JPH08277290A - 新規キチナーゼ阻害物質及びその製造法 - Google Patents
新規キチナーゼ阻害物質及びその製造法Info
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- JPH08277290A JPH08277290A JP7081080A JP8108095A JPH08277290A JP H08277290 A JPH08277290 A JP H08277290A JP 7081080 A JP7081080 A JP 7081080A JP 8108095 A JP8108095 A JP 8108095A JP H08277290 A JPH08277290 A JP H08277290A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 次式（Ｉ）：
【化３】
で表される新規物質シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロ
リン。 【効果】 キチナーゼ阻害活性を有する新規物質シクロ
−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンおよびその製造方法を
提供する。
リン。 【効果】 キチナーゼ阻害活性を有する新規物質シクロ
−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンおよびその製造方法を
提供する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規物質シクロ−Ｌ−
アルギニル−Ｄ−プロリンに関するものである。シクロ
−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンは、その優れたキチナ
ーゼ阻害能力により抗真菌剤、農薬として有用である。
アルギニル−Ｄ−プロリンに関するものである。シクロ
−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンは、その優れたキチナ
ーゼ阻害能力により抗真菌剤、農薬として有用である。
【０００２】
【従来の技術】キチンは、甲殻類、昆虫類、カビ、酵母
等に幅広く分布している。甲殻類、昆虫類においては、
クチクラの主成分がキチンであり、脱皮、成長の過程
で、キチンの合成と分解が巧みに制御されていることが
知られている。また、カビ、酵母等の真菌類は、分裂及
び増殖の過程でキチンの合成と分解が制御されている。
キチナーゼは、キチンをＮ−アセチルキトビオースにま
で分解する酵素であり、この酵素が阻害剤によって阻害
されれば、甲殻類、昆虫類の脱皮、成長また、カビ、酵
母等の分裂、増殖に影響を与えることになる。すなわ
ち、キチナーゼは、この代謝系に関わる重要な酵素であ
り、キチナーゼに対する阻害剤は、新しいタイプの抗真
菌剤あるいは昆虫の成長制御剤になることが期待され
る。
等に幅広く分布している。甲殻類、昆虫類においては、
クチクラの主成分がキチンであり、脱皮、成長の過程
で、キチンの合成と分解が巧みに制御されていることが
知られている。また、カビ、酵母等の真菌類は、分裂及
び増殖の過程でキチンの合成と分解が制御されている。
キチナーゼは、キチンをＮ−アセチルキトビオースにま
で分解する酵素であり、この酵素が阻害剤によって阻害
されれば、甲殻類、昆虫類の脱皮、成長また、カビ、酵
母等の分裂、増殖に影響を与えることになる。すなわ
ち、キチナーゼは、この代謝系に関わる重要な酵素であ
り、キチナーゼに対する阻害剤は、新しいタイプの抗真
菌剤あるいは昆虫の成長制御剤になることが期待され
る。
【０００３】これまでに、キチナーゼ阻害剤としては、
アロサミジン及びその誘導体（バイオサイエンスとイン
ダストリー，作田庄平 51巻，18-23 1993年) 知られて
いる。
アロサミジン及びその誘導体（バイオサイエンスとイン
ダストリー，作田庄平 51巻，18-23 1993年) 知られて
いる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、高い
キチナーゼ活性を有する新規物質を提供することであ
る。
キチナーゼ活性を有する新規物質を提供することであ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、キチナー
ゼ阻害活性を有する物質を種々の海洋性細菌の生産物よ
り探索した結果、シュードモナス属に属する微生物の生
産する、新規物質シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリ
ンが高いキチナーゼを阻害活性を有することを見出し、
本発明を完成するに至った。
ゼ阻害活性を有する物質を種々の海洋性細菌の生産物よ
り探索した結果、シュードモナス属に属する微生物の生
産する、新規物質シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリ
ンが高いキチナーゼを阻害活性を有することを見出し、
本発明を完成するに至った。
【０００６】即ち、本発明は、次式（Ｉ）：
【０００７】
【化２】
【０００８】で表される新規物質シクロ−Ｌ−アルギニ
ル−Ｄ−プロリンである。また、本発明は、シュードモ
ナス属に属し、シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリン
生産能を有する微生物を培地で培養し、培養物からシク
ロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンを採取することを特
徴とするシクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンの製造
方法である。
ル−Ｄ−プロリンである。また、本発明は、シュードモ
ナス属に属し、シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリン
生産能を有する微生物を培地で培養し、培養物からシク
ロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンを採取することを特
徴とするシクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンの製造
方法である。
【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。シクロ−
Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンの理化学的性質は以下の
通りである。 １．色性状：無色 ２．分子量：253 ３．分子式：Ｃ11Ｈ19Ｎ5Ｏ2 ４．ＩＲスペクトルνmax(KBr, cm-1) : 3424, 1673, 1
458, 1205, 1137 ５．水素核磁気共鳴スペクトル（重水中，pD3.0, δpp
m) : 1.77(m,2H),1.92(m,2H), 1.99(m,2H), 2.13(m,1
H), 2.41(m,1H), 3.29(t,2H), 3.62(m,2H), 4.08(t,1
H), 4.43(t,1H) ６．炭素核磁気共鳴スペクトル（重水中，pD3.0, δpp
m) : 24.0, 26.4,30.8, 32.7, 43.0, 48.3, 59.1, 60.
8, 159.4, 170.2, 174.0 ７. 高分解能質量分析スペクトル： HR FABMS m/z 254.
1627［(M+H)+］（計算値：254.1617） ８．旋光度［α］D 29 ＋42.0(c0.24, H2O） シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンを生産する菌株
としては、例えば、IZ208株を挙げることができる。
Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンの理化学的性質は以下の
通りである。 １．色性状：無色 ２．分子量：253 ３．分子式：Ｃ11Ｈ19Ｎ5Ｏ2 ４．ＩＲスペクトルνmax(KBr, cm-1) : 3424, 1673, 1
458, 1205, 1137 ５．水素核磁気共鳴スペクトル（重水中，pD3.0, δpp
m) : 1.77(m,2H),1.92(m,2H), 1.99(m,2H), 2.13(m,1
H), 2.41(m,1H), 3.29(t,2H), 3.62(m,2H), 4.08(t,1
H), 4.43(t,1H) ６．炭素核磁気共鳴スペクトル（重水中，pD3.0, δpp
m) : 24.0, 26.4,30.8, 32.7, 43.0, 48.3, 59.1, 60.
8, 159.4, 170.2, 174.0 ７. 高分解能質量分析スペクトル： HR FABMS m/z 254.
1627［(M+H)+］（計算値：254.1617） ８．旋光度［α］D 29 ＋42.0(c0.24, H2O） シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンを生産する菌株
としては、例えば、IZ208株を挙げることができる。
【００１０】IZ 208株の菌学的性質は下記に示すが、培
地は、マリンアガー（Bacto MarineAgar 2216 (Difco社
製) ）あるいはマリンブロス（Bacto Marine Broth 221
6 (Difco社製) ）を用いた。これらの培地に植菌し30℃
で24から48時間培養し、光学顕微鏡及び透過型電子顕微
鏡を用いて形態観察を行った。 （１）形態（好気的条件下） 細胞の形及び大きさ ： 曲がりのない桿菌、大きさ
0.8×2.1 μm 細胞多形成の有無 ： なし 運動性 ： あり 鞭毛の着生状態 ： あり、極毛性 胞子の有無 ： なし グラム染色性 ： 陰性 （２）各培地における生育状態 マリンアガー平板培養 ： 良好に生育、コロニーは、
円形、凸円状、全縁、湿光、不透明乳白色 マリンアガー斜面培養 ： 良好に生育、糸状、乳白色 マリンブロス培養 ： 良好に生育、培養液は均一に濁
る。
地は、マリンアガー（Bacto MarineAgar 2216 (Difco社
製) ）あるいはマリンブロス（Bacto Marine Broth 221
6 (Difco社製) ）を用いた。これらの培地に植菌し30℃
で24から48時間培養し、光学顕微鏡及び透過型電子顕微
鏡を用いて形態観察を行った。 （１）形態（好気的条件下） 細胞の形及び大きさ ： 曲がりのない桿菌、大きさ
0.8×2.1 μm 細胞多形成の有無 ： なし 運動性 ： あり 鞭毛の着生状態 ： あり、極毛性 胞子の有無 ： なし グラム染色性 ： 陰性 （２）各培地における生育状態 マリンアガー平板培養 ： 良好に生育、コロニーは、
円形、凸円状、全縁、湿光、不透明乳白色 マリンアガー斜面培養 ： 良好に生育、糸状、乳白色 マリンブロス培養 ： 良好に生育、培養液は均一に濁
る。
【００１１】マリンブロスゼラチン穿刺培養 ： 液化
しない。 （３）生理学的性質 硝酸塩の還元 ： 還元しない。 硝酸呼吸 ： 硝酸呼吸しない。 インドールの生成 ： 生成しない。
しない。 （３）生理学的性質 硝酸塩の還元 ： 還元しない。 硝酸呼吸 ： 硝酸呼吸しない。 インドールの生成 ： 生成しない。
【００１２】硫化水素の生成 ： 生成しない。（ＴＳ
Ｉ培地） でんぷんの分解 ： 加水分解する。 クエン酸の利用 : Simmons培地 利用する : Cristensen培地 利用する 無機窒素源の利用 ： 利用する。
Ｉ培地） でんぷんの分解 ： 加水分解する。 クエン酸の利用 : Simmons培地 利用する : Cristensen培地 利用する 無機窒素源の利用 ： 利用する。
【００１３】色素の生成 ： 生成しない。（蛍光色素
の生成なし。） ウレアーゼ活性 ： 陰性 オキシダーゼ活性 ： 陽性 カタラーゼ活性 ： 陽性 生育の範囲（温度、ｐＨ）： 温度４〜50℃、ｐＨ５〜
10 酸素に対する態度 ： 好気性 Ｏ−Ｆテスト ： 酸性化 メチルレッド試験 ： 陰性 ＶＰ反応 ： 陰性 糖類から酸及びガスの生成の有無 30℃、１週間培養後 酸の生成 ガスの生成 Ｌ−アラビノース − − Ｄ−キシロース − − Ｄ−グルコース ＋ − Ｄ−マンノース − − Ｄ−フラクトース ＋ − 麦芽糖 ＋ − ショ糖 − − 乳糖 − − トレハロース − − Ｄ−ソルビット − − Ｄ−マンニット ＋ − イノシット − − グリセリン ＋ − デンプン ＋ − −：生成せず， ＋：生成する エスクリンの分解 ： 陰性 アルギニンの分解 ： 陰性 ＤＮＡの分解 ： 分解しない ＰＨＢの蓄積 ： 蓄積しない 好塩性試験 ： ０〜７％の範囲で生育 ＯＮＰＧテスト ： 陰性 Tween80 分解性 ： 陰性 レシチナーゼ活性 ： 陰性 ＧＣ含量 ： 65.9mol％ イソプレノイドキノン ： 主たるキノン ユビ
キノン Ｑ9 マイナーなキノン ユビキノン Ｑ8 以上の菌学的性質からバージーズ・マニュアル・オブ・
デターミネイティブ・バクテリオロジー第８版の分類基
準に従って公知の菌株と比較した結果、本菌株は、シュ
ードモナス属に属すると考えられ、本菌株をシュードモ
ナスsp.IZ208株と同定し、平成７年１月19日付で工業技
術院生命工学工業技術研究所に寄託した（FERM P-1473
8) 。
の生成なし。） ウレアーゼ活性 ： 陰性 オキシダーゼ活性 ： 陽性 カタラーゼ活性 ： 陽性 生育の範囲（温度、ｐＨ）： 温度４〜50℃、ｐＨ５〜
10 酸素に対する態度 ： 好気性 Ｏ−Ｆテスト ： 酸性化 メチルレッド試験 ： 陰性 ＶＰ反応 ： 陰性 糖類から酸及びガスの生成の有無 30℃、１週間培養後 酸の生成 ガスの生成 Ｌ−アラビノース − − Ｄ−キシロース − − Ｄ−グルコース ＋ − Ｄ−マンノース − − Ｄ−フラクトース ＋ − 麦芽糖 ＋ − ショ糖 − − 乳糖 − − トレハロース − − Ｄ−ソルビット − − Ｄ−マンニット ＋ − イノシット − − グリセリン ＋ − デンプン ＋ − −：生成せず， ＋：生成する エスクリンの分解 ： 陰性 アルギニンの分解 ： 陰性 ＤＮＡの分解 ： 分解しない ＰＨＢの蓄積 ： 蓄積しない 好塩性試験 ： ０〜７％の範囲で生育 ＯＮＰＧテスト ： 陰性 Tween80 分解性 ： 陰性 レシチナーゼ活性 ： 陰性 ＧＣ含量 ： 65.9mol％ イソプレノイドキノン ： 主たるキノン ユビ
キノン Ｑ9 マイナーなキノン ユビキノン Ｑ8 以上の菌学的性質からバージーズ・マニュアル・オブ・
デターミネイティブ・バクテリオロジー第８版の分類基
準に従って公知の菌株と比較した結果、本菌株は、シュ
ードモナス属に属すると考えられ、本菌株をシュードモ
ナスsp.IZ208株と同定し、平成７年１月19日付で工業技
術院生命工学工業技術研究所に寄託した（FERM P-1473
8) 。
【００１４】シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリン
は、シュードモナス属に属し、シクロ−Ｌ−アルギニル
−Ｄ−プロリン生産能を有する微生物を培地で培養し、
その培養物から得ることができる。シクロ−Ｌ−アルギ
ニル−Ｄ−プロリン生産能を有する微生物としては、シ
ュードモナス属に属する微生物であれば、いずれの菌株
でも用いることができる。また、これら微生物の人工的
変異方法、例えば紫外線照射、Ｘ線照射、変異誘起剤処
理など、あるいは自然発生による変異株、また遺伝子操
作、細胞融合による変異株でもシクロ−Ｌ−アルギニル
−Ｄ−プロリンを生産するものであればいずれも本発明
を用いることができる。このようなシクロ−Ｌ−アルギ
ニル−Ｄ−プロリン生産能を有する菌株を選定するに
は、実施例に示すように菌株の培養物を取り出し、その
キチナーゼ阻害活性を測定することにより行うことがで
きる。シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリン生産株の
うち、代表的な株としては、シュードモナスsp.IZ 208
株を挙げることができる。
は、シュードモナス属に属し、シクロ−Ｌ−アルギニル
−Ｄ−プロリン生産能を有する微生物を培地で培養し、
その培養物から得ることができる。シクロ−Ｌ−アルギ
ニル−Ｄ−プロリン生産能を有する微生物としては、シ
ュードモナス属に属する微生物であれば、いずれの菌株
でも用いることができる。また、これら微生物の人工的
変異方法、例えば紫外線照射、Ｘ線照射、変異誘起剤処
理など、あるいは自然発生による変異株、また遺伝子操
作、細胞融合による変異株でもシクロ−Ｌ−アルギニル
−Ｄ−プロリンを生産するものであればいずれも本発明
を用いることができる。このようなシクロ−Ｌ−アルギ
ニル−Ｄ−プロリン生産能を有する菌株を選定するに
は、実施例に示すように菌株の培養物を取り出し、その
キチナーゼ阻害活性を測定することにより行うことがで
きる。シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリン生産株の
うち、代表的な株としては、シュードモナスsp.IZ 208
株を挙げることができる。
【００１５】上記微生物を一般に微生物の培養に用いら
れる培地で培養し、生産されるシクロ−Ｌ−アルギニル
−Ｄ−プロリンを常法により分離、精製することができ
る。まず培養法について述べる。キチナーゼ阻害活性を
もつ微生物の培養には通常の培養方法を用いることがで
きる。培地としては資化可能な炭素源、窒素源、無機物
および必要な生育、生産促進物質を程よく含有する培地
であれば合成培地、天然培地いずれでも使用可能であ
る。炭素源としては、グルコース、澱粉、デキストリ
ン、マンノース、フラクトース、シュークロース、ラク
トース、キシロース、アラビノース、マンニトール、糖
蜜などを単独または組み合わせて用いられる。更に、菌
の資化能によっては炭化水素、アルコール類、有機酸な
ども用いられる。窒素源としては塩化アンモニウム、硝
酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素、ペプトン、肉
エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチーブ・リ
カー、大豆粉、カザミノ酸などが単独または組み合わせ
て用いられる。そのほか、食塩、塩化カリウム、硫酸マ
グネシウム、炭酸カルシウム、リン酸二水素カリウム、
リン酸水素二カリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、
硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅などの無機塩類や海水
を必要に応じて加える。更に使用菌の生育やシクロ−Ｌ
−アルギニル−Ｄ−プロリンの生産を促進する微量成分
を適当に添加することができる。
れる培地で培養し、生産されるシクロ−Ｌ−アルギニル
−Ｄ−プロリンを常法により分離、精製することができ
る。まず培養法について述べる。キチナーゼ阻害活性を
もつ微生物の培養には通常の培養方法を用いることがで
きる。培地としては資化可能な炭素源、窒素源、無機物
および必要な生育、生産促進物質を程よく含有する培地
であれば合成培地、天然培地いずれでも使用可能であ
る。炭素源としては、グルコース、澱粉、デキストリ
ン、マンノース、フラクトース、シュークロース、ラク
トース、キシロース、アラビノース、マンニトール、糖
蜜などを単独または組み合わせて用いられる。更に、菌
の資化能によっては炭化水素、アルコール類、有機酸な
ども用いられる。窒素源としては塩化アンモニウム、硝
酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素、ペプトン、肉
エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチーブ・リ
カー、大豆粉、カザミノ酸などが単独または組み合わせ
て用いられる。そのほか、食塩、塩化カリウム、硫酸マ
グネシウム、炭酸カルシウム、リン酸二水素カリウム、
リン酸水素二カリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、
硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅などの無機塩類や海水
を必要に応じて加える。更に使用菌の生育やシクロ−Ｌ
−アルギニル−Ｄ−プロリンの生産を促進する微量成分
を適当に添加することができる。
【００１６】培養法としては、一般の培養方法が用いら
れるが、液体培養法、とくに深部攪拌培養法がもっとも
適している。培養温度は16〜37℃、特に22〜30℃が適当
であり、培養中の培地のｐＨはアンモニア水や炭酸アン
モニウム溶液、塩酸溶液などを添加して、４〜10、特に
６〜８に維持することが望ましい。液体培地で通常１〜
８日培養をおこなうと、目的物質のシクロ−Ｌ−アルギ
ニル−Ｄ−プロリンが菌体外に生成される。培養物中の
生成量が最大に達したときに培養を停止する。
れるが、液体培養法、とくに深部攪拌培養法がもっとも
適している。培養温度は16〜37℃、特に22〜30℃が適当
であり、培養中の培地のｐＨはアンモニア水や炭酸アン
モニウム溶液、塩酸溶液などを添加して、４〜10、特に
６〜８に維持することが望ましい。液体培地で通常１〜
８日培養をおこなうと、目的物質のシクロ−Ｌ−アルギ
ニル−Ｄ−プロリンが菌体外に生成される。培養物中の
生成量が最大に達したときに培養を停止する。
【００１７】培養物からシクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−
プロリンの分離、精製は、微生物代謝産物をその培養物
から単離精製するために常用される方法に従っておこな
われる。例えば培養物を濾過により培養濾液と菌体に分
け、培養ろ液の脂溶性画分を有機溶剤（例えば、ヘキサ
ン、ベンゼン、クロロホルム、アセトン、エーテル、酢
酸エチルなど）で取り除く。ついで、活性炭、イオン交
換クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相カラムクロマト
グラフィー等でシクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリン
を分離、精製する。
プロリンの分離、精製は、微生物代謝産物をその培養物
から単離精製するために常用される方法に従っておこな
われる。例えば培養物を濾過により培養濾液と菌体に分
け、培養ろ液の脂溶性画分を有機溶剤（例えば、ヘキサ
ン、ベンゼン、クロロホルム、アセトン、エーテル、酢
酸エチルなど）で取り除く。ついで、活性炭、イオン交
換クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相カラムクロマト
グラフィー等でシクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリン
を分離、精製する。
【００１８】シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリン
は、合成法によっても製造することができる。すなわ
ち、保護基を有するＬ−アルギニンとＤ−プロリンをＤ
ＣＣ法等によって縮合し、脱保護、環化反応を行うこと
で製造することができる。キチナーゼの阻害活性は、シ
ャーレー変法等の既知の方法（キチン、キトサン実験マ
ニュアル、キチン、キトサン研究会編, p109-120) 又
は、キチナーゼ阻害物質の検定法（特願平6-237650号明
細書) により測定することができる。
は、合成法によっても製造することができる。すなわ
ち、保護基を有するＬ−アルギニンとＤ−プロリンをＤ
ＣＣ法等によって縮合し、脱保護、環化反応を行うこと
で製造することができる。キチナーゼの阻害活性は、シ
ャーレー変法等の既知の方法（キチン、キトサン実験マ
ニュアル、キチン、キトサン研究会編, p109-120) 又
は、キチナーゼ阻害物質の検定法（特願平6-237650号明
細書) により測定することができる。
【００１９】本発明のシクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プ
ロリンは、例えばカンジダ症治療剤として利用できる。
カンジダ アルビカンスは、酵母型と糸状型の二つの形
態をとり、酵母型は病原性がないのに対し、糸状型は病
原性があることから、糸状型への形態の変化を阻害すれ
ばカンジダ症治療剤としての効果が期待できる。本発明
化合物へのカンジダ アルビカンスへの影響は、カンジ
ダ アルビカンスを本発明化合物を含む培地中で培養
し、その形態変化を顕微鏡で観察することで判定でき
る。
ロリンは、例えばカンジダ症治療剤として利用できる。
カンジダ アルビカンスは、酵母型と糸状型の二つの形
態をとり、酵母型は病原性がないのに対し、糸状型は病
原性があることから、糸状型への形態の変化を阻害すれ
ばカンジダ症治療剤としての効果が期待できる。本発明
化合物へのカンジダ アルビカンスへの影響は、カンジ
ダ アルビカンスを本発明化合物を含む培地中で培養
し、その形態変化を顕微鏡で観察することで判定でき
る。
【００２０】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれに限定されるものではない。 ［実施例１］ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、
グルコース５ｇ／Ｌ、りん酸第二鉄0.01ｇ／Ｌ、天然海
水1000mlの組成を有する培養培地（殺菌前ｐＨ7.5) 150
mlを500ml フラスコに加え、これにシュードモナスsp.I
Z 208 株を種菌として植菌し、25℃, 72時間振盪培養し
た。
するが、本発明はこれに限定されるものではない。 ［実施例１］ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、
グルコース５ｇ／Ｌ、りん酸第二鉄0.01ｇ／Ｌ、天然海
水1000mlの組成を有する培養培地（殺菌前ｐＨ7.5) 150
mlを500ml フラスコに加え、これにシュードモナスsp.I
Z 208 株を種菌として植菌し、25℃, 72時間振盪培養し
た。
【００２１】得られた培養液10Ｌを10000rpmで遠心分離
し、培養上清を得た。上清を酢酸エチル（1000ml) で二
層分配し、酢酸エチル層と水層を得た。水層を活性炭
（和光純薬製）を充填したカラムに付し、水洗後、２Ｎ
酢酸を用いて溶出した。得られた溶出画分を減圧濃縮し
て10mlとし、HP-20 カラム（三菱化成社製）に付し、分
画を行った。活性画分を減圧濃縮して10mlとし、HW-40
(東ソー製) カラムに付し、分画を行った。活性画分を
２mlに減圧濃縮し、ＯＤＳカラム（ナカライテスク社
製) を用いたＨＰＬＣで、水（0.１％ＴＦＡ含有）から
10％アセトニトリル水溶液（0.１％ＴＦＡ含有）のグラ
ジェント溶出（30分間）によって展開した結果、28分に
活性画分が認められ分取した。分取画分を減圧濃縮して
シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリン５mgを得た。 ［実施例２］塩化メチレン溶液４ml中にＮ−α−ｔ−ブ
トキシカルボニル−Ｎ−ω−メトキシ−２，３，６−ト
リメチルベンゼンスルフォニル−Ｌ−アルギニン487mg
を溶解後、Ｄ−プロリンベンジルエステル塩酸塩242mg
とトリエチルアミン0.17mlを加え攪拌後、Ｎ，Ｎジクロ
ロヘキシルカルボジイミド227mg を加え室温で２時間攪
拌した。反応液は減圧濃縮し、残渣に酢酸エチル0.１ml
を加え、固形物をろ過により除去後、減圧濃縮し、エー
テル−石油エーテル２mlから結晶化することで、Ｎ−α
−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｎ−ω−メトキシ−２，
３，６−トリメチルベンゼンスルフォニル−Ｌ−アルギ
ニル−Ｄ−プロリンベンジルエステルを572 mgを得た。
し、培養上清を得た。上清を酢酸エチル（1000ml) で二
層分配し、酢酸エチル層と水層を得た。水層を活性炭
（和光純薬製）を充填したカラムに付し、水洗後、２Ｎ
酢酸を用いて溶出した。得られた溶出画分を減圧濃縮し
て10mlとし、HP-20 カラム（三菱化成社製）に付し、分
画を行った。活性画分を減圧濃縮して10mlとし、HW-40
(東ソー製) カラムに付し、分画を行った。活性画分を
２mlに減圧濃縮し、ＯＤＳカラム（ナカライテスク社
製) を用いたＨＰＬＣで、水（0.１％ＴＦＡ含有）から
10％アセトニトリル水溶液（0.１％ＴＦＡ含有）のグラ
ジェント溶出（30分間）によって展開した結果、28分に
活性画分が認められ分取した。分取画分を減圧濃縮して
シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリン５mgを得た。 ［実施例２］塩化メチレン溶液４ml中にＮ−α−ｔ−ブ
トキシカルボニル−Ｎ−ω−メトキシ−２，３，６−ト
リメチルベンゼンスルフォニル−Ｌ−アルギニン487mg
を溶解後、Ｄ−プロリンベンジルエステル塩酸塩242mg
とトリエチルアミン0.17mlを加え攪拌後、Ｎ，Ｎジクロ
ロヘキシルカルボジイミド227mg を加え室温で２時間攪
拌した。反応液は減圧濃縮し、残渣に酢酸エチル0.１ml
を加え、固形物をろ過により除去後、減圧濃縮し、エー
テル−石油エーテル２mlから結晶化することで、Ｎ−α
−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｎ−ω−メトキシ−２，
３，６−トリメチルベンゼンスルフォニル−Ｌ−アルギ
ニル−Ｄ−プロリンベンジルエステルを572 mgを得た。
【００２２】Ｎ−α−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｎ−ω
−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルフォ
ニル−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンベンジルエステル
404mgをトリフルオロ酢酸とアニソールの９対１混合溶
液１mlに加え50℃で90分攪拌した。反応液を減圧濃縮
後、生じた油状成分に水３mlを加え、トリエチルアミン
でｐＨ6.０に調整後80℃で16時間攪拌した。反応液を減
圧濃縮後、イソプロパノールと水の３対１溶液から結晶
化することで、シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリン
115mg（収率76％) を得た。 ［実施例３］キチナーゼ阻害活性試験は、キチナーゼ阻
害物質の検定法（特願平6-23765)に従って行った。イカ
由来のキチンを含んだ寒天培地に、キチナーゼ産生菌Se
rratia marcescens ATCC990 の菌液を塗布し、その寒天
培地上にシクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンを含む
ペーパーディスクをのせ、24℃、48時間静置した。その
後、ペーパーディスクのまわりに残存するキチンの直径
を測定し、活性を測定した。結果を下表に示す。
−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルフォ
ニル−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンベンジルエステル
404mgをトリフルオロ酢酸とアニソールの９対１混合溶
液１mlに加え50℃で90分攪拌した。反応液を減圧濃縮
後、生じた油状成分に水３mlを加え、トリエチルアミン
でｐＨ6.０に調整後80℃で16時間攪拌した。反応液を減
圧濃縮後、イソプロパノールと水の３対１溶液から結晶
化することで、シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリン
115mg（収率76％) を得た。 ［実施例３］キチナーゼ阻害活性試験は、キチナーゼ阻
害物質の検定法（特願平6-23765)に従って行った。イカ
由来のキチンを含んだ寒天培地に、キチナーゼ産生菌Se
rratia marcescens ATCC990 の菌液を塗布し、その寒天
培地上にシクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンを含む
ペーパーディスクをのせ、24℃、48時間静置した。その
後、ペーパーディスクのまわりに残存するキチンの直径
を測定し、活性を測定した。結果を下表に示す。
【００２３】 接種量 残存キチン直径 μg/disk 0 − 1 − 5 1.2cm 10 1.8cm ［実施例４］カンジダ アルビカンスIFO 1060をYMBrot
h (Difco社製) を用いて培養を行い、シクロ−Ｌ−アル
ギニル−Ｄ−プロリンを加えた場合と加えない場合との
形態の観察を行った。その結果、シクロ−Ｌ−アルギニ
ル−Ｄ−プロリンを加えない場合は、培養24時間後に酵
母型から菌糸型への形態変化を起こしたが、シクロ−Ｌ
−アルギニル−Ｄ−プロリンを６μg/disk以上の濃度に
して培養すると、カンジダ アルビカンスIFO 1060は、
酵母型から、菌糸型への形態変化を起こさなかった。
h (Difco社製) を用いて培養を行い、シクロ−Ｌ−アル
ギニル−Ｄ−プロリンを加えた場合と加えない場合との
形態の観察を行った。その結果、シクロ−Ｌ−アルギニ
ル−Ｄ−プロリンを加えない場合は、培養24時間後に酵
母型から菌糸型への形態変化を起こしたが、シクロ−Ｌ
−アルギニル−Ｄ−プロリンを６μg/disk以上の濃度に
して培養すると、カンジダ アルビカンスIFO 1060は、
酵母型から、菌糸型への形態変化を起こさなかった。
【００２４】
【発明の効果】本発明によりキチナーゼ阻害活性を有す
る新規物質シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンおよ
びその製造方法が提供される。
る新規物質シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンおよ
びその製造方法が提供される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 佐野 浩 静岡県清水市袖師町1900番地 株式会社海 洋バイオテクノロジー研究所清水研究所内 (72)発明者 山岸 政昭 静岡県焼津市小川256−２ (72)発明者 大石 一男 静岡県沼津市三園町７−１職住303 (72)発明者 鈴木 光彰 静岡県沼津市泉町16−６大岡寮202号室 (72)発明者 勝山 敦弘 静岡県清水市殿岡２−12−17
Claims (2)
- 【請求項１】 次式（Ｉ）： 【化１】 で表される新規物質シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロ
リン。 - 【請求項２】 シュードモナス属に属し、シクロ−Ｌ−
アルギニル−Ｄ−プロリン生産能を有する微生物を培地
で培養し、培養物からシクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プ
ロリンを採取することを特徴とするシクロ−Ｌ−アルギ
ニル−Ｄ−プロリンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP08108095A JP3858061B2 (ja) | 1995-04-06 | 1995-04-06 | 新規キチナーゼ阻害物質及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP08108095A JP3858061B2 (ja) | 1995-04-06 | 1995-04-06 | 新規キチナーゼ阻害物質及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08277290A true JPH08277290A (ja) | 1996-10-22 |
| JP3858061B2 JP3858061B2 (ja) | 2006-12-13 |
Family
ID=13736421
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP08108095A Expired - Lifetime JP3858061B2 (ja) | 1995-04-06 | 1995-04-06 | 新規キチナーゼ阻害物質及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3858061B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130190177A1 (en) * | 2010-07-15 | 2013-07-25 | Kongju National University Industry- University Cooperation Foundation | Agricultural agent containing 2,5-diketopiperazine derivative as active ingredient |
-
1995
- 1995-04-06 JP JP08108095A patent/JP3858061B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130190177A1 (en) * | 2010-07-15 | 2013-07-25 | Kongju National University Industry- University Cooperation Foundation | Agricultural agent containing 2,5-diketopiperazine derivative as active ingredient |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3858061B2 (ja) | 2006-12-13 |
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