JPH07318534A - 生体高分子物質の分離展開データのサンプリング方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ゲル電気泳動などにより分離展開されたＤＮ
Ａ又はその断片などの支持媒体上での位置の検出と濃度
の積算とを、高度の熟練を必要とすることなくコンピュ
ータを用いて行なうためのサンプリング方法を提供す
る。 【構成】支持媒体上で生体高分子物質の混合物が一次元
方向に分離展開されて形成された複数のバンドからなる
レーン画像を、デジタルデータとしてコンピュータに取
り込み、そのレーン内のバンドの位置と濃度とをコンピ
ュータにより算出するための、コンピュータ上でデジタ
ルデータを画像として表示し算出対象のバンドを取り囲
むレーン方向に沿った帯状領域を設定する工程、そして
この領域内でデジタルデータを該領域を横切る方向に互
いに平行に順次積算してレーン画像を表わす一次元デー
タを得てこの一次元データからレーン内のバンドの位置
と濃度とを算出する工程とを含む生体高分子物質の分離
展開データのサンプリング法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ゲル電気泳動や薄層ク
ロマトグラフィーなどの手段により支持媒体上で分離展
開されたＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、あるいはそれらを切
断して得た断片物、修飾物などの支持媒体上での位置の
検出と濃度を積算するために有利に用いられる生体高分
子物質の分離展開データのサンプリング方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、急速に発達して来た分子生物学の
分野においては、生物体の機能や複製のメカニズムを解
明するために、生物体のもつ遺伝情報を明らかにするこ
とが必須のこととなっている。とりわけ、特定の遺伝情
報を担うＤＮＡやＲＮＡ（もしくはＤＮＡ断片物やＲＮ
Ａ断片物、あるいはそれらの修飾物、以下同様）などの
核酸に関する研究が活発に行なわれている。

【０００３】たとえば、目的とする遺伝子を特異的に検
出するための代表的な方法として、ＤＮＡやＲＮＡが、
互いに相補的な一対のポリヌクレオチド鎖からなる特徴
的構成を有するとの事実を利用したサザン・ブロッティ
ング法が知られている。このサザン・ブロッティング法
では、まずＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼによって切
断してＤＮＡ切断物の混合物からなる試料を調製し、こ
の試料をアガロースゲルを支持媒体とする電気泳動にか
けて、アガロースゲル上で分離展開し、この分離展開し
た試料を、次いでニトロセルロースフィルタに移す。次
に、このニトロセルロースフィルタ上で、別に用意した
プローブ（検出目的の遺伝子に対応するＤＮＡまたはＲ
ＮＡの放射線同位元素標識物）とのハイブリッドを形成
させる。そして、ハイブリッドを形成しないプローブを
ニトロセルロースフィルタから除去したのち、ニトロセ
ルロースフィルタを放射線写真フィルムを用いたオート
ラジオグラフィにかけると、ハイブリッドを形成した部
分（すなわち、検出目的の遺伝子に対応する核酸配列部
分を有するＤＮＡ断片物が存在する部分）が黒化領域
（バンド）として示される画像が得られる。即ち、この
ような方法により、目的とする遺伝子を特異的に分離検
出することが可能となる。なお、類似の方法として、主
としてＲＮＡを対象としたノーザン・ブロッティング
法、蛋白質を対象としたウエスタン・ブロッティング法
も知られている。

【０００４】上記のようなブロッティング法では通常、
分離展開した各バンドに存在する検出目的のハイブリッ
ド物をアガロースゲルなどの分離展開支持媒体から摘出
し、これに必要な分離処理などを施したのち、様々な研
究が行なわれる。従って、アガロースゲルなどの支持媒
体上のハイブリッド物の位置や濃度の確認は非常に重要
となるが、支持媒体上にバンド（分離展開バンド）とし
て存在するハイブリッド物は目で確認することはできな
い。このため、上記のようにして黒化画像として得られ
たオートラジオグラフィー画像（オートラジオグラム）
に基づいて、支持媒体上の目的のバンドの濃度や位置を
確認したのち、支持媒体の当該バンド領域を摘出し、そ
の摘出物を液体シンチレーションカウンターなどを用い
て定量測定している。しかしながら、このような作業を
人間の手作業を頼りにして行なうことは大きな誤差が生
じる要因となる。特に、分離展開して得られたレーン
が、分離展開用の支持媒体の不均一さ、あるいは分離展
開条件の変動や位置的誤差により途中で曲る現象が発生
した場合には、レーン内のバンドの位置の確認や正確な
バンドの摘出は更にむずかしくなる。

【０００５】一方、オートラジオグラフィーにおいて、
従来の放射線フィルムを用いる方法に代って、輝尽性蛍
光体（蓄積性蛍光体ともいう）をシート状に形成してな
る放射線像変換パネル（蓄積性シートともいう）を感光
材料として用いる放射線像記録・再生方法が最近提案さ
れ、多くの研究において実際に使用されるようになって
いる。この放射線像記録・再生方法では、分離展開用の
支持媒体あるいはセルロースフィルタのような移転用支
持媒体と放射線像変換パネルを重ね合せて、支持媒体上
の放射線標識物質から発生する放射線エネルギーを放射
線像変換パネルの輝尽性蛍光体に吸収させ記録したの
ち、この放射線像変換パネルに励起光を照射して、輝尽
性蛍光体から輝尽光を発生させ、この輝尽光を検出し、
次いで検出された輝尽光を光電変換装置によりデジタル
データに変える方法であり、分離展開された放射性標識
物質の位置や濃度を表わす画像データが直接デジタルデ
ータとして得られる利点がある。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ゲル電気泳
動や薄層クロマトグラフィーなどの手段により支持媒体
上で分離展開されたＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、あるいは
それらの断片物、修飾物などの支持媒体上での位置の検
出と濃度の積算とを、高度の熟練を必要とすることなく
コンピュータを用いて実施するための新規な生体高分子
物質の分離展開データのサンプリング方法を提供するこ
とを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、支持媒体上で
生体高分子物質の混合物が一次元方向に分離展開されて
形成された複数のバンドからなるレーン画像を、デジタ
ルデータとしてコンピュータに取り込み、そのレーン内
のバンドの位置とバンドの濃度とをコンピュータにより
算出するための下記の工程からなる生体高分子物質の分
離展開データのサンプリング方法にある。コンピュータ
上で上記デジタルデータを画像として表示し、その画像
上で、算出対象の複数のバンドを取り囲むレーン方向に
沿った帯状領域を設定する第一工程；そして第一工程で
設定した帯状領域内でデジタルデータを該帯状領域を横
切る方向に互いに平行に順次積算することによりレーン
画像を表わす一次元データを得た後この一次元データか
らレーン内のバンドの位置と濃度とを算出する第二工
程。

【０００８】本発明の好ましい態様を次に挙げる。 （１）第一工程における帯状領域を平行四辺形（長方形
も含む）として設定する上記のサンプリング方法。 （２）第二工程における帯状領域のデジタルデータの積
算を帯状領域に直角の方向で行なう上記のサンプリング
方法。 （３）レーンが途中で曲がっている場合に、第一工程に
おける帯状領域の設定を、連続する複数の平行四辺形に
より形成する上記のサンプリング方法。 （４）第一工程において、レーンを構成する複数のバン
ドの中心点を結び合わせて設定した線の両側を広げるこ
とによって帯状領域を設定する上記のサンプリング方
法。 （５）レーンが途中で曲がっている場合に、第一工程に
おける帯状領域の設定を、レーンを構成する複数のバン
ドの中心点を結び合わせて設定した折れ線の両側を広げ
ることによって行なう上記のサンプリング方法。 （６）一次元データから検出、算出されたレーン内のバ
ンドの位置と濃度とをグラフにて表示する工程を含む上
記のサンプリング方法。

【０００９】本発明のサンプリング方法は通常、電気泳
動画像データなどの分離展開画像データを一旦ディジタ
ル信号の組合せ（ディジタルデータ）に変換し、このデ
ィジタルデータに基づき形成される可視画像をコンピュ
ータのディスプレィに表示して実施する。たとえば、オ
ートラジオグラフィーによって放射線フィルム上に可視
化した分離展開画像を光学的に読み取り、これをディジ
タルデータに変換し、その後、上記のようにしてコンピ
ュータのディスプレィを利用して処理する方法を利用す
ることができる。

【００１０】なお、本願出願人は、電気泳動による分離
展開パターンのオートラジオグラフを得る方法として放
射線フィルムを用いる従来の放射線写真法の代りに、蓄
積性蛍光体シートを用いる前述の放射線像記録・再生方
法（放射線像変換方法）を利用する方法について既に多
数特許出願している（特開昭５９−８３０５７号、特開
昭６０−１０１７４号、特願昭５８−１７３３９３
号）。ここで、前述のように、蓄積性蛍光体シートは輝
尽性蛍光体からなるものであって、放射線エネルギーを
該蛍光体シートの輝尽性蛍光体に吸収させた後、可視乃
至赤外領域の電磁波（励起光）で励起することにより放
射線エネルギーを輝尽光として放出させることができる
ものである。この方法によれば、露光時間を大幅に短縮
化することができ、また従来より問題となっていた化学
カブリ等が発生することがない。さらに、放射性標識物
質のオートラジオグラフは、一旦放射線エネルギーとし
て蛍光体シートに蓄積されたのち輝尽光として光電的に
読み取られるから、直接にデジタルデータとして得るこ
とができるとの利点がある。このため、本発明のサンプ
リング法は、上記の蓄積性蛍光体シートを用いる放射線
像変換方法と組合せて実施することが特に有利である。

【００１１】次に、本発明のサンプリング方法を、サザ
ン・ブロッティング法において得られる電気泳動による
分離展開画像について行なう場合を例にとって詳しく説
明する。まず、公知の方法に従って、エンドヌクレアー
ゼのような制限酵素でＤＮＡを切断して得たＤＮＡ断片
の混合物をアガロースゲルのような支持媒体の上で一次
元方向に分離展開し、複数のバンドからなるレーンを形
成させる。この支持体から各分離展開物の一部をニトロ
セルロースフィルタ上に転写し、その上で放射性同位元
素で標識されたプローブとのバイブリッドを発生させ
る。ハイブリッドしなかったプローブを除去したのち、
このニトロセルロースフィルタを放射線像変換パネルを
用いるオートグラフィーにかけ、ニトロセルロースフィ
ルタ上の放射性標識プローブが存在する領域の位置と、
その領域における放射性標識物質の濃度に関する情報を
含む画像データをデジタルデータとして得て、これをコ
ンピュータに取り込む。このコンピュータに取り込まれ
たデジタルデータは、サンプリング作業を行なうに際し
て可視画像データとしてコンピュータに接続されたディ
スプレィに表示される。

【００１２】図１は、コンピュータに接続されたディス
プレィ画面上に濃淡画像として表示された複数の分離展
開列（レーン）を含む泳動パターンのオートラジオグラ
フを示す図である。なお、泳動パターンの略中央部の長
方形で囲った泳動列には、途中で曲る現象が生じてい
る。本発明において、図１の電気泳動データから、途中
で曲る現象が発生した略中央部の電気泳動列に属する多
数のバンド（泳動バンド）の位置と各バンドの積算濃度
とは、次のような工程を組み合せることによって算出さ
れる。

【００１３】（１）第一工程 まず、電気泳動の出発点あるいはその近傍の点Ｓから、
泳動バンドの大きさ、形状、位置などを考慮して基準と
決めた泳動バンド１と２との中心を結ぶ直線Ｉ（図１で
は一点鎖線で示した）を両泳動バンドの両側に延長する
ように画面上に引き、次いで、改めて泳動バンドの大き
さ、形状、位置などを考慮して基準と決めた泳動バンド
３と４との中心を結ぶ直線II（図１では一点鎖線で示し
ている）を両泳動バンドの両側に延長するように画面上
に引き、それらの直線の交点Ｐで折れ曲る折れ線を作成
する。次いで、その折れ線を両側部に基準と考えられる
泳動バンドの幅にまで広げた折れ曲った帯状領域Ａを作
成する。なお、帯状領域Ａは上記の方法では基準泳動バ
ンドの中心点を結び付ける方法を利用して作成したが、
最初から基準として選択した泳動バンドの両側端部に該
当する位置のそれぞれを順次結ぶことによって、直接各
泳動バンドを両側部から囲む二本の互いに平行な折れ線
（帯状領域Ａ）を形成してもよい。

【００１４】また、各泳動バンドは、電気泳動条件そし
て、その泳動バンドを形成する物質の量、特性などによ
って、形状、大きさなどが変動するため、基準泳動バン
ドの両側端部の位置の決定に際しては、それらの変動を
考慮して若干ずれた位置を指定してもよく、この指定に
より帯状領域Ａの幅は若干広めることができ、あるいは
若干狭く設定することもできる。また、帯状領域は単
に、各泳動バンドを内包する長方形などの平行四辺形
（レーンが折れ曲っている場合には、連続する平行四辺
形となる）として作成してもよい。

【００１５】（２）第二工程 第一工程で作成した二本の折れ線により形成される帯状
領域Ａ内のデジタルデータ（信号）を、帯状領域を横切
る方向で互いに平行に順次積算（図１において積算方向
ａとｂとｃが互いに平行となるように積算）することに
よって、帯状領域Ａ内に検知される信号の位置と強度と
の関係を表わす一次元データを得る。この場合、帯状領
域を積算するとは、帯状領域を形成しているデジタル信
号を、指定された方向に順次演算（通常は加算）するこ
とを意味する。この演算は、コンピュータ処理により容
易に実施できる。帯状領域を横切る積算の方向は通常、
点Ｓから最初の屈折位置（交点Ｐに該当する）までの直
線部分に垂直な方向に設定する。この積算方向は、最初
に決めた方向で確定し、帯状領域が最初の屈曲点で屈曲
した後も、最初に決めた方向と平行な方向が維持され
る。従って、最初の屈折位置以降の積算の帯状領域に対
する角度は変化する。

【００１６】なお、上記で求められた帯状領域Ａ内に検
知される信号の位置と強度との関係は、そのまま一次元
データとして記憶させ、そのまま、のちの処理に利用し
てもよいが、実用上では図２に示すようなグラフの形に
表示することが望ましい。図２では、図１に示された帯
状領域Ａ内の各泳動バンドについて、その位置と濃度分
布を示すグラフの形で、検知された関係が示されてい
る。このような表示方法を採用することにより、各泳動
バンドの位置と濃度の相互関係が容易に観察されるとの
利点がある。次いで、上記で求められた信号の位置と強
度との関係から、その電気泳動列に属する泳動バンドの
位置（泳動距離、あるいは泳動出発点からの直線距離）
と各泳動バンドの積算濃度とを算出する。この、算出も
コンピュータを用いた演算により容易に実施できる。

【００１７】従って、このような方法を実施することに
より、任意の電気泳動列について、その泳動列の属する
各泳動バンドの位置と積算濃度とが容易に求められる。

【００１８】

【発明の効果】本発明のサンプリング方法によって、ゲ
ル電気泳動や薄層クロマトグラフィーなどの手段により
支持媒体上で分離展開されたＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、
あるいはそれらの断片物、修飾物などの支持媒体上での
位置の検出と濃度の積算とが、高度の熟練を必要とする
ことなく、コンピュータを用いて容易に実施できる。こ
のため、サザン・ブロッティング法などのブロッティン
グ法の実施の際に有利に利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ディスプレィ画面上に濃淡画像として表示され
た電気泳動パターンのオートラジオグラフについて、本
発明のサンプリング方法の実施の例を示す図である。

【図２】図１の電気泳動パターンのオートラジオグラフ
で指定された電気泳動列中の各泳動バンドについての位
置と濃度との関係を示すグラフを示す図である。

【符号の説明】

１ 泳動バンド ２ 泳動バンド ３ 泳動バンド ４ 泳動バンド Ｓ 泳動出発点 Ｐ 交点 Ｉ 泳動バンド１と２との中心を結ぶ直線 II 泳動バンド３と４との中心を結ぶ直線 Ａ 帯状グラフあるいは帯状領域 ａ 積算方向 ｂ 積算方向 ｃ 積算方向

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 支持媒体上で生体高分子物質の混合物が
   一次元方向に分離展開されて形成された複数のバンドか
   らなるレーン画像を、デジタルデータとしてコンピュー
   タに取り込み、そのレーン内のバンドの位置とバンドの
   濃度とをコンピュータにより算出するための下記の工程
   からなる生体高分子物質の分離展開データのサンプリン
   グ方法：コンピュータ上で上記デジタルデータを画像と
   して表示し、その画像上で、算出対象の複数のバンドを
   取り囲むレーン方向に沿った帯状領域を設定する第一工
   程；そして第一工程で設定した帯状領域内でデジタルデ
   ータを該帯状領域を横切る方向に互いに平行に順次積算
   することによりレーン画像を表わす一次元データを得た
   後この一次元データからレーン内のバンドの位置と濃度
   とを算出する第二工程。
2. 【請求項２】 第一工程における帯状領域を平行四辺形
   として設定する請求項１に記載の生体高分子物質の分離
   展開データのサンプリング方法。
3. 【請求項３】 第二工程における帯状領域のデジタルデ
   ータの積算を帯状領域に直角の方向で行なう請求項１に
   記載の生体高分子物質の分離展開データのサンプリング
   方法。
4. 【請求項４】 レーンが途中で曲がっている場合に、第
   一工程における帯状領域の設定を、連続する複数の平行
   四辺形により形成する請求項１に記載の生体高分子物質
   の分離展開データのサンプリング方法。
5. 【請求項５】 第一工程において、レーンを構成する複
   数のバンドの中心点を結び合わせて設定した線の両側を
   広げることによって帯状領域を設定する請求項１に記載
   の生体高分子物質の分離展開データのサンプリング方
   法。
6. 【請求項６】 レーンが途中で曲がっている場合に、第
   一工程における帯状領域の設定を、レーンを構成する複
   数のバンドの中心点を結び合わせて設定した折れ線の両
   側を広げることによって行なう請求項１に記載の生体高
   分子物質の分離展開データのサンプリング方法。