JPH0588114B2 - - Google Patents
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- JPH0588114B2 JPH0588114B2 JP59209930A JP20993084A JPH0588114B2 JP H0588114 B2 JPH0588114 B2 JP H0588114B2 JP 59209930 A JP59209930 A JP 59209930A JP 20993084 A JP20993084 A JP 20993084A JP H0588114 B2 JPH0588114 B2 JP H0588114B2
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、従来酸素法により製造できることの
全く知られていなかつた、スフインゴリン脂質複
素環化合物誘導体の酸素法により製法に関し、該
誘導体は例えばリポソーム形成基材、乳化剤、生
理活性物質及びそのキヤリヤーなどの分野に有用
な、酸素法スフインゴリン脂質複素環化合物誘導
体の製法に関する。 更に詳しくは、従来の、他のリン脂質について
の酸素法で使用されたキヤベツ由来のホスホリパ
ーゼＤ（至適温度40℃以下、至適PH5.4〜5.6）と
は異つて至適温度60〜70℃、至適PH７付近のホス
ホリパーゼDMの存在下で、スフインゴリン脂質
と従来、酸素法によつて製造できないとされてい
たアルコール性水酸基を有する複素環化合物とを
反応させるスフインゴリン脂質複素環化合物誘導
体の製法に関する。 尚、本発明に於てスフインゴリン脂質複素環化
合物誘導体とは、出発物質であるスフインゴリン
脂質のリン酸構造部分と該スフインゴリン脂質の
アルコール構造部分とのエステル結合を、ホスホ
リパーゼDMの作用で加水分解すると同時に上記
反応に用いるアルコール性水酸基を有する複素環
化合物へ転移させて誘導した、出発物質とは異る
新しいスフインゴリン脂質を意味する。 特に、本発明は、下記式（） 【式】 式中、Ａは下記式(i)又は(ii) 【化】 又は 【化】 の基を示し、ここで、Ｒは飽和もしくは不飽和の
C12〜C24の脂肪族炭化水素基を示し、A′はオキシ
ドアニオン又は水酸基を示し、Ｂは−（CH2）2Ｎ＋
（CH3）3、−（CH2）2NH2又は−CH2CH（OH）CH2
（OH）を示す。 で表わされるスフインゴリン脂質を、下記(1)〜(3)
に示すアルコール性水酸基を有する複素環化合
物、すなわち、 (1) 一級アルコール性OHに結合した鎖状側鎖を
有し、且つテトラヒドロフラン環、ジオキソラ
ン環、チオフエン環、ピロリジン環、イミダゾ
ール環、イミダゾリジン環、オキサゾール環、
チアゾール環、ピラン環、オキサン環、チアン
環、ピペリジン環、トリアジン環、テトラヒド
ロフタルイミド環、ベンゾオキソラン環及びヘ
キサメチレンイミン環よりなる群からえらばれ
る複素環を持つ複素環一級アルコール化合物、
ここで、該化合物の複素環部分はC1〜C3アル
キル基、C1〜C3アルキレン基、水酸基、カル
ボキシル基、カルボル基、ハロゲン、アミノ
基、オキソ基、ベンジル基、フエニル基及び
C1〜C3のアルキレンスルホン酸基より成る群
からえらばれる置換基を有していてもよい、 (2) 環に直接結合した二級アルコール性OHもし
くは二級アルコール性OHに結合した鎖状側鎖
を有し且つピペリジン環、モルホリン環、ピペ
ラジン環、ピロリジン環、オキサン環及びフタ
ルイミド環よりなる群からえらばれた複素環を
持つ複素環二級アルコール化合物、ここで、該
化合物の複素環部分はC1〜C3のアルキル基、
水酸基及びC1〜C3のアルキレンスルホン環基
より成る群からえらばれた置換基を有してもよ
い。 (3) ピリジン環、ピリミジン環、トリアジン環、
プリン環及び８−アザプリン環からえらばれる
複素環を置換基として有するペントース誘導体
又はデオキシペントース誘導体、ここで、該誘
導体の複素環部分はメルカプト基、ハロゲン、
水酸基、カルボキシル基、オキソ基、アミノ
基、C1〜C3のアルキル基、メトキシ基、エト
キシ基、カルボキシメチル基、アセチル基及び
アソイル基よりなる群からえらばれる置換基を
有してもよい、ただし、アデノシン、シチジ
ン、ウリジン、グアノシン及びアラビノシチジ
ンより成る群からえらばれる糖を持つ複素環化
合物を除外する、より成る群からえらばれるア
ルコール性水酸基を有する複素環化合物と、ス
フインゴリン脂質と複素環アルコールとの間の
転移反応を触媒しうるホスホリパーゼＤ（以下、
ホスホリパーゼDMという）の存在下で反応さ
せることを特徴とする下記式（） 【式】 式中、Ａ及びA′は上記の意味を有し、 Ｃは上記(1)〜(3)に示すアルコール性水酸基を
有する複素環化合物から該アルコール性水酸基
を除いた残基を示す、 で表わされるスフインゴリン脂質複素環化合物誘
導体及びその塩類の製法に関する。 従来、ホスホリパーゼＤがスフインゴリン脂質
Ｄがスフインゴリン脂質たとえばスフインゴミエ
リンのコリン塩基−リン酸エステルを加水分解
し、コリンとＮ−アシルスフインゴシン−１−リ
ン酸を生ずる反応を触媒することが知られている
〔F.M Davidson「Biochem，J.vol69、458−466
（1958）」（キヤベツホスホリパーゼＤ）；Ｙ，
OKAWA等「J.Biochem.，78，363−372（1975）」
（Strepto−myces hachijoeusisのホスホリパーゼ
Ｄ）〕。 更にグリセロリン脂質については、たとえばレ
シチンとエチルアルコールとをホスホリパーゼＤ
の存在下に反応させるとリン脂質のリン酸構造部
分と該リン脂質のアルコール構造部分とのエステ
ル結合が加水分解され、同時にホスフアチジル基
転移作用によりホスフアチジルエタノールを生成
する作用のあることが報公されている〔R.M.
Dawson；Biochem.J.102、205（1967）；Yaug；
J.Biol chem.，242、477（1967）〕。又キヤベツ由
来のホスホリパーゼＤのホススフアチジル基転移
作用を利用する英国特許No.1581810（対応西ドイツ
国公開No.2717547）には“ホスホリピツドの製法”
が提案されているが、この中ではグリセロリン脂
質とC5以下の鎖状一級アルコールとの間でのみ
ホスホリパーゼＤの作用によつて転移誘導体が生
起する事について述べているだけであつてスフイ
ンゴリン脂質とアルコールとの転移作用について
は全く記載も示唆もされていない。即ちこの提案
によれば、この提案の一般式で示されたグリセロ
リン脂質と水酸基、ハロゲン、アミノその他置換
基で置換されていてもよいC5までの直鎖もしく
は、分枝のアルキル基を有する一級アルコールと
の前記キヤベツ由来のホスホリパーゼＤの酵素作
用を利用した一級アルコール転移反応について開
示されているのみであつて非極性部分の構造をグ
リセリン脂質とは全く異にするスフインゴリン脂
質については全く言及されていない。唯一、
Robert J.CHALIFOUR，等はスフインゴミエリ
ンを基質としグリセロールを受容体アルコールと
して、ホスホリパーゼＤの作用によりグリセリン
転移の生成を試みたが生成しなかつたと報告して
いる。（Can.J.Biochem.，vol58、1189（1980））。
この様に従来、スフインゴリン脂質についてはア
ルコール性水酸基を有する化合物の共存下にホス
ホリパーゼＤを作用された時、スフインゴリン脂
質のリン酸構造部分と該スフインゴリン脂質のア
ルコール構造部分とのエステル結合が加水分解さ
れると同時にＮ−アシルスフインゴシン−１−リ
ン酸転移作用により出発スフインゴリン脂質とは
異なる新しいスフインゴリン脂質誘導体を生成す
る事は全く知られていなかつた。 本発明者等は、従来公知のキヤベツのホスホリ
パーゼＤとは、その至適温度、至適PH等で異なる
ホスホリパーゼＤ生産能を有する微生物の存在を
発見して既に、特開昭58−63388号、特開昭58−
67183号に提案した。 この提案の中では、該ホスホリパーゼＤ生産菌
より得られるホスホリパーゼＤはC5以下の一級
アルコールを包合して、更に従来全く言及された
ことのない広範囲なアルコール化合物に対してリ
ン脂質を転移させる作用を持つことが記載されて
いる。そしてこの中で、基質となるリン脂質とし
てグリセリン脂質、スフインゴリン脂質が記載さ
れ、又転移の起るアルコールの中で複素環アルコ
ールとしては複素環一級アルコールが記載され、
該複素環一級アルコールの複素環としてフラン
環、フタルイミド環、ピロール環、インドール
環、ピリジン環、モルホリン環、ピリミジン環、
ピペラジン環、イミダゾピリミジン環（プリン
環）が記載されている。 しかし上記提案の中にはテトラヒドロフラン
環、ジオキソラン環、チオフエン環、ピロリジン
環、イミダゾール環、イミダゾリジン環、チオキ
サゾール環、チアゾール環、ピラン環、オキサン
環、チアン環、ピペリジン環、トリアジン環、テ
トラヒドロフタルイミド環、ベンゾオキソラン
環、ヘキサメチレンイミン環を有する複素環一級
アルコール、及び複素環二級アルコールについて
は全く記載されていないし、示唆もされていな
い。又上記提案の中に記載されている複素環アル
コールについては、置換基の種類についてはとく
に言及されていないが、直換基を有する複素環一
級アルコールとして、ピリドキシン、チアミン及
びアデノシンの三種のみが記載されている。 本発明者等は、さらに研究を重ねた結果、該ホ
スホリパーゼDMは前記式（）で表わされるス
フインゴリン脂質を加水分解すると同時に、上記
提案に全く記載されていない前記(1)、(2)及び(3)よ
り成る群からえらばれたアルコール性水酸基を有
する複素環化合物に転移するという新しい事実を
発見した。 本発明者等の研究によれば、スフインゴリン脂
質としてたとえばスフインゴミエリンと複素環一
級アルコールであるＮ−（２−ヒドロキシエチル）
ピロリジンとの間におけるスフインゴリン脂質複
素環化合物誘導体の形成を触媒する本発明に於て
新たにホスホリパーゼDMと呼称する酵素が存在
し、このホスホリパーゼDMの存在下に、前記式
（）で表わされるスフインゴリン脂質と前記(1)
〜(3)のアルコール性水酸基を有する複素環化合物
とを反応させることにより、従来製造できること
の知られていなかつた新しいスフインゴリン脂質
複素環化合物誘導体が製造できる事が発見され
た。 斯して、煩雑且つ不利益な化学的合成手段を要
することなしに、温和且つ容易な条件及び、手段
で、副反応を伴うをおそれもなしに、一段階反応
で酵素法によつて新しいスフインゴリン脂質複素
環化合物誘導体を好収率で製造できることがわか
つた。 従つて本発明の目的は新しい酵素法スフインゴ
リン脂質複素環化合物誘導体の製法を提供するこ
とにある。 本発明の上記目的及び更に多くの他の目的なら
びに利点は以下の記載から一層明らかとなるであ
ろう。 本発明方法で利用するスフインゴリン脂質は下
記式（）で表わされる。 【化】 但し式中Ａは下記(i)又は(ii) 【化】 又は 【化】 を示し、 ここでＲは飽和もしくは不飽和のC12〜C24の脂
肪族炭化水素基を示し、 A′はオキシドアニオン又は水酸基を示し、Ｂ
は、−（CH2）2Ｎ＋（CH3）、−（CH2）2NH2もしくは
−CH2・CH（OH）CH2（OH）を示す。 上記式（）原子スフインゴリン脂質は公知化
合物であつて、市場でも入手可能であり、それ自
体公知の方法によつて天然物より抽出採取又は合
成することが出来る。例えば動植物及び微生物組
織から公知の手段で抽出して得られるスフインゴ
ミエリン、セラミドホスホリルエタノールアミ
ン、セラミドホスホリルグリセロール等の単独或
いは混合物をそのまま若しくは精製して用いるこ
とができるし、それ自体公知の方法によつてその
構造の一部もしくは全部を化学合成して利用する
ことが出来る。 本発明方法に於て上記式（）原料スフインゴ
リン脂質とホスホリパーゼDMの存在下に反応せ
しめる複素環アルコールとしては以下に例示する
(1)〜(3)のアルコール性水酸基を有する複素環化合
物を利用することが出来る。 (1) 複素環Ｍ級アルコール化合物として下記の化
合物をあげられる。一級アルコール性OHに結
合した鎖状側鎖を有し且つ下記複素環 テトラヒドロフラン環、ジオキソラン環、チオ
フエン環、ピロリジン環、イミダゾール環、イ
ミダゾリジン環、オキサゾール環、チアゾール
環、ピラン環、オキサン環、チアン環、ピペリ
ジン環、トリアジン環、テトラヒドロフタルイ
ミド環、ベンゾオキソラン環及びヘキサメチレ
ンイミン環 よりなる群からえらばれた複素環を持つ複素環
一級アルコール化合物残基、ここで該残基の複
素環部分はC1〜C3アルキル基、C1〜C3アルキ
レン基、水酸基、カルボキシル基、カルボニル
基、ハロゲン、アミノ基、オキソ基、ベンジル
基、フエニル基及びC1〜C3のアルキレンスル
ホン酸基より成る群からえらばれた置換基を有
してもよい； 上記において、置換基を持たない場合はチオフ
エン環、ピロリジン環、イミダゾール環、ピペリ
ジン環、テトラヒドロフタルイミド環、ベンゾオ
キソラン環及びヘキサメチレンイミン環が好まし
く、その例としてはＮ−（２−ヒドロキシエチル）
ピロリジン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペ
リジン、２−（２−ヒドロキシエチル）ピペリジ
ン、２−ヒドロキシメチルピペリジン、３−ヒド
ロキシメチルピペリジン、Ｎ−（２−ヒドロキシ
エチル）ヘキサメチレンイミン、２−チオフエン
メタノール、２−チオフエンエタノール、Ｎ−ヒ
ドロキシメチルテトラヒドロフタルイミド、４−
ヒドロキシメチルイミダゾール、ピペロニルアル
コールなどがあげられる。 上記において、置換基としてC1〜C3のアルキ
ル基を有する場合はジオキソラン環、ピロリジン
環、チアゾール環、オキサゾール環、イミダゾー
ル環及びイミダゾリジン環が好ましく、その例と
してはＮ−メチル−２−ヒドロキシエチルピロリ
ジン、２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン
−４−メタノール、１−（ヒドロキシメチル）−
５，５−ジメチルヒダントイン、２，４−ジメチ
ル−４−ヒドロキシオキサゾリン、５−（２−ヒ
ドロキシエチル）−４−メチルチアゾールなどが
あげられる。 上記において置換基としてC1〜C3のアルキレ
ン基を有する場合は、該アルキレン基は２つの複
素環を結ぶ結合を意味し、ピペリジン環が好まし
く、その例としては１，３−ビス（Ｎ−２−ヒド
ロキシエチル−４−ピペリジル）プロパン、１−
（Ｎ−２−ヒドロキシエチル−４−ピペリジル）−
３−（4′−ピペリジル）プロパンなどがあげられ
る。 上記において置換基として水酸基を有する場合
は、ピペリジン環、テトラヒドロフラン環及びオ
キサン環が好ましく、その例としては、Ｎ−（２
−ヒドロキシエチル）−４−（ヒドロキシプロピ
ル）ピペリジン、５−チオグルコース、コージ
酸、アルコルビン酸、イソアスコルピン酸、グル
コノ−δ−ラクトン、ガラクノ−γ−ラクトン、
α−グルコヘプトニツクアシツド−γ−ラクトン
などがあげられる。 上記において、置換基としてオキソ基を有する
場合はピロリジン環が好ましく、その例としては
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−２−ピロリドン、
Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−２−ピロリドン
などがあげられる。 上記において、置換基としてアミノ基を有する
場合はピリミジン環が好ましく、その例として、
トキソピリミジンなどがあげられる。 上記において置換基としてフエニル基を有する
場合はピペリジン環が好ましく、その例としては
スコポラミン、アトロピンなどがあげられる。 (2) 複素環二級アルコール化合物として下記の化
合物をあげられる。環に直接結合した二級アル
コール性OHもしくは二級アルコール性OHに
結合した鎖状側鎖を有し且つピペリジン環、モ
ルホリン環、ピペラジン環、ピロリジン環、オ
キサン環及びフタルイミド環よりなる群からえ
らばれた複素環を持つ複素環二級アルコール化
合物残基、ここで該残基の複素環部分はC1〜
C3のアルキル基、水酸基及びC1〜C3のアルキ
レンスルホン酸基より成る群からえらばれた置
換基を有してもよい：− 上記において環に直接結合した二級アルコール
性OHを持つ複素環としては、ピペリジン環及び
ピロリジン環が好ましく、その例としては３−ヒ
ドロキシピペリジン、４−ヒドロキシピペリジ
ン、３−ヒドロキシピロリジンなどがあげられ
る。 上記において二級アルコール性OHに結合した
鎖状側鎖を有する複素環としては、フタイミド環
及びモルホリン環、好ましくは、その例としては
Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）フタルイミド、
Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）モルホリンなど
があげられる。 上記において置換基として、C1〜C3のアルキ
ル基を有する場合はピペリジン環が好ましく、そ
の例としてはＮ−メチル−４−ヒドロキシピペリ
ジンなどがあげられる。 上記において置換基としてC1〜C3のアルキレ
ンスルホン酸基を有する場合はピペラジン環及び
モルホリン環が好ましく、その例としてはピペラ
ジン−Ｎ，N′−ビス（２−ヒドロキシプロパン
−３−スルホン環）、３−（Ｎ−モルホリン）−２
−ヒドロキシプロパンスルホン酸などがあげられ
る。 (3) 糖を持つ複素環化合物として下記のものがあ
げられる。ピリジン環、ピリミジン環、トリア
ジン環、プリン環及び８−アザプリン環からえ
らばれた複素環を置換基として有するペントー
ス残基又はデオキシペントース残基、ここで該
残基の複素環部分はメルカプト基、ハロゲン、
水酸基、カルボキシル基、オキソ基、アミノ
基、C1〜C3のアルキル基、メトキシ基、エト
キシ基、カルボキシメチル基、アセチル基及び
アニソイル基よりなる群からえらばれた置換基
を有してもよい：一 上記においてピリジン環を置換基として有する
ペントース残基及びデオキシペントース残基とし
ては、３−デアザウリジンなどがあげられる。 上記においてトリアジン環を置換基として有す
る、ペントース残基及びデオキシペントース残基
としては、５−アザシチジンなどがあげられる。 上記においてピリミジン環を置換基として有す
るペントース残基及びデオキシペントース残基と
しては、４−チオウリジン、５−ブロモウリジ
ン、５−ヒドロキシウリジン、６−フルオロデオ
キシウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボ
キシメチルウリジン、５−メチルウリジン、N4
−アセチルシチジン、55−メトキシウリジン、５
−ブロモ−2′−デオキシシチジン、N4−アニソ
イル−2′−デオキシシチジン、3′−Ｏ−メチルシ
チジン、オロチジン、サイクロシチジン、チミン
デオキシリボシド、ラウシルデオキシリボシド、
シトシンデオキシリボシド、などがあげられる。 上記においてプリン環を置換基として有するペ
ントース残基及びデオキシペントース残基として
は、６−メルカプトグアノシン、１−メチル−グ
アノシン、キサントシン、６−メルカプトプリン
リボシド、６−メチルアミノプリン−９−リボシ
ド、N6−メチル−2′−デオキシアデノシン、８
−プロモアデノシン、N6−エタノアデノシン、
2′−クロロアデノシン、１−メチルアデノシン、
N6，N6−ジメチルアデノシン、2′−Ｏ−メチル
アデノシン、イノシン、グアニンデオキシリボシ
ド、アデニンデオキシリボシドなどがあげられ
る。 上記において８−アザプリン環を置換基として
有するペントース残基及びデオキシペントース残
基としては８−アザアデノシンなどがあげられ
る。 上記例示の如き(1)〜(3)からえらばれたアルコー
ル性水酸基を有する複素環化合物が例示出来る
が、前記(1)〜(3)までの範囲がみたされる限り、ア
ルコール類の選択に制限はない。 上記例示の如き(1)〜(3)のアルコール性水酸基を
有する複素環化合物は天然物、合成品、いづれで
も利用できるが、目的とする化合物以外のアルコ
ール性水酸基を有する複素環化合物を含まないよ
うに、予め適当な手段を利用して精製して利用す
るのが好ましい。このような精製手段の例として
たとえば蒸留、再結晶、アルミナ、シリカゲル活
性炭、イオン交換樹脂などを用いたカラムクロマ
トグラフイー、薄層クロマトグラフイー及びこれ
等の適当な組合わせによる精製手段を例示でき
る。 本発明方法によれば前記例示の如き式（）ス
フインゴリン脂質と上記例示の如き(1)〜(3)の群か
らえらばれたアルコール性水酸基を有する複素環
化合物とをホスホリパーゼDMの存在下に反応さ
せる。 この際利用するホスホリパーゼDMとしては、
従来公知のキヤベツから抽出されたホスホリパー
ゼＤの至適温度40℃以下、至適PH5.4〜5.6に対し
て、至適温度60〜70℃、至適PH７付近である点で
公知ホスホリパーゼＤと区別ができるホスホリパ
ーゼDM生産菌の生産するホスホリパーゼDMが
例示できるが、Ｎ−アシルスフインゴシン脂質−
１−リン酸転移作用を有するホスホリパーゼDM
であればその起源にかかわらずすべて利用でき
る。 該ホスホリパーゼDMは式（）スフインゴリ
ン脂質とＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピロリジ
ンとの間におけるスフインゴリン脂質誘導体の形
成を触媒する点で公知ホスホリパーゼＤと区別で
きる。 このようなホスホリパーゼDM生産菌の例とし
ては、同一出願人の出願に係わる特開昭58−
63388号に開示されたノカルデイオプシス
（Nocardiopsis）属に属するホスホリパーゼDM
生産菌たとえばノルカデイオプシス属No.779株
〔FERM−BP−512〕、同一出願人の出願に係わ
る特開昭58−67183号に開示されたアクチノマデ
ユーラ（Actinomadu−ra）属に属するホスホリ
パーゼDM生産菌たとえばアクチノマデユーラ属
No.362株〔FERM−BP−511〕等を挙げることが
できるが前記式（）のリン脂質を原料として前
記(1)〜(3)のアルコール性水酸基を有する複素環化
合物の転移反応を起す作用を有するホスホリパー
ゼＤであれば如何なる起源のホスホリパーゼＤで
もホスホリパーゼDMとして用いることが出来
る。至適温度及び至適PHの相違と共に他のいくつ
かの相違点と共に、下掲第１表に、本発明方法で
利用するホスホリパーゼDMと公知ホスホリパー
ゼＤとの酵素学的性質の差異を示す。なお、酵素
学的性質は上記特開昭58−63388号公報及び特開
昭58−67183号公報記載の方法により測定したも
のである。 【表】 するサンライト株式会社の商品名である。
公知ホスホリパーゼＤを用いては得られなかつ
たスフインゴリン脂質複素環化合物誘導体が、本
発明方法を形成できる理由には、この酵素的触媒
反応に関与する公知ホスホリパーゼＤと本発明方
法で用いるホスホリパーゼDMとの上記の如き酵
素学的性質の差異が関与しているものと推測され
る。勿論、本発明方法はこのような作用の推測に
よつて何等の制約もうけるものではない。 本発明方法で利用するホスホリパーゼDMは後
記転移作用の実験方法〔TLCによる転移生成物
の生成確認方法〕に従つて反応を行つて例えば複
素環一級アルコールのＮ−（２−ヒドロキシエチ
ル）ピロリジンとスフインゴリン脂質であるスフ
インゴミエリンとの間におけるスフインゴリン脂
質誘導体形成反応を触媒して、該スフインゴリン
脂質の該複素環化合物誘導体を形成する。公知キ
ヤベツホスホリパーゼＤは上記誘導体を形成しな
い。 本発明方法によれば、前記例示の如き式（）
スフインゴリン脂質と前記例示の如き(1)〜(3)のア
ルコール性水酸基を有する複素環化合物とを、上
記に詳しく述べたホスホリパーゼDMの存在下に
反応させることにより、下記式（） 【化】 但し式中、Ａ，A′及びＣは前記したと同義で
ある、 で表わされるスフインゴリン脂質複素環化合物誘
導体を製造することができる。この際、ホスホリ
パーゼDMは精製品として使用する必要はなく粗
製品であつてもよい。更に、適当な固定化担体た
とえばポリプロピレン膜、セライト粒、ガラスピ
ーズなどの如き各種の重合体樹脂類や無機材料の
粒状物やフイルム状物に担持固定化して利用する
こともできる。 反応は、ホスホリパーゼDMの存在下で、好ま
しくは溶媒の存在下に、式（）スフインゴリン
脂質と前記(1)〜(3)アルコール性水酸基を有する複
素環化合物とを接触せしめることにより行うこと
ができる。利用する溶媒の例としては、水性溶媒
及び水性溶媒と有機溶媒との混合溶媒を例示する
ことができる。又、アルコール性水酸基を有する
複素環化合物によつてはそれ自体に溶媒の役目を
兼ねさせることができる。また、ホスホリパーゼ
DMの酵素学的触媒作用を阻害しない任意の他の
添加剤を含む溶媒も利用でき、たとえば該作用を
促進したり、酵素の安定化に役立つ適当な添加剤
を含有した溶媒であることができる。例えば、ア
ルブミン、カゼイン等の蛋白質、酢酸、クエン
酸、リン酸などの緩衝剤を含有したり、塩化カル
シウムその他の中性塩を含有したり又、タウロコ
ール酸ソーダ等の胆汁酸塩類を含有した水性溶媒
であることができる。更に、有機溶媒の例として
は、例えば、ｎ−ヘプタン、ｎ−ヘキサン、イソ
オクタンなどの如き脂肪族炭化水素類；シクロペ
ンタン、シクロヘキサン、シクロブタンなどの如
き脂環族炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシ
レンなどの如き芳香族炭化水素類；アセトン、メ
チルイソプロピルケトンなどの如きケトン類；ジ
メチルエーテル、ジエチルエーテル、ジイソプロ
ピルエーテルなどの如きエーテル類；酢酸メチ
ル、酢酸エチルなどの如きエステル類；四塩化炭
素、クロロホルム、塩化メチレンなどの如きハロ
ゲン化炭化水素類；ジメチルホルムアミドの如き
アミド溶媒類；ジメチルスルホキシドの如きスル
ホキシド溶媒類などを例示することができる。 水性溶媒と有機溶媒との混合溶媒の形で利用す
る場合の両者の混合比は適当に選択できるが、例
えば水性溶媒：有機溶媒（Ｖ／Ｖ比）の比で
100：０〜１：99の如き混合比を例示することが
できる。 反応モル比、ホスホリパーゼDMの使用量、溶
媒の使用量などは、適宜に選択できるが、例え
ば、式（）スフインゴリン脂質１モルに対して
前記(1)−(3)アルコール性水酸基を有する複素環化
合物約１：１〜約１：1000モルの反応モル比を例
示することができる。また、ホスホリパーゼDM
の使用量としては、例えば、式（）スフインゴ
リン脂質１ｇ当り約10〜約100000単位、好ましく
は約100〜約1000単位程度の使用量を例示するこ
とができる。さらに、溶媒の使用量としては、例
えば、式（）スフインゴリン脂質に対して約２
〜約100容量倍程度の使用量を例示できる。 反応は、室温で進行するので、とくに冷却或は
加熱の必要はないが、所望により適宜に冷却もし
くは加温条件を採用することができる。例えば、
約０℃〜約90℃、好ましくは、約20℃〜約60℃の
如き反応温度を例示することができる。また反応
時間も適宜に選択できるが、例えば約１分〜約10
日、好ましくは約１時間〜第72時間の如き反応時
間を例示することができる。所望により、たとえ
ばTLC（薄層クロマトグラフイー）などの手法を
利用して反応経過を追跡し、所望の目的物の形成
を確認することにより反応時間を適宜に変更する
ことができる。 ホスホリパーゼDMの存在下で式（）スフイ
ンゴリン脂質と前記(1)〜(3)アルコール性水酸基を
有する複素環化合物とを接触せしめる態様は適宜
に選択できるが、撹拌もしくは振盪条件下で行う
のが普通である。又、酸化分解を受け易い基質又
はアルコール性水酸基を有する複素環化合物を用
いて反応する場合は窒素気流中等で行う事が望ま
しい。又、前記のように適当な粒状物やフイルム
状物担体に担持固定化した固定化酵素の形でホス
ホリパーゼDMを利用する場合には、例えば、固
定化酵素膜もしくは固定化酵素粒子層を介して反
応組成液を循環ポンプを用いて通過させる態様で
行うことができる。 上述のようにして反応を行つた後、形成された
式（）のようにして反応を行つた後、形成され
た式（）スフインゴリン脂質複素化合物誘導体
は、そのまま又は塩の形で沈殿させて分離して利
用することができる。尚、ここで式（）スフイ
ンゴリン脂質複素環化合物誘導体の塩としては、
例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、燐酸等の無機酸
との塩、シユウ酸、マレイン酸、乳酸、酒石酸、
フマール酸、メタンスルホン酸、ベンビンスルホ
ン酸、トルエンスルホン酸等の有機酸との塩、ア
ルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のア
ミノ酸との塩、ナトリウム、カリウムなどのアル
カリ金属との塩、マグネシウム、カルシウム等の
アルカリ士類金属との塩及びアンモニウム塩等が
あげられる。更に、該誘導体及びその塩はケイ酸
カラムクロマト、アルミナカラムクロマト、イオ
ン交換クロマト、高速液体クロマト、向流分配、
ゲル過、吸着クロマト等の適当な公知の方法を
利用して分離精製することができる。 本発明方法によれば、上述したようにして、式
（）スフインゴリン脂質と前記(1)〜(3)のアルコ
ール性水酸基を有する複素環化合物とを、ホスホ
リパーゼDMの存在下に反応させて式（）スフ
インゴリン脂質複素化合物誘導体を製造すること
ができる。得られる式（）スフインゴリン脂質
複素環化合物誘導体は、すぐれた界面活性作用を
有し細胞膜の透過性に大きな影響を持つ。この意
味から、該式（）誘導体はリポソーム形成基材
として又、リポソーム表面の修飾基材として利用
出来る他、化粧品たとえばクリーム、乳液に配合
して皮膚生理に役立つ乳化剤として、更に脂肪系
薬剤の乳化剤、殺虫剤、除草剤など乳化剤などの
広い乳化剤用途に有用である。 更にスフインゴリン脂質は、植物細胞と動物細
胞の重要な膜成分であり、動物では特に脳と伸経
組織に多量に存在している他、臓器や血球中にも
存在する。スフインゴリン脂質の中で最も豊富に
見られるのはスフインゴミエリンでありその誘導
体と考えられるものとしてセラミドホスホリルエ
タノールアミン、セラミド２−アミノエチルホス
ホネート等が知られているが天然に見出されるス
フインゴリン脂質の種類はまだ、きわめて少な
い。スフインゴリン脂質の生理的役割について
は、神経伝達に関与していると考えられている
が、この分野での解明はまだあまりなされていな
い。 むしろそのアナログとも言えるスフインゴグリ
コリピツドについては、様々な抗原として、又は
細菌毒素、インターフエロン、ホルモンなどのリ
セプターとして知られている。 又最近では細胞の分化誘導、増殖に関与してい
る事も考えられている。 本発明で誘導しうる式（）スフインゴリン脂
質複素環化合物誘導体は多くの異つた構造を有す
る新規なスフインゴリン脂質誘導体であり、これ
等のスフインゴリン脂質アナログの中には神経系
薬剤として有効な作用を有する誘導体が期待出来
る。又これ等の誘導体、特に糖を持つ複素環を誘
導したスフインゴリン脂質アナログの中には細胞
培養に用いた時その分化誘導を促進したり細胞の
増殖を進めたりする効果を有するものが存在する
可能性が考えられる。又逆に分化あるいはガン化
の進行を阻止する効果を発現する可能性も考えら
れる。又、一、二級アルコール水酸基を有する複
素環化合物或は一、二級アルコール水酸基を導入
した複素環薬理活性化合物を、スフインゴリン脂
質に転移させることによつて、該化合物の薬理的
副作用を弱めたり或は薬理効果を高めてその投与
量を低減させたりすることも期待できる。さらに
又、上記薬理活性化合物をスフインゴリン脂質に
転移させて、該化合物を患部に的確に集中させる
ための薬理活性化合物のキヤリヤーとして、さら
には、薬理活性化合物の保護基として有用な役割
をはたすことも期待できる。 又更に、各種医薬品をはじめとする化学合成の
中間体として有用であり、例えば、反応性の高い
ハロゲンやアミノ置換基を有するアルコールを転
移させた誘導体を利用出来る。更に又三重水素や
14Cでラベルしたアルコール性水酸基を有する複
素環化合物を転移することによつてラベルされた
スフインゴリン脂質複素環化合物誘導体が得ら
れ、スフインゴリン脂質の代謝経路の解明に移用
する事も出来る。 以下、実施例により本発明方法実施の数態様に
ついて、更に詳しく例示する。 参考例１ ホスホリパーゼDMの調製。 きな粉3.0％、コーンスターチ−プリカー1.0
％、ペプトン0.5％、粉末酵母エキス0.1％、グル
コース1.0％、NH4NO30.25％、K2HPO40.4％、
MsSO4・7H2O0.01％、ツウイン（Tween）−85
0.1％から成る培地（PH6.0）約15を30ジヤー
フアーメンターに入れ、120℃で15分間滅菌後、
シード培養液1.5を植菌し、27℃で40時間培養
を行つた。尚、上記シード培養液は、殿粉１％、
（NH4）H2PO40.25％、ペプトン0.25％、
K2HPO30.2％、MgSO4・7H2O0.01％を含む水溶
液培地（PH6.8）100mlを500ml坂口フラスコに入
れ、蒸気殺菌後、ノカルデイオプシス属NO.779
株〔FERM.BP512〕又はアクチノマデユーラ属
NO.362株〔FERM・BP−511〕の胞子を一白金
耳接種し、培養温度30℃、120回転／分の条件で
２日間振盪培養して調製した。 培養後、菌体固形物を遠心分離により除去し、
遠心上清13（ノカルデイオプシス属FERM・
BP−512を用いた場合は0.54u／ml；アクチノマ
デユーラ属FERM・BP−511株を用いた場合は
1.7u／mlであつた。）を得た。この遠心上清を５
℃に冷却した後、−20℃のアセトンを加えてアセ
トン濃度30〜70％画分に相当するホスホリパーゼ
DMを含む沈殿物を遠心分離により集めた。この
沈殿物を、ノカルデイオプシス属FERM・BP−
512株を用いた場合にはPH6.0、アクチノマデユー
ラ属FERM・BP−511株を用いた場合はPH6.5の
トリス・マレイン酸に溶解し、0.02Mの同緩衝液
に対して透析した後、同緩衝液で平衡化した
DEAE−セルロースに通塔し、通過区分を集め
た。次に堀内等の方法〔J.Biochem.81、1639
（1977）〕で調整したパルミトイルガーゼをカラム
に充填し、充分に水洗してから上記DEAE−セル
ロース通過液を注入し、活性を吸着した。これを
0.05Mトリス−塩酸緩衝液（PH7.2）で洗浄後、
0.2％Triton Ｘ−100を含む同緩衝液を加え活性
を溶出した。活性区分を集めてバイオエンジエア
リング社製の限外過膜（Type Ｇ−10T）を用
いて濃縮した後、ゲル過担体としてトヨパール
HW−55F〔東洋曹達(株)製〕充填カラムに注入し、
蒸留水を用いて通塔し、活性区分を集めて凍結乾
燥を行つた。 この乾燥粉末を、ノカルデイオプシス属ホスホ
リパーゼDMの場合には0.025Mイミダゾール・
塩酸（PH7.4）に溶解後、アクチノマデユーラ属
ホスホリパーゼDMの場合には0.025Mトリス−
酢酸（PH8.3）に溶解後、フアルマシア・フアイ
ンケミカルス社製のポリバツフア交換体PBETN94
（20ml）充填カラムに通塔して活性を吸着後、同
社製の溶出用ポリバツフア（PH5.0）を用いてPH
勾配により溶出した。溶出したホスホリパーゼ
DMの活性区分を集めて限外過膜にて濃縮し、
セフアデツクスＧ−75充填カラムに通塔し、ホス
ホリパーゼDM活性区分を集めて凍結乾燥した。 斯くて、ノカルデイオプシス属ホスホリパーゼ
DMの場合には、約40％の活性回収率で、比活性
178.3u／mg蛋白質として、アクチマデユーラ属ホ
スホリパーゼDMの場合には約43％の活性回収率
で、比活性218.3u／mg蛋白質として、ホスホリポ
ーゼDMが回収された。 実施例１ （Run No.１〜No.50） スフインゴミエリン、卵黄由来（シグマ社製）
と後掲第２表に示した多数種の複素環アルコール
とを、後記TLCによる転移生成物の生成確認方
法に従つて、ホスホリパーゼDMの存在下で反応
させて、転移生成物の形成を確認した。そのRf
値を後掲第２表に示した。 TLCによる転移生成物の生成確認方法：一下
記組成 １％スフインゴミエリン乳化液 0.1ml 0.2M酢酸緩衝液（PH5.7）、 0.1ml 1M塩化カルシウム水溶液 0.01ml 20％複素環アルコール水溶液 0.2ml の反応液にホスホリパーゼDM水溶液0.01ml
（IU）を加え、30℃で２日静置した。 尚上記１％スフインゴミエリン乳化液はスフイ
ンゴミエリン100mgにジエチルエーテル−石油エ
ーテル（１：1V／Ｖ）１ml及び蒸留水10mlを加
え氷冷条件下に600W、20KHzの条件で５分間超
音波処理して形成した。又上記20％複素環アルコ
ール水溶液は、必要に応じて1N塩酸もしくは1N
カセイソーダでPHを6.0に調整した後に用いた。 上記静置後0.1N塩酸0.5mlを加え反応を停止し
た後激しく撹拌し、脂質（生成物）を抽出した。
この懸濁液を数分静置し、下層のクロロホルム層
を分取し、30℃で減圧乾固した後、クロロホルム
−メタノール混液（２：1V／Ｖ）100に溶解し
て、TLCの試料とした。このうち10をシリカ
ゲル薄層（メルク社製、シリカゲル60TLCプレ
ート、20×20cm）にスポツトし、クロロホルム−
メタノール−水（60：30：5V／Ｖ）、クロロホル
ム−メタノール−アンモニア−水（50：20：１：
2V／Ｖ）又はジイソブチルケトン−酢酸−水
（40：25：5V／Ｖ）を展開溶媒として展開した。 スポツトの検出は下記の試薬を用いた。 検出されたスポツトで末分解の基質及びその加
水分解物であるＮ−アシルスフインゴシン−１−
リン酸以外のリン脂質のスポツトが検出された場
合、これを転移生成物と認めた。 展開溶媒としてクロロホルム−メタノール−水
（60：30：5V／Ｖ）を用いた時のRf値を第２表に
示した。（Run No.１〜50） 検出試薬： リンの呈色：Zinzadeの試薬（Beiss U.J.
Chromatog.13、104、1964） プリン及びピリミジンの呈色：フルオレツセイン
−アンモニア試薬（Wieland T.らAngew.
63、511、1951） 有機化合物の呈色：50％硫酸。 【表】 【表】 実施例２ （Run No.１〜No.15） スフインゴミエリン（卵黄由来 シグマ社製）
500mg、ジエチルエーテル１ml、蒸留水10mlを超
音波用セルに入れ、氷冷しながら600W20KHzで
５分間音波処理をし、乳化液を調整した。 このスフインゴミエリン乳化液0.2ml、0.2M酢
酸緩衝液（PH5.7）0.2ml、1M塩化カルシウム水
溶液0.1ml、20％Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピ
ロリジン水溶液0.5ml、を共栓付き試験管中に入
れ、PHを5.7に合した後、ホスホリパーゼDM水
溶液0.1ml（20U）を加えよく混合した後、30℃
で、２日静置した。次に反応液に0.1N塩酸を２
ml加えて反応を停止した後更にクロロホルム−メ
タノール混液（２：1V／Ｖ）10mlを加え激しく
混合し、リン脂質を抽出した。この混合液を2000
×ｇ10分間遠心し、下層のクロロホルム層を分取
し、分取したクロロホルム層を更に５mlの水で洗
つた。この混合液から遠心によつて再びクロロホ
ルム層を分取し、30℃で減圧乾燥した後、0.5ml
のｎ−ヘキサン−２−プロパノール−水（60：
80：14V／Ｖ）混液に溶解した。この試料10mlを
シリカゲル薄層（メルク社製シリカゲル60TLC
プレート20×20cm）にスポツトしクロロホルム−
メタノール−水（60：30：5V／Ｖ）の溶媒系で
展開したところ３種類のリン脂質が検出され、そ
のうち２つのスフインゴミエリン及び、Ｎ−アシ
ルスフインゴシン−１−リン酸とRf値が一致し
た。 そこでこの試料を高速液体クロマトグラフイー
によつて分離、精製した。 カラムはラジアルパツクカートリツジシリカ８
mm×10cm、（ウオーターズ社製）、溶媒はｎ−ヘキ
サン−イソプロパノール−水（60：80：14V／
Ｖ）で、ピークの検出には441型紫外線検出器
（ウーターズ社製）による214nmの吸収、及び、
R401型示差屈析計（ウオーターズ社製）を用い
た。試料は0.1mlづつ５回に分け注入した。この
溶媒によりＮ−アシルスフインゴシン−１−リン
酸、スフインゴミエリン、Ｎ−アシルスフインゴ
シン−１−リン酸−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）
ピロリジンエステルの３成分を分取した。 得られたＮ−アシルスフインゴシン−１−リン
酸−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピロリジンエ
ステルはもう一度同様な操作により精製し、精製
物３mgを得た。これはTLC及び高速液クロで単
一であることを確認した。 この化合物のIRスペクトルは日本分光A202型
赤外分光光度計を用い、液膜法で測定した。その
結果を第３表（Run No.３）に示した。 更に第３表に示した各種複素環アルコールにつ
いて同様な方法で転移生成物を調製してIRスペ
クトルを測定した。 その結果を第３表に示した。（Run1〜２、４〜
15） 【表】 【表】 実施例３ （Run No.１〜No.２） 実施例２と同様にして調整した５％スフインゴ
ミエリン乳化液10mlに0.2M酢酸緩衝液10ml（PH
5.7）と1M塩化カルシウム水溶液１mlを共栓付き
三角フラスコに入れエタノール塩酸塩５ｇを加え
更にホスホリパーゼDM水溶液10ml20U／ml）を
加え30℃で２日間静置した。上記静置後1N塩酸
を加えてPHを2.0に合し反応を止め更に50mlのク
ロロホルム−メタノール混液（２：1V／Ｖ）を
加え激しく撹拌し、生成物を抽出した。この混合
液を2000×ｇ２分間遠心し、下層のクロロホルム
層を分取した。 分取した抽出液を30℃で減圧乾固した後２mlの
ｎ−ヘキサン−２−プロパノール−水（60：80：
14V／Ｖ）混液に溶解した。以下実施例２と同様
な操作によりＮ−アシルスフインゴシン−１−リ
ン酸エタノールアミンエステルを精製し、精製物
150mgを得た。 同様な操作により精製Ｎ−アシルスフインゴシ
ン−１−リン酸グリセロールエステル130mgを得
た。 上記のようにして得られた 基質：Ｎ−アシルスフインゴシン−１−リン酸
エタノールアミンエステル、（セラミドホス
ホリルエタノールアミン） 基質：Ｎ−アシルスフインゴシン−１−リン酸
グリセロールエステル（セラミドホスホリル
グリセロール） の５％乳化液を0.2mlをそれぞれ別の共栓付き試
験管に入れ20％Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−２
−ピロリドン水溶液0.2ml、0.2M酢酸緩衝液（PH
5.7）0.2ml、1M塩化カルシウム水溶液0.1mlを加
えPHを5.7に合したホスホリパーゼDM水溶液0.1
ml（20U）を加え30℃で２日間静置した。 この反応液を実施例２と同様に処理し、共通の
転移生成物であるＮ−アシルスフインゴシン−１
−リン酸Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−２−ピロ
リドンエステルを得た。そのIRスペクトルを第
４表に示した。 【表】
全く知られていなかつた、スフインゴリン脂質複
素環化合物誘導体の酸素法により製法に関し、該
誘導体は例えばリポソーム形成基材、乳化剤、生
理活性物質及びそのキヤリヤーなどの分野に有用
な、酸素法スフインゴリン脂質複素環化合物誘導
体の製法に関する。 更に詳しくは、従来の、他のリン脂質について
の酸素法で使用されたキヤベツ由来のホスホリパ
ーゼＤ（至適温度40℃以下、至適PH5.4〜5.6）と
は異つて至適温度60〜70℃、至適PH７付近のホス
ホリパーゼDMの存在下で、スフインゴリン脂質
と従来、酸素法によつて製造できないとされてい
たアルコール性水酸基を有する複素環化合物とを
反応させるスフインゴリン脂質複素環化合物誘導
体の製法に関する。 尚、本発明に於てスフインゴリン脂質複素環化
合物誘導体とは、出発物質であるスフインゴリン
脂質のリン酸構造部分と該スフインゴリン脂質の
アルコール構造部分とのエステル結合を、ホスホ
リパーゼDMの作用で加水分解すると同時に上記
反応に用いるアルコール性水酸基を有する複素環
化合物へ転移させて誘導した、出発物質とは異る
新しいスフインゴリン脂質を意味する。 特に、本発明は、下記式（） 【式】 式中、Ａは下記式(i)又は(ii) 【化】 又は 【化】 の基を示し、ここで、Ｒは飽和もしくは不飽和の
C12〜C24の脂肪族炭化水素基を示し、A′はオキシ
ドアニオン又は水酸基を示し、Ｂは−（CH2）2Ｎ＋
（CH3）3、−（CH2）2NH2又は−CH2CH（OH）CH2
（OH）を示す。 で表わされるスフインゴリン脂質を、下記(1)〜(3)
に示すアルコール性水酸基を有する複素環化合
物、すなわち、 (1) 一級アルコール性OHに結合した鎖状側鎖を
有し、且つテトラヒドロフラン環、ジオキソラ
ン環、チオフエン環、ピロリジン環、イミダゾ
ール環、イミダゾリジン環、オキサゾール環、
チアゾール環、ピラン環、オキサン環、チアン
環、ピペリジン環、トリアジン環、テトラヒド
ロフタルイミド環、ベンゾオキソラン環及びヘ
キサメチレンイミン環よりなる群からえらばれ
る複素環を持つ複素環一級アルコール化合物、
ここで、該化合物の複素環部分はC1〜C3アル
キル基、C1〜C3アルキレン基、水酸基、カル
ボキシル基、カルボル基、ハロゲン、アミノ
基、オキソ基、ベンジル基、フエニル基及び
C1〜C3のアルキレンスルホン酸基より成る群
からえらばれる置換基を有していてもよい、 (2) 環に直接結合した二級アルコール性OHもし
くは二級アルコール性OHに結合した鎖状側鎖
を有し且つピペリジン環、モルホリン環、ピペ
ラジン環、ピロリジン環、オキサン環及びフタ
ルイミド環よりなる群からえらばれた複素環を
持つ複素環二級アルコール化合物、ここで、該
化合物の複素環部分はC1〜C3のアルキル基、
水酸基及びC1〜C3のアルキレンスルホン環基
より成る群からえらばれた置換基を有してもよ
い。 (3) ピリジン環、ピリミジン環、トリアジン環、
プリン環及び８−アザプリン環からえらばれる
複素環を置換基として有するペントース誘導体
又はデオキシペントース誘導体、ここで、該誘
導体の複素環部分はメルカプト基、ハロゲン、
水酸基、カルボキシル基、オキソ基、アミノ
基、C1〜C3のアルキル基、メトキシ基、エト
キシ基、カルボキシメチル基、アセチル基及び
アソイル基よりなる群からえらばれる置換基を
有してもよい、ただし、アデノシン、シチジ
ン、ウリジン、グアノシン及びアラビノシチジ
ンより成る群からえらばれる糖を持つ複素環化
合物を除外する、より成る群からえらばれるア
ルコール性水酸基を有する複素環化合物と、ス
フインゴリン脂質と複素環アルコールとの間の
転移反応を触媒しうるホスホリパーゼＤ（以下、
ホスホリパーゼDMという）の存在下で反応さ
せることを特徴とする下記式（） 【式】 式中、Ａ及びA′は上記の意味を有し、 Ｃは上記(1)〜(3)に示すアルコール性水酸基を
有する複素環化合物から該アルコール性水酸基
を除いた残基を示す、 で表わされるスフインゴリン脂質複素環化合物誘
導体及びその塩類の製法に関する。 従来、ホスホリパーゼＤがスフインゴリン脂質
Ｄがスフインゴリン脂質たとえばスフインゴミエ
リンのコリン塩基−リン酸エステルを加水分解
し、コリンとＮ−アシルスフインゴシン−１−リ
ン酸を生ずる反応を触媒することが知られている
〔F.M Davidson「Biochem，J.vol69、458−466
（1958）」（キヤベツホスホリパーゼＤ）；Ｙ，
OKAWA等「J.Biochem.，78，363−372（1975）」
（Strepto−myces hachijoeusisのホスホリパーゼ
Ｄ）〕。 更にグリセロリン脂質については、たとえばレ
シチンとエチルアルコールとをホスホリパーゼＤ
の存在下に反応させるとリン脂質のリン酸構造部
分と該リン脂質のアルコール構造部分とのエステ
ル結合が加水分解され、同時にホスフアチジル基
転移作用によりホスフアチジルエタノールを生成
する作用のあることが報公されている〔R.M.
Dawson；Biochem.J.102、205（1967）；Yaug；
J.Biol chem.，242、477（1967）〕。又キヤベツ由
来のホスホリパーゼＤのホススフアチジル基転移
作用を利用する英国特許No.1581810（対応西ドイツ
国公開No.2717547）には“ホスホリピツドの製法”
が提案されているが、この中ではグリセロリン脂
質とC5以下の鎖状一級アルコールとの間でのみ
ホスホリパーゼＤの作用によつて転移誘導体が生
起する事について述べているだけであつてスフイ
ンゴリン脂質とアルコールとの転移作用について
は全く記載も示唆もされていない。即ちこの提案
によれば、この提案の一般式で示されたグリセロ
リン脂質と水酸基、ハロゲン、アミノその他置換
基で置換されていてもよいC5までの直鎖もしく
は、分枝のアルキル基を有する一級アルコールと
の前記キヤベツ由来のホスホリパーゼＤの酵素作
用を利用した一級アルコール転移反応について開
示されているのみであつて非極性部分の構造をグ
リセリン脂質とは全く異にするスフインゴリン脂
質については全く言及されていない。唯一、
Robert J.CHALIFOUR，等はスフインゴミエリ
ンを基質としグリセロールを受容体アルコールと
して、ホスホリパーゼＤの作用によりグリセリン
転移の生成を試みたが生成しなかつたと報告して
いる。（Can.J.Biochem.，vol58、1189（1980））。
この様に従来、スフインゴリン脂質についてはア
ルコール性水酸基を有する化合物の共存下にホス
ホリパーゼＤを作用された時、スフインゴリン脂
質のリン酸構造部分と該スフインゴリン脂質のア
ルコール構造部分とのエステル結合が加水分解さ
れると同時にＮ−アシルスフインゴシン−１−リ
ン酸転移作用により出発スフインゴリン脂質とは
異なる新しいスフインゴリン脂質誘導体を生成す
る事は全く知られていなかつた。 本発明者等は、従来公知のキヤベツのホスホリ
パーゼＤとは、その至適温度、至適PH等で異なる
ホスホリパーゼＤ生産能を有する微生物の存在を
発見して既に、特開昭58−63388号、特開昭58−
67183号に提案した。 この提案の中では、該ホスホリパーゼＤ生産菌
より得られるホスホリパーゼＤはC5以下の一級
アルコールを包合して、更に従来全く言及された
ことのない広範囲なアルコール化合物に対してリ
ン脂質を転移させる作用を持つことが記載されて
いる。そしてこの中で、基質となるリン脂質とし
てグリセリン脂質、スフインゴリン脂質が記載さ
れ、又転移の起るアルコールの中で複素環アルコ
ールとしては複素環一級アルコールが記載され、
該複素環一級アルコールの複素環としてフラン
環、フタルイミド環、ピロール環、インドール
環、ピリジン環、モルホリン環、ピリミジン環、
ピペラジン環、イミダゾピリミジン環（プリン
環）が記載されている。 しかし上記提案の中にはテトラヒドロフラン
環、ジオキソラン環、チオフエン環、ピロリジン
環、イミダゾール環、イミダゾリジン環、チオキ
サゾール環、チアゾール環、ピラン環、オキサン
環、チアン環、ピペリジン環、トリアジン環、テ
トラヒドロフタルイミド環、ベンゾオキソラン
環、ヘキサメチレンイミン環を有する複素環一級
アルコール、及び複素環二級アルコールについて
は全く記載されていないし、示唆もされていな
い。又上記提案の中に記載されている複素環アル
コールについては、置換基の種類についてはとく
に言及されていないが、直換基を有する複素環一
級アルコールとして、ピリドキシン、チアミン及
びアデノシンの三種のみが記載されている。 本発明者等は、さらに研究を重ねた結果、該ホ
スホリパーゼDMは前記式（）で表わされるス
フインゴリン脂質を加水分解すると同時に、上記
提案に全く記載されていない前記(1)、(2)及び(3)よ
り成る群からえらばれたアルコール性水酸基を有
する複素環化合物に転移するという新しい事実を
発見した。 本発明者等の研究によれば、スフインゴリン脂
質としてたとえばスフインゴミエリンと複素環一
級アルコールであるＮ−（２−ヒドロキシエチル）
ピロリジンとの間におけるスフインゴリン脂質複
素環化合物誘導体の形成を触媒する本発明に於て
新たにホスホリパーゼDMと呼称する酵素が存在
し、このホスホリパーゼDMの存在下に、前記式
（）で表わされるスフインゴリン脂質と前記(1)
〜(3)のアルコール性水酸基を有する複素環化合物
とを反応させることにより、従来製造できること
の知られていなかつた新しいスフインゴリン脂質
複素環化合物誘導体が製造できる事が発見され
た。 斯して、煩雑且つ不利益な化学的合成手段を要
することなしに、温和且つ容易な条件及び、手段
で、副反応を伴うをおそれもなしに、一段階反応
で酵素法によつて新しいスフインゴリン脂質複素
環化合物誘導体を好収率で製造できることがわか
つた。 従つて本発明の目的は新しい酵素法スフインゴ
リン脂質複素環化合物誘導体の製法を提供するこ
とにある。 本発明の上記目的及び更に多くの他の目的なら
びに利点は以下の記載から一層明らかとなるであ
ろう。 本発明方法で利用するスフインゴリン脂質は下
記式（）で表わされる。 【化】 但し式中Ａは下記(i)又は(ii) 【化】 又は 【化】 を示し、 ここでＲは飽和もしくは不飽和のC12〜C24の脂
肪族炭化水素基を示し、 A′はオキシドアニオン又は水酸基を示し、Ｂ
は、−（CH2）2Ｎ＋（CH3）、−（CH2）2NH2もしくは
−CH2・CH（OH）CH2（OH）を示す。 上記式（）原子スフインゴリン脂質は公知化
合物であつて、市場でも入手可能であり、それ自
体公知の方法によつて天然物より抽出採取又は合
成することが出来る。例えば動植物及び微生物組
織から公知の手段で抽出して得られるスフインゴ
ミエリン、セラミドホスホリルエタノールアミ
ン、セラミドホスホリルグリセロール等の単独或
いは混合物をそのまま若しくは精製して用いるこ
とができるし、それ自体公知の方法によつてその
構造の一部もしくは全部を化学合成して利用する
ことが出来る。 本発明方法に於て上記式（）原料スフインゴ
リン脂質とホスホリパーゼDMの存在下に反応せ
しめる複素環アルコールとしては以下に例示する
(1)〜(3)のアルコール性水酸基を有する複素環化合
物を利用することが出来る。 (1) 複素環Ｍ級アルコール化合物として下記の化
合物をあげられる。一級アルコール性OHに結
合した鎖状側鎖を有し且つ下記複素環 テトラヒドロフラン環、ジオキソラン環、チオ
フエン環、ピロリジン環、イミダゾール環、イ
ミダゾリジン環、オキサゾール環、チアゾール
環、ピラン環、オキサン環、チアン環、ピペリ
ジン環、トリアジン環、テトラヒドロフタルイ
ミド環、ベンゾオキソラン環及びヘキサメチレ
ンイミン環 よりなる群からえらばれた複素環を持つ複素環
一級アルコール化合物残基、ここで該残基の複
素環部分はC1〜C3アルキル基、C1〜C3アルキ
レン基、水酸基、カルボキシル基、カルボニル
基、ハロゲン、アミノ基、オキソ基、ベンジル
基、フエニル基及びC1〜C3のアルキレンスル
ホン酸基より成る群からえらばれた置換基を有
してもよい； 上記において、置換基を持たない場合はチオフ
エン環、ピロリジン環、イミダゾール環、ピペリ
ジン環、テトラヒドロフタルイミド環、ベンゾオ
キソラン環及びヘキサメチレンイミン環が好まし
く、その例としてはＮ−（２−ヒドロキシエチル）
ピロリジン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペ
リジン、２−（２−ヒドロキシエチル）ピペリジ
ン、２−ヒドロキシメチルピペリジン、３−ヒド
ロキシメチルピペリジン、Ｎ−（２−ヒドロキシ
エチル）ヘキサメチレンイミン、２−チオフエン
メタノール、２−チオフエンエタノール、Ｎ−ヒ
ドロキシメチルテトラヒドロフタルイミド、４−
ヒドロキシメチルイミダゾール、ピペロニルアル
コールなどがあげられる。 上記において、置換基としてC1〜C3のアルキ
ル基を有する場合はジオキソラン環、ピロリジン
環、チアゾール環、オキサゾール環、イミダゾー
ル環及びイミダゾリジン環が好ましく、その例と
してはＮ−メチル−２−ヒドロキシエチルピロリ
ジン、２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン
−４−メタノール、１−（ヒドロキシメチル）−
５，５−ジメチルヒダントイン、２，４−ジメチ
ル−４−ヒドロキシオキサゾリン、５−（２−ヒ
ドロキシエチル）−４−メチルチアゾールなどが
あげられる。 上記において置換基としてC1〜C3のアルキレ
ン基を有する場合は、該アルキレン基は２つの複
素環を結ぶ結合を意味し、ピペリジン環が好まし
く、その例としては１，３−ビス（Ｎ−２−ヒド
ロキシエチル−４−ピペリジル）プロパン、１−
（Ｎ−２−ヒドロキシエチル−４−ピペリジル）−
３−（4′−ピペリジル）プロパンなどがあげられ
る。 上記において置換基として水酸基を有する場合
は、ピペリジン環、テトラヒドロフラン環及びオ
キサン環が好ましく、その例としては、Ｎ−（２
−ヒドロキシエチル）−４−（ヒドロキシプロピ
ル）ピペリジン、５−チオグルコース、コージ
酸、アルコルビン酸、イソアスコルピン酸、グル
コノ−δ−ラクトン、ガラクノ−γ−ラクトン、
α−グルコヘプトニツクアシツド−γ−ラクトン
などがあげられる。 上記において、置換基としてオキソ基を有する
場合はピロリジン環が好ましく、その例としては
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−２−ピロリドン、
Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−２−ピロリドン
などがあげられる。 上記において、置換基としてアミノ基を有する
場合はピリミジン環が好ましく、その例として、
トキソピリミジンなどがあげられる。 上記において置換基としてフエニル基を有する
場合はピペリジン環が好ましく、その例としては
スコポラミン、アトロピンなどがあげられる。 (2) 複素環二級アルコール化合物として下記の化
合物をあげられる。環に直接結合した二級アル
コール性OHもしくは二級アルコール性OHに
結合した鎖状側鎖を有し且つピペリジン環、モ
ルホリン環、ピペラジン環、ピロリジン環、オ
キサン環及びフタルイミド環よりなる群からえ
らばれた複素環を持つ複素環二級アルコール化
合物残基、ここで該残基の複素環部分はC1〜
C3のアルキル基、水酸基及びC1〜C3のアルキ
レンスルホン酸基より成る群からえらばれた置
換基を有してもよい：− 上記において環に直接結合した二級アルコール
性OHを持つ複素環としては、ピペリジン環及び
ピロリジン環が好ましく、その例としては３−ヒ
ドロキシピペリジン、４−ヒドロキシピペリジ
ン、３−ヒドロキシピロリジンなどがあげられ
る。 上記において二級アルコール性OHに結合した
鎖状側鎖を有する複素環としては、フタイミド環
及びモルホリン環、好ましくは、その例としては
Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）フタルイミド、
Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）モルホリンなど
があげられる。 上記において置換基として、C1〜C3のアルキ
ル基を有する場合はピペリジン環が好ましく、そ
の例としてはＮ−メチル−４−ヒドロキシピペリ
ジンなどがあげられる。 上記において置換基としてC1〜C3のアルキレ
ンスルホン酸基を有する場合はピペラジン環及び
モルホリン環が好ましく、その例としてはピペラ
ジン−Ｎ，N′−ビス（２−ヒドロキシプロパン
−３−スルホン環）、３−（Ｎ−モルホリン）−２
−ヒドロキシプロパンスルホン酸などがあげられ
る。 (3) 糖を持つ複素環化合物として下記のものがあ
げられる。ピリジン環、ピリミジン環、トリア
ジン環、プリン環及び８−アザプリン環からえ
らばれた複素環を置換基として有するペントー
ス残基又はデオキシペントース残基、ここで該
残基の複素環部分はメルカプト基、ハロゲン、
水酸基、カルボキシル基、オキソ基、アミノ
基、C1〜C3のアルキル基、メトキシ基、エト
キシ基、カルボキシメチル基、アセチル基及び
アニソイル基よりなる群からえらばれた置換基
を有してもよい：一 上記においてピリジン環を置換基として有する
ペントース残基及びデオキシペントース残基とし
ては、３−デアザウリジンなどがあげられる。 上記においてトリアジン環を置換基として有す
る、ペントース残基及びデオキシペントース残基
としては、５−アザシチジンなどがあげられる。 上記においてピリミジン環を置換基として有す
るペントース残基及びデオキシペントース残基と
しては、４−チオウリジン、５−ブロモウリジ
ン、５−ヒドロキシウリジン、６−フルオロデオ
キシウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボ
キシメチルウリジン、５−メチルウリジン、N4
−アセチルシチジン、55−メトキシウリジン、５
−ブロモ−2′−デオキシシチジン、N4−アニソ
イル−2′−デオキシシチジン、3′−Ｏ−メチルシ
チジン、オロチジン、サイクロシチジン、チミン
デオキシリボシド、ラウシルデオキシリボシド、
シトシンデオキシリボシド、などがあげられる。 上記においてプリン環を置換基として有するペ
ントース残基及びデオキシペントース残基として
は、６−メルカプトグアノシン、１−メチル−グ
アノシン、キサントシン、６−メルカプトプリン
リボシド、６−メチルアミノプリン−９−リボシ
ド、N6−メチル−2′−デオキシアデノシン、８
−プロモアデノシン、N6−エタノアデノシン、
2′−クロロアデノシン、１−メチルアデノシン、
N6，N6−ジメチルアデノシン、2′−Ｏ−メチル
アデノシン、イノシン、グアニンデオキシリボシ
ド、アデニンデオキシリボシドなどがあげられ
る。 上記において８−アザプリン環を置換基として
有するペントース残基及びデオキシペントース残
基としては８−アザアデノシンなどがあげられ
る。 上記例示の如き(1)〜(3)からえらばれたアルコー
ル性水酸基を有する複素環化合物が例示出来る
が、前記(1)〜(3)までの範囲がみたされる限り、ア
ルコール類の選択に制限はない。 上記例示の如き(1)〜(3)のアルコール性水酸基を
有する複素環化合物は天然物、合成品、いづれで
も利用できるが、目的とする化合物以外のアルコ
ール性水酸基を有する複素環化合物を含まないよ
うに、予め適当な手段を利用して精製して利用す
るのが好ましい。このような精製手段の例として
たとえば蒸留、再結晶、アルミナ、シリカゲル活
性炭、イオン交換樹脂などを用いたカラムクロマ
トグラフイー、薄層クロマトグラフイー及びこれ
等の適当な組合わせによる精製手段を例示でき
る。 本発明方法によれば前記例示の如き式（）ス
フインゴリン脂質と上記例示の如き(1)〜(3)の群か
らえらばれたアルコール性水酸基を有する複素環
化合物とをホスホリパーゼDMの存在下に反応さ
せる。 この際利用するホスホリパーゼDMとしては、
従来公知のキヤベツから抽出されたホスホリパー
ゼＤの至適温度40℃以下、至適PH5.4〜5.6に対し
て、至適温度60〜70℃、至適PH７付近である点で
公知ホスホリパーゼＤと区別ができるホスホリパ
ーゼDM生産菌の生産するホスホリパーゼDMが
例示できるが、Ｎ−アシルスフインゴシン脂質−
１−リン酸転移作用を有するホスホリパーゼDM
であればその起源にかかわらずすべて利用でき
る。 該ホスホリパーゼDMは式（）スフインゴリ
ン脂質とＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピロリジ
ンとの間におけるスフインゴリン脂質誘導体の形
成を触媒する点で公知ホスホリパーゼＤと区別で
きる。 このようなホスホリパーゼDM生産菌の例とし
ては、同一出願人の出願に係わる特開昭58−
63388号に開示されたノカルデイオプシス
（Nocardiopsis）属に属するホスホリパーゼDM
生産菌たとえばノルカデイオプシス属No.779株
〔FERM−BP−512〕、同一出願人の出願に係わ
る特開昭58−67183号に開示されたアクチノマデ
ユーラ（Actinomadu−ra）属に属するホスホリ
パーゼDM生産菌たとえばアクチノマデユーラ属
No.362株〔FERM−BP−511〕等を挙げることが
できるが前記式（）のリン脂質を原料として前
記(1)〜(3)のアルコール性水酸基を有する複素環化
合物の転移反応を起す作用を有するホスホリパー
ゼＤであれば如何なる起源のホスホリパーゼＤで
もホスホリパーゼDMとして用いることが出来
る。至適温度及び至適PHの相違と共に他のいくつ
かの相違点と共に、下掲第１表に、本発明方法で
利用するホスホリパーゼDMと公知ホスホリパー
ゼＤとの酵素学的性質の差異を示す。なお、酵素
学的性質は上記特開昭58−63388号公報及び特開
昭58−67183号公報記載の方法により測定したも
のである。 【表】 するサンライト株式会社の商品名である。
公知ホスホリパーゼＤを用いては得られなかつ
たスフインゴリン脂質複素環化合物誘導体が、本
発明方法を形成できる理由には、この酵素的触媒
反応に関与する公知ホスホリパーゼＤと本発明方
法で用いるホスホリパーゼDMとの上記の如き酵
素学的性質の差異が関与しているものと推測され
る。勿論、本発明方法はこのような作用の推測に
よつて何等の制約もうけるものではない。 本発明方法で利用するホスホリパーゼDMは後
記転移作用の実験方法〔TLCによる転移生成物
の生成確認方法〕に従つて反応を行つて例えば複
素環一級アルコールのＮ−（２−ヒドロキシエチ
ル）ピロリジンとスフインゴリン脂質であるスフ
インゴミエリンとの間におけるスフインゴリン脂
質誘導体形成反応を触媒して、該スフインゴリン
脂質の該複素環化合物誘導体を形成する。公知キ
ヤベツホスホリパーゼＤは上記誘導体を形成しな
い。 本発明方法によれば、前記例示の如き式（）
スフインゴリン脂質と前記例示の如き(1)〜(3)のア
ルコール性水酸基を有する複素環化合物とを、上
記に詳しく述べたホスホリパーゼDMの存在下に
反応させることにより、下記式（） 【化】 但し式中、Ａ，A′及びＣは前記したと同義で
ある、 で表わされるスフインゴリン脂質複素環化合物誘
導体を製造することができる。この際、ホスホリ
パーゼDMは精製品として使用する必要はなく粗
製品であつてもよい。更に、適当な固定化担体た
とえばポリプロピレン膜、セライト粒、ガラスピ
ーズなどの如き各種の重合体樹脂類や無機材料の
粒状物やフイルム状物に担持固定化して利用する
こともできる。 反応は、ホスホリパーゼDMの存在下で、好ま
しくは溶媒の存在下に、式（）スフインゴリン
脂質と前記(1)〜(3)アルコール性水酸基を有する複
素環化合物とを接触せしめることにより行うこと
ができる。利用する溶媒の例としては、水性溶媒
及び水性溶媒と有機溶媒との混合溶媒を例示する
ことができる。又、アルコール性水酸基を有する
複素環化合物によつてはそれ自体に溶媒の役目を
兼ねさせることができる。また、ホスホリパーゼ
DMの酵素学的触媒作用を阻害しない任意の他の
添加剤を含む溶媒も利用でき、たとえば該作用を
促進したり、酵素の安定化に役立つ適当な添加剤
を含有した溶媒であることができる。例えば、ア
ルブミン、カゼイン等の蛋白質、酢酸、クエン
酸、リン酸などの緩衝剤を含有したり、塩化カル
シウムその他の中性塩を含有したり又、タウロコ
ール酸ソーダ等の胆汁酸塩類を含有した水性溶媒
であることができる。更に、有機溶媒の例として
は、例えば、ｎ−ヘプタン、ｎ−ヘキサン、イソ
オクタンなどの如き脂肪族炭化水素類；シクロペ
ンタン、シクロヘキサン、シクロブタンなどの如
き脂環族炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシ
レンなどの如き芳香族炭化水素類；アセトン、メ
チルイソプロピルケトンなどの如きケトン類；ジ
メチルエーテル、ジエチルエーテル、ジイソプロ
ピルエーテルなどの如きエーテル類；酢酸メチ
ル、酢酸エチルなどの如きエステル類；四塩化炭
素、クロロホルム、塩化メチレンなどの如きハロ
ゲン化炭化水素類；ジメチルホルムアミドの如き
アミド溶媒類；ジメチルスルホキシドの如きスル
ホキシド溶媒類などを例示することができる。 水性溶媒と有機溶媒との混合溶媒の形で利用す
る場合の両者の混合比は適当に選択できるが、例
えば水性溶媒：有機溶媒（Ｖ／Ｖ比）の比で
100：０〜１：99の如き混合比を例示することが
できる。 反応モル比、ホスホリパーゼDMの使用量、溶
媒の使用量などは、適宜に選択できるが、例え
ば、式（）スフインゴリン脂質１モルに対して
前記(1)−(3)アルコール性水酸基を有する複素環化
合物約１：１〜約１：1000モルの反応モル比を例
示することができる。また、ホスホリパーゼDM
の使用量としては、例えば、式（）スフインゴ
リン脂質１ｇ当り約10〜約100000単位、好ましく
は約100〜約1000単位程度の使用量を例示するこ
とができる。さらに、溶媒の使用量としては、例
えば、式（）スフインゴリン脂質に対して約２
〜約100容量倍程度の使用量を例示できる。 反応は、室温で進行するので、とくに冷却或は
加熱の必要はないが、所望により適宜に冷却もし
くは加温条件を採用することができる。例えば、
約０℃〜約90℃、好ましくは、約20℃〜約60℃の
如き反応温度を例示することができる。また反応
時間も適宜に選択できるが、例えば約１分〜約10
日、好ましくは約１時間〜第72時間の如き反応時
間を例示することができる。所望により、たとえ
ばTLC（薄層クロマトグラフイー）などの手法を
利用して反応経過を追跡し、所望の目的物の形成
を確認することにより反応時間を適宜に変更する
ことができる。 ホスホリパーゼDMの存在下で式（）スフイ
ンゴリン脂質と前記(1)〜(3)アルコール性水酸基を
有する複素環化合物とを接触せしめる態様は適宜
に選択できるが、撹拌もしくは振盪条件下で行う
のが普通である。又、酸化分解を受け易い基質又
はアルコール性水酸基を有する複素環化合物を用
いて反応する場合は窒素気流中等で行う事が望ま
しい。又、前記のように適当な粒状物やフイルム
状物担体に担持固定化した固定化酵素の形でホス
ホリパーゼDMを利用する場合には、例えば、固
定化酵素膜もしくは固定化酵素粒子層を介して反
応組成液を循環ポンプを用いて通過させる態様で
行うことができる。 上述のようにして反応を行つた後、形成された
式（）のようにして反応を行つた後、形成され
た式（）スフインゴリン脂質複素化合物誘導体
は、そのまま又は塩の形で沈殿させて分離して利
用することができる。尚、ここで式（）スフイ
ンゴリン脂質複素環化合物誘導体の塩としては、
例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、燐酸等の無機酸
との塩、シユウ酸、マレイン酸、乳酸、酒石酸、
フマール酸、メタンスルホン酸、ベンビンスルホ
ン酸、トルエンスルホン酸等の有機酸との塩、ア
ルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のア
ミノ酸との塩、ナトリウム、カリウムなどのアル
カリ金属との塩、マグネシウム、カルシウム等の
アルカリ士類金属との塩及びアンモニウム塩等が
あげられる。更に、該誘導体及びその塩はケイ酸
カラムクロマト、アルミナカラムクロマト、イオ
ン交換クロマト、高速液体クロマト、向流分配、
ゲル過、吸着クロマト等の適当な公知の方法を
利用して分離精製することができる。 本発明方法によれば、上述したようにして、式
（）スフインゴリン脂質と前記(1)〜(3)のアルコ
ール性水酸基を有する複素環化合物とを、ホスホ
リパーゼDMの存在下に反応させて式（）スフ
インゴリン脂質複素化合物誘導体を製造すること
ができる。得られる式（）スフインゴリン脂質
複素環化合物誘導体は、すぐれた界面活性作用を
有し細胞膜の透過性に大きな影響を持つ。この意
味から、該式（）誘導体はリポソーム形成基材
として又、リポソーム表面の修飾基材として利用
出来る他、化粧品たとえばクリーム、乳液に配合
して皮膚生理に役立つ乳化剤として、更に脂肪系
薬剤の乳化剤、殺虫剤、除草剤など乳化剤などの
広い乳化剤用途に有用である。 更にスフインゴリン脂質は、植物細胞と動物細
胞の重要な膜成分であり、動物では特に脳と伸経
組織に多量に存在している他、臓器や血球中にも
存在する。スフインゴリン脂質の中で最も豊富に
見られるのはスフインゴミエリンでありその誘導
体と考えられるものとしてセラミドホスホリルエ
タノールアミン、セラミド２−アミノエチルホス
ホネート等が知られているが天然に見出されるス
フインゴリン脂質の種類はまだ、きわめて少な
い。スフインゴリン脂質の生理的役割について
は、神経伝達に関与していると考えられている
が、この分野での解明はまだあまりなされていな
い。 むしろそのアナログとも言えるスフインゴグリ
コリピツドについては、様々な抗原として、又は
細菌毒素、インターフエロン、ホルモンなどのリ
セプターとして知られている。 又最近では細胞の分化誘導、増殖に関与してい
る事も考えられている。 本発明で誘導しうる式（）スフインゴリン脂
質複素環化合物誘導体は多くの異つた構造を有す
る新規なスフインゴリン脂質誘導体であり、これ
等のスフインゴリン脂質アナログの中には神経系
薬剤として有効な作用を有する誘導体が期待出来
る。又これ等の誘導体、特に糖を持つ複素環を誘
導したスフインゴリン脂質アナログの中には細胞
培養に用いた時その分化誘導を促進したり細胞の
増殖を進めたりする効果を有するものが存在する
可能性が考えられる。又逆に分化あるいはガン化
の進行を阻止する効果を発現する可能性も考えら
れる。又、一、二級アルコール水酸基を有する複
素環化合物或は一、二級アルコール水酸基を導入
した複素環薬理活性化合物を、スフインゴリン脂
質に転移させることによつて、該化合物の薬理的
副作用を弱めたり或は薬理効果を高めてその投与
量を低減させたりすることも期待できる。さらに
又、上記薬理活性化合物をスフインゴリン脂質に
転移させて、該化合物を患部に的確に集中させる
ための薬理活性化合物のキヤリヤーとして、さら
には、薬理活性化合物の保護基として有用な役割
をはたすことも期待できる。 又更に、各種医薬品をはじめとする化学合成の
中間体として有用であり、例えば、反応性の高い
ハロゲンやアミノ置換基を有するアルコールを転
移させた誘導体を利用出来る。更に又三重水素や
14Cでラベルしたアルコール性水酸基を有する複
素環化合物を転移することによつてラベルされた
スフインゴリン脂質複素環化合物誘導体が得ら
れ、スフインゴリン脂質の代謝経路の解明に移用
する事も出来る。 以下、実施例により本発明方法実施の数態様に
ついて、更に詳しく例示する。 参考例１ ホスホリパーゼDMの調製。 きな粉3.0％、コーンスターチ−プリカー1.0
％、ペプトン0.5％、粉末酵母エキス0.1％、グル
コース1.0％、NH4NO30.25％、K2HPO40.4％、
MsSO4・7H2O0.01％、ツウイン（Tween）−85
0.1％から成る培地（PH6.0）約15を30ジヤー
フアーメンターに入れ、120℃で15分間滅菌後、
シード培養液1.5を植菌し、27℃で40時間培養
を行つた。尚、上記シード培養液は、殿粉１％、
（NH4）H2PO40.25％、ペプトン0.25％、
K2HPO30.2％、MgSO4・7H2O0.01％を含む水溶
液培地（PH6.8）100mlを500ml坂口フラスコに入
れ、蒸気殺菌後、ノカルデイオプシス属NO.779
株〔FERM.BP512〕又はアクチノマデユーラ属
NO.362株〔FERM・BP−511〕の胞子を一白金
耳接種し、培養温度30℃、120回転／分の条件で
２日間振盪培養して調製した。 培養後、菌体固形物を遠心分離により除去し、
遠心上清13（ノカルデイオプシス属FERM・
BP−512を用いた場合は0.54u／ml；アクチノマ
デユーラ属FERM・BP−511株を用いた場合は
1.7u／mlであつた。）を得た。この遠心上清を５
℃に冷却した後、−20℃のアセトンを加えてアセ
トン濃度30〜70％画分に相当するホスホリパーゼ
DMを含む沈殿物を遠心分離により集めた。この
沈殿物を、ノカルデイオプシス属FERM・BP−
512株を用いた場合にはPH6.0、アクチノマデユー
ラ属FERM・BP−511株を用いた場合はPH6.5の
トリス・マレイン酸に溶解し、0.02Mの同緩衝液
に対して透析した後、同緩衝液で平衡化した
DEAE−セルロースに通塔し、通過区分を集め
た。次に堀内等の方法〔J.Biochem.81、1639
（1977）〕で調整したパルミトイルガーゼをカラム
に充填し、充分に水洗してから上記DEAE−セル
ロース通過液を注入し、活性を吸着した。これを
0.05Mトリス−塩酸緩衝液（PH7.2）で洗浄後、
0.2％Triton Ｘ−100を含む同緩衝液を加え活性
を溶出した。活性区分を集めてバイオエンジエア
リング社製の限外過膜（Type Ｇ−10T）を用
いて濃縮した後、ゲル過担体としてトヨパール
HW−55F〔東洋曹達(株)製〕充填カラムに注入し、
蒸留水を用いて通塔し、活性区分を集めて凍結乾
燥を行つた。 この乾燥粉末を、ノカルデイオプシス属ホスホ
リパーゼDMの場合には0.025Mイミダゾール・
塩酸（PH7.4）に溶解後、アクチノマデユーラ属
ホスホリパーゼDMの場合には0.025Mトリス−
酢酸（PH8.3）に溶解後、フアルマシア・フアイ
ンケミカルス社製のポリバツフア交換体PBETN94
（20ml）充填カラムに通塔して活性を吸着後、同
社製の溶出用ポリバツフア（PH5.0）を用いてPH
勾配により溶出した。溶出したホスホリパーゼ
DMの活性区分を集めて限外過膜にて濃縮し、
セフアデツクスＧ−75充填カラムに通塔し、ホス
ホリパーゼDM活性区分を集めて凍結乾燥した。 斯くて、ノカルデイオプシス属ホスホリパーゼ
DMの場合には、約40％の活性回収率で、比活性
178.3u／mg蛋白質として、アクチマデユーラ属ホ
スホリパーゼDMの場合には約43％の活性回収率
で、比活性218.3u／mg蛋白質として、ホスホリポ
ーゼDMが回収された。 実施例１ （Run No.１〜No.50） スフインゴミエリン、卵黄由来（シグマ社製）
と後掲第２表に示した多数種の複素環アルコール
とを、後記TLCによる転移生成物の生成確認方
法に従つて、ホスホリパーゼDMの存在下で反応
させて、転移生成物の形成を確認した。そのRf
値を後掲第２表に示した。 TLCによる転移生成物の生成確認方法：一下
記組成 １％スフインゴミエリン乳化液 0.1ml 0.2M酢酸緩衝液（PH5.7）、 0.1ml 1M塩化カルシウム水溶液 0.01ml 20％複素環アルコール水溶液 0.2ml の反応液にホスホリパーゼDM水溶液0.01ml
（IU）を加え、30℃で２日静置した。 尚上記１％スフインゴミエリン乳化液はスフイ
ンゴミエリン100mgにジエチルエーテル−石油エ
ーテル（１：1V／Ｖ）１ml及び蒸留水10mlを加
え氷冷条件下に600W、20KHzの条件で５分間超
音波処理して形成した。又上記20％複素環アルコ
ール水溶液は、必要に応じて1N塩酸もしくは1N
カセイソーダでPHを6.0に調整した後に用いた。 上記静置後0.1N塩酸0.5mlを加え反応を停止し
た後激しく撹拌し、脂質（生成物）を抽出した。
この懸濁液を数分静置し、下層のクロロホルム層
を分取し、30℃で減圧乾固した後、クロロホルム
−メタノール混液（２：1V／Ｖ）100に溶解し
て、TLCの試料とした。このうち10をシリカ
ゲル薄層（メルク社製、シリカゲル60TLCプレ
ート、20×20cm）にスポツトし、クロロホルム−
メタノール−水（60：30：5V／Ｖ）、クロロホル
ム−メタノール−アンモニア−水（50：20：１：
2V／Ｖ）又はジイソブチルケトン−酢酸−水
（40：25：5V／Ｖ）を展開溶媒として展開した。 スポツトの検出は下記の試薬を用いた。 検出されたスポツトで末分解の基質及びその加
水分解物であるＮ−アシルスフインゴシン−１−
リン酸以外のリン脂質のスポツトが検出された場
合、これを転移生成物と認めた。 展開溶媒としてクロロホルム−メタノール−水
（60：30：5V／Ｖ）を用いた時のRf値を第２表に
示した。（Run No.１〜50） 検出試薬： リンの呈色：Zinzadeの試薬（Beiss U.J.
Chromatog.13、104、1964） プリン及びピリミジンの呈色：フルオレツセイン
−アンモニア試薬（Wieland T.らAngew.
63、511、1951） 有機化合物の呈色：50％硫酸。 【表】 【表】 実施例２ （Run No.１〜No.15） スフインゴミエリン（卵黄由来 シグマ社製）
500mg、ジエチルエーテル１ml、蒸留水10mlを超
音波用セルに入れ、氷冷しながら600W20KHzで
５分間音波処理をし、乳化液を調整した。 このスフインゴミエリン乳化液0.2ml、0.2M酢
酸緩衝液（PH5.7）0.2ml、1M塩化カルシウム水
溶液0.1ml、20％Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピ
ロリジン水溶液0.5ml、を共栓付き試験管中に入
れ、PHを5.7に合した後、ホスホリパーゼDM水
溶液0.1ml（20U）を加えよく混合した後、30℃
で、２日静置した。次に反応液に0.1N塩酸を２
ml加えて反応を停止した後更にクロロホルム−メ
タノール混液（２：1V／Ｖ）10mlを加え激しく
混合し、リン脂質を抽出した。この混合液を2000
×ｇ10分間遠心し、下層のクロロホルム層を分取
し、分取したクロロホルム層を更に５mlの水で洗
つた。この混合液から遠心によつて再びクロロホ
ルム層を分取し、30℃で減圧乾燥した後、0.5ml
のｎ−ヘキサン−２−プロパノール−水（60：
80：14V／Ｖ）混液に溶解した。この試料10mlを
シリカゲル薄層（メルク社製シリカゲル60TLC
プレート20×20cm）にスポツトしクロロホルム−
メタノール−水（60：30：5V／Ｖ）の溶媒系で
展開したところ３種類のリン脂質が検出され、そ
のうち２つのスフインゴミエリン及び、Ｎ−アシ
ルスフインゴシン−１−リン酸とRf値が一致し
た。 そこでこの試料を高速液体クロマトグラフイー
によつて分離、精製した。 カラムはラジアルパツクカートリツジシリカ８
mm×10cm、（ウオーターズ社製）、溶媒はｎ−ヘキ
サン−イソプロパノール−水（60：80：14V／
Ｖ）で、ピークの検出には441型紫外線検出器
（ウーターズ社製）による214nmの吸収、及び、
R401型示差屈析計（ウオーターズ社製）を用い
た。試料は0.1mlづつ５回に分け注入した。この
溶媒によりＮ−アシルスフインゴシン−１−リン
酸、スフインゴミエリン、Ｎ−アシルスフインゴ
シン−１−リン酸−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）
ピロリジンエステルの３成分を分取した。 得られたＮ−アシルスフインゴシン−１−リン
酸−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピロリジンエ
ステルはもう一度同様な操作により精製し、精製
物３mgを得た。これはTLC及び高速液クロで単
一であることを確認した。 この化合物のIRスペクトルは日本分光A202型
赤外分光光度計を用い、液膜法で測定した。その
結果を第３表（Run No.３）に示した。 更に第３表に示した各種複素環アルコールにつ
いて同様な方法で転移生成物を調製してIRスペ
クトルを測定した。 その結果を第３表に示した。（Run1〜２、４〜
15） 【表】 【表】 実施例３ （Run No.１〜No.２） 実施例２と同様にして調整した５％スフインゴ
ミエリン乳化液10mlに0.2M酢酸緩衝液10ml（PH
5.7）と1M塩化カルシウム水溶液１mlを共栓付き
三角フラスコに入れエタノール塩酸塩５ｇを加え
更にホスホリパーゼDM水溶液10ml20U／ml）を
加え30℃で２日間静置した。上記静置後1N塩酸
を加えてPHを2.0に合し反応を止め更に50mlのク
ロロホルム−メタノール混液（２：1V／Ｖ）を
加え激しく撹拌し、生成物を抽出した。この混合
液を2000×ｇ２分間遠心し、下層のクロロホルム
層を分取した。 分取した抽出液を30℃で減圧乾固した後２mlの
ｎ−ヘキサン−２−プロパノール−水（60：80：
14V／Ｖ）混液に溶解した。以下実施例２と同様
な操作によりＮ−アシルスフインゴシン−１−リ
ン酸エタノールアミンエステルを精製し、精製物
150mgを得た。 同様な操作により精製Ｎ−アシルスフインゴシ
ン−１−リン酸グリセロールエステル130mgを得
た。 上記のようにして得られた 基質：Ｎ−アシルスフインゴシン−１−リン酸
エタノールアミンエステル、（セラミドホス
ホリルエタノールアミン） 基質：Ｎ−アシルスフインゴシン−１−リン酸
グリセロールエステル（セラミドホスホリル
グリセロール） の５％乳化液を0.2mlをそれぞれ別の共栓付き試
験管に入れ20％Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−２
−ピロリドン水溶液0.2ml、0.2M酢酸緩衝液（PH
5.7）0.2ml、1M塩化カルシウム水溶液0.1mlを加
えPHを5.7に合したホスホリパーゼDM水溶液0.1
ml（20U）を加え30℃で２日間静置した。 この反応液を実施例２と同様に処理し、共通の
転移生成物であるＮ−アシルスフインゴシン−１
−リン酸Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−２−ピロ
リドンエステルを得た。そのIRスペクトルを第
４表に示した。 【表】
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記式（） 【式】 式中、Ａは下記式(i)又は(ii) 【化】 又は 【化】 の基を示し、ここで、Ｒは飽和もしくは不飽和の
C12〜C24の脂肪族炭化水素基を示し、 A′はオキシドアニオン又は水酸基を示し、Ｂ
は−（CH2）2Ｎ＋（CH3）3、−（CH2）2NH2 又は−CH2CH（OH）CH2（OH）を示す、 で表わされるスフインゴリン脂質を、下記(1)〜(3)
に示すアルコール性水酸基を有する複素環化合
物、すなわち、 (1) 一級アルコール性OHに結合した鎖状側鎖を
有し、且つテトラヒドロフラン環、ジオキソラ
ン環、チオフエン環、ピロリジン環、イミダゾ
ール環、イミダゾリジン環、オキサゾール環、
チアゾール環、ピラン環、オキサン環、チアン
環、ピペリジン環、トリアジン環、テトラヒド
ロフタルイミド環、ベンゾオキソラン環及びヘ
キサメチレンイミン環よりなる群からえらばれ
る複素環を持つ複素環一級アルコール化合物、
ここで、該化合物の複素環部分はC1〜C3アル
キル基、C1〜C3アルキレン基、水酸基、カル
ボキシル基、カルボニル基、ハロゲン、アミノ
基、オキソ基、ベンジル基、フエニル基及び
C1〜C3のアルキレンスルホン酸基より成る群
からえらばれる置換基を有していてもよい、 (2) 環に直接結合した二級アルコール性OHもし
くは二級アルコール性OHに結合した鎖状側鎖
を有し且つピペリジン環、モルホリン環、ピペ
ラジン環、ピロリジン環、オキサン環及びフタ
ルイミド環よりなる群からえらばれる複素環を
持つ複素環二級アルコール化合物、ここで、該
化合物の複素環部分はC1〜C3のアルキル基、
水酸基及びC1〜C3のアルキレンスルホン酸基
より成る群からえらばれる置換基を有してもよ
い、 (3) ピリジン環、ピリミジン環、トリアジン環、
プリン環及び８−アザプリン環からえらばれる
複素環を置換基として有するペントース誘導体
又はデオキシペントース誘導体、ここで、該誘
導体の複素環部分はメルカプト基、ハロゲン、
水酸基、カルボキシル基、オキソ基、アミノ
基、C1〜C3のアルキル基、メトキシ基、エト
キシ基、カルボキシメチル基、アセチル基及び
アニソイル基よりなる群からえらばれる置換基
を有してもよい、ただし、アデノシン、シチジ
ン、ウリジン、グアノシン及びアラビノシチジ
ンより成る群からえらばれる糖を持つ複素環化
合物を除外する、より成る群からえらばれるア
ルコール性水酸基を有する複素環化合物と、ス
フインゴリン脂質と複素環アルコールとの間の
転移反応を触媒しうる、非イオン性界面活性剤
ポリオキシエチレン(10)オクチルフエニルエーテ
ルによつて賦活されるホスホリパーゼＤの存在
下で反応させることを特徴とする下記式（） 【式】 式中、ＡおよびA′は上記の意味を有し、Ｃ
は上記(1)〜(3)に示すアルコール性水酸基を有す
る複素環化合物から該アルコール性水酸基を除
いた残基を示す、 で表わされるスフインゴリン脂質複素環化合物誘
導体及びその塩基の製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59209930A JPS6188891A (ja) | 1984-10-08 | 1984-10-08 | 酵素法スフインゴリン脂質複素環化合物誘導体の製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59209930A JPS6188891A (ja) | 1984-10-08 | 1984-10-08 | 酵素法スフインゴリン脂質複素環化合物誘導体の製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6188891A JPS6188891A (ja) | 1986-05-07 |
| JPH0588114B2 true JPH0588114B2 (ja) | 1993-12-21 |
Family
ID=16581008
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59209930A Granted JPS6188891A (ja) | 1984-10-08 | 1984-10-08 | 酵素法スフインゴリン脂質複素環化合物誘導体の製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6188891A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2588729B2 (ja) * | 1987-10-05 | 1997-03-12 | 塩野義製薬株式会社 | スフィンゴシン誘導体 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5863388A (ja) * | 1981-10-12 | 1983-04-15 | Meito Sangyo Kk | ホスホリパ−ゼｄの製造法 |
| JPS5867183A (ja) * | 1981-10-15 | 1983-04-21 | Meito Sangyo Kk | ホスホリパ−ゼｄの製造方法 |
-
1984
- 1984-10-08 JP JP59209930A patent/JPS6188891A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6188891A (ja) | 1986-05-07 |
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