JPH07508659A - 洗剤に使用する新しいリパーゼ変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 洗剤に使用する新しいリパーゼ変異体 技術分野 本発明は改良型リパーゼ、および、これを使用した洗剤またはクリーニング剤に 関する。

発明の背景 リパーゼは脂質を加水分解することが可能な酵素であり、脂肪および油処理、洗 剤、診断薬等幅広い応用範囲で利用されている。

細胞外リパーゼ（トリアジルグリセロール・アシルヒドロラーゼ、Ｅ、Ｃ，３， １，１，３）は種々の微生物で生産されている。例えば、適当な微生物のリパー ゼは米国ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコトルラ・ リポリチカ（Ｍｙｃｏｔｏｒｕｌａ　ｌ１ｐｏｌｙｔｉｃａ）およびスフレロチ ニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）等、多様な微生物から入手できる。

洗剤にリパーゼを使用した例は、例えば［！Ｐ４６３１００　（シュードモナス ・アルカに盛んに使用されている。醗酵によるリパーゼの収率を上げるために幾 つかのリパーゼ遺伝子がクローニングされ、同一種または異種において発現され ている。

リパーゼ遺伝子のクローニングが報告されているシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ ｍｏｎａｓ）種の例には、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 　ｃｅｐａｃｉａＸ　［！Ｐ　３３１３７Ｂ））、ｓｔ：Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 　２３：３３３（１９７３）に報告されているようにＤＮＡ−ｒＲＮＡおよびＤ ＮＡ−ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験に基づいている。より詳細な概説に はＢｅｒｇｅｙ’　ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔ ｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｖｏｌ、　１．５ｅｃｔｉｏｎ　４．　ｐｐ、１６０−１６ １（１９８S）、　Ｎ、Ｒ。

クリーブ（Ｋｒｉｅｇ）およびＪ、Ｇ、ホルト（Ｈｏｌｔ）編、ウィリアムス・ アンド・ウィルキンス版、バルチモア、ロンドン）がある。また、この概説はそ の分類が形態学的データおよび１６ＳリボゾーマルＲＮＡホモロジーに支持され ていることを記してい　。

る。

望ましい応用特性を有するシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）は２つの ＤＮＡホモロジーグループに分類される。シュードモナス・シュードアルカリゲ ネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）　、シ ュードモナス“アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｌｃａｌｉｇｅｎ ｅｓ）　、シュードモナス・アルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇ ｉｎｏｓａＸ例えばＥＰ３３４４６２参照）、シュードモナス・スツツエリ（Ｐ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　５ｔｕｔｚｅｒｉ）およびシュードモナス・メンドシナ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）は密接に関係しており、グル ープＩに属する。例えば、シュードモナス・アルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ ｓ　ａｅｒｕｇｉｎ匹すのリパーゼはシュードモナス・シュードアルカリゲネス （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌ　ｉｇｅｎｅｓ）のリパー ゼと８１Ｘのホモロジーを有する。シュードモナス・グルメ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ ｎａｓ　ｇｌｕｍａｅ）とシュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 　ｃｅｐａｃｉａ）はグループＨに属する。表１に種々の株に由来するリパーゼ 遺伝子のホモロジー比較を示した。このホモロジー比較からシュードモナス・フ ラジ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｒａ高く、より親油的である。この性質は洗 剤に応用する際に大変有利である。シュードモナス・シュードアルカリゲネス（ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）のリパーゼの 疎水的性質は表面−の容易な付着を起こす。他のグループまたは例えば、フミコ ラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　Ｉａｎｕｇｉｎｏｓａ）等、他の生物由来 のリパーゼは往々にして親水的である。洗剤に使用した際に高い疎水性のグルー プ■のリパーゼのみがうまく作用しうる。

表１　他のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）リパーゼに対するホモロ ジー表の下部は核酸配列の比較を示している。上部はアミノ酸配列の比較を示し ている。

すでに記してきたようにリパーゼは洗剤組成物の成分として使用しつる。洗剤組 成物にはリパーゼ以外にその形状に依存して多くの既知成分が含まれている。

一般に粉末洗剤にはビルグー（例えばゼオライト、リン酸塩）、界面活性剤（例 えばアニオン性、非イオン性）、ポリマー（例えばアクリル）、漂白剤前駆体（ 例えば硼酸塩）、漂白活性剤、ストラクチュラント（例えばシリケート）、ｐＨ 調整剤（例えばアルカリ）を含んでいる。

一般に液体洗剤は界面活性剤（例えばアニオン性および非イオン性）、漂白剤前 駆体（例えば硼酸塩）、漂白活性剤、ｐＨ調整剤（例えばアルカリ）を含んでい る。

これらの組成物のなかには酵素（例えばプロテアーゼ、アミラーゼ）、有機酸、 無機酸、繊維柔軟剤のような成分も含めることがある。

リパーゼを洗剤の成分として使用するためには洗浄性能のほかにこのような組成 物中に存在する成分に対する耐性を持たなくてはならない。

洗剤に使用するために選択される酵素は、例えば古典的スクリーニング法または 最近の遺伝的およびタンパク質工学的手法等、いくつかの方法で開発しうる。

望ましい酵素活性を示す生物または微生物のスクリーニングは、例えば、微生物 または微生物の培養上清から酵素を単離精製し、その生物学的性質を決定し、そ の生物学的性質が特定の用途に対する要求を満足するかどうかを判定することに よって行われる。もし、同定された酵素が天然の生物から得られない場合は、組 み換えＤＮＡ技術を用いてその酵素をコードする遺伝子を単離し、他の生物内で その遺伝子を発現させ、発現された酵素を単離精製後、目的に適しているかどう かを判定する。

特定の目的に適した新しい酵素を得るための別の方法には既存の酵素の改変があ る。とりわけこれは化学修飾法によって行われる（Ｗｏ　９１／１６４２３）。

一般に、これらの方法は共通した側鎖を有する全ての受容残基を修飾する点で特 異性を欠いているか、さもなくば修飾すべき適当なアミノ酸の存在に依存してお り、さらに、この方法ではその酵素の構造が壊れていないかぎり到達するのが困 難なアミノ酸を修飾することが出来ないこともしばしばある。

これとは別に、コードされている遺伝子の突然変異誘発により酵素を改変する方 法は上述の非特異性の心配が無く、優れた方法であると考えられている。突然変 異誘発はランダム突然変異誘発または部位指定突然変異誘発により行いつる。

微生物全体を化学変異原または変異性照射で処理することによるランダム突然変 異誘発ももちろん酵素の改変を起こす。この場合、特定の変異体を探索する強力 な選択法が必要となる。ランダム突然変異誘発による変異酵素を高い確率で単離 するには、コード遺伝子をクローニング後、インビトロまたはインビボでこれを 変異させ、その変異遺伝子を再クローニングすることにより適当な宿主細胞中で コードされている酵素を発現する事で行いうる。改変酵素の生産に適した宿主こ の場合、望ましい変異酵素を選択するための適当な生物学的選択方法が無ければ ならない。これらの生物学的選択方法は必ずしも工業的用途に最も適した酵素を 直接選択するものではない。例えば、ＨＰ　０４０７２２５はプロテアーゼまた は酸化剤による攻撃に対して安定なリパーゼを報告している。これらの改良が特 定の問題を解決することは正しいが、必ずしもより良い洗浄性能を示すものでは ない（例えば、ＥＰ　０３２８２２９）。

さらに、Ｉ！Ｐ　０４０７２２５はシュードモナス・グルメ（Ｐｓｅｕｄｏｉｘ ＋ｎａｓ　ｇｌｕｍｅ）由来のリパーゼの配列の変異を示している。この出願は 他の微生物に由来するリパーゼをコードする遺伝子の場合に置換すべき残基を示 してはいない。一般に特定の酵素に関する変異の最良の選択は他の相同的の酵素 に対する最良の選択とは限らず、関連性の低い酵素の対しては確実なものとはな らない。

１１１０９２１０５２４９は洗浄性能、安定性、保存性および特異性の改良を起 こしうる脂質接触領域の疎水性又は静電的性質の異なるリパーゼ変異体を報告し ている。

しかし、本出願に記載されているリパーゼがシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ ｎａｓ）のリパーゼとほとんどホモロジーを示さず、かつ、実際に全く異なる性 質を示すことから、’［］　９２１０５２４９は望ましい性質を有するシュード モナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｎａｓ）のリパーゼを得るためにどの部位を変異すべき かを判定するのに使用することは出来ない。

発明の概要 本発明は野生型のシュードモナス・シュードアルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｗｎ ａｓμｕｄｏａｌｃａｌ　ｉｇｅｎｅｓ）のリパーゼの少なくとも部位２１に対 応するメチオニンを他のアミノ酸に置換し、望ましい性質の改変を起こした新し い改変リパーゼを提供している。本発明の望ましい態様において、これらのリパ ーゼ変異体は使用条件において洗浄性能の向上を示した。Ｍ２１残基をロイシン 、セリンまたはアラニンで置換した変異体が特に望ましい。

図面の簡単な説明 図１：ＰＣＲを用いた部位指定突然変異誘発図２：染色体へのプラスミドｐＢＲ の組み込み図３＝染色体からリパーゼ遺伝子およびプラスミドを欠失させる組み 換え図４＝染色体およびプラスミドへの変異リパーゼＤＮＡの導入図５＝３°側 隣接領域での組み換え 発明の詳細な説明および好ましい態様 本明細書で使用されている「改良された洗浄性能」という言葉は、使用条件下、 即ち十分に確立された洗剤成分の存在下で、かつ確立された条件下で改良された 洗浄結果を示す場合に使用される。

アミノ酸配列を比較してみるとシュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍ ｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来のリパーゼの部位１６のメチオニンは（ ウォールファース（Ｗｏｈｌｆａｒｔｈ）等、　（１９９２）　Ｊ、ｏｆ　Ｇｅ ｎｅｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　１３８　（７）：１３２５−１３３５ ）、シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｓ ｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）由来の対応する酵素の部位２１のメチオニン と等価である。

産しつるリパーゼである。ホモロジーとは、異なるアミノ酸（またはタンパク質 ）配列を整列および比較したときに同一と見なせるアミノ酸の数と定義される。

我々は工業的プロセス条件下で改良された洗浄性能を示す変異体または改良酵素 を得るのに始めて成功した。

１つ以上のアミノ酸を他の望ましいアミノ酸に特異的に置換できる部位指定突然 変異誘発を使用して改良型の酵素を構築し、選択することが出来た。

ｏａｌｃａｌ　ｉｇｅｎｅｓ）のリパーゼの少なくとも部位２１に対応する特異 的突然変異、即ち、本来のメチオニンの別のアミノ酸による置換は、以外にも漂 白剤の存在下、または非存在下で洗浄性能の向上を示し、このことは洗浄性能に おけるこの部位の重要性を示している。従って部位２１のメチオニンの置換は酸 化安定性のみならず、洗浄性能の改良をも引き起こす。

にある。このことは、これらのリパーゼの全体的な三次元構造が良く似ているこ とを示している。従って、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｎａｓ）株のグルー プ１に属する他のリパーゼにおけるこの構造部位の修正も洗浄性能に影響するで あろう。

上述めメチオニンの置換に適したアミノ酸には、Ａｌａ、　Ｓｅｒ　、　Ｌｅｕ 　、　Ｖａｌ　、　Ｐｈｅ、ＡｓｎおよびＡｓｐがある。

本発明の望ましい態様において、野生型のシュードモナス・シュードアルカリメ チオニンをロイシンで置換すると、以外にもこの変異体の疎水性又は静電的性質 の実質的変化は見られないにもかかわらず洗浄性能の向上が示された。

酵素における望ましい性質の変化を評価する方法を提供している。このような性 質の変化には洗浄性能の向上、特異性の変化、ｐＨ依存性の変化、基質依存性の 変化、または酸化安定性の向上、またはこれらの性質の組み合わせが含まれる。

洗浄条件下におけるリパーゼの性能の測定法（ＳＬＭテスト）本発明では洗浄工 程におけるアルカリリパーゼ変異体の評価には所謂ＳＬ＆４テストを使用した。

ＳＬＭテストは、Ｔ、ハシモト（Ｈａｓｈｉｌ）Ｏｔｏ）等（Ｙｕｋａｇａｋｕ 　３４　（１９８５）６０６−６１２）が開発した方法と同様の原理を使用して いるが、分析に要する時間は著しく削減されている。この方法は、試験シミとし て繊維に固定化した非エマルシコン性脂質または脂肪酸を使用し、洗浄工程後、 そのスワッチを抽出し、その抽出物中の脂肪および脂肪酸を分析するステップを 含んでいる。使用した条件に依存してリパーゼ活性の結果生成する脂肪酸は、洗 浄工程の間、残存するトリグリセライドと共に布地上に留まりつる。従って、ス ラッチ上に残った生成物の量が洗浄工程におけるリパーゼの性能の良い尺度とな る。

以下に示すものはＳＬＭテストがいかに旨く行われたかを示す典型的な例である 。

繊維としてポリエステルのスワッチを使用し、基質としてはトリオレインまたは 精製したオリーブ油（いずれもシグマの製品、ＵＳＡ　）を用いた。トリオレイ ンの加水分解は繊維抽出後のクロマトグラフィー法で追跡した。

５ＬＩＪテストの目的で使用した洗浄工程を以下に示す。ｎ−ヘキサンに溶かし た１０１１ｇのオリーブ油（１２，５％　）　８０μｍをポリエステルのスワッ チ（３Ｘａ　ｃｍ）にスポツティングした。このスワッチを室温で空気乾燥した 。ＳＴＷ　（標準タップ水：２−　塩化カルシウムおよび０．７ｍＭ　塩化マグ ネシウム／蒸留水）または洗剤を溶かしたｓ’ｒｖを１０＋ｎｌ含む洗浄溶液を 栓付きの三角フラスコ（５０ｍｌ）に入れ、４０℃の振盪水浴で保温する。洗浄 工程は三角フラスコにリバー−１ｒ”Ｍｌ　（４０１ＬＵ　、以下参照）および スワッチを入れた直後から開始さね、４０分間振盪する。ブランク実験にはリパ ーゼを含めない。洗浄後、スワッチをｓｒｗで濯ぎ５５℃で１時間乾燥してから 第２の洗浄サイクルを行う。乾燥したスワッチは基質および生成物のクロマトグ ラフィー分離に用いる溶出液と同様の組成を有する溶剤５ｍｌを含むガラス管中 で回転することにより抽出操作を行う。

抽出液中のトリグリセライドの残量は、生成した遊離の脂肪酸および１．２−お よび１．３−ジアシルグリセライドの量とともにＨＰＬＣで測定する。

装置および条件 ポンプ：ＬＫＢ（モデル２１５０） 検出器：屈折率計（ジョビン・イボン）インジェクション・システム：パーキン ・エルマー１５５−１０１　；１０μｍインテグレータ一二スペクトラ・フィジ ックス、クロムシジェットカラム：　ＣＰ　Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒ−３ｉ　（ク ロムバック）　、１００　Ｘ４．６ｏｎ溶出液二〇−ヘキサン／イソプロピルア ルコール／蟻酸＋９７５：２５：２．５（Ｖ／ＶＱ、１ｍｌ／これらの条件下、 トリオレイン、オレイン酸、１．３−および１．２−ジアシルグリセライドの保 持時間は各々１．２．１．６．２．４および３．４分であった。ピークの面積ま たは高さを測定した。これらはスワッチからの抽出のトリグリセライド、遊離脂 肪酸およびジアシルグリセライドの回収の尺度となる。非洗浄スワッチの抽出に よるトリグリセライドの回収を１００　％とした。先に述べた条件下でのオリー ブ油、オレイン酸、１．２−および１．３−ジアシルグリセライド間の屈折率の 比はピークの高さにより各々１．００．０．９８．２．ｌＯおよび１．３０であ ることが分かった。

リパーゼ活性の測定法 ＩＬＵで表される本発明のリパーゼおよび変異体の活性はオリーブ油の加水分解 に基づいて測定した。加水分解は２〇−塩化ナトリウムおよびｌＯ−塩化カルシ ウムを含む０．４ｍＭトリス・バッファ（ｐＨ９）にＩＯＸのオリーブ油を添加 したｐＨスタット中、３０℃で測定した。ＩＩＬＵはテスト条件下において１分 間に１ｒモルの脂肪酸を遊離するのに必要な酵素量であると定義される。

以下の実施例は本発明の説明を目的としたものであり、これを制限するものでは ない。

実施例１ リパーゼ遺伝子の突然変異システムの開発現在の部位指定突然変異誘発の戦略は ２つに分類できる。

■）ギャップを有する二本鎖ＤＮＡの変異プライマーに基づくフィル・インで一 方が変異した鎖を含むヘテロ二本鎖が出来る。

２）目的遺伝子内のカセットを交換することにより適当な変異配列を導入する。

発現カセット中の一部を望ましい変異を含むＰＣＲ断片と交換する。

の一般的説明を行ったジョン（Ｘｉｏｎｇ）の方法に基づくものである。本方法 を図１に模式的に示した。

一本鎖ＤＮＡを単離するために、ＥＰ　０３３４４６２に報告されているプラス ミドｐＴＭＰｖ１８Ａを使用した。増幅反応にはベント・ポリメラーゼ（バイオ ラド）を使用した。

このポリメラーゼは３゛プルーフリーデイング活性を有しており、ＰＣＲ反応に おける取り込みミスは少ない。

ＰＣＲ反応は以下に示すバッファ中で行った：　１０ｍ１ｉｌ　ＫＣＩ　、　１ ０ｍ（ＮＨ４）雪Ｓ０４．２０ＷＭトリスー）ＩＣＩ（ｐＨ８，８）　、２　ｔ ｒＭ　Ｍｇ５Ｏ＋および０．　Ｉ　Ｘ　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，０，２１１ ！１ｄ` ＴＰ、　０．２ｍＭｄＣＴＰ、０．２ｍＭｄＧＴＰ、０．２＋ＭｄＴｒＰおよび ｌユニットのベント・ポリメラーゼ。

ステップｌにおいて、０．５μＭの変異を含むプライマーＡ、０．０５μＭのプ ライ７−８および１−１０ｎＨの一本鎖ｐＴｈｌＰｖ１８Ａを５０μｍの反応混 合物に添加し、９８℃：２分、５５℃：２分、７２℃＝２分のサイクルを２５サ イクル行った。

その後、クレノーポリメラーゼおよびリガーゼを添加し、プライマーとして変異 を含む断片を用いて一本鎖ＤＮＡをフィルインした。これで一方が変異を有する ヘテロ二本鎖ができる。この混合物にエクソヌクレアーゼを添加し、−重鎖ＤＮ ＡおよびプライマーＡおよびＢを除去した。ＤＮＡは沈殿後、ＰＣＲバッファに 溶解した。変異を含む新たに合成されたＤＮＡをステップ２のテンプレートとし て使用した。

ステップ２では、０．０５μＭのプライマー〇をこの混合物に添加し、先と同様 の第２のＰＣＲを行った。

ＰＣＲフラグメントを適当な制限酵素で消化し、組み込みベクターにサブクロー ニングした。

実施例２ 選択した。使用したオリゴヌクレオチドを表２に示す。

表２ 実施例３ シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｓｅｕ ｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）　Ｍｌ（ＣＢＳ　４７３．８５）のリパーゼ遺伝 子の染色体不活性化シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍ ｏｎａｓ　ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）中では複製できないが、他の 微生物では複製できる自殺型組み込みプラスミドを用いてシュードモナス・シュ ードアルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅ ｎ照）の染色体中のリパーゼ遺伝子を不活性化した。

リパーゼを含む遺伝子フラグメントをプラスミドｐＴＭＰｖ１８から、大腸菌で は複製できるがシュードモナス・シュードアルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏ＋ｎｏ ｎａｓ　ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）では複製できないプラスミドｐ ＢＲ３２２（ポリバー（Ｂｏｌ　１ｖａｒ）等、Ｇｅｎｅ　２（１９７７）９５ −１１３）にサブクローニングした。さらに、このプラスミドから内部のフラグ メントの欠失を行った。このプラスミドをｐＢＲｆｌｉｎｋと命名した。

シュードモナス−シュードアルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｓｅｕ ｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）Ｍｌ（ＣＢＳ　４７３．８５）をｐＢＲｆｌｉｎ ｋにトランスホーメーションした。このプラスミドはシュードモナス（Ｐｓｅｕ ｄｏｍｏｎａｓ）中で複製できないため、組み込みによりテトラサイクリン耐性 のコロニーのみ得ることが出来る。いくつかのテトラサイクリン耐性のコロニー （５ｍｇハ）を選択した。この株では、プラスミドｐＢＲｆｌａｎｋが５°また は３°側隣接領域における単一の組み換えにより細菌の染色体への組み込まれて いる（図２）。これらの株が機能的リパーゼ遺伝子を含んでいることから、これ らはリパーゼ陽性であり、かつ、テトラサイクリン耐性であるという表現型を有 する１次の実験のためにいくつかの株を選択した。染色体がリパーゼ遺伝子およ びプラスミドを欠失させるために、第２の組み換え（切りだし）を行った。この 事は株を数日間、抗生物質を含まないＢＨＩ（プレイン・ハート・インフュージ ョン）培地中で生育させることにより達成しうる。

さらに、この細胞をトリブチリンを含む寒天培地にブレーティングした。リパー ゼ陰性の表現型を持つコロニーについても選択寒天培地で生育できるかどうかを 試した。このリパーゼ陰性の株をＰｓ６００と命名した。

組み込み、および第２の組み換えの模式図を図２および図３に示した。

リパーゼ陰性株シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ ａｓ　ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）　Ｐｓ６００における変異リパー ゼ遺伝子の導入多量の変異酵素を生産するために、変異遺伝子を染色体中ならび にプラスミドとして同株に導入した。染色体への変異リパーゼ遺伝子の組み込み は、先の実施・例において説明した方法で行った。

この方法の模式図を図４および図５に示した。

変異リパーゼの生産 この株をＥＰ　０３３３４４６２に示した方法で生育させた。この培養培地力島 ら１ノ（−ゼタンパク質を精製した。この操作もＥＰ　０３３４４６２に示しで ある。

実施例４ Ｍ２ル変異体リパーゼの比活性の測定 光に述べた活性検定法およびタンノ々り質含量の定量を行うためのアミノ酸定量 分析を行うことによって、野生型および変異体の比活性を測定した。変異体の比 活性は野生型よりも１．４倍小さかった：　８０００対６３９θＩＬυ／ｍｇタ ンノくり質。

実施例５ 使用条件下（ＳＬＭテスト）における野生型リノ（−ゼＭｌ（ＣＢＳ　４７３． ８５）、およびＭ２１変異体のリパーゼ活性 先に述べた方法に従ってＳＬＭテストを打った。以下の条件下で野生型および変 異体について単一および２サイクルの洗浄テストを行った。

−標準タップ水（Ｓｍ −洗剤アリール・ウルトラ”（２ｇ／ｌ）−指示されたリパーゼ投入量 アリール・ウルトラはブロクター・アンド・ギヤ２７１１社の製品であり、市販 されている。この洗剤にはプロテアーゼもリノく−ゼも含まれて（１なｔｌ。

これらの条件は基本的にヨーロツノくの洗浄条件を示して（（る。

］Ｌユ この表から使用したリパーゼが布地に対して脂質分解的性質を示していると考え られる。これらの結果はここでの使用条件下においては同菫量添加したときに殿 ルおよびＭ２１Ａ変異体が野生型よりも活性が高いことを明確に示している。Ｍ ２１Ｓ変異体リパーゼの脂質分解的性質は野生型のリパーゼに匹敵する。

実施例６ ＳＬＭテストに従った洗浄工程における野生型リパーゼ（Ｍｌ）および変異体１ ｆｆｌＬの性能。

これらの酵素の粉末洗剤および漂白システムとの適合性を以下の条件下でチェッ クした。

一標準硬水（０，７５ｍＭカルシウムおよび０．２５ｍマグネシウム）−洗剤タ イド”（Ｉｇ／Ｉ） 一指示されたリパーゼ投入量 一２サイクル洗浄テスト タイド７′″はブロクター・アンド・ギャンブル社の製品であり、市販されてい る。

この洗剤にはプロテアーゼは含まれているがリパーゼは含まれていない。

これらの条件は基本的にアメリカにおける洗浄条件を示している。

表４からこの実施例で使用したリパーゼは布地に対する脂質分解的性質を有し、 特に粉末洗剤において洗浄性能を示すことが明確に読み取れる。この変異酵素の 洗浄性能は洗剤中の漂白剤の有無を問わず野生型よりも優れている。

ｉａ４ リパーゼＭ１および　Ｍ２１　の 會☆ＴＧ　−）リグリセライド、ＤＧ−ジグリセライド　ＦＦＡ々　遊離脂肪酸 実施例７ ＳＬＭテストに従った洗浄工程における野生型Ｍｌ（ＣＧＳ４７３．８５）およ びＭ２１Ｓおよび社ＩＡ変異体の性能 これらの酵素の洗浄性能および粉末洗剤および漂白システムに対する適合性を以 下の条件下でチェックした。

一標準硬水（０，７５＋ｎＭカルシウムおよび０．２５−マグネシウム）−洗剤 タイド”（Ｉｇ／ｌ） 一指示されたリパーゼ投入量 一２サイクル洗浄テスト タイド１はブロクター・アンド・ギャンブル社の製品であり、市販されている。

この洗剤にはプロテアーゼは含まれているがリパーゼは含まれていない。この洗 浄テストに使用したスワッチは洗浄において種々の処理を施した布地に由来する ものである。

これらの条件は基本的にアメリカにおける洗浄条件を示している。

表５からこの実施例で使用したリパーゼは布地に対する脂質分解的性質を有し、 洗剤中の漂白剤の有無を問わず洗浄性能を示すことが明確に読み取れる。Ｍ２１ Ｓの洗浄性能は野生型と同等である一方、Ｍ２１Ａの洗浄性能は野性型を上回っ ている。

す１＜−１’Ｍ１．　Ｍ２＋Ｓ＃、ｌ：び　Ｍ２１Ａの’☆☆ＴＧ＝）リグリセ ライド　、ＤＧ＝ノグリセライド　ＦＦＡ　＝遊離脂肪酸実施例８ 種々の温度における使用条件下での（ＳＬＭテスト）野生型Ｍｌリパーゼおよｎ ２ル変異体のリパーゼ活性 先に示したように５ＬＩＩＩテストを行った。野生型および変異体について以下 の条件下で１回洗浄テストを行った。

一標準タツブ水（ＳＴＷ） 一洗剤アリール・ウルトデ’（２ｇ／ｌ）−指示されたリパーゼ量 アリール・ウルトラ１はブロクタ町アンド・ギャンブル社の製品であり、市販さ れている。これには酵素は含まれていない。

表６ Ｍ２ル変異体および野生型リパーゼ■の有無条件下、種々の温度における１回洗 浄サイクル後のトリグリセライド（Ｔの残存率本実施例はテストの使用条件下、 全ての温度において変異体の脂質分解能力が野生型の能力を上回ることを明確に 示している。本テストにおける使用条件下でのリパーゼ組の至適温度（最高のト リグリセライド加水分解能を示す）は４０℃であり、−ガク異体の至適温度はよ り高い温度５０℃にシフトしていることが分かった。

実施例９ 成形したリパーゼ■およびＭ２１２１変異シェルフ安定性リパーゼ用および変異 体Ｍ２ル、Ｍ２１ＳおよびＭ２１ＡをＰＥＧ−グリルで成形した。これらの顆粒 を密閉したガラス管中以下に示す表７に記した温度で保存した。８週間の保存後 、ｐＨスタットでリパーゼの残存活性を測定した。

以下の表に見られるように、３７℃までの温度における８週間の保存では、全て のリパーゼが本来の活性の９０％以上を保持していた。

表７ リパーゼ狙および種々のＭ２１２１変異保存安定性リパーゼ　種々の温度（℃） における保存後の残存活性α）リパ一ゼ’Ｍｌ　９８　９５　９５ Ｍ２１Ｌ変異体　９７　１０２　１０２Ｍ２１Ｓ変異体　９７　９４　９２ Ｍ２１Ａ変異体　９３　９５　９５ 特に本発明の新しい変異体は洗濯および食器洗浄等の洗剤に使用するのに有用で あるが、当分野で知られているその他の用途に使用することも可能である。リパ ーゼは、通常安定化剤と共に粒子（例えばプリル等）または液体の形で洗剤添加 物として使用されるのが望ましい。Ｍｅｔ　＋２１の置換は洗剤安定性を高くす る効果を持っているが、その程度は使用するアミノ酸に依存する。また、漂白シ ステム（例えばパーボレート／ＴＡｆ！Ｄ）の有無に係わらず液体中でのＭｅｔ 　＋２１変異体の安定性は驚くほど高い。リパーゼはアミラーゼ、プロテアーゼ 、セルラーゼおよび種々の細胞壁分解酵素等の酵素とともに使用しつる。

本明細書に記した全ての出版物（特許および特許出願を含む）は本発明が属する 分野の関係者の技術レベルに適ったものである。また、全ての出版物は各出版物 が個々に特定されて参考として引用されることが示されていると同様に本明細書 に参考として引用されている。

以上明確な理解を目的として実例を基にしである程度詳細に本発明を説明してき たが、本発明の請求の意図または範囲を逸脱すること無しに本発明に変化、修正 を施すことが可能であることは明白である。

配列表 （１）一般的情報 （ｉ）出願者： （Ａ）氏名：ギスト・プロケーズ（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ）　Ｎ、Ｖ。

（Ｂ）番地：Ｐ、０、Ｂｏｘ　１ （の市：デルフト （Ｅ）国：オランダ （Ｆ）郵便番号：　ＭＬ−２６００ＭＡ（Ｇ）電話番号：　３１．１５．７９１ １１１（Ｈ）ファックス番号：　３１．１５．７９３９５７（ｉｉ）発明の名称 ：洗剤に使用する新しいリパーゼ変異体（ｉｉｉ）配列の数二３ （ｉｖ）コンピュータ・リーダプル・フオーム：（Ａ）メディア・タイプ：フロ ッピィディスク（Ｂ）コンピュータ：　ＩＢＭ　ＰＣコンバチ（Ｃ）オペレーテ ィング・システム：　ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェア：パテン トイン・リリース＃１．　Ｏ，ノく−ジョン＃１．２５　（ＥＰＯ）（ｖｉ）先 願出願データ： （Ａ）出願番号：　ＥＰ　９３２０１２１２．３（Ｂ）登録期日＋　２７−ＡＰ Ｒ−１９９３（２）　ＳＥＱ、　ＩＤ　Ｎｏ、　ｌの情報（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２３塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鏡型ニー重鎖 （Ｄ）トポロン−二線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成） （ｉｉｌ）仮定、無し くｉｖ）由来： （のインディビジュアル・アイソレート：プライマーＡ（ｘｉ）配列：　ＳＥＱ 、　ＩＤ　Ｎｏ、　Ｉ　：ＣＧＡＡＧＣＣＧＡＧ　ＮＮＮＧＣＣＧＴＧＧ　ＧＴ Ｃ（２）　ＳＥＱ、　１０　Ｎｏ、　２の情報（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ＝２４塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鏡型ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成） （ｉｉ）仮定：無し くｉｖ）由来： （Ｃ）インディビジュアル・アイソレート：プライマーＢ（ｘｉ）配列：　ＳＥ Ｑ、　１０　Ｎｏ、　２　：ＧＧＡＴＧＣＭＧＧ　ＡＴＧＧＡＴＣＡＧＴ　ＧＣ ＣＣ（２）　ＳＥＱ、　ＩＤ　Ｎｏ、　３の情報（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２４塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鏡型ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（合成） （ｉｉ）仮定：無し くｉｖ）由来： （Ｃ）インディビジュアル・アイソレート：プライマーＣ（ｘ　ｉ）配列：　Ｓ ＥＱ、　ＩＤ　Ｎｏ、　３　：ＣＴＧＣＧＧＧＣＴＧ　ＧＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴ ＧＣＣ部位　Ｘ 充填反応 Ｘ及びＹを含むＰＣＲフラグメントの消化及びベクターへのり０−ニング Ｆｉｇｕｒｅ　１ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｒ１：３８） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＰＴ、ＳＥ ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＢＹ、　ＣＡ、　ＣＨ，ＣＮ、 　ＣＺ、　ＤＥ、　ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　 ＫＲ，ＫＺ、　ＬＫ。

ＬＵ、ＬＶ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、　ＮＺ、　ＰＬ、　ＰＴ、　ＲＯ ，ＲＵ、　ＳＤ、　ＳＥ、　ＳＫ、　ＵＡ、　ＵＳ、ＵＺ、ＶＮ ＦＩ （７２）発明者　ミューレネルス　レオナドルス　ヨハネスソフイー　マリ− オランダ国　エフエル−５１２１エスヴエーレイエン　フークセストラート４２ （７２）発明者　コックス　マリア　マチルダ　ヨゼフィーナ オランダ国　エフエル−２６１３エスエヌ　デルフト　クーンデルストラート　 あ

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも野生型シュードモナス・シュードアルカリゲネスのリパーゼの部 位２１に対応する部位のメチオニンを他のアミノ酸で置換した改変リパーゼであ って、望ましい特性の変化を示すリパーゼ。
2. ２．前記野生型リパーゼがシュードモナスのグループ１の徴生物に由来する請求 項１記載の改変リパーゼ。
3. ３．前記野生型リパーゼがシュードモナス・シュードアルカリゲネスのリパーゼ と少なくとも７０％のホモロジーを有する請求項１または２記載の改変リパーゼ 。
4. ４．前記部位２１のメチオニンがロイシン、セリンまたはアラニンで置換されて いる請求項１乃至３のいずれか１項記載の改変リパーゼ。
5. ５．洗浄性能の向上を示す請求項１乃至４のいずれか１項記載の改変リパーゼ。
6. ６．請求項１乃至５のいずれか１項記載の改変リパーゼを含む洗剤組成物。
7. ７．洗剤成分として請求項１乃至６のいずれか１項記載の改変リパーゼの使用。
8. ８．請求項１乃至５のいずれか１項記載の改変リパーゼをコードする組み換えＤ ＮＡ配列。
9. ９．請求項８記載の組み換えＤＮＡ配列を含む組み換えＤＮＡベクターであって 、改変リパーゼの発現に有用なベクター。
10. １０．請求項８記載の組み換えＤＮＡ配列または請求項９記載の組み換えＤＮＡ ベクターを含む形質転換宿主徴生物。
11. １１．シュードモナスであることを特徴とする請求項１０記載の形質転換宿主微 生物。
12. １２．シュードモナスのリパーゼをコードするＤＮＡ中、少なくともシュードモ ナスシュードアルカリゲネスのリパーゼ中のＭｅｔ＋２１に対応する部位に突然 変異を起こし、かつ、該突然変異に由来する該酵素の性質の変化を試験すること を含む方法。
13. １３．前記性質の変化が洗浄性能の向上、比活性の変化、ｐＨ依存性の変化、基 質特異性の変化および酸化安定性の向上の内の１つ以上の項目に関するものであ る請求項１２記載の方法。