JPH0664058B2 - 核酸の塩基配列決定のための信号処理方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、核酸の塩基配列決定のための信号処理方法に
関するものである。

［発明の背景］ 近年、急速に発達して来た分子生物学の分野において
は、生物体の機能や複製のメカニズムを解明するため
に、生物体のもつ遺伝情報を明らかにすることが必須の
こととなっている。とりわけ、特定の遺伝情報を担うＤ
ＮＡ（もしくはＤＮＡ断片物、以下同様）などの核酸の
塩基配列を決定することが必要不可欠なこととなってい
る。

ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸の塩基配列を決定するための
代表的な方法として、オートラジオグラフィーを利用す
るマキサム・ギルバード（Maxam-Gilbert）法およびサ
ンガー・クールソン（Sanger-Coulson）法が知られてい
る。前者のマキサム・ギルバート法は、まず、塩基配列
を決定しようとしているＤＮＡあるいはＤＮＡ断片物の
鎖状分子の一方の端部に³²Ｐ等の放射性同位元素を含む
基を結合させることにより、その対象物を放射性標識物
質としたのち、化学的な手段を利用して鎖状分子の各構
成単位間の結合を塩基特異的に切断する。次に、この操
作により得られた塩基特異的ＤＮＡ切断分解物の混合物
をゲル電気泳動法により分離展開し、多数の切断分解物
がそれぞれ分離展開されて形成された分離展開パターン
（ただし、視覚的には見ることができない）を得る。こ
の分離展開パターンをたとえばＸ線フィルム上に可視化
してそのオートラジオグラフを得、得られたオートラジ
オグラフと各々の塩基特異的切断手段とから、放射性同
位元素が結合された鎖状分子の端部から一定の位置関係
にある塩基を順次決定し、これにより対象物全ての塩基
配列を決定することができる。

また、後者のサンガー・クールソン法は、ＤＮＡあるい
はＤＮＡ断片物の鎖状分子と相補的であって、かつ放射
性標識が付与されたＤＮＡ合成物を化学的な手段を利用
して塩基特異的に合成し、この塩基特異的ＤＮＡ合成物
の混合物を用いて上記と同様にしてそのオートラジオグ
ラフから塩基配列を決定する方法である。

本出願人は、上記核酸の塩基配列決定を簡易かつ高精度
で行なうことを目的として、それに利用されるオートラ
ジオグラフ測定操作において、上記Ｘ線フィルム等の写
真感光材料を用いる従来の放射線写真法の代りに、蓄積
性蛍光体シートを用いる放射線像変換方法を利用する方
法について既に特許出願している（特開昭５９−８３０
５７号、特開昭６０−９３３５４号）。ここで、蓄積性
蛍光体シートは輝尽性蛍光体からなるものであり、放射
線エネルギーを該蛍光体シートの輝尽性蛍光体に吸収さ
せたのち、可視乃至赤外領域の電磁波（励起光）で励起
することにより、放射線エネルギーを蛍光として放出さ
せることができるものである。この方法によれば、露光
時間を大幅に短縮化することができ、また従来より問題
となっていた化学カブリ等が発生することがない。さら
に、放射性標識物質のオートラジオグラフは、一旦放射
線エネルギーとして蛍光体シートに蓄積されたのち輝尽
光として光電的に読み出されるから、直接にデジタル信
号として得たのち適当な記録媒体に保存することができ
る。

従来より、核酸の塩基配列は、可視化されたオートラジ
オグラフについて、放射性標識が付与された核酸の塩基
特異的切断分解物もしくは塩基特異的合成物（以下、単
に核酸の塩基特異的断片物と称する）の分離展開位置
（バンド）を視覚的に判断し、それらのバンドの位置を
相互に比較することにより決定されている。よって、オ
ートラジオグラフの解析は通常人間の視覚を通して行な
われており、そのために多大な時間と労力が費されてい
る。

また、人間の目に依存しているため、オートラジオグラ
フを解析して得られる核酸の塩基配列が解析者によって
異なるなど塩基配列情報の精度には限界がある。

そこで、本出願人は、上記オートラジオグラフをデジタ
ル画像データとして得た後このデジタル画像データに適
当なデジタル信号処理を施すことにより、ＤＮＡの塩基
配列を自動的に決定する方法についても既に特許出願し
ている（特開昭５９−１２６５２７号、特開昭６０−２
３３５５７号、特開昭６２−８５８６１号、特開昭６２
−８５８６２号等）。オートラジオグラフに対応するデ
ジタル画像データは、従来の放射線フィルムを利用する
場合には一旦オートラジオグラフを該フィルム上に可視
画像化したのち、反射光または透過光を利用して光電的
に読み取ることにより得られる。また、蓄積性蛍光体シ
ートを用いる場合には、オートラジオグラフが蓄積記録
された蛍光体シートを直接に読み出すことにより得られ
る。

しかしながら、実際に放射性標識物質を電気泳動法など
により支持媒体上に分離展開させて得られた分離展開パ
ターンには種々の歪みおよびノイズが生じがちである。

たとえば、試料の作成時において核酸の塩基特異的断片
物の調製、分離が不十分であったり、試料に放射線不純
物が混入したり、あるいは露光時に自然放射線等の照射
を受けたりすることにより、そのオートラジオグラフ上
にノイズが発生することがある。この結果、ノイズも含
めてバンドの比較同定が行なわれるために、塩基配列決
定に誤差が生じて得られる情報の精度が低下してしま
う。

このようなノイズが発生した場合であっても、そのオー
トラジオグラフを包含するデジタル画像データに効率良
く信号処理を施して核酸の塩基配列を高精度で自動決定
することが望まれる。

［発明の要旨］ 本発明者は、放射性標識物質からなる分離展開パターン
のオートラジオグラフにノイズが生じている場合であっ
てもそのデジタル画像データに好適なデジタル信号処理
を施すことにより、核酸の塩基配列を簡易かつ高精度で
自動決定することを実現した。

すなわち、本発明は、放射性標識が付与された塩基特異
的ＤＮＡ断片物もしくは塩基特異的ＲＮＡ断片物の混合
物が支持媒体上に一次元的方向に分離展開されて形成さ
れた分離展開パターンのオートラジオグラフを包含する
デジタル画像データについてデジタル信号処理を行なう
ことにより、核酸の塩基配列を決定する方法において、 １）一つの分離展開列について、分離展開方向に沿った
位置と信号のレベルとからなる一次元波形を少なくとも
二つ得る工程、 ２）全ての一次元波形上でピークを検出する工程、 ３）一つの一次元波形上の一つのピークについて、隣接
する一次元波形上の該ピークの位置を中心とする一定範
囲内に、ピークが存在するか否かを探索する工程、 ４）第三工程においてピークが存在する場合には、順次
隣接する一次元波形に対して第三工程を繰り返す工程、 ５）第三および第四工程で、互いに隣接する予め決めら
れた数以上の複数個の一次元波形上でピークが検出され
た場合には、一連のピークの位置にバンドが存在すると
決定し、それ以外の場合には該ピークの位置にバンドは
存在しないと決定する工程、および ６）上記第三乃至第五工程を順次繰り返すことにより、
分離展開列上の全てのバンドを検出する工程、 を含むことを特徴とする核酸の塩基配列決定のための信
号処理方法を提供するものである。

本発明によれば、核酸の塩基特異的断片物の混合物を支
持媒体上で分離展開させて得られた分離展開パターンの
オートラジオグラフを包含するデジタル画像データにお
いて、分離展開パターンにノイズが生じている場合で
も、ノイズを排除して真正バンドのみを検出しうる信号
処理機能を有する処理回路を通すことにより、核酸の塩
基配列を簡易かつ高精度で得ることができる。

分離展開列についてその分離展開方向に沿った位置と信
号のレベルとからなる一次元波形（ラスタ）上で単純に
ピークを検出しただけでは、真のバンドのほかにノイズ
をもバンドと誤認しがちであり、正確な塩基配列情報を
得ることができない。通常、バンドはスロットの大きさ
に応じて分離展開方向に垂直な方向に幅を持っている。
一方、試料の作成過程における放射性同位元素の不完全
な導入あるいは露光過程における自然放射線の混入等が
原因となってオートラジオグラフ上に現われるノイズは
スポット状であるか、あるいはバンド状であるとしても
真のバンドよりもその幅が狭い。

本発明によれば、一つの分離展開列について多数のラス
タを作成し、分離展開方向に垂直な方向にこれらのラス
タ上でピークが連続的に存在するかどうかを判断基準と
して、検出されたピークが真のバンドを示すピークであ
るのかあるいはノイズであるのかを決定することによ
り、ノイズを排除して真正バンドのみを検出することが
できる。なお、不純物がたまたま二つの泳動試料に入り
込んだ場合や、露光操作中において部分的に自然放射線
の照射を受けた場合などでは、一部の隣接する泳動列間
でノイズが複数個のピークとして観察される場合がある
ため、このように電気泳動試料の種類や泳動条件などを
考慮して、泳動バンドであると認定するための隣接する
連続ピークが泳動バンドであると決定する基準の数を三
個あるいはそれ以上とすることもできる。そして、検出
されたバンドの位置に基づいて分離展開列間でバンドを
比較することにより、核酸の塩基配列を簡便かつ高精度
に決定することができる。

［発明の構成］ 本発明において用いられる試料の例としては、放射性標
識が付与されたＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸の塩基特異的断
片物の混合物を挙げることができる。ここで、核酸の断
片物とは長鎖状の分子の一部分を意味する。たとえば、
塩基特異的ＤＮＡ断片物混合物の一種である塩基特異的
ＤＮＡ切断分解物混合物は、前述のマキサム・ギルバー
ト法に従って、放射性標識が付与されたＤＮＡを塩基特
異的に切断分解することにより得られる。

また、塩基特異的ＤＮＡ合成物混合物は前述のサンガー
・クールソン法に従って、ＤＮＡをテンプレート（鋳
型）として、放射性標識が付与されたデオキシヌクレオ
シドトリフォスフェートとＤＮＡ合成酵素とを用いて合
成することにより得られる。

さらに、塩基特異的ＲＮＡ断片物の混合物も上記と同様
の方法により、切断分解物混合物としてまたは合成物混
合物として得ることができる。なお、ＤＮＡはその構成
単位としてアデニン、グアニン、チミン、シトシンの四
種類の塩基からなるが、一方ＲＮＡはアデニン、グアニ
ン、ウラシル、シトシンの四種類の塩基からなる。

放射性標識は、これらの物質に適当な方法で³²Ｐ、
¹⁴Ｃ、³⁵Ｓ、³Ｈ、¹²⁵Ｉなどの放射性同位元素を保持さ
せることによって付与される。

試料である放射性標識が付与された核酸の塩基特異的断
片物の混合物はゲル状支持媒体など公知の各種の支持媒
体を用いて、電気泳動法、薄層クロマトグラフィー、カ
ラムクロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー
など種々の分離展開方法により支持媒体上に分離展開さ
れる。

次に、放射性標識物質が分離展開された支持媒体につい
て、従来の写真感光材料を用いる放射線写真法により、
あるいは蓄積性蛍光体シートを用いる放射線像変換方法
によりそのオートラジオグラフが得られ、次いで適当な
読取り（読出し）系を介して放射性標識物質のオートラ
ジオグラフを包含するデジタル画像データが得られる。

前者の放射線写真法を利用する場合には、まず支持媒体
とＸ線フィルム等の写真感光材料とを低温もしくは常温
で長時間（数時間〜数十時間）重ね合わせて放射線フィ
ルムを感光させたのち、現像して放射性標識物質のオー
トラジオグラフを放射線フィルム上に可視画像化する。
次いで、画像読取装置を用いて放射線フィルム上に可視
化されたオートラジオグラフを読み取る。たとえば、放
射線フィルムに光ビームを照射してその透過光または反
射光を光電的に検出することにより、オートラジオグラ
フは電気信号として得られる。さらに、この電気信号を
Ａ／Ｄ変換することにより、オートラジオグラフを包含
するデジタル画像データを得ることができる。

後者の放射線像変換方法を利用する場合には、まず、支
持媒体と蓄積性蛍光体シートとを常温で短時間（数秒〜
数十分間）重ね合わせて蛍光体シートに放射性標識物質
から放出される放射線エネルギーを蓄積させることによ
り、そのオートラジオグラフを蛍光体シートに一種の潜
像として記録する。ここで、蓄積性蛍光体シートは、た
とえばプラスチックフィルムからなる支持体、二価ユー
ロピウム賦活弗化臭化バリウム（ＢａＦＢｒ：Ｅｕ²⁺）
等の輝尽性蛍光体からなる蛍光体層、および透明な保護
膜がこの順に積層されたものである。蓄積性蛍光体シー
トに含有されている輝尽性蛍光体は、Ｘ線等の放射線が
照射されるとその放射線エネルギーを吸収して蓄積し、
そののち可視乃至赤外領域の光で励起すると蓄積してい
た放射線エネルギーを輝尽光として放出するという特性
を有する。

次いで、読出装置を用いて蓄積性蛍光体シートに蓄積記
録されたオートラジオグラフを読み出す。具体的には、
たとえば蛍光体シートをレーザー光で走査して放射線エ
ネルギーを輝尽光として放出させ、この輝尽光を光電的
に検出することにより、放射性標識物質のオートラジオ
グラフは可視画像化することなく直接に電気信号として
得られる。さらに、この電気信号をＡ／Ｄ変換すること
により、オートラジオグラフを包含するデジタル画像デ
ータを得ることができる。

上述のオートラジオグラフ測定操作およびオートラジオ
グラフを包含するデジタル画像データを得る方法の詳細
については、前記特開昭５９−８３０５７号、特開昭５
９−１２６５２７号、特開昭５９−１２６２７８号等の
各公報に記載されている。

なお、上記においては、支持媒体上に分離展開された放
射性標識物質のオートラジオグラフを包含するデジタル
画像データを得る方法として、従来の放射線写真法およ
び放射線像変換方法を利用する方法について述べたが、
これらの方法に限定されるものではなく、それ以外の如
何なる方法により得られたデジタル画像データであって
も放射性標識物質のオートラジオグラフを包含するもの
である限り、本発明の信号処理方法を適用することが可
能である。

また、上記いずれの方法においてもオートラジオグラフ
の読取り（または読出し）は、放射線フィルム（または
蓄積性蛍光体シート）の全面に亘って行なう必要はな
く、画像領域のみについて行なうことも勿論可能であ
る。

さらに、予め各分離展開列の位置およびバンドの幅等に
ついての情報を入力して読取り（読出し）条件を設定し
ておき、読取り（読出し）操作においては各バンド上を
二本以上の走査線が通過するような走査線密度で光ビー
ムによる走査を行なうことにより、読取り（読出し）時
間を短縮化して必要な情報を効率良く得ることができ
る。なお、本発明においてオートラジオグラフを包含す
るデジタル画像データには、このようにして得られたデ
ジタル信号をも含まれる。

得られたデジタル画像データは、放射線フィルム（また
は蛍光体シート）に固定された座標系で表わされた座標
（ｘ，ｙ）とその座標における信号のレベル（ｚ）とか
らなるデジタル信号Ｄ_ｘｙの集合であり、一つの信号は
一つの画素に対応している。信号のレベルはその座標に
おける画像濃度、すなわち放射性標識物質の量を表わし
ている。従って、デジタル画像データは放射性標識物質
の二次元的な位置情報を有している。

このようにして得られた支持媒体上の放射性標識物質の
オートラジオグラフを包含するデジタル画像データに
は、以下に述べるような本発明の方法により信号処理が
施されて、目的の核酸の塩基配列の決定が行なわれる。

本発明の信号処理方法の実施の態様を、次の四種類の放
射性標識が付与された塩基特異的ＤＮＡ断片物の組合せ
により形成された泳動列（分離展開列）からなる場合に
ついて説明する。

１）グアニン（Ｇ）特異的ＤＮＡ合成物 ２）アデニン（Ａ）特異的ＤＮＡ合成物 ３）チミン（Ｔ）特異的ＤＮＡ合成物 ４）シトシン（Ｃ）特異的ＤＮＡ合成物 ここで、各塩基特異的ＤＮＡ合成物は、塩基特異的に切
断分解もしくは合成された、すなわち末端の塩基を同じ
くする種々の長さのＤＮＡ断片物からなる。

第１図は、上記四種類の塩基特異的ＤＮＡ断片物がそれ
ぞれ四つのスロットに電気泳動されてなる泳動パターン
のオートラジオグラフの例を示す。泳動方向はｙ方向で
ある。

このオートラジオグラフを包含するデジタル画像データ
は、信号処理回路において一旦メモリ（バッファーメモ
リ、または磁気ディスク等の不揮発性メモリ）に記憶さ
れる。

通常、放射線フィルムもしくは蓄積性蛍光体シートを読
み取ることにより得られたデジタル画像データは、泳動
パターンだけではなくフィルムもしくは蛍光体シート全
面についての画像情報を含んでおり、画像領域（パター
ン領域）以外の余分な部分のデジタルデータを含んでい
る。従って、本発明の塩基配列決定のための信号処理に
先立って、該処理の質的向上および処理効率の向上のた
めには、得られデジタル画像データから画像領域に対応
する画像データのみを抽出すること（いわゆる『画像領
域の切出し』）が望ましい。

たとえば、泳動パターンに対応する画像データは、次の
ような信号処理により抽出することができる。まず、得
られた画像データを、泳動方向に垂直な方向（ｘ方向）
に沿って二つ以上のブロックに分割したのち、ブロック
ごとに分離展開方向（ｙ方向）に沿って画像データを加
算することによりｘ方向の位置と信号のレベルとからな
る一次元波形（射影）を得る。次いで、ブロックごとに
その射影から泳動パターン領域の境界、更には各泳動列
（レーン）の境界を検出し、ブロック間でこれらの境界
を補間することにより、幅方向（ｘ方向）における泳動
パターン領域全体およびレーン全体の境界を決定するこ
とができる。同様にして、長さ方向（ｙ方向）における
境界も決定することができる。

なお、上記画像領域の切出しのための信号処理方法の詳
細については、本出願人による昭和６１年１２月２７日
出願の特願昭６１−３０９７５４号明細書に記載されて
いる。

あるいは、得られたデジタル画像データに基づいてオー
トラジオグラフをＣＲＴ等の画面に電気的に表示したの
ち、画面上でカーソル、マウス等を用いて操作すること
によりあるいはキーボード操作によって、泳動パターン
領域は情報として入力することができる。

なお、長さ方向における境界は試料の注入位置（スロッ
ト）および泳動条件等によっておおよその位置が判明し
ているから、予め固定座標として設定されてもよい。

まず第一に、泳動パターン領域に対応する画像データに
基づいて、各泳動列（レーン）について泳動方向に沿っ
た位置と信号のレベルとからなる一次元波形（ラスタ）
を二つ以上作成する。

デジタル画像データが、前記のように各バンドについて
少なくとも二本の走査線がかかるような走査線密度で泳
動方向に沿って走査することによって読み取られたもの
である場合には、直接に各走査線について位置（ｙ）と
信号のレベル（ｚ）とからなるラスタを作成することが
できる。また、オートラジオグラフ全面に渡って読み取
られたものである場合には、画像データ上で上記と同様
の走査を行なうことにより、各レーンに沿って信号を抽
出した後ラスタを作成する。

一つのレーン当りのラスタの数はスロットの形状
（幅）、試料の量および画素数などによっても異なる
が、一般にバンド検出の精度の点からは５〜４０個の範
囲にある。一例として、スロットの幅が５mm、画素の間
隔が０．２mmであるとき、ラスタ間隔も０．２mm（画素
単位でラスタ作成）とするとレーン当りのラスタ数は２
５個である。

第２図は、第一レーンについて作成された多数のラスタ
を部分的に示す。ラスタは換言すれば、第一レーンをｘ
方向の各位置で切断したときの濃度断面図に相当する。

第二に、全てのラスタ上でピークを検出する。ピークは
たとえば、信号のレベルの差分の符号が反転する点を求
めることにより検出することができる。

第２図において、矢印（↓）はそれぞれピークを示す。

第三に、一つのラスタ上の一つのピークに着目して、隣
接するラスタ上の該ピークの位置を中心とする一定範囲
内に、ピークが存在するか否かを探索する。次いで第四
に、ピークが探し出される限り、順次隣接するラスタ上
でピーク探索を繰り返し行なう。

ここで、ピークの位置を中心とする一定範囲とは、通常
はピーク位置ｙ_ａを中心としてｙ_ａ±σmmの範囲であ
り、σはラスタ間隔に依存して決定される。一例とし
て、ラスタ間隔が０．２mmであるときσ＝０．４であ
る。ピーク探索の範囲を限定することにより、複数のラ
スタ上で泳動方向に大きなずれのないピークが存在する
場合にのみバンドと判断され、バンド検出の精度を高め
ることができる。

また、ピーク探索は、隣接する一つのラスタについて行
なってもよいし、あるいは同時に二つ以上のラスタにつ
いて行なってもよい。たとえば、２〜５個のラスタにつ
いて同時に探索することができる。この複数のラスタに
ついての同時探索は後記するピークの途切れがある場合
に好適な方法である。

第３図は、第２図の各ラスタについて検索されたピーク
の存在を示す。×印はピーク位置を表わす。

第五に、検索されたピークの連続性を判定し、その判定
に基づいて一定範囲（ｙ_ａ±σ）内にある一連のピーク
がバンドであるか否かを決定する。

ピークの連続性の判定は、バンドの幅（スロットの
幅）、パターンの形状、ラスタ間隔などによっても異な
るが、一般にＮ個以上のラスタでピークが連続して検出
された場合に、これら一連のピークの位置にバンドが存
在すると決定することができる。ここで、Ｎは、スロッ
トの幅が５mmおよびラスタ間隔が０．２mmである場合
（レーン当りのラスタ数：２５個）には、バンドの幅が
電気泳動の際に伸縮することを考慮して通常は１３≦Ｎ
≦３７の範囲の整数である。

好ましくは、Ｎ個以上Ｍ個以下のラスタでピークが連続
して検出された場合にバンドが存在すると決定する。上
記条件の場合には、たとえばＮ＝１５およびＭ＝３０と
することができる。

さらに、ピークがなまっていたり、信号レベルが局部的
に低くなっている場合には、一連のピークが必ずしもラ
スタ間で連続して検出されないことがある。従って、ピ
ーク探索がなされた一連のラスタにおいて、ピークの途
切れ（ピークの検出されないラスタの存在）が一定範囲
内であれば、これもバンドと判断決定するのが望まし
い。たとえば、ピークの途切れがＬ箇所以下であって、
かつ各途切れた箇所においてピークの検出されないラス
タの数がＫ個以下であるときにも、該一連のピーク位置
にバンドが存在すると決定する。ここで、ＫおよびＬは
それぞれラスタ間隔に依存して決定され、たとえばラス
タ間隔が０．２mmである場合には１≦Ｋ≦３および１≦
Ｌ≦３の範囲の整数である。

そして、上記以外の場合にはピークの位置にバンドは存
在しないと決定する。

第４図は、複数のラスタについて検索されたピークの存
在を示す別の例である（×印：ピーク位置）。

第４図において、一連のピークＡおよびＥはそれぞれバ
ンドであり、残りのピークＢ、ＣおよびＤはバンドでは
なくノイズであると決定される。

以上の操作を全てのピークについて行ない、泳動パター
ン上の全てのバンドを検出する。このようにして、泳動
パターンにノイズが生じている場合であっても、高精度
でバンドを検出することができる。

なお、上記においては画像領域の切出しを泳動パターン
単位で行なった場合について説明したが、始めにレーン
単位で画像領域を切り出し、切り出されたレーンごとに
上述の操作を繰り返し行なってもよい。

なお、泳動パターンにノイズの発生のほかに、スマイリ
ング現象、オフセット歪みあるいはバンドの融合などの
種々の歪みが発生している場合には、上記バンドの検出
後にこれらの補正のための信号処理を行なってもよい。

ここで、スマイリング現象は、支持媒体の中央部のスロ
ットの泳動距離に比べて両端部のスロットの泳動距離が
短くなる現象であり、泳動過程における放熱効果（いわ
ゆるエッジ効果）などが原因となって生じる。オフセッ
ト歪みとは、レーン間相互の全体的な位置ズレをいい、
スロットの形状の相違等により試料の電気泳動の開始位
置、開始時間が各スロットで異なることなどが原因とな
って生じる。また、バンドの融合は、泳動が十分でない
ために、二乃至三個のバンドが連結して一個の幅広なバ
ンドを形成していることをいう。一般にパターン上部の
泳動開始位置に近い領域で発生しやすい。

信号処理によるこれらの補正の詳細については、本出願
人による特願昭６０−７４８９９号、特願昭６０−７４
９００号、特願昭６０−８５２７５号、特願昭６０−８
５２７６号、特願昭６０−１１１１８６号、特願昭６０
−１１１１８７号の各明細書に記載されている。

ＤＮＡの塩基配列は検出されたバンドの位置を相互に比
較し、バンドに序列を付けることにより直ちに決定する
ことができる。このとき、上記四種類の塩基特異的ＤＮ
Ａ断片物の組合せが排他的な組合せであることから、異
なるレーン上の同じ位置に二つ以上のバンドは存在しえ
ないことを利用して、容易に序列を決定することができ
る。上記（１）〜（４）のスロットはそれぞれ（Ｇ）、
（Ａ）、（Ｔ）、（Ｃ）からなる末端塩基についての情
報を有するから、各バンドの属するスロットに対応する
塩基で置換することにより、ＤＮＡの塩基配列（例えば
Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｇ−…）を得ることができ
る。

このようにして、ＤＮＡの片方の鎖状分子についての塩
基配列を決定することができる。なお、ＤＮＡの塩基配
列についての情報は、上記の表示形態に限られるもので
はなく、たとえば所望により同時に各バンドの強度
（ｚ′）を放射性標識物質の相対量として表示すること
も可能である。さらに、ＤＮＡの二本の鎖状分子両方に
ついての塩基配列を表示することもできる。

あるいはまた、ＤＮＡの塩基配列情報は、上記の信号処
理がなされたデジタル画像データに基づいて画像として
表示してもよい。すなわち、検出された各バンドの位置
をオリジナルのオートラジオグラフとともに可視画像化
して表示することができる。この場合には、最終的な塩
基配列決定を解析者自身がこの表示画像に基づいて行な
うことが可能である。

なお、上記においては、試料である塩基特異的ＤＮＡ断
片物の混合物として（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）の排他的組合せ
を利用した場合について説明したが、本発明の信号処理
方法はこの組合せに限定されるものではなく、例えば
（Ｇ、Ｇ＋Ａ、Ｔ＋Ｃ、Ｃ）などの種々の組合せに適用
することができる。また同様に、塩基特異的ＲＮＡ断片
物の混合物（例えば、Ｇ、Ａ、Ｕ、Ｃの組合せ）につい
ても本発明の方法を適用することができる。さらに、バ
ンドの検出は一組の核酸の塩基特異的断片物の分離展開
列に限定されるものではなく、支持媒体上に同時に分離
展開された全ての分離展開列について行なうことが可能
である。

このようにして得られた塩基配列情報についてはこのほ
かにも、たとえば、既に記録保存されている他の核酸の
塩基配列と照合するなどの遺伝言語学的情報処理を行な
うことも可能である。

上述の信号処理により決定された核酸の塩基配列につい
ての情報は、信号処理回路から出力されたのち、次いで
直接的に、もしくは必要により磁気ディスクや磁気テー
プなどの記憶保存手段を介して記録装置に伝送される。

記録装置としては、たとえば、感光材料上をレーザー光
等で走査して光学的に記録するもの、ＣＲＴ等に表示さ
れた記号・数値をビデオ・プリンター等に記録するも
の、熱線を用いて感熱記録材料上に記録するものなど種
々の原理に基づいた記録装置を用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ノイズが生じている泳動パターンのオートラ
ジオグラフの例を示す図である。 第２図は、第一レーンについての複数のラスタを示す部
分図である。 第３図は、第２図に示されたラスタについて検索された
ピークの存在を示す部分図である。 第４図は、別の複数のラスタについて検索されたピーク
の存在を示す部分図である。 矢印（↓）：ピーク、×印：ピーク位置、

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】放射性標識が付与された塩基特異的ＤＮＡ
   断片物もしくは塩基特異的ＲＮＡ断片物の混合物が支持
   媒体上に一次元的方向に分離展開されて形成された分離
   展開パターンのオートラジオグラフを包含するデジタル
   画像データについてデジタル信号処理を行なうことによ
   り、核酸の塩基配列を決定する方法において、 １）一つの分離展開列について、分離展開方向に沿った
   位置と信号のレベルとからなる一次元波形を少なくとも
   二つ得る工程、 ２）全ての一次元波形上でピークを検出する工程、 ３）一つの一次元波形上の一つのピークについて、隣接
   する一次元波形上の該ピークの位置を中心とする一定範
   囲内に、ピークが存在するか否かを探索する工程、 ４）第三工程においてピークが存在する場合には、順次
   隣接する一次元波形に対して第三工程を繰り返す工程、 ５）第三および第四工程で、互いに隣接する予め決めら
   れた数以上の複数個の一次元波形上でピークが検出され
   た場合には、一連のピークの位置にバンドが存在すると
   決定し、それ以外の場合には該ピークの位置にバンドは
   存在しないと決定する工程、および ６）上記第三乃至第五工程を順次繰り返すことにより、
   分離展開列上の全てのバンドを検出する工程、 を含むことを特徴とする核酸の塩基配列決定のための信
   号処理方法。
2. 【請求項２】上記塩基特異的ＤＮＡ断片物の混合物が、 （１）グアニン特異的ＤＮＡ断片物、 （２）アデニン特異的ＤＮＡ断片物、 （３）チミン特異的ＤＮＡ断片物、 （４）シトシン特異的ＤＮＡ断片物、 の四種類からなり、分離展開パターンが、これら四種類
   の塩基特異的ＤＮＡ断片物がそれぞれ支持媒体上に分離
   展開されて形成された四列の分離展開列からなる特許請
   求の範囲第１項記載の核酸の塩基配列決定のための信号
   処理方法。