JPH0529070B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、核酸の塩基配列決定のための信号処
理方法に関するものである。

［発明の背景］ 近年、急速に発達して来た分子生物学の分野に
おいては、生物体の機能や複数のメカニズムを解
明するために、生物体のもつ遺伝情報を明らかに
することが必須のこととなつている。とりわけ、
特定の遺伝情報を担うDNA（もしくはDNA断片
物、以下同様）などの核酸の塩基配列を決定する
ことが必要不可欠なこととなつている。

DNA、RNAなどの核酸の塩基配列を決定する
ための代表的な方法として、オートラジオグラフ
イーを利要するマキサム・ギルバート（Maxam
−Gilbert）法およびサンガー・クールソン
（Sanger−Coulson）法が知られている。前者の
マキサム・ギルバート法は、まず、塩基配列を決
定しようとしているDNAあるいはDNA断片物の
鎖状分子の一方の端部に³²P等の放射性同位元素
を含む基を結合させることにより、その対象物を
放射性標識物質としたのち、化学的な手段を利用
して鎖状分子の各構成単位間の結合を塩基特異的
に切断する。次に、この操作により得られた塩基
特異的DNA切断分解物の混合物をゲル電気泳動
法により分離展開し、多数の切断分解物がそれぞ
れ分離展開されて形成された分離展開パターン
（ただし、視覚的には見ることができない）を得
る。この分離展開パターンをたとえばＸ線フイル
ム上に可視化してそのオートラジオグラフを得、
得られたオートラジオグラフと各々の塩基特異的
切断手段とから、放射性同位元素が結合された鎖
状分子の端部から一定の位置関係にある塩基を順
次決定し、これにより対象物全ての塩基配列を決
定することができる。

また、後者のサンガー・クールソン法は、
DNAあるいはDNA断片物の鎖状分子と相補的で
あつて、かつ放射性標識が付与されたDNA合成
物を化学的な手段を利用して塩基特異的に合成
し、この塩基特異的DNA合成物の混合物を用い
て上記と同様にしてそのオートラジオグラフから
塩基配列を決定する方法である。

本出願人は、上記核酸の塩基配列決定を簡易か
つ高精度で行なうことを目的として、それに利用
されるオートラジオグラフ測定操作において、上
記Ｘ線フイルム等の写真感光材料を用いる従来の
放射線写真法の代りに、蓄積性蛍光体シートを用
いる放射線像変換方法を利用する方法について既
に特許出願している（特開昭59−83057号、特願
昭58−201231号）。ここで、蓄積性蛍光体シート
は輝尽性蛍光体からなるものであり、放射線エネ
ルギーを該蛍光体シートの輝尽性蛍光体に救急さ
せたのち、可視乃至赤外領域の電磁波（励起光）
で励起することにより、放射線エネルギーを蛍光
として放出させることができるものである。この
方法によれば、露光時間を大幅に短縮化すること
ができ、また従来より問題となつていた化学カブ
リ等が発生することがない。さらに、放射性標識
物質のオートラジオグラフは、一旦放射線エネル
ギーとして蛍光体シートに蓄積されたのち輝尽光
として光電的に読み出されるから、直接にデジタ
ル信号として得たのち適当な記録媒体に保存する
ことができる。

従来より、核酸の塩基配列は、可視化されたオ
ートラジオグラフについて、放射性標識が付与さ
れた核酸の塩基特異的切断分解物もしくは塩基特
異的合成物（以下、単に核酸の塩基特異的断片物
と称する）の分離展開位置（バンド）を視覚的に
判断し、それらバンドの位置を相互に比較するこ
とにより決定されている。よつて、オートラジオ
グラフの解析は通常人間の視覚を通して行なわれ
ており、そのために多大な時間と労力が費されて
いる。

また、人間の目に依存しているため、オートラ
ジオグラフを解析して得られる核酸の塩基配列が
解析者によつて異なるなど塩基配列情報の精度に
は限界がある。

そこで、本出願人は、上記オートラジオグラフ
をデジタル信号として得た後このデジタル信号に
適当な信号処理を施すことにより、DNAの塩基
配列を自動的に決定する方法についても既に特許
出願している（特開昭59−126527号、特願昭59−
89615号、特願昭60−226091号、特願昭60−
226092号等）。オートラジオグラフに対応するデ
ジタル信号は、従来の放射線フイルムを利用する
場合には一旦オートラジオグラフを該フイルム上
に可視画像化したのち、反射光また透過光を利用
して光電的に読み取ることにより得られる。ま
た、蓄積性蛍光体シートを用いる場合には、オー
トラジオグラフが蓄積記録された蛍光体シートを
直接に読み出すことにより得られる。

しかしながら、実際に放射性標識物質を電気泳
動法などにより支持媒体上に分離展開させて得ら
れた分離展開パターンには種々の歪みおよびノイ
ズが生じがちである。

たとえば、試料の作成時において核酸の塩基特
異的断片物の調製、分離が不十分であつたり、あ
るいは試料を支持媒体の各スロツトに注入する際
に他のスロツトの試料が混入したりすることによ
り、本来現われるべきではない位置にバンド（こ
れをゴーストバンドまたはエクストラバンドと呼
ぶ）が現われることがある。あるいはまた試料に
放射性不純物が混入したり、露光過程で自然放射
線等の照射を受けたりすることによりノイズが発
生することがある。この結果、これらのエクスト
ラバンドおよびノイズも含めてバンドの比較同定
が行なわれるために、塩基配列決定に誤差が生じ
て得られる情報の精度が低下してしまう。

このようなノイズが発生した場合であつても、
そのオートラジオグラフに対応するデジタル信号
を効率良く信号処理して核酸の塩基配列を高精度
で自動決定することが望まれる。

［発明の要旨］ 本発明者は、オートラジオグラフイーを利用し
て核酸の塩基配列を自動決定する方法において、
ノイズの生じている分離展開パターンであつても
そのオートラジオグラフに対応するデジタル信号
を好適に信号処理することにより、核酸の塩基配
列を簡易かつ高精度で自動決定することを実現し
た。

すなわち、本発明は、放射性標識が付与された
塩基特異的DNA断片物もしくは塩基特異的RNA
断片物の混合物が支持媒体上に一次元的方向に分
離展開されて形成された複数の分離展開列のオー
トラジオグラフに対応するデジタル信号について
信号処理を行なうことにより、核酸の塩基配列を
決定する方法において、 (1) 各分離展開列について分離展開方向に沿つた
位置と信号のレベルとからなる一次元波形を得
る工程、 (2) 一次元波形上で、探索基準点から一定区間内
において一定値以上の信号レベルを有する領域
の平均レベル値を算出する工程、 (3) 平均レベル値に基づいて閾値を決定する工
程、 (4) 該区間内で閾値以上の信号レベルを有するピ
ークが存在するか否かを探索する工程、 (5a) 第四工程においてピークが存在する場合に
は、該ピークの位置にバンドが存在すると決定
し、そして該ピークの位置を次の探索基準点と
する工程、 (5b) 第四工程においてピークが存在しない場合
には、該探索基準点を一定距離進めた位置を次
の探索基準点とする工程、および (6) 上記第二乃至第五工程を順次繰り返すことに
より、分離展開列上の全てのバンドの位置を決
定する工程、 を含むことを特徴とする核酸の塩基配列決定のた
めの信号処理方法を提供するものである。

本発明によれば、核酸の塩基特異的断片物の混
合物を支持媒体上で分離展開させて得られた分離
展開パターンのオートラジオグラフに対応するデ
ジタル信号において、分離展開パターンにノイズ
が生じている場合でも、ノイズを排除して真正バ
ンドのみを検出しうる信号処理機能を有する信号
処理回路を通すことにより、核酸の塩基配列を簡
易かつ高精度で得ることができる。

一般に、試料の混入あるいは自然放射線等が原
因となつてオートラジオグラフ上に現われたエク
ストラバンドおよびノイズの画像濃度（デジタル
信号のレベル）は真正バンドのそれより低い。し
かしながら、サンガー・クールソン法などにおい
ては試料である塩基特異的断片物が分子量が大き
くなるのに比例して放射性同位元素を多く含み、
放射能強度が大となるために、オートラジオグラ
フには分離展開距離が大きくなるにつれて画像濃
度が低くなるといつた濃度勾配（信号レベルの変
化）が生じる。従つて、真正バンドが存在するか
否かあるいはバンドが真正バンドであるか否かを
決定する際に、一定の閾値を設定して分離展開パ
ターン上に現われた信号レベルのピークがこの閾
値より高いか否かで一様に取捨選択しただけで
は、エクストラバンドを真正バンドとして検出し
たり、逆に真正バンドを誤つて排除してしまいが
ちであり、正確な塩基配列情報を得ることができ
ない。

本発明によれば、信号レベルが分離展開位置に
よつて局所的に異なつている場合であつても、一
定区間ごとに信号レベルの平均値を算出し、これ
に基づいて閾値を真正バンドとノイズとを分離し
うる好適な値に設定することにより、区間ごとに
変動する閾値に基づいて真正バンドのみを過不足
なく検出することができる。そして、検出された
バンドの位置に基づいて分離展開列間でバンドの
位置を比較することにより、核酸の塩基配列を簡
便かつ高精度に決定することができる。

［発明の構成］ 本発明において用いられる試料の例としては、
放射性標識が付与されたDNA、RNA等の核酸の
塩基特異的断片物の混合物を挙げることができ
る。ここで、核酸の断片物とは長鎖状の分子の一
部分を意味する。たとえば、塩基特異的DNA断
片物混合物の一種である塩基特異的DNA切断分
解物混合物は、前述のマキサム・ギルバート法に
従つて、放射性標識が付与されたDNAを塩基特
異的に切断分解することにより得られる。

また、塩基特異的DNA合成物混合物は前述の
サンガー・クールソン法に従つて、DNAをテン
プレート（鋳型）として、放射性標識が付与され
たデオキシヌクレオシドトリフオスフエートと
DNA合成酵素とを用いて合成することにより得
られる。

さらに、塩基特異的RNA断片物の混合物も上
記と同様の方法により、切断分解物混合物として
または合成物混合物として得ることができる。な
お、DNAはその構成単位としてアデニン、グア
ニン、チミン、シトシンの四種類の塩基からなる
が、一方RNAはアデニン、グアニン、ウラシル、
シトシンの四種類の塩基からなる。

放射性標識は、これらの物質に適当な方法で
³²P、¹⁴C、³⁵S、³H、₁ ²⁵Iなどの放射性同位元素を保
持させることによつて付与される。

試料である放射性標識が付与された核酸の塩基
特異的断片物の混合物はゲル状支持媒体など公知
の各種の支持媒体を用いて、電気泳動法、薄層ク
ロマトグラフイー、カラムクロマトグラフイー、
ペーパークロマトグラフイーなど種々の分離展開
方法により支持媒体上に分離展開される。

次に、放射性標識物質が分離展開された支持媒
体について、従来の写真感光材料を用いる放射線
写真法により、あるいは蓄積性蛍光体シートを用
いる放射線像変換方法によりそのオートラジオグ
ラフが得られ、次いで適当な読取り（読出し）系
を介して放射性標識物質のオートラジオグラフに
対応するデジタル信号が得られる。

前者の放射線写真法を利用する場合には、まず
支持媒体とＸ線フイルム等の写真感光材料とを低
温もしくは常温で長時間（数時間〜数十時間）重
ね合わせて放射線フイルムを感光させたのち、現
像して放射性標識物質のオートラジオグラフを放
射線フイルム上に可視画像化する。次いで、画像
読取装置を用いて放射線フイルム上に可視化され
たオートラジオグラフを読み取る。たとえば、放
射線フイルムに光ビームを照射してその透過光ま
たは反射光を光電的に検出することにより、オー
トラジオグラフは電気信号として得られる。さら
に、この電気信号をＡ／Ｄ変換することにより、
オートラジオグラフに対応するデジタル信号を得
ることができる。

後者の放射線像変換方向を利用する場合には、
まず、支持媒体と蓄積性蛍光体シートとを常温で
短時間（数秒〜数十分間）重ね合わせて蛍光体シ
ートに放射性標識物質から放出される放射線エネ
ルギーを蓄積させることにより、そのオートラジ
オグラフを蛍光体シートに一種の潜像として記録
する。ここで、蓄積性蛍光体シートは、たとえば
プラスチツクフイルムからなる支持体、二価ユー
ロピウム賦活弗化臭化バリウム（BaFBr：Eu²⁺）
等の輝尽性蛍光体からなる蛍光体層、および透明
な保護膜がこの順に積層されたものである。蓄積
性蛍光体シートに含有されている輝尽性蛍光体
は、Ｘ線等の放射線が照射されるとその放射線エ
ネルギーを吸収して蓄積し、そののち可視乃至赤
外領域の光で励起すると蓄積していた放射線エネ
ルギーを輝尽光として放出するという特性を有す
る。

次いで、読出装置を用いて蓄積性蛍光体シート
に蓄積記録されたオートラジオグラフを読み出
す。具体的には、たとえば蛍光体シートをレーザ
ー光で走査して放射線エネルギーを輝尽光として
放出させ、この輝尽光を光電的に検出することに
より、放射性標識物質のオートラジオグラフは可
視画像化することなく直接に電気信号として得ら
れる。さらに、この電気信号をＡ／Ｄ変換するこ
とにより、オートラジオグラフに対応するデジタ
ル信号を得ることができる。

上述のオートラジオグラフ測定操作およびオー
トラジオグラフに対応するデジタル信号を得る方
法の詳細については、前記特開昭59−83057号、
特開昭59−126527号、特開昭59−126278号等の各
公報に記載されている。

なお、上記においては、支持媒体上に分離展開
された放射性標識物質のオートラジオグラフに対
応するデジタル信号を得る方法として、従来の放
射線写真法および放射線像変換方法を利用する方
法について述べたが、これらの方法に限定される
ものではなく、それ以外の如何なる方法により得
られたデジタル信号であつても放射性標識物質の
オートラジオグラフと対応関係がある限り、本発
明の信号処理方法を適用することが可能である。

また、上記いずれの方法においてもオートラジ
オグラフの読取り（または読出し）は、放射線フ
イルム（または蓄積性蛍光体シート）の全面に亘
つて行なう必要はなく、画像領域のみについて行
なうことも勿論可能である。

さらに、予め各分離展開列の位置およびバンド
の幅等についての情報を入力して読取り（読出
し）条件を設定しておき、読取り（読出し）操作
においては各バンド上を一本以上の走査線が通過
するような走査線密度で光ビームによる走査を行
なうことにより、読取り（読出し）時間を短縮化
して必要な情報を効率良く得ることができる。な
お、本発明においてオートラジオグラフに対応す
るデジタル信号とは、このようにして得られたデ
ジタル信号をも包含する。

得られたデジタル信号D_xyは、放射線フイルム
（または蛍光体シート）に固定された座標系で表
わされた座標（ｘ，ｙ）とその座標における信号
のレベル(z)とからなり、一つの信号は一つの画素
に対応している。信号のレベルはその座標におけ
る画像濃度、すなわち放射性標識物質の量を表わ
している。従つて、一連のデジタル信号（すなわ
ち、デジタル画像データ）は放射性標識物質の二
次元的な位置情報を有している。

このようにして得られた支持媒体上の放射性標
識物質のオートラジオグラフに対応するデジタル
信号には、以下に述べるような本発明の方法によ
り信号処理が施されて、目的の核酸の塩基配列の
決定が行なわれる。

本発明の信号処理方法の実施の態様を、次の四
種類の放射性標識が付与された塩基特異的DNA
断片物の組合せにより形成された泳動列（分離展
開列）からなる場合について説明する。

(1) グアニン(G)特異的DNA合成物 (2) アデニン(A)特異的DNA合成物 (3) チミン(T)特異的DNA合成物 (4) シトシン(C)特異的DNA合成物 ここで、各塩基特異的DNA合成物は、サンガ
ー・クールソン法により塩基特異的に合成され
た、すなわち末端の塩基を同じくする種々の長さ
のDNA合成物からなる。

第１図は、上記四種類の塩基特異的DNA合成
物がそれぞれ四つのスロツトに電気泳動されてな
る泳動パターンのオートラジオグラフを示す。オ
ートラジオグラフには泳動方向（矢印→の方向）
に沿つて濃度勾配が生じている。

このオートラジオグラフに対応するデジタル信
号は、信号処理回路において一旦メモリ（バツフ
アーメモリ、または磁気デイスク等の不揮発性メ
モリ）に記憶される。

まず、各泳動列（レーン）について泳動方向に
沿つた位置と信号のレベルとからなる一次元波形
を作成する。

第２図は、第一レーンについて第１図に示され
た矢印方向にデジタル信号を抽出して作成された
一次元波形を示す。換言すれば、第２図は第一レ
ーンの濃度断面図に相当する。

第３図は、第２図を部分的に拡大した図であ
る。第３図において、左側部分は泳動開始位置に
近い部分の一次元波形であり、ピークＡ（信号レ
ベルの極大）は両側のピークに比べて低く、明ら
かにエクストラバンドもしくはノイズである。ま
た、右側部分は泳動開始位置から離れた（泳動距
離が大きな）部分の一次元波形であり、ピークＢ
は右側の他のピークとの比較から真正バンドであ
る。しかし、ピークＡとピークＢとではピークＡ
の方が信号レベルが高く、従つて、各ピークの信
号レベル（絶対値）のみから単純に真正バンドで
あるか否かを決定することはできないことがわか
る。すなわち、着目するピークの周囲の信号レベ
ルを考慮して相対的な比較を行なう必要がある。

第４図は、第２図の一次元波形を部分的に拡大
した図であり、本発明の特徴的な要件である閾値
の決定およびそれに基づくバンドの決定操作を説
明する図である。

次に、バンド決定のための以降の操作を第４図
を参照しながら説明する。

まず、一次元波形上で、バンドの探索基準点x_i
から一定区間Ｌ内における信号レベルＺの平均レ
ベル値Z_iを算出する。

なお、第４図において、既に決定された真正バ
ンドのピークＣの位置が探索基準点x_iとなつてい
る。

始めの探索基準点は通常は、バンド間の間隔が
開いている泳動の最下端（泳動距離が最大である
位置、第２図の右端）を選ぶのが好ましく、そし
て探索を泳動の下端から上端に向かつて順に進め
るのが好ましい。一定区間Ｌは泳動距離（支持媒
体の実用上の長さ）などに基づいて予め設定して
おいてもよいし、あるいは探索位置によつて変化
するように適当な泳動距離（または泳動方向に沿
つた位置）の関数で表わしてもよく、この場合に
は探索位置に関係なく一区間内で検出されるピー
クの数をほぼ一定とすることができる。また、区
間Ｌは第４図に示すように基準点x_iを起点として
探索方向（矢印←）にとつてもよいが、または基
準点を中心点として両側に1/2Ｌずつとつてもよ
い。

平均レベル値Z_iは、信号レベルが一定値Z_a以上
である領域、すなわち区間L₁，L₂およびL₃につ
いての信号レベルの平均値を求めることにより得
られる。具体的には、Z_a以上のレベルを有する信
号についてその平均値を求める。これにより、比
較的小さなエクストラバンドおよび泳動パターン
全体に現われるノイズ（バツクグラウンドノイ
ズ）などを除去することができる。

この平均レベル値Z_iに基づいて閾値T_iを決定す
る。閾値T_iはたとえば、予め設定された平均値を
変数とする関数にZ_iを代入することにより得られ
る［T_i＝ｆ（Z_i）］。具体的には、 T_i＝α・Z_i （ただし、係数αは０以外の正の数である） と設定することができる。これにより、エクスト
ラバンドと真正バンドとを分離しうる好適な値に
閾値T_iを設定することができる。たとえば係数α
を１より大きい定数とすることにより、エクスト
ラバンドのピークが比較的大きい場合あるいはエ
クストラバンドが多数存在する場合であつても好
適に排除することができる。関数ｆ（Z_i）あるい
は係数αは更に探索位置によつて異なるように適
当な泳動距離の関数で表わしてもよい。

次いで、上記探索基準点x_iを起点とする区間Ｌ
内でピークの信号レベルが閾値T_i以上であるピー
クを探す。ピークは、一次元波形上で信号レベル
が極大となる点である。このとき、区間Ｌ全体に
ついてではなく、一定値Z_a以上の区間L₁〜L₃に
ついてのみピークを探すことにより探索時間を短
縮することができる。

そして、信号レベルが閾値T_i以上であるピーク
を真正バンドと決定し、T_iより小さいピークはエ
クストラバンドもしくはノイズと判断して無視す
る。これにより、第４図において区間L₁〜L₃内
の二つのピークＤおよびＥは、信号レベルが閾値
T_iを越えるピークＥのみが真正バンドと決定さ
れ、エクストラバンドであるピークＤは排除され
る。

このようにして区間Ｌ内でバンドの決定が終了
したときは、該区間内の閾値T_i以上であるピーク
Ｅ（真正バンド）の位置を次の探索基準点x_i+1と
定めて、この探索基準点x_i+1から一定区間Ｌにつ
いて上記の操作を繰り返す。閾値T_i以上であるピ
ークが二つ以上存在する場合には、探索方向上で
探索基準点に最も近いピークを選ぶことにより、
区間を少しずつずらしながら周囲の信号レベルの
僅かな変化を考慮して、より高精度に真正バンド
を決定することができる。また、探索方向上で探
索基準点に最も遠いピークを選ぶことにより、区
間の重なりが少ないから上記のバンド探索操作の
回数が少なくて済み、処理時間を短縮することが
できる。

区間Ｌ内に閾値T_i以上のピーク（真正バンド）
が全く存在しない場合には、探索基準点x_iを探索
方向に一定距離dLだけ進ませた位置を次の探索
基準点x_i+1として、上記の操作を繰り返す。この
距離dLは、たとえば一画素に相当する距離など
一定の値を予め設定しておいてもよいし、あるい
は泳動距離の関数として表わして探索基準点に基
づいて定めてもよい。

以上の操作を泳動開始点（第２図の左端）まで
順次繰り返し行なつて、第一レーン上の全ての真
正バンドを検出する。さらに、残りの三つのレー
ンについても同様の操作を行なうことにより、泳
動パターン上の全ての真正バンドを検出すること
ができる。

なお、泳動パターンにエクストラバンド等のノ
イズの発生がほかに、スマイリング現象、オフセ
ツト歪みあるいはバンドの融合などの種々の歪
み、ノイズが発生している場合には、上記バンド
の決定を行なう前にまたはその途中でこれらの補
正のための信号処理を行なつてもよい。

ここで、スマイリング現象は、支持媒体の中央
部のスロツトの泳動距離に比べて両端部のスロツ
トの泳動距離が短くなる現象であり、泳動過程に
おける放熱効果（いわゆるエツジ効果）などが原
因となつて生じる。オフセツト歪みとは、レーン
間相互の全体的な位置ズレをいい、スロツトの形
状の相違等により試料の電気泳動の開始位置、開
始時間が各スロツトで異なることなどが原因とな
つて生じる。また、バンドの融合は、泳動が十分
でないために、三乃至三個のバンドが連結して一
個の幅広なバンドを形成していることをいう。一
般にパターン上部の泳動開始位置に近い領域で発
生しやすい。

信号処理によるこれらの補正の詳細について
は、本出願人による特願昭60−74899号、特願昭
60−74900号、特願昭60−85275号、特願昭60−
85276号、特願昭60−111186号、特願昭60−
111185号の各明細書に記載されている。

レーン間で決定された真正バンドの位置を相互
に比較することにより、直ちにバンドに序列を付
けることができる。このとき、上記四種類の塩基
特異的DNA合成物の組合せが排他的な組合せで
あることから、同じ位置に二つ以上のバンド（異
なるレーンのバンド）は存在しえないことを利用
して、容易に序列を決定することができる。上記
(1)〜(4)のスロツトはそれぞれ(G)、(A)、(T)、(C)から
なる末端塩基についての情報を有するから、各バ
ンドの属するスロツトに対応する塩基で置換する
ことにより、DNAの塩基配列（例えばＡ−Ｇ−
Ｃ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｇ−…）を得ることができる。

このようにして、DNAの片方の鎖状分子につ
いての塩基配列を決定することができる。なお、
DNAの塩基配列についての情報は、上記の表示
形態に限られるものではなく、たとえば所望によ
り同時に各バンドの強度（z′）を放射性標識物質
の相対量として表示することも可能である。さら
に、DNAの二本の鎖状分子両方についての塩基
配列を表示することもできる。

あるいはまた、DNAの塩基配列情報は、上記
の信号処理がなされたデジタル信号に基づいて画
像として表示することもできる。すなわち、各バ
ンドの補正後の位置をオリジナルのオートラジオ
グラフとともに可視画像化して表示することがで
きる。この場合には、最終的な塩基配列決定を解
析者自身がこの表示画像に基づいて行なうことが
可能である。

なお、上記においては、試料である塩基特異的
DNA合成物の混合物として（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）
の排他的組合せを利用した場合について説明した
が、本発明の信号処理方法はこの組合せに限定さ
れるものではなく、例えば（Ｇ、Ｇ＋Ａ、Ｔ＋
Ｃ、Ｃ）などの種々の組合せに適用することがで
きる。また、サンガー・クールソン法によつて得
られた塩基特異的DNA合成物に限定されるもの
ではなく、本発明の方法は任意の方法によつて調
製された塩基特異的DNA断片物に適用すること
ができる。

また同様に、塩基特異的RNA断片物の混合物
（例えば、Ｇ、Ａ、Ｕ、Ｃの組合せ）についても
本発明の方法を適用することができる。さらに、
バンドの決定は、一組の核酸の塩基特異的断片物
の分離展開列に限定されるものではなく、支持媒
体上に同時に分離展開された全ての分離展開列に
ついて行なうことが可能である。

このようにして得られた塩基配列情報について
はこのほかにも、たとえば、既に記録保存されて
いる他の核酸の塩基配列と照合するなどの遺伝言
語学的情報処理を行なうことも可能である。

上述の信号処理により決定された核酸の塩基配
列についての情報は、信号処理回路から出力され
たのち、次いで直接的に、もしくは必要により磁
気デイスクや磁気テープなどの記憶保存手段を介
して記録装置に伝送される。

記録装置としては、たとえば、感光材料上をレ
ーザー光等で走査して光学的に記録するもの、
CRT等に表示された記号・数値をビデオ・プリ
ンター等に記録するもの、熱線を用いて感熱記録
材料上に記録するものなど種々の原理に基づいた
記録装置を用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、濃度勾配が生じている泳動パターン
のオートラジオグラフの例を示す図である。第２
図は、第一レーンについて第１図の矢印に沿つた
一次元波形を示す図である。第３図は、第２図の
一次元波形の部分拡大図である。第４図は、第２
図の一次元波形の部分拡大図であつて、本発明の
処理方法を説明する図である。 x_i：探索基準点、Ｌ：一定区間、Z_a：一定値、
T_i：閾値、ピークＣ，Ｅ：真正バンド、ピーク
Ｄ：エクストラバンド。

【特許請求の範囲】

１ 放射性標識が付与された塩基特異的DNA断
片物もしくは塩基特異的RNA断片物の混合物が
支持媒体上に一次元的方向に分離展開されて形成
された複数の分離展開剤のオートラジオグラフに
対応するデジタル信号について信号処理を行なう
ことにより、核酸の塩基配列を決定する方法にお
いて、 (1) 各分離展開列について分離展開方向に沿つた
位置と信号のレベルとからなる一次元波形を得
る工程、 (2) 一次元波形を少なくとも二つの区間に分割す
る工程、および (3) 区間ごとに異なる特性を有する平滑化手段に
よつて信号のレベルを平滑化する工程、 を含むことを特徴とする核酸の塩基配列決定のた
めの信号処理方法。 ２ 上記第三工程において、平滑化手段が移動平
均フイルタであることを特徴とする特許請求の範
囲第１項記載の核酸の塩基配列決定のための信号
処理方法。 ３ 上記第三工程において、区間ごとに移動平均
フイルタのマスクサイズを変えることを特徴とす
る特許請求の範囲第２項記載の核酸の塩基配列決
定のための信号処理方法。

Claims (1)

1. (6) 上記第二乃至第五工程を順次繰り返すことに
   より、分離展開列上の全てのバンドの位置を決
   定する工程、 を含むことを特徴とする核酸の塩基配列決定のた
   めの信号処理方法。 ２ 上記第二工程における始めの探索基準点を分
   離展開距離の最も大きな位置とし、分離展開方向
   とは逆の方向に上記第六工程を行なうことを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の核酸の塩基配
   列決定のための信号処理方法。 ３ 上記第五ａ工程において、探索基準点に最も
   近いピークの位置を次の探索基準点とすることを
   特徴とする特許請求の範囲第１項記載の核酸の塩
   基配列決定のための信号処理方法。 ４ 上記第二工程における一定区間および一定
   値、第三工程における閾値、および第五ｂ工程に
   おける一定距離を、それぞれ一次元波形上の位置
   に基づいて設定することを特徴とする特許請求の
   範囲第１項記載の核酸の塩基配列決定のための信
   号処理方法。 ５ 上記塩基特異的DNA断片物の混合物が、 (1) グアニン特異的DNA断片物、 (2) アデニン特異的DNA断片物、 (3) チミン特異的DNA断片物、 (4) シトシン特異的DNA断片物、 の四種類からなり、分離展開列が、これら四種類
   の塩基特異的DNA断片物がそれぞれ支持媒体上
   に分離展開されて形成された四列の分離展開列か
   らなることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載の核酸の塩基配列決定のための信号処理方法。 ６ 上記オートラジオグラフに対応するデジタル
   信号が、支持媒体と輝尽性蛍光体を含有する蓄積
   性蛍光体シートとを重ね合わせて、支持媒体上の
   放射性標識物質のオートラジオグラフを該蛍光体
   シートに蓄積記録したのち、該蛍光体シートに励
   起光を照射して該オートラジオグラフを輝尽光と
   して光電的に読み出すことにより得られたもので
   あることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の核酸の塩基配列決定のための信号処理方法。 ７ 上記オートラジオグラフに対応するデジタル
   信号が、支持媒体と写真感光材料とを重ね合わせ
   て、支持媒体上の放射性標識物質のオートラジオ
   グラフを該感光材料に感光記録したのち、該感光
   材料上に可視化されたオートラジオグラフを光電
   的に読み取ることにより得られたものであること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の核酸の
   塩基配列決定のための信号処理方法。