JPH07165761A

JPH07165761A - 新規生理活性物質ｓｆ２７７１物質及びその製造法

Info

Publication number: JPH07165761A
Application number: JP30893893A
Authority: JP
Inventors: Kazuo Suzuki; 和男鈴木; Mayumi Kawai; 真由美川井; Kunimoto Hotsuta; 国元堀田; Masahiro Hatsu; 正浩発; Akira Shimizu; 明清水; Shoichi Amano; 昭一天野; Satoshi Imai; 敏今井; Masayuki Shibahara; 聖至柴原
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1993-12-09
Filing date: 1993-12-09
Publication date: 1995-06-27

Abstract

(57)【要約】【目的】放線菌の培養法により新規生理活性物質SF2771
物質を提供する。【構成】ストレプトマイセス・エスピー・SF2771株を通
常の微生物が利用し得る栄養物を含有する培地で培養
し、得られた培養物中からカラムクロマト法、ゲル濾過
法等を用いて目的物を単離した。新規生理活性物質SF27
71の分子式はC₉H₁₂N ₂O₂であり、下記の構造式を有す
る。SF2771物質は好中球の腫瘍細胞障害活性を促進す
る。【化３】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規生理活性物質SF2771
物質及びその製造法に関するものである。腫瘍細胞は獲
得免疫に加えて自然免疫によっても排除されると考えら
れており，invitroで好中球による腫瘍細胞の障害がお
こることが知られている。 (Morikawaet al.; Cancer R
es.45 3482(1985))

【０００２】腫瘍細胞に対する好中球やマクロファー
ジ, ナチュラルキラー細胞等の攻撃は各種の免疫強化剤
の他, インターロイキンや単球走化因子等のサイトカイ
ンによっても促進されている。このような腫瘍細胞と食
細胞との相互作用を明らかにすることは癌の悪性化の
他, 細菌感染, 炎症応答のメカニズム等の解明に有用で
ある。また腫瘍細胞と食細胞の相互作用に影響を与える
物質は悪性腫瘍治療や細菌感染症治療, 炎症治療, 免疫
機能改善を目的とした医薬品としての応用が期待されて
いる。

【０００３】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】腫瘍細
胞と好中球の相互作用を観察する系として本発明者ら
は, ヒト肺巨細胞腫瘍LU65C やヒト肺腫瘍A549細胞と好
中球を混合して好中球による腫瘍細胞の障害を測定する
系を確立しており，ヒト肺巨細胞腫瘍LU65C の場合には
分泌されるサイトカイン(LUCT/IL-8) を明らかにすると
ともに好中球走化因子として作用すること及びその遺伝
子構造について報告している。(Suzuki et al.; J.Exp.
Med.169 1895 (1989),Hotta et al.; Immunology Lette
r 24 165(1990))

【０００４】本発明が解決しようとする課題は、ヒト肺
腫瘍A549細胞を標的細胞とし好中球をエフェクターとし
た混合培養系に各種微生物培養液を添加し，好中球によ
る腫瘍細胞障害活性を促進する新規な化合物を見出し、
癌の悪性化の他, 細菌感染,炎症応答のメカニズム解明
に役立つ新しい材料を提供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】腫瘍細胞と食細胞の相互
作用に影響を与える新規な化合物をスクリーニングする
ため、本発明者らは96穴プレート上でヒト肺腫瘍細胞で
あるA549細胞にヒト好中球を粘着させ、各種微生物の培
養液を添加・培養後、クリスタルバイオレット染色にて
生残する腫瘍細胞のコロニー数を測定し、好中球の腫瘍
細胞障害活性に対する添加微生物培養液の影響を評価し
た。ヒト肺腫瘍細胞A549細胞は国立衛生試験所のJCRB細
胞バンクまたは理化学研究所RIKEN Cell Bankから入手
することができる。またヒト好中球は本発明者らの方法
によって容易に調製することが可能である。(Suzuki et
al.; Cell Biochem. Func. 3 297 (1985))

【０００６】本発明者等は、上述したヒト肺腫瘍A549細
胞に粘着させた好中球の混合培養系に各種微生物培養液
を添加し，ストレプトマイセスに属する放線菌の培養液
に好中球による腫瘍細胞の障害促進作用のあることを見
出し、その培養液より活性物質として新規化合物SF2771
物質を単離して本発明を完成した。すなわち本発明は、
ストレプトマイセスに属する放線菌の生産する新規な生
理活性物質SF2771物質及びその製造法に関する。したが
って第１の本発明の要旨とするところは下記の理化学的
性状を有する新規生理活性物質SF2771物質にある。

【０００７】１. SF2771物質の理化学的性状（１）色及び性状無色針状結晶（２）融点 178-180℃ （３）分子式 C₉H₁₂N₂O₂ （４）分子量 EI-MS (m/z) 180 [M]⁺ SI-MS (m/z) 181 [M+H]⁺ HREI-MS (m/z) 計算値 180.0926 実験値 180.0912 （５）比旋光度 [α]_D ²⁵ =＋109.6゜(c=1.O, メタノール）（６）紫外線吸収スペクトル λmax = 225.8 nm（メタノール中）

【０００８】（７）赤外線吸収スペクトル KB
r 錠で測定したスペクトルを

【図１】に示す。（８）核磁気共鳴スペクトル重ジメチルスル
ホキシド中での水素核磁気共鳴スペクトルを

【図２】に、炭素核磁気共鳴スペクトルを

【図３】に示す。（９）溶解性水、メタノール、
酢酸エチル、アセトン、クロロホルムに易溶、ヘキサン
に難溶。（10）呈色反応モリブデン酸、ヨ
ードに陽性、ニンヒドリンに陰性。（11）シリカゲル薄層クロマトグラフィーのRf値ブタノール：酢酸：水(4:1:2) 0.85

【０００９】上記のSF2771物質の理化学的性状及び各種
のスペクトルデータからSF2771物質はC₉H₁₂N₂O₂の分子
式を有し、下記の構造式で示されるジケトピペラジン構
造を有すると推定される。

【００１０】

【化２】しかしながら、これまでに見いだされているジケトピペ
ラジン構造を有する化合物とは構造が異なることからSF
2771物質は新規物質と判定した。

【００１１】２．SF2771物質の生産菌本発明に使用される新規生理活性物質SF2771物質生産菌
の一例としては、東京都の土壌から分離され、ストレプ
トマイセス属に属するStreptomyces sp. SF2771株があ
る。Streptomyces sp.SF2771株の菌学的性状は下記の通
りである。

【００１２】Ｉ．形態基生菌糸は長く伸長し、よく分岐し、通常の条件下では
分断しない。気菌糸はスターチ寒天、オートミール寒
天、イースト・麦芽寒天等で豊富に着生し胞子形成も良
好である。気菌糸の分岐は比較的少なく、車軸分岐は見
られない。気菌糸先端の胞子連鎖は螺旋状ないしカール
状である。電子顕微鏡による観察では、胞子は楕円型〜
円筒型で、0.5〜0.7 x 0.6〜1.3 μｍの大きさを有し、
表面は平滑で通常30〜50個位連鎖する。胞子のう、運動
性胞子、菌核などは観察されていない。

【００１３】II．各種培地上の生育状態 SF2771株の各種培地上の生育状態は次の表１に示す通り
である。色の記載について（）内に示す標準はコンテ
イナー・コーポレーション・オブ・アメリカ（Containe
r Corporation of America）社製の「カラー・ハーモニ
ィ・マニアル（Color Harmony Manual）」に記載のもの
を用いた。観察は28℃で14〜21日培養後に行った。

【００１４】

【表１】培地発育(色は裏面) 気菌糸可溶性色素シュクロース・硝酸塩寒天微弱、なし貧弱、なしグルコース・アスパラギン寒天微弱、なし貧弱、なしグリセロール・アスパラギン寒天良好、なし豊富、白色(a) なしスターチ寒天良好、茶褐色豊富、灰桃色(a-5dc) なしオートミール寒天普通、なし豊富、灰桃色(5dc) なしイースト・麦芽寒天良好茶褐色豊富、灰桃色(5ba) なしチロシン寒天良好、茶褐色豊富、白(13ba) なし栄養寒天良好、なし豊富灰桃色(5ba) なしリンゴ酸・カルシウム寒天普通、なし豊富、なしベネット寒天良好、なし豊富、なし

【００１５】III．生理的性質（１）生育温度範囲：イースト・スターチ寒天において
20〜37℃の温度範囲で生育し、25〜30℃付近で良好に生
育する。（２）ゼラチンの液化：陰性（３）スターチの加水分解：陽性（４）硝酸塩の還元；陽性（５）脱脂乳のペプトン化：陰性脱脂乳の凝固：陰性（６）耐塩性：7%NaCl含有培地では生育するが10%では
生育しない。（７）メラニン様色素の生成：陰性

【００１６】IV．炭素源の利用性（ISPー9培地使用）（１）利用する：Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、
Ｄ−キシロース、グリセロール、Ｌ−アラビノース、Ｄ
−マンニトール、myo−イノシトール、ラフィノース
Ｌ−ラムノース（２）利用しない：シュクロース、Ｖ．菌体分析ベッカー（Becker）らの方法（Appl. Microbiol. 13: 2
36,1965）により分析した結果、全菌体加水分解物中の
ジアミノピメリン酸はＬＬ型であつた。

【００１７】以上の性状より、SF2771株は放線菌の中で
ストレプトマイセス属に属し、気菌糸色調はレッド・シ
リーズ、気菌糸先端は螺旋状〜カール状で、胞子表面は
平滑状、裏面色調は無色〜茶褐色で、顕著な可溶性色素
を生産しない菌株と要約される。本発明者らはＳＦ２７
７１株をストレプトマイセス・エスピー・SF2771（Stre
ptomyces sp. SF2771）と命名した。なお、本菌株は工
業技術院生命工学工業技術研究所に、FERM P-13884とし
て寄託されている。

【００１８】SF2771株は他の放線菌に見られるように、
その性状が変化しやすい。例えば、SF2771株、またはこ
の株に由来する突然変異株（自然発生または誘発性）、
形質接合体または遺伝子組換え体であっても、生理活性
物質SF2771を生産するものは全て本発明に使用出来る。
本発明の方法では、前記の菌を通常の微生物が利用しう
る栄養物を含有する培地で培養する。栄養源としては、
従来放線菌の培養に利用されている公知のものが使用で
きる。例えば、炭素源として、グルコース、水あめ、
デキストリン、澱粉、糖みつ、動・植物油等を使用しう
る。また窒素源として、大豆粕、小麦胚芽、コーンステ
ィープリカー、綿実粕、肉エキス、ペプトン、酵母エキ
ス、硫酸アンモニウム、硝酸ソーダ、尿素等を使用しう
る。その他、必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カル
シウム、マグネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸、
およびその他のイオンを生成することができる無機塩類
を添加することは有効である。また菌の発育を助け、生
理活性物質SF2771の生産を促進するような有機および無
機物を適当に添加することができる。

【００１９】培養法としては、好気的条件での培養法、
特に深部培養法が最も適している。培養に適当な温度は
25〜30℃であるが、多くの場合、28℃付近で培養する。
新規生理活性物質SF2771物質の生産は培地や培養条件に
より異なるが、振とう培養、タンク培養のいずれにおい
ても通常2〜7日の間でその蓄積が最高に達する。培養
中の新規生理活性物質SF2771物質の蓄積量が最高になっ
た時に培養を停止し、培養液から目的物質を単離精製す
る。

【００２０】以下に本発明の実施例を示すが、これらは
単なる一例であって本発明を限定するものではない。こ
こに例示しなかった多くの変法あるいは修飾手段を用い
うることは勿論のことである。

【００２１】３. SF2771物質の精製法かく生産されるSF2771物質は前記する理化学的性状を有
するので、その性状に従って培養液から精製することが
可能であるが、特に以下の方法により効率的に精製でき
る。

【００２２】すなわち、有効成分を含む培養物から固形
物を濾別し濾液と固形物に分ける。濾液は活性炭で処理
して活性物質を樹脂に吸着する。ついでアセトン等の適
当な溶媒にて溶出し、溶出液を減圧濃縮することにより
溶媒を留去し、水溶液とする。この水溶液を吸着樹脂ダ
イアイオンHP20あるいはセパビーズSP207 （三菱化成社
製）で処理して活性物質を樹脂に吸着する。ついでメタ
ノール等の適当な溶媒にて溶出し、溶出液を減圧濃縮す
ることにより活性粗粉末を得る。この粗粉末をセファデ
ックスG-10（ファルマシア社製）を用いてゲルろ過を行
い、得られた活性溶液を濃縮した後、結晶化することに
より、SF2771物質を単離する。

【００２３】SF2771物質の検定に当たっては、本物質に
よる好中球の腫瘍細胞に対する細胞障害活性増強能を測
定する生物学的検定法及びシリカゲル薄層クロマトグラ
フィーやHPLCによる化学的検定法を用いることができ
る。以下に本発明の実施例を示すが、これは単なる一例
であって本発明を限定するものではない。ここに例示し
なかった多くの変法あるいは修飾手段を用い得ることは
勿論のことである。

【００２４】

【実施例】種培地として、スターチ 2.0％、グルコース
1.0％、ポリペプトン 0.5％、小麦胚芽 0.6％、酵母エ
キス 0.3％、大豆粕 0.2％および炭酸カルシウム0.2
％、（殺菌前 pH7.0）の組成からなる培地を用いた。ま
た、生産培地として、水飴 2.0％、大豆油 0.15％、大
豆粕 1.0％、サングレイン 0.25％、ファーマメヂイア
0.5％、硫酸第一鉄 0.001％、塩化ニッケル0.0001％、
塩化コバルト 0.0001％、炭酸カルシウム 0.15％（殺菌
前 pH7.0）の組成からなる培地を用いた。

【００２５】前記の種培地 20mlを分注した 100ml容三
角フラスコを121℃で20分間殺菌し、これにストレプト
マイセス・エスピー・SF2771株（FERM P-13884）の斜面
寒天培養の2〜3白金耳を接種し、28℃で24時間振盪培養
し、第１種培養とした。次いで、種培地 80mlを分注し
た 500ml容三角フラスコを 121℃で30分間殺菌し、前記
第１種培養4mlを接種し、28℃で24時間振盪培養し、こ
れを第２種培養とした。

【００２６】予め、121℃で30分間殺菌した 6Ｌの生産
培地を含む 10Ｌ容ジャーファーメンターに、前記の第
２種培養を 300ml接種し、28℃で3日間通気（17.5Ｌ／
分）、撹拌 300rpmで培養した。培養終了後、濾過助剤
として珪藻土を加えて濾過した。

【００２７】こうして得られた濾液 50 Ｌを活性炭5Ｌ
の塔にかけ有効成分を吸着させた後、水 30 Ｌで洗浄
後、50％アセトン水（ｐＨ 2.5） 15 Ｌにより有効成分
を溶出した。さらに、溶出液から減圧濃縮によりアセト
ンを留去した水層 10 ＬをダイヤイオンHP20（三菱化成
社製）3Ｌの塔にかけ有効成分を吸着させた後、水 10Ｌ
で洗浄後、50%アセトン水（ｐＨ 2.5） 5Ｌにより有効
成分を溶出した。さらに、溶出液から減圧濃縮によりア
セトンを留去した水層 3ＬをセパビーズSP207（三菱化
成社製）500mlの塔にかけ有効成分を吸着させた後、水
4Ｌ洗浄後、50％アセトン水 2Ｌにより有効成分を溶出
した。溶出画分のSF2771物質はＨＰＬＣ（カラム；ラジ
アルパック 5C18（ウオーターズ社製）、展開溶媒；
20％メタノール水、流速；1 ml/min、検出；250 nm）で
検出した。

【００２８】得られた活性画分を合わせて減圧下にて濃
縮、凍結乾燥し、4.6 gの活性粗粉末を得た。この粉末
を少量の水に溶解し、水にて充填したセファデックスG-
10（ファルマシア社製）1800mlの塔にかけ、水で展開し
て活性画分を得た。この活性画分を少量にまで濃縮し、
この濃縮液よりSF2771物質を粗結晶として、620 mg単離
した。さらに、この粗結晶を水中より再結晶することに
よりSF2771物質を無色針状結晶の純品として得た。

【００２９】

【試験例】採取されたSF2771物質をヒト肺腫瘍A549細胞
に好中球を粘着させた混合培養系に添加し、腫瘍細胞に
対する食細胞の相互作用に対する影響を調べた。すなわ
ちウシ胎児血清10%を含むＭＥＭ培地で培養したヒト肺
腫瘍A549細胞を10⁴/wellづつ96穴プレートにまき２日間
培養した。

【００３０】この細胞層に鈴木等の方法によって調整し
た好中球を2 x 10⁵個づつ分注して好中球を粘着させた
後、各濃度のSF2771物質を添加してCO₂インキュベータ
ー中で37℃、４時間培養後、トリプシン処理を行い 20
0個のA549細胞を別の96穴プレートにまき37℃のCO₂イン
キュベーターで４日間培養を継続した。腫瘍細胞の残存
コロニー数をクリスタルバイオレットによるO.D.法（54
6nm）にて測定した。次の表２に示す通り、SF2771物質
はそれ自身では腫瘍細胞障害を示さず、好中球の腫瘍細
胞障害活性を促進するのは明かである。

【００３１】

【表２】 SF2771添加量腫瘍細胞残存量 O.D. 546nm （生存率％）（μg/ml）好中球無添加好中球添加無添加 0.407 (100) 0.414 (100) 0.073 0.311 (76) 0.364 (88) 0.73 0.384 (94) 0.329 (79) 7.3 0.279 (69) 0.101 (24) 22 0.324 (80) 0.096 (23) 66 0.363 (89) 0.069 (17)

【００３２】

【発明の効果】本発明による新規生理活性物質SF2771物
質は好中球の腫瘍細胞障害活性の促進作用を有すること
から、免疫強化剤としての効果が期待される他、腫瘍細
胞と好中球等の食細胞との相互作用を明らかにする上で
貴重な材料として用いられる事が期待される。

【図面の簡単な説明】

【図１】：SF2771物質のKBr錠での赤外線吸収スペクト
ルを示す。

【図２】：SF2771物質の重ジメチルスルホキシド中で測
定した水素核磁気共鳴スペクトルを示す。

【図３】：SF2771物質の重ジメチルスルホキシド中で測
定した炭素核磁気共鳴スペクトルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者発正浩神奈川県横浜市港北区師岡町760番地明治製菓株式会社薬品総合研究所内 (72)発明者清水明神奈川県横浜市港北区師岡町760番地明治製菓株式会社薬品総合研究所内 (72)発明者天野昭一神奈川県横浜市港北区師岡町760番地明治製菓株式会社薬品総合研究所内 (72)発明者今井敏神奈川県横浜市港北区師岡町760番地明治製菓株式会社薬品総合研究所内 (72)発明者柴原聖至神奈川県横浜市港北区師岡町760番地明治製菓株式会社薬品総合研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の構造式【化１】で示される化合物
【請求項２】ストレプトマイセス属に属するSF2771物
質生産菌を培養し、その培養物から請求項１記載のSF27
71物質を採取することを特徴とするSF2771物質の製造
法。