JPH0462342B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、核酸の塩基配列決定のための信号処
理方法に関するものである。

［発明の背景］ 近年、急速に発達して来た分子生物学の分野に
おいては、生物体の機能や複製のメカニズムを解
明するために生物体のもつ遺伝情報を明らかにす
ることが必須のこととなつている。とりわけ、特
定の遺伝情報を担うDNA（もしくはDNA断片物、
以下同様）などの核酸の塩基配列を決定すること
が必要不可欠なこととなつている。

DNA、RNAなどの核酸の塩基配列を決定する
ための代表的な方法として、オートラジオグラフ
イーを利用するマキサム・ギルバート（Maxam
−Gilbert）法およびサンガー・クールソン
（Sanger−Coulson）法が知られている。前者の
マキサム・ギルバート法は、まず塩基配列を決定
しようとしているDNAあるいはDNA断片物の鎖
状分子の一方の端部に³²P等の放射性同位元素を
含む基を結合させることにより、その対象物を放
射性標識物質としたのち、化学的な手段を利用し
て鎖状分子の各構成単位間の結合を塩基特異的に
切断する。次に、この操作により得られた塩基特
異的DNA切断分解物の混合物をゲル電気泳動法
により分離展開し、多数の切断分解物がそれぞれ
分離展開されて形成された分離展開パターン（た
だし、視覚的には見ることができない）を得る。
この分離展開パターンをたとえばＸ線フイルム上
に可視化してそのオートラジオグラフを得、得ら
れたオートラジオグラフと各々の塩基特異的切断
手段とから、放射性元素が結合された鎖状分子の
端部から一定の位置関係にある塩基を順次決定
し、これにより対象物全ての塩基配列を決定する
ことができる。

また、後者のサンガー・クールソン法は、
DNAあるいはDNA断片物の鎖状分子と相補的で
あつて、かつ放射性標識が付与されたDNA合成
物を化学的な手段を利用して塩基特異的に合成
し、この塩基特異的DNA合成物の混合物を用い
て上記と同様にしてそのオートラジオグラフから
塩基配列を決定する方法である。

本出願人は、上記核酸の塩基配列決定を簡易か
つ高精度で行なうことを目的として、それに利用
されるオートラジオグラフ測定操作において、上
記Ｘ線フイルム等の写真感光材料を用いる従来の
放射線写真法の代りに、蓄積性蛍光体シートを用
いる放射線像変換方法を利用する方法について既
に特許出願している（特開昭59−83057号、特願
昭58−201231号）。ここで、蓄積性蛍光体シート
は輝尽性螢光体からなるものであり、放射線エネ
ルギーを該螢光体シートに輝尽性螢光体に吸収さ
せたのち、可視乃至赤外領域の電磁波（励起光）
で励起することにより、放射線エネルギーを螢光
として放出させることができるものである。この
方法によれば、露光時間を大幅に短縮化すること
ができ、また従来より問題となつていた化学カブ
リ等が発生することがない。さらに、放射性標識
物質のオートラジオグラフは、一旦放射線エネル
ギーとして螢光体シートに蓄積されたのち輝尽光
として時系列的に読み出されるから、画像のほか
に記号、数値など任意の形で表示記録することが
可能である。

従来より、核酸の塩基配列決定をしようとする
者は、可視化されたオートラジオグラフについ
て、放射性標識が付与された核酸の塩基特異的切
断分解物もしくは塩基特異的合成物（以下、単に
核酸の塩基特異的断片物と称する）のそれぞれの
分離展開位置を視覚的に判断し、分離展開列間で
相互に比較することにより核酸の塩基配列を決定
している。よつて、得られたオートラジオグラフ
の解析は通常人間の視覚を通して行なわれてお
り、そのために多大な時間と労力が費されてい
る。

また、人間の目に依存しているため、オートラ
ジオグラフを解析して決定された核酸の塩基配列
が解析者によつて異なるなど得られる情報の精度
には限界がある。

そこで、本出願人は、上記オートラジオグラフ
をデジタル信号として得た後、このデジタル信号
に適当な信号処理を施すことにより、DNAの塩
基配列を自動的に決定する方についても既に特許
出願している（特開昭59−126527号、特開昭59−
126278号、特願昭59−89615号、特願昭59−
140908号等）。オートラジオグラフに対応するデ
ジタル信号は、従来の放射線フイルムを利用する
場合には一旦オートラジオグラフを該フイルム上
に可視画像化したのち、反射光または透過光を利
用して光電的に読み取ることにより得られる。ま
た、蓄積性蛍光体シートを用いる場合には、オー
トラジオグラフが蓄積記録された蛍光体シートを
直接に読み出すことにより得られる。

しかしながら、実際に放射性標識物質を電気泳
動法などにより支持媒体上に分離展開させて得ら
れた分離展開パターンには種々の歪みおよびノイ
ズが生じがちである。その代表的なものに、試料
の分離展開の開始位置または開始時点が各列で異
なることによる列間相互の全体的な位置ズレ（い
わゆるオフセツト歪み）がある。オフセツト歪み
はたとえば、ゲル媒体など支持媒体の上端に設け
られた多数のスロツト（試料の注入口）の形状
（凹のみ大きさ）が完全に同一ではなく個々に異
なりがちであることが原因となつて発生する。ま
た、試料を支持媒体に付着させる際に付着位置が
相互にずれたり、試料注入直前におけるゲル媒体
の尿素の洗い出しが不十分である場合には試料の
支持媒体への浸入速度が異なることも歪みの発生
の一因となつている。

スロツトの形状が不ぞろいであるために分離展
開パターンにオセツト歪みが発生した場合の具体
例を第１図に示す。第１図ａは、試料の分離展開
に使用された支持媒体の上端部を示しており、ｂ
は同一試料を(1)〜(4)の各スロツトに注入したのち
分離展開して得られたパターンを示す。第１図ａ
に示すように、第三スロツトが他のスロツトより
も凹みが大きい結果、ｂに示すように第三スロツ
トの分離展開列のみが全体的に下方にずれてお
り、他の列との間でズレ（Δy）を生じている。
このような列間の相対的な位置ズレをオフセツト
歪みという。

このような歪みが発生した場合にも、そのオー
トラジオグラフに対応するデジタル信号を効率良
く信号処理して核酸の塩基配列を高精度で自動決
定することが望まれている。

［発明の要旨］ 本発明者は、オートラジオグラフイーを利用し
て核酸の塩基配列を自動決定する方法において、
オフセツト歪みの生じている分離展開パターンで
あつてもそのオートラジオグラフに対応するデジ
タル信号を好適に信号処理することにより、核酸
の塩基配列を簡易かつ高精度で自動決定すること
を実現した。

すなわち、本発明は、放射性標識が付与された
塩基特異的DNA断片物もしくは塩基特異的RNA
断片物の混合物が支持媒体上に一次元的方向に分
離展開されて形成された複数の分離展開列のオー
トラジオグラフに対応するデジタル信号について
信号処理を行なうことにより、核酸の塩基配列を
決定する方法において、 (1) 各分離展開列について下部の少なくとも二つ
のバンドを検出し、下端から順にバンドに通し
番号を付する工程、 (2) 分離展開列ごとに、該バンドの番号とその分
離展開距離との相関関係を得る工程、 (3) 得られた相関関係から分離展開列間における
分離展開距離の差を得る工程、 (4) 各分離展開列について、より上部の少なくと
も一つのバンドを検出し、得られた分離展開距
離の差を列間の位置ズレとして該バンドの分離
展開位置を補正したのち、その位置に基づいて
該バンドに続き番号を付する工程、 (5) 既に検出されているバンドに上記第四工程で
新たに検出されたバンドを加え、これらのバン
ドについて分離展開列ごとにバンドの番号とそ
の分離展開距離との相関関係を新たに得る工
程、 および (6) 上記第三乃至第五工程を順次繰り返すことに
より、各分離展開列上の全てのバンドにその補
正位置に基づいて序列を付する工程、 を含むことを特徴とする核酸の塩基配列決定のた
めの信号処理方法を提供するものである。

本発明によれば、核酸の塩基特異的断片物の混
合物を支持媒体上で分離展開して得られた分離展
開パターンにオフセツト歪みが発生している場合
でも、そのオートラジオグラフに対応するデジタ
ル信号をオフセツト歪みの補正のための信号処理
機能を有する適当な信号処理回路を通すことによ
り、核酸の塩基配列を簡易かつ高精度を得ること
ができる。

分離展開パターンは一般に、下部（すなわち分
離展開距離が大きい領域）においては分離展開バ
ンドの間隔が疎であり、一方、上部の分離展開の
開始位置に近づくにつれてバンドの間隔が密にな
つている。ここで、下部とは一般に支持媒体の中
央付近より下側の領域を意味し、また上部とは中
央付近より上側の領域を意味する。そのため、分
離展開列相互においてオフセツト歪みが生じてバ
ンドの位置がずれている場合であつても、下部領
域においては各列のバンドの位置を相互に比較す
ることにより、その序列を比較的容易に決定する
ことが可能である。しかしながら、上部領域にお
いてはバンドの間隔が密であるために列間の位置
ズレはバンドの序列決定を困難にし、得られる核
酸の塩基配列に誤差が生じる原因となる。

本発明者は、バンドの間隔が分離展開パターン
の上部と下部とで異なり、下部領域においてはオ
フセツト歪みが生じている場合でもバンドの序列
を決定することが容易であることに注目して、オ
フセツト歪みの補正を適性かつ簡単に行なう方法
を見い出した。すなわち、下部領域においてはバ
ンドの序列が容易に決定さ、かつバンドの通し番
号とその分離展開距離との間で一定の相関関係が
得られることから、この関係に基づいてそれより
上部領域の列間の位置ズレを部分的に決定するこ
とができ、これによりオフセツト歪みを逐次補正
することができる。

特に、バンドの通し番号とその分離展開距離と
の相関関係は局部的には直線で表わすことができ
るから、相関関係を得るのに用いるバンドの数が
あまり多くない場合には直線で近似することがで
き、容易にこの相関関係を求めることができる。

従つて、本発明は、列間の位置ズレを逐次に補
正する方法であり、位置ズレが分離展開方向に局
部的に異なる場合であつても高精度に位置補正を
行なうことができる。そして、オフセツト歪みの
補正がなされたデジタル信号に基づいて核酸の塩
基配列を簡易かつ高精度に決定することができる
ものである。

［発明の構成］ 本発明において用いられる試料の例としては、
放射性標識が付与されたDNA、RNA等の核酸の
塩基特異的断片物の混合物を挙げることができ
る。ここで、核酸の断片物とは長鎖状の分子の一
部分を意味する。たとえば、塩基特異的DNA断
片物混合物の一種である塩基特異的DNA切断分
解物混合物は、前述のマキサム・ギルバート法に
従つて、放射性標識が付与されたDNAを塩基特
異的に切断分解することにより得られる。

また、塩基特異的DNA合成物混合物は前述の
サンガー・クールソン法に従つて、DNAをテン
プレート（鋳型）として、放射性標識が付与され
たデオキシヌクレオシドトリフオスフエートと
DNA合成酵素とを用いて合成することにより得
られる。

さらに、塩基特異的RNA断片物の混合物も上
記と同様の方法により、切断分解物混合物として
または合成物混合物として得ることができる。な
お、DNAはその構成単位としてアデニン、グア
ニン、チミン、シトシンの四種類の塩基からなる
が、一方RNAはアデニン、グアニン、ウラシル、
シトシンの四種類の塩基からなる。

放射性標識は、これらの物質に適当な方法で
³²P、¹⁴C、³⁵S、³H、¹²⁵Iなどの放射性同位元素を保
持させることによつて付与される。

試料である放射性標識が付与された塩基特異的
DNA断片物の混合物はゲル状支持媒体など公知
の各種の支持媒体を用いて、電気泳動法、薄層ク
ロマトグラフイー、カラムクロマトグラフイー、
ペーパークロマトグラフイーなど種々の分離展開
方法により支持媒体上に分離展開される。

次に、放射性標識物質が分離展開された支持媒
体について、従来の写真感光材料を用いる放射線
写真法により、あるいは蓄積性蛍光体シートを用
いる放射線像変換方法によりそのオートラジオグ
ラフが得られ、次いで適当な読取り（読出し）系
を介して放射性標識物質のオートラジオグラフに
対応するデジタル信号が得られる。

前者の放射線写真法を利用する場合は、まず支
持媒体とＸ線フイルム等の写真感光材料とを低温
（−90〜−70℃）で長時間（数十時間）重ね合わ
せて放射線フイルムを感光させたのち、現像して
放射性標識物質のオートラジオグラフを放射線フ
イルム上に可視画像化する。次いで、画像読取装
置を用いて放射線フイルム上に可視化されたオー
トラジオグラフを読み取る。たとえば、放射線フ
イルムに光ビームを照射してその透明光または反
射光を光電的に検出することにより、オートラジ
オグラフは電気信号として得られる。さらに、こ
の電気信号をＡ／Ｄ変換することにより、オート
ラジオグラフに対応するデジタル信号を得ること
ができる。

後者の放射線像変換方法を利用する場合には、
まず、支持媒体と蓄積性蛍光体シートとを常温で
短時間（数秒〜数十分間）重ね合わせて蛍光体シ
ートに放射性標識物質から放出される放射線エネ
ルギーを蓄積させることにより、そのオートラジ
オグラフを蛍光体シートに一種の潜像として記録
する。ここで、蓄積性蛍光体シートは、たとえば
プラスチツクフイルムからなる支持体、二価ユー
ロピウム賦活弗化臭化バリウム（BaFBr：Eu²⁺）
等の輝尽性蛍光体からなる蛍光体層、および透明
な保護膜がこの順に積層されたものである。蓄積
性蛍光体シートに含有されている輝尽性蛍光体
は、Ｘ線等の放射線が照射されるとその放射線エ
ネルギーを吸収して蓄積し、そののち可視乃至赤
外領域の光で励起すると蓄積としていた放射線エ
ネルギーを輝尽光として放出するという特性を有
する。

次いで、読出装置を用いて蓄積性蛍光体シート
に蓄積記録されたオートラジオグラフを読み出
す。具体的には、たとえば蛍光体シートをレーザ
ー光で走査して放射線エネルギーを輝尽光として
放出させ、この輝尽光を光電的に検出することに
より、放射性標識物質のオートラジオグラフは可
視画像化することなく直接に電気信号として得ら
れる。さらに、この電気信号をＡ／Ｄ変換するこ
とにより、オートラジオグラフに対応するデジタ
ル信号を得ることができる。

上述のオートラジオグラフ測定操作およびオー
トラジオグラフに対応するデジタル信号を得る方
法の詳細については、前記特開昭59−83057号、
特開昭59−126527号、特開昭59−126278号等の各
公報に記載されている。

なお、上記においては、支持媒体上に分離展開
された放射性標識物質のオートラジオグラフに対
応するデジタル信号を得る方法として、従来の放
射線写真法および放射線像変換方法を利用する方
法について述べたが、これらの方法に限定される
ものではなく、それ以外の如何なる方法により得
られたデジタル信号であつても放射性標識物質の
オートラジオグラフと対応関係がある限り、本発
明の信号処理方法を適用することが可能である。

また、上記いずれの方法においてもオートラジ
オグラフの読取り（または読出し）は、放射線フ
イルム（または蓄積性蛍光体シート）の全面に亘
つて行なう必要はなく、画像領域のみについて行
なうことも勿論可能である。

さらに、本発明においては、予め各分離展開列
の位置およびバンドの幅等についての情報を入力
して読取り（読出し）条件を設定しておき、読取
り（読出し）操作においては各バンド上を走査線
が通過するような走査線密度で光ビームによる走
査を行なうことにより、読取（読出）時間を短縮
化して必要な情報を効率良く得ることができる。
なお、本発明においてオートラジオグラフに対応
するデジタル信号とは、このようにして得られた
デジタル信号をも包含する。

得られたデジタル信号D_xyは、放射線フイルム
（または蛍光体シート）に固定された座標系で表
わされた座標（ｘ、ｙ）とその座標における信号
のレベル（ｚ）とからなる。信号のレベルはその
座標における画像濃度、すなわち放射性標識物質
の量を表わしている。従つて、一連のデジタル信
号（すなわち、デジタル画像データ）は放射性標
識物質の二次元的な位置情報を有している。

このようにして得られた支持媒体上に分離展開
された放射性標識物質のオートラジオグラフに対
応するデジタル信号には、以下に述べるような本
発明の方法により信号処理が施されて、目的の核
酸の塩基配列決定が行なわれる。

本発明の信号処理方法の実施の態様を、次の四
種類の放射性標識が付与された塩基特異的DNA
断片物の組合せにより形成された泳動列（分離展
開列）からなる場合について説明する。

(1) グアニン(G)特異的DNA断片物 (2) アデニン(A)特異的DNA断片物 (3) チミン(T)特異的DNA断片物 (4) シトシン(C)特異的DNA断片物 ここで、各塩基特異的DNA断片物は、塩基特
異的に切断分解もしくは合成された、すなわち末
端の塩基を同じくする種々の長さのDNA断片物
からなる。

第２図は、上記四種類の塩基特異的DNA断片
物をそれぞれ四個のスロツトに電気泳動してなる
泳動パターンのオートラジオグラフを示す。第２
図に示すように、得られたオートラジオグラフに
はオフセツト歪みが生している。

このオートラジオグラフに対応するデジタル信
号は、信号処理回路において一旦メモリ（バツフ
アーメモリ、または磁気デイスク等の不揮発性メ
モリ）に記憶される。

まず、各泳動列（レーン）について二つ以上の
バンドを検出し、その序列を決定する。

たとえば、各レーンの泳動方向に沿つた一定領
域内のデジタル信号を抽出したのち、各レーンに
ついて抽出された信号の位置(y)とその信号のレベ
ル(z)とからなる一次元波形を作成する。なお、デ
ジタル信号の検出を、前記のように各バンドにつ
いて走査線がかかるような走査線密度で泳動方向
に走査することにより行なつた場合には、直接に
各レーンについてその一次元波形を作成すること
ができる。

第３図は、各レーンについて信号の位置(y)と信
号のレベル(z)とからなる一次元波形を示す。な
お、第３図において、縦軸の位置（ｙ＝y₀）はデ
ジタル画像データ上の基準原点を示す。

第３図の各一次元波形の右側部分（ｙが大であ
る領域）において、たとえば信号のレベルの差分
値の符号が反転する（＋から−に変化する）点を
求めることにより、信号レベルが極大となる位置
を探し出す。この極大値をとる位置をバンドの位
置とする。検出すべきバンドの数は、泳動パター
ン上の総バンド数およびパターンの状態などによ
つても異なるが、たとえば総バンド数が150〜200
の範囲にある場合には各レーンについて10個程度
のバンドを検出するのが好ましい。

得られたバンド全部について、泳動位置(y)が基
準原点から遠い順に通し番号(n)を付す。泳動パタ
ーンの下部領域においては、第３図の一次元波形
から明らかなようにバンドの間隔が疎であるため
に、オフセツト歪みが生じていてもバンドの位置
がレーン間で逆転するようなことがなく、バンド
の序列を容易に決定することができる。

次に、各レーンについて、バンドの番号とその
泳動距離との相関関係を求める。

たとえば、横軸にバンド番号(n)をとり、縦軸に
泳動距離（y′）をとつたグラフを作成することに
より、第４図直線１〜４に示すような回帰直線を
得る。なお第４図は、各レーンについてのバンド
番号(n)と泳動距離（y′）とからなる回帰直線を示
す。直線１〜４はスロツトの番号に対応する。

ここで、泳動距離（y′）は基準原点（y₀）から
各バンドの位置までの距離（y′＝ｙ−y₀）を表わ
す。基準原点はたとえばスロツトの位置とするこ
とができる。従つて、レーン相互に位置ズレがあ
る場合に共通の基準原点からの距離y′は真の泳動
距離とは限らない。また、各レーンの回帰直線は 一般式：y′＝an＋ｂ で表わされる。ここで、ａおよびｂはそれぞれ定
数である。

通常、泳動パターンの下部領域においては局所
的に、バンド番号と泳動距離とが直線関係を有し
ており、第４図の直線１〜４に示すような回帰直
線で近似することができる。ここで、オフセツト
歪みが発生していなければ、検出されたバンドは
一つの回帰直線上に存在したはずである。換言す
れば、各レーンについて得られた四本の回帰直線
は一つに重なつたはずである。

なお、バンド番号とその泳動位置との相関関係
の表わし方は、上記の回帰直線に限定されるもの
ではなく、たとえば適当な高次曲線で近似して回
帰曲線とすることにより一層高精度に相関関係を
決定することもできる。

次いで、得られた相関関係からレーン間の泳動
距離の差を求め、この差を次に検出されるべきバ
ンド領域における列間の位置ズレとする。

レーン間の泳動距離の差はたとえば、まず各回
帰直線をｎが大となる方向に外挿し、横軸の任意
の点における泳動距離y′をそれぞれ求めることに
より、その差として得ることができる。そして、
この泳動距離の差をその付近における（すなわ
ち、次に検出されるべきバンド領域における）列
間の位置ズレとする。具体的には、第一スロツト
および第二スロツトのレーン間の泳動距離の差
は、第４図において直線１および２をそれぞれ右
方向（ｎが大となる方向）に延長したときの任意
の点（ｎ＝n_a）における泳動距離の差y′₁₂として
得られる。この差が、オフセツト歪みによるレー
ン間の位置ズレに相当する。

既にバンドの検出された下部領域より上部の領
域において一つ以上のバンドを検出し、これらの
バンドについて、上記で決定されたレーン間の位
置ズレに基づいて泳動位置の補正を行なつたのち
序列を付ける。

バンドの検出は、各レーンの一次元波形から前
記と同様にしてその極大値を求めることにより行
なうことができる。

泳動位置の補正は、得られた泳動距離の差だけ
新たに検出されたバンドの位置(y)を上部または下
部方向にずらす。たとえば、第二スロツトのバン
ドについては、ｙに関してy′₁₂の値だけ減算する
ことにより、泳動位置を補正することができる。
このようにして、レーンごとにレーン間の位置ズ
レを補正することができ、泳動パターンのオフセ
ツト歪みを是正することができる。

この補正された位置に基づいて各バンドを相互
に比較し、下端から順に続き番号を付す。この際
に、上記四種類の塩基特異的DNA断片物の組合
せが排他的な組合せであることから、一つのバン
ドが二つ以上のレーンに同時に存在することはな
いことを利用して、容易にバンドの序列を決定す
ることができる。

さらに、レーンごとに、既に検出されているバ
ンドにこの新たに検出されたバンド加え、その代
りにバンド番号を最も若いバンドを除外して、再
びバンドの番号とその泳動距離との相関関係（回
帰直線もしくは回帰曲線）を求める。たとえば、
第４図の直線１′〜４′に示すような回帰直線が新
たに得られる。この場合に、相関関係を求めるの
に用いられるバンドのデータ量は常に一定である
から、得られた相関関係はデータによつて異なる
ことなく直線などほぼ一定の関係式で表わすこと
ができる。

この補正された回帰直線に基づいて再び、次に
検出されるべきバンド領域におけるレーン間の位
置ズレを求め、該領域で新たに検出されたバンド
について泳動位置の補正を行ない、そしてバンド
に序列を付す。

このようにして、各レーンを一定領域ごとに区
分し、区分ごとに上述の操作を繰り返すことによ
り、各レーン上の全てのバンドについてオフセツ
ト歪みによる位置ズレを補正することができる。
レーン間の位置ズレはレーン全体を通して必ずし
も一様であるとは限らないので、区分的に位置ズ
レを補正することにより高精度にオフセツト歪み
の補正を行なうことができる。

一回の操作で検出、位置補正されるバンドの数
は相関関係を得るのに用いられるバンド数の半分
以下であるのが好ましく、たとえば一つのレーン
当り３〜５個程度である。

あるいは、バンドの通し番号とその泳動距離と
の相関関係は、単に既に検出されているバンドに
新たに検出されたバンドを加えて、これら検出済
の全てのバンドに対して求めてもよい。ただし、
上記操作を重ねるにつれて相関関係は直線ではな
く、適当な曲線（多項式あるいは指数関数等）を
最小二乗法などで近似した回帰曲線（第５図参
照）で表わされるようになる。

なお、第５図において、曲線１〜４はそれぞれ
各レーンで検出されたバンド全てについてのバン
ド番号(n)と泳動距離（y′）とからなる回帰曲線で
ある。

また、上記操作を一バンド単位で繰り返しても
よい。すなわち、一つのバンドを検出するたびに
バンドの通し番号とその泳動距離との相関関係を
修正し、次に検出されるべきバンド領域における
レーン間の位置ズレを求めてもよく、これにより
泳動位置の補正をより制度高く行なうことができ
る。たとえば、第５図に示すように、１〜n_b番目
のバンドのデータに基づいて各レーンごとに回帰
曲線１〜４を求めたのちｎが大となる方向に外挿
することにより、次のn_b＋１番目のバンドについ
て第一スロツトと第三スロツトのレーン間の泳動
距離の差はy′₁₃と決定される。

このようにして得られたバンドの通し番号が即
ち、目的とするDNAの塩基配列を意味している。
上記(1)〜(4)のスロツトはそれぞれ(G)、(A)、(T)、(C)
からなる末端塩基についての情報を有するから、
各バンドの属するスロツトに対応する塩基で置換
することにより、DNAの塩基配列（例えば、Ａ
−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｇ−…）を得ることがで
きる。

なお、本発明において泳動パターンにスマイリ
ング現像が発生している場合には、デジタル信号
に上述のオフセツト歪みの補正を行なう前に、ス
マイリングの補正を行なつてもよい。

スマイリング現像は、支持媒体の中央部のスロ
ツトの泳動距離に比べて両端部のスロツトの泳動
距離が短くなる現像であり、泳動過程における放
熱効果（いわゆるエツジ効果）などが原因となつ
て生じるものである。

スマイリングの補正は、たとえば、以下のよう
にして行なうことができる。

スマイリング現像の発生している泳動パターン
においては通常、バンド（軸方向に長い帯状であ
る）が、スマイリング効果の程度に応じて泳動方
向に対して直角ではなく傾きを有していることか
ら、まず各レーンについて少なくとも一つのバン
ドの傾きを検出する。傾きはたとえば、デジタル
画像データ上を、各バンドに少なくとも二本の走
査線がかかるように走査してデジタル信号を抽出
したのち、各走査線について一次元波形を作成
し、その極大値の位置を結んで得られる回帰直線
から求めることができる。あるいは、オートラジ
オグラフの読取（読出）過程において予め上記の
ようなデジタル信号を検出しておいてもよい。

次に、スマイリング効果の程度の最も小さな一
つのレーン（基準レーンとする）上の一つのバン
ド（基準バンド）を求め、このバンドの傾きと他
のレーンの最寄りのバンドの傾きとから、基準バ
ンドを当該他レーンに外挿し、他のレーンにおけ
る基準バンドの相対位置を決定する。次いで、こ
の相対位置と基準レーン上の位置とから、各レー
ンについて泳動距離の比率を求める。得られた比
率は各レーンのスマイリング効果の程度を表わし
ており、この比率に基づいて各レーンの泳動距離
を一括して伸縮させる。このようにして、全ての
レーンについてスマイリングの補正を行なうこと
ができる。

あるいは、全てのバンドについてその傾きを検
出し、基準レーン以外のレーン上の名バンドをそ
の傾きに基づいて基準レーンに外挿することによ
り、個々のバンドについて個別に泳動距離の補正
をすることもできる。この場合には、予め全ての
バンドが検出され、バンド単位でスマイリングの
補正が行なわれることになる。

なお、前記の方法によるスマイリング補正の詳
細については、本出願人による特願昭60−74899
号［昭和60年４月９日出願(1)］および特願昭60−
74900号［昭和60年４月９日出願(2)］の各明細書
に記載されている。

以上に述べた方法により、DNAの片方の鎖状
分子についての塩基配列を決定することができ
る。なお、DNAの塩基配列についての情報は、
上記の表示形態に限られるものではなく、たとえ
ば所望により同時に各バンドの強度（z′）を放射
性標識物質の相対量として表示することも可能で
ある。また同時に、オートラジオグラフの可視画
像とともに画像として表示することも可能であ
る。さらに、DNAの二本の鎖状分子両方につい
ての塩基配列を表示することもできる。

また、上記においては、試料である塩基特異的
DNA断片物の混合物として（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）
の排他的組合せを利用した場合について説明した
が、本発明の信号処理方法はこの組合せに限定さ
れるものではなく、例えば（Ｇ、Ｇ＋Ａ、Ｔ＋
Ｃ、Ｃ）などの種々の組合せに適用することがで
きる。また同様に、塩基特異的RNA断片物の混
合物（例えば、Ｇ、Ａ、Ｕ、Ｃの組合せ）につい
ても本発明の信号処理方法を適用することができ
る。さらに、オフセツト歪みの補正は、一組の核
酸の塩基特異的断片物の分離展開列に限定される
ものではなく、支持媒体上に同時に分離展開され
た全ての分離展開列について行なうことが可能で
ある。

このようにして得られた塩基配列情報について
はこのほかにも、たとえば、既に記録保存されて
いる他の核酸の塩基配列と照合するなどの遺伝言
語学的情報処理を行なうことも可能である。

上述の信号処理により決定された核酸の塩基配
列についての情報は、信号処理回路から出力され
たのち、次いで直接的に、もしくは必要により磁
気デイスクや磁気テープなどの記憶保存手段を介
して記録装置に伝送される。

記録情報としては、たとえば、感光材料上をレ
ーザー光等で走査して光学的に記録するもの、
CRT等に表示された記号・数値をビデオ・プリ
ンター等に記録するもの、熱線を用いて感熱記録
材料上に記録するものなど種々の原理に基づいた
記録装置を用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図ａは、支持媒体の上端部に設けられたス
ロツト形状を示す部分図であり、ｂは、オフセツ
ト歪みが発生した分離展開パターンの例を示す図
である。第２図は、オフセツト歪みが発生した泳
動パターンの例を示す図である。第３図は、各レ
ーンについて信号の位置(y)と信号のレベル(z)とか
らなる一次元波形を示す図である。第４図は、各
レーンについてバンド番号(n)と泳動距離（y′）と
からなる回帰直線を示す図である。直線１〜４お
よび直線１′〜４′はそれぞれ(1)〜(4)のスロツトに
対応する。第５図は、各レーについてバンド番号
(n)と泳動距離（y′）とからなる回帰曲線を示す図
である。曲線１〜４はそれぞれ(1)〜(4)のスロツト
に対応する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 放射性標識が付与された塩基特異的DNA断
   片物もしくは塩基特異的RNA断片物の混合物が
   支持媒体上に一次元的方向に分離展開されて形成
   された複数の分離展開列のオートラジオグラフに
   対応するデジタル信号について信号処理を行なう
   ことにより、核酸の塩基配列を決定する方法にお
   いて、 (1) 各分離展開列について下部の少なくとも二つ
   のバンドを検出し、下端から順にバンドを通し
   番号を付する工程、 (2) 分離展開列ごとに、該バンドの番号とその分
   離展開距離との相関関係を得る工程、 (3) 得られた相関関係から分離展開列間における
   分離展開距離の差を得る工程、 (4) 各分離展開列について、より上部の少なくと
   も一つのバンドを検出し、得られた分離展開距
   離の差を列間の位置ズレとして該バンドの分離
   展開位置を補正したのち、その位置に基づいて
   該バンドに続き番号を付する工程、 (5) 既に検出されているバンドに上記第四工程で
   新たに検出されたバンドを加え、これらのバン
   ドについて分離展開列ごとにバンドの番号とそ
   の分離展開距離との相関関係を新たに得る工
   程、 および (6) 上記第三乃至第五工程を順次繰り返すことに
   より、各分離展開列上の全てのバンドにその補
   正位置に基づいて序列を付する工程、 を含むことを特徴とする核酸の塩基配列決定のた
   めの信号処理方法。 ２ 上記第一および第四工程において、各列の分
   離展開方向に沿つてデジタル信号を抽出したの
   ち、各列における抽出信号のレベルが極大となる
   位置を求めることにより、バンドを検出すること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の核酸の
   塩基配列決定のための信号処理方法。 ３ 上記第二工程において、バンドの番号とその
   分離展開距離との相関関係を回帰直線もしくは回
   帰曲線として得ることを特徴とする特許請求の範
   囲第１項記載の核酸の塩基配列決定のための信号
   処理方法。 ４ 上記第三工程において、分離展開列間におけ
   る分離展開距離の差を、回帰直線もしくは回帰曲
   線をバンド番号が大となる方向に外挿したときの
   分離展開距離の差として得ることを特徴とする特
   許請求の範囲第３項記載の核酸の塩基配列決定の
   ための信号処理方法。 ５ 上記第五工程において、既に検出されている
   バンドに第四工程で新たに検出されたバンドを加
   え、かつ既に検出されているバンドのうち番号の
   小さなバンドを除外し、これらのバンドについて
   分離展開列ごとにバンドの番号とその分離展開距
   離との相関関係を新たに得ることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載の核酸の塩基配列決定の
   ための信号処理方法。 ６ 上記第一工程の前に、各分離展開列について
   少なくとも一つのバンドの分離展開方向に対する
   傾きを検出したのち、この傾きに基づいて該バン
   ドの他の分離展開列における相対位置を求めるこ
   とにより、各バンドの分離展開距離を補正するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の核酸
   の塩基配列決定のための信号処理方法。 ７ 上記塩基特異的DNA断片物の混合物が、 (1) グアニン特異的DNA断片物、 (2) アデニン特異的DNA断片物、 (3) チミン特異的DNA断片物、 (4) シトシン特異的DNA断片物、 の四種類からなり、分離展開列が、これら四種類
   の塩基特異的DNA断片物がそれぞれ支持媒体上
   に分離展開されて形成された四列の分離展開列か
   らなることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載の核酸の塩基配列決定のための信号処理方法。 ８ 上記オートラジオグラフに対応するデジタル
   信号が、支持媒体と輝尽性蛍光体を含有する蓄積
   性蛍光体シートとを重ね合わせて、支持媒体上の
   放射性標識物質のオートラジオグラフを該蛍光体
   シートに蓄積記録したのち、該蛍光体シートに励
   起光を照射して該オートラジオグラフを輝尽光と
   して光電的に読み出すことにより得られたもので
   あることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の核酸の塩基配列決定のための信号処理方法。 ９ 上記オートラジオグラフに対応するデジタル
   信号が、支持媒体と写真感光材料とを重ね合わせ
   て、支持媒体上の放射性標識物質のオートラジオ
   グラフを該感光材料に感光記録したのち、該感光
   材料上に可視化されたオートラジオグラフを光電
   的に読み取ることにより得られたものであること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の核酸の
   塩基配列決定のための信号処理方法。