JPS62215869A - 核酸の塩基配列決定のためのオ−トラジオグラフ解析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野１ 本発明は、核酸の塩基配列決定のためのオートラジオグ
ラフ解析力υ：に関するものである。

［発明の背Ｊ：ＦＯ］ 近年、急速に発達して来た分子生物学の分デ？において
は、生物体の機ずＬや複製のメカニズムを解明するため
に、生物体のもつ遺伝情報を明らかにすることが必須の
こととなっている。とりわけ、特定の遺伝情報を担うＤ
ＮＡ　（もしくはＤＮＡ断片物、以下同様）などの核酸
の塩基配列を決定することが必要不可欠なこととなって
いる。

ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸のに１Ｘ基配列を決定するた
めの代表的な方法として、オートラジオグラフィーを利
用するマキサム・ギルバート（Ｍａｘａｖｉ−Ｇｉｌｂ
ｅｒｔ　）法およびサンガー・クールソン（Ｓａｎｇｃ
ｒ−Ｃｏｕｌｓｏｎ）法が知られている。前者のマキサ
ム・ギルバート法は、まず、塩基配列を決定すべきＤＮ
ＡあるいはＤＮＡ断片物の鎖状分子の一方の端部に３２
　ｐ　１の放射性同位元末を含む基を結合させて放射性
標識を付がしたのち、化学的なｆ段を利用して鎖状分子
の構成単位（Ｉｌｌ！基単位）間の結合な塩基特異的に
切断する。次に、得られた塩基特異的ＤＮＡ切断分解物
の混合物をゲル電気泳動法により支持媒体上に分離展開
し、多数の切断分解物かそれぞれ分離展開されて形成さ
れた分離展開パターン（ただし、視覚的には見ることか
できない）を得る。次いて、この分離展開パターンをた
とえばｘ５フィルム上に可視化してそのオートラジオグ
ラフを得、得られたオートラジオグラフと各々の塩基特
異的切断手段とから、放射性回位元素か結合された鎖状
分子の端部から一定の位置関係にある塩基を順次決定し
、これにより対象物全ての塩基配列を決定するものであ
る。

また、後者のサンガー・クールラン法は、ＤＮＡあるい
はＤＮＡｌｆｒ片物の鎖状分子と相補的であって、かつ
放射性標識か付与されたＤＮＡ合ｒ＃、物を化学的な手
段を利用して塩基特異的に合成し、得られた塩基特異的
ＤＮＡ合成物の混合物を用いて上記と同様にしてそのオ
ートラジオグラフから塩基配列を決定する方法である。

本出願人は、支持媒体トに分離展開された放射性標識物
質のオートラジオグラフを得る方法として放射線フィル
ムを用いる従来の放射線写真法の代りに、蓄請性蛍光体
シートを用いる放射線像変換方法を利用する方法につい
て既に特許出願している（特開昭５９−８３０５７号、
特願昭５８−２０１２３１号）、ここで、蓄積性蛍光体
シートは輝尽性蛍光体からなるものてあり、放射線エネ
ルギーを該蛍光体シートの輝尽性蛍光体に吸収させた後
、可視乃至赤外領域の電磁波（励起光）で励起すること
により放射線エネルギーを輝尽光として放出させること
かできるものである。この方法によれば、′Ａ光時間を
大幅に短縮化することかでき、また従来より問題となっ
ていた化学カブリ等が発生することかない。さらに、放
射性標識物質のオートラジオグラフは、−μ放射線エネ
ルギーとして蛍光体シートにＪｍされたのち輝尽光とし
て充電的に読み取られるから、直接にデジタル信号とし
て得たのち適当な記録媒体に記録保存することかできる
。

従来より、核酸の塩基配列は、可視化されたオートラジ
オグラフについて、放射性標識か付与された核酸の１１
！基特異的切断分解物もしくは塩基特異的合成物（以下
、単に核酸の塩基特異的断片物と称する）の分離展開位
ｔ（バンド）を視覚的に判断し、それらバンドの位置を
相互に比較することにより決定されている。よって、オ
ートラジオグラフの解析は通常人間の視覚を通して行な
われており、そのために多大な時間と労力が費されてい
る。また、人間の目に依存しているため、決定された塩
基配列が解析者によって異なるなど得られる情報の精度
には限界がある。

そこて、本出願人は、上記オートラジオグラフをデジタ
ル信号として得た後このデジタル信号に適当な信号処理
を施すことにより、ＤＮＡの塩基配列を自動的に決定す
る方法についても既に特許出願している（特開昭５９−
１２６５２７号、特開昭５９−１２６２７８号、特願昭
６Ｏ−７４８９９−）、特願昭６０−８５２７５号等）
。

［９，明の要旨］ 本発明は、核酸の塩基配列を高精度で決定することかで
きるオートラジオグラフ解析方法を提供するものである
。

また、本発明は、−１１−決定されたバンドの序列を容
易かつ有利に確認および／または修正することかてきる
オートラジオグラフ解析方法をも提供するものである。

すなわち、本発明は。

（１）放射性標識か付与されたＩＩＩ基特異的ＤＮＡ断
片物もしくはＲＮＡ断片物か支持媒体上に一次元的方向
に分離展開されて形成された複数の分離展開列のオート
ラジオグラフを解析することにより、核酸の塩基配列を
決定する方法において。

ｌ）バンドの序列が決定されたオートラジオグラフを、
該オートラジオグラフに対応するデジタル信（）に基づ
いて電気的に画像表示する工程、２）バンドの序列確認
のための入力情報に基づいて、分離展開列を横切りかっ
−っのバンドの位置を通過するように読取カーソルをオ
ートラジオグラフに固定して画面上に表示し、同時に該
バンドの塩基基を画面上に表示する工程、 ３）バンドの序列確認のための入力情報に基づいて、前
工程てカーソル固定されたバンドに隣接するバンドの位
置を通過するように読取カーソルをオートラジオグラフ
に固定して画面上に表示し、同時に該バンドの塩基基を
画面上に表示する工程、および ４）第三工程を繰り返すことにより、決定されたバンド
の序列をオートラジオグラフ上で確認する工程。

を含むことを特徴とする核酸の塩基配列決定のためのオ
ートラジオグラフ解析方法：および（ＩＩ）放射性標識
か付与された塩基特異的ＤＮＡ断片物もしくはＲＮＡ断
片物が支持媒体上に一次元的方向に分離展開されて形成
された複数の分離展開列のオートラジオグラフを解析す
ることにより、核酸の塩基配列を決定する方法において
、１）バンドの序列が決定されたオートラジオグラフを
、１偵オートラジオグラフに対応するデジタル信号に基
づいて電気的に画像表示する工程、２）バンドの序列確
認のための入力情報に基づいて、分離展開列を横切りか
つ一つのバンドの位置を通過するように読取カーソルを
オートラジオグラフに固定して画面上に表示し、同時に
該バンドの塩基基を画面上に表示する工程、 ３）バンドの序列確認のための入力情報に基づいて、前
工程でカーソル固定されたバンドに隣接するハン］〜の
位置を通過するように読取カーソルをオートラジオグラ
フに固定して画面上に表示し、同時に該バンドの塩基基
を画面にに表示する工程、 ４）第三工程において表示された読取カーソルおよび／
または塩基基を、表示画面に基づく情報の入力がある場
合には該情報に従って削除し、追加し、もしくは変更す
る工程、および ５）第三および第四工程を順次繰り返すことにより、決
定されたバンドの序列を確認し、修正する工程。

を含むことを特徴とする核酸の塩基配列決定のためのオ
ートラジオグラフ解析方法； を提供するものである。

なお、本発明において「バンドの序列を決定するＪとは
１分離展開方向に沿った各バンドの位置に基づいてバン
ドに順序を付し、かつバンドか属する分離展開列に基づ
いてバンドに塩基基を付すことを、ｔｉ味する。

本発明の方法によれば、オートラジオグラフ上のバンド
に序列が付されて一旦決定された核酸の塩基配列につい
て確認を行なう際に、塩基配列がオートラジオグラフと
ともに表示され、かつその塩基配列は文字列として一度
に列挙されるのではなく一塩基ごとにバンドと対応させ
ながら表示されるために、確実に−バンドずつ確認する
ことができる。そして、塩基基とバンドとは、直線状、
折れ線状などの読取カーソルによって一対−の対応がつ
けられるために、バンドの順序の誤り、バンドの重複読
みあるいは読み落としの有無を一目で判断することかで
きる。

また、確認の途中でバンドの序列（順序および塩基基）
の誤り、バンドの重複読みあるいは読み落としを発見し
た場合に、その場で簡単に修正することができる。この
修正においても−バンドー塩基ごとに順次表示されるか
ら、間違いなく修正することができる。

従って、最終的に得られる塩基配列の信頼性を顕著に高
めることかできる。

特に、始めのバンドの序列決定を上述したように信号処
理により自動的に行なった場合には最終的な確認、さら
には修正を研究者自身か行ないたいとの要求か高く、そ
のような場合に本発明の方法は非常に有効な方法である
といえる。

［発明の構成］ 本発明において用いられる試料の例としては。

放射性標識か付与されたＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸の塩基
特異的断片物の混合物を挙げることがてきる。ここで、
核酸の断片物とは長鎖状の分子の一部分を意味する。た
とえば、１ｔ！基特異的ＤＮＡ１ｆｒ片物混合物の一種
である塩基特異的ＤＮＡ切断分解物混合物は、前述のマ
キサム・ギルバート法に従って、放射性標識か付与され
たＤＮＡを１１！基特異的に切断分解することにより得
られる。また、塩ノ＾特異的ＤＮＡ合Ｉ＆物混合物は前
述のサンガー・クールラン法に従って、ＤＮＡをテンプ
レート（Ｐｒ型）として、放射性標識か付′ｊされたデ
オキシヌクレオシドトリフオスフェートとＤＮＡ合成酵
素とを用いて合成することにより得られる。

さらに、塩基特異的ＲＮＡ断片物の混合物色ヒ記と同様
の方法により、切断分解物混合物としてまたは合成物混
合物として得ることかできる。なお、ＤＮＡはその構成
中位としてアデニン、グアニン、チミン、シトシンの四
種類の塩基からなるが、一方ＲＮＡはアデニン、グアニ
ン、ウラシル、シトシンの四種類の塩基からなる。

放射性標識は、これらの物質に適当な方法で３２　ｐ、
直ＡＣ，％ｓ、コＨ，”Ｉなとの放射性同位元素を保持
させることによって付与される。

試料である放射性標識が付与された核酸の塩基特異的断
片物の混合物はゲル状支持媒体など公知の各種の支持媒
体を用いて、電気泳動法、薄層クロマトグラフィー、カ
ラムクロマトグラフィー、ベーパークロマトグラフィー
など種々の分Ｓ展開方法により支持媒体−ヒに分子ａ展
開される。

次に、放射性！５ｍ物質か分類展開された支持媒体につ
いて従来の写真感光材料を用いる放射線写真法により、
あるいは蓄積性蛍光体シートを用いる放射線像変換方法
によりそのオートラジオグラフか得られたのち、適巳な
読取り（読出し）系を介して該オートラジオグラフに対
応するデジタル信号か得られる。

前者の放射線写真法を利用する場合には、まず支持媒体
とＸ線フィルム等の写真感光材料とを低温（−９０〜−
７０℃）で長時間（数十時間）重ね合わせて放射線フィ
ルムを感光させたのち、現像して放射性標識物質のオー
トラジオグラフを放射線フィルム上に可視画像化する。

次いで、画像読取装置を用いて放射線フィルム上に可視
化されたオートラジオグラフを読み取る。たとえば、放
射線フィルムに光ビームを照射してその透過光または反
射光な光電的に検出することにより、オートラジオグラ
フは電気信号として得られる。さらに、この電気信号を
Ａ／Ｄ変換することにより。

オートラジオグラフに対応するデジタル信号を得ること
かできる。

後者の放射線像変換方法を利用する場合には。

まず、支持媒体と蓄積性蛍光体シートとを常温で短時間
（数秒〜数十分間）重ね合わせて蛍光体シートに放射性
標識物質から放出される放射線エネルギーを蓄積させる
ことにより、そのオートラジオグラフを蛍光体シートに
一種の潜像として記録する。ここで、蓄積性蛍光体シー
トは、たとえばプラスチックフィルムからなる支持体、
二価ユーロピウム賦活弗化臭化バリウム（ＢａＦＢｒ：
Ｅ　ｕ　”　）等の輝尽性蛍光体からなる蛍光体層、お
よび透明な保護膜がこの順に積層されたものである。蓄
積性蛍光体シートに含有されている輝尽性蛍光体は、Ｘ
線等の放射線が照射されるとその放射線エネルギーを吸
収して蓄請し、そののち可視乃至赤外領域の光で励起す
ると蓄積していた放射線エネルギーな輝尽光として放出
するという特性を有する。

次いて、読出装置を用いて蓄積性蛍光体シートに蓄積記
録されたオートラジオグラフを読み出す。具体的には、
たとえば蛍光体シートをレーザー光で走査して放射線エ
ネルギーを輝尽光として放出させ、この輝尽光を光電的
に検出することにより、放射性標識物質のオートラジオ
グラフはｉｉｆ視画像画像化ことなく直接に電気信号と
して得られる。さらに、この電気信号をＡ／Ｄ変換する
ことにより、オートラジオグラフに対応するデジタル信
号を得ることができる。

上述のオートラジオグラフ測定操作およびオートラジオ
グラフに対応するデジタル信号を得る方法の詳細につい
ては、前記特開昭５９−８３０５７号、特開昭５９−１
２６５２７号、特開■（５９−１２６２７８号等の各公
報に記載されている。

なお、上記においては、支持媒体上に分離展開された放
射性標識物質のオートラジオグラフに対応するデジタル
信号を得る方法として、従来の放射線写真法および放射
線像変換方法を利用する方法について述べたが、これら
の方法に限定されるものではなく、それ以外の如何なる
方法により得られたデジタル信号であっても放射性標識
物質のオートラジオグラフと対応関係がある限り、未発
Ｉｌｌの信号処理方法を適用することが回部である。

また、上記いずれの方法においてもオートラジオグラフ
の読取り（または読出し）は、放射線フィルム（または
蓄積性蛍光体シート）の全面に亘って行なう必要はなく
、画像領域のみについて行なうことも勿論可能である。

さらに、本発明においては、予め各分離展開列の位置お
よびバンドの幅等についての情報を入力して読取り（読
出し）条件を設定しておき、読取り（読出し）操作にお
いては各バンド上を二本以上の走査線が通過するような
走査線密度で光ビームによる走査を行なうことにより、
読取り（読出し）時間を短縮化して必要な情報を効率良
く得ることかてきる。なお１本発明においてオートラジ
オグラフに対応するデジタル信号とは、このようにして
得られたデジタル信−）をも包含する。

得られたデジタル信号Ｄｘｙは、放射線フィルム（また
は蛍光体シート）に固定された座標系で表わされた座標
（ｘ、ｙ）とその座標における信号のレベル（２）とか
らなる。信号のレベルはその座標における画像濃度、す
なわち放射性標識物質の量を表わしている。従って、一
連のデジタル信号（すなわち、デジタル画像データ）は
放射性標識物質の二次元的な位置情報を有している。

このオートラジオグラフに対応するデジタル信号は、一
旦メモリ（バッファーメモリ、または磁気ディスク等の
不揮発性メモリ）に記憶されたのち信−）処理回路に送
られる。

次いで、得られたデジタル信号について信号処理を施す
ことにより、あるいはデジタル信−）に基づいて電気的
に画像表示されたオートラジオグラフを人間が視覚的に
判断することにより、オートラジオグラフ上に現われた
全てのバンドの序列が決定される。前者の信号処理によ
る自動解析は基本的に、信号のレベルか極大となる位置
を検出してバンドの位置を決定したのち、この位置に基
づいてバンドに順序を付し、次いで分ｇｌ展開列ごと末
端塩基が規定されるからバンドが属する分離展開列に基
づいてバンドに塩基名を付すことにより行なうことがで
きる。また、後者の表示画面上での人為的な解析は、た
とえば読取カーソルを画面上で作成し、これを用いて順
序よくバンドに塩基名を付すことにより行なわれる。

前者の自動解析方法の詳細については、本出願人による
特願昭６０−７４８９９号、特願昭６０−８５２７５号
、特願昭６０−１８１４３２号、特願昭６０−２２６０
９１号および特願昭６０−２２６０９２号などの各明細
書に記載されている。また、後者の人為的解析方法の詳
細については、本出願人による昭和６１年３月５日出願
の特願昭６１−　　　号および同３月１２日出願（２）
の特願昭６１−　　　号の各明細書に記載されている。

得られたバンドの序列およびオートラジオグラフはそれ
ぞれ、バンド情報およびパターン情報として適当な記録
媒体に記録保存される。バンド情報は具体的に、第１図
に示すように、オートラジオグラフに固定された座標系
（すなわち、デジタル信号が有する座標系）で表わされ
たバンドの位置（ｘ、ｙ）とバンドが帰属された塩ノ＾
の名称（たとえば、ＤＮＡの場合にはＧ、Ａ、Ｔまたは
Ｃ）とからなるバンドデータである。

以下に、未発ＩＪＪの第一の解析方法を、次の四種片物
の混合物が電気泳動によりゲル支持媒体とに分離展開さ
れてなる泳動列（分離展開列）を例にとって説明する。

ｌ）グアニン（Ｇ）特異的ＤＮＡ断片物２）アデニン（
Ａ）特異的ＤＮＡＩＩ片物３）チミン（Ｔ）特異的ＤＮ
Ａ断片物 ４）シトシン（Ｃ）特異的ＤＮＡ断片物ここで、各塩基
特異的ＤＮＡ断片物は、塩基特異的に切断分解もしくは
合成された、すなわち末端塩基を同じくする種々の長さ
のＤＮＡｐＪｉ片物からなる。

まず、上記四本の泳動列（レーン）からなる泳動パター
ンのオートラジオグラフに関するパターン情報および決
定されたバンドの序列に関するバンド情報を、信号処理
回路と、オートラジオグラフ、カーソルおよび塩基名を
同時に表示することかできるＣＲＴなどの表示手段と、
バンドの序列確認のための入力を行なうことができる入
力手段とを有する装置に送ったのち、パターン情報に基
づいて解析対曽のオートラジオグラフ（放射性標識物質
の泳動パターン）を表示画面にに可視画像化する。この
装置にはさらに、カーソル作成および塩基名表示のため
の入力を行なうことかできる入力手段と、パターン情報
、カーソル情報および１１！基配列情報を記録保存する
ことかできる保存手段か設けられているのか望ましい。

なお、パターン情報として蓄積保存されているオートラ
ジオグラフに対応するデジタル信号には予め、濃度およ
びコントラストが適正で観察読影性能の優れた可視画像
か得られるように信号処理（画像処理）を行なっておい
てもよい。画像処理としては、たとえば、空間周波数処
理１階調処理、加算モ均処理、縮小処理、拡大処理など
が挙げられる。

画面上に画像表示されるオートラジオグラフは、画面に
設定された座標系における信号のレベル（画像濃度、す
なわち放射性標ｎ物質の賃）を色彩の明度で表わした、
従来の写真画像と同様の濃淡画像てあってもよいし、あ
るいは信号レベルを予め二４Ｎ化することにより簡略化
して表わした二値画像であってもよい。

あるいはまた、オートラジオグラフは、−次元の位置（
泳動方向に沿った位置）と信号レベルとからなる多数の
二次元波形な泳動方向に垂直な方向に一定間隔で多重表
示することにより表わした画像（いわゆる島轍図）であ
ってもよい。この鳥瞼図によれば放射性標識物質の量か
鳥轍図の高さとして三次元的に表わされるから、バンド
のピーク位置を正確に読み取ることかでき、泳動列（レ
ーン）間のバンドの位置関係の把握並びに泳動開始位置
近くのバンドの密な領域におけるバンドの分離を容易に
行なうことかできる。なお、鳥瞼図によってオートラジ
オグラフを表示する方法の詳細については、本出願人に
よる特願昭６０−１８１４３１壮明細書に記載されてい
る。

第２図に、画面上に濃淡画像として表示された泳動パタ
ーンのオートラジオグラフの例を示す。

また第３図に、鳥撤図として表示された泳動パターンの
オートラジオグラフの例を示す。

次に、バンドの序列確認のための入力情報に基づいて、
読取カーソルを分Ｓ展開列を横切りかつ一つのバンドの
位置を通過するように画面上の泳動パターンに固定して
表示し、同時に決定済みの該バンドの塩基名を画面上に
表示する。

バンドの序列確認のための情報の入力は、たとえば確認
キーを押すなどの筒中なキーボード操作によって行なう
ことができる。

最初のキー入力に従って、バンド情報の中からたとえば
泳動パターンの最下端のバンドについての情報（ｘ、、
　　　、、Ｔ）を抽出したのち、予め情報として入力さ
れているかあるいは画面上で作成された読取カーソルか
バンドの位置（Ｘ　ｌ＋ｙ　１）を通るように泳動パタ
ーンに固定して画面上に表示する。

バンド情＋Ｖもまた画面、Ｌに、同時にもしくは画面を
切り換えて表示してもよく、その場合には抽出されたバ
ンドが矢印等のポインタによって−［１てわかるように
しておくのか好ましい。

て表示してもよいが、スマイリング現象またはオフセッ
ト歪みなどによって泳動パターンにバンドの位置ずれあ
るいはバンドの欠陥か生じている場合には、各レーンの
バンドに沿った折れ線もしくは曲線を作成して表示する
のが好ましい（第６図１２参照）。

ここで、スマイリング現象とは、泳動過程における放熱
効果（エツジ効果）などが原因となって生しるものであ
り、支持媒体の中央部の泳動距層に比べて両端部の泳動
距離が短くなる現象をいう。またオフセット歪みとは、
試料注入口（スロット）の形状の相違等により試料の泳
動開始位と、開始時間が各レーンで異なることなどが原
因となって生じるものであり、レーン間相互の全体的な
位置ずれをいう。これらのバンドの位置ずれのほかにも
バンド自体の欠陥、レーンの蛇行などが生じることかあ
る。

折れ線状もしくは曲線状の読取カーソルは、たとえば以
下のようにして画面上に作成することか第４図は、画面
−ＬにＣ淡画像として表示された泳動パターンのオート
ラジオグラフの別の例を示す図である。第４図において
泳動方向は右方向である。

まず、画面の上端から表示画面に基づいて入力された位
置まて垂直な線を引く。入力される最初の位置は、端部
のレーン上のバンドの位置であるのか好ましい（第４図
１）。端部のレーンとするのは読取カーソルかこの位置
を起点として作成されるからである。

位置情報の入力は、マウスカーソル、ライトベン、ジョ
イスティックなどの手段を用いて行なうことがてきる。

位置精度の点から、特にマウスカーソルが好ましい。

たとえば、画面上のオートラジオグラフか表示される四
角形の領域を座標（Ｘａ、ｙａ）、（ｘｂ、ｙｂ）で表
わし、マウスカーソル（画面ヒの矢印２）の位置座標を
（ｘｍ、ｙｍ）で表わすとすると、マウスカーソルによ
ってｘｍ＝ｘ１＋　’Ｉ　ｍ　＝　３’　、なる位置情
報か入力されることにより、線分３　（ｘｌ、ｙａ）（
ｘｌ、ｙＩ）が画面上に表示される。

次に、起点４の位置から、それよりも泳動パターンの内
側の入力された位置（第二の位置）まで直線を引く。位
置の入力はｌ二足と同様にしてマウスカーソル等を介し
て行なわれる。まず始めに、起点４（ｘｌ、ｙｌ）とマ
ウスカーソル２の位置（Ｘｆｆｌ＋　ｙｍ）との間に線
分（ｘ　１　、　ｙ　＋　）（ＸＩｎ、ｙＩ、りか表示
される。マウスカーソル２が移動すると、この線分は画
面上て消えて、新たに起点４と移動した位置との間に線
分が表示される。なお、マウスカーソルは上記座標（Ｘ
ａ。

ｙａ）、（Ｘｂ＋　ｙｂ）で仕切られた四角形の領域内
を自由に移動することができる。こうして、マウスカー
ソルの移動とともに起点４とマウスカーソル２の各移動
位置とを結んだ線分が次々と表示される。該線分か好適
にレーンを横切るところで位置の入力を行なうことによ
り、線分３に連結した次の線分が画面に固定されて表示
される。

このようにして、上端のレーンから下端のレーンまてレ
ーンを横切りかつ各レーンのバンドに沿うように順次、
線分（ｘｉ、ｙｌ）（Ｘ＋や１゜ｙｌ。１）（ただし、
ｉは正整数である）を引く。

なお、試料は四種の塩基特異的ＤＮＡＦｔｉ片物の排他
的な組合せであるのて、各レーンのバンドは互いに同じ
位置（泳動距Ｒ１）には存在しえない、従って、ｒバン
ドに沿うように１とは、各レーンの泳動距離か等しくな
るように巨視的な意味でバンドに沿って線分を引くこと
を意味し、厳密に各線分か各レーンのバンド上を通過す
ることを意味するものではない。

次いで、第５図に示すように、線分か泳動パターンを完
全に横切った時点で最後に入力された位置か終点である
との入力情報に従って、該終点の位置５から画面下端ま
での垂直な線分６　（Ｘ　＋　＋ｙ＋）（ｘｌ、ｙｂ）
を引く。このようにして画面上には、泳動パターンを完
全に横切った複数の連結した折れ線からなる読取カーソ
ル７か表示される。

読取カーソルは泳動パターントの任意の領域で作成する
ことかてき、泳動開始位ｔに近いパターン上部の領域で
あってもよいし、あるいは泳動距離の大きなパターン下
部の領域であってもよい。

また、入力される位置情報は、泳動パターンに応じてレ
ーンの個数程度てあってもよいし、あるいはそれより多
くても少なくてもよい。少なくとも一つの位δか入力さ
れ、かつ起点と終点が認識できればよい。読取カーソル
は、入力位置を直線で結んだ折れ線状であってもよいし
、あるいは得られた折れ線に適当な演算処理（曲線近似
）を施すことにより曲線状であってもよい。

読取カーソルが画面上に固定して表示された段階で、バ
ンド情報に含まれているバンドの位置座標を、カーソル
情報（カーソルか折れ線状である場合には、折れ線の節
目の座標の組）に変換するのが好ましい。

作成された読取カーソルは泳動パターンに合致している
から、このカーソルを用いて解析者は正確かつ容易にバ
ンドの序列を確認することがてきる。なお、読取カーソ
ルの作成および表示方法の詳細については前記昭和６１
年３月５日出願の特願昭６１−　　　号明細書に記載さ
れている。

また、バンドの序列の決定をオートラジオグラフか表示
された画面上で解析者か読取カーソルを用いて目視によ
り行なった場合には、使用された読取カーソルをカーソ
ル情報として予め記録保存しておくことにより、各バン
ドに最適なカーソルを即座に表示することかできる。こ
の読取カーソルの保存方法の詳細については本出願人に
よる昭和６１年３月１２日出願（３）の特願昭６１−号
明細書に記載されている。

画面上には、読取カーソルの表示と同時に最下端のバン
ドについて決定済みの塩基基（Ｔ）をカーソルの下方に
表示する。

次にバンドの序列確認のための情報か入力されると（キ
ー入力等）、最下端から二番目のバンドをバンド情報の
中から抽出する。具体的に、バンド情報が表示された画
面上ではポインタによって該バンドを指し示し、泳動パ
ターンか表示された画面上では該バンドの位置を通過す
る読取カーソルおよび該バンドの塩基基を表示する。

このようにして順々に、ｒ・め序列が決定されたバンド
についてカーソルと塩基基を表示しながらバンドの序列
か正しいか否かを確認することかできる。なお、この際
に上記四種類の塩基特異的ＤＮＡｆｆ１片物の組合せか
排他的な組合せであることから、同じ位置に二つ以上の
バンド（異なるレーンのバンド）は存在しえないことを
利用して、バンドの序列の確認を行なうことができる。

第６図は、確認過程にある画面上に表示された泳動パタ
ーンのオートラジオグラフ１１、読取カーソル１２およ
び塩基各欄１３の例を示す図である。なお、第６図にお
いて泳動方向は右方向である。

この際に、確認処理済みの読取カーソルと未処理の読取
カーソルとを区別し、また確認処理済みの塩基各欄と未
処理の塩基名柚とを区別して表示してもよい。これによ
り、一層バンドの順序の逆転、重複読みあるいは読み落
としを発見しやすくすることができる。これらの区別は
、色彩、模様、輝度の相違などによって行なうことかて
きる。また、確認未処理のカーソルおよび塩基各欄は、
次のキー入力によって処理済みと判断して直ちに表示を
転換する。そして、新たに画面上には未処理の識別を付
したカーソルを表示する。

なお、確認過程て、設定された読取カーソルが泳動パタ
ーンに合致しなくなった場合には、前記と同様の操作を
鰻り返すことにより簡単に所望の形状のカーソルを作成
表示することができる。

さらに、本発明の第二の方法によれば、確認過程でバン
ドの順序の逆転、重複読みあるいは読み落としなどの序
列に誤りがあることが見い出された場合には、次のキー
入力の前に表示画面に基づいて入力された情報に従って
、バンドの序列を修正することができる。

バンドの序列の修正は、たとえばバンドの重複読みが生
じている場合には、キー入力茅による入力情報に従って
該バンドに対応するカーソルおよび塩基基を表示画面か
ら門−除することにより行なう、バンドの読み落としか
生している場合には、新たに該バンドに対応するカーソ
ルおよび塩基基を画面上に追加して表示することにより
行なう。

また、バンドの順序の逆転が生じている場合には、該バ
ンドに対応するカーソルおよび塩基基を画面上で変更（
すなわち、削除および追加）することにより行なう。

このようにして順々に、予め序列が決定されたバンドに
ついてカーソルと塩基基を表示し、必要に応じてカーソ
ルおよび塩基基の削除、追加、変更を行ないながら、バ
ンドの序列が正しいか否かを確認するとともに修正する
ことができる。

バンドの序列の確認、さらには修正操作か終了した画面
上には、泳動パターン、各バンドに一対一で対応した読
取カーソルと塩基基とが表示されて残る。この一連の塩
基を端から順に結ぶことにより、ＤＮＡの塩基配列（例
えばＴ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｔ　−Ｃ−Ｇ　−−−−）を得る
ことかできる。

画面上の泳動パターン、読取カーソルおよび塩基配列に
ついての情報はそれぞれ、パターン情報、カーソル情報
および塩基配列情報として別個にかつ相互に対応づけて
記録保存するのが好ましい。

すなわち、画面上に画像表示された泳動パターンについ
ての情報（パターン情報）のみを、第１図に示したよう
な濃淡画像、第２図に示したような鳥轍図、あるいは二
値画像に対応するデジタル画像データとして記録保存す
る。デジタル画像データは、上述したように一画素に対
応する二次元の座標（ｘ、ｙ）と信号レベル（ｚ）とか
らなる。

また、泳動パターンの各バンドに重ね合わせて固定され
た多数の読取カーソルについての情報（カーソル情報）
のみを、第７ＵＡに示すようなカーソルデータとして独
立に記録保存する。カーソル情報は、塩基配列決定され
たバンドの個数に相当する個数のカーソルについてのデ
ータであり、各カーソルにはバンドの序列に従う番号が
付されており、そしてたとえば読取カーソルが折れ線状
である場合には各折れ線の節目の二次元座標がデータと
して記録保存される。

また、得られた塩基配Ａについての情報（１１！基配列
情報）のみを、独立に第８図に示すような文字列データ
として記録保存する。この塩基配列情報にはバンドの序
列に従う番号か付されている。

これにより、バンドの序列が決定された段階においてパ
ターン情報（たとえば各画素に対応するデジタル画像デ
ータ）とバンド情報とから構成されていたオートラジオ
グラフの解析情報は、この確認修正操作後にはパターン
情報（表示画像に対応するデジタル画像データ）、カー
ソル情報および１１！基配列情報から構成されることに
なる。

パターン情報とカーソル情報とは、画面に固定された二
次元座標で対応づけられて（これをアドレス対応という
）保存され、カーソル情報と塩基配列情報とは泳動パタ
ーン上のバンドの序列順の番号で対応づけられて（これ
を順序対応という）保存される。これらの情報は、二次
記憶装置などの保存手段に記録保存されて三つの情報フ
ァイルか形成される。そして、これらの情報ファイルは
、何時でも再び組み合わせてＣＲＴ等の表示画面あるい
は感光材料、感熱記録材料等の記録材料上に再現するこ
とが可能であるから、後日他人か解析結果の確認をする
場合にバンドと塩基基との照合、確認を容易に行なうこ
とができる。

なお、情報の記録保存はオートラジオグラフの解析（塩
基配列の確認、修正）終了後のみならず、その途中で随
時性なうことが可能である。解析結果を上記三種類の情
報として記録保存する方法の詳細については前記昭和６
１年３月１２０出願（３）の特願昭６１−　　　号明細
書に記載されている。

上記においては、試料である塩基特異的ＤＮＡ断片物の
混合物として（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）の排他的組合せを利用
した場合について説明したか１本発明の解析方法はこの
組合せに限定されるものではなく、たとえば（Ｇ、Ｇ＋
Ａ、Ｔ＋Ｃ，Ｃ）などの種々の組合せに適用することが
できる。また同様に、塩基特異的ＲＮＡ断片物の混合物
（例えばＧ、Ａ、Ｕ、Ｃの組合せ）についても本発明の
−ｈ用を轟…オスｙ＞ｈ＜１ヘス

【図面の簡単な説明】

第１図は、決定されたバンドの序列に関するバンド情報
の例を示す図である。 第２図は１画面上に濃淡画像として表示された泳動パタ
ーンのオートラジオグラフの例を示す図である。 第３図は、画面上に鳥轍図として表示された泳動パター
ンのオートラジオグラフの例を示す図である。 第４図および第５図はそれぞれ、画面上に表示されたオ
ートラジオグラフを示す図であり、読取カーソルの作成
−ｒ程を説明する図である。 ｌ：泳動バンド、２：マウスカーソル、３．６：線分、
４：起点、５：終点、 ７：読取カーソル 第６図は１画面上に表示された泳動パターン、読取カー
ソルおよび１１！基名欄の例を示す図である。 ｌｌ：泳動パターン、１２：読取カーソル１３：塩基名
欄 第７図は、カーソル情報として記録保存される多数の折
れ線状の読取カーソルの例を示す図である。 第８図は、１′！！基配列情報として記録保存される一
連の塩基名の例を示す図である。 特許出願人　　富士写真フィルム株式会社代　　理　　
人　　　弁理士　　　柳　　川　　泰　　実弟１図 第２図 第４図 第Ｓ図 第６図 ＧＡＧＡＴＴＣＣＣＡＴＧＣＡＧＧ・・・・・・・・・
・・・・三Ｆ続ネ市正書 昭和６２年　４月１０日 昭和６１年　特許願　第５５４８３号 ２、発明の名称 核酸の塩基配列決定のための オートラジオグラフ解析方法 ３、補正をする者 事件との関係　　　　　特許出願人 名　称　　（５２０）富士写真フィルム株式会社４、代
理人 住　所　　東京都新宿区四谷２−１４ミツヤ四谷ビル８
階６、補正により増加する発明の数　　な　し７、補正
の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄。 明細書の「発明の詳細な説明」の欄を下記の如く補正致
します。 記 （１）明細書の第２０頁第４行〜５行目の「低温（−９
０〜−７０°Ｃ）て長時間（数十時間）ＡをＶ低温もし
くは常温で長時間（数時間〜数十時間）Ａと補正する。 （２）明細書の第２３頁第６行〜７行目の「二本以上ｊ
を「−木以上」と補正する。 （３）明細書の第２５頁第７行目および第３５頁第２行
目のｒ特願昭６１−　　　号」を「特願昭６１−４７９
２４号Ｊと補正する。 （ｌｌ）明細書の第２５頁第８行目の「特願昭６１−　
　　号」を「特願昭６１−５５４８１号ｊと補正する。 （５）明細書の第２９頁第９行目の「最初のキー入力に
従って、」の後に「第１１！に示したような、あらかじ
め決定されたＪと挿入する。 （６）明細書の第３５頁第１０行〜１１行目および第４
１頁第１０行目のＩｒ特願昭６１−　　　号」を「特願
昭６１−５５４８２号」と補正する。 （７）明細書の第３９頁第４行〜５行目の「第１図に示
したような」をｌｒ第２図に示したような」と補正する
。 （８）明細書の第３９頁第５行目の「第２図に示したｊ
を「第３図に示（９）明細書の第４０頁第１２行目の１
画面に固定ｊを１画像に固定Ｊと補正する。 −以上一

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、放射性標識が付与された塩基特異的ＤＮＡ断片物も
   しくはＲＮＡ断片物が支持媒体上に一次元的方向に分離
   展開されて形成された複数の分離展開列のオートラジオ
   グラフを解析することにより、核酸の塩基配列を決定す
   る方法において、１）バンドの序列が決定されたオート
   ラジオグラフを、該オートラジオグラフに対応するデジ
   タル信号に基づいて電気的に画像表示する工程、２）バ
   ンドの序列確認のための入力情報に基づいて、分離展開
   列を横切りかつ一つのバンドの位置を通過するように読
   取カーソルをオートラジオグラフに固定して画面上に表
   示し、同時に該バンドの塩基名を画面上に表示する工程
   、 ３）バンドの序列確認のための入力情報に基づいて、前
   工程でカーソル固定されたバンドに隣接するバンドの位
   置を通過するように読取カーソルをオートラジオグラフ
   に固定して画面上に表示し、同時に該バンドの塩基名を
   画面上に表示する工程、および ４）第三工程を繰り返すことにより、決定されたバンド
   の序列をオートラジオグラフ上で確認する工程、 を含むことを特徴とする核酸の塩基配列決定のためのオ
   ートラジオグラフ解析方法。 ２、上記バンドの序列が、オートラジオグラフに対応す
   るデジタル信号について信号処理を行なうことにより決
   定されたものであることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載の核酸の塩基配列決定のためのオートラジオグ
   ラフ解析方法。 ３、上記第二工程でカーソル固定されたバンドが分離展
   開列の最下端のバンドであり、上記第二乃至第四工程に
   おいて最下端のバンドから順にバンドの序列を確認する
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の核酸の塩
   基配列決定のためのオートラジオグラフ解析方法。 ４、上記第二および第三工程において、バンドの序列確
   認のための入力情報が決定されたバンドの序列に基づく
   ものであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の核酸の塩基配列決定のためのオートラジオグラフ解析
   方法。 ５、上記第二および第三工程において、読取カーソルを
   折れ線もしくは曲線として表示することを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載の核酸の塩基配列決定のための
   オートラジオグラフ解析方法。 ６、上記画像表示された分離展開パターンのオートラジ
   オグラフ、オートラジオグラフに固定された確認後の複
   数の読取カーソルおよび確認されたバンドの序列をそれ
   ぞれ、（１）パターン情報、（２）カーソル情報および
   （３）塩基配列情報として分離し、かつ（１）と（２）
   および（２）と（３）をそれぞれ対応づけて記録保存す
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の核酸の
   塩基配列決定のためのオートラジオグラフ解析方法。 ７、上記第一工程において、オートラジオグラフを濃淡
   画像、二値画像、もしくは分離展開方向に沿った位置と
   画像濃度とからなる複数の二次元波形を分離展開方向に
   垂直な方向に一定間隔で多重表示してなる画像として画
   像表示することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の核酸の塩基配列決定のためのオートラジオグラフ解析
   方法。 ８、上記第一工程において、オートラジオグラフに対応
   するデジタル信号が、支持媒体と輝尽性蛍光体を含有す
   る蓄積性蛍光体シートとを重ね合わせて、支持媒体上の
   放射性標識物質のオートラジオグラフを該蛍光体シート
   に蓄積記録した後、該蛍光体シートに励起光を照射して
   該オートラジオグラフを輝尽光として光電的に読み出す
   ことにより得られたものであることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載の核酸の塩基配列決定のためのオー
   トラジオグラフ解析方法。 ９、上記第一工程において、オートラジオグラフに対応
   するデジタル信号が、支持媒体と写真感光材料とを重ね
   合わせて、支持媒体上の放射性標識物質のオートラジオ
   グラフを該感光材料に感光記録した後、該感光材料上に
   可視化されたオートラジオグラフを光電的に読み取るこ
   とにより得られたものであることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項記載の核酸の塩基配列決定のためのオート
   ラジオグラフ解析方法。 １０、放射性標識が付与された塩基特異的ＤＮＡ断片物
   もしくはＲＮＡ断片物が支持媒体上に一次元的方向に分
   離展開されて形成された複数の分離展開列のオートラジ
   オグラフを解析することにより、核酸の塩基配列を決定
   する方法において、１）バンドの序列が決定されたオー
   トラジオグラフを、該オートラジオグラフに対応するデ
   ジタル信号に基づいて電気的に画像表示する工程、２）
   バンドの序列確認のための入力情報に基づいて、分離展
   開列を横切りかつ一つのバンドの位置を通過するように
   読取カーソルをオートラジオグラフに固定して画面上に
   表示し、同時に該バンドの塩基名を画面上に表示する工
   程、 ３）バンドの序列確認のための入力情報に基づいて、前
   工程でカーソル固定されたバンドに隣接するバンドの位
   置を通過するように読取カーソルをオートラジオグラフ
   に固定して画面上に表示し、同時に該バンドの塩基名を
   画面上に表示する工程、 ４）第三工程において表示された読取カーソルおよび／
   または塩基名を、表示画面に基づく情報の入力がある場
   合には該情報に従って削除し、追加し、もしくは変更す
   る工程、および ５）第三および第四工程を順次繰り返すことにより、決
   定されたバンドの序列を確認し、修正する工程、 を含むことを特徴とする核酸の塩基配列決定のためのオ
   ートラジオグラフ解析方法。 １１、上記バンドの序列が、オートラジオグラフに対応
   するデジタル信号について信号処理を行なうことにより
   決定されたものであることを特徴とする特許請求の範囲
   第１０項記載の核酸の塩基配列決定のためのオートラジ
   オグラフ解析方法。 １２、上記第二工程でカーソル固定されたバンドが分離
   展開列の最下端のバンドであり、上記第二乃至第五工程
   において最下端のバンドから順にバンドの序列を確認修
   正することを特徴とする特許請求の範囲第１０項記載の
   核酸の塩基配列決定のためのオートラジオグラフ解析方
   法。 １３、上記第二および第三工程において、バンドの序列
   確認のための入力情報が決定されたバンドの序列に基づ
   くものであることを特徴とする特許請求の範囲第１０項
   記載の核酸の塩基配列決定のためのオートラジオグラフ
   解析方法。 １４、上記第二および第三工程において、読取カーソル
   を折れ線もしくは曲線として表示することを特徴とする
   特許請求の範囲第１０項記載の核酸の塩基配列決定のた
   めのオートラジオグラフ解析方法。 １５、上記画像表示された分離展開パターンのオートラ
   ジオグラフ、オートラジオグラフに固定された確認修正
   後の複数の読取カーソルおよび確認修正されたバンドの
   序列をそれぞれ、（１）パターン情報、（２）カーソル
   情報および（３）塩基配列情報として分離し、かつ（１
   ）と（２）および（２）と（３）をそれぞれ対応づけて
   記録保存することを特徴とする特許請求の範囲第１０項
   記載の核酸の塩基配列決定のためのオートラジオグラフ
   解析方法。 １６、上記第一工程において、オートラジオグラフを濃
   淡画像、二値画像、もしくは分離展開方向に沿った位置
   と画像濃度とからなる複数の二次元波形を分離展開方向
   に垂直な方向に一定間隔で多重表示してなる画像として
   画像表示することを特徴とする特許請求の範囲第１０項
   記載の核酸の塩基配列決定のためのオートラジオグラフ
   解析方法。 １７、上記第一工程において、オートラジオグラフに対
   応するデジタル信号が、支持媒体と輝尽性蛍光体を含有
   する蓄積性蛍光体シートとを重ね合わせて、支持媒体上
   の放射性標識物質のオートラジオグラフを該蛍光体シー
   トに蓄積記録した後、該蛍光体シートに励起光を照射し
   て該オートラジオグラフを輝尽光として光電的に読み出
   すことにより得られたものであることを特徴とする特許
   請求の範囲第１０項記載の核酸の塩基配列決定のための
   オートラジオグラフ解析方法。 １８、上記第一工程において、オートラジオグラフに対
   応するデジタル信号が、支持媒体と写真感光材料とを重
   ね合わせて、支持媒体上の放射性標識物質のオートラジ
   オグラフを該感光材料に感光記録した後、該感光材料上
   に可視化されたオートラジオグラフを光電的に読み取る
   ことにより得られたものであることを特徴とする特許請
   求の範囲第１０項記載の核酸の塩基配列決定のためのオ
   ートラジオグラフ解析方法。