JPH0529072B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、核酸の塩基配列決定のための信号処
理方法に関するものである。

［発明の背景］ 近年、急速に発達して来た分子生物学の分野に
おいては、生物体の機能や複製のメカニズムを解
明するために、生物体のもつ遺伝情報を明らかに
することが必須のこととなつている。とりわけ、
特定の遺伝情報を担うDNA（もしくはDNA断片
物、以下同様）などの核酸の塩基配列を決定する
ことが必要不可欠なこととなつている。

DNA、RNAなどの核酸の塩基配列を決定する
ための代表的な方法として、オートラジオグラフ
イーを利用するマキサム・ギルバート（Maxam
−Gilbert）法およびサンガー・クールソン
（Sanger−Coulson）法が知られている。前者の
マキサム・ギルバート法は、まず、塩基配列を決
定しようとしているDNAあるいはDNA断片物の
鎖状分子の一方の端部に³²P等の放射性同位元素
を含む基を結合させることにより、その対象物を
放射性標識物質としたのち、化学的な手段を利用
して鎖状分子の各構成単位間の結合を塩基特異的
に切断する。次に、この操作により得られた塩基
特異的DNA切断分解物の混合物をゲル電気泳動
法により分離展開し、多数の切断分解物がそれぞ
れ分離展開されて形成された分離展開パターン
（ただし、視覚的には見ることができない）を得
る。この分離展開パターンをたとえばＸ線フイル
ム上に可視化してそのオートラジオグラフを得、
得られたオートラジオグラフと各々の塩基特異的
切断手段とから、放射性同位元素が結合された鎖
状分子の端部から一定の位置関係にある塩基を順
次決定し、これにより対象物全ての塩基配列を決
定することができる。

また、後者のサンガー・クールソン法は、
DNAあるいはDNA断片物の鎖状分子と相補的で
あつて、かつ放射性標識が付与されたDNA合成
物を化学的な手段を利用して塩基特異的に合成
し、この塩基特異的DNA合成物の混合物を用い
て上記と同様にしてそのオートラジオグラフから
塩基配列を決定する方法である。

本出願人は、上記核酸の塩基配列決定を簡易か
つ高精度で行なうことを目的として、それに利用
されるオートラジオグラフ測定操作において、上
記Ｘ線フイルム等の写真感光材料を用いる従来の
放射線写真法の代りに、蓄積性蛍光体シートを用
いる放射線像変換方法を利用する方法について既
に特許出願している（特開昭59−83057号、特願
昭58−201231号）。ここで、蓄積性蛍光体シート
は輝尽性蛍光体からなるものであり、放射線エネ
ルギーを該蛍光体シートの輝尽性蛍光体に吸収さ
せたのち、可視乃至赤外領域の電磁波（励起光）
で励起することにより、放射線エネルギーを蛍光
として放出させることができるものである。この
方法によれば、露光時間を大幅に短縮化すること
ができ、また従来より問題となつていた化学カブ
リ等が発生することがない。さらに、放射性標識
物質のオートラジオグラフは、一旦放射線エネル
ギーとして蛍光体シートに蓄積されたのち輝尽光
として光電的に読み出されるから、直接にデジタ
ル信号として得たのち適当な記録媒体に保存する
ことができる。

従来より、核酸の塩基配列は、可視化されたオ
ートラジオグラフについて放射性標識が付与され
た核酸の塩基特異的切断分解物もしくは塩基特異
的合成物（以下、単に核酸の塩基特異的断片物と
称する）の分離展開部位（バンド）を視覚的に判
断し、それらバンドの位置を相互に比較すること
により決定されている。よつて、オートラジオグ
ラフの解析は通常人間の視覚を通して行なわれて
おり、そのために多大な時間と労力が費されてい
る。

また、人間の目に依存しているため、オートラ
ジオグラフを解析して得られる核酸の塩基配列が
解析者によつて異なるなどの塩基配列情報の精度
には限界がある。

そこで、本出願人は、上記オートラジオグラフ
をデジタル信号として得た後このデジタル信号に
適当な信号処理を施すことにより、DNAの塩基
配列を自動的に決定する方法についても既に特許
出願している（特開昭59−126527号、特願昭59−
89615号、特願昭60−226091号、特願昭60−
226092号）。オートラジオグラフに対応するデジ
タル信号は、従来の放射線フイルムを利用する場
合には一旦オートラジオグラフを該フイルム上に
可視画像化したのち、反射光または透過光を利用
して光電的に読み取ることにより得られる。ま
た、蓄積性蛍光体シートを用いる場合には、オー
トラジオグラフが蓄積記録された蛍光体シートを
直接に読み出すことにより得られる。

しかしながら、実際に放射性標識物質を電気泳
動法などにより支持媒体上に分離展開させて得ら
れた分離展開パターンには種々の歪みおよびノイ
ズが生じがちである。たとえば、分離展開過程に
おいて展開条件が十分でなかつたために分離展開
列自体が曲がつて蛇行したり、あるいは露光過程
で支持媒体と写真感光材料または蓄積性蛍光体シ
ートとの重ね合せがずれたり、読取り（読出し）
過程では感光材料または蛍光体シートの設置が不
十分であつたりしたために、パターン全体が傾く
ことがある。

さらに、試料の作成時において核酸の塩基特異
的断片物の調製、分離が不十分であつたり、試料
の支持媒体への注入時に他の試料がスロツトに混
入することにより、本来現われるべきではない位
置にバンド（これをゴーストバンドまたはエクス
トラバンドと呼ぶ）が現われることがある。ある
いは試料に放射性不純物が混入したり、露光過程
で自然放射線等の照射を受けたりすることにより
ノイズが発生することがある。また、分離展開開
始位置付近のバンドの密な領域においては一つ一
つのバンドが十分に分離していず、複数のバンド
が融合していることがある。

このように分離展開列に歪みが発生した場合で
あつても、また得られたデジタル信号が分離展開
列の歪んだ情報を有する場合であつても、さらに
はノイズあるいはバンドの融合が発生した場合で
あつても、そのオートラジオグラフに対応するデ
ジタル信号を効率良く信号処理して核酸の塩基配
列を高精度で自動決定することが望まれる。

［発明の要旨］ 本発明者は、オートラジオグラフイーを利用し
て核酸の塩基配列を自動決定する方法において、
分離展開列に歪みが生じている分離展開パターン
であつてもそのオートラジオグラフに対応するデ
ジタル信号を好適に信号処理することにより、核
酸の塩基配列を簡易かつ高精度で自動決定するこ
とを実現した。

さらに本発明者は、分離展開パターンにノイズ
あるいはバンドの融合が生じている場合であつて
も、核酸の塩基配列を簡易かつ高精度で自動決定
することを実現した。

すなわち、本発明は、放射性標識が付与された
塩基特異的DNA断片物もしくは塩基特異的RNA
断片物の混合物が支持媒体上に一次元的方向に分
離展開されて形成された複数の分離展開列のオー
トラジオグラフに対応するデジタル信号について
信号処理を行なうことにより、核酸の塩基配列を
決定する方法において、 (1) 分離展開列ごとに、列の追尾開始点より分離
展開方向ｘに沿つてバンドを一つ検出する工
程、 (2) これらのバンドのうち分離展開の開始位置に
最も近い上部のバンドＡを有する分離展開列に
ついて、ｘ方向に直角な方向ｙにおけるバンド
Ａの領域の最大値と最小値を求めたのち、この
最大値と最小値の平均値yaを次の追尾開始点
のｙ座標とし、該バンド領域内でyaを有する
点のうちｘ方向の最大値xaを次の追尾開始点
のｘ座標とする工程、 (3) 残りの分離展開列について、 (a) バンドＡのｘ方向の領域と残りの分離展開
列のバンドＢの領域が重なる場合には、xa
を次の追尾開始点のｘ座標とし、バンドＢの
領域のｙ方向の最大値と最小値の平均値yb
を次の追尾開始点のｙ座標とする工程、また
は (b) バンドＡのｘ方向の領域と残りの分離展開
列のバンドＢの領域が重ならない場合には、
xaを次の追尾開始点のｘ座標とし、yaとバ
ンドＡを有する列の追尾開始点のｙ座標との
差をバンドＢを有する列の追尾開始点のｙ座
標に加えた値を次の追尾開始点のｙ座標とす
る工程、および (4) 上記第一乃至第三工程を順次繰り返すことに
より、各分離展開列について列を追従する工
程、 を含むことを特徴とする核酸の塩基配列決定のた
めの信号処理方法を提供するものである。

本発明によれば、核酸の塩基特異的断片物の混
合物を支持媒体上で分離展開させて得られた分離
展開パターンのオートラジオグラフに対応するデ
ジタル信号について、分離展開列（レーン）が歪
んでいる場合でも、レーンを精確に追尾しうる機
能を有する信号処理回路を通すことにより、核酸
の塩基配列を自動的に簡易かつ高精度で得ること
ができる。

また、本発明によれば、分離展開パターンにノ
イズおよび／または融合バンドが生じている場合
であつても、レーンを追尾過程でノイズを拾うこ
となく、また融合バンド一つ一つのバンドに分離
しながら真正なバンドのみを有効に検出すること
ができる。そして、この有効なバンドの検出によ
り、更に一層精度高くレーン追尾を行なうことが
できる。

すなわち、まず各レーンでバンドを一つずつ検
出し、このうち分離展開開始位置に最も近いバン
ドを有するレーンについてバンドの領域から次の
追尾開始点のxy座標を有効に決定し、このｘ座
標を各レーンに共通の追尾開始点のｘ座標とす
る。また、他のレーンにおける次の追尾開始点の
ｙ座標については、該バンドと他のレーンのバン
ドの領域が少しでも重なる場合には上記同様にし
てバンド領域からｙ座標を求め、該バンドと他の
レーンのバンドの領域が全く重ならない場合には
上記レーンにおけるｙ座標の変更値を加えること
によりｙ座標を決定する。このようにしてパター
ンの上部から下部領域に向かつて一つのバンドを
検出する度に各レーンの追尾開始点の修正を行な
うことにより、高精度でレーン追尾することがで
きる。

また特に、バンドの検出に際して、予め信号レ
ベルの閾値とバンドの大きさに関する一定範囲と
を設定しておき、まず分離展開方向に沿つた追尾
線上で閾値を越える信号が見つかつた場合にバン
ド有りとみなし、次いでこのバンドの大きさが一
定範囲である場合に真正な一のバンドと決定する
ことによりエキストラバンド等のノイズをバンド
と誤認することがなく、また融合バンドを一つの
バンドと読み誤ることもない。バンドの大きさが
予め設定された範囲を越えた場合には閾値をより
大きな値に変更して上記操作をやり直すことによ
りノイズの影響を排除し、融合バンドを適確に分
離しながらバンドを確定することができる。

そして、この精確なレーンの追尾情報に基づい
て各レーンに沿つた一次元波形（パターンに即し
たプロフアイル）を得ることができ、この一次元
のプロフアイルに対してさらに好適な信号処理を
行なうことにより、核酸の塩基配列を簡便かつ高
精度で自動決定することができる。

［発明の構成］ 本発明において、用いられる試料の例として
は、放射性標識が付与されたDNA、RNA等の核
酸の塩基特異的断片物の混合物を挙げることがで
きる。ここで、核酸の断片物とは長鎖状の分子の
一部分を意味する。たとえば、塩基特異的DNA
断片物混合物の一種である塩基特異的DNA切断
分解物混合物は、前述のマキサム・ギルバート法
に従つて、放射性標識が付与されたDNAを塩基
特異的に切断分解することにより得られる。

また、塩基特異的DNA断片物混合物は前述の
サンガー・クールソン法に従つて、DNAをテン
プレート（鋳型）として、放射性標識が付与され
たデオキシヌクオシドトリフオスフエートと
DNA合成酵素とを用いて合成することにより得
られる。

さらに、塩基特異的DNA断片物の混合物も上
記と同様の方法により、切断分解物混合物として
または合成物混合物として得ることができる。な
お、DNAはその構成単位としてアデニン、グア
ニン、チミン、シトシンの四種類の塩基からなる
が、一方RNAはアデニン、グアニン、ウラシル、
シトシンの四種類の塩基からなる。

放射性標識は、これらの物質に適当な方法で
³²P、¹⁴C、³⁵S、³H、¹²⁵Iなどの放射性同位元素を保
持させることによつて付与される。

試料である放射性標識が付与された核酸の塩基
特異的断片物の混合物はゲル状支持媒体など公知
の各種の支持媒体を用いて、電気泳動法、薄層ク
ロマトグラフイー、カラムクロマトグラフイー、
ペーパークロマトグラフイーなど種々の分離展開
方法により支持媒体上に分離展開される。

次に、放射性標識物質が分離展開された支持媒
体について、従来の写真感光材料を用いる放射線
写真法により、あるいは蓄積性蛍光体シートを用
いる放射線像変換方法によりそのオートラジオグ
ラフが得られ、次いで適当な読取り（読出し）系
を介してオートラジオグラフ物質のオートラジオ
グラフに対応するデジタル信号が得られる。

前者の放射線写真法を利用する場合には、まず
支持媒体とＸ線フイルム等の写真感光材料とを低
温もしくは常温で長時間（数時間〜数十時間）重
ね合わせて放射線フイルムを感光させたのち、現
像して放射性標識物質のオートラジオグラフを放
射線フイルム上に可視画像化する。次いで、画像
読取装置を用いて放射線フイルム上に可視化され
たオートラジオグラフを読み取る。たとえば、放
射線フイルムに光ビームを照射してその透過光ま
たは反射光を光電的に検出することにより、オー
トラジオグラフは電気信号として得られる。さら
に、この電気信号をＡ／Ｄ変換することにより、
オートラジオグラフに対応するデジタル信号を得
ることができる。

後者の放射線像変換方法を利用する場合には、
まず、支持媒体と蓄積性蛍光体シートとを常温で
短時間（数秒〜数十分間）重ね合わせて蛍光体シ
ートに放射性標識物質から放出される放射線エネ
ルギーを蓄積させることにより、そのオートラジ
オグラフを蛍光体シートに一種の潜像として記録
する。ここで、蓄積性蛍光体シートは、たとえば
プラスチツクフイルムからなる支持体、二価ユー
ロピウム賦活弗化臭化バリウム（BaFBr：Eu²⁺）
等の輝尽性蛍光体からなる蛍光体層、および透明
な保護膜がこの順に積層されたものである。蓄積
性蛍光体シートに含有されている輝尽性蛍光体
は、Ｘ線等の放射線が照射されるとその放射線エ
ネルギーを吸収して蓄積し、そののち可視乃至赤
外領域の光で励起すると蓄積していた放射線エネ
ルギーを輝尽光として放出するという特性を有す
る。

次いで、読出装置を用いて蓄積性蛍光体シート
に蓄積記録されたオートラジオグラフを読み出
す。具体的には、たとえば蛍光体シートをレーザ
ー光で走査して放射線エネルギーを輝尽光として
放出させ、この輝尽光を光電的に検出することに
より、放射性標識物質のオートラジオグラフは可
視画像化することなく直接に電気信号として得ら
れる。さらに、この電気信号をＡ／Ｄ変換するこ
とにより、オートラジオグラフに対応するデジタ
ル信号を得ることができる。

上述のオートラジオグラフ測定操作およびオー
トラジオグラフに対応するデジタル信号を得る方
法の詳細については、前記特開昭59−83057号、
特開昭59−126527号、特開昭59−126278号等の各
公報に記載されている。

なお、上記においては、支持媒体上に分離展開
された放射性標識物質のオートラジオグラフに対
応するデジタル信号を得る方法として、従来の放
射線写真法および放射線像変換方法を利用する方
法について述べたが、これらの方法に限定される
ものではなく、それ以外の如何なる方法により得
られたデジタル信号であつても放射性標識物質の
オートラジオグラフと対応関係がある限り、本発
明の信号処理方法を適用することが可能である。

また、上記いずれの方法においてもオートラジ
オグラフの読取り（または読出し）は、放射線フ
イルム（または蓄積性蛍光体シート）の全面に亘
つて行なう必要はなく、画像領域のみについて行
なうことも勿論可能である。

得られたデジタル信号D_xyは、放射線フイルム
（または蛍光体シート）に固定された座標系で表
わされた座標（ｘ、ｙ）とその座標における信号
のレベルｚとからなり、一つの信号は一つの画素
に対応している。信号のレベルはその座標におけ
る画像濃度、すなわち放射性標識物質の量を表わ
している。従つて、一連のデジタル信号（すなわ
ち、デジタル画像データ）は放射性標識物質の二
次元的な位置情報を有している。

このようにして得られた支持媒体上の放射性標
識物質のオートラジオグラフに対応するデジタル
信号には、以下に述べるような本発明の方法によ
り信号処理が施されて、目的の核酸の塩基配列の
決定が行われれる。

本発明の信号処理方法の実施の態様を、次の四
種類の放射性標識が付与された塩基特異的DNA
断片物の組合わせにより形成された泳動列（分離
展開列）からなる場合について説明する。

(1) グアニン(G)特異的DNA断片物 (2) アデニン(A)特異的DNA断片物 (3) チミン(T)特異的DNA断片物 (4) シトシン(C)特異的DNA断片物 ここで、各塩基特異的DNA断片物は、塩基特
異的に切断分解もしくは合成された、すなわち末
端の塩基を同じくする種々の長さのDNA断片物
からなる。

第１図は、上記四種類の塩基特異的DNA合成
物がそれぞれ四つのスロツトに電気泳動されてな
る泳動パターンのオートラジオグラフを示す。泳
動方向はｘ方向である。

このオートラジオグラフに対応するデジタル信
号は、信号処理回路において一旦メモリ（バツフ
アーメモリ、または磁気デイスク等の不揮発性メ
モリ）に記憶される。

まず第一に泳動列（レーン）ごとに追尾開始点
から始めて泳動方向ｘに沿つた直線（追尾線）上
でバンドを一つ検出する。

バンドの検出は、たとえば以下のような操作に
より行なうことができる。

まず、各レーンについて泳動方向ｘに沿つた直
線上で、追尾開始点の信号レベルlsおよび信号の
初期閾値loに基づいてバンドを求める。

ここで、泳動方向は、レーンの蛇行およびパタ
ーンの傾斜が生じている場合に、実際のパターン
に完全に一致する泳動方向を意味するものではな
く、試料を電気泳動させようとした方向であつて
通常は支持媒体（すなわち、重ね合わせられた写
真感光材料もしくは蓄積性蛍光体シート）の長軸
方向（ｘ方向）を意味する。

また、最初の追尾開始点は通常は、レーンの位
置があまりずれていない泳動開始点近く（第１図
の左端）を選ぶのが好ましく、そして追尾は泳動
の上端から下端に向かつて行なうようにする。初
期閾値loは、バンドの有無を判別するための信号
レベルの閾値（基準値）ln（ただし、ｎは０また
は正の整数である）の初期値であり、比較的低い
値に設定される。バンドの大きさが一定範囲以上
である場合には後述するように順次より高い値に
設定変更されうる。

具体的には、たとえば次のようにしてバンドを
検出する。

第２図１は、一つのレーンについての部分的な
オートラジオグラフであり、バンド１を平面的に
濃淡画像として表示した図である。バンドの探索
は泳動方向ｘに沿つた直線２について行なわれ
る。

第２図２はこの直線２についてｘ方向の位置と
信号レベルからなる一次元波形を示す。すなわ
ち、バンド探索はこの一次元波形に基づいて行な
われるのであるが、デジタル信号は各読取り（読
出し）画素に対応しているから、実際には一次元
波形は不連続点の集合である。

追尾開始点の信号レベルlsと初期閾値loとの関
係に基づいて場合分けすると、第３図に示すよう
な五通りの場合が起こりうる。なお、第３図は第
２図２の一次元波形を部分的に示す図であり、白
点は追尾開始点を表わし、黒点はバンド検知点を
表わしている。すなわち、 (1) 開始レベルlsが初期閾値lo以下（ls≦lo）で
あつて、かつ信号レベルが増加する傾向にある
場合［第３図１］、 (2) 開始レベルlsが初期閾値lo以下（ls≦lo）で
あつて、かつ信号レベルが減少する傾向にある
場合［第３図２］、 (3) 開始レベルlsが初期閾値loより高く（ls＞
lo）、かつ信号レベルが増加する傾向にある場
合［第３図３］、 (4) 開始レベルlsが初期閾値loより高く（ls＞
lo）、かつ信号レベルが減少する傾向にある
（そして、信号レベルは一度閾値loを下回る）
場合［第３図４］、および (5) 開始レベルlsが初期閾値loより高く（ls＞
lo）、かつ信号レベルが減少する傾向にあるも
のの閾値loを下回らない場合［第３図５］、 である。

なお、上記５の場合はバンドが近接していてバ
ンドとの間隔が十分ではないときに生じ、いわゆ
るバンドの融合を表わしている。

上記１および２の場合（ls≦lo）は最も単純な
ケースであり、信号レベルが一次元波形上で初め
て閾値lo以上となる点をバンド検知点とする。

上記３の場合（ls＞lo）には既に開始点が検出
すべきバンドの領域にあるので、信号レベルが次
に開始レベルls以上となる点をバンド検知点とす
る。

上記４の場合（ls＞lo）にはまだ開始点が検出
済みのバンド領域にあるので、信号レベルが一度
閾値loを下回つた後初めて閾値lo以上となる点を
バンド検知点とする。

そして、上記５の場合（ls＞lo）にはバンド間
で信号レベルが閾値lo以下とならないので、次に
初めて開始レベルls以上となる点をバンド検知点
とする。

このようにバンド検知点を定めることにより、
既に決定されたバンドを再び検知したり、次に検
出すべきバンドを探索し損なうことなく、バンド
探索を行なうことができる。

次に、検知されたバンドについて閾値loに基づ
いてその領域を求め、次いで領域の大きさから該
バンドが真のバンドであるか否かを決定し、真の
バンドである場合にのみ検出すべきバンドとす
る。

バンドは上記バンド検知点に連なつている点の
集合であるとして、バンド検知点を基点としてそ
れに上下左右斜めのいずれかで連続し、かつ信号
レベルが閾値lo以上である点を求める。得られた
バンド検知点を含む連続した領域がバンドの領域
である。

バンドの領域の大きさはたとえば、領域のｘ方
向の最大距離（最大値と最小値との差）xoおよ
びｘ方向に直角な方向ｙの最大距離yoで見積る
ことができる。

第４図に、バンドの領域（斜線部分：３）の例
を示す。

予め、一つのバンドとして容認できるｘ方向お
よびｙ方向の最小の幅xmin、ymin、並びにｘ方
向およびｙ方向の最大の幅xmax、ymaxを設定
しておく。すなわち、xminおよびyminは真正バ
ンドとノイズを区別するための設定値であり、
xmaxおよびymaxは単一のバンドと複数個が併
合したバンドを区別するための設定値である。

(a) 距離xoおよびyoがいずれも上記最小幅と最
大幅の範囲内にある（xmin≦xo≦xmaxかつ
ymin≦yo≦ymax）場合には、得られたバン
ドは真のバンドであると決定し、このバンドを
検出すべきバンドとする。

(b₁) 距離xoおよび距離yoのうちの少なくとも一
方が上記最小幅よりも小さい（xo＜xminまた
はyo＜ymin）場合には、得られたバンドはエ
クストラバンドであつて真のバンドではないと
決定したのち、バンド検出点よりさらに下部の
領域についてバンド探索を行なう。

(b₂) 上記(a)および（b₁）以外の場合であつて、
距離xoおよび距離yoのうちの少なくとも一方
が上記最大幅よりも大きい（xo＜xmaxもしく
はyo＜ymax）場合には、バンドの分離が十分
ではないとして、閾値loをl₁に変更して追尾開
始点から再びバンド探索をやり直す。

ここで、新たな閾値l₁はloに一定の増分Δlを加
えた値（l₁＝lo＋Δl）であり、閾値を高くしてバ
ンドを探索し直すことにより、融合バンドを一つ
一つ分離して真のバンドを決定し、あるいは相対
的に信号レベルの小さなエクストラバンドを好適
に除去することができる。

一般に、バンド領域が大き過ぎる場合には何度
でも閾値lnより高い値ln₊₁（ln₊₁＝ln＋Δl；ここ
で、ｎ＋１は閾値を変更した回数を表わす）に変
更して、追尾開始点からバンド探索を繰り返すこ
とができる。この場合に、予め閾値の最大値
lmaxを設定しておき、変更後の閾値ln₊₁が最大
値以下である（ln₊₁≦lmax）場合にはこの閾値
ln₊₁に基づいて追尾開始点からバンド探索をやり
直すが、閾値ln₊₁が最大値よりも大きくなる
（ln₊₁＞lmax）場合にはバンドの分離は不可能で
あるとして、該バンドは真のバンドではないと決
定してバンド検知点より下部領域でバンド探索を
行なうのが処理効率および精度の点から好まし
い。

なお、バンドの大きさの判定は上記手段に限ら
れるものではなく、たとえばバンド領域に含まれ
る信号の数から判断することも可能である。

このようにして、各レーンについて真のバンド
が一つ検出されるまで（上記ａの場合が起こるま
で）バンドの探索を繰り返す。

第二に、レーンごとに検出されたバンドのう
ち、泳動開始位置に最も近い、すなわち最もパタ
ーン上部に位置するバンド（これをバンドＡとす
る）を有するレーンについて、次の追尾開始点を
決定する。

次の追尾開始点のｙ座標は、第４図に示すよう
に、バンドＡの領域３におけるｙ方向の最大値と
最小値の平均値yaとする。また、ｘ座標は、バ
ンドＡの領域内で座標yaを有する点のうちｘ方
向と最大値xaとする。これにより、バンドを検
出し損なうことなくレーンに沿つて精確に追尾す
ることができる。第４図において、座標（xa、
ya）４が次の追尾開始点であり、矢印の方向に
追尾が続行される。

第三に、残りの三つのレーンについてそれぞ
れ、次の追尾開始点を決定する。

第５図および第６図に、バンドの領域と次の追
尾開始点との関係を示す。

まず、各レーンにおける次の追尾開始点のｘ座
標は、上記バンドＡのレーンと同一の座標xaと
する。これにより、いずれか一つのレーンでバン
ドを一つ検出するごとに追尾開始点を修正してレ
ーン追尾を行なうことになるので、バンド検出し
損なうことなく常にレーンに沿つて追尾すること
ができる。

次に、 (a) 第５図に示ように、他のレーンのバンド（こ
れをバンドＢとする）と領域５とバンドＡのｘ
方向と領域とが少しでも重なる場合には、バン
ドＢの領域５におけるｙ方向の最大値と最小値
の平均値ybを次の追尾開始のｙ座標とする。
追尾は、次の追尾開始点６から矢印の方向に続
行される。バンドＢが次の追尾開始点の座標
xaに近い位置に存在するので、バンドＢの領
域に基づいて好適にｙ座標を決定することがで
きる。

(b) 第６図に示すように、他のレーンのバンドＢ
の領域７のバンドＡのｘ方向の領域とが全く重
ならない場合には、バンドＡのレーンにおける
次の追尾開始点の座標yaと初めの追尾開始点
ysとの差を、バンドＢのレーンの初めと追尾開
始点ys′に加えた値： yb′＝ys′＋（ya−ys） を次の追尾開始点のｙ座標とする。追尾は、次の
追尾開始点８から矢印の方向に続行される。一般
に、レーンの蛇行はパターン全体に似かよつた傾
向で現われることが多いので、他のレーンの次の
追尾開始点の座標xaに近い位置にバンドが存在
しないときは、バンドＡのレーンにおける追尾開
始点のｙ座標の修正値と同じと仮定してその分だ
け該レーンのｙ座標を変更することにより、より
レーンに沿つて追尾することができる。

第四に、レーンごとに新たに設定された追尾開
始点からパターンの下部に向かつてｘ方向に沿つ
た直線上で、上記と同様にして再びバンドの探索
を行なう。

この際に、閾値lnは常に初期閾値loから始め
る。そして閾値lnはlmax以下で終わるようにす
るのが好ましい。

バンドが一つも検出されなくなるまで上述した
操作を繰り返す。これにより、レーン上端部から
下端部までレーン追尾を完了することができる。

第７図に、レーン追尾が終了した別の泳動パタ
ーンの例を部分的に示す。レーン上の折れ線は追
尾の軌跡を表わし、四角形はバンドの領域の大き
さを表わしている。

このようにして得られたレーンの追尾情報に基
づいてDNAの塩基配列を精度高く自動設定する
ことができる。

たとえば、レーン追尾情報に基づいてレーンに
沿つた一定幅の信号を抽出し、これよりｘ方向の
位置と信号のレベルとからなる一次元波形（プロ
フアイル）を精度高く得、この一次元のプロフア
イルについて更に適当な信号処理を施すことによ
り、塩基配列決定を行なうことができる。

なお、泳動パターンに更にスマイリング現象あ
るいはオフセツト歪みなどの種々の歪みが発生し
ている場合には、プロフアイルについてバンドの
位置を決定する前にこれらの補正のための信号処
理を行なつてもよい。

ここで、スマイリング現象は、支持媒体の中央
部のスロツトの泳動距離に比べて両端部のスロツ
トの泳動距離が短くなる現象であり、泳動過程に
おける放熱効果（いわゆるエツジ効果）などが原
因となつて生じる。オフセツト歪みとは、レーン
間相互の全体的な位置ズレをいい、スロツトの形
状の相違等により試料の電気泳動の開始位置、開
始時間が各スロツトで異なることなどが原因とな
つて生じる。

これらの補正のための信号処理の詳細について
は、本出願人による特願昭60−74899号、特願昭
60−74900号、特願昭60−85275号、特願昭60−
85276号の各明細書に記載されている。

次いで、プロフアイルについてたとえば信号レ
ベルが極大となる位置を求めることにより、バン
ドの位置を精確に決定することができる。そし
て、レーン間で決定された真正バンドの位置を相
互に比較することにより、直ちにバンドに序列を
付けることができる。このとき、上記四種類の塩
基特異的DNA合成物の組合わせが排他的な組合
せであることから、異なるレーン上の同じ泳動位
置に二つ以上のバンドは存在しえないことを利用
して、容易に序列を決定することができる。上記
１〜４のスロツトはそれぞれ(G)、(A)、(T)、(C)から
なる末端塩基についての情報を有するから、各バ
ンドの属するスロツトに対応する塩基で置換する
ことにより、DNAの塩基配列、（例えば（Ａ−Ｇ
−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｇ−…）を得ることができ
る。

このようにして、DNAの片方の鎖状分子につ
いての塩基配列を決定することができる。なお、
DNAの塩基配列についての情報は、上記の表示
形態に限られるものではなく、たとえば所望によ
り同時に各バンドの強度（z′）を放射性標識物質
の相対量として表示することも可能である。さら
に、DNAの二本の鎖状分子両方についての塩基
配列を表示することもできる。

あるいはまた、DNAの塩基配列情報は、上記
の信号処理がなされたデジタル信号に基づいて画
像として表示することもできる。すなわち、各バ
ンドの補正後の位置をオリジナルのオートラジオ
グラフとともに可視画像化して表示することがで
きる。この場合には、最終的な塩基配列決定を解
析者自身がこの表示画像に基づいて行なうことが
可能である。

なお、上記においては、試料である塩基特異的
DNA合成物の混合物として（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）
の排他的組合せを利用した場合について説明した
が、本発明の信号処理方法はこの組合せに限定さ
れるものではなく、例えば（Ｇ、Ｇ＋Ａ、Ｔ＋
Ｃ、Ｃ）などの種々の組合せに適用することがで
きる。また同様に、塩基特異的DNA断片物の混
合物（例えば、Ｇ、Ａ、Ｕ、Ｃと組合せ）につい
ても本発明の方法を適用することができる。さら
に、レーンの追尾は、一組の核酸の塩基特異的断
片物の分離展開列に限定されるものではなく、支
持媒体上に同時に分離展開された全ての分離展開
列について行なうことが可能である。

このようにして得られた塩基配列情報について
はこのほかにも、たとえば、既に記録保存されて
いる他の核酸の塩基配列と照合するなどの遺伝言
語学的情報処理を行なうことも可能である。

上述の信号処理により決定された核酸の塩基配
列についての情報は、信号処理回路から出力され
たのち、次いで直接的に、もしくは必要により磁
気デイスクや磁気テープなどの記録保存手段を介
して記録装置に伝送される。

記録装置としては、たとえば、感光材料上をレ
ーザー光等で走査して光学的に記録するもの、
CRT等に表示された記号・数値をビデオ・プリ
ンター等で記録するもの、熱線を用いて感熱記録
材料上に記録するものなど種々の原理に基づいた
記録装置を用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、泳動パターンのオートラジオグラフ
の例を示す部分図である。第２図の１は、一つの
レーンについてのオートラジオグラフ（濃淡画
像）の例を示す部分図であり、２は、直線２につ
いてｘ方向の位置と信号レベルとからなる一次元
波形を示す。第３図１〜５は、第２図２の一次元
波形の部分拡大図である。第４図は、検出された
バンドの領域および次の追尾開始点の例を示す図
である。第５図および第６図はそれぞれ、検出さ
れたバンドの領域および次の追尾開始点の別の例
を示す図である。第７図は、レーン追尾が終了し
た泳動パターンの例を示す部分図である。 １：バンド、２：直線（追尾線）、３，５，
７：バンドの領域、４，６，８：次の追尾開始
点、白点：追尾開始点、黒点：バンド検知点。

【特許請求の範囲】

１ 中心軸を鉛直線分から対称に傾斜させて上方
をねらうように設けられ、飛行物体から発せられ
る飛行音を集音して集音信号を出力する指向性を
有する２個の集音手段と、 前記両集音手段の集音信号を加、減算して和信
号および差信号を形成する第１の演算手段と、 前記和信号と差信号とのレベル差の信号を導出
する第２の演算手段と、 前記和信号、前記差信号および前記レベル差の
信号が異なるしきいレベルそれぞれを上回る時間
と、前記和信号、前記差信号がそれぞれのしきい
レベルを上回つてから前記レベル差の信号がしき
いレベルを上回るまでの時間差とが所定の条件を
満足するときにのみ前記飛行物体の探知エリア内
への侵入の探知および侵入した前記飛行物体の識
別を行なう処理手段と を備えたことを特徴とする飛行物体探知装置。

Claims (1)

1. (b) バンドＡのｘ方向の領域と残りの分離展開
   列のバンドＢの領域が重ならない場合には、
   xaを次の追尾開始点のｘ座標とし、yaとバ
   ンドＡを有する列の追尾開始点のｙ座標との
   差をバンドＢを有する列の追尾開始点のｙ座
   標に加えた値を次の追尾開始点のｙ座標とす
   る工程、および (4) 上記第一乃至第三工程を順次繰り返すことに
   より、各分離展開列について列を追尾する工
   程、 を含むことを特徴とする核酸の塩基配列決定のた
   めの信号処理方法。 ２ 上記、第一工程が、 (i) 分離展開列ごとに列の追尾開始点より分離展
   開方向ｘに沿つた直線上で、追尾開始点の信号
   レベルlsおよび信号レベルの閾値ln（ただし、
   ｎは０または正の整数である）に基づいて追尾
   開始点に最も近い一つのバンドを求める工程、 および (ii) 閾値lnに基づいて該バンドの領域を求めたの
   ち、この領域の大きさに基づいて (a) 該バンドは真のバンドであると決定してバ
   ンドを検出する工程、または (b) 該バンドは真のバンドではないと決定して
   上記(i)工程からやり直す工程、 からなることを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載の核酸の塩基配列決定のための信号処理方
   法。 ３ 上記(i)工程において、追尾開始点の信号レベ
   ルlsおよび信号レベルの閾値lnに関して (a) ls≦lnであるとき、信号レベルが次に閾値ln
   以上となる点をバンド検知点とする、 または (b) ls＞lnであるとき、信号レベルが次に閾値ln
   を下回つた後閾値ln以上となる点、もしくは信
   号レベルが次に閾値lnを下回ることなく開始レ
   ベルls以上となる点をバンド検知点とする、 ことを特徴とする特許請求の範囲第２項記載の核
   酸の塩基配列決定のための信号処理方法。 ４ 上記第(ii)工程において、信号レベルが閾値ln
   以上であるバンド検知点を含む連続した領域を求
   めたのち、この領域のｘ方向の最大距離xnおよ
   びｙ方向の最大距離ynに関して、 (a) xmin≦xn≦xmaxであり、かつymin≦yn≦
   ymaxであるとき、距離xnおよびynで区切られ
   た領域を真のバンドと決定することによりバン
   ドを検出する、 (b₁) xn＜xminもしくはyn＜yminであるとき、
   距離xnおよびynで区切られた領域を真のバン
   ドではないと決定したのちバンド検出点よりｘ
   方向に沿つて第(i)工程からやり直す、 または (b₂) xn＜xmaxもしくはyn＜ymaxであるとき、
   距離xnおよびynで区切られた領域を真のバン
   ドではないと決定したのち閾値をln＋Δl＝ln₊₁
   に変更して追尾開始点よりｘ方向に沿つて第(i)
   工程からやり直す、 （ただし、xmin、xmax、yminおよびymaxはそ
   れぞれ定数であつて、バンドとして認められるｘ
   方向の最小幅、ｘ方向の最大幅、ｙ方向の最小幅
   およびｙ方向の最大幅であり；Δlは閾値lnの一定
   増分である） ことを特徴とする特許請求の範囲第２項記載の核
   酸の塩基配列決定のための信号処理方法。 ５ 上記第(ii)（b₂）工程において、 (b₂₁) ln₊₁≦lmaxであるとき、閾値をln₊₁として
   追尾開始点よりｘ方向に沿つて第(i)工程からや
   り直す、または (b₂₂) ln₊₁≦lmaxであるとき、距離xnおよびyn
   で区切られた領域を真のバンドではないと決定
   したのちバンド検出点よりｘ方向に沿つて第(i)
   工程からやり直す、 （ただし、lmaxは定数であつて閾値lnがとり
   うる最大値である） ことを特徴とする特許請求の範囲第４項記載の核
   酸の塩基配列決定のための信号処理方法。 ６ 上記第四工程で得られた分離展開列の追尾情
   報に基づいて、各分離展開列についてｘ方向の位
   置と信号のレベルとからなる一次元波形を得るこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の核酸
   の塩基配列決定のための信号処理方法。 ７ 上記塩基特異的DNA断片物の混合物が、 (1) グアニン特異的DNA断片物、 (2) アデニン特異的DNA断片物、 (3) チミン特異的DNA断片物、 (4) シトシン特異的DNA断片物、 の四種類からなり、分離展開列が、これら四種類
   の塩基特異的DNA断片物がそれぞれ支持媒体上
   に分離展開されて形成された四列の分離展開列か
   らなることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載の核酸の塩基配列決定のための信号処理方法。 ８ 上記オートラジオグラフに対応するデジタル
   信号が、支持媒体と輝尽性蛍光体を含有する蓄積
   性蛍光体シートとを重ね合わせて、支持媒体上の
   放射性標識物質のオートラジオグラフを該蛍光体
   シートに蓄積記録したのち、該蛍光体シートに励
   起光を照射して該オートラジオグラフを輝尽光と
   して光電的に読み出すことにより得られたもので
   あることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の核酸の塩基配列決定のための信号処理方法。 ９ 上記オートラジオグラフに対応するデジタル
   信号が、支持媒体と写真感光材料とを重ね合わせ
   て、支持媒体上の放射性標識物質のオートラジオ
   グラフを該感光材料に感光記録したのち、該感光
   材料上に可視化されたオートラジオグラフを光電
   的に読み取ることにより得られたものであること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の核酸の
   塩基配列決定のための信号処理方法。