JPH0764876B2 - インシュリン誘導体結晶懸濁液 - Google Patents

インシュリン誘導体結晶懸濁液

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JPH0764876B2
JPH0764876B2 JP59155695A JP15569584A JPH0764876B2 JP H0764876 B2 JPH0764876 B2 JP H0764876B2 JP 59155695 A JP59155695 A JP 59155695A JP 15569584 A JP15569584 A JP 15569584A JP H0764876 B2 JPH0764876 B2 JP H0764876B2
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Description

【発明の詳細な説明】 インシユリンの結晶化は構造分析的作業〔Adams氏他「N
ature」第224巻第491頁（1969年）およびThe Peking In
sulin Structure Research Group「Sc.Sinica」第X VII
巻第152〜118頁（1974年）参照〕の点でもまた薬学的使
用〔Schlichtkrull氏著「Insulin-Kristalle」（1961
年）参照〕の点でも集中的に研究された分野である。イ
ンシユリンの遅延作用形態物として治療上使用するには
通常約30μｍを超えるべきでなく従つて表面が直接的お
よび再生産しうる様式でインシユリンの絶対量と関連す
ることになるできるだけ限定された結晶寸法が重要であ
る。かかるいわゆる単分散懸濁液により、限定された再
溶解力学が予測される筈である。
かかる性質を有する治療上使用されるインシユリン結晶
懸濁液の例は、0.8〜2.5％（インシユリン重量基準）の
亜鉛の存在下に中性pHで安定でありそして遅延作用を示
す約25μｍの大きさの菱面体亜鉛‐インシユリン結晶、
ならびに長さ約10μｍおよび厚さ約１μｍの桿状体の形
態で遅延製剤中に使用されるイソフアン（isophane）‐
インシユリン‐プロタミン結晶からなる懸濁液である。
その他にインシユリンの二、三の結晶変形物が知られて
いるが、しかしこれまでＸ線構造分析にとつてのみ重要
であつた。従つて酸性pH条件下に亜鉛不含の斜方晶およ
び単斜晶が得られる〔EinsteinおよびLow両氏「Acta Cr
yst.」第15巻第32〜34頁（1962年）参照〕。等電点で
は、亜鉛の不存在下におけると同様、立体空間基に分類
される比較的小さな、斜方12面体が得られる〔「Insuli
n-Kristalle」（1961年）参照〕。終りにSchlichtkull
氏の場合と同様に、等電点以上で亜鉛およびフエノール
またはフエノール誘導体の存在下に得られたインシユリ
ンの単斜晶形も記載された。これら結晶は数日内に相当
の大きさ（3mmまで）まで成長しそして鋭い縁辺を有す
る。興味深いことにこれら結晶はガラス表面でのみ見出
され、そして溶液の自由な表面では見出されない〔「In
sulin-Kristalle」第57〜60頁（1961年）参照〕。
それらの正味荷電において少くとも１個以上の陽電荷を
有し、従つてそれらの等電点がより高い方のpH値へ移動
されるインシユリン誘導体においてはインシユリンまた
はプロインシユリンと比較して異なる結晶化性質が見出
される。これには特にＢ鎖のC-末端に例えば知られてい
るように膵臓抽出物中に少量に見出されるプロインシユ
リン崩壊生成物であるインシユリン‐ArgB31‐OHおよび
インシユリン‐ArgB31‐Arg32‐OHのような塩基特性を
有する付加的な基を有する誘導体が包含される。類似の
性質を有する他の誘導体は半合成的に入手しうる。かか
るインシユリン誘導体、それらの製法、それらを含有す
る薬剤ならびにそれらの使用は西ドイツ特許出願第P332
6 672.4号および同第P3326 473.2号の目的とするところ
である。
これらは例えば他の塩基性アミノ酸または塩基性アミノ
酸誘導体（例えばD-アミノ酸、オルニチン、ヒドロキシ
リジン、アルギニノール）をアルギニンの代りにまたは
アルギニンに加えて有するかまたは簡単なアルコールま
たはアミンとのエステルまたはアミド基をC-末端に有す
る。その場合アルコールまたはアミドは例えばインシユ
リン‐（B30）‐コリンエステルにおけるように付加的
な陽電荷をもたらしうる。
今や驚くべきことに、これら誘導体がその等電点近くで
水性媒体から芳香族ヒドロキシ化合物の存在下に約10μ
ｍの寸法の非常に均一な形状のプリズム晶の形態で結晶
化しうることが見出された。
それゆえ本発明は、等電点5.8〜8.5を有する式 〔式中R1はＨまたはH-Pheであり、R30はAla、Thrまたは
Serであり、そしてR31は式‐Xn‐Ｓ（ｎは０、１、２ま
たは３であり、ＸはArg、Lys、Hyl、Orn、CitまたはHis
から選択された天然に存在する塩基性Ｌ−アミノ酸およ
び／または対応するＤ−アミノ酸の同一または相異なる
残基を表し、そしてＳはOHであるかまたは生理学的に受
容しうるカルボキシル保護基であり、ただしｎが０であ
る場合にはＳは｛トリ（C1〜C4）アルキルアンモニオ｝
−（C2〜C6）アルコキシである）を有する基である〕 を有するインシュリン誘導体の少なくとも１種を水性媒
体中で上記誘導体の等電点近くで少なくとも１つのフェ
ノールとグリセリンの存在下で結晶化して調製された実
質的に均一な粒子寸法と形とを有する上記インシュリン
誘導体結晶の懸濁液に関する。
さらに、その残基R31がアミノ酸残基またはその誘導体
（例えば相当するアルコールまたはラクトン）の残基を
含有する場合はL-形のもののみを含有するペプチドが特
に好ましい。
遺伝的にコード化されうるのは下記L-アミノ酸すなわち
Gly,Ala,Ser,Thr,Val,Leu,Ile,Asp,Asn,Glu,Gln,Cys,Me
t,Arg,Lys,His,Tyr,Phe,Trp,Pro（中性アミノ酸には下
線が引いてある）である。
中性の天然に存在するアミノ酸としては特にGly,Ala,Se
r,Thr,Val,Leu,Ile,Asn,Gln,Cys,Met,Tyr,Phe,Proまた
はHypが包含されるものと理解される。塩基性の天然に
存在するアミノ酸としては特にArg,Lys,Hyl,Orn,Citま
たはHisが包含されるものと理解される。
特にそのC-末端が（C1〜C6）アルコキシ、（C3〜C6）シ
クロアルキルオキシ、NH2、ジ（C1〜C6）アルキルアミ
ノ、（C1〜C6）アルキルアミノ、アミノ‐（C1〜C6）ア
ルコキシ、（C1〜C4）アルキルアミノ‐（C2〜C6）アル
コキシ、ジ（C1〜C4）アンモニオ‐（C2〜C6）アルコキ
シ、トリ（C1〜C4）アンモニオ‐（C2〜C6）アルコキ
シ、アミノ‐（C2〜C6）アルキルアミノ、（C1〜C4）ア
ルキルアミノ‐（C2〜C6）アルキルアミノ、〔ジ（C1〜
C4）アルキルアミノ〕‐（C2〜C6）アルキルアミノまた
は〔トリ（C1〜C4）アルキルアンモニオ〕‐（C2〜C6）
アルキルアミノからなる群から選ばれるカルボキシ保護
基を担持する式Ｉのペプチドもあげられる。
塩基性のカルボキシ保護基としては特に （ここでこれら式中ｐは２〜６でありそしてＲは同一ま
たは異なりて水素または（C1〜C4）アルキルを表わす）
があげられる。
式Ｉのインシユリン誘導体はヒト、豚または牛インシユ
リンの順列を有するのが好ましい。
例えば本発明による方法を用いて下記インシユリン誘導
体の結晶懸濁液が得られうるが本発明はそれらに限定さ
れるものではない。
ヒトインシユリン‐Arg31‐OH ヒトインシユリン‐Arg31‐AlaB32‐OH 豚インシユリン‐ArgB31‐OH 豚インシユリン‐ArgB31‐AlaB32‐OH 牛インシユリン‐ArgB31‐OH 牛インシユリン‐ArgB31‐ArgB32‐OH Des-PheB1‐豚インシユリン‐ArgB21‐OH Des-PheB1‐ヒトインシユリン‐ArgB31‐OH Des-PheB1‐豚インシユリン‐ArgB31‐ArgB32‐OH Des-PheB1‐ヒトインシユリン‐ArgB31‐ArgB32‐OH 豚インシユリン‐ArgB31‐OCH3 ヒトインシユリン‐ArgB31‐OCH3 牛インシユリン‐ArgB31‐OCH3 豚インシユリン‐ArgB31‐ArgB32‐OCH3 ヒトインシユリン‐ArgB31‐ArgB32‐OCH3 Des-ThrB30‐ヒトインシユリン‐ValB30‐ArgB31‐OH Des-ThrB30‐ヒトインシユリン‐ValB30‐AlaB31‐Arg
B32‐OH ヒトインシユリン‐LysB31‐OH ヒトインシユリン‐D-ArgB31‐OH ヒトインシユリン‐D-ArgB31‐ArgB32‐OH ヒトインシユリン‐ArgB31‐D-ArgB32‐OH ヒトインシユリン‐LysB31‐ArgB32‐OH ヒトインシユリン‐ArgB31‐LysB32‐OH ヒトインシユリン‐アルギニノールB31 ヒトインシユリン‐ValB31‐ArgB32‐OH ヒトインシユリン‐ValB31‐ArgB32‐ArgB33‐OH ヒトインシユリン‐ArgB31‐アルギニノールB32 ヒトインシユリン‐LysB31‐ArgB32‐ArgB33OH ヒトインシユリン‐ArgB31‐NH2 ヒトインシユリン‐ArgB31‐ArgB32‐NH2 ヒトインシユリン‐OrnB31‐OH ヒトインシユリン‐LeuB31‐CitB32‐OH ヒトインシユリン‐（B30）‐OCH2CH2‐NH2 ヒトインシユリン‐（B30）‐NH-CH2CH2‐NH2 ヒトインシユリン‐ArgB31‐O-CH2‐CH2‐NH2 ヒトインシユリン‐ArgB31‐CH2‐CH2‐N(CH3)2 式Ｉを有するインシユリン誘導体は ａ）式II （式中、R1はPheまたは結合でありそしてS1はプロトン
ソルボリシス的にかまたはβ‐離脱により除去できるア
ミノ保護基例えば第３ブチルオキシカルボニル（Bo
c）、第３アミルオキシカルボニル（Aoc）またはメチル
スルホニルエチルオキシカルボニル（Msc）基を表わ
す）を有するデス‐オクタペプチド（B23〜30）‐イン
シユリンを式III H-Gly-Phe-Phe-Tyr（S2）‐Thy（S2）‐Pro-Lys（S3）‐R30‐R31 （III） （式中R30およびR31は前記定義のとおりであり、S2は水
素、BzlまたはButでありそしてS3はウレタン保護基例え
ばBoc、Moc、FmocまたはＺを表わし、その際基R30およ
びR31に場合により存在する遊離のCOOH-、OH-、SH-、ω
‐NH2‐、グアニジノおよび／またはイミダゾール基は
必要な場合にはそれ自体既知の方法で保護された状態で
存在する）を有するペプチドと縮合させ、そして次に場
合により存在する保護基をそれ目体既知方法で除去する
か、 ｂ）式Ｉ（式中R1はＨまたはH-PheでありそしてC-末端R
30‐R31は一緒になつてOHを表わす）を有するデス‐B30
-インシユリンをトリプシンまたはトリプシン類似エン
ドペプチダーゼの存在下に式IV H-R30‐R31 （IV） （式中R30およびR31は前記定義のとおりでありそしてそ
の中に存在する遊離のCOOH-、OH-、SH-、ω‐NH2‐、グ
アニジノおよび／またはイミダゾール官能分は必要なら
ばそれ自体既知方法で保護された状態で存在する）を有
する化合物と反応させそして次に場合により存在する保
護基をそれ自体既知方法で除去するか、または ｃ）R31基中にL-配置アミノ酸残基を有するインシユリ
ン誘導体を調製するためにプロインシユリン、プロイン
シユリン誘導体、プレプロインシユリンまたはプレプロ
インシユリン誘導体またはこれら化合物の中間体を化学
的および／または酵素的に解裂させることにより調製さ
れる。
出発化合物としてのデス‐PheB1‐インシユリンは例え
ばDE-PS第2005658号またはEP-A第46979号の記載から知
られている。
方法ｂ）において出発化合物として使用されるデス‐B3
0-インシユリンは例えばEP-A第46979号または「Hoppe-S
eyler′s Z.Physiol.Chem.」第359巻第799頁（1978年）
の記載により知られている。方法ｂ）で使用される式IV
の出発物質はそれ自体既知方法でペプチド化学の方法に
従い調製される。IVについて使用しうる保護基はM.Boda
nzky氏他により「Peptide Synthesis」第１版（1976
年）中に詳細に記載されている。
遺伝子工学的方法によりｃ）の出発物質としてのヒトま
たは霊長類プロインシユリンを入手しうる。そのものか
らArg（B31）およびジ‐Arg（B31〜32）誘導体はトリプ
シンまたはトリプシン類似酵素を用いる簡単な消化によ
り入手しうる。しかしまたそれと並んで、相当するプレ
プロインシユリン誘導体の解裂により新規なインシユリ
ン誘導体を生ずる比較的簡単なプラスミドを構成するこ
ともできる。何故ならこれらは天然のB31またはB32に存
在するアルギニンの代りに他の中性または塩基性アミノ
酸をコード化するからである。
組換えDNA技術を用いるプロインシユリンの調製はプロ
インシユリンのアミノ酸順列のためのDNA順列の形成を
必要とし、このことは単離、構成またはこれら両者の組
み合せにより達成されうる。次にプロインシユリン‐DN
Aを読み取り相（reading phase）中で適当なクローニン
グおよび発現（expression）担体中に挿入する。担体は
適当な微生物の形質転換に使用され、そしてその際得ら
れる形質転換された微生物を次にプロインシユリン含有
ベクターをさらにコピーさせそしてプロインシユリン、
純粋なインシユリン誘導体またはプロインシユリン前駆
物質またはプレプロインシユリン誘導体の発現に至る発
酵条件にかける。
発現生成物がプロインシユリン前駆物質である場合、か
かる生成物は一般に、プロインシユリンまたはプロイン
シユリン誘導体は挿入された遺伝子順列により通常表示
される蛋白質の断片にその末端アミノ基で結合している
プロインシユリンアミノ酸順列を含有する。プロインシ
ユリンアミノ酸順列は例えばメチオニンである特異的に
解裂されうる位置を介して蛋白質断片に結合している。
得られるプロインシユリンアミノ酸順列は例えばDE-A第
3232036号に記載されるような融合された遺伝子生成物
から解裂されそしてプロインシユリンは精裂後単離され
る。
本発明による方法の結晶化媒体は亜鉛を含有でき、その
場合亜鉛量はインシユリン誘導体の重量に基づき１％ま
で、しかし特に0.8％を越えないことが好ましい。通常
結晶化には最大40μg/100単位しかし好ましくは30μg/1
00単位を越えない比較的少量の亜鉛のみで充分であり、
ある状況下ではこれらの量は乾燥物質中に既に含有され
うる。
結晶化は好ましくは等電点より1pH単位下から等電点よ
り1pH単位上までのpH範囲内で遂行されるのが好ましい
（PI±１）。pH調整は場合により緩衝液（例えば燐酸
塩、酢酸塩またはクエン酸塩）を用いて行われうる。
結晶化媒体中には他にフエノール、クレゾールまたは類
似の芳香族が存在する。結晶化温度は好ましくは３〜27
℃特に10〜20℃である。懸濁液は操作期間中わずかに攪
拌（例えば攪拌容器中で攪拌）されうる。式Ｉのインシ
ユリン誘導体の濃度は結晶化の前で0.2〜40mg/ml特に１
〜7.5mg/mlであるのが好ましい。
結晶は例えばまたすでに仕上つた注射用懸濁液（純粋な
遅延製剤の場合）に相当する媒体中においても得られう
る。従つてこの（滅菌）媒体はフエノールまたは類似の
芳香族および場合により亜鉛と並んで、例えばNaCl、グ
リセリンのような等張剤、ならびに例えば燐酸ナトリウ
ムのような緩衝物質を含有しうる。
本発明はさらに前記結晶化方法により得られる１種また
は数種の式Ｉのインシユリン誘導体の結晶懸濁液、なら
びにこの結晶化法により得られる均一な形状をした結晶
形態の式Ｉの化合物にも関する。
本発明による結晶懸濁液はａ）溶解されたか、および／
または無定形における式Ｉのインシユリン誘導体の１種
または数種、溶解されたか、無定形かおよび／または結
晶形態におけるｂ）インシユリンおよび／またはｃ）プ
ロインシユリンおよび／またはｄ）C-ペプチドを付加的
に含有しうる。これらは他にグロビンまたは硫酸プロタ
ミンのようなインシユリン放出に対し遅延作用を及ぼす
助剤を含有しうる。
結晶寸法およびその同質性に関する利点と並んで、亜鉛
がデポ担体として見做される濃度以下にある比較的低い
亜鉛含量ゆえに本発明による結晶懸濁液は溶解されたイ
ンシユリンと自由に混和しうる。従つて例えばインシユ
リン溶液を適用前にインシユリン誘導体結晶の懸濁液と
合することが可能である。個々の成分の割合を変えるこ
とによりかくして得られた医薬の作用プロフイルを至適
方向に制御しうる。
結晶の安定化に比較的高濃度の亜鉛が必要である場合
（例えば亜鉛‐インシユリン菱面体の場合にそうである
ように）、添加され溶解されたインシユリンが析出しそ
してもはや即動作用性成分としては作用しないであろ
う。
従つて前記した誘導体の結晶懸濁液は糖尿病の治療にと
つて望ましい性質を理想的様式で有する。遅延原理はイ
ンシユリン誘導体に固有でありそして蛋白化学的現象、
すなわち等電点での難溶性、に帰せられる。
下記の例により本発明をさらに説明するが本発明はそれ
らに限定されるものではない。
例１ 本例は豚プロインシユリンからトリプシン消化により調
製された40IU/mlを有する寸法約10μｍのプリズム晶の
結晶懸濁液としての豚インシユリン‐ArgB31‐ArgB32‐
OHおよびその寸法分布を示す。
下記すなわち 豚インシユリンArgB31‐ 14.8mg ArgB32‐OH（27.0IU/mg） 燐酸二水素ナトリウム二水化物 30.0mg m-クレゾール 15.0mg フエノール 6.0mg を水中で混合する。
希NaOHを用いてpH＝7.4に調整しそして水を加えて合計
量10mlとなす。反応混合物を18℃で軽く攪拌しそして非
常に均一に成長し、寸法約10μｍでありそして偏光の下
に非常に狭い角度範囲内における吸光作用を示すプリズ
ム形状の、鋭い縁辺を有する結晶が生成する。この結晶
の寸法分布をクールターカウンター中で測定した。その
曲線（図面参照）では極度に同質の寸法分布が示され
る。大部分は５μｍ〜10μｍなる等価なる直径（球形粒
子に基づく）を有する。
例２ 本例は40IU/mlを有する製剤中における、遺伝子工学的
に得られたプレプロインシユリンのトリプシン分解によ
り調製されたヒトインシユリン‐ArgB31‐OH50％および
豚インシユリンからの半合成により調製されたヒトイン
シユリン‐B30-コリンエステル50％からなる混合物の結
晶化およびその遅延作用を示す。
下記すなわち ヒトインシユリン‐ArgB31‐ 7.3mg ‐OH（27.0IU/mg） ヒトインシユリン‐（B30）‐ 7.1mg コリンエステル（28.0IU/mg） 燐酸二水素ナトリウム二水化物 21.0mg m-クレゾール 15.0mg フエノール 0.6mg グリセリン 16.0mg を水中にて混合する。希NaOHを用いてpH7.0に調整しそ
して水を加えて合計量10mlとなす。反応混合物を室温で
軽く攪拌すると寸法約10μｍのプリズム形結晶が生成す
る。かかる懸濁液は家兎に4.0IU/kgの投与量で強い遅延
作用を示す。血糖値（出発値の％）は次のとおりである
（動物数12）。
時間 ０ １ ２ ４ ６ 血糖 100％ 51％ 44％ 69％ 83％ 例３ 本例は100U/mlを有する50％イソフアンプロタミン‐ヒ
トインシユリン結晶と混合した、豚インシユリンからの
半合成により調製された結晶状ヒトインシユリン‐Arg
B31‐LysB32‐OCH3の懸濁液を示す。
下記すなわち 無鉛ヒトインシユリン‐ ArgB31‐LysB31‐OCH3 37.0mg （27.0IU/mg） 塩化亜鉛 0.6mg 燐酸二水素ナトリウ 21.0mg ム二水化物 m-クレゾール 15.0mg フエノール 6.0mg グリセリン 160.0mg を水を用いて合計量10ml中に溶解させる。
1N HClまたは1N NaOHを用いpH7.4に調整する。反応混合
物を室温で弱く攪拌すると１日以内でプリズム形結晶が
生成する。これと別に下記成分すなわち ヒトインシユリン（28.0IU/mg） 35.7mg 硫酸プロタミン 3.2mg 燐酸二水素ナトリウム二水化物 21.0mg m-クレゾール 15.0mg フエノール 6.0mg グリセリン 160.0mg を水中で混合することによりイソフアン‐ヒトインシユ
リン結晶（NPH）を調整する。
1N HClまたは1N NaOHを用いてpH7.4に調整しそして水を
加えて全量10mlとなす。この反応混合物を弱く攪拌する
と典型的な桿状形NPH結晶が生成する。
これら２種類の懸濁液を一緒にすると、100IU/mlを有す
る所望の混合製剤が生成し、このものは動物実験におい
て強い遅延作用を示す。
例４ 本例は遺伝子工学的に得られたプレプロインシユリンの
トリプシン分解により得られた結晶状ヒトインシユリン
‐ArgB31‐ArgB32‐OH 75％および溶解された形態のヒ
トインシユリン25％からなる40IU/mlを有するデポ製剤
を示す。
希HCl 250ml中にヒトインシユリン‐ArgB31‐ArgB32‐O
H（27.0IU/mg）1.111gを溶解させるとpH4.0である。こ
の溶液を適当な方法で滅菌過する。
これとは別に水中に下記すなわち 燐酸二水素ナトリウム二水化物 1.575g m-クレゾール 1.125g フエノール 0.450g グリセリン 14.118g を溶解させる。
1N NaOHを用いてpH7.5に調整しそして水を加えて全量0.
5lとなす。この緩衝溶液を同様に適当な方法で滅菌過
する。
無菌条件下に攪拌しながらこれら２種類の滅菌溶液を合
しそして寸法約10μｍの同質な結晶が生成するまで攪拌
する（Ａ）。
下記成分すなわち ヒトインシユリン（28.0IU/mg） 0.357g 燐酸二水素ナトリウム二水化物 0.525g m-クレゾール 0.375g フエノール 0.150g グリセリン 4.706g を混合することによりインシユリン溶液（Ｂ）を調製す
る。
この溶液を希NaOHを用いてpH7.3となしそして水を加え
て全量0.25lとなす。この溶液を滅菌過する。無菌条
件下にインシユリン溶液（Ｂ）を結晶懸濁液（Ａ）に加
えそしてこの製剤を適当なバイアル瓶中に充填する。
かかるデポ製剤は糖尿病の治療に使用されうる。
【図面の簡単な説明】
添付図面は例１により調製された豚インシユリン‐Arg
B31‐ArgB32‐OHの結晶懸濁液における寸法分布を示
す。

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】等電点5.8〜8.5を有する式 〔式中R1はＨまたはH-Pheであり、R30はAla、Thrまたは
    Serであり、そしてR31は式‐Xn‐Ｓ（ｎは０、１、２ま
    たは３であり、ＸはArg、Lys、Hyl、Orn、CitまたはHis
    から選択された天然に存在する塩基性Ｌ−アミノ酸およ
    び／または対応するＤ−アミノ酸の同一または相異なる
    残基を表し、そしてＳはOHであるかまたは生理学的に受
    容しうるカルボキシル保護基であり、ただしｎが０であ
    る場合にはＳは｛トリ（C1〜C4）アルキルアンモニオ｝
    −（C2〜C6）アルコキシである）を有する基である〕 を有するインシュリン誘導体の少なくとも１種を水性媒
    体中で上記誘導体の等電点近くで少なくとも１つのフェ
    ノールとグリセリンの存在下で結晶化して調製された実
    質的に均一な粒子寸法と形とを有する上記インシュリン
    誘導体結晶の懸濁液。
  2. 【請求項２】式ＩにおいてR1がH-Pheであることを特徴
    とする前記特許請求の範囲第１項記載の懸濁液。
  3. 【請求項３】式Ｉにおいて基R31がＬ−形のみのアミノ
    酸残基またはその誘導体の残基を含有することを特徴と
    する前記特許請求の範囲第１または２項に記載の懸濁
    液。
  4. 【請求項４】結晶化媒体中にインシュリンの重量に基づ
    き１％までの量の亜鉛が存在することを特徴とする前記
    特許請求の範囲第１〜３項のいずれか一つに記載の懸濁
    液。
  5. 【請求項５】結晶化媒体が適当量の緩衝物質の添加によ
    りそれぞれの結晶化pH値に緩衝されることを特徴とする
    前記特許請求の範囲第１〜４項のいずれか一つに記載の
    懸濁液。
  6. 【請求項６】結晶化が３℃〜27℃で遂行されることを特
    徴とする前記特許請求の範囲第１〜５項のいずれか一つ
    に記載の懸濁液。
  7. 【請求項７】結晶化媒体中におけるインシュリン誘導体
    （Ｉ）の濃度が0.2〜40mg/mlであることを特徴とする前
    記特許請求の範囲第１〜６項のいずれか一つに記載の懸
    濁液。
  8. 【請求項８】ａ）溶解されたおよび／または無定形にお
    ける式Ｉのインシュリン誘導体の１種または数種、それ
    ぞれ溶解されたか、無定形および／または結晶形態にお
    けるｂ）インシュリンおよび／またはｃ）プロインシュ
    リンおよび／またはｄ）Ｃ−ペプチドを付加的に含有す
    ることを特徴とする前記特許請求の範囲第１項記載の懸
    濁液。
  9. 【請求項９】遅延作用を有する助剤を付加的に含有する
    ことを特徴とする前記特許請求の範囲第１または８項記
    載の懸濁液。
  10. 【請求項１０】等電点5.8〜8.5を有する式 〔式中R1はＨまたはH-Pheであり、R30はAla、Thrまたは
    Serであり、そしてR31は式‐Xn‐Ｓ（ｎは０、１、２ま
    たは３であり、ＸはArg、Lys、Hyl、Orn、CitまたはHis
    から選択された天然に存在する塩基性Ｌ−アミノ酸およ
    び／または対応するＤ−アミノ酸の同一または相異なる
    残基を表し、そしてＳはOHであるかまたは生理学的に受
    容しうるカルボキシル保護基であり、ただしｎが０であ
    る場合にはＳは｛トリ（C1〜C4）アルキルアンモニオ｝
    −（C2〜C6）アルコキシである）を有する基である〕 を有するインシュリン誘導体の少なくとも１種を水性媒
    体中で上記誘導体の等電点近くで少なくとも１つのフェ
    ノールとグリセリンの存在下で結晶化して調製された実
    質的に均一な粒子寸法と形とを有する上記インシュリン
    誘導体結晶の懸濁液からなる糖尿病治療剤。
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