JPH0529069B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、核酸の塩基配列決定のためのオート
ラジオグラフ解析方法に関するものである。 ［発明の背景］ 近年、急速に発達して来た分子生物学の分野に
おいては、生物体の機能や複製のメカニズムを解
明するために、生物体のもつ遺伝情報を明らかに
することが必須のこととなつている。とりわけ、
特定の遺伝情報を担うDNA（もしくはDNA断片
物、以下同様）などの核酸の塩基配列を決定する
ことが必要不可欠なこととなつている。 DNA、RNAなどの核酸の塩基配列を決定する
ための代表的な方法として、オートラジオグラフ
イーを利用するマキサム・ギルバート（Maxam
−Gilbert）法およびサンガー・クールソン
（Sanger−Coulson）法が知られている。前者の
マキサム・ギルバート法は、まず、塩基配列を決
定すべきDNAあるいはDNA断片物の鎖状分子の
一方の端部に³²P等の放射性同位元素を含む基を
結合させて放射性標識を付与したのち、化学的な
手段を利用して鎖状分子の構成単位（塩基単位）
間の結合を塩基特異的に切断する。次に、得られ
た塩基特異的DNA切断分解物の混合物をゲル電
気泳動法により支持媒体上に分離展開し、多数の
切断分解物がそれぞれ分離展開されて形成された
分離展開パターン（ただし、視覚的には見ること
ができない）を得る。次いで、この分離展開パタ
ーンをたとえばＸ線フイルム上に可視化してその
オートラジオグラフを得、得られたオートラジオ
グラフと各々の塩基特異的切断手段とから、放射
性同位元素が結合された鎖状分子の端部から一定
の位置関係にある塩基を順次決定し、これにより
対象物全ての塩基配列を決定するものである。 また、後者のサンガー・クールソン法は、
DNAあるいはDNA断片物の鎖状分子と相補的で
あつて、かつ放射性標識が付与されたDNA合成
物を化学的な手段を利用して塩基特異的に合成
し、得られた塩基特異的DNA合成物の混合物を
用いて上記と同様にしてそのオートラジオグラフ
から塩基配列を決定する方法である。 本出願人は、支持媒体上に分離展開された放射
性標識物質のオートラジオグラフを得る方法とし
て放射線フイルムを用いる従来の放射線写真法の
代りに、蓄積性蛍光体シートを用いる放射線像変
換方法を利用する方法について既に特許出願して
いる（特開昭59−83057号、特願昭58−201231
号）。ここで、蓄積性蛍光体シートは輝尽性蛍光
体からなるものであり、放射線エネルギーを該蛍
光体シートの輝尽性蛍光体に吸収させた後、可視
乃至赤外領域の電磁波（励起光）で励起すること
により放射線エネルギーを輝尽光として放出させ
ることができるものである。この方法によれば、
露光時間を大幅に短縮化することができ、また従
来より問題となつていた化学カブリ等が発生する
ことがない。さらに、放射性標識物質のオートラ
ジオグラフは、一旦放射線エネルギーとして蛍光
体シートに蓄積されたのち輝尽光として光電的に
読み取られるから、直接にデジタル信号として得
たのち適当な記録媒体に記録保存することができ
る。 従来より、核酸の塩基配列は、可視化されたオ
ートラジオグラフについて、放射性標識が付与さ
れた核酸の塩基特異的切断分解物もしくは塩基特
異的合成物（以下、単に核酸の塩基特異的断片物
と称する）の分離展開位置（バンド）を視覚的に
判断し、それらバンドの位置を相互に比較するこ
とにより決定されている。よつて、オートラジオ
グラフの解析は通常人間の視覚を通して行なわれ
ており、そのために多大な時間と労力が費されて
いる。また、人間の目に依存しているため、決定
された塩基配列が解析者によつて異なるなど得ら
れる情報の精度には限界がある。 そこで、本出願人は、上記オートラジオグラフ
をデジタル信号として得た後このデジタル信号に
適当な信号処理を施すことにより、DNAの塩基
配列を自動的に決定する方法についても既に特許
出願している（特開昭59−126527号、特開昭59−
126278号、特願昭60−74899号、特願昭60−85275
号等）。 ［発明の要旨］ 本発明は、核酸の塩基配列を高精度で決定する
ことができるオートラジオグラフ解析方法を提供
するものである。 また、本発明は、一旦決定されたバンドの序列
を容易かつ有利に確認および／または修正するこ
とができるオートラジオグラフ解析方法をも提供
するものである。 すなわち、本発明は、 () 放射性標識が付与された塩基特異的DNA
断片物もしくはRNA断片物が支持媒体上に一
次元的方向に分離展開されて形成された複数の
分離展開列のオートラジオグラフを解析するこ
とにより、核酸の塩基配列を決定する方法にお
いて、 (1) バンドの序列が決定されたオートラジオグ
ラフを、該オートラジオグラフに対応するデ
ジタル信号に基づいて電気的に画像表示する
工程、 (2) バンドの序列確認のための入力情報に基づ
いて、分離展開列を横切りかつ一つのバンド
の位置を通過するように読取カーソルをオー
トラジオグラフに固定して画面上に表示し、
同時に該バンドの塩基名を画面上に表示する
工程、 (3) バンドの序列確認のための入力情報に基づ
いて、前工程でカーソル固定されたバンドに
隣接するバンドの位置を通過するように読取
カーソルをオートラジオグラフに固定して画
面上に表示し、同時に該バンドの塩基名を画
面上に表示する工程、および (4) 第三工程を繰り返すことにより、決定され
たバンドの序列をオートラジオグラフ上で確
認する工程、 を含むことを特徴とする核酸の塩基配列決定の
ためのオートラジオグラフ解析方法；および () 放射性標識が付与された塩基特異的DNA
断片物もしくはRNA断片物が支持媒体上に一
次元的方向に分離展開されて形成された複数の
分離展開列のオートラジオグラフを解析するこ
とにより、核酸の塩基配列を決定する方法にお
いて、 (1) バンドの序列が決定されたオートラジオグ
ラフを、該オートラジオグラフに対応するデ
ジタル信号に基づいて電気的に画像表示する
工程、 (2) バンドの序列確認のための入力情報に基づ
いて、分離展開列を横切りかつ一つのバンド
の位置を通過するように読取カーソルをオー
トラジオグラフに固定して画面上に表示し、
同時に該バンドの塩基名を画面上に表示する
工程、 (3) バンドの序列確認のための入力情報に基づ
いて、前工程でカーソル固定されたバンドに
隣接するバンドの位置を通過するように読取
カーソルをオートラジオグラフに固定して画
面上に表示し、同時に該バンドの塩基名を画
面上に表示する工程、 (4) 第三工程において表示された読取カーソル
および／または塩基名を、表示画面に基づく
情報の入力がある場合には該情報に従つて削
除し、追加し、もしくは変更する工程、およ
び (5) 第三および第四工程を順次繰り返すことに
より、決定されたバンドの序列を確認し、修
正する工程、 を含むことを特徴とする核酸の塩基配列決定の
ためのオートラジオグラフ解析方法； を提供するものである。 なお、本発明において『バンドの序列を決定す
る』とは、分離展開方向に沿つた各バンドの位置
に基づいてバンドに順序を付し、かつバンドが属
する分離展開列に基づいてバンドに塩基名を付す
ことを意味する。 本発明の方法によれば、オートラジオグラフ上
のバンドに序列が付されて一旦決定された核酸の
塩基配列について確認を行なう際に、塩基配列が
オートラジオグラフとともに表示され、かつその
塩基配列は文字列として一度に列挙されるのでは
なく一塩基ごとにバンドと対応させながら表示さ
れるために、確実に一バンドずつ確認することが
できる。そして、塩基名とバンドとは、直線状、
折れ線状などの読取カーソルによつて一対一の対
応がつけられるために、バンドの順序の誤り、バ
ンドの重複読みあるいは読み落としの有無を一目
で判断することができる。 また、確認の途中でバンドの序列（順序および
塩基名）の誤り、バンドの重複読みあるいは読み
落としを発見した場合に、その場で簡単に修正す
ることができる。この修正においても一バンド一
塩基ごとに順次表示されるから、間違いなく修正
することができる。 従つて、最終的に得られる塩基配列の信頼性を
顕著に高めることができる。 特に、始めのバンドの序列決定を上述したよう
に信号処理により自動的に行なつた場合には最終
的な確認、さらに修正を研究者自身が行ないたい
との要求が高く、そのような場合に本発明の方法
は非常に有効な方法であるといえる。 ［発明の構成］ 本発明において用いられる試料の例としては、
放射性標識が付与されたDNA、RNA等の核酸の
塩基特異的断片物の混合物を挙げることができ
る。ここで、核酸の断片物とは長鎖状の分子の一
部分を意味する。たとえば、塩基特異的DNA断
片物混合物の一種である塩基特異的DNA切断分
解物混合物は、前述のマキサム・ギルバート法に
従つて、放射性標識が付与されたDNAを塩基特
異的に切断分解することにより得られる。また、
塩基特異的DNA合成物混合物は前述のサンガ
ー・クールソン法に従つて、DNAをテンプレー
ト（鋳型）として、放射性標識が付与されたデオ
キシヌクレオシドトリフオスフエートとDNA合
成酵素とを用いて合成することにより得られる。 さらに、塩基特異的RNA断片物の混合物も上
記と同様の方法により、切断分解物混合物として
または合成物混合物として得ることができる。な
お、DNAはその構成単位としてアデニン、グア
ニン、チミン、シトシンの四種類の塩基からなる
が、一方RNAはアデニン、グアニン、ウラシル、
シトシンの四種類の塩基からなる。 放射性標識は、これらの物質に適当な方法で
³²P、¹⁴C、³⁵S、³H、¹²⁵Iなどの放射性同位元素を保
持させることによつて付与される。 試料である放射性標識が付与された核酸の塩基
特異的断片物の混合物はゲル状支持媒体などの公
知の各種の支持媒体を用いて、電気泳動法、薄層
クロマトグラフイー、カラムクロマトグラフイ
ー、ペーパークロマトグラフイーなど種々の分離
展開方法により支持媒体上に分離展開される。 次に、放射性標識物質が分離展開された支持媒
体について従来の写真感光材料を用いる放射線写
真法により、あるいは蓄積性蛍光体シートを用い
る放射線像変換方法によりそのオートラジオグラ
フが得られたのち、適当な読取り（読出し）系を
介して該オートラジオグラフに対応するデジタル
信号が得られる。 前者の放射線写真法を利用する場合には、まず
支持媒体とＸ線フイルム等の写真感光材料とを低
温もしくは常温で長時間（数時間〜数十時間）重
ね合わせて放射線フイルムを感光させたのち、現
像して放射性標識物質のオートラジオグラフを放
射線フイルム上に可視画像化する。次いで、画像
読取装置を用いて放射線フイルム上に可視化され
たオートラジオグラフを読み取る。たとえば、放
射線フイルムに光ビームを照射してその透過光ま
たは反射光を光電的に検出することにより、オー
トラジオグラフは電気信号として得られる。さら
に、この電気信号をＡ／Ｄ変換することにより、
オートラジオグラフに対応するデジタル信号を得
ることができる。 後者の放射線像変換方法を利用する場合には、
まず、支持媒体と蓄積性蛍光体シートとを常温で
短時間（数秒〜数十分間）重ね合わせて蛍光体シ
ートに放射性標識物質から放出される放射線エネ
ルギーを蓄積させることにより、そのオートラジ
オグラフを蛍光体シートに一種の潜像として記録
する。ここで、蓄積性蛍光体シートは、たとえば
プラスチツクフイルムからなる支持体、二価ユー
ロピウム賦活弗化臭化バリウム（BaFBr：Eu²⁺）
等の輝尽性蛍光体からなる蛍光体層、および透明
な保護膜がこの順に積層されたものである。蓄積
性蛍光体シートに含有されている輝尽性蛍光体
は、Ｘ線等の放射線が照射されるとその放射線エ
ネルギーを吸収して蓄積し、そののち可視乃至赤
外領域の光で励起すると蓄積していた放射線エネ
ルギーを輝尽光として放出するという特性を有す
る。 次いで、読出装置を用いて蓄積性蛍光体シート
に蓄積記録されたオートラジオグラフを読み出
す。具体的には、たとえば蛍光体シートをレーザ
ー光で走査して放射線エネルギーを輝尽光として
放出させ、この輝尽光を光電的に検出することに
より、放射性標識物質のオートラジオグラフは可
視画像化することなく直接に電気信号として得ら
れる。さらに、この電気信号をＡ／Ｄ交換するこ
とにより、オートラジオグラフに対応するデジタ
ル信号を得ることができる。 上述のオートラジオグラフ測定操作およびオー
トラジオグラフに対応するデジタル信号を得る方
法の詳細については、前記特開昭59−83057号、
特開昭59−126527号、特開昭59−126278号等の各
公報に記載されている。 なお、上記においては、支持媒体上に分離展開
された放射性標識物質のオートラジオグラフに対
応するデジタル信号を得る方法として、従来の放
射線写真法および放射線像変換方法を利用する方
法について述べたが、これらの方法に限定される
ものではなく、それ以外の如何なる方法により得
られたデジタル信号であつても放射性標識物質の
オートラジオグラフと対応関係がある限り、本発
明の信号処理方法を適用することが可能である。 また、上記いずれの方法においてもオートラジ
オグラフの読取り（または読出し）は、放射線フ
イルム（または蓄積性蛍光体シート）の全面に亘
つて行なう必要はなく、画像領域のみについて行
なうことも勿論可能である。 さらに、本発明においては、予め各分離展開列
の位置およびバンドの幅等についての情報を入力
して読取り（読出し）条件を設定しておき、読取
り（読出し）操作においては各バンド上を一本以
上の走査線が通過するような走査線密度で光ビー
ムによる走査を行なうことにより、読取り（読出
し）時間を短縮化して必要な情報を効率良く得る
ことができる。なお、本発明においてオートラジ
オグラブに対応するデジタル信号とは、このよう
にして得られたデジタル信号をも包含する。 得られたデジタル信号D_xyは、放射線フイルム
（または蛍光体シート）に固定された座標系で表
わされた座標（ｘ，ｙ）とその座標における信号
のレベル(z)とからなる。信号のレベルはその座標
における画像濃度、すなわち放射性標識物質の量
を表わしている。従つて、一連のデジタル信号
（すなわち、デジタル画像データ）は放射性標識
物質の二次元的な位置情報を有している。 このオートラジオグラフに対応するデジタル信
号は、一旦メモリ（バツフアーメモリ、または磁
気デイスク等の不揮発性メモリ）に記憶されたの
ち信号処理回路に送られる。 次いで、得られたデジタル信号について信号処
理を施すことにより、あるいはデジタル信号に基
づいて電気的に画像表示されたオートラジオグラ
フを人間が視覚的に判断することにより、オート
ラジオグラフ上に現われた全てのバンドの序列が
決定される。前者の信号処理による自動解析は基
本的に、信号のレベルが極大となる位置を検出し
てバンドの位置を決定したのち、この位置に基づ
いてバンドに順序を付し、次いで分離展開列ごと
末端塩基が規定されるからバンドが属する分離展
開列に基づいてバンドに塩基名を付すことにより
行なうことができる。また、後者の表示画面上で
の人為的な解析は、たとえば読取カーソルを画面
上で作成し、これを用いて順序よくバンドに塩基
名を付すことにより行なわれる。 前者の自動解析方法の詳細については、本出願
人による特願昭60−74899号、特願昭60−85275
号、特願昭60−181432号、特願昭60−226091号お
よび特願昭60−226092号などの各明細書に記載さ
れている。また、後者の人為的解析方法の詳細に
ついては、本出願人による昭和61年３月５日出願
の特願昭61−47924号および同３月12日出願(2)の
特願昭61−55481号の各明細書に記載されている。 得られたバンドの序列およびオートラジオグラ
フはそれぞれ、バンド情報およびパターン情報と
して適当な記録媒体に記録保存される。バンド情
報は具体的に、第１図に示すように、オートラジ
オグラフに固定された座標系（すなわち、デジタ
ル信号が有する座標系）で表わされたバンドの位
置（ｘ，ｙ）とバンドが帰属された塩基の名称
（たとえば、DNAの場合にはＧ、Ａ、Ｔまたは
Ｃ）とからなるバンドデータである。 以下に、本発明の第一の解析方法を、次の四種
類の放射性標識が付与された塩基特異的DNA断
片物の混合物が電気泳動によりゲル支持媒体上に
分離展開されてなる泳動列（分離展開列）を例に
とつて説明する。 (1) グアニン(G)特異的DNA断片物 (2) アデニン(A)特異的DNA断片物 (3) チミン(T)特異的DNA断片物 (4) シトシン(C)特異的DNA断片物 ここで、各塩基特異的DNA断片物は、塩基特
異的に切断分解もしくは合成された、すなわち末
端塩基を同じくする種々の長さのDNA断片物か
らなる。 まず、上記四本の泳動列（レーン）からなる泳
動パターンのオートラジオグラフに関するパター
ン情報および決定されたバンドの序列に関するバ
ンド情報を、信号処理回路と、オートラジオグラ
フ、カーソルおよび塩基名を同時に表示すること
ができるCRTなどの表示手段と、バンドの序列
確認のための入力を行なうことができる入力手段
とを有する装置に送つたのち、パターン情報に基
づいて解析対象のオートラジオグラフ（放射性標
識物質の泳動パターン）を表示画面上に可視画像
化する。この装置にはさらに、カーソル作成およ
び塩基名表示のための入力を行なうことができる
入力手段と、パターン情報、カーソル情報および
塩基配列情報を記録保存することができる保持手
段が設けられているのが望ましい。 なお、パターン情報として蓄積保存されている
オートラジオグラフに対応するデジタル信号には
予め、濃度およびコントラストが適正で観察読影
性能の優れた可視画像が得られるように信号処理
（画像処理）を行なつておいてもよい。画像処理
としては、たとえば、空間周波数処理、階調処
理、加算平均処理、縮小処理、拡大処理などが挙
げられる。 画面上に画像表示されるオートラジオグラフ
は、画面に設定された座標系における信号のレベ
ル（画像濃度、すなわち放射性標識物質の量）を
色彩の明度で表わした、従来の写真画像と同様の
濃淡画像であつてもよいし、あるいは信号レベル
を予め二値化することにより簡略化して表わした
二値画像であつてもよい。 あるいはまた、オートラジオグラフは、一次元
の位置（泳動方向に沿つた位置）と信号レベルと
からなる多数の二次元波形を泳動方向に垂直な方
向に一定間隔で多重表示することにより表わした
画像（いわゆる鳥瞰図）であつてもよい。この鳥
瞰図によれば放射性標識物質の量が鳥瞰図の高さ
として三次元的に表わされるから、バンドのピー
ク位置を正確に読み取ることができ、泳動列（レ
ーン）間のバンドの位置関係の把握並びに泳動開
始位置近くのバンドの密な領域におけるバンドの
分離を容易に行なうことができる。なお、鳥瞰図
によつてオートラジオグラフを表示する方法の詳
細については、本出願人による特願昭60−181431
号明細書に記載されている。 第２図に、画面上に濃淡画像として表示された
泳動パターンのオートラジオグラフの例を示す。 また第３図に、鳥瞰図として表示されて泳動パ
ターンのオートラジオグラフの例を示す。 次に、バンドの序列確認のための入力情報に基
づいて、読取カーソルを分離展開列を横切りかつ
一つのバンドの位置を通過するように画面上の泳
動パターンに固定して表示し、同時に決定済みの
該バンドの塩基名を画面上に表示する。 バンドの序列確認のための情報の入力は、たと
えば確認キーを押すなどの簡単なキーボード操作
によつて行なうことができる。 最初のキーの入力に従つて、第１図に示したよ
うな、あらかじめ決定されたバンド情報の中から
たとえば泳動パターンの最下端のバンドについて
の情報（x₁，y₁，Ｔ）を抽出したのち、予め情報
として入力されているかあるいは画面上で作成さ
れた読取カーソルがバンドの位置（x₁，y₁）を通
るように泳動パターンに固定して画面上に表示す
る。 バンド情報もまた画面上に、同時にもしくは画
面を切り換えて表示してもよく、その場合には抽
出されたバンドが矢印等のポインタによつて一目
でわかるようにしておくのが好ましい。 読取カーソルはレーンを横切る単なる直線とし
て表示してもよいが、スマイリング現象またはオ
フセツト歪みなどによつて泳動パターンにバンド
の位置ずれあるいはバンドの欠陥が生じている場
合には、各レーンのバンドに沿つた折れ線もしく
は曲線を作成して表示するのが好ましい（第６図
１２参照）。 ここで、スマイリング現象とは、泳動過程にお
ける放熱効果（エツジ効果）などが原因となつて
生じるものであり、支持媒体の中央部の泳動距離
に比べて両端部の泳動距離が短くなる現象をい
う。またオフセツト歪みとは、試料注入口（スロ
ツト）の形状の相違等により試料の泳動開始位
置、開始時間が各レーンで異なることなどが原因
となつて生じるものであり、レーン間相互の全体
的な位置ずれをいう。これらのバンドの位置ずれ
のほかにもバンド自体の欠陥、レーンの蛇行など
が生じることがある。 折れ線状もしくは曲線状の読取カーソルは、た
とえば以下のようにして画面上に作成することが
できる。 第４図は、画面上に濃淡画像として表示された
泳動パターンのオートラジオグラフの別の例を示
す図である。第４図において泳動方向は右方向で
ある。 まず、画面の上端から表示画面に基づいて入力
された位置まで垂直な線を引く。入力される最初
の位置は、端部のレーン上のバンドの位置である
のが好ましい（第４図１）。端部のレーンとする
のは読取カーソルがこの位置を起点として作成さ
れるからである。 位置情報の入力は、マウスカーソル、ライトペ
ン、ジヨイステイツクなどの手段を用いて行なう
ことができる。位置精度の点から、特にマウスカ
ーソルが好ましい。 たとえば、画面上のオートラジオグラフが表示
される四角形の領域を座標（x_a，y_a）、（x_b，y_b）
で表わし、マウスカーソル（画面上の矢印２）の
位置座標を（x_n，y_n）で表わすとすると、マウ
スカーソルによつてx_n＝x₁，y_n＝y₁なる位置情
報が入力されることにより、線分３（x₁，y_a）
（x₁，y₁）が画面上に表示される。 次に、起点４の位置から、それよりも泳動パタ
ーンの内側の入力された位置（第二の位置）まで
直線を引く。位置の入力は上記と同様にしてマウ
スカーソル等を介して行なわれる。まず始めに、
起点４（x₁，y₁）とマウスカーソル２の位置
（x_n，y_n）との間に線分（x₁，y₁）（x_n，y_n）が
表示される。マウスカーソル２が移動すると、こ
の線分は画面上で消えて、新たに起点４と移動し
た位置との間に線分が表示される。なお、マウス
カーソルは上記座標（x_a，y_a）、（x_b，y_b）で仕切
られた四角形の領域内を自由に移動することがで
きる。こうして、マウスカーソルの移動とともに
起点４とマウスカーソル２の各移動位置とを結ん
だ線分が次々と表示される。該線分が好適にレー
ンを横切るところで位置の入力を行なうことによ
り、線分３に連結した次の線分が画面に固定され
て表示される。 このようにして、上端のレーンから下端のレー
ンまでレーンを横切りかつ各レーンのバンドに沿
うように順次、線分（x_i，y_i）（x_i+1，y_i+1）（ただ
じ、ｉは正整数である）を引く。なお、試料は四
種の塩基特異的DNA断片物の排他的な組合せで
あるので、各レーンのバンドは互いに同じ位置
（泳動距離）には存在しえない。従つて、『バンド
に沿うように』とは、各レーンの泳動距離が等し
くなるように巨視的な意味でバンドに沿つて線分
を引くことを意味し、厳密に各線分が各レーンの
バンド上を通過することを意味するものではな
い。 次いで、第５図に示すように、線分が泳動パタ
ーンを完全に横切つた時点で最後に入力された位
置が終点であるとの入力情報に従つて、該終点の
位置５から画面下端までの垂直な線分６（x_i，
y_i）（x_i，y_b）を引く。このようにして画面上に
は、泳動パターンを完全に横切つた複数の連結し
た折れ線からなる読取カーソル７が表示される。 読取カーソルは泳動パターン上の任意の領域で
作成することができ、泳動開始位置に近いパター
ン上部の領域であつてもよいし、あるいは泳動距
離の大きなパターン下部の領域であつてもよい。
また、入力される位置情報は、泳動パターンに応
じてレーンの個数程度であつてもよいし、あるい
はそれより多くても少なくてもよい。少なくとも
一つの位置が入力され、かつ起点と終点が認識で
きればよい。読取カーソルは、入力位置を直線で
結んだ折れ線状であつてもよいし、あるいは得ら
れた折れ線に適当な演算処理（曲線近似）を施す
ことにより曲線状であつてもよい。 読取カーソルが画面上に固定して表示された段
階で、バンド情報に含まれているバンドの位置座
標を、カーソル情報（カーソルが折れ線状である
場合には、折れ線の節目の座標の組）に変換する
のが好ましい。 作成された読取カーソルは泳動パターンに合致
しているから、このカーソルを用いて解析者は正
確かつ容易にバンドの序列を確認することができ
る。なお、読取カーソルの作成および表示方法の
詳細については前記昭和61年３月５日出願の特願
昭61−47924号明細書に記載されている。 また、バンドの序列の決定をオートラジオグラ
フが表示された画面上で解析者が読取カーソルを
用いて目視により行なつた場合には、使用された
読取カーソルをカーソル情報として予め記録保存
しておくことにより、各バンドに最適なカーソル
を即座に表示することができる。この読取カーソ
ルの保存方法の詳細については本出願人による昭
和61年３月12日出願(3)の特願昭61−55482号明細
書に記載されている。 画面上には、読取カーソルの表示と同時に最下
端のバンドについて決定済みの塩基名(T)をカーソ
ルの下方に表示する。 次にバンドの序列確認のための情報が入力され
ると（キー入力等）、最下端から二番目のバンド
をバンド情報の中から抽出する。具体的に、バン
ド情報が表示された画面上ではポインタによつて
該バンドを指し示し、泳動パターンが表示された
画面上では該バンドの位置を通過する読取カーソ
ルおよび該バンドの塩基名を表示する。 このようにして順々に、予め序列が決定された
バンドについてカーソルと塩基名を表示しながら
バンドの序列が正しいか否かを確認することがで
きる。なお、この際に上記四種類の塩基特異的
DNA断片物の組合せが排他的な組合せであるこ
とから、同じ位置に二つ以上のバンド（異なるレ
ーンのバンド）は存在しえないことを利用して、
バンドの序列の確認を行なうことができる。 第６図は、確認過程にある画面上に表示された
泳動パターンのオートラジオグラフ１１、読取カ
ーソル１２および塩基名欄１３の例を示す図であ
る。なお、第６図において泳動方向は右方向であ
る。 この際に、確認処理済みの読取カーソルと未処
理の読取カーソルとを区別し、また確認処理済み
の塩基名欄と未処理の塩基名欄とを区別して表示
してもよい。これにより、一層バンドの順序の逆
転、重複読みあるいは読み落としを発見しやすく
することができる。これらの区別は、色彩、模
様、輝度の相違などによつて行なうことができ
る。また、確認未処理のカーソルおよび塩基名欄
は、次のキー入力によつて処理済みと判断して直
ちに表示を転換する。そして、新たに画面上には
未処理の識別を付したカーソルを表示する。 なお、確認過程で、設定された読取カーソルが
泳動パターンに合致しなくなつた場合には、前記
と同様の操作を繰り返すことにより簡単に所望の
形状のカーソルを作成表示することができる。 さらに、本発明の第二の方法によれば、確認過
程でバンドの順序の逆転、重複読みあるいは読み
落としなどの序列に誤りがあることが見い出され
た場合には、次のキー入力の前に表示画面に基づ
いて入力された情報に従つて、バンドの序列を修
正することができる。 バンドの序列の修正は、たとえばバンドの重複
読みが生じている場合には、キー入力等による入
力情報に従つて該バンドに対応するカーソルおよ
び塩基名を表示画面から削除することにより行な
う。バンドの読み落としが生じている場合には、
新たに該バンドに対応するカーソルおよび塩基名
を画面上に追加して表示することにより行なう。
また、バンドの順序の逆転が生じている場合に
は、該バンドに対応するカーソルおよび塩基名を
画面上で変更（すなわち、削除および追加）する
ことにより行なう。 このようにして順々に、予め序列が決定された
バンドについてカーソルと塩基名を表示し、必要
に応じてカーソルおよび塩基名の削除、追加、変
更を行ないながら、バンドの序列が正しいか否か
を確認するとともに修正することができる。 バンドの序列の確認、さらには修正操作が終了
した画面上には、泳動パターン、各バンドに一対
一で対応した読取カーソルと塩基名とが表示され
て残る。この一連の塩基を端から順に結ぶことに
より、DNAの塩基配列（例えばＴ−Ｇ−Ｃ−Ａ
−Ｔ−Ｃ−Ｇ−…）を得ることができる。 画面上の泳動パターン、読取カーソルおよび塩
基配列についての情報はそれぞれ、パターン情
報、カーソル情報および塩基配列情報として別個
にかつ相互に対応づけて記録保存するのが好まし
い。 すなわち、画面上に画像表示された泳動パター
ンについての情報（パターン情報）のみを、第２
図に示したような濃淡画像、第３図に示したよう
な鳥瞰図、あるいは二値画像に対応するデジタル
画像データとして記録保存する。デジタル画像デ
ータは、上述したように一画素に対応する二次元
の座標（ｘ，ｙ）と信号レベル(z)とからなる。 また、泳動パターンの各バンドに重ね合わせて
固定された多数の読取カーソルについての情報
（カーソル情報）のみを、第７図に示すようなカ
ーソルデータとして独立に記録保存する。カーソ
ル情報は、塩基配列決定されたバンドの個数に相
当する個数のカーソルについてのデータであり、
各カーソルにはバンドの序列に従う番号が付され
ており、そしてたとえば読取カーソルが折れ線状
である場合には各折れ線の節目の二次元座標がデ
ータとして記録保存される。 また、得られた塩基配列についての情報（塩基
配列情報）のみを、独立に第８図に示すような文
字列データとして記録保存する。この塩基配列情
報にはバンドの序列に従う番号が付されている。 これにより、バンドの序列が決定された段階に
おいてパターン情報（たとえば各画素に対応する
デジタル画像データ）とバンド情報とから構成さ
れていたオートラジオグラフの解析情報は、この
確認修正操作後にはパターン情報（表示画像に対
応するデジタル画像データ）、カーソル情報およ
び塩基配列情報から構成されることになる。 パターン情報とカーソル情報とは、画像に固定
された二次元座標に対応づけられて（これをアド
レス対応という）保存され、カーソル情報と塩基
配列情報とは泳動パターン上のバンドの序列順の
番号で対応づけられて（これを順序対応という）
保存される。これらの情報は、二次記憶装置など
の保存手段に記録保存されて三つの情報フアイル
が形成される。そして、これらの情報フアイル
は、何時でも再び組み合わせてCRT等の表示画
面あるいは感光材料、感熱記録材料等の記録材料
上に再現することが可能であるから、後日他人が
解析結果の確認をする場合にバンドと塩基名との
照合、確認を容易に行なうことができる。 なお、情報の記録保存はオートラジオグラフの
解析（塩基配列の確認、修正）終了後のみなら
ず、その途中で随時行なうことが可能である。解
析結果を上記三種類の情報として記録保存する方
法の詳細については前記昭和61年３月12日出願(3)
の特願昭61−55482号明細書に記載されている。 上記においては、試料である塩基特異的DNA
断片物の混合物として（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）の排他
的組合せを利用した場合について説明したが、本
発明の解析方法はこの組合せに限定されるもので
はなく、たとえば（Ｇ、Ｇ＋Ａ、Ｔ＋Ｃ、Ｃ）な
どの種々の組合せに適用することができる。また
同様に、塩基特異的RNA断片物の混合物（例え
ばＧ、Ａ、Ｕ、Ｃの組合せ）についても本発明の
方法を適用することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、決定されたバンドの序列に関するバ
ンド情報の例を示す図である。第２図は、画面上
に濃淡画像として表示された泳動パターンのオー
トラジオグラフの例を示す図である。第３図は、
画面上に鳥瞰図として表示された泳動パターンの
オートラジオグラフの例を示す図である。第４図
および第５図はそれぞれ、画面上に表示されたオ
ートラジオグラフを示す図であり、読取カーソル
の作成工程を説明する図である。 １：泳動バンド、２：マウスカーソル、３，
６：線分、４：起点、５：終点、７：読取カーソ
ル。 第６図は、画面上に表示された泳動パターン、
読取カーソルおよび塩基名欄の例を示す図であ
る。 １１：泳動パターン、１２：読取カーソル、１
３：塩基名欄、。 第７図は、カーソル情報として記録保存される
多数の折れ線状の読取カーソルの例を示す図であ
る。第８図は、塩基配列情報として記録保存され
る一連の塩基名の例を示す図である。

【特許請求の範囲】

１ 放射性標識が付与された塩基特異的DNA断
片物もしくは塩基特異的RNA断片物の混合物が
支持媒体上に一次元的方向に分離展開されて形成
された複数の分離展開列のオートラジオグラフに
対応するデジタル信号について信号処理を行なう
ことにより、核酸の塩基配列を決定する方法にお
いて、 (1) 各分離展開列について分離展開方向に沿つた
位置と信号のレベルとからなる一次元波形を得
る工程、 (2) 一次元波形上で、探索基準点から一定区間内
において一定値以上の信号レベルを有する領域
の平均レベル値を算出する工程、 (3) 平均レベル値に基づいて閾値を決定する工
程、 (4) 該区間内で閾値以上の信号レベルを有するピ
ークが存在するか否かを探索する工程、 (5a) 第四工程においてピークが存在する場合に
は、該ピークの位置にバンドが存在すると決定
し、そして該ピークの位置を次の探索基準点と
する工程、 (5b) 第四工程においてピークが存在しない場合
には、該探索基準点を一定距離進めた位置を次
の探索基準点とする工程、および

Claims (1)

1. めのオートラジオグラフ解析方法。 ２ 上記バンドの序列が、オートラジオグラフに
   対応するデシタル信号について信号処理を行なう
   ことにより決定されたものであることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項記載の核酸の塩基配列決
   定のためのオートラジオグラフ解析方法。 ３ 上記第二工程でカーソル固定されたバンドが
   分離展開列の最下端のバンドであり、上記第二乃
   至第四工程において最下端のバンドから順にバン
   ドの序列を確認することを特徴とする特許請求の
   範囲第１項記載の核酸の塩基配列決定のためのオ
   ートラジオグラフ解析方法。 ４ 上記第二および第三工程において、バンドの
   序列確認のための入力情報が決定されたバンドの
   序列に基づくものであることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載の核酸の塩基配列決定のため
   のオートラジオグラフ解析方法。 ５ 上記第二および第三工程において、読取カー
   ソルを折れ線もしくは曲線として表示することを
   特徴とする特許請求の範囲第１項記載の核酸の塩
   基配列決定のためのオートラジオグラフ解析方
   法。 ６ 上記画像表示された分離展開パターンのオー
   トラジオグラフ、オートラジオグラフに固定され
   た確認後の複数の読取カーソルおよび確認された
   バンドの序列をそれぞれ、(1)パターン情報、(2)カ
   ーソル情報および(3)塩基配列情報として分離し、
   かつ(1)と(2)および(2)と(3)をそれぞれ対応づけて記
   録保存することを特徴とする特許請求の範囲第１
   項記載の核酸の塩基配列決定のためのオートラジ
   オグラフ解析方法。 ７ 上記第一工程において、オートラジオグラフ
   を濃淡画像、二値画像、もしくは分離展開方向に
   沿つた位置と画像濃度とからなる複数の二次元波
   形を分離展開方向に垂直な方向に一定間隔で多重
   表示してなる画像として画像表示することを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の核酸の塩基配
   列決定のためのオートラジオグラフ解析方法。 ８ 上記第一工程において、オートラジオグラフ
   に対応するデジタル信号が、支持媒体と輝尽性蛍
   光体を含有する蓄積性蛍光体シートとを重ね合わ
   せて、支持媒体上の放射性標識物質のオートラジ
   オグラフを該蛍光体シートに蓄積記録した後、該
   蛍光体シートに励起光を照射して該オートラジオ
   グラフを輝尽光として光電的に読み出すことによ
   り得られたものであることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項記載の核酸の塩基配列決定のための
   オートラジオグラフ解析方法。 ９ 上記第一工程において、オートラジオグラフ
   に対応するデジタル信号が、支持媒体と写真感光
   材料とを重ね合わせて、支持媒体上の放射性標識
   物質のオートラジオグラフを該感光材料に感光記
   録した後、該感光材料上に可視化されたオートラ
   ジオグラフを光電的に読み取ることにより得られ
   たものであることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載の核酸の塩基配列決定のためのオートラ
   ジオグラフ解析方法。 １０ 放射性標識が付与された塩基特異的DNA
   断片物もしくはRNA断片物が支持媒体上に一次
   元的方向に分離展開されて形成された複数の分離
   展開列のオートラジオグラフを解析することによ
   り、核酸の塩基配列を決定する方法において、 (1) バンドの序列が決定されたオートラジオグラ
   フを、該オートラジオグラフに対応するデジタ
   ル信号に基づいて電気的に画像表示する工程、 (2) バンドの序列確認のための入力情報に基づい
   て、分離展開列を横切りかつ一つのバンドの位
   置を通過するように読取カーソルをオートラジ
   オグラフに固定して画面上に表示し、同時に該
   バンドの塩基名を画面上に表示する工程、 (3) バンドの序列確認のための入力情報に基づい
   て、前工程でカーソル固定されたバンドに隣接
   するバンドの位置を通過するように読取カーソ
   ルをオートラジオグラフに固定して画面上に表
   示し、同時に該バンドの塩基名を画面上に表示
   する工程、 (4) 第三工程において表示された読取カーソルお
   よび／または塩基名を、表示画面に基づく情報
   の入力がある場合には該情報に従つて削除し、
   追加し、もしくは変更する工程、および (5) 第三および第四工程を順次繰り返すことによ
   り、決定されたバンドの序列を確認し、修正す
   る工程、 を含むことを特徴とする核酸の塩基配列決定のた
   めのオートラジオグラフ解析方法。 １１ 上記バンドの序列が、オートラジオグラフ
   に対応するデジタル信号について信号処理を行な
   うことにより決定されたものであることを特徴と
   する特許請求の範囲第１０項記載の核酸の塩基配
   列決定のためのオートラジオグラフ解析方法。 １２ 上記第二工程でカーソル固定されたバンド
   が分離展開列の最下端のバンドであり、上記第二
   乃至第五工程において最下端のバンドから順にバ
   ンドの序列を確認修正することを特徴とする特許
   請求の範囲第１０項記載の核酸の塩基配列決定の
   ためのオートラジオグラフ解析方法。 １３ 上記第二および第三工程において、バンド
   の序列確認のための入力情報が決定されたバンド
   の序列に基づくものであることを特徴とする特許
   請求の範囲第１０項記載の核酸の塩基配列決定の
   ためのオートラジオグラフ解析方法。 １４ 上記第二および第三工程において、読取カ
   ーソルを折れ線もしくは曲線として表示すること
   を特徴とする特許請求の範囲第１０項記載の核酸
   の塩基配列決定のためのオートラジオグラフ解析
   方法。 １５ 上記画像表示された分離展開パターンのオ
   ートラジオグラフ、オートラジオグラフに固定さ
   れた確認修正後の複数の読取カーソルおよび確認
   修正されたバンドの序列をそれぞれ、(1)パターン
   情報、(2)カーソル情報および(3)塩基配列情報とし
   て分離し、かつ(1)と(2)および(2)と(3)をそれぞれ対
   応づけて記録保存することを特徴とする特許請求
   の範囲第１０項記載の核酸の塩基配列決定のため
   のオートラジオグラフ解析方法。 １６ 上記第一工程において、オートラジオグラ
   フを濃淡画像、二値画像、もしくは分離展開方向
   に沿つた位置と画像濃度とからなる複数の二次元
   波形を分離展開方向に垂直な方向に一定間隔で多
   重表示してなる画像として画像表示することを特
   徴とする特許請求の範囲第１０項記載の核酸の塩
   基配列決定のためのオートラジオグラフ解析方
   法。 １７ 上記第一工程において、オートラジオグラ
   フに対応するデジタル信号が、支持媒体と輝尽性
   蛍光体を含有する蓄積性蛍光体シートとを重ね合
   わせて、支持媒体上の放射性標識物質のオートラ
   ジオグラフを該蛍光体シートに蓄積記録した後、
   該蛍光体シートに励起光を照射して該オートラジ
   オグラフを輝尽光として光電的に読み出すことに
   より得られたものであることを特徴とする特許請
   求の範囲第１０項記載の核酸の塩基配列決定のた
   めのオートラジオグラフ解析方法。 １８ 上記第一工程において、オートラジオグラ
   フに対応するデジタル信号が、支持媒体と写真感
   光材料とを重ね合わせて、支持媒体上の放射性標
   識物質のオートラジオグラフを該感光材料に感光
   記録した後、該感光材料上に可視化されたオート
   ラジオグラフを光電的に読み取ることにより得ら
   れたものであることを特徴とする特許請求の範囲
   第１０項記載の核酸の塩基配列決定のためのオー
   トラジオグラフ解析方法。