JPH0675504B2

JPH0675504B2 - 変異ズブチリシン遺伝子

Info

Publication number: JPH0675504B2
Application number: JP1501511A
Authority: JP
Inventors: ハストルプ，スベン; ブランネル，スベン; ノリス，ファニイ; ベーペーターセン，ステフェン; ネールスコウーラウリドゥセン，レイフ; ヨハネスイエンセン，ビリ; アースリング，ドリト
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1988-01-07
Filing date: 1989-01-06
Publication date: 1994-09-28
Anticipated expiration: 2009-09-28
Also published as: WO1989006279A1; US6506589B1; US20030148495A1; ATE136329T1; US20030186378A1; EP0675196A3; DK6488D0; JPH03503477A; DE68926163T2; US20050003986A1; DK175697B1; DK176102B1; US5741694A; US6908991B2; JP2726799B2; EP0396608A1; DK36196A; EP1498481A1; US20030175933A1; US6835821B2

Description

【発明の詳細な説明】 1.発明の分野本発明は、ズブチリシン（subtilisin）酵素の化学的特
性の変化を生じさせるズブチリシン遺伝子の変異に関す
る。ズブチリシン遺伝子の特異的核酸での変異はアミノ
酸置換を生じ、その結果、酵素の機能変換が起こる。こ
れらの変異酵素の中には、産業上の用途、特に洗浄剤工
業において有利な物性を示して、酸化に対してより安定
で、プロテアーゼ活性がより大きく、そして改善された
洗浄性を示すズブチリシンを生成するものがある。

2.発明の背景 2.1.桿菌プロテアーゼタンパク質基質におけるアミド結合を開裂する酵素は、
プロテアーゼ、即ち、ペプチダーゼ（相互に交換して用
いられる）として分類される〔ワルシュ（Walsh）等、1
979年、「酵素反応機構（Enzymatic Reaction Mechanis
ms）」、ダブリュ・エイチ・フリーマン・アンド・カン
パニー（W.H.and Company）、サンフランシスコ、第３
章参照〕。桿菌種の細菌は、２種類の細胞外種のプロテ
アーゼ、即ち、中性又はメタロプロテアーゼと、機能的
にはズブチリシンと呼ばれるセリンエンドペプチダーゼ
であるアルカリ性プロテアーゼを分泌する。これらのプ
ロテアーゼの分泌は細菌の成長周期と連結しており、芽
抱形成も生じるとき、定常期にプロテアーゼの最大の発
現が生じる。ジョリフェ（Joliffe）等（1980年、ジェ
イ・バクテリアル（J.Bacterial）、141:1199〜1208）
は、桿菌プロテアーゼは細胞壁ターンオーバーにおいて
機能を果たすことを教示している。

2.2.ズブチリシンセリンプロテアーゼは、活性部位に必須セリン残基があ
るペプチド結合の加水分解を触媒する酵素である〔ホワ
イト（White）、ハンドラー（Handler）及びスミス（Sm
ith）、1973年、「生化学の原理（Pinciples of Bioche
mistry）」、第５版、マグローヒル・ブック・カンパニ
ー、ニューヨーク、第271〜272頁〕。

セリンプロテアーゼの分子量は、25,000〜30,000の範囲
である。セリンプロテアーゼは、ジイソプロピルフルオ
ロホスフェートにより阻害されるが、メタロプロテアー
ゼとは異なり、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）耐性が
ある〔但し、カルシウムイオンにより高温で安定化され
る〕。また、セリンプロテアーゼは、単純末端エルテル
類を加水分解し、そして真核性キモトリプシンと活性が
類似している。セリンプロテアーゼの代替用語であるア
ルカリ性プロテアーゼは、セリンプロテアーゼの最適pH
が9.0〜11.0と高いことを反映した用語である〔プリー
スト（Priest）、1977年、バクテリオロジカル・レビュ
ー（Bacteriological Rev.）、41、711〜753〕。

ズブチリシンは、グラム陽性菌又はカビにより産生され
るセリンプロテアーゼである。多種多様のズブチリシン
が同定され、そして少なくとも８種のズブチリシンのア
ミノ酸配列が決定された。これらには、細菌株由来の６
種のズブチリシン、即ち、ズブチリシン168、ズブチリ
シンBPN′、ズブチリシンカールズベルグ（subtilisin
Carlsberg）、ズブチリシンDY、ズブチリシンアミノサ
ッカリチカス及びメサンテリコペプチダーゼ（mesenter
icopeptidase（〔栗原等、1972年、ジェイ・バイオル・
ケム（J.Biol.Chem.）、247:5629〜5631;スタール（Sta
hl）及びフェラリ（Ferrari）、1984、ジェイ・バクテ
リオル（J.Bacteriol）、158:411〜418;バサンサ（Vasa
ntha）等、1984年、ジェイ・バクテリオル（J.Bacterio
l）、159:811〜819、ジャコブズ等、1985年、核酸研究
（Nucl.Acids Res.）、13:8913〜8926;ネドコフ（Nedko
v）等、1985年、バイオロジカル・ケミストリー・ホッ
ペーセイラー（Biol.Chem.Hoppe−Seyler）、366:421〜
430;スベンドセン（Svendsen）等、1986年、フェブス・
レター（FEBS Lett）、196:228〜232）〕と、２種のカ
ビズブチリシン、即ち、サーモアクチヨミセス・バルガ
リス（Thermoactinymyces vulgaris）由来のズブチリシ
ンサーミターゼ〔メロウン（Meloun）等、1985年、フェ
ブス・レター（FEBS Lett）、183:195〜200〕及びトリ
チラウム・アルブム（Tritirachium album）〔ジェニー
（Janey）及びメイヤー（Meyer）、1985年、バイオロジ
カル・ケミストリー・ホッペーセイラー（Biol.Chem.Ho
ppe−Seyler）、366:584〜492〕が含まれる。

ズブチリシンは、物理的にも化学的にも十分に特性決定
がなされている。これらの酵素の一次構造（アミノ酸配
列）の知見の他に、ズブチリシンの50を超える高分解能
Ｘ線構造が測定され、基質の結合、転移状態、生成物、
３種の異なるプロテアーゼ阻害因子を示すとともに、自
然変異における構造上の重要性が明らかにされた〔クラ
ウト（Kraut）、1977年、アン・レブ・バイオケム（An
n.Rev.Biochem.）46:331〜358〕。ズブチリシンのラン
ダム変異及び部位特異的変異は、両方とも、酵素の物理
的性質及び及び化学的性質の知見並びに論文に掲載され
たズブチリシンの触媒活性、基質特異性、三次構造等に
関する情報に起因するものである〔ウエルズ（Wells）
等、1987年、プロク・ナトル・アカド・（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.）、米国、84:1219〜1223;ウエルズ等、1986
年、フィル・トランス・アール・ソサ・ロンド・エイ
（Phil.Trans.R.Soc.Lond.A.）、317:415〜423;ワング
（Hwang）及びワーシェル（Warshel）、1987年、バイオ
ケム（Biochem.）、26:2669〜2673;ラオ（Rao）等、198
7年、ネーチャー、328:551〜554〕 2.3.ズブチリシンの産業上の用途ズブチリシンは、タンパク様の汚れを除去するのに有効
であることから、産業上、特に洗浄剤配合物において多
大な実用性があることが判明した。しかしながら、これ
らの酵素が効果的であるには、洗浄条件化で活性を有す
る必要があるだけでなく、貯蔵中に他の洗浄剤成分と適
合しなければならない。例えば、ズブチリシンは、澱粉
に対して活性なアミラーゼとの組み合わせ、セルロース
性物質を消化するセルラーゼとの組み合わせ、脂肪に対
して活性なリパーゼとの組み合わせ、ペプチドに対して
活性なペプチダーゼとの組み合わせ、及び尿による汚れ
に対して効果的なウレアーゼとの組み合わせで用いられ
ることがある。配合物は他の酵素をズブチリシンによる
消化から保護しなければならないだけでなく、ズブチリ
シンは酸化力、カルシウム結合性、洗浄力及び高pHの非
酵素洗浄剤成分に関して安定でなければならない。酵素
が安定して存在できる能力は、洗浄性と称されることが
よくある。

3.発明の概要本発明は、ズブチリシン遺伝子の変異に関し、これらの
変異の中にはズブチリシン酵素の化学的特性を変更させ
るものもある。変異は、ズブチリシン遺伝子の特異的核
酸で生じ、そして種々の具体的実施態様では、変異酵素
の化学的性質が変化して、酸化安定性が増加し、タンパ
ク質分解活性が増加し、洗浄性が向上したりするが、こ
れらには限定されない。

また、本発明は、バシラス・レンタス（Bacillus lentu
s）変異体、ズブチリシン147及びズブチリシン309由来
の２種のプロテアーゼのアミノ酸配列及びDNA配列、さ
らにこれらの遺伝子の変異及び対応する変異酵素に関す
るが、これらのには限定されない。

サイト特異的変異では、特に洗浄剤及び食品技術分野に
おける多数の産業上の用途に適するようにすることので
きる変異ズブチリシン酵素を効果的に産生することがで
きる。また、本発明は、部分的には、酸化安定性の向
上、プロテアーゼ活性の増加及び／又は洗浄性の向上を
示すズブチリシン309遺伝子の変異体に関するがこれら
には限定されない。

3.1.略語Ａ＝Ala＝アラニンＶ＝Val＝バリンＬ＝Leu＝ロイシンＩ＝Ile＝イソロイシンＰ＝Pro＝プロリンＦ＝Phe＝フェニルアラニンＷ＝Trp＝トリプトファンＭ＝Met＝メチオニンＧ＝Gly＝グリシンＳ＝Ser＝セリンＴ＝Thr＝トレオニンＣ＝Cys＝システインＹ＝Tyr＝チロシンＮ＝Asn＝アスパラギンＱ＝Gln＝グルタミンＤ＝Asp＝アスパラギン酸Ｅ＝Glu＝グルタミン酸Ｋ＝Lys＝リジンＲ＝Arg＝アルギニンＨ＝His＝ヒスチジン 4.図面の説明第１図は、BamH I切断プラスミドpSx50への、バラシス
・レンタス株309DNAをSau3A制限エンドヌクレアーゼで
部分的に消化することにより得られた長さ1.5kb〜6.5kb
のサブセットの断片の挿入を示している。反対の向きに
ズブチリシン309を含んでいる得られる２種のプラスミ
ド、即ち、pSx86とpSx88も公知である。

第２図は、プラスミドpSx56へのバラシス・レンタス株1
47DNA断片の挿入を示している。Sau3A制限エンドヌクレ
アーゼを用いて、株147DNAを部分的に消化した。次に、
サイズが1.5〜6.5kbの断片を、、BamH I開裂プラスミド
pSx56に結合させた。生成物である。pSx94はズブチリシ
ン147遺伝子を含有している。

第３図は、森永等の方法を用いたギャップ二本鎖変異誘
発を示している〔1984年、バイオテクノロジー、2:636
〜639）。この特徴は、puC13由来の２種のプラスミド、
即ち、pSx93とpSx119にある。pSx93はズブチリシン309
遺伝子のXba I−Hind III断片を含んでおり、そしてpSx
119はEcoR I−Xba Iにおける断片中のズブチリシン309
遺伝子の残部を含んでいる。第３図（Ａ）図では、プラ
スミドpSx93をXba IとCla Iで開裂し、そしてギャップ
分子を、Sca I切断pSx93と混合し、変性し、そして再ア
ニーリングを行って、ズブチリシン309コード配列内に
延びている一本鎖DNAの領域を有するプラスミドを生成
する。ズブチリシン309遺伝子に相同であるが変異を含
んでいる合成オリゴヌクレオチドを、一本鎖ギャップに
対してアニーリング後、DNAポリメラーゼＩのクレノー
断片とT4リガーゼを用いて充填する。プラスミドを複製
すると、ズブチリシン309遺伝子の二本鎖変異体が生成
する。第３（Ｂ）図では、プラスミドpSx119とEcoR I酵
素及びXba I酵素を用いて、同様の操作を行い、ズブチ
リシン遺伝子309の対応領域に変異を生じさせる。

第４図は、ズブチリシン309を担持しているプラスミドp
Sx62の誘導体であるプラスミドpSx93を示している。適
当な制限エンドヌクレアーゼを用いて変異プラスミドpS
x93又はpSx119（第３図参照）から切除した変異断片
（即ち、Xba I−Cla I、Xba I−Hind III又はEcoR I−X
ba I）をプラスミドpSx92に挿入し、枯草菌（B.subtili
s）株DN497中で発現させた。

第５図は、ズブチリシン309とズブチリシン147を両方と
も切形で含んでいるプラスミドpSx143を示している。２
種の遺伝子の相同性領域間の生体内組み換えにより、活
性プロテアーゼを生じさせることができる。

5.発明の詳細な説明本発明は、ズブチリシン遺伝子の変異に関し、これらの
変異の中にはズブチリシン酵素の化学的特性を変化させ
るものもある。変異は特異的核酸で生じるので、ズブチ
リシンの形態は産業上の用途の必要性に合わせて設計で
きる。

本発明は、部分的には、ズブチリシン遺伝子における特
異的核酸の変異により、性質が変換された酵素が得られ
るという知見に基づいている。種々の実施態様におい
て、酸化安定性の向上、プロテアーゼ活性の増加又は洗
浄性の向上した酵素を生成できる。

説明を明瞭に行うために、本発明を以下の４つの部分に
分けて説明するが、本発明はこれらには限定されない：
（ａ）公知のズブチリシン及びズブチリシン147及びズ
ブチリシン309の化学構造；（ｂ）ズブチリシン遺伝子
における変異を生じさせる方法；（ｃ）ズブチリシンの
変異体の発現；及び（ｄ）所望の化学的性質についての
ズブチリシン変異のスクリーニング。

5.1.公知のズブチリシン及びズブチリシン147及びズブ
チリシン309の化学構造種々の起源からのズブチリシンの配列分析から、一次ア
ミノ酸配列の機能的重要性が分かり、そして慎重に変更
した機能を用いて新規な変異体を生成することができ
る。異種の形態のズブチリシンのアミノ酸配列を、物理
的性質又は化学的性質を対比しながら比較すると、有用
な変異酵素を産生すると思われる特異的な標的領域があ
ることが分かる。

ズブチリシンのアミノ酸配列は、少なくとも８種類知ら
れている。これらには、細菌株由来の６種のズブチリシ
ン、即ち、ズブチリシン168、ズブチリシンBPN′、ズブ
チリシンカールズベルグ（subtilisin Carlsberg）、ズ
ブチリシンDY、ズブチリシンアミノサッカリチカス及び
メサンテリコペプチダーゼ（mesentericopeptidase）
〔栗原等、1972年、ジェイ・バイオル・ケム（J.Biol.C
hem.）、247:5629〜5631;スタール（Stahl）及びフェラ
リ（Ferrari）、1984、ジェイ・バクテリオル（J.Bacte
riol）、158:411〜418;バサンサ（Vasantha）等、1984
年、ジェイ・バクテリオル（J.Bacteriol）、159:811〜
819;ジャコブス（Jacobs）等、核酸研究（Nucl.Acids R
es.）、13:8913〜8926;ネドコフ（Nedkov）等、1985
年、バイオロジカル・ケミストリー・ホッペ−セイラー
（Biol.Chem.Hoppe−Seyler）、366:421〜430;スベンド
セン（Svendsen）等、1986年、フェブス・レター（FEBS
Lett）、196:228〜232）〕と、２種のカビズブチリシ
ン、即ち、サーモアクチヨミセス・バルガリス（Thermo
actinymyces vulgaris）由来のズブチリシンサーミター
ゼ〔メロウン（Meloun）等、1985年、フェブス・レター
（FEBS Lett）、183:195〜200〕及びトリチラウム・ア
ルブム・リンバー（Tritirachium albumlimber）由来の
プロテアーゼｋ〔ジェニー（Janey）及びメイヤー（Mey
er）、1985年、バイオロジカル・ケミストリー・ホッペ
−セイラー（Biol.Chem.Hoppe−Seyler）、366:485〜49
2〕が含まれる。

本発明に関連して、更に２種のセンリプロテアーゼのア
ミノ酸配列及びDNA配列が明らかとなった。これらのプ
ロテアーゼは、２種のバシラス・レンタス変異体（147
及び309）に由来のものである。これらは、それぞれ「B
acillus lentus C303」及び「Bucillus lentus C360」
と命名されて、National Collection of Industrial Ba
cteria Torry Research Station（NCIB）にブタペスト
条約に基き国際寄託され、それぞれ、寄託番号NCIB第10
147号及びNCIB第10309号が与えられた。便宜上、上記の
株により産生したプロテアーゼを、それぞれズブチリシ
ン147及びズブチリシン309と命名し、そしてこれらのタ
ンパク質をコードしている遺伝子をズブチリシン147遺
伝子及びズブチリシン309遺伝子と称する。

本発明において使用される用語「ズブチリシン物質（su
btilisinmaterial）」とは、活性成分としてズブチリシ
ンを含有するタンパク様物質を意味する。本明細書で使
用されている用語「セリンプロテアーゼ（serine prote
ase）」とは、ズブチリシン309、ズブチリシン168、ズ
ブチリシンBPN′、ズブチリシンカールズベルグ、ズブ
チリシンDY、ズブチリシンアミノサッカリチカス、メサ
ンテリコペプチダーゼ、サーミターゼ、タンパク質分解
酵素Ｋ及びサーモミコラーゼに関して上記で述べた配列
と少なくとも30％、好ましくは50％、より好ましくは80
％のアミノ酸配列の相同性があるズブチリシンである。
これらのセリンプロテアーゼは、本明細書において、
「相同性セリンプロテアーゼ（homologous serine prot
ease）」とも称する。

表Ｉは、演繹により推定したズブチリシン309、ズブチ
リシン147、ズブチリシンBPN′、ズブチリシンカールズ
ベルグ及びズブチリシン168のアミノ酸配列を比較した
ものである〔スピズィーゼン（Spizizen）等、1958年、
プロク・ナトル・アカド・サイ（Proc.Natl.Acad.Sc
i.）、米国、44:1072〜1078〕。表IIにズブチリシン309
遺伝子の核酸配列を示し、そして表IIIにズブチリシン1
47遺伝子の核酸配列を示す。本発明において、ズブチリ
シン309若しくは147又はそれらの機能的等価物の配列を
使用することができる。例えば、表Ｉ、表II又は表III
に示したズブチリシン309の配列又はズブチリシン147の
配列を、機能的に等価な分子を提供する置換、付加又は
矢失により変更することができる。例えば、ヌクレオチ
ドをコードしている配列の縮退により、表Ｉに示したの
と実質的に同じアミノ酸配列をコードする他のDNA配列
を、本発明の実施に用いることができる。これらには、
配列内に同じ又は機能的に等価なアミノ酸残基をコード
している異種のコドンの置換により変更してサイレント
変化を生じさせる表II又は表IIIに示したズブチリシン3
09又はズブチリシン147の全ての部分又は一部分を含有
しているヌクレオチド配列が含まれるが、本発明はこれ
らのものには限定されない。例えば、配列内の一種以上
のアミノ酸残基を、機能的に等価に作用する同様の極性
の別のアミノ酸で置換することができる。配列内のアミ
ノ酸の置換物は、別の種類のアミノ酸から選択すること
ができる。非極性（疎水性）アミノ酸としては、例え
ば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロ
リン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニ
ンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシ
ン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アス
パラギン及びグルタミンが挙げられる。正に帯電した
（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン及び
ヒスチジンが挙げられる。負に帯電した（酸性）アミノ
酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げら
れる。

類似性は、アミノ酸配列を比較することにより測定でき
る。アミノ酸配列を整列させるには多くの方法がある
が、それらの差がはっきりするのは、関連性がかなり小
さいときだけである。「図解：タンパク質配列とタンパ
ク質構造（Atlas of Protein Sequence and Structur
e）」、マーガレット・オー・デイホフ（Margaret O.Da
yhoff）編集、第５巻、補遺２、1976年、ナショナル・
バイオケミカル・リサーチ・ファウンデーション（Nati
onal Biochemical Research Foundation）、ジョウジタ
ウン・ユニバーシティ・メディカルセンター（Gergetow
n University Medical Center）、ワシントンDC、第３
頁以下、〔題名リサーチ・アンド・アライン（REASECH
and ALIGN）に記載されている方法により、関連性が定
義できる。当該技術分野において周知のように、同族タ
ンパク質は、アミノ酸の数だけでなく鎖に沿った各アミ
ノ酸の同一性においても異なることがある。即ち、２つ
の構造を同一性が最大となるように整列させたとき、欠
失又は挿入が見られることがある。例えば、ズブチリシ
ンカールズベルグはアミノ酸の数が274個であるのに対
して、ズブチリシンBPN′は275個のアミノ酸を有してい
る。２つの配列を整列させると、カールズベルグにはズ
ブチリシンBPN′のAsn56に対応する残基がないことが分
かる。このように、ギャップを位置56に記録しない限
り、カールズベルグのアミノ酸配列はBPN′とは非常に
異なるように思われる。したがって、カールズベルグ中
の残基がBPN′に対して相同となるように番号が付けら
れていれば、ズブチリシンカールズベルグの位置218のA
snに対してSerを置換することにより、熱安定性が増加
することが、高度の確信を持って予測できる。本発明に
よれば、ズブチリシン309及びズブチリシン147の配列
を、公知のズブチリシン（表Ｉ参照）新規に見出したズ
ブチリシンと比較して、所望の変異の位置を演繹推定で
きる。これを行うために、比較するズブチリシンの類似
性を測定する必要がある。

ズブチリシンの一次構造とその物理的性質との関係を実
験で測定したところ、メチオニン−222残基だけでなく
活性部位において機能的なアミノ酸、即ち、アスパラギ
ン酸−32、ヒスチジン−64及びセリン−221も重要であ
ることが判明した。アスパラギン−155とセリン−221
は、オキシアニオン結合部位内にある。これらの位置で
の変異は、タンパク質分解活性を減少させると思われ
る。本発明により、ズブチリシン309のアミノ酸配列と
ズブチリシン147ののアミノ酸配列とを互いに比較する
とともに、他のズブチリシン（表II参照）とも比較し
た。ズブチリシン309又はズブチリシン147と他のズブチ
リシンとの間で異なる残基を同した。例えば、残基153
で、ズブチリシン309はセリン残基を含んでいるのに対
して、ズブチリシン147、ズブチリシンBPN′、ズブチリ
シンカールズベルグ及びズブチリシン168はアラニン残
基を含んでいる。したがって、もズブチリシン309のセ
リン153残基をアラニン残基に変更すれば、ズブチリシ
ン309の物性は所望の方法に変化するであろう。同様
に、ズブチリシン147は位置218にセリン残基を含んでい
るのに対して、他のズブチリシンはアスパラギン残基を
発現した。ズブチリシン147は他のズブチリシンよりも
熱安定性が向上しているので、ズブチリシン309のアル
カリ性218をセリン残基に変異させることにより、ズブ
チリシン309の熱安定性が向上する。別の例を挙げる
と、Thr71は活性部位に近接しているので、アスパラギ
ン酸等の負に帯電したアミノ酸を導入すると、静電反発
による酸化攻撃が抑制される可能性がある。ズブチリシ
ンの物性に最も関連していると思われる部位は、ほとん
どのアミノ酸の間にアミノ酸残基の保存されている所、
例えば、上記したAsp−153及びAsn−218、さらにTrp−
６、Arg−170、Pro−168、His−67、Met−175、Gly−21
9、Arg−275である。他のズブチリシンとは異なるアミ
ノ酸を、一致するアミノ酸で置換するようにして各配列
を変異させることにより、より安定なズブチリシンが得
られる。

ウエルズ等（1987年、プロク・ナトル・アカド・サイ
（Proc.Natl.Acad.Sci.）米国、04:1219〜1223〕は、ズ
ブチリシン基質特異性を工作するために、アミノ酸配列
と部位特異的変異とを比較した。選択された基質に対す
る種々のズブチリシンの触媒活性は、著しく異なること
がある。ウエルズは３個のアミノ酸を置換したときだ
け、バシラス・アミロリクエファシーナ（B.amylolique
faciena）ズブチリシン基質特異性が生じ、未変性状態
における触媒効率とは10〜50倍異なる酵素であるバシラ
ス・リッチェンフォーミス（B.lichenformis）ズブチリ
シンの基質特異性に似てくることを示した。ズブチリシ
ン147とズブチリシン309と他のズブチリシンとを比較し
たところ、下記の部位を変異させることによりズブチリ
シンの物理性質又は化学的性質を変えることができるこ
とが分かった:6、９、11〜12、19、25、36〜38、53〜5
9、67、71、89、104、111、115、120、121〜122、124、
128、131、140、153〜166、168、169〜170、172、175、
180、182、186、187、191、194、195、199、218、219、
222、226、234〜238、241、260〜262、265、268又は27
5。ズブチリシン147及び／又はズブチリシン309の１、3
6、56、159、164〜166の位置に欠失が生じ、これらの部
位に適当なアミノ酸残基を挿入すると親酵素の安定性が
高まる。上記した例で説明した方法に準じて、多数の変
異の可能性のある部位が明らかとなる。

5.2.ズブチリシン遺伝子において変異を生成する方法遺伝子に変異を導入する方法は、当該技術分野において
数多く知られている。ズブチリシン遺伝子のクローニン
グについて簡単に述べた後で、ズブチリシン遺伝子内の
ランダムな部位及び特異的な部位の両方に変異を生成す
る方法について説明する。

5.2.1.ズブチリシン遺伝子のクローニングズブチリシンをコードする遺伝子は、グラム陽性菌又は
カビから当該技術分野において公知の種々の方法により
クローニングできる。まず、DNAのベノミックライブラ
リー及び／又はcDNAライブラリーを、検討すべきズブチ
リシンを産生する微生物から染色体DNA又はメッセンジ
ャーRNAを用いて造成する必要がある。次に、もしズブ
チリシンのアミノ酸配列が公知であるならば、相同な標
識オリゴヌクレチオドプローブを合成し、それを用いて
細菌DNAのゲノミックライブラリーからズブチリシンを
コードしているクローンを同定することができる。ま
た、ハイブリダイゼーションとより低いストリンジェン
シーの洗浄条件を利用して、細菌又はカビの別の株由来
のズブチリシンに相同な配列を含んでいる標識オルゴヌ
クレチオドプローブをプローブとして用いてズブチリシ
ンをコードしているクローンを同定することができる。

ズブチリシン産生クローンのさらに別の同定方法とし
て、プラスミド等の発現ベクターにゲノミックDNAの断
片を挿入し、得られるゲノミックDNAライブラリーでプ
ロテアーゼ陰性バクテリアを形質転換後、脱脂乳等のズ
ブチリシンの基質を含む寒天上で形質転換したバクテリ
アを平板培養することが挙げられる。ズブチリシンを担
持したプラスミドを含んでいるバクテリアは、分泌され
たズブチリシンによる脱脂乳の消化により、透明な寒天
の光輝により包囲されたコロニーを生成する。

5.2.2.ズブチリシン遺伝子におけるランダム変異の生成ズブチリシン遺伝子がプラスミド等の適当なベクターに
クローニングされたら、いくつかの方法を用いて遺伝子
にランダム変異を導入できる。

一つの方法として、クローニングしたズブチリシン遺伝
子を取り出しのできる（retrievable）ベクターの一部
分として大腸菌の突然変異誘発株に組み込むことが挙げ
られる。

別の方法として、一本鎖のズブチリシン遺伝子を生成
後、ズブチリシン遺伝子を含んでいる断片を別のDNA断
片とともに、ズブチリシンの一部分が一本鎖で残るよう
にしてアニーリングすことが挙げられる。次に、この別
個となった一本鎖領域を、亜硫酸水素ナトリウム、ヒド
ロキシルアミン、亜硝酸、ギ酸又はヒドララジン（これ
らには限定されない）をはじめとする多数の変異誘発剤
のいずれかにに暴露する。ランダム変異を生成するこの
方法の具体例が、ショートル（Shortle）及びナサン（N
athan）〔19788年、プロク・ナトル・アカド・サイ（Pr
oc.Natl.Acad.Sci.）、米国、75:2170〜2174〕により記
載されている。ショートル・ナサン法によれば、ズブチ
リシン遺伝子を担持しているプラスミドを、遺伝子内で
開裂する制限酵素により切断する。このニックを、DNA
ポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼを用いてギャップ
内に広げる。次に、得られる一本鎖ギャップを、上記し
た変異誘発剤のいずれか一つを用いて変異誘発する。

また、天然プロモーター及び他の制御配列を含んだ桿菌
種由来のズブチリシンを、大腸菌と枯草菌の両方のレプ
リコン、選択表現マーカー及び複製のM13起源を含んだ
プラスミドベクター内でクローニングして、ヘルパーフ
ァージIRIで重感染により一本鎖プラスミドDNAを産生さ
せることができる。クローニングしたズブチリシン遺伝
子を含んだ一本鎖プラスミドDNAを単離し、ベクター配
列を有するがズブチリシンのコード領域を含まないDNA
断片とともにアニーリングしてギャップ二重鎖分子を得
る。亜硫酸水素ナトリウム、亜硝酸又はギ酸を用いる
か、上記した大腸菌の変異誘発株中で複製することによ
りズブチリシン遺伝子に変異を導入する。亜硫酸水素ナ
トリウムは一本鎖DNA中のシトシンと過剰に反応するの
で、この変異誘発剤で生成した変異はコード領域に限ら
れる。一種のズブチリシン当たり１〜５の変異が生成す
るように実験ごとに反応時間及び亜硫酸水素ナトリウム
濃度を変更する。10μｇのギャップ二重鎖DNAを4M亜硫
酸水素ナトリウム中において、反応容積40μｌで、pH6.
0、温度37℃で９分間インキュベーションすることによ
り、一本鎖領域における約１％のシトシンが脱アミノ化
される。成熟ズブチリシンのコード領域は、DNA鎖に応
じて約200個のシトシンを含んでいる。反応時間は、約
４分間（200個のうちの１個の変異頻度で変異を生成す
るとき）〜約20分間（200個にのうちの約５個の変異）
の範囲で変化させるのが有利である。

変異誘発の後、ギャップ分子を、試験管内においてDNA
ポリメラーゼＩ（クレノー断片）で処理して完全二本鎖
分子を作製するとともに変異を固定する。次に、コンピ
テント菌としての大腸菌を変異誘発したDNAで形質転換
して変異ズブチリシンの増幅ライブラリーを生成する。
また、増幅変異ライブラリーは、プラスミドDNAを、誤
りがちなDNAポリメラーゼにより変異の範囲が広がる大
腸菌のMutD株中で成長させることによっても製造でき
る。

また、変異誘発剤の亜硫酸及びギ酸を用いて変異体ライ
ブラリーを生成することもできる。これらの薬品は、亜
硫酸ナトリウムほどには一本鎖DNAに対して特異的では
ないので、変異誘発反応を、以下の手順で行う。ズブチ
リシン遺伝子のコード領域を、常法によりM13ファージ
中でクローニングして、一本鎖ファージDNAを調製す
る。次に、一本鎖DNAを1M亜硝酸とpH4.3において23℃の
温度で15〜60分間反応させるか、2.4Mギ酸と23℃の温度
で２〜５分間反応させる。上記の反応時間では、1:1000
〜5:1000の変異度数が得られる。変異誘発の後、万能プ
ライマーをM13DNAに対してアニーリングし、そして変異
誘発した一本鎖DNAを鋳型として用いて、ズブチリシン
遺伝子のコード部分が完全に二重鎖となるように二重鎖
DNAを合成する。この時点で、コード領域をM13ベクター
から制限酵素を用いて切断し、そして制限断片において
のみ変異が生じるようにコード領域を未変異誘発発現ベ
クターに結さつする〔マイヤーズ（Myers）等、サイエ
ンス、229:242〜257（1985）〕。

さらに別の方法において、２種の異なるズブチリシンを
生体内で組み換えをしてことにより変異を生成すること
ができる。この方法によれば、２つの遺伝子内の相同領
域により、対応する領域のクロスオーバーが生じて、遺
伝子情報の交換が起きる。この手法によるハイブリッド
アミラーゼ分子の生成は、1987年６月29日出願の米国特
許出願第67,992号に詳細に記載されている。この特許出
願に記載の内容全体は、本発明に利用できる。ハイブリ
ッドの形態のズブチリシンを生成できるプラスミドの例
を第５図に示す。プラスミドpSx143に組み込まれたズブ
チリシン309とズブチリシン147の両方がトランスケーシ
ョンされるので、それら自体ではズブチリシンの発現は
できない。しかしながら、２つの遺伝子の間に組み換え
が生じて、トランスケーションにより生じた欠陥が修正
される。即ち、ズブチリシン309遺伝子のＮ末端領域
が、ズブチリシン147遺伝子のＣ末端領域に結合された
状態になり、活性な変異体ズブチリシンが産生される。
もしpSx143をバクテリアのプロテアーゼ陰性株る組み込
む場合には、プロテアーゼ陰性表現形を発現するバクテ
リアを選択し、その後、種々の変異体ズブチリシン309/
147キメラーゼを同定できる。

5.2.3.ズブチリシン遺伝子における部位特異的変異の生
成ズブチリシン遺伝子がクローニングし、変異のための所
望の部位が確認できたら、合成オリゴヌクレオチドを用
いて変異を導入できる。これらのオリゴヌクレオチド
は、所望の変異部位の側部に隣接してヌクレオチド配列
を含んでいる。変異体ヌクレオチドはオリゴヌクレオチ
ド合成中に挿入される。好ましい方法においては、ズブ
チリシン遺伝子をブリッジしているDNAの一本鎖ギャッ
プを、ズブチリシン遺伝子を担持しているベクター中で
生成する。その後、所望の変異を担持している合成ヌク
レオチドを、一本鎖DNAの相同部分に対してアニーリン
グする。次に、残存しているギャップをDNAポリメラー
ゼＩ（クレノー断片）で充填し、そして造成物をT4リガ
ーゼを用いて結合させる。この方法についての具体例
が、森永等（1984年、バイオテクノロジー、2:646〜63
9）に開示されている。森永等によれば、遺伝子内の断
片は、制限エンドヌクレアーゼを用いて取り除く。次
に、ベクター／遺伝子（この時点ではギャップを含んで
いる）を変性後、ギャップを含有せしめる代わりに、ギ
ャップに含まれている領域以外の部位を別のエンドヌク
レアーゼで開裂したベクター／遺伝子に対してハイブリ
ダイゼーションを行う。次に、遺伝子の一本鎖領域が変
異オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションし、残
存しているギャップにDNAポリメラーゼＩのクレノー断
片を充填し、挿入物をT4DNAリガーゼで結合し、そして
１サイクルの複製後に所望の変異を担持している二重鎖
プラスミドが産生する。森永の方法では、新規な制限部
位を造成する追加の操作が必要なく、したがって、複数
の部位に変異を生成するのが容易となる。1988年７月26
日発行のエステレ（Estelle）による米国特許第第4,76
0,025号では、カセットを多少変更することにより、複
数の変異を担持しているオリゴヌクレオチドを導入する
ことが可能であるが、森永の方法では種々の長さの多数
のオリゴヌクレオチドを導入できるので、森永の方法の
方がより多種類の変異を一度に導入できる。

5.3.ズブチリシン変異体の発現本発明によれば、上記した方法又は当該技術分野におい
て公知の代替法により製造した変異ズブチリシン遺伝子
は、発現ベクターを用いて酵素の形態で発現できる。発
現ベクターは、一般的に、クローニングベクターの定義
の範囲に入る。これは、発現ベクターは、通常、典型的
なクローニングベクター、即ち、微生物のゲノムとは無
関係に微生物中においてベクターの自律複製を可能とす
る要素、並びに選択のための表現形マーカーを含んでい
るからである。発現ベクターは、プロモーターをコード
している制御配列、オペレーター、リボソーム結合部
位、翻訳開始信号及び必要に応じてリプレッサー遺伝子
を含んでいる。発現タンパク質を分泌させるために、
「シグナル配列（signal sequence）」を、遺伝子のコ
ード配列の前に挿入してもよい。制御配列方向の発現の
場合、本発明により処理されるべき標的遺伝子を、適当
な読み取り枠の制御配列に適切に結合する。プラスミド
ベクターに組み込むことのでき、そして変異体ズブチリ
シン遺伝子の転写を補助することのできるプロモーター
配列は、原核βラクタマーゼプロモーター〔ビラーカマ
ロフ（Villa−Kamaroff）等、1978年、プロク・ナトル
・アカド・サイ（Proc.Natl.Acad.Sci.）、米国、75:37
27〜3731〕と、tacプロモーター〔デボア（DeBoer）
等、1983年、プロク・ナトル・アカド・サイ（Proc.Nat
l.Acad.Sci.）、米国、80:21〜25〕を含むが、これらに
限定されない。このことについては、「組み換えバクテ
リア由来の有用なタンパク質（Usuful proteins from r
ecombinant bacteria）」、1980、242;74〜94にも記載
がある。

一実施態様によれば、枯草菌は、変異DNAを担持してい
る発現ベクターにより形質転換される。もし発現が枯草
菌等の分泌微生物中で起こる場合には、シグナル配列を
翻訳開始シグナルの後で且つ意図するDNA配列に先立つ
ようにする。シグナル配列は、発現産生物を細胞壁まで
輸送する役割を果たし、分泌にともない産生物から開裂
する。上記で使用した用語「制限配列（control sequen
ce）」は、シグナル配列が存在する場合にはそれを含
む。

5.4.変異体ズブチリシンのスクリーニング変異体をスクリーニングするために、形質転換した枯草
菌を、濾材（ニトロセルロース等）の存在下で培養でき
る。この場合、分泌した発現産生物（例えば、酵素）が
濾材に結合する。所望の特性を有する発現産生物をスク
リーニングするために、意図する発現産生物と野生型発
現産生物とを識別できる条件下にフィルターに結合した
産生物を置く。逆処理して酵素活性が保持されていると
きには、変異により酵素の安定性が高まり、したがっ
て、その変異が有用であることを示している。

本発明の一実施態様において、安定な変異株のスクリー
ニングを、変異株プラスミドで形質転換したプロテアー
ゼ欠乏枯草菌株を用いて行い、以下のようにプレーティ
ングする。ニトロセルロースフィルターをペトリ皿内の
栄養基剤上に配置し、そして酢酸セルロールフィルター
をニトロセルロースの上部に配置する。コロニーが酢酸
セルロース上に成長し、個々のコロニーからプロテアー
ゼが酢酸セルロースを通過してニトロセルロースフィル
ター上に分泌され、そこで安定に結合する。何百ものコ
ロニーからプロテアーゼが単一のフィルターに結合する
ので、続いて多数のフィルターを処理することにより何
千もの異なる変異株がスクリーニングできる。

熱安定性が高まったズブチリシンを産生しているコロニ
ーを同定ずるために、フィルターを、実質的に全ての野
性型活性を不活性化する温度において、緩衝液中でイン
キュベーションできる。安定性又は活性が高まった変異
株は、この工程の後でも活性を保持している。次に、適
当に処理したフィルターを、トシル−Ｌ−Argメチルエ
ステル（TAME）ベンゾリ−Arg−エチルエステル（BAE
E）、アセチル−Tyr−エチルエステル（ATEE）（シグマ
社製）又はこれに類似の化合物を含有している溶液に浸
漬する。TAME,BAEE及びATEEはプロテアーゼに対して基
質であるので、処理後に活性状態のままである変異ズブ
チリシンを含有しているフィルター上で開裂する。開裂
が生じるとともに、反応でプロトンが放出され、プロテ
アーゼ活性を保持している領域でフェノールレッドの色
が赤から黄色に変化する。

この操作を使用して、わずかにしか変更していない異種
の変異株をスクリーニングできる。例えば、フィルター
を、高温、高pHで、変性剤、酸化剤を用いるか、通常プ
ロテアーゼ等の酵素を不活性化して耐性のある変異株を
見つけ出す他の条件下で処理する。基質特異性が変化し
た特異株は、TAME,BAEE又ははATEEの代わりに、通常野
性型ズブチリシンにより開裂されない他の基質を用いる
ことによりスクリーニングできる。安定性が高まった変
異株をスクリーニングで同定したら、変異株を得たコロ
ニーを単離し、変異したズブチリシンを精製する。精製
酵素について実験を行い、酸化、熱不活性化、変性温
度、動的パラメーターに対する安定性だけでなく、他の
物理的測定値の条件も測定した。変異遺伝子の配列決定
を行って、安定性の向上をもたらすアミノ酸の変化を測
定することもできる。この操作法を用いて、洗浄性の向
上した変異株を単離した。

6.実施例：ズブチリシン遺伝子の部位特異的変異による
有用な化学的特性を有する変異体の生成 6.1.材料及び方法 6.1.1.細菌株 B.ズブチリス（B.subtilis）309及び147は、バシラス
レンタス（Bacillus lentus）の変異体であり、寄託番
号NCIB10147及びNCIB10309としてNCIBに寄託され、そし
て、1973年３月27日に発行されたアメリカ特許第3,723,
250号（引用により明細書に組込まれる）に記載されて
いる。B.ズブチリスDN497は、アメリカ出願番号第039,2
98号（または引用により明細書に組込まれる）に記載さ
れており、そしてSL438、すなわちBiogenのDr.Kim Hard
yから得られた胞子形成及びプロテアーゼ欠失性株から
の染色体DNAを有するRUB200のaro⁺形質転換体である。
E.コリMC1000r^-m⁺（Casa−daban,M.J.及びCohen,S.N.
（1980）,J,Mol.Biol.138:179〜207）は、従来の方法に
よりr^-m⁺にされ、そしてアメリカ出願番号第039,298号
にも記載されている。

6.1.2.プラスミド pSx50（1987年４月17日に出願されたアメリカ特許出願
第039,298号に記載され、そして引用により明細書に組
込まれている）は、プロモーター−オペレーターP₁O₁,
B.パミラス（B.pumilus）xynB遺伝子及びB.サブチリスx
ylR遺伝子を含む、プラスミドpDN1050の誘導体である。

pSX65（アメリカ特許出願第039,298、前記に記載され
る）は、プロモーター−オペレーターP₂O₂,B.パミラスx
ynB遺伝子及びB.ズブチリスxylR遺伝子を含む、プラス
ミドpDN1050の誘導体である。

第3a図に示されるpSX93は、ポリリンカー配列に挿入さ
れるターミネーターを含むズブチリシン309遺伝子の0.7
KbのXba I−Hind IIIフラグメントを含んで成るpUC13
（Vieira及びMessing,1982,Gene19:259〜268）である。

pSX119は、ポリリンカー中に挿入されるズブチリシン30
9遺伝子のEcoR I−Xba Iフラグメントを有するpUC13で
ある。

pSX62（アメリカ特許出願第039,298号、前記に記載され
る）は、ウシプロキモシン遺伝子とpSX50（前記）中に
挿入されるB.パミラスxynB遺伝子との間の融合遺伝子を
含んで成る、pSX52の誘導体である。pSX62は、プロキモ
シン遺伝子の後ろのpSX52中にE.コリrrnBターミネータ
ーを挿入することによって生成された。

pSX92は、Cla I及びHind IIIで切断されたプラスミドpS
X62（前記）中にズブチリシン309をクローン化すること
により生成され、そしてそのクローン化さたズブチリシ
ン309遺伝子からのDra I−Nhe I及びNhe I−Hins IIIフ
ラグメントの挿入の前、フィルインされた。

6.1.3.ズブチリシンの精製この方法は、ズブチリシン147酵素、ズブチリシン309酵
素又はそれらの突然変異体の10l規模発酵の典型的な精
製に関係する。

およそ8lの発酵ブイヨンを、１のビーカー中で35分
間、5000rpmで遠心分離した。その上清液を、10％酢酸
を用いてpH6.5に調整し、そしてSeitz Supra S100フィ
ルタープレート上で濾過した。

その濾液を、Amicon S1Y10 UF遠心分離機を備えるAmico
n CH2A UFユニットを用いて、約400mlに濃縮した。その
UF濃縮物を遠心分離し、そして濾過し、その後、pH7でB
acitracinアフィニティーカラム上に吸着した。pH7に調
整された、0.01Mのジメチルグルタル酸、0.1Mの硼酸及
び0.002Mの塩化カルシウムを含む緩衝溶液中、25％の２
−プロパノール及び1Mの塩化ナトリウム溶液を用いて、
プロテアーゼをBacitracinカラムから溶離した。

Bacitracin精製段階からのプロテアーゼ活性を有する画
分を組合し、そして0.01Mのジメチルグルタル酸、0.2M
の硼酸及び0.002Mの塩化カルシウムを含む、pH6.5に調
整された緩衝液により平衡化された750mlのSephadex G2
5カラム（直径5cm）に適用した。

Sephadex G25カラムからのタンパク質分解活性を有する
画分を組合し、そして0.01Mのジメチルグルタル酸、0.2
Mの硼酸及び0.002Mの塩化カルシウムを含む、pH6.5に調
整された緩衝液により平衡化された150mlのCM Sepharos
e CL6Bカチオン交換カラム（直径5cm）に適用した。

プロテアーゼを、同じ緩衝液（０〜0.2Mの塩化ナトリウ
ム）2l中、０〜0.1M塩化ナトリウムの直線グラジェント
を用いて溶離した。

最終精製段階において、CM Sepharoseカラムからのプロ
テアーゼ含有画分を組合し、そしてGR81F膜（Danish Su
gar Facturies Inc.からの）を備えるAmicon限外濾過セ
ルで濃縮した。

ズブチリシン309及び突然変異体、 Met222〜Ala Gly195〜Glu Asn218〜Ser Arg170〜Tyr Gly195〜Glu、Arg170〜Tyr Gly195〜Glu、Met222〜Ala を、この方法により精製した。

6.1.4.オリゴヌクレオチド合成すべての不適正（ミスマッチ）プライマーを、Applied
Biosystems380A DNA合成機により合成し、そしてポリア
クリルアミドゲル電気泳動（PAGE）により精製した。

6.1.5.酸化安定性の決定精製された酵素を、pH7の0.01Mジメチルグルタル酸及び
0.01Mの過酢酸（pH7）を有する同じ緩衝液により約0.1m
g/mlの酵素含有濃度に希釈する。

両組の希釈溶液を50℃に20分間加熱した。希釈溶液中の
タンパク質分解活性を、加熱処理の前及び後で測定し
た。

6.1.6.タンパク質分解活性についてのアッセイ OPA−カゼイン法タンパク質分解活性を、基質としてカゼインを用いて決
定した。１つのカゼインプロテアーゼ単位（CPU）を、
標準条件、すなわち25℃及びpH9.5で30分間のインキュ
ベーション下で、１分当たり一次アミノ基１ミリモルを
生成する酵素の量（セリン標準液との比較により決定さ
れる）として定義される。

カゼイン（Hammarstein,Merck A.G.,西ドイツにより供
給される）の２％（W/V）溶液を、Britton及びRobinson
（Journ.Chem.Soc.1931,1451ページ）により記載され
る、pH9.5に調整されたUniversal Butterにより調製し
た。

基質溶液2mlを、水浴中で10分間25℃で予備インキュベ
ートした。Britton−Robinson緩衝液（pH9.5）1ml当た
り約0.2〜0.3CPUを含む酵素溶液1mlを添加した。25℃で
の30分間のインキュベーションの後、その反応を、停止
剤（脱イオン水により500mlまで希釈された、トリクロ
ロ酢酸17.9g、酢酸ナトリウム29.9g及び酢酸19.8gを含
む溶液5ml）の添加により停止せしめた。ブランクを、
試験溶液として同じ方法で調製した。但し、停止剤は、
酵素溶液の前に添加された。

反応混合物を、水浴中に20分間保持し、その後それらを
Whatman濾紙を通して濾過した。

一次アミノ基を、ｏ−フタルジアルデヒド（OPA）によ
るそれらの色の展開により決定した。

四硼酸＝ナトリウム10水和物（7.62g）及びドデシル硫
酸ナトリウム（2.0g）を、水150mlに溶解した。次に、
メタノール4ml中に溶解されたOPA（160mg）を、β−メ
ルカプトエタノール400mlと共に添加し、その後、その
溶液を水により200mlにした。

OPA試薬（3ml）に、上記濾液40μｌを添加し、そして混
合した。340nmでの光学密度を、約５分後に測定した。

OPA試験をまた、Britton−Robinson緩衝液（pH9.5）100
mlにセリン10mgを含むセリン標準液により行なった。緩
衝液を、ブランクとして使用した。

プロテアーゼ活性を、次の式により光学密度測定値から
計算した：ここで、0D_t,0D_b；0D_ser及び0D_Bは、試験溶液、ブラン
ク、セリン標準液及び緩衝液の光学密度であり、C
_serは、標準液中でのセリンの濃度mg/mlであり、μW_ser
はセリンの分子量である。Ｑは、酵素溶液のための希釈
係数（この場合、８に等しい）であり、そしてt_iはイン
キュベーション時間（分）である。

次の表Ｖにおいては、上記アッセイからの結果が、親酵
素に比較して示される。

6.1.7.洗浄性についてのアッセイ試験布（7cm×7cm、約1g）を、ホウレンソウのジュース
（新鮮なホウレンソウから生成された）を含む、Mathis
Washing及びDrying UnitタイプTH（Werner Mathis AG,
Zurich、スイス）の容器を通して及び次に、過剰のホウ
レンソウのジュースを除去するためにその機械の圧力ロ
ールを通して所望する綿（100％綿、DS71）の布を通す
ことによって製造した。

最後に、その布を、室温で強い空気流下で乾燥せしめ、
室温で３週間保存し、そして続いて、使用する前、−18
℃で保持した。

試験は、Terg−Ｏ−tometer試験洗浄機（Jay C.Harris
“Detergency Evaluation and Testing",Interscience
Publishers Ltd.,1954,60〜61ページに記載される）に
より、10分間、100rpmで恒温で行なわれた。洗剤とし
て、次の標準粉末洗剤を使用した： LAS,Nansa S80 0.4 g/l AE,Beral 0 65 0.15g/l 石ケン 0.15g/l STPP 1.75g/l 珪酸ナトリウム 0.40g/l CMC 0.05g/l EDTA 0.01g/l Na₂SO₄ 2.10g/l 過硼酸塩 1.00g/l TAED 0.10g/l ここで、TAED＝N,N,N′,N′−テトラアセチル−エチレ
ンジアミン;pHは4NのNaOHにより9.5に調整された。使用
される水は、約９のGH（Gernan Hardness）であった。

試験は、0,0.05及び0.1CPU/lの酵素濃度で行なわれ、そ
して２つの独立した組の試験が、個々の突然変異体のた
めに行なわれた。

８枚の布が、洗剤の１つのビーカー（800ml）を用いて
個々の試験のために使用された。それらの布のうち、４
枚はきれいで、そして他の４枚はホウレンソウのジュー
スにより汚された。洗浄に続いて、それらの布を、バケ
ツの中で25分間、水道水によりフラッシュした。

次に、それらの布を一晩、空気乾燥せしめ（日光に対し
て保護された）、そして規約反射率、Ｒを、460nmでDat
acolorS.A.,Dietkikon、スイスからのE1REPH02000分光
光度計により決定した。

洗浄能力示差規約反射率の尺度として、ΔＲを使用し、
ΔＲは、添加された酵素による洗浄後の規約反射率−酵
素添加によらない洗浄後の規約反射率に等しい。

6.1.8.熱安定性についてのアッセイ洗浄性についての上記方法と同じ方法が、それぞれ40℃
及び60℃での試験を行なうことによって、生成された突
然変異体の熱安定性を評価するために使用された。

6.2.結果 6.2.1.ズブチリシン309及び147遺伝子のクローニング “309"株からの染色体DNAを、37℃で30分間、リゾチー
ムにより、及び次に60℃で５分間、SDSにより細胞懸濁
液を処理することにより単離した。続いて、その懸濁液
を、フェノールクロロホルム（50:50）により抽出し、
エタノールにより沈澱せしめ、そしてその沈殿物をTEに
再溶解した。この溶液を、37℃で１時間、RNaseにより
処理した。

約30μｇの染色体DNAを、制限酵素San3A（New England
Biolabs）により一部消化し、そして約1.5kb〜約6.5kb
のフラグメントを、１％アガロースゲルからDEAEセルロ
ース紙上で単離した（他の種のズブチリシン遺伝子は約
1.2kbの長さである）。

第１図に概略されるように、そのフラグメントをアニー
ルし、そしてBamH Iにより切断されたプラスミドpSX50
（1987年４月17日に出願されたアメリカ特許出願第039,
298号に記載される、これは引用により組込まれる）に
連結した。次に、そのプラスミドを、コンピテントB.ズ
ブチリスDN497中に形質転換せしめた。

次に、その細胞を、10mMのリン酸塩pH7、６μl/mlのク
ロラムフェニコール及び0.2％のキシロースを含むLB寒
天プレート上に広げ、プラスミドにおけるxyn−プロモ
ーターを誘発した。そのプレートはまた、プロテアーゼ
産生形質転換体を、スキンミルクが分解された場所での
透明なかさにより検出するために、１％スキンミルクも
含んだ。

プロテアーゼ発現クローンを、10^-4の頻度で生成した。
２種のクローンは、ズブチリシン309のための遺伝子を
担持するプラスミド、pSX86及びpSX88を有することが見
出された。次に、その遺伝子を、Maxam及びGilbertの方
法を用いて配列決定した。ズブチリシン309の推定され
るヌクレオチド配列は、第II表に示される。

上記と同じ方法が、ズブチリシン147遺伝子のクローニ
ングのために使用された。但し、DANフラグメンを、プ
ラスミドpSX56（アメリカ特許出願第039,298号、前記に
また記載される）中に連結し、そしてこれは、第２図に
示されるように、xynプロモーターの代わりに、xylプロ
モーターを有する。１つのクローンは、ズブチリシン14
7のための遺伝子を担持するプラスミドpSX94を有するこ
とが見出された。この遺伝子のための配列は、下記第II
I表に示される。

6.6.2.ズブチリシン309遺伝子の部位（サイト）特異的
突然変異の発生部位特異的突然変異はMorinagaらの方法（特にBiotechn
ology）により行なわれた。この突然変異をおこすため
以下のオリゴヌクレオチドが用いられた。

ａ）Gly−195Glu: 27マーミスマッチプライマー、NOR−237、これは新規Sa
c I制限サイトを形成する。

ｂ）Gly−195Aap: 23マーミスマッチプライマー、NOR−323、これは新規Bg
l IIを形成する。

ｃ）Met−222Gys: 24マーミスマッチプライマー、NOR−236 ｄ）Met−222Ala: 22マーミスマッチプライマー、NOR−235 このプライマーは両方ともCla Iサイトを破壊する。

ｅ）Ser−153Ala: 18マーミスマッチプライマー、NOR−324、これは新規Pv
u IIサイトを形成する。

ｆ）Asn−218Ser: 23マーミスマッチプライマー、NOR−325、これは新規Ms
p Iサイトを形成する。

ｇ）Thr−71Asp: 23マーミスマッチプライマー、NOR−483、ｈ）Met−222Cys及びGly−219Cys: 32マーミスマッチ、NOR−484、ｉ＋ｊ）Gly−195Glu及びMet−222Ala又はMet−222Cys: この二重変異体に対し１個の変異体DNAフラグメントを
結合することによりNOR−237及びNOR−235又はNOR−236
の結合を行った。

ｋ）Sar−153Ala及びAsn−218Ser: 上記と同様にNOR−324及びNOR−325の結合を行った。

鋳型としてプラスミドpSX93を用いて開裂重複突然変異
を行った。pSX93は第3a図及び第3b図に示してあり、ポ
リアンカーに挿入されたターミネーターを含むズブチリ
シン309遺伝子の0.7kb Xba I−Hind IIIフラグメントを
含むpUC13である（Visira,J.及びMessing J:1982,Gene1
9:259〜268）。このターミネーター及びHind IIIサイト
は第四表に示されていない。

酵素のＮ端部において突然変異を行なうためプラスミド
pSX119を用いた。pSX119はポリリンカーに挿入されたズ
ブチリシン309遺伝子のEcoR I−Xba Iフラグメントを有
するpUC13である。こうして鋳型pSX93及びpSX119はズブ
チリシン309遺伝子全体をカバーする。

突然変異ａ）,b）、及びｅ）は第3a図に示すようにXba
I及びCla IによりpSX93を切断することにより行ない、
ｃ）,d）,f）、及びｈ）は第3b図に示すようにXba I及
びHind IIIによりpSX93を切断することにより行った。

突然変異ｇ）はEcoR I及びXba Iにより切断することに
よりpSX119において行った。

重複突然変異体ｉ）及びｊ）はａ）からの0.7kb Xba−H
ind IIIフラグメントをHgiA Iにより一部切断すること
により形成された（HgiA Iは突然変異により形成された
Sac Iも切断する）。それぞれｃ）及びｄ）突然変異か
らの180bp Xba I−HgiA Iフラグメント及び0.5kb HgiA
IフラグメントはpSX93からの大きなHind III−Xba Iフ
ラグメントに縛られた。

重複突然変異体ｋ）は突然変異体ｅ）及びｆ）を結合す
ることにより形成された。

アニーリング、フィリング及び連結反応後、混合物をE.
Coli MC1000r^-m⁺の形質転換に用いた。形質転換細胞の
中の突然変異体をVlasukら1983,J.Biol.Chem.258,7141
〜7148及びVlasuk G.P.及びInouyeら、p.292〜303,「Ex
perimental Manipulation of Gene Expression"Academi
c Press,New Yorkに記載されているようにしてコロニー
ハイブリッド法によりスクリーニングした。突然変異体
はDNA配列により確認された。

6.2.3.変異ズブチリシンの表示正確な突然変異の配列確認後、突然変異DNAフラグメン
トをプラスミドpSX92に挿入し、これを突然変異体の形
成に用いた。

プラスミドpSX92は第４図に示されており、Cla Iで切断
され、DNAポリメラーゼＩのKlenowフラグメントで満た
され、及びクローニングされたSub309遺伝子からのフラ
グメントDra I−Nhe I及びNhe I−Hind IIIの挿入前にH
ind IIIで切断されたプラスミドpSX62にSub309遺伝子を
クローニングすることにより形成された。

突然変異体を示すため、突然変異フラグメント（Xba I
−Cla I、Xba I−Hind III、又はEcoR I−Xba I）を適
当な突然変異プラスミドpSX93又はpSX119より切り出しp
SX92に挿入した。

次いでB.ズブチリス株DN497を形質転換するため突然変
異pSX92を用い、親遺伝子のクローニングに用いた同じ
培地及び同じ条件において増殖させた。

適当に増殖後、突然変異酵素を回収し精製した。

6.2.4.変異ズブチリシンの酸化安定性突然変異体ａ）及びｂ）を50℃及びpH7において20分後
0.01M過酢酸中のその酸化安定性についてテストした。

結果を表IVに示すが、これはオキシダントもしくは熱に
より未処理のサンプルに対する熱処理したサンプルの残
留蛋白分解活性を示している。

突然変異体ｄ（Met222Ala）が親酵素及び突然変異体ａ
にくらべすぐれた酸化安定性を示すことがわかる。

ｇ）及びｈ）を除くすべての突然変異体を室温及び35
℃、pH6.5及び9.0、15分〜２時間100〜500ppm次亜塩素
酸塩で処理した。

このテストは、突然変異体ｃ）,d）,i）、及びｊ）（す
べてMet−222）が他の突然変異体よりも３〜５倍次亜塩
素酸塩に耐えることを示した通常のタイプの液体洗剤でテストした場合、突然変異体
ｆ）が他の突然変異体及び親酵素と比較してすぐれた安
定性を示すことがわかった。

6.2.5.変異ズブチリシンの蛋白質分解活性前記方法に従い、蛋白質基質としてのカゼインに対し種
々の突然変異体の蛋白質分解活性をテストした。結果を
表Ｖに示す。

この表より突然変異体ａ）が親にくらべ高い活性を示す
ことがわかる。また、Met−222突然変異体が親よりも活
性が低いこともわかるが、その改良された酸化安定性の
ためオキシダントを含む洗浄における使用は除外されな
い。

表Ｖ突然変異ズブチリシンの蛋白質分解活性突然変異体比活性無 100 ａ） 120 ｂ） 100 ｃ） 30 ｄ） 20 ｅ） 100 ｆ） 100 ｉ） 20 ｊ） 30 6.2.6.変異ズブチリシンの洗浄性前記方法に従い、ホウレンソウジュースに対し種々の突
然変異体の洗浄性をテストした。結果を表VIに示す。

この表より、テストした突然変異体はすべて親酵素と比
較して改良された洗浄能を有し、突然変異体ｃ）,d）,
i）、及びｊ）は特にすぐれていることがわかる。

表 VI 突然変異体の洗浄性突然変異体濃度（CPU/l） 0.05 0.1 無 14.4 20.4 ａ） 18.8 21.5 ｂ） 16.9 19.7 ｃ） 21.8 23.8 ｄ） 22.2 23.4 ｅ） 15.4 21.8 ｆ） 16.6 19.3 ｉ） 21.6 22.1 ｊ） 20.6 22.6 6.2.7.変異ズブチリシンの熱安定性 40℃及び60℃において洗濯適性テストを用いることによ
り野生タイプ酵素に対し突然変異体ｆ）の熱安定性をテ
ストした。結果を表VIIに示す。

この表より、突然変異体ｆ）は60℃において野生タイプ
酵素にくらべ改良された洗濯適性を示すが、40℃では突
然変異体ｆ）の洗濯適性は野性タイプ酵素よりわずかの
みすぐれていることがわかる。

6.3.考察ズブチリシン遺伝子を、細菌バシラスレンタス（Bacill
us lentus）の147および309突然変異体からクローン化
し、クローン化した遺伝子を配列させた。ズブチリシン
147および309突然変異体の推定アミノ酸配列と、他のズ
ブチリシンの配列と比較することにより、突然変異の
際、親酵素の物理的特性を変え得るサイトは同一であっ
た。ズブチリシン309遺伝子内において、これらのいく
つかのサイトで突然変異を生じさせるためサイト特異性
変異誘発を用いた。得られた突然変異体の酵素を、バシ
ラス菌株内で発現させ、次いで種々の物理的および化学
的パラメータを試験した。幾つかの突然変異体は、親ズ
ブチリシン309酵素と比較して酸化に対する改良された
安定性、改良されたタンパク質分解能又は改良された洗
浄性を有することを示した。これらの突然変異体は、洗
剤組成物中に含まれる酵素中で望ましい特性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ノリス，ファニイデンマーク国，デーコー‐2900 ヘルレルプ，アールマンスアレ 34 (72)発明者ペーターセン，ステフェンベーデンマーク国，デーコー‐2750 バルレルプ，スネペホイ 15 (72)発明者ネールスコウーラウリドゥセン，レイフデンマーク国，デーコー‐4600 ケーエ, ビルケベイ 10 (72)発明者イエンセン，ビリヨハネスデンマーク国，デーコー‐2880 バクスバエルト，スコウキルデン６ (72)発明者アースリング，ドリトデンマーク国，デーコー‐4000 ロスキルデ，スボゲルスレウ，フィアン８ (56)参考文献特開平１−85075（ＪＰ，Ａ) 特表昭63−502396（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，84（1987）Ｐ．1219−1223 Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，193（1987) Ｐ．803−813

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】第Ｉ表（ａ）で記載された如きアミノ酸配
列を含んでなる突然変異体ズブチリシン酵素309。
【請求項２】次の位置： 6,9,11−12,19,25,36−38,53−59,67,68,71,89,104,11
1,115,120,121−122,124,128,131,140,153−166,168,16
9−170,172,175,180,182,186,187,191,194,195,199,21
8,219,222,226,234−238,241,260−262,265,268、また
は275 の１個所またはそれ以上の個所のアミノ酸残基が、他の
アミノ酸残基により置換されている請求の範囲第１項記
載の突然変異体のズブチリシン酵素309。
【請求項３】アミノの酸が次の位置:36,56,159もしくは
164〜166の１個所またはそれ以上で挿入されている請求
の範囲第２項記載の突然変異体のズブチリシン酵素30
9。
【請求項４】６位のトリプトファン残基が、チロシンに
よって置換されている、請求の範囲第２項記載の突然変
異体のズブチリシン酵素309。
【請求項５】67位のヒスチジン残基が、グルタミン酸も
しくはアスパラギン酸で置換されている請求の範囲第２
項記載の突然変異体のズブチリシン酵素309。
【請求項６】68位のバリン残基が、システインもしくは
メチオニンで置換されている請求の範囲第２項記載の突
然変異体のズブチリシン酵素309。
【請求項７】71位のトレオニン残基が、アスパラギン酸
もしくはグルタミン酸で置換されている請求の範囲第２
項記載の突然変異体のズブチリシン酵素309。
【請求項８】153位のセリン残基が、アラニンで置換さ
れている請求の範囲第２項記載の突然変異体のズブチリ
シン酵素309。
【請求項９】168位のプロリン残基が、アラニンによっ
て置換されている、請求の範囲第２項記載の突然変異体
のズブチリシン酵素309。
【請求項１０】170位のアルギニン残基が、チロシンで
置換されている請求の範囲第２項記載の突然変異体のズ
ブチリシン酵素309。
【請求項１１】175位のメチオニン残基が、イソロイシ
ンで置換されている請求の範囲第２項記載の突然変異体
のズブチリシン酵素309。
【請求項１２】195位のグリシン残基が、グルタミン酸
もしくはアスパラギン酸で置換されている請求の範囲第
２項記載の突然変異体のズブチリシン酵素309。
【請求項１３】218位のアスパラギン残基が、セリンで
置換されている請求の範囲第２項記載の突然変異体のズ
ブチリシン酵素309。
【請求項１４】219位のグリシン残基が、メチオニンに
よって置換されている、請求の範囲第２項記載の突然変
異体のズブチリシン酵素309。
【請求項１５】222位のメチオニン残基が、システイン
もしくはアラニンで置換されている請求の範囲第２項記
載の突然変異体のズブチリシン酵素309。
【請求項１６】275位のアルギニン残基が、グルタミン
で置換されている請求の範囲第２項記載の突然変異体の
ズブチリシン酵素309。
【請求項１７】19位のアルギニン残基が、グリシンで置
換されておりさらに219位のグリシン残基がシステイン
で置換されている請求の範囲第２項記載の突然変異体の
ズブチリシン酵素309。
【請求項１８】153位のセリン残基が、アラニンで置換
されておりさらに218位のアスパラギン残基がセリンで
置換されている請求の範囲第２項記載の突然変異体のズ
ブチリシン酵素309。
【請求項１９】195位のグリシン残基が、グルタミン酸
で置換されており更に222位のメチオニン残基がアラニ
ンもしくはシステインによって置換されている、請求の
範囲第２項記載の突然変異体のズブチリシン酵素309。
【請求項２０】219位のグリシン残基がシステインで置
換されており、更に222位のメチオニン残基がシステイ
ンで置換されている請求の範囲第２項記載の突然変異体
のズブチリシン酵素309。
【請求項２１】アミノ酸配列が第Ｉ表（ｂ）に実質的に
記載される如きアミノ酸配列を含んでなる突然変異体の
ズブチリシン酵素147。
【請求項２２】次の位置： 6,9,11−12,19,25,36−38,53−59,67,68,71,89,111,11
5,120,121−122,124,128,131,140,153−166,168,169−1
70,172,175,180,182,186,187,191,194,195,199,218,21
9,222,226,234−238,241,260−262,265,268もしくは27
5、の１個所またはそれ以上の個所のアミノ酸残基が他のア
ミノ酸残基によって置換されている請求の範囲第21項記
載の突然変異体のズブチリシン酵素147。
【請求項２３】１種もしくはそれ以上のアミノ酸残基
が、次の位置:36,56,159または164〜166の１個所または
それ以上の個所で挿入されている、請求の範囲第22項記
載の突然変異体のズブチリシン酵素147。
【請求項２４】６位のトリプトファン残基がチロシンで
置換されている請求の範囲第22項記載の突然変異体のズ
ブチリシン酵素147。
【請求項２５】67位のヒスチジン残基が、グルタミン酸
もしくはアスパラギン酸によって置換されている、請求
の範囲第22項記載の突然変異体のズブチリシン酵素14
7。
【請求項２６】68位のバリン残基が、システインもしく
はメチオニンで置換されている請求の範囲第22項記載の
突然変異体のズブチリシン酵素147。
【請求項２７】71位のトレオニン残基が、アスパラギン
酸もしくはグルタミン酸で置換されている請求の範囲第
22項記載の突然変異体のズブチリシン酵素147。
【請求項２８】153位のアラニン残基が、セリンで置換
されている請求の範囲第23項記載の突然変異体のズブチ
リシン酵素147。
【請求項２９】168位のプロリン残基が、アラニンで置
換されている請求の範囲第22項記載の突然変異体のズブ
チリシン酵素147。
【請求項３０】170位のアルギニン残基が、チロシンに
よって置換されている、請求の範囲第22項記載の突然変
異体のズブチリシン酵素147。
【請求項３１】175位のメチオニン残基が、イソロイシ
ンで置換されている請求の範囲第22項記載の突然変異体
のズブチリシン酵素147。
【請求項３２】195位のグリタミン酸残基が、アスパラ
ギン酸もしくはグリシンで置換されている請求の範囲第
22項記載の突然変異体のズブチリシン酵素147。
【請求項３３】218位のセリン残基が、アスパラギンで
置換されている請求の範囲第22項記載の突然変異体のズ
ブチリシン酵素147。
【請求項３４】219位のグリシン残基が、メチオニンで
置換されている請求の範囲第22項記載の突然変異体のズ
ブチリシン酵素147。
【請求項３５】222位のメチオニン残基が、システイン
もしくはアラニンで置換されている請求の範囲第22項記
載の突然変異体のズブチリシン酵素147。
【請求項３６】275位のグルタミン残基が、アルギニン
によって置換されている、請求の範囲第22項記載の突然
変異体のズブチリシン酵素147。
【請求項３７】19位のアルギニン残基が、グリシンで置
換され、さらに219位のグリシン残基がシステインで置
換されている請求の範囲第22項記載の突然変異体のズブ
チリシン酵素147。
【請求項３８】153位のアラニン残基が、セリンで置換
され、さらに218位のセリン残基がアスパラギンで置換
されている請求の範囲第22項記載の突然変異体のズブチ
リシン酵素147。
【請求項３９】195位のグルタミン酸残基が、グリシン
で置換され、更に222位のメチオニン残基がアラニンも
しくはシステインで置換されている請求の範囲第22項記
載の突然変異体のズブチリシン酵素147。
【請求項４０】219位のグリシン残基がシステインで置
換され、さらに222位のメチオニン残基がシステインで
置換されている請求の範囲第22項記載の突然変異体のズ
ブチリシン酵素147。
【請求項４１】第Ｉ表（ａ）に記載される如きアミノ酸
配列を含んでなるズブチリシン酵素をコードするヌクレ
オチド配列を含んでなる組換えDNA分子。
【請求項４２】第Ｉ表（ｂ）に記載される如きアミノ酸
配列を含んでなるズブチリシン酵素をコードするヌクレ
オチド配列を含んでなる組換えDNA分子。
【請求項４３】第II表に記載される如きズブチリシン30
9酵素をコードするヌクレオチド配列を含んでなる組換
えDNA分子。
【請求項４４】第III表に記載される如きズブチリシン1
47酵素をコードするヌクレオチド配列を含んでなる組換
えDNA分子。
【請求項４５】次の位置： 6,9,11−12,19,25,36−38,53−59,67,68,71,89,104,11
1,115,120,121−122,124,128,131,140,153−166,168,16
9−170,172,175,180,182,186,187,191,194,195,199,21
8,219,222,226,234−238,241,260−262,265,268もしく
は275 の１個所もしくはそれ以上の個所の対応するアミノ酸残
基が、他のアミノ酸残基での置換により、または１個も
しくはそれ以上のアミノ酸残基を挿入もしくは欠失によ
り変化されるように核酸配列が変更されている請求の範
囲第41項もしくは第43項記載の組換えDNA分子。
【請求項４６】次の位置： 6,9,11−12,19,25,36−38,53−59,67,68,71,89,104,11
1,115,120,121−122,124,128,131,140,153−166,168,16
9−170,172,175,180,182,186,187,191,194,195,199,21
8,219,222,226,234−238,241,260−262,265,268もしく
は275、の１個所もしくはそれ以上の個所の対応するアミノ酸残
基が、他のアミノ酸残基での置換により、または１個も
しくはそれ以上のアミノ酸残基を挿入もしくは欠失によ
り変化されるように核酸配列が変更されている請求の範
囲第42項もしくは第44項記載の組換えDNA分子。
【請求項４７】核酸配列が、次の位置:36,56,159、もし
くは164〜166の１個所もしくはそれ以上のアミノ酸残基
が挿入されるように変更されている請求の範囲第41項も
しくは第43項記載の組換えDNA分子。
【請求項４８】核酸配列が、次の位置:36,56,159、もし
くは164〜166の１個所もしくはそれ以上のアミノ酸残基
が挿入されるように変更されている請求の範囲第42項も
しくは第44項記載の組換えDNA分子。
【請求項４９】請求の範囲第１項〜第40項のいずれかに
記載のズブチリシン酵素の製造方法であって、ズブチリ
シン酵素を発現するために請求の範囲第41項〜第48項の
いずれかに記載の組換えDNA分子で形質転換された宿主
細胞を培養し、次いでズブチリシン酵素を回収すること
を特徴とする、前記製造方法。