JPH08193083A - 新規生理活性物質ｎｄ２０ - Google Patents
新規生理活性物質ｎｄ２０Info
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- JPH08193083A JPH08193083A JP446095A JP446095A JPH08193083A JP H08193083 A JPH08193083 A JP H08193083A JP 446095 A JP446095 A JP 446095A JP 446095 A JP446095 A JP 446095A JP H08193083 A JPH08193083 A JP H08193083A
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【構成】下記式で示される新規生理活性物質ＮＤ２０。
ＮＤ２０は、ノカルディア属に属するＮＤ２０生産菌を
適当な培地で好気的に培養し、培養物から目的物を採取
することによって製造することができる。 【効果】式の物質は鉄キレート作用の他、活性酸素消去
作用、過酸化脂質生成抑制作用、並びに抗腫瘍作用を有
する。
適当な培地で好気的に培養し、培養物から目的物を採取
することによって製造することができる。 【効果】式の物質は鉄キレート作用の他、活性酸素消去
作用、過酸化脂質生成抑制作用、並びに抗腫瘍作用を有
する。
Description
【０００１】技術分野 本発明は新規生理活性物質、詳しくは、鉄キレート作用
を有し、活性酸素消去作用、過酸化脂質生成抑制作用、
及び抗腫瘍作用を有する新規生理活性物質ＮＤ２０に関
する。
を有し、活性酸素消去作用、過酸化脂質生成抑制作用、
及び抗腫瘍作用を有する新規生理活性物質ＮＤ２０に関
する。
【０００２】発明の背景 過剰の鉄の関与していると考えられる生体内の病態は数
多く存在する。この過剰鉄の存在が、活性酸素種（acti
ve oxygen radicals）を多量に発生させることが示唆さ
れており、局所的に発生したその活性酸素種は内因性の
鉄と錯体を形成することによって強力なヒドロキシルラ
ジカル（OH・）を生成し、その結果、組織に大量の過酸
化脂質が発生する。この過酸化脂質は、血管をはじめ正
常な臓器・組織を傷害し、血管障害・炎症・浮腫などの
二次的病変の原因となることが知られている（日本臨
床、４６（１０）、６４（１９８８））。従って、鉄キ
レート作用を有し、活性酸素種を消去し、過酸化脂質生
成を抑制しうる物質は、虚血性心疾患・脳血管障害・動
脈硬化・炎症・腎疾患・癌・消化性潰瘍などの各種障害
や疾患に対する予防剤あるいは治療剤として使用するこ
とが可能であり、よって、このような作用を有する物質
の開発が望まれている。
多く存在する。この過剰鉄の存在が、活性酸素種（acti
ve oxygen radicals）を多量に発生させることが示唆さ
れており、局所的に発生したその活性酸素種は内因性の
鉄と錯体を形成することによって強力なヒドロキシルラ
ジカル（OH・）を生成し、その結果、組織に大量の過酸
化脂質が発生する。この過酸化脂質は、血管をはじめ正
常な臓器・組織を傷害し、血管障害・炎症・浮腫などの
二次的病変の原因となることが知られている（日本臨
床、４６（１０）、６４（１９８８））。従って、鉄キ
レート作用を有し、活性酸素種を消去し、過酸化脂質生
成を抑制しうる物質は、虚血性心疾患・脳血管障害・動
脈硬化・炎症・腎疾患・癌・消化性潰瘍などの各種障害
や疾患に対する予防剤あるいは治療剤として使用するこ
とが可能であり、よって、このような作用を有する物質
の開発が望まれている。
【０００３】また、地中海性貧血や再生不良性貧血に係
る輸血時に生じ易い鉄過剰症候群に対しては、従来から
過剰鉄のキレート療法による治療が主であるが、この面
からも経口で有効な過剰鉄キレート剤の開発が望まれて
いる。
る輸血時に生じ易い鉄過剰症候群に対しては、従来から
過剰鉄のキレート療法による治療が主であるが、この面
からも経口で有効な過剰鉄キレート剤の開発が望まれて
いる。
【０００４】更にまた、鉄キレート剤の癌細胞に対する
増殖抑制効果に関してはR.J.Bergeronらが報告している
(Biochem.Biophys.Res.Commun., 136 , 273, (1986))。
この報告によれば、鉄キレート剤ビブリオバクチンは、
癌細胞のリボヌクレオチドレダクターゼを阻害すること
によりＧ1 ／Ｓ期をブロックすると考えられている。こ
のビブリオバクチンは実際にマウス白血病細胞Ｌ１２１
０及びヒトバーキットリンパ腫Ｄａｕｄｉ細胞の増殖を
抑制した、と報告されている。このように鉄キレート剤
の癌細胞に対する増殖抑制効果も期待されている。
増殖抑制効果に関してはR.J.Bergeronらが報告している
(Biochem.Biophys.Res.Commun., 136 , 273, (1986))。
この報告によれば、鉄キレート剤ビブリオバクチンは、
癌細胞のリボヌクレオチドレダクターゼを阻害すること
によりＧ1 ／Ｓ期をブロックすると考えられている。こ
のビブリオバクチンは実際にマウス白血病細胞Ｌ１２１
０及びヒトバーキットリンパ腫Ｄａｕｄｉ細胞の増殖を
抑制した、と報告されている。このように鉄キレート剤
の癌細胞に対する増殖抑制効果も期待されている。
【０００５】このような鉄キレート剤としては、微生物
の代謝産物である、例えば、デフェロキサミン、デスフ
ェリチオシン、パイオケリン、リゾバクチン、ロドトル
リック酸、エンテロバクチン、などが報告されている
が、鉄キレート剤の開発に関しては依然として不断の希
求があるといえよう。
の代謝産物である、例えば、デフェロキサミン、デスフ
ェリチオシン、パイオケリン、リゾバクチン、ロドトル
リック酸、エンテロバクチン、などが報告されている
が、鉄キレート剤の開発に関しては依然として不断の希
求があるといえよう。
【０００６】発明の概要 本発明は上記の希求に応えるものである。すなわち、本
発明は、次式（Ｉ）で示される新規生理活性物質ＮＤ２
０を提供するものである。
発明は、次式（Ｉ）で示される新規生理活性物質ＮＤ２
０を提供するものである。
【化２】 この新規化合物ＮＤ２０は、鉄キレート作用を有し、後
述の実験例の結果から明らかなように、ビタミンＥ（過
酸化脂質生成抑制作用を有すると報告されている）との
比較においてより強い過酸化脂質生成抑制作用を示すと
ともに、癌細胞に対する増殖抑制作用も示す生理活性物
質である。このような特性に依り、本発明の化合物ＮＤ
２０は、前記のような疾病の予防剤あるいは治療剤とし
て有用であるといえよう。
述の実験例の結果から明らかなように、ビタミンＥ（過
酸化脂質生成抑制作用を有すると報告されている）との
比較においてより強い過酸化脂質生成抑制作用を示すと
ともに、癌細胞に対する増殖抑制作用も示す生理活性物
質である。このような特性に依り、本発明の化合物ＮＤ
２０は、前記のような疾病の予防剤あるいは治療剤とし
て有用であるといえよう。
【０００７】発明の具体的な説明 ［Ｉ］新規化合物ＮＤ２０ １） 化学構造 本発明の新規化合物ＮＤ２０は、上記の式（Ｉ）で示さ
れる化学構造を有するものである。この化学構造は、該
ＮＤ２０のプロトン核磁気共鳴スペクトル、炭素１３核
磁気共鳴スペクトル、紫外部吸収スペクトル、赤外部吸
収スペクトル、及び質量分析スペクトルを詳細に検討し
た結果、決定されたものである。
れる化学構造を有するものである。この化学構造は、該
ＮＤ２０のプロトン核磁気共鳴スペクトル、炭素１３核
磁気共鳴スペクトル、紫外部吸収スペクトル、赤外部吸
収スペクトル、及び質量分析スペクトルを詳細に検討し
た結果、決定されたものである。
【０００８】２） 物理化学的性質 （１）外観 白色粉末 （２）融点 ６８〜７２℃（分解） （３）溶解性 メタノール、エタノール、クロロホルム、アセトン、酢
酸エチルに可溶，ｎ−ヘキサンに微溶，水に不溶 （４）Ｒｆ値（メルク社製「シリカゲル６０Ｆ254 」使
用） クロロホルム−メタノール（１０：１）で０．４８ （５）ＦＤ−ＭＳスペクトル（ｍ／ｚ） ７４３（Ｍ+ ） （６）比旋光度［α］Ｄ 25 （ｃ＝１．０，メタノール
中） −８．６° （７）紫外部吸収スペクトル 第１図に示す。 （８）赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒディスク法） 第２図に示す。 （９）プロトン核磁気共鳴スペクトル（５００メガヘル
ツ、重ＤＭＳＯ中） 第３図に示す。 （１０）炭素１３核磁気共鳴スペクトル（１２５メガヘ
ルツ、重ＤＭＳＯ中） 第４図に示す。 （１１）元素分析 Ｃ Ｈ Ｎ Ｏ 分析値（％） ： 61.18 7.68 9.12 22.02 計算値（％） ： 61.37 7.67 9.42 21.53 （１２）分子式 Ｃ38Ｈ57Ｎ5 Ｏ10 （１３）塩化鉄（III)に対する呈色反応 陽性
酸エチルに可溶，ｎ−ヘキサンに微溶，水に不溶 （４）Ｒｆ値（メルク社製「シリカゲル６０Ｆ254 」使
用） クロロホルム−メタノール（１０：１）で０．４８ （５）ＦＤ−ＭＳスペクトル（ｍ／ｚ） ７４３（Ｍ+ ） （６）比旋光度［α］Ｄ 25 （ｃ＝１．０，メタノール
中） −８．６° （７）紫外部吸収スペクトル 第１図に示す。 （８）赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒディスク法） 第２図に示す。 （９）プロトン核磁気共鳴スペクトル（５００メガヘル
ツ、重ＤＭＳＯ中） 第３図に示す。 （１０）炭素１３核磁気共鳴スペクトル（１２５メガヘ
ルツ、重ＤＭＳＯ中） 第４図に示す。 （１１）元素分析 Ｃ Ｈ Ｎ Ｏ 分析値（％） ： 61.18 7.68 9.12 22.02 計算値（％） ： 61.37 7.67 9.42 21.53 （１２）分子式 Ｃ38Ｈ57Ｎ5 Ｏ10 （１３）塩化鉄（III)に対する呈色反応 陽性
【０００９】［II］本発明の化合物ＮＤ２０の製造 本発明の化合物ＮＤ２０は、以下で詳説するような微生
物の培養法により得ることができるが、このような方法
に限定されることはなく、例えば、類縁化合物の合成化
学的または微生物学的修飾によって製造することも、あ
るいは全合成化学的に製造することも可能であろう。ま
た、遺伝子工学的手法によることもできるであろう。す
なわち、化合物ＮＤ２０の生産に関与する遺伝子を適当
な微生物に組込み、得られた形質転換体を培養し、この
培養物から目的化合物を分離して得ることも可能であろ
う。微生物の培養法による場合には、菌株としては、例
えば、ノカルディア属に属し、ＮＤ２０生産能を有する
ものを使用しうる。具体的には、下記で詳説するところ
の、本発明者の単離に係るノカルディア・エスピー Ｎ
Ｄ２０株が、ＮＤ２０生産能を有する菌株であることが
本発明者によって此の度明らかにされたことから、この
菌株を好ましく用いることができる。その他の菌株とし
ては、細胞毒性の有無及び過酸化脂質生成抑制能を指標
として抗生物質生産菌単離の常法に従って自然界から単
離したものが用いられうるであろう。また、ノカルディ
ア・エスピーＮＤ２０株を含め各種ＮＤ２０生産菌を放
射線照射、その他の変異処理に付してＮＤ２０の生産能
を高めることもできるであろう。こうして得られた変異
菌株は、いずれも以下で詳説する培養法による本発明の
化合物ＮＤ２０の製造において好ましく用いられうるで
あろう。
物の培養法により得ることができるが、このような方法
に限定されることはなく、例えば、類縁化合物の合成化
学的または微生物学的修飾によって製造することも、あ
るいは全合成化学的に製造することも可能であろう。ま
た、遺伝子工学的手法によることもできるであろう。す
なわち、化合物ＮＤ２０の生産に関与する遺伝子を適当
な微生物に組込み、得られた形質転換体を培養し、この
培養物から目的化合物を分離して得ることも可能であろ
う。微生物の培養法による場合には、菌株としては、例
えば、ノカルディア属に属し、ＮＤ２０生産能を有する
ものを使用しうる。具体的には、下記で詳説するところ
の、本発明者の単離に係るノカルディア・エスピー Ｎ
Ｄ２０株が、ＮＤ２０生産能を有する菌株であることが
本発明者によって此の度明らかにされたことから、この
菌株を好ましく用いることができる。その他の菌株とし
ては、細胞毒性の有無及び過酸化脂質生成抑制能を指標
として抗生物質生産菌単離の常法に従って自然界から単
離したものが用いられうるであろう。また、ノカルディ
ア・エスピーＮＤ２０株を含め各種ＮＤ２０生産菌を放
射線照射、その他の変異処理に付してＮＤ２０の生産能
を高めることもできるであろう。こうして得られた変異
菌株は、いずれも以下で詳説する培養法による本発明の
化合物ＮＤ２０の製造において好ましく用いられうるで
あろう。
【００１０】ＮＤ２０株 本発明者が自然界より単離して得たＮＤ２０株の菌学的
性質は以下の通りである。 １）形態 ＮＤ２０株は、シュクロ−ス硝酸塩寒天培地、グルコ−
ス・アスパラギン寒天培地、グリセロ−ル・アスパラギ
ン寒天培地、チロシン寒天培地、及びイ−スト・麦芽寒
天培地で良く生育し、気菌糸の着生も良好である。基生
菌糸より生じる菌糸は直状、又は波状で伸長し単純分枝
する。胞子はその菌糸上に、２〜７個が連鎖して着生す
る。胞子は円筒型で、大きさは長さ０．８〜１．３μm
、幅０．５〜０．７μm であり、その表面は平滑であ
る。気菌糸及び基生菌糸に、胞子嚢、鞭毛胞子、及び菌
核などの特殊形態は認められない。 ２）各種培地上の生育 ＮＤ２０株を各種培地上で２７℃、３週間培養した結果
は、第１表に示す通りである。 ３）生理的性質 ＮＤ２０株の生理的性質は、第２表に示す通りである。 ４）炭素源の利用性 ＮＤ２０株の炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリ−ブ
寒天培地上）は、第３表に示す通りである。 ５）菌体成分 （１）全菌体中に、メソ−ジアミノピメリン酸を含む
が、グリシンは検出されない。 （２）糖成分としてはアラビノ−ス及びガラクト−スが
検出される。 （３）細胞壁グリカン部のＮ−アシル型は、グリコリル
型である。 （４）リン脂質はタイプＰII型である。 （５）ミコ−ル酸が検出され、極性酸のスポットは、単
一である。 （６）メナキノンは、ＭＫ−８（Ｈ4 ）が主成分であ
る。 （７）ＤＮＡ中のＧＣ含量は、６２％である。
性質は以下の通りである。 １）形態 ＮＤ２０株は、シュクロ−ス硝酸塩寒天培地、グルコ−
ス・アスパラギン寒天培地、グリセロ−ル・アスパラギ
ン寒天培地、チロシン寒天培地、及びイ−スト・麦芽寒
天培地で良く生育し、気菌糸の着生も良好である。基生
菌糸より生じる菌糸は直状、又は波状で伸長し単純分枝
する。胞子はその菌糸上に、２〜７個が連鎖して着生す
る。胞子は円筒型で、大きさは長さ０．８〜１．３μm
、幅０．５〜０．７μm であり、その表面は平滑であ
る。気菌糸及び基生菌糸に、胞子嚢、鞭毛胞子、及び菌
核などの特殊形態は認められない。 ２）各種培地上の生育 ＮＤ２０株を各種培地上で２７℃、３週間培養した結果
は、第１表に示す通りである。 ３）生理的性質 ＮＤ２０株の生理的性質は、第２表に示す通りである。 ４）炭素源の利用性 ＮＤ２０株の炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリ−ブ
寒天培地上）は、第３表に示す通りである。 ５）菌体成分 （１）全菌体中に、メソ−ジアミノピメリン酸を含む
が、グリシンは検出されない。 （２）糖成分としてはアラビノ−ス及びガラクト−スが
検出される。 （３）細胞壁グリカン部のＮ−アシル型は、グリコリル
型である。 （４）リン脂質はタイプＰII型である。 （５）ミコ−ル酸が検出され、極性酸のスポットは、単
一である。 （６）メナキノンは、ＭＫ−８（Ｈ4 ）が主成分であ
る。 （７）ＤＮＡ中のＧＣ含量は、６２％である。
【００１１】上記の性質を、バ−ジ−ズ・マニュアル・
オブ・システマチック・バクテリオロジ−（Bergey's M
anual of Systematic Bacteriology）第４巻及びバ−ジ
−ズ・マニュアル・オブ・ディタ−ミナティブ・バクテ
リオロジ−（Bergey's Manual of Determinative Bacte
riology ）第９巻の記載と対比してみたところ、ＮＤ２
０株のＤＮＡのＧＣ含量が６２％であって、上記参考書
記載の放線菌に対する６４〜７２％に比べて多少低い値
ではあるが、細胞壁の成分、ミコ−ル酸の検出などの
他、菌の形態等によりノカルディア属に最も類似する菌
株であると推察し得た。よって、本菌株を Nocardia s
p. ＮＤ２０株と命名し、茨城県つくば市東１丁目１番
３号の工業技術院生命工学工業技術研究所に１９９４年
１２月１６日に寄託して、FERM BP −4938の受託番号を
得た。
オブ・システマチック・バクテリオロジ−（Bergey's M
anual of Systematic Bacteriology）第４巻及びバ−ジ
−ズ・マニュアル・オブ・ディタ−ミナティブ・バクテ
リオロジ−（Bergey's Manual of Determinative Bacte
riology ）第９巻の記載と対比してみたところ、ＮＤ２
０株のＤＮＡのＧＣ含量が６２％であって、上記参考書
記載の放線菌に対する６４〜７２％に比べて多少低い値
ではあるが、細胞壁の成分、ミコ−ル酸の検出などの
他、菌の形態等によりノカルディア属に最も類似する菌
株であると推察し得た。よって、本菌株を Nocardia s
p. ＮＤ２０株と命名し、茨城県つくば市東１丁目１番
３号の工業技術院生命工学工業技術研究所に１９９４年
１２月１６日に寄託して、FERM BP −4938の受託番号を
得た。
【００１２】
【表１】
【００１３】
【表２】
【００１４】
【表３】
【００１５】培養／ＮＤ２０の生産 化合物ＮＤ２０は、ノカルディア属に属するＮＤ２０生
産菌を適当な培地で好気的に培養し、その培養物から目
的物を採取することによって製造することができる。培
地は、ＮＤ２０生産菌が利用しうる任意の栄養源を含有
するものであり得る。具体的には、例えば、炭素源とし
てグルコース、ガラクトース、麦芽糖、及びグリセロー
ルなどが使用でき、窒素源として大豆粉、魚粉、綿実
粕、乾燥酵母、酵母エキス及びコーンスティープリカー
などの有機物並びにアンモニウム塩又は硝酸塩、例え
ば、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム及び塩化アンモ
ニウムなどの無機物が利用できる。また、必要に応じ
て、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カルシウムの
他、各種燐酸塩、重金属塩などの無機塩類を添加するこ
とができる。発酵中の発泡を抑制するために、常法に従
って適当な消泡剤、例えばシリコーン油を添加すること
もできる。
産菌を適当な培地で好気的に培養し、その培養物から目
的物を採取することによって製造することができる。培
地は、ＮＤ２０生産菌が利用しうる任意の栄養源を含有
するものであり得る。具体的には、例えば、炭素源とし
てグルコース、ガラクトース、麦芽糖、及びグリセロー
ルなどが使用でき、窒素源として大豆粉、魚粉、綿実
粕、乾燥酵母、酵母エキス及びコーンスティープリカー
などの有機物並びにアンモニウム塩又は硝酸塩、例え
ば、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム及び塩化アンモ
ニウムなどの無機物が利用できる。また、必要に応じ
て、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カルシウムの
他、各種燐酸塩、重金属塩などの無機塩類を添加するこ
とができる。発酵中の発泡を抑制するために、常法に従
って適当な消泡剤、例えばシリコーン油を添加すること
もできる。
【００１６】培養方法としては、抗生物質の生産の場合
に一般的に行なわれている方法と同様に、好気的液体培
養法が最も適している。培養温度は２０〜３７℃が適当
であるが、２５〜３０℃が好ましい。この方法でのＮＤ
２０の生産量は、振盪培養、通気撹拌培養ともに培養５
日目に最高に達する。このようにしてＮＤ２０の蓄積さ
れた培養物が得られる。培養物中では、ＮＤ２０はその
一部は菌体外（即ち、培養濾液中）に存在するが、その
大部分は菌体中に存在する。
に一般的に行なわれている方法と同様に、好気的液体培
養法が最も適している。培養温度は２０〜３７℃が適当
であるが、２５〜３０℃が好ましい。この方法でのＮＤ
２０の生産量は、振盪培養、通気撹拌培養ともに培養５
日目に最高に達する。このようにしてＮＤ２０の蓄積さ
れた培養物が得られる。培養物中では、ＮＤ２０はその
一部は菌体外（即ち、培養濾液中）に存在するが、その
大部分は菌体中に存在する。
【００１７】このような培養物からＮＤ２０を採取する
には、合目的的な任意の方法が利用可能である。そのひ
とつの方法は抽出の原理に基づくものであって、具体的
には、菌体外（即ち、培養濾液中）のＮＤ２０について
はこれを水不混和性のＮＤ２０用溶媒（前記参照）、例
えば酢酸エチルなどで抽出する方法、あるいは、菌体内
のＮＤ２０については濾過、遠心分離などで得た菌体集
体をメタノール、エタノール、アセトンなどで処理して
回収する方法などがある。菌体を分離せずに培養物その
ままを上記の抽出操作に付すこともできる。適当な溶媒
を用いた向流分配法も抽出の範疇に入れることができ
る。培養物からＮＤ２０を採取する他の方法は、吸着の
原理に基づくものであって、既に液状となっているＮＤ
２０含有物、例えば培養濾液あるいは上記のようにして
抽出操作を行うことによって得られる抽出液を対象とし
て、適当な吸着剤、例えばシリカゲル、活性炭、合成吸
着剤（例えば、「ダイヤイオンＨＰ２０］（三菱化成社
製))などを用いて目的のＮＤ２０を吸着させ、その後、
適当な溶媒にて溶離させることによってＮＤ２０を得る
ことができる。このようにして得られたＮＤ２０溶液を
減圧濃縮乾固すれば、ＮＤ２０粗標品が得られる。
には、合目的的な任意の方法が利用可能である。そのひ
とつの方法は抽出の原理に基づくものであって、具体的
には、菌体外（即ち、培養濾液中）のＮＤ２０について
はこれを水不混和性のＮＤ２０用溶媒（前記参照）、例
えば酢酸エチルなどで抽出する方法、あるいは、菌体内
のＮＤ２０については濾過、遠心分離などで得た菌体集
体をメタノール、エタノール、アセトンなどで処理して
回収する方法などがある。菌体を分離せずに培養物その
ままを上記の抽出操作に付すこともできる。適当な溶媒
を用いた向流分配法も抽出の範疇に入れることができ
る。培養物からＮＤ２０を採取する他の方法は、吸着の
原理に基づくものであって、既に液状となっているＮＤ
２０含有物、例えば培養濾液あるいは上記のようにして
抽出操作を行うことによって得られる抽出液を対象とし
て、適当な吸着剤、例えばシリカゲル、活性炭、合成吸
着剤（例えば、「ダイヤイオンＨＰ２０］（三菱化成社
製))などを用いて目的のＮＤ２０を吸着させ、その後、
適当な溶媒にて溶離させることによってＮＤ２０を得る
ことができる。このようにして得られたＮＤ２０溶液を
減圧濃縮乾固すれば、ＮＤ２０粗標品が得られる。
【００１８】このようにして得られるＮＤ２０の粗標品
をさらに精製するためには、上記の抽出法及び吸着法
に、ゲル濾過、高速液体クロマトグラフィーなどの操作
を必要に応じて適宜組合わせて必要回数実施すればよ
い。例えば、シリカゲルなどの吸着剤、「セファデック
スＬＨ−２０］（ファルマシア社製）などのゲル濾過剤
を用いたカラムクロマトグラフィー、「ＣＡＰＣＥＬＬ
ＰＡＫ」（資生堂社製）などのシリカ系充填カラム
（順相あるいは逆相カラム）を用いた高速液体クロマト
グラフィー、あるいは向流分配法を適宜組合わせて実施
することができる。
をさらに精製するためには、上記の抽出法及び吸着法
に、ゲル濾過、高速液体クロマトグラフィーなどの操作
を必要に応じて適宜組合わせて必要回数実施すればよ
い。例えば、シリカゲルなどの吸着剤、「セファデック
スＬＨ−２０］（ファルマシア社製）などのゲル濾過剤
を用いたカラムクロマトグラフィー、「ＣＡＰＣＥＬＬ
ＰＡＫ」（資生堂社製）などのシリカ系充填カラム
（順相あるいは逆相カラム）を用いた高速液体クロマト
グラフィー、あるいは向流分配法を適宜組合わせて実施
することができる。
【００１９】［III ］本発明の化合物ＮＤ２０の用途 本発明の化合物ＮＤ２０は、既述したように、塩化鉄
（III ）による呈色反応に対して陽性を示し、また、鉄
キレーターとして既に報告されているマイコバクチン類
［Bacteological Revews, 34,(2), 99 (1970) 〕と構造
的に類似していることから、鉄キレーターの一つとして
位置づけられるものである。更に、本化合物は、後述す
るように、活性酸素種を消去することに基づく優れた過
酸化脂質生成抑制作用を有することから、例えば脳、心
臓、末梢における循環障害に起因する各種疾患や炎症、
浮腫などの諸病態に対する予防・治療剤として期待でき
るものである。また、抗腫瘍活性を有する点でも有用で
あり、抗腫瘍剤としても期待できる。
（III ）による呈色反応に対して陽性を示し、また、鉄
キレーターとして既に報告されているマイコバクチン類
［Bacteological Revews, 34,(2), 99 (1970) 〕と構造
的に類似していることから、鉄キレーターの一つとして
位置づけられるものである。更に、本化合物は、後述す
るように、活性酸素種を消去することに基づく優れた過
酸化脂質生成抑制作用を有することから、例えば脳、心
臓、末梢における循環障害に起因する各種疾患や炎症、
浮腫などの諸病態に対する予防・治療剤として期待でき
るものである。また、抗腫瘍活性を有する点でも有用で
あり、抗腫瘍剤としても期待できる。
【００２０】医薬品として使用する場合の製剤化および
投与方法は、従来公知の種々の方法が適応できる。すな
わち、製剤形態としては、注射剤、顆粒剤、錠剤、粉末
剤、坐剤などの形態がとり得る。また、投与方法として
は、注射、経口、直腸内投与などが可能である。経口又
は直腸内投与の場合は、徐放化製剤として用いてもよ
い。製剤化の際には、ＮＤ２０に悪影響を与えない限
り、医薬用に用いられている種々の補助剤、即ち、担体
やその他の助剤、例えば安定剤、防腐剤、無痛化剤、乳
化剤など、が必要に応じて使用され得る。製剤におい
て、ＮＤ２０の含量は、製剤形態により広範囲に変える
ことが可能である。ＮＤ２０の投与量は、成人１人１日
当たり０．１〜１００ｍｇ程度であるが、年齢、病態、
症状などに応じて適宜増減することができ、またその方
が好ましい。
投与方法は、従来公知の種々の方法が適応できる。すな
わち、製剤形態としては、注射剤、顆粒剤、錠剤、粉末
剤、坐剤などの形態がとり得る。また、投与方法として
は、注射、経口、直腸内投与などが可能である。経口又
は直腸内投与の場合は、徐放化製剤として用いてもよ
い。製剤化の際には、ＮＤ２０に悪影響を与えない限
り、医薬用に用いられている種々の補助剤、即ち、担体
やその他の助剤、例えば安定剤、防腐剤、無痛化剤、乳
化剤など、が必要に応じて使用され得る。製剤におい
て、ＮＤ２０の含量は、製剤形態により広範囲に変える
ことが可能である。ＮＤ２０の投与量は、成人１人１日
当たり０．１〜１００ｍｇ程度であるが、年齢、病態、
症状などに応じて適宜増減することができ、またその方
が好ましい。
【００２１】１）生理活性 本発明の化合物ＮＤ２０の生理活性を以下の実験例にお
いて示す。 （１）過酸化脂質生成抑制作用 ウィスター系雄ラットの前脳を脱血後に摘出し、６７ｍ
Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）でホモジナイズして、
脳ホモジネートを調製した。直ちに、このラット脳ホモ
ジネートにアスコルビン酸を１００μＭ添加して３７℃
で１時間振盪しながらインキュベートすることで、脳ホ
モジネート中に活性酸素種を発生させ、その結果として
過酸化脂質の生成をもたらした。この反応において、試
験薬物をアスコルビン酸添加と同時に反応液中に添加
し、同様にインキュベートを行ない、インキュベート混
合物中に生成したマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）を、八
木ら［Anal.Biochem.,95, 351,(1979)］によるチオバル
ビツール酸法によって測定した。このＭＤＡ量（ａ）お
よびコントロール値（ｂ）（試験薬物を加えないときの
ＭＤＡ量）から、過酸化脂質生成抑制率を下式により求
めた。 なお、試験薬物（本発明の化合物ＮＤ２０及び対照薬物
のビタミンＥ）は水に難溶なので、メタノールで溶解、
希釈後に試験に供した。
いて示す。 （１）過酸化脂質生成抑制作用 ウィスター系雄ラットの前脳を脱血後に摘出し、６７ｍ
Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）でホモジナイズして、
脳ホモジネートを調製した。直ちに、このラット脳ホモ
ジネートにアスコルビン酸を１００μＭ添加して３７℃
で１時間振盪しながらインキュベートすることで、脳ホ
モジネート中に活性酸素種を発生させ、その結果として
過酸化脂質の生成をもたらした。この反応において、試
験薬物をアスコルビン酸添加と同時に反応液中に添加
し、同様にインキュベートを行ない、インキュベート混
合物中に生成したマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）を、八
木ら［Anal.Biochem.,95, 351,(1979)］によるチオバル
ビツール酸法によって測定した。このＭＤＡ量（ａ）お
よびコントロール値（ｂ）（試験薬物を加えないときの
ＭＤＡ量）から、過酸化脂質生成抑制率を下式により求
めた。 なお、試験薬物（本発明の化合物ＮＤ２０及び対照薬物
のビタミンＥ）は水に難溶なので、メタノールで溶解、
希釈後に試験に供した。
【００２２】結果を次表に示す。
【表４】 上記の結果より、ＮＤ２０には、ビタミンＥと比較して
より強い過酸化脂質生成抑制作用があることがわかる。
より強い過酸化脂質生成抑制作用があることがわかる。
【００２３】（２）in vitro 抗腫瘍活性 マウスの腫瘍細胞であるＰ３８８細胞を使用した。Ｆ底
マイクロプレートを用い、培地で被試験物質を順次に段
階希釈し、それぞれに５×１０3 ／ウエルの細胞を加え
た後、５％ＣＯ2 インキュベーター中、３７℃で２日間
培養後、細胞数をＭＴＴ法でカウントした。細胞数がコ
ントロールの５０％に減少した濃度をＩＣ50（μｇ／ｍ
ｌ）とした。培地はＲＰＭＩ １６４０に牛胎児血清
（１０％）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプ
トマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、２−メルカプトエタ
ノール（５×１０-5Ｍ）を加えたものを使用した。試験
薬物（本発明の化合物ＮＤ２０）は水に難溶なので、メ
タノールで溶解、希釈後に試験に供した。その結果、Ｉ
Ｃ50は０．０３６μｇ／ｍｌであった。
マイクロプレートを用い、培地で被試験物質を順次に段
階希釈し、それぞれに５×１０3 ／ウエルの細胞を加え
た後、５％ＣＯ2 インキュベーター中、３７℃で２日間
培養後、細胞数をＭＴＴ法でカウントした。細胞数がコ
ントロールの５０％に減少した濃度をＩＣ50（μｇ／ｍ
ｌ）とした。培地はＲＰＭＩ １６４０に牛胎児血清
（１０％）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプ
トマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、２−メルカプトエタ
ノール（５×１０-5Ｍ）を加えたものを使用した。試験
薬物（本発明の化合物ＮＤ２０）は水に難溶なので、メ
タノールで溶解、希釈後に試験に供した。その結果、Ｉ
Ｃ50は０．０３６μｇ／ｍｌであった。
【００２４】［IV］実施例 以下、具体的な実施例でもって本発明をより詳細に説明
する。 １）培養 使用した培地は、下記の組成の成分を１リットルの水に
溶解してｐＨ７．４に調整したものである。 グリセロール １５．０ｇ Pharma media １５．０ｇ Ｌ−グルタミン酸ナトリウム一水和物 ５．０ｇ ＮａＣｌ ３．０ｇ 上記培地１００ｍｌを５００ｍｌのイボ付き三角フラス
コヘ分注後滅菌したものにノカルディア・エスピー Ｎ
Ｄ２０株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９３８）をスラントより
各々のフラスコヘ１白金耳ずつ接種し、ロータリーシェ
ーカーで２７℃にて５日間振盪培養した。
する。 １）培養 使用した培地は、下記の組成の成分を１リットルの水に
溶解してｐＨ７．４に調整したものである。 グリセロール １５．０ｇ Pharma media １５．０ｇ Ｌ−グルタミン酸ナトリウム一水和物 ５．０ｇ ＮａＣｌ ３．０ｇ 上記培地１００ｍｌを５００ｍｌのイボ付き三角フラス
コヘ分注後滅菌したものにノカルディア・エスピー Ｎ
Ｄ２０株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９３８）をスラントより
各々のフラスコヘ１白金耳ずつ接種し、ロータリーシェ
ーカーで２７℃にて５日間振盪培養した。
【００２５】２）ＮＤ２０の採取 上記の条件で培養後、培養液（５．０リットル）を濾過
し、菌体を得た。この菌体を１リットルのアセトンで抽
出し、抽出液を濃縮後、あらかじめ洗浄しておいたダイ
ヤイオンＨＰ−２０（三菱化成社製）カラム（３．０ｃ
ｍφ×２５ｃｍ）に吸着させ、３００ｍｌの２０％アセ
トンでカラムを洗浄したのち、３００ｍｌの７０％アセ
トンで溶出した。溶出画分を減圧濃縮し、ｐＨを７に調
整し、２倍量の酢酸エチルで３回抽出した。抽出液に無
水硫酸ナトリウムを添加して脱水し、濾過した後、濾液
を濃縮乾固した。これを５ｍｌのクロロホルムに溶解
し、シリカゲル（和光純薬製「ワコーゲル Ｃ−２０
０］）のカラム（４．５ｃｍφ×２０ｃｍ）に吸着さ
せ、クロロホルム−メタノール（５０：１）で溶出し
た。活性画分を濃縮乾固し、メタノールに溶解し、逆相
カラム（ＣＡＰＳＥＬＬＰＡＫ Ｃ１８（資生堂社
製），４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ）を用い、移動相とし
て８５％メタノールを毎分３ｍｌで送液して高速液体ク
ロマトグラフィーを行なった。その結果得られたＮＤ２
０を含む分画を減圧濃縮乾固して、６１．７ｍｇの精製
ＮＤ２０を得た。
し、菌体を得た。この菌体を１リットルのアセトンで抽
出し、抽出液を濃縮後、あらかじめ洗浄しておいたダイ
ヤイオンＨＰ−２０（三菱化成社製）カラム（３．０ｃ
ｍφ×２５ｃｍ）に吸着させ、３００ｍｌの２０％アセ
トンでカラムを洗浄したのち、３００ｍｌの７０％アセ
トンで溶出した。溶出画分を減圧濃縮し、ｐＨを７に調
整し、２倍量の酢酸エチルで３回抽出した。抽出液に無
水硫酸ナトリウムを添加して脱水し、濾過した後、濾液
を濃縮乾固した。これを５ｍｌのクロロホルムに溶解
し、シリカゲル（和光純薬製「ワコーゲル Ｃ−２０
０］）のカラム（４．５ｃｍφ×２０ｃｍ）に吸着さ
せ、クロロホルム−メタノール（５０：１）で溶出し
た。活性画分を濃縮乾固し、メタノールに溶解し、逆相
カラム（ＣＡＰＳＥＬＬＰＡＫ Ｃ１８（資生堂社
製），４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ）を用い、移動相とし
て８５％メタノールを毎分３ｍｌで送液して高速液体ク
ロマトグラフィーを行なった。その結果得られたＮＤ２
０を含む分画を減圧濃縮乾固して、６１．７ｍｇの精製
ＮＤ２０を得た。
【図１】メタノール中でのＮＤ２０の紫外吸収スペクト
ルを模写したものである。
ルを模写したものである。
【図２】ＮＤ２０のＫＢｒディスク法による赤外吸収ス
ペクトルを模写したものである。
ペクトルを模写したものである。
【図３】ＮＤ２０の重ＤＭＳＯ中における５００メガヘ
ルツプロトン核磁気共鳴スペクトルを模写したものであ
る。
ルツプロトン核磁気共鳴スペクトルを模写したものであ
る。
【図４】ＮＤ２０の重ＤＭＳＯ中における１２５メガヘ
ルツ炭素１３核磁気共鳴スペクトルを模写したものであ
る。
ルツ炭素１３核磁気共鳴スペクトルを模写したものであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 17/16 Ｃ１２Ｒ 1:365）
Claims (3)
- 【請求項１】次式（Ｉ）で示される新規生理活性物質Ｎ
Ｄ２０。 【化１】 - 【請求項２】ノカルディア属に属するＮＤ２０生産菌を
培養し、培養物から生理活性物質ＮＤ２０を採取するこ
とを特徴とする生理活性物質ＮＤ２０の製造法。 - 【請求項３】ＮＤ２０生産菌がノカルディア・エスピー
ＮＤ２０株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９３８）である、請求
項２の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP446095A JPH08193083A (ja) | 1995-01-13 | 1995-01-13 | 新規生理活性物質ｎｄ２０ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP446095A JPH08193083A (ja) | 1995-01-13 | 1995-01-13 | 新規生理活性物質ｎｄ２０ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08193083A true JPH08193083A (ja) | 1996-07-30 |
Family
ID=11584760
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP446095A Pending JPH08193083A (ja) | 1995-01-13 | 1995-01-13 | 新規生理活性物質ｎｄ２０ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08193083A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003073266A (ja) * | 2001-08-30 | 2003-03-12 | Osaka Organic Chem Ind Ltd | 癌細胞増殖阻害剤 |
-
1995
- 1995-01-13 JP JP446095A patent/JPH08193083A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003073266A (ja) * | 2001-08-30 | 2003-03-12 | Osaka Organic Chem Ind Ltd | 癌細胞増殖阻害剤 |
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