JPH08501692A - セルラーゼ変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 セルロース結合ドメイン（CBD）、触媒活性ドメイン（CAD）およびセルロース結合ドメインと触媒活性ドメインを連結する領域（連結領域）を含んでなる親セルラーゼのセルラーゼ変異体、例えばフミコラ インソレンス（Humico insolens）43kDエンドグルカナーゼの如き科45に分類されるセルラーゼであって、ここにおいて CBD，CAD 又は連結領域の１以上のアミノ酸残基が欠失しているか、又は１個又は複数のアミノ酸残基により置換されおよび／又は１個又は複数のアミノ酸が連結領域に加えられおよび／又は他のCBD が触媒的に活性なドメインの対向末端で加えられ、注目すべき改善された性質、例えばアルカリ活性、洗剤組成物成分との適合性、粒質物の土壌除去、色彩明澄性、毛羽立ち除去、脱ピリング、手粗さ軽減およびアニオン界面活性剤およびペルオキシダーゼ漂白系に対する感受性を有しそして例えば、繊維処理に対し洗剤組成中で、製紙用パハプ加工に対し、動物の飼料およびジーズのストーン（stone）洗浄に対して有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 セルラーゼ変異体 技術分野 本発明は、改良された性質を有するセルラーゼ変異体に関する。 発明の背景 セルロースを分解できる酵素（以下、「セルロース分解酵素」又は「セルラー ゼ」と言う）は、セルロースの非晶質部を除去するため製紙用パルプの加工にお いて使用でき、従ってパルプ中の結晶質セルロースの割合を増加させ、そしてグ ルカンの消化能を改善するため動物飼料中で用いられる。セルロース分解酵素の 更に重要な使用は、繊維処理のため、例えば綿含有布帛の手粗さを軽減するため （注、例えば英国特許1368 599又は米国特許4,435,307）、土壌の除去および布 帛の色彩明澄化のため（注、例えばヨーロッパ特許220016）又は布帛に「ストー ン−ウオッシット（Stone−Washed）」、外観を与えるため色彩に局存化変化を 与えるため（注、例えば、ヨーロッパ特許307 564）である。 セルロース分解酵素の実際的利用は、或る程度、公知のセルラーゼ調製品の性 質により妨げられてきたが、その調製品はしばしば多様の単一セルラーゼ成分の 複合体混合物であり、そして相当に低い特異的活性を有し得る。多様な酵素系に おいて単一成分の製造を最適化することそして従ってセルロース分解酵素を工業 的にコスト的に有効に生産することは困難でありそしてそれらの実際の使用は所 望の効果を達成するため相当量の酵素を用いる必要性から生じる困難性により妨 げられてきた。 これまで示されてきたセルロース分解酵素の欠点は、高い比活性に対して選ば れた単一成分酵素を用いることにより救済できるかもしれない。単一成分セルラ ーゼは、例えば国際公開（WO）91／17243，WO 91／17244 および WO 91／10732 に記載されている。 発明の要約 更に研究を重ね次の知見を得た；すなわちセルラーゼの改善された性質が、そ のような改善された性質を示すセルラーゼ変異性を得るため特異的セルラーゼを 発現する DNA配列において１種又はそれ以上の特異的突然変異により得ることが できる。 従って、本発明はセルロース結合ドメイン (CBD)、触媒的に活性なドメイン ( CAD)およびセルロース結合ドメインと触媒的に活性なドメインを連結する領域（ 連結領域）を含んでなる親セルラーゼのセルラーゼ変異体に関し、ここにおいて 、セルラーゼ変異体の性質を改善するため、CBD，CAD又は連結領域の１個又は複 数のアミノ酸残基が欠失されているか、又は１個又は複数のアミノ酸残基により 置換されているか、および／または１個又は複数のアミノ酸が連結領域に加えら れているか、および／またはもう一つのCBD が触媒的に活性なドメインの対向末 端で加えられている。 本発明のセルラーゼ変異体は、洗剤組成物例えば粉末組成物、液体組成物およ び強力液体組成物中に通常存在する他の成分との増加せしめられた適合性並びに 増加せしめられたアルカリ活性を示す。 更に、本発明のセルラーゼ変異体は、洗剤組成物中で用いられると、粒質土壌 除去、色彩明澄化、脱毛羽立ち、脱ピリングおよび手粗さ軽減に関し改善された 性質を示しそして本発明のセルラーゼ変異体は、アニオン界面活性剤に対する感 受性の減少並びに酸化又はペルオキシダーゼ漂白系の存在に対する感受性の減少 を示す。 以下の内容が考えられる；すなわち、本発明のセルラーゼ変異体の改善された 性質は、繊維処理のためおよびデニム、特にジーパンの如き布帛の「ストーン− ウオッシュト（stone-washed）」外観を与えるため、例えば製紙用パルプ加工中 、および動物飼料中に用いられるとき、セルラーゼ変異体を公知のセルラーゼよ りも更により有用にする。 本発明のセルラーゼ変異体の改善された性質は、本発明の種々の面および態様 に対し更に以下に説明されるように、連結領域において又はCBD において又はCA D においてまたはこれらの領域およひドメインの如何なる組合せにおいて親セル ラーゼを改質することによって得ることができる。 本発明の一つの面において、セルラーゼ変異体が与えられここにおいて、１個 又は複数のアミノ酸残基が連結領域から欠失されているか、又は１個又は複数の アミノ酸が連結領域に加えられているか、又はここにおいてタンパク質分解に対 するセルラーゼ変異体の感受性が、プロテアーゼによる加水分解に対し感受性が ある該連結領域の１個又は複数のアミノ酸残基を欠失することにより、挿入する ことにより、又はプロテアーゼによる加水分解に対し感受性がある該連結領域の １個又は複数のアミノ酸残基を、プロテアーゼによる加水分解に抵抗する１個又 は複数のアミノ酸残基により置換することによって減少せしめられている。 本発明の他の面において、セルラーゼ変異体が得られ、ここにおいてセルラー ゼ変異体の結合特性が次の（ａ）〜（ｄ）： （ａ）セルロース結合に関与する１個又は複数のアミノ酸残基を置換して改質 された結合親和力を得ること、 （ｂ）CBD の静電荷を、CBD の１個又は複数の負に荷電したアミノ酸残基を欠 失することにより、挿入することにより、又はCBD の １個又は複数の負に荷電したアミノ酸残基を中性又は正に荷電したアミノ酸残基 により置換させること、又は１個又は複数の正に荷電したアミノ酸残基を正に荷 電したアミノ酸残基により置換すること、又は１個又は複数の正に荷電したアミ ノ酸残基を中性又は負に荷電したアミノ酸残基により置換すること、又は１個又 は複数の中性アミノ酸残基を負に荷電したアミノ酸残基により置換することに変 化させること、 （ｃ）触媒活性ドメインの対向末端でもう一つのCBD を加えること、 （ｄ）１個又は複数のアミノ酸残基をプロリンにより置換すること、 により改質される。 このような改質の目的は、基質に対する酵素の結合親和力を改質することによ りセルラーゼ処理布帛の引張り強さに対する好ましい割合の酵素性能をセルラー ゼに付与することである。 本発明の更に他の面において触媒活性ドメイン (CAD)を含んでなる親セルラー ゼのセルラーゼ変異体が提供され、これは触媒的に活性な部位を含有する伸びた クレフト (cleft)、セルラーゼ分子の表面から該クレフトに至る少なくとも１個 のチヤンネルおよび活性部位の少なくとも１個のアミノ酸残基の近くで正に荷電 した表面領域および所望によりトンネルを形成するため触媒的に活性な部位上で 閉じることのできる柔軟な表面ループ領域を含んでなり、ここにおいて基質は開 裂され、ここにおいて、好ましくはアルカリ条件下、セルラーゼ変異体の酵素活 性を改質するため該クレフト、チヤンネル又は表面領域の１個又は複数のアミノ 酸残基は１個又は複数の他のアミノ酸残基により置換されている。 本発明の更に別の面において触媒活性ドメイン (CAD)を含んでな る親セルラーゼのセルラーゼ変異体が提供され、これは触媒的に活性な部位を含 有する伸びたクレフト、セルラーゼ分子の表面から該クレフトに至る少なくとも １個のチヤンネルおよび活性部位の少なくとも１個のアミノ酸残基の近くで正に 荷電した表面領域を含んでなり、ここにおいて、アニオン界面活性剤（特に線状 アルキルスルホネート）に対するセルラーゼ変異体の感受性を減少させるため、 CAD の表面上の１個又は複数の中性アミノ酸残基が、１個又は複数の負に荷電し たアミノ酸残基により置換され、又はCAD の表面上の１個又は複数の正に荷電し たアミノ酸残基が、１個又は複数の中性又は負に荷電したアミノ酸残基により置 換され、又はここにおいて１個又は複数の疎水性アミノ酸残基が１個又は複数の 非−疎水性アミノ酸残基により置換され、又はここにおいて１個又は複数のアミ ノ酸残基がプロリンで置換されている。 本発明の更に他の面において、CBD 、CAD および連結領域を含んでなる親セル ラーゼのセルラーゼ変異体が提供され、ここにおいて、酸化又は漂白剤の存在に 対するセルラーゼ変異体の感受性を減少させるため、CAD 、CBD 又は連結領域の 表面上の１個又は複数のアミノ酸残基が、酸化又はペルオキシダーゼ漂白系の存 在に対し感受性のより少ない１個又は複数のアミノ酸残基により置換されている 。 本発明は又、本発明のセルラーゼ変異体を含んでなる洗剤組成物に関する。 図 面 本発明を更に図面により説明する。 図１は、フミコラ インソレンス（Humicola insolens）、フサリアム オキ シスポラム（Fusarium oxysporum）およびシュードモナス フルオレセンス（Ps eudomonas fluorescens）由来のそれぞれ３ 種の43kDセルラーゼ配列整列を示す。 図２はpCaHj170の構築を示す。 図３は 43K遺伝子の部位特異的変異誘発を示す。 図４はpCaHj171の構築を示す。 図５はpCaHj201の構築を示す。 図６はpCaHj416およびpCaHj417の構築を示す。 図７は鋳型としてpCaHj201を用いた変異体の構築を示す。 図８はダイド アビセル（Dyed Avicel）分析における標準曲線およびサンプ ル応答を示す。 図９は液体洗剤中の43kD変異体（V221S＋N222S ＋Q223T）の貯蔵安定度を示す 。 図10はpH7.5 でのLAS（線状アルキルスルホネート）阻害を示す。 発明の詳細な開示 本明細書および請求の範囲において、次の略字が用いられる。 アミノ酸 Ａ＝Ala ＝アラニン Ｖ＝Val ＝ハツン Ｌ＝Leu ＝ロイシン Ｉ＝Ile ＝イソロイシン Ｐ＝Pro ＝プロリン Ｆ＝Phe ＝フェニルアラニン Ｗ＝Trp ＝トリプトファン Ｍ＝Met ＝メチオニン Ｇ＝Gly ＝グリシン Ｓ＝Ser ＝セリン Ｔ＝Thr ＝スレオニン Ｃ＝Cys ＝システイン Ｙ＝Tyr ＝チロシン Ｎ＝Asn ＝アスパラギン Ｑ＝Gln ＝グルタミン Ｄ＝Asp ＝アスパラギン酸 Ｅ＝Glu ＝グルタミン酸 Ｋ＝Lys ＝リシン Ｒ＝Arg ＝アルギニン Ｈ＝His ＝ヒスチジン 本発明に係るセルラーゼ変異体の記載にあたって、次の命名を用いて参照を容 易にする： 原アミノ酸（複数）：位置（複数）：置換アミノ酸（複数） この命名に従い、例えば 221位のセリンをバリンで置換するとV221S として示 され、同じ位置におけるバリンの欠失はV221^* として示され、そしてスレオニン の如き追加のアミノ酸残基の挿入はV221STの如く示される。 多数の変異は、プラスによって分離され、すなわち： V221S ＋N222S ＋Q223T これらは221 ，222 および 223位でセリンおよびスレオニンをそれぞれバリン 、アスパラギンおよびグルタミンで置換していることを示す。 本発明において、語句「セルロース結合ドメイン」（以下CBD と略す）は、セ ルロース基質に対するセルラーゼ変異体の結合を行なわしめることのできるアミ ノ酸配列（例えば、クラリス，Ｐ.,クローレ，Ｇ．Ｍ．ニルゲス、Ｍ．ジョーン ズ，Ｔ．Ａ.,パターソン，Ｇ.,クルス，Ｊ．およびグロネンボルン，Ａ．Ｍ．に 記載の如く；Determination of the three-dimensional structure of the C te rminal domain of cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei．A study us ing nuclear magnetic resonance and hybrid distance geometrydynamical sim ulated annealing..Biochemistry 28：7241-7257，1989）を示すことを意味して いる。 語句「触媒的に活性なドメイン」（以下において、CAD と略す）は、酵素の触 媒部位を含有する酵素のコア領域を示すことを意味する（例えば、ギデオン等， Nature (1993)365，p.363-364 参照）。 語句、「連結領域」は、CBD を結びつけそしてそれを酵素のCADに結合させる 領域を示すことを意図する。これまで確認された連結領域は優先的に親水性であ りそして変化していないことを特徴としそして配列に柔軟性を付与する短い繰り 返し単位を形成するため幾つかのアミノ酸に富んでいることを特徴とする。連結 領域の柔軟構造は、CBD によってセルロース基質に結合する酵素の触媒活性ドメ インの作用を促進するものと考えられる。連結領域の例は、Ｎ．Ｒ．ギルケス等 、Microbiol.Rev.55，1991，pp303-315 に示されている。 語句「結合特性」は、CBD がセルロース基質に結合する親和力、並びにCBD が 異なる条件下で結合する方法を示すものと意図される。例えば、CBD は異なるpH 値で異って結合し得る。異なる条件下でのこの挙動は、例えば前記の如く静電荷 を変化させることにより改質されうる。 語句「もう一つのCBD」は、他のセルラーゼ由来のCBD を含めしめることを意 図し；追加のCBD は、「生来の（native）」CBD がＣ末端に位置しているとき、 触媒的に活性なドメインのＮ末端に位置することができ、そして逆も又同じであ る。プロリンによる特異的置換は、酵素の熱的およびプロテアーゼ安定性に影響 すると考えられている。 親セルラーゼは好ましくは微生物セルラーゼである。そのようなものとして、 セルラーゼは細菌セルラーゼ、例えばシュードモナスセルラーゼ又はバシラス、 例えば米国特許4,822,516 米国特許5,045,464 又はヨーロッパ特許468 464 に記 載のバシラス株、又はＢ．ラウタス（lautus）（注 WO 91／10732）セルラーゼ から選択することができる。より好ましくは、親セルラーゼは菌類セルラーゼ、 特にフミコラ、トリコデルマ、イルペックス、アスペルギルス、ペニシリウム、 マイセリロフトラ又はフサアムセルラーゼであってよい。適当な親セルラーゼの 例は、例えば WO 91／17244 に記載されている。適当なトリコデルマセルラーゼ の例は、Ｔ．Ｔ．テリー，Gene51,1987，pp43-52 に記載されたセルラーゼであ る。好ましくは、親セルラーゼは科45に分類される酵素、ヘンリサット，Ｂ等，Biochem.j.， 293，p.781-788に記載される如く、例えば酵素EG B（シュードモナ スフルオレセンス）およびEGV（フミコラ・インソレンス）から選ばれる。 特に好ましいセルラーゼは、フミコラインソレンス株から由来するセルラーゼ であり、例えばＨ．インソレンスエンドグルカナーゼ、特に WO 91／17243 に記 載の如くＨ．インソレンス43kDエンドグルカナーゼ又はその相同体である。 本発明において、語句「相同体」は、セルラーゼのアミノ酸配列が43kDエンド グルカナーゼに少なくとも45％の同一性である該セルラーゼ、又は両者がＨ．イ ンソレンス（insolense）由来の43kDエンドグルカナーゼと同じ全体的三次元（ ３Ｄ）折りたたみを有しそして触媒内に含まれそして活性部位クレフト内に配置 された２個の酸残基および所望により触媒内に含まれそして活性部位クレフトに 面する柔軟性ループ内に配置されたセルラーゼを示すことを意図する。 配列の比較は、公知のアルゴリズム、例えばリパーアンおよびピアソン，Scil nce 227， 1985，p.1435 に記載のものによって行うことができる。 タンパク質の骨格は、構造分析および相同タンパク質の整列によって柔軟性お よび構造的に保護された領域に分割することができる。柔軟性領域（FR）は折り たたみタンパク質部分でありそしてそこは骨格のコンホメーシヨンは、進展中に 変化しそうである。保護領域（SCR）は折りたたみタンパク質の一部であり、そ こは骨格のコンホメーシヨンは非常に未変化のままであろう。すなわち同じ折り たたみを有する他のタンパク質において保護されることが期待される。加えてSC R は特異的に公知の触媒の、又は重要な他の残基である。 タンパク質Ａは、もしも次の条件の一つが満たされる場合、タンパク質Ｂと同 じ全体的折りたたみを有するものと定義される： １．Ａの３Ｄ構造が、４Å以下、好ましくは３Å以下、より好ましくは２Å以下 のルート平均２乗差を有するＢに定義されたSCR_s と重なる。ルート平均２乗は 、Ｂに対して定義されたSCR_S中の全数の残基によって割られたSCR_Sにより同等化 した残基間のオイグルジアン（Euclidididn）距離として算出される。 ２．アミノ酸配列はＢの折りたたみを定義するSCR_Sと両方する。両立性を測定す るため、Wodak，S.J．等：Curr.Opin.Struct.Biol.1993，3，p.247-249に記載さ れた反対の折りたたみの問題およびそこに記載されている文献が用いられている 。 相同体の例は、Ｈ．Ｊ．ギルベルト等、同上により記載されたシュードモナス フルオレセンスセルラーゼ、およびWO／91 17243に記載されたフサリアムオキシ スポラムセルラーゼであり、３種のセルラーゼの配列整列を示す添付された図１ を参照のこと。 本発明において、語句「伸びたクレフト」は、活性部位に接近し やすいβ−１，４−グルカンポリマー基質の少なくとも３個のグルコース単位を 許容する寸法を有するクレフトを言及する。本発明で用いられる語句の改善され た理解のため、１つの特異的親セルラーゼを参照のこと、この触媒活性ドメイン は上記の全体的トポロージーを有し、すなわち、以下において WO 91／17243 中 に記載されているセルラーゼはEG V（エンドグルカナーゼＶ）と呼ばれる。本発 明はいかなる場合もこの特定のセルラーゼの変異体に制限されないことは理解さ れるべきである。 これらの結晶構造は、Ｘ−線結晶学によりEG Vに対して解決されている。三種 の構造は天然酵素（ギデオン等；Nature(1993) 365，p362-364）を記載し、この 天然酵素はセロビロース（ゼギデン等、同上）と複合体化しそして活性部位変異 体DIONは２個のセロトリオース単位（ギデン等、私信）から成る生成物と複合体 化する。 酵素の全体的コンホメーシヨンは柔軟性表面ループを除いて全ての３種の構造 において同じであり、そしてそのループは天然構造において見につかず、セルロ ビオースを有する構造中に開口位置においておよびセロトリオース生成物を有す る構造中に閉じた位置において固定されている。 EG Vにおいてクレフトは、約30Åの長と、約９Åの幅および約７Åの深さを有 する。クレフトの寸法はβ−１，４−グルカンの７個のグルコース単位の結合を 許容するのに十分である。これらの部位は、ラベルされたＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ， Ｆ，Ｇであり、裂け目が部位ＤおよびＥ間において生じる。以下の表１において 、異なる部位Ａ−Ｇでグルコース単位と相互作用するEG V中の原子が定義される 。EVの裂け目パターンの分析は、部位Ｃ−Ｆに対する結合が触媒にとって必要で あること並びに他の部位への結合が触媒を高めることを示した。セロトリオース 生成物に関する構造において、生成物の 一つは部位Ａ−Ｃに結合しそして他の生成物は部位Ｅ−Ｇに結合しており、部位 Ｇは弱く結合した部位でありそして十分には定義されていない。部位Ｄでのグル コース単位をわずかに立体の重なりを有するように設計することは可能である。 酵素が触媒中位置Ｄでグルコース単位の普通のコンホメーシヨンをゆがめること が企図される。 基質が結合していないとき、活性部位クレフトはその中のグルカンポリマーの ドツキング（docking）を許容する表面で開口する。柔軟性表面ループ領域をド ツキング中、残基111-119 は、コンホメーシヨンを変化させ、Leu115は暴露され た溶剤から埋められた位置まで約１３Å動き、その結果部位ＤとＥ間の裂け目で トンネル内のグルカンポリマーを閉じる。 活性部位は２個のアスパラギン酸、Asp10 およびAsP121を含んでなる。 機械的研究および結晶構造は、EG Vが触媒中一般塩基として機能するAsp10 を 有する転化酵素である理論を支持する。加えて、Asp114およびHis119は触媒に対 し重要であることが見出された。AsP114は部位Ｄでグルコース単位の結合をもた らしそしてIle131共にそれはグルコースポリマーを閉じそしてクレフトをトンネ ルに向ける。トンネルの目的はAsp121の周囲から水を追い出しそしてこれにより Asp121のプロトン化された酵素を安定化させる。次の内容が見出された；すなわ ち、His119はThr6を通ってAsP121の他の酸素までの水素結合網目中に含まれる。 この水素結合網目は又、AsP121のプロトン化形の安定化を助け得る。His119が正 に荷電すると、他の近くの正に荷電した表面残基と共に、それは活性部位が負に 荷電しているのでAsp121を超える強い静電場を誘発する。グルカンポリマーを用 いると、この場は分極をひきおこしそしてこれによりグルコース単 位間の裂け目（cleavage）を促進する。 同様の静電場はリゾチーム中の対応する活性酸上に見出される。 表面からクレフトに至る「チヤンネル」（この特定の場合、２個のそのような チヤンネルがある）は、グルカンポリマーの加水分解に対しAsp10 に対し水を供 給すると信じられている。加えて、チヤンネルは基質のドツキング中該クレフト から水を追い出す手段として用いられ得る。 表１において、原子の命名のための標準PD13表示法（バースタイン等、（1977 ）：Insightll， Biosym Technulogies Inc.）が用いられる。水素が強く結合せ しめられている水素に注目のこと、何故なら水素は構造中に存在しないからであ る。分析は、部位Ａ−Ｃおよび部位Ｅ−Ｇでセロトリオース結合を有する構造に 基づいている。結合に関与する構造中に存在する水分子は、明白に（HOH として ）参照される。距離は、オングストローム単位である。 表１の参照記号において、「PI−相互作用」は二つの芳香族環の間の相互作用 を示し；「水を通して」は構造中に水が存在しない場合を示すが、しかし基質と の相互作用は水分子を通して生起し得る；「可能な」は原子が他の結合形式で基 質と相互作用をし得ること を示し；「立体の」はそれよりも他の明白な相互作用がないことを示し；「触媒 の」は触媒的残基を示す。 本発明によれば、セルラーゼ変異体は、好ましくは連結領域の１個又は複数の アミノ酸が、細胞中変異体の発現の際Ｏ−グリコシル化に対する部位を与える１ 個又は複数のアミノ酸残基により置換されたものである；何故なら、Ｏ−グリコ シル化アミノ酸残基でタンパク質分解開裂は、存在する炭水化物基のために立体 的に障害される。特に、バリン、リシン、アスパラギン又はグルタミンは、セリ ン又はスレオニンによって置換され得る。択一的に連結領域の１個又は複数のア ミノ酸残基は、（洗剤の存在中に含められる）プロテアーゼによる加水分解に抵 抗するプロリンによって置換され得る。 この態様において、１個又は複数のアミノ酸残基は次の如く V221S，T，P N222S，T，P Q223S，T，P V240S，T，P Q241S，T，P 置換される。 また、１種又はそれ以上の置換基を次の如く V221S ＋N222S ＋Q223T V240S ＋Q241T 置換することが好都合である。 更に、所望の効果を達成するため、連結領域の１個又は複数のアミノ酸残基、 特にVal ，Gln ，Lys 又はAsn 又は特にこれらのアミノ酸の１種又はそれ以上を 含有する配列が欠失されていてよい。 そのような修飾の目的は、基質に対する酵素の結合親和力を改質することによ り、セルラーゼ処理布帛の引張り強度に対する酵素性 能の好ましい割合をセルラーゼに与えることである。セルラーゼ変異体のセルロ ース基質、例えば布帛に対する減少せしめられた結合を得るため、連結領域はそ のアミノ酸残基の半分まで欠失されてよい。セルロース基質、例えば布帛、に対 するセルラーゼ変異体の増加せしめられた結合を得るため、１種又はそれ以上の アミノ酸残基が連結領域に加えられてもよい。これらの追加のアミノ酸（１種又 は複数）の少なくとも１種は、好都合にはプロリンであってよい。 次のように理解すべきである；すなわち、本発明のセルラーゼドメインは、前 記の如き連結領域を前記の如きセルロース結合ドメインおよび／又は、連結領域 を与える親セルラーゼとは異なる親セルラーゼ由来の触媒活性ドメインと結合さ せることによって得ることもできる。 本発明によれば、好ましいセルラーゼは、セルラーゼ結合特性が次の（ａ）〜 （ｄ）： （ａ）セルロース結合に関与する１個又は複数のアミノ酸残基を置換して改質 された結合親和力を得ること、 （ｂ）CBD の静電荷を、CBD の１個又は複数の負に荷電したアミノ酸残基を欠 失することにより、挿入することにより、又はCBD の１個又は複数の負に荷電し たアミノ酸残基を中性又は正に荷電したアミノ酸残基により置換することにより 、又は中性又は正に荷電したアミノ酸残基を正に荷電したアミノ酸残基により置 換することにより、又は１個又は複数の正に荷電したアミノ酸残基を、中性又は 負に荷電したアミノ酸残基により置換することにより、又は１個又は複数の中性 アミノ酸残基を負に荷電したアミノ酸残基により置換することによって変化させ ること； （ｃ）触媒的に活性なドメインの対向末端でもう一つのCBD を加えること、又 は （ｄ）１個又は複数のアミノ酸をプロリンによって置換すること によって改質されたセルラーゼである。 本発明の好ましい態様において、CBD の１個又は複数のアミノ酸残基は次の如 く置換される； E251S，Q，N，P R252L，Q，H V268E A269E，R T265R，E W253Y，F A254S，D，G Q255E，R，K W261R，Y，F S262A，N，D T274R K275R，Q I276D，Q，N N277Q，D D278P W279Y，F Y280W，F H281S Q282N，R Y280F ＋Q282N。 触媒的に活性なドメインの対向末端でCBD が加えられたセルラーゼ変異体を含 んでなる態様において、追加のCBD は次の文献中に記載されるセルラーゼの１種 から例えば由来できる；WO 91／10732 又は WO 91／17244 、又はペンチラ、Ｍ．Ｅ.,レトバラ，Ｐ.,ネバライネン，Ｈ .,ビクハビハリ，Ｒ．およびクノーレス，Ｊ．Homologybetween cellulase gene s of Trichoderma reesei：completenucleotide sequence of the endoglucanas e I gene..Gene45：253-263，1986；又はサロヘモ，Ｍ.,レトバラ，Ｐ.,ベント ラ，Ｍ．Ｅ.,テリー，Ｔ．Ｔ.,スクルベルク，Ｊ.,ヤンソン，Ｇ.,ペターソン， Ｇ.,クラセンス，Ｍ．およびトミー，Ｐ．EG III，a new endoglucanase from T richoderma reesei.the characterization of bothgene and enzyme,,Gene 63： 11-23，1988；又はテリー，Ｔ．Ｔ.,レトバラ，Ｐ.,クピネン，Ｓ.,サロブリ， Ｉ．およびクルス，Ｊ.Homologous domains in Trichoderma reesei cellulolyt ic enzymes：gene sequence and expression of Cellobiohydrolase II..Gene51 ：43-52，1987；又はシム，Ｐ.,ジェームス，Ｃ．およびブロダ，Ｐ.The identi fication，molecular cloning and characterization of a gene from Phaneroc haete chrysosporium that showsstrong homology to the exocellobiohydrolas e i gene from Trichoderma reesei..Gene 74：411-422，1988：又はDeオリベラ アルベド，Ｍ.andラドフォード，Ａ.Sequence of CBH I of Humicolagrisea v ar.thermoider..Nucleic Acid Research 18：668,1990；orラグズ，Ｓ.,ヤグエ ，Ｅ.,ウッド，Ｄ．Ａ．およびターソン，Ｃ．Ｆ．Isolation and Characteriza tion of a Cellulose-Growth-Specific Gene from Agaricus-Bisporus.Gene.119 ：183-190，1992：又はコッホ，Ａ．およびシュルツ，Ｇ.Cloning，sequencing ，and heterologous expression of a cellulase-encoding cdna（CBH1）from p enicilliumjanthinellum.Gene.124：57-65 1993。 本発明によれば、次のものが好ましいセルラーゼ変異体であり、ここにおいて 、セルラーゼ変異体の酵素活性を改質するため、触媒 的に活性な部位を含有する伸びたクレフト（creft）、セルラーゼ分子の表面か ら該クレフトに至りそして活性部位でセルロースの加水分解のため該クレフトに 水を供給する少なくとも１個のチヤンネルおよび活性部位の少なくとも１個のア ミノ酸残基の近くで正に荷電した表面領域を含んでなる触媒活性ドメイン（CAD ）の１個又は複数のアミノ酸残基が欠失され、又は１個又は複数の他のアミノ酸 により置換されている。 他の好ましい態様において、アルカリ条件下でセルラーゼ変異体の酵素活性を 改善するため、活性部位の近くの静電荷は、該クレフトの１個又は複数の正に荷 電したアミノ酸残基を、１個又は複数の中性又は負に荷電したアミノ酸残基によ り置換することにより、又は１個又は複数の中性アミノ酸残基を１個又は複数の 負に荷電したアミノ酸残基により置換することにより、又は１個又は複数の負に 荷電したアミノ酸残基をより負に荷電した（１又は複数の）アミノ酸残基により 変化され得る。 更に他の好ましい態様において、次のセルラーゼ変異体が好ましく、ここにお いて触媒的に活性なドメインは、柔軟性表面ループ領域を更に与えられる。アル カリ条件下、セルラーゼ変異体の酵素活性を改善するため、該ループ領域の１個 又は複数のアミノ酸残基又は活性部位のアミノ酸残基に対する水素結合網目内に 含まれる１個又は複数のアミノ酸が、該水素結合網目を改質するように１個又は 複数のアミノ酸残基により置換される。 アルカリ条件下セルラーゼ変異体の酵素活性は又、ループの柔軟性に対し変化 するように柔軟性ループ領域の１個又は複数のアミノ酸残基を１個又は複数のア ミノ酸残基により置換することにより、すなわち活性部位のアミノ酸残基に対す る水素結合網目に関与すべきループの能力を保護することによっても改善できる 。 また、アルカリ条件下、セルラーゼ変異体の酵素活性を改善するため、活性部 位クレフトの表面の１個又は複数のアミノ酸残基は、基質と相互作用するための 表面の能力を改質するように、１個又は複数のアミノ酸に残基によって置換され る。 更に、アルカリ条件下でのセルラーゼ変異体の酵素活性は，活性部位クレフト に至るチヤンネルの表面の１個又はそれ以上のアミノ酸残基を、チヤンネル内を 通る水の流れを改質するように１個又は複数のアミノ酸残基により置換すること によって改善され得る。 更に好ましい態様において、次のセルラーゼが好ましい、ここにおいて、アル カリ条件下セルラーゼ変異体の酵素活性を改善するため、正に荷電した領域の１ 個又は複数の中性又は負に荷電したアミノ酸残基が、領域の正の正味の荷電を増 加させるため１個又は複数の正に荷電したアミノ酸残基によって置換される。 以下に示す領域Ｉ−Ｘは、43kDエンドグルカナーゼ配列中の次の位置に対応す る。 領 域 残 基 I 2−21 II 44−48 III 55−60 IV 65−67 V 72−75 VI 95−103 VII 109−123 VIII 128−136 IX 142−148 X 175−185 変異体H.インソレンス43kDエンドグルカナーゼ又は相同性セルラ ーゼの一つの態様において、該クレフト、チヤンネル（１個又は複数）および／ 又はループの表面コンホメーシヨン、上記の領域Ｉ−VII 又はIX−X の１種又は 複数における、又は位置28，37，又は90の１種又は複数における１種又は複数の アミノ酸残基を置換することによって改質され得る。 より特異的には、該クレフトの表面コンホメーシヨンは、43kDエンドグルカナ ーゼの位置4，5，6，7，8，10，25 11，12，13，15，18，20，21，44，45，48， 74，110，114，117，119，121，128，131，132，147，176，178or179の１種又は 複数において、１種又は複数のアミノ酸残基を置換することによって変化され得 る。相同性セルラーゼの対応する位置におけるアミノ酸残基も同様に置換され得 ることが期待される。 他の態様において、表面コンホメーシヨンおよび／又はループ領域の水素結合 特性は前記の領域VII 中の１個又は複数のアミノ酸残基を置換することによって 変化し得る。より詳しくは、該ループ領域の表面コンホメーシヨンは、位置111 ，112，113，114，115，116，117，118又は119 中の１個又は複数のアミノ酸残 基を置換することによって変化し得る。相同性セルラーゼの対応する位置内の複 数のアミノ酸残基は同様に置換されることが期待される。 別の面において、該チヤンネル（１個又は複数）の表面コンホメーシヨンは、 領域Ｉ，III，Ｖ又は VII−IXの１個又は複数において１個又は複数のアミノ酸 残基を置換することによって変化し得る。より詳しくは、該チヤンネルの（１個 又は複数）表面コンホメーシヨンは、位置9，14，28，37，55，58，59，60，63 ，72，78，109，118，123，129，131，132，133，136，142，145，146，158，16 3，176，179，186 又は196 の１個又は複数において１個又は複数のアミノ酸残 基を置換することによって変化し得る。相同性セルラーゼ の対応する位置におけるアミノ酸残基も同様に置換されることが期待される。 更に別の態様において、正荷電表面領域の正の静電荷は、領域IV，Ｖ又はＸの １個又は複数において、又は位置２において１個又は複数のアミノ酸残基を置換 することによって変化されうる。より特異的には、正の静電荷は、位置2，13，2 0，44，65，66，67，90，20 95，96，97，98，100，102，103，175，176，178， 179，180，183 又は185 において１個又は複数のアミノ酸残基を置換することに よって変化され得る。相同性セルラーゼの対応する位置においてアミノ酸残基は 同様に置換され得ることが期待される。 更に他の態様において、該クレフトの負静電荷は、位置55，74，90又は123 の １個は複数において１個又は複数のアミノ酸残基を置換することによって変化し 得る。相同性セルラーゼの対応する位置におけるアミノ酸残基が同様に置換され 得る。相同性セルラーゼの対応する位置においてアミノ酸残基は同様に置換され 得ることが期待される。 より特異的には、１個又は複数のアミノ酸残基は次の如く置換される： D2N S5A T6S Y8F W9S，G D10E K13R S15N，A，D W18H K20R V28T R37N，S，A K44R S45N，D E48D，Q，A S55E，D D58N，S，A Q59S，A，G N65R D66R，N D67R，N A74S，D，N Y90F S96R A100R K102R K103R S110N，A，D T111G，A，S G112A G113A L115I，V，F，H，T，N，Q，G G116A S117G，A，D，E，N，Q N118G，A，S，D，R H119Q，K N123D，E，Y K175R N179D，H，A S185R，K C11A＋C135A C12A＋C47A R37N＋D58A 本発明は又、セルラーゼ変異体に関し、ここにおいてアニオン界面活性剤に対 応するセルラーゼ変異性の感受性を減少させるため、CAD の表面上の１個又は複 数の中性アミノ酸残基が、１個又は複数の負に荷電したアミノ酸残基により置換 されるか、又はCAD の表面上の１個又は複数の正に荷電したアミノ酸残基が１個 又は複数の中性の又は負に荷電したアミノ酸残基により置換されるか、又はここ において１個又は複数の疎水性アミノ酸残基が１個又は複数の非−疎水性アミノ 酸残基より置換されるか、又はここにおいて１個又は複数のアミノ酸残基がプロ リンにより置換され、CAD が触媒的に活性な部位を含有する伸びたクレフト、セ ルラーゼ分子の表面から該クレフトに至りそして活性部位でセルロースの加水分 解のため該クレフトに水を供給する少なくとも１つのチヤンネル、および活性部 位の少なくとも１個のアミノ酸残基の近くの正荷電表面領域を含んでなる。 アニオン界面活性剤（特に線状アルキルスルホネート）は、セルラーゼ活性を 阻害し得ることが見出された。今日次のように考えられている；すなわち、その ような阻害は、セルラーゼ分子表面上で正に荷電したアミノ酸残基に結合する界 面活性剤の負に荷電した頭部並びにセルラーゼ分子の表面上で疎水性アミノ酸残 基に結合する界面活性剤の疎水性尾部により引き起こされる。この結合パターン はタンパク質の局所的未折りたたみの原因となり従って活性を損失すると考えら れる。前記の如く、アニオン界面活性剤によるセルラーゼの阻害は、タンパク表 面上の中性又は正に荷電した残基を、負に電荷したアミノ酸残基により置換する ことにより、又はタンパク質表面の疎水性アミノ酸残基を親水性残基で置換する ことにより矯正できる。しかし、活性部位の少なくとも１個のアミノ酸残基の近 くの表面領域内で正に荷電したアミノ酸残基を置換することは今日余り適当でな いと考えられている。何故ならこのことはCAD の静電位に対し不都合な作用をも たらし得るからである。更に、プロリンによる置換は骨格の剛性を増加させるこ とによって酵素を安定化させる。 変異体Ｈ．インソレンス43kDエンドグルカナーゼ又は相同性セルラーゼの一態 様において、該親タンパク質の表面コンホメーシヨンは、前記の領域VIII−Ｘの １個又は複数領域において又は相同性セルラーゼはそれに対応する領域において 、又は位置37，62，63，78，118，158，163，179，186 又は196 において、１個 又は複数のアミノ酸基により置換することによって改質される得る。 この態様において、１個又はそれ以上のアミノ酸残基は位置37， 62，63，78，118，129，131，133，136，142，146，158，163，175，176，179 ，186又は196の１個又は複数において置換され得る。 更に特異的には、１個又は複数のアミノ酸残基は次の如く置換され得る。 R37N，S，A W62E，F A63D，T，R A78D N118D V129D，T，S I131L，V，T，N，Q，H，G D133Q T136D L142D，T，S R146E，Q，S R158D L163N N176D N179D N186D R196D。 択一的に、１個又は複数のアミノ酸は次の如く置換され得る。 A78P A162P K175G，S 本発明は又、セルラーゼ変異体に関し、ここにおいて酸化又は漂白剤の存在に 対するセルラーゼ変異体の感受性を減少させるため、CAD ，CBD 又は連結領域の 表面上の１個又は複数のアミノ酸残基を、酸化又はペルオキシダーゼ漂白系の存 在に対し感受性がより少ない１個又は複数のアミノ酸によって置換され；CAD は 触媒的に活性な部位を含有する伸びたクレフト、セルロース分子の表面から該ク レフトに至りそして活性部位でセルロースの加水分解に対し該クレフトに水を供 給する少なくとも１つのチヤンネル、該活性部位の少なくとも１個のアミノ酸残 基の近くで正に荷電した表面領域を含んでなる。 本発明によれば、以下の内容が見出された；すなわち一定のアミノ酸、例えば メチオニンは例えばハイポクロライトによる酸化に感受性であり、一方他のもの 、例えばトリプトファン又はチロシンは漂白剤、例えばペルオキシダーゼ系の存 在に感受性であり、酵素の不活性化をもたらす。本発明において、語句「ペルオ キシダーゼ系」はペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼに対する基質および漂白 促進剤（例えば WO 89／09813 又は WO 91／05839 に記載される如く）を含んで なる漂白系を示すことを意図する。更に以下の内容が見出された；すなわちこの 問題はより少ない感受性のアミノ酸残基、例えばセリン、アスパラギン、グルタ ミン、プロリン、フェニルアラニン、グルタミン酸又はグリシンによって適当に 置換することにより軽減できる。 変異体Ｈ．インソレンス43kDエンドグルカナーゼ又は相同性セルラーゼの一つ の態様において、酵素の表面コンホメーシヨンは、前記領域IX又はＸの１個又は 複数において、又は位置62又は104 の１個又は複数において１個又は複数のアミ ノ酸残基を置換することにより改質され得る。 変異体Ｈ．インソレンス43kDエンドグルカナーゼの一つの態様において、１個 又は複数のアミノ酸残基は8，9，18，62，104，147又は175 において置換され得 る。 より特異的には、１個又は複数のアミノ酸残基は次の如く置換される。 Y8F W9F，H，S，A W18H，F，A W62F，E M104S，N，Q Y147F，H，S，Q，N，E，D。本発明のセルラーゼ変異体の製造方法 遺伝子に突然変異を導入するための幾つかの方法は、当業者に公知である。セ ルラーゼをエンコードする DNA配列をクローニングすることについて簡単に論議 した後、セルラーゼをエンコードする配列内の特異的部位で突然変異を発生させ る方法が議論されるであろう。セルラーゼをエンコードする DNA配列のクローニング 親セルラーゼをエンコードする DNA配列を、当業者に周知の種々の方法により 対象のセルラーゼを生産する微生物又は任意の細胞から単離できる。第一にゲノ ム DNAおよび／又はcDNAライブラリーは染色体 DNA又はメッセンジャーRNA を用 い研究されるべきセルラーゼを生産する生物から構築されるべきである。次いで 、もしもセルラーゼのアミノ酸配列が公知であると、相同性の、標識したオリゴ ヌクレオチドプローブは合成されそして細菌 DNAのゲノムライブラリーから、又 は菌類cDNAライブラリーからセルラーゼをエンコードするクローンを同定するた めに用いられる。択一的に、細菌又は菌類の他の株由来のセルラーゼに相同性の 配列を含む標識したオリゴヌクレオチドプローブは、より低い厳重さの洗浄条件 およびハイブリッド形成を用い、セルラーゼをエンコードするクローンを同定す るためプローブとして用いることができる。 セルラーゼ−生産クローンを同定するための他の方法は、ゲノム DNAの断片を 発現ベクター、例えばプラスミドに挿入し、得られたゲノム DNAライブラリーを 用いセルラーゼ−ネガチブ細菌を形質転換し、次いで形質転換した細菌をセルラ ーゼに対する基質を含有する寒天上でプレート培養することを含む。セルラーゼ −含有プラスミドを含むこれらの細菌は、分泌されたセルラーゼによる基質の消 化により、澄んだ寒天のハローにより囲まれたコロニーを形成するであろう。 択一的に、酵素をコードする DNA配列は確立された方法、例えばＳ．Ｌ．ベカ ージーおよびＭ．Ｈ．カルテルスにより記載されるホスホアミダイト法、Tetera heron Letters 22, 1981, pp. 1859-1869, 又はマテス等に記載された方法、Th e EMBO J. 3, 1984, pp801-805により合成的に製造できる。ホスホアミダイト法 によれば、オリゴヌクレオチドが例えば自動 DNA合成器中で合成され、精製され 、アニールされ、結合されそして適当なベクター中でクローン化される。 最後に DNA配列は合成の、ゲノム又はcDNA源（適当なものとして）の断片を結 合することにより作成された、混合されたゲノムおよび合成、混合された合成お よびcDNA又は混合されたゲノムおよびcDNA又はcDNA源から作られることができ、 断片は標準技術に従って全 DNA配列の種々の部分に相当する。 DNA配列は、又例 えば米国特許4,683,202 又はＲ．Ｋサイキ等、Science 239, 1988, pp. 487-491 に記載される如く特異的プライマーを用いポリメラーゼ鎖反応（PCR）によって も製造できる。セルラーゼをエンコードする配列の部位特異的変異誘発 一度、セルラーゼをエンコードする DNA配列を単離し、そして突然変異のため の望ましい部位が同定されたら、突然変異は合成オリゴヌクレオチドを用いて導 入され得る。これらのオリゴヌクレオチドは所望の突然変異部位の側面にあるヌ クレオチド配列を含み；変異体ヌクレオチドはオリゴヌクレオチド合成中に挿入 される。特異的方法において、セルラーゼをエンコードする配列を橋かけする D NAの一本鎖ギャップをセルラーゼ遺伝子を有するするベクター中で作る。次いで 、所望の突然変異を有する合成ヌクレオチドを、一本 鎖 DNAの相同部分にアニールする。次いで残りのギャップを DNAポリメラーゼＩ （クレノー断片）を用いて充てんしそして構築体をT4リガーゼを用いて連結する 。この方法の特異的例は、モリナガ等（1984, Biotechnology 2 :646-639）に記 載されている。米国特許4,760,025（エステル等による、7月26, 1988年発行）は カセットの小変更を行うことにより、多くの突然変異をコードするオリゴヌクレ オチドの導入を開示しているが、しかしより多種類の突然変異はモリナガ法によ り任意に１回導入できる；何故なら種々の長さの多数のオリゴヌクレオチドが導 入できるからである。 セルラーゼをコードする配列への突然変異の導入のための他の方法は、ネルソ ンおよびロング、Analytical Biochemistry, 180, 1989, 147-151 に記載されて いる。その方法は、PCR反応においてプライマーの一つとして化学的に合成され た DNA鎖を用い導入された所望の突然変異を含有する PCR断片の３工程の作成を 含む。PCRで作成した断片から、突然変異を有する DNA断片は制限エンドヌクレ アーゼを用いて切断することにより単離されそして発現プラスミドに再挿入され てよい。カレザイム（Carezyme）（Ｈ．インソレンス由来の43kDセルラーゼ）の部位特異 的変位誘発に対するシステムの構築 アスペルギルスオリゼ中、フミコラインソレンス〜43kDエンドグルカナーゼ（ カルヨゾーメ（karyosome）の発現を可能しなしめるプラスミド（pSX200）は、 先の特許 PCT／DK91／00123）に記載されていた。カルヨゾーメをコードする遺 伝子をpSX320からpUC にサブクローンした（Ｃ．セニチーベロン等（1985）。遺 伝子（33, 103-119）は図２に記載される如くである。Clal制限部位を、537位内 にサイレント部位特異的突然変異として 43K遺伝子中のpCaHj170に導入した。 部位特異的変位誘発は、ネルソンおよびロープの PCR法を用いて行った。（Ｒ ．Ｍ．ネルソン，Ｇ．Ｌ．ロング（1989）Anal.Biuchem.180, 147-151）。詳細 は図３に示される。プラスミドpCaHj171およびpCaHj201を図４および図５に示す 如くpCaHj170から構築した。 変異体の構築に対しpCaHj201の使用を可能にさせる２つのプラスミド、pCaHj4 16およびpCaHj417は、アスペルギルス発現プラスミドpHD414から作成された。こ れらのプラスミドの構築は図６に要約される。pCaHj201は図７に示す如く変異体 の構築に対して用いられた。突然変異した43K 遺伝子を有する発現プラスミドを 、親特許出願（PCT／DK／00123）に記載される如くpToC90と同時形質転換により アセタミド上で選択することによりアスペルギルスオリゼ IFO4177に形質転換し た。変異体CC234 およびCC248 の構築 V221S, cN222S, Q223Tから成る変異体をオリゴヌクレオチド4214を用いて構築 した。 突然変異を図６に記載される如く導入し、変異したHind III−Sa１ Ｉ断片をp CaHj416にサブクローンした。 A162Pから成る変異体のCC248 をオリゴヌクレオチド4271を用いて構築した。 突然変異を図６に示す如く導入し、変異したBamH I -Hind II 断片をpCaHj41 7にサブクローンした。 以下において、添付図面２〜７を更に説明する。 図２. pCaHj170の構築： pSX320をACC I で消化した。消化は、フェノール／クロロホルム抽出、エタノ ールによる沈殿および真空中での乾燥により停止した 。陥凹３′末端をクレノ−ポリメラーゼを用いて埋めそして反応を前記の如く停 止させた。 DNAを再溶解しそしてBamH I で消化した。カルヨゾーメ遺伝子を含 有する920bp 断片を、アガロースゲルから単離した。pUC19 をSaI で消化し、陥 凹３′末端をクレノーポリメラーゼを用いて埋め次いで DNAを前記の如くBamH I で消化した。形成された2675bp断片をアガロースゲルから単離した。 920bp pSX320 断片を、2675bp pUC19断片に結合させそして常法によりｒ^- ｍ⁺ に仕上げたＥ．コリーMT172,Ｅ. コリーMC1000株（カサダバンおよびコーヘン（ 1980），J.Mol.Biol.,138, 179-207）に形質転換した。 図３． 43K遺伝子の部位特異的変異誘発： プラスミドpCaHj170，pCaHj171又はpCaHj201を、対象の突然変異に依存する鋳 型として用いた。 えり抜きの鋳型を変異誘発プライマー（星印とともに矢印として示される）お よびプライマー2834, ３′末端で鋳型に対合Ｃ（２個のヌクレオチド）および５ ′末端で鋳型に誤対合する（２個のヌクレオチド）42個のヌクレオチドプライマ ーを用い増幅した。 2834: ５′ 温度サイクルプロフィルは、製造者の指示に従いパーキン−エレマーシータス（ Perkin-Elemer Cetus）（アンプリタック（amplitaq）（商標）からtaq ポリメ ラーゼを用い図面上に示す如くであった。 PCR生成物をアガロースゲルから単離し、次いで上記の如く同じ鋳型を用い PCR サイクルにおいて伸長した。温度プロフィルは、アンプリタク（amplitaq）（商 標）および標準 PCR条件を用い図面上に示す如くであった。伸長後、PCRプライ マー2833および2832を直接伸長混合物に加え、次いで図面上に示される温度サン クルプログラム を行い、そして突然変異を有する得られた PCR断片をアガロースゲルから単離し た。 PCRプライマー2833は2834の５′末端に相当する： プライマー2832は鋳型に相当する： 図４. pCaHj171の構築： 43K遺伝子のサイレント突然変異（Argコドンの第３位におけるＧからＡへの変 異）を、鋳型および突然変異プライマー2831としてpCaHj170を用い 43k遺伝子内 に導入した： 突然変異 PCR断片を NcoＩおよび XhoＩを用いて消化し次いで NcoＩおよび X hoＩで消化されたpCaHj170に結合させた。結合混合物をＥ．コリーMT172 内に形 質転換した NcoＩ− XhoＩ挿入物は、製造者の指示に従いUnited States Bioche micals市販のセキュナーゼ（Sequenase）（商標）を用い組換え体プラスミドか ら配列決定された。配列は所望の突然変異体を除きpCaHj170の配列と同一であっ た。このプラスミドはpCaHj171と呼ばれた。 図５．pCaHj201の構築： 43k遺伝子（Proコドンの第３位におけるＧからＡへの変異、内のサイレント突 然変異を、鋳型および突然変異プライマー847 としてpCaHj171を用い 43k遺伝子 内に導入した； 突然変異 PCR断片を ClaＩおよび XhoＩで消化し次いで ClaＩおよび XhoＩで 消化されたpCaHj171に結合させた。結合混合物をＥ．コリーMT172 内に形質転換 した。ClaＩ− XhoＩ挿入物は、製造者の指示に従いUnited States Biochemical s市販のセキュナーゼ（Seq uenase）（商標）を用い組換え体プラスミドから配列決定された。配列は所望の 突然変異体を除きpCaHj170の配列と同一であった。このプラスミドはpCaHj201と 呼ばれた。 図６．pCaHj416およびpCaHj417の構築： pCaHj416の構築：pCaHj201をBamHＩおよびBamH IIIで消化し、次いで612bp断 片をBamHＩおよびBamH IIIで消化されたpHD414内に結合させた。 pCaHj417の構築：pCaHj201をHind IIIおよびSalＩで消化し、次いで317bp 断 片をHind IIIおよび XhoＩで消化したpHD414内に結合させた。 図７．鋳型としてpCaHj201を用い変異体の構築： 部位特異的変異誘発を、図２に記載した如く行った。改変物がHind III部位（ 1-612 位）の上流に位置するとき、突然変異 PCR断片をBamHＩおよびHind IIIで 消化し、そして発生した 612bp断片BamHＩおよびHind IIIで消化したpCaHj4l7に 結合させ突然変異遺伝子に対する発現プラスミドが生成する。 改変物がHind III部位（612-928位）の下流に位置したとき、突然変異 PCR断 片をHind IIIおよびSalＩで消化し、そして発生した316 bp断片をhind IIおよび XhoＩで消化したpCaHj4l6に結合させ突然変異した遺伝子に対する発現プラスミ ドを生成した。プラスミドのサイズと制限部位の位置は、置換にのみ相当する。 欠失又は挿入の場合においては、サイズと部位の位置は示された図面と異なる。セルラーゼ変異体の発現 本発明によれば、上記方法により又は公知の択一的方法により生産された突然 変異したセルラーゼをコードする配列は、プロモーターをエンコードするコント ロール配列、オペレーター、リポソーム結合部位、翻訳開始シグナルおよび所望 によりレプレッサー遺伝子 又は種々の活性化因子遺伝子を典型的に含む発現ベクターを用い、酵素の形で発 現され得る。発現せしめられたタンパク質の分泌を許容せしめるため、「シグナ ル配列」をエンコードするヌクレオチドが、セルラーゼをコードする配列の前に 挿入され得る。コントロール配列の方向の下での発現に対し、本発明に従って処 理されるべき標的遺伝子は、適当な読み枠内のコントロール配列に実施可能に結 合される。プラスミドベクター内に組み入れられることができ、そして変異体セ ルラーゼ遺伝子の転写を支援し得るプロモーター配列が含まれるが、原核β−ラ クタマーゼプロモーター（ヴラ−カマロフ等、1978，Proc．Natl．Acad．Sci．U ．S．A．75：3727-3731）およびtac プロモーター（デボエル等、1983，Proc．N atl．Acad．Sci．U．S．A．80：21-25）に制限されない。更に、「UsefuI prote ins from recombinant bacteria」J in Scientific American，1980，242 ：74- 94の文献を見出すことができる。 一つの態様において、Ｂ．サブチリス（subtilis）が突然変異 DNAを有する発 現ベクターにより形質転換される。もしも発現が分泌性微生物、例えばＢ．サブ チリス（Subtilis） 内でおこるとき、シグナル配列は翻訳開始シグナルに従いそ して対象の DNA配列に先行する。シグナル配列は発現生成物を細胞壁（ここでは それは分泌により生成物から開裂される）に輸送する作用をする。先に定義した 語句「コントロール配列」は、存在する場合シグナル配列を含むことを意図する 。 本発明セルラーゼ変異体を生産する、容易に好ましい方法において、線維状菌 類が宿主生物として用いられる。線維状菌類宿主生物は、好都合には、組換えタ ンパク質を生産するための宿主としてこれまで用いられたものでよく、例えばア スペルギルス（Aspergillus）SP.,例えばＡ．ニガー（niger），Ａ．ニドランス （nudulans） 又はＡ ．オリゼ（oryzae） である。組換えタンパク質の生産におけるＡ．オリゼ（oryz ae） の使用は、例えばヨーロッパ特許238 023 に広範囲に記載されている。 アスペルギルス（Aspergillus）におけるセルラーゼ変異体の発現のため、セ ルラーゼ変異体をコードする DNA配列はプロモーターにより先行せられる。プロ モーターは、アスペルギルス（Aspergillus）において強い転写活性を示すいか なる DNA配列であってよくそして細胞外又は細胞内タンパク質、例えばアミラー ゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ又は解糖酵素をコ ードする遺伝子から由来することができる。 適当なプロモーターの例は、Ａ．オリゼ（oryzae）TAKAアミラーゼ、リゾムコ ールマイヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテアーゼ、Ａ．ニガー （niger） ノイトラルα−アミラーゼ，Ａ．ニガー（niger）酸安定α−アミラー ゼ、Ａ．ニガー（niger）グルコアミラーゼ、リゾムコールマイヘイ（Rhizomuco r miehei）リパーゼ ，Ａ．オリゼ（oryzae）アルカリプロテアーゼ又はＡ．オリ ゼ（oryzae） トリオースホスフェートイソメラーゼから由来ものである。 特に、宿主生物がＡ．オリゼ（oryzae）である場合、本発明方法で使用するた めの好ましいプロモーターはＡ．オリゼ（oryzae）TAKAアミラーゼプロモーター である；何故ならそれがＡ．オリゼ（oryzae）において強い転写活性を示すから である。TAKAアミラーゼプロモーターの配列は、ヨーロッパ特許238 023 に示さ れている。 終結およびポリアデニル化配列は、プロモーターと同じ起源から適当に由来す ることができる。 菌類宿主細胞を形質転換するために用いられる技術はヨーロッパ特許238 023 に適当に記載されている如くである。 宿主細胞からセルラーゼ変異体の分泌を確保するため、セルラー ゼ変異体をエンコードする DNA配列はシグナル配列によって先行されることがで き、このシグナル配列は天然シグナル配列又はその機能部分又は細胞からタンパ ク質の分泌を与える合成配列であってよい。特に、シグナル配列は、アスペルギ ルス（Aspergillus） SP．アミラーゼ又はグルコアミラーゼをエンコードする遺 伝子、リゾムコールマイヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ又はプロテアーゼ をエンコードする遺伝子、又はフミコラ（Humicola）セルラーゼ、キシラナーゼ 又はリパーゼをエンコードする遺伝子から由来することができる。シグナル配列 はＡ．オリゼ（oryzae）TAKAアミラーゼ、Ａ．ニガー（niger）ノイトラルα− アミラーゼ、Ａ．ニガー（niger）酸−安定α−アミラーゼ又はＡ．ニガー（nig er ）グルコアミラーゼをエンコードする遺伝子から好ましく由来する。 形質転換された宿主細胞を培養するために用いられる培地は、アスペルギルス （Aspergillus）を増殖させるのに適したいかなる通常の培地であってよい。形 質転換体は通常安定でありそして選択圧の非存在下で培養できる。しかし、もし も形質転換体が不安定であることが見出されると、細胞に導入される選択マーカ ーは選択に対し使用できる。 宿主細胞から分泌される成熟セルラーゼタンパク質は、遠心分離により培地か ら細胞を分離し又は濾過し、および硫酸アンモニウムの如き塩を用い培地のタン パク質成分を沈殿し、引き続きイオン交換クロマトグラフィー，アフィニティク ロマトグラフィー等の如きクロマトグラフィー手順を含む周知手順により培養基 から好都合に回収できる。 本発明によれば、セルラーゼ変異体は洗剤組成分の成分として典型的に添加で きる。そのようなものとして、セルラーゼ変異体は無粉塵性粒質物、液体、特に 安定化液体又は保護された酵素の形態で 洗剤組成物中に含ましめることができる。無粉塵性粒質物は、例えば米国特許4, 106,991 および4,661,452 （ノボ インダストリーＡ／Ｓ社へ付与）に記載の如 く生産できそして当業者に公知の方法により所望によりコートされ得る。液体酵 素調製品は、例えば、ポリオール、例えばポリプロピレングリコール、糖又は糖 アルコール、乳酸又はホウ酸を確立された寸法に従って添加することにより安定 化できる。他の酵素安定化剤は、当業者に周知である。保護された酵素は、ヨー ロッパ特許238 216 に開示された方法に従って製造できる。洗剤組成物は、１種 又はそれ以上の他の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、 オキシダーゼ又はアミラーゼを更に含有することができ、好都合には洗剤用添加 剤中に含まれる。 本発明の洗剤組成物は、任意の好都合の形態で例えば粉末、顆粒又は液体とし て存在してよい。液体洗剤は、水性であってよ〈、典型的には９０％までの水と ０〜２０％の有機溶剤を含有する。 洗剤組成物は、アニオン、非イオン、カチオン、両性又はこれらのタイプの混 合物であってより界面活性剤を含んでなる。洗剤は、通常０〜５０％のアニオン 、界面活性剤、例えば線状アルキルベンゼンスルホネート（LAS）、α−オレフ ィンスルホネート（AOS）、アルキルスルホネート（AOS）、アルキルスルフェー ト（AS）、アルコールエトキシスルフェート（AES）又は石けんを通常含有する であろう。洗剤組成物は又、０〜40％の非イオン界面活性剤、例えばノニルフェ ノールエトキシレート又はアルコールエトキシレートを含有できる。更に洗剤組 成物はポリヒドロキシ脂肪酸アミド界面活性剤（例えば WO 92/06154 に記載） を含有できる。 洗剤組成物は追加的に１種又はそれ以上の他の酵素、例えばアミラーゼ、リパ ーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、エステラー ゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ タイプII又はプロテアーゼを含んでいて もよい。 pH（水性洗剤液中で測定）は、通常中性又はアルカリ性、例えば７〜11である 。洗剤は、１〜40％の洗剤用ビルダー、例えばゼオライト，ホスフェート，ホス ホネート，シトレート，NTA ，EDTA又はDTPA，アルケニル無水コハク酸、又はシ リケートを含むことができ、又は洗剤はビルドされていなくてもよい（すなわち 、本質的に洗剤用ビルダーを有しない）。洗剤は又、他の通常の洗剤成分、例え ば塗布コンディショナー、フォームブースター、漂白剤、例えばパーボレート、 パーカーボネート、テトラアセチルエチレンジアミン（TAED）又はノナノイルオ キシベンゼンスルホネート（NOBS）、抗腐蝕剤、土壌懸濁剤、酵素用安定剤、フ ォームデプレッサー、染料、殺菌剤、螢光増白剤又は香料を含有することができ る。 本発明の範囲内の洗剤組成物の特定の形態は次のものを含む。 ａ）ホスフェートビルダー、アニオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、シリケ ート、使用時に所望pHに調節するためのアルカリおよび中性無機塩を含有する洗 剤粉末として配合された洗剤組成分。 ｂ）ゼオライトビルダー、アニオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、アクリル 又は同等のポリマー、シリケート、使用時に所望pHに調節するためのアルカリお よび中性無機塩を含有する洗剤粉末として配合された洗剤組成物。 ｃ）アニオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、保湿剤、有機塩、苛性アルカリ を含んでなり、使用の際７〜１１９値に調節されたpHを有する洗剤液体として配 合された洗剤組成物。 ｄ）線状、アルコキシレート化第一アルコールから本質的に成る液体非イオン界 面活性剤、ホスフェートビルダー、苛性アリカリを含んでなり、使用時に７〜11 の値に調節されたpHを有する非水性洗剤 組成物として配合された洗剤組成物。 ｅ）アニオン界面活性剤および非イオン界面活性剤、低又は実質的に零の中性無 機塩、ホスフェートビルダー、およびケイ酸ナトリウムを含有する、少なくとも 600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物の形態の洗剤粉末として配合された洗剤組成 物。 ｆ）アニオン界面活性剤および非イオン界面活性剤、低又は実質的に零の中に中 性無機塩、ゼオライトビルダーおよびケイ酸ナトリウムを含有する、少なくとも 600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物の形で洗剤粉末として配合された洗剤組成物 。 ｇ）アニオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、アクリルポリマー、脂肪酸石け ん、炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、粘土粒子およびケイ酸ナトリウムを含有 する洗剤粉末として配合された洗剤組成物。 ｈ）５〜65重量％の界面活性剤、０〜50重量％のビルダーおよび０〜30重量％の 電解質を含有する液体コンパクト洗剤。 これらの成分とは別に、洗剤組成物ａ）〜ｈ）は、本発明のセルラーゼ変異体 のおよび所望により前記の如く１種又は複数の他の酵素を含有する。 今日、次のように企図されている；すなわち本発明の洗剤組成物において、セ ルラーゼは洗液１ｌ当たり0.001 〜 100mgに相当する量で添加され得る。 次の実施例は本発明を説明するものであるがいかなる場合も本発明の範囲を制 限するものではない。 例１ 残留活性に関する連結領域中の変異の効果 プロテアーゼ酵素を含有する液体洗剤中で貯蔵後、セルラーゼ変異体の残留活 性を２つの異なる方法で評価した。 S-CEVU分析は、カルボキシメチルセルロース（CMC）の溶液の粘度を減少せし めるサンプルの能力を測定することによりサンプル中に存在する触媒活性の量を 定量する。この活性は、酵素コアにのみ関しそして連結領域およびCBD 領域の存 在又は非存在により影響されない。 S-CEVU分析は、基質（CMC）の粘度を減少させるため相対的酵素標準物を用い 、40℃、pH7.5 で行なわれる。この方法は、要求によりNo．AF302／2GB として 出願人から入手可能である。 ダイド アビセル（Dyed Avicel）分析（DAA）は、不溶性セルロースに結びつ くことのできそしてセルロース粉末の表面に結合した染料を解放し得るセルラー ゼの量を定量する。連結領域と CBD領域を有しないセルラーゼはこの基質に対し 低活性を示しそして分析はそさ故無傷のセルラーゼの酵素コアへのタンパク分解 を監視するために使用できる。 連結領域とCBD 粒子を有しないセルラーゼの洗浄能力は無傷の酵素に対するよ りも低いので、DAA は（１又は複数の）プロテアーゼ酵素を含有する洗剤中で貯 蔵されたセルラーゼの洗浄能力とある程度相関関係にある。 本発明の係る次のセルラーゼ変異体を残留活性に対して試験した： 変異体 Ｉ：V221S ＋N222S ＋Q223T 変異体 II：V240P ＋Q241P WO 91／17243 に記載されたＨ．インソレンス43kDエンドグルカナーゼを対 照（親）セルラーゼとして用いた。 ダイド アビセル（DYED AVICEL）分析（DAA） レマゾールブリリアントブルー（Remazol Brilliant Blue）で染色したセルロ ース粉末とセルラーゼの酵素反応は、セルロースの活性に関連した染料の量を解 放する。 反応条件： pH 7.50 温度 40℃ 基質 染色微晶質セルロース 緩衝液 0.1Mホスフェート緩衝液pH7.5 １ｇ／ｌ非イオンテンサイド（tenside）を有す （ベロール160） 時間 60分 サンプル濃度 0.5〜15 S-CEVU／ml 染色セルロースの調製 50ｇのシグマセルタイプ20セルロース粉末を、2000mlのガラスビーカー中の50 0mの脱イオン水に加え次いで電磁かくはん機でかくはんした。４ｇのレマゾール ブリリアントブルーR19 染料（C.I.61200リアクチブブル−19）を350ml の脱イ オン水に溶解した。染料濾液をシグマセルの懸濁液に加え次いで約55℃に加熱し た。100 ｇの無水硫酸ナトリウムをゆっくり加えながら、混合物を30分間撹伴し た。 20ｇのリン酸三ナトリウムに水和物200ml の脱イオン水に溶解した。シグマセ ル／染料溶液のpHを約150ml のリン酸三ナトリウム溶液を加えることにより11.5 に調節した。 混合物を55℃で60分間かくはんした。混合物を1000mlのブフナーロートおよび ワトマンNo. 54濾紙を用いて真空濾過した。フィルターケークを、濾液（廃水） の590nm での光学濃度（OD₅₉₀）が0.03未満になるまで70℃〜80℃で脱イオン水 を用いくりかえし洗浄した。フィルターケークを100ml の50％エタノールですす ぎ青色の更なる除去が生じ次いで引き続き100ml の96％エタノールですすいだ。 セルラーゼをロートから除きそして乾燥させた（クリーンベンチ中で ）。 分析試薬0.1Mホスフェート緩衝液 NaH₂PO₄ ・2H₂ O（メルク6345.1000） 15.6ｇ 脱イオン水 加えて 800ml ベロール160（AEO） 1.0ｇ NaOH，4N 7.5にpH調節 脱イオン水 1000mlにフィルアップ pHをチェック7.5＋／−0.03非イオン停止試剤 リン酸三ナトリウム（メルク6578） 19ｇ 脱イオン水 加えて 950ml ベロール160 20ｇ 完全に明澄になるまでかくはん 脱イオン水で1000mlまでフィルアップ染色セルラーゼ基質 毎日新たに調製されなければならない。乾燥粉末を秤量し、そして0.1Mホスフ ェート緩衝液（記載の如く）に溶解した10％（Ｗ／Ｗ）溶液を調製する。分析前 に少なくとも30分間撹伴する。0.1M緩衝液中に希釈した酵素サンプル サンプルを0.1Mホスフェート緩衝液中、例えば4，8，12，16 S-CEVU／mlの濃 度に希釈した。酵素標準物 適当な酵素標準物、又は対照非−貯蔵サンプルを0.1Mホスフェート緩衝液中で 希釈し標準曲線を得た。 標準物の濃度は例えば0，1／2，1，2，4，8，12，16 S-CEVU／mlであった。装置 40℃の水浴 分光光度計（590nm） バリオマグ テレシステム（Variomag Telesystem）HP 60p、水中用電磁かく はん器 プレート（60ポイント） バリオマグ試験管ラック（Rack）HP 60 、16mm試験管に対し、試験管、16mmφ 電磁かくはん棒、３×８mm 濾紙 φ９cm、ムンクテル（Munktell）１Ｆ 濾過用ロート ファインピペット １−５ml 試験管および濾液を集めるためのラック 電磁かくはん機プレートおよび基質懸濁のための磁石方法 水浴の温度は40℃でなければならない。標準溶液のサンプル２mlをラック内に 設けられた試験管に釈量して入れた。全ての試験管が準備できたら、ラックを水 浴内に設けた。電磁かくはん棒を全ての試験管に加え、かくはん機プレートを60 0rpmで開始した。10秒の間隔で、２mlの染色セルロース基質を定速かくはんしな がらピペッティング中に添加した。非イオン停止試剤を各試験管に加えた。40℃ で十分混合したサンプルを、濾過用ロート内の濾紙上に注ぎ、そして明澄な濾液 を集めた。もしも濾液が未明澄である場合、濾過をくりかえさなければならない 。濾液の 590nmでの吸光度を測定した。酵素なしの標準物O S-CEVU／mlの吸光度 をサンプルおよび他の標準物の吸光度から引いた。590nmで得られたデルタ吸光 度を、S-CEVU／mlで測定したサンプル溶液中の酵素活性に対してプロットした。 用量−応答曲線は直状でなく（図８）、そして標準物に関するサンプルの活性、 （又は非貯蔵サンプルに関する貯蔵サンプルの活性）は示される如く計算できる 。 実験、貯蔵安定性 高精製セルラーゼの2475 S-CEVU を凍結乾燥した。 1.65ｇの液体洗剤を加え次いでセルラーゼが溶解するまで攪拌した。0.165 KN PU（S）サビナーゼ（Savinase）プロテアーゼを加え次いで完全に混合した。酵 素を有する100μｌの洗剤を（最大）７個の１mlのナンク（Nunc）−管にピペッ トで移した。管の一つを直ちに参照のためディープフリーザー（−18℃）内に入 れた。残りの（６個）管を25℃、および35℃で、１日、２日又は５日間インキュ ベートした。インキュベーション後、サンプルを作動濃度に希釈し、次いで非貯 蔵対照に関する貯蔵サンプルの残留活性をダイドアゼセル（Dyed Avicel）分析 で測定した。S-CEVU／ｇでの活性に関する対照に関してのサンプルの残留活性を も測定した。 結 果 図９はセルラーゼ変異体Ｉに対するダイドアゼセル分析からの曲線の例を示す。 例２ 非晶質セルロースに対するセルラーゼ吸着 85％リン酸中で膨潤させることによって非晶質化したアビセル（Avicel）（商 標）（アサヒケミカル社、日本）を、試験吸着剤として用いた、詳細は下記の例 ５参照。 試験吸着剤を蒸留水中懸濁液として貯蔵し、乾燥セルロースの含量（典型的に は15ｇ／ｌ）を乾燥しそして別途の実験でアリコートを秤量することにより測定 した。吸着剤は封止され得るプラスチック管内に容量（０−0.5ml）で入れ、０ −８mgの範囲内のセルロース乾燥質量の含量とした。商業上のコンパクト粉末洗 剤であるアリエル カラー（Ariel Color）を、洗剤を電子オーブン中で85℃で ８分間インキュベートすることにより粉末洗剤中に存在する酵素を不活性化する ために予備処理した。1MのGly-NaOH緩衝液（pH10）中に溶解した0.3mlの予備処 理したアリエル カラー溶液（21.67ｇ／ｌ）を各管に加え、次いで0.2mlの酵素 （5 IU／ml）のアリコートを加え、約1 IU／mlの混合物中初期ＥＧ活性を得た。 懸濁液を、スウェラボ インストラメント（Swelab Instrument）440 ミキサ ー上で20℃で60分間振とうし、次いで吸着された酵素と共に基質を2500ｇ、20℃ で５分間遠心分離することにより沈降させた。 上澄みを通常の技術、例えば Red CMC分析（Tikhomirov D.F.等、Biotechnolo gia（モスクワ）、プレナム社により英語にほん訳、1989，vol．5，No．4，P．5 18-524）を用い未結合エンドグルカナーゼに対し分析した。 100μｌの酵素アリコートを狭いガラス管内の１mlの１％のレッド（Red）CMC 基質（Fermentas Co., Vilnius，Lithuania）、pH7.5（0.05M のTris緩衝液）に 加え、混合物を40℃の水サーモスタットに40分間移した。１以上の管をブランク として酵素アリコートの代 りに緩衝液を有するサーモスタットに加えた。酵素反応を、0.1MのCaCl₂を含有 する80％エタノール１mlを加え、引き続き激しく振とうすることによって停止さ せた。未加水分解基質を、同じ管を4000ｇで10分間遠心分離することにより分離 し次いで490nmで上澄みの吸光度を水に対して測定した。 吸着の程度を、Ao／Asuper比対吸着剤濃度を用いてプロットしたが、これは線 状法でありこの方法は吸着特性に従い単一エンドグルカナーゼイソ型同質性の場 合に直線を与える（Klyosov A．A．等、Bioorgan．Chem． （モスクワ）、プレ ナム社により英訳、1982，Vol．8，No．5，p．643-651）。分布定数、Kd＝Aboun d／（Asupper ・ [S]）は、線の傾きとしてこのプロットから測定される。 次のKd値がアリエルカラーにおいて得られた： カレザイム（Carezyme） 0.6ｌ／ｇ Y280F 2.9ｌ／ｇ R252F 4.3ｌ／ｇ Y280F ＋R252F 3.3ｌ／ｇ 例３ 洗浄試験 Ａ．条件 装置 ：トルグ−ロートメーター 液体量 ：150ml 攪拌 ：100回運動／分 洗浄時間 ：30分 すすぎ時間：水道水で５分 洗浄温度 ：40゜ 繊維 ：100％熟成された黒色綿の２個のスワッチ、 ５×６cm 乾燥 ：ライン乾燥 くり返し ：３回 商業上の洗剤の予備処理：電子オーブン中85℃で８分間インキ ュベーション 評価 ：パネルの数は、色彩明澄性およびぼやけのレベルに関 して実験の範囲で相対的評価を与えることが求められ る。 １．カレザイム（Carezyme）対 Y280F 洗剤 ：商業上のヨーロッパのコンパクトカラー粉末 粒質物 ：6.5 ｇ／ｌ，pH 10.2 水硬度 ：３mM Ca⁺⁺ 平均パネル点数（点数１−６） 酵素なし 1.0 カレザイム 500 S-CEVU／ｌ 3.4 Y280F 500 S-CEVU／ｌ 4.3 データーは変異体が試験された条件下で改善された性能を有することを示す。 ２．カレザイム対 １）V221S-N222S-Q223T， ２）Y8F， ３）Del（S219-T235） 洗剤 ：商業上の米国の重質コンパクト粉末粒質物、 １ｇ／ｌ，pH 10 水硬度 ：１mM Ca⁺⁺ 平均パネル点数（点数１−11） 酵素なし 1.0 カレザイム 250 S-CEVU／ｌ 4.0 カレザイム 500 S-CEVU／ｌ 6.5 カレザイム 1000 S-CEVU／ｌ 9.0 １） 500 S-CEVU／ｌ 10.0 ２） 500 S-CEVU／ｌ 8.0 ３） 500 S-CEVU／ｌ 11.0 データーは全ての三種の変異体は試験された条件下、改善され た性能を有 することを示す。 Ｂ．条件 装置 ：トルグ−ロートメーター 液体量 ：800ml 洗浄時間 ：12分 すすぎ時間：水道水で4分 洗浄温度 ：35゜ 繊維 ：100％熟成された黒色綿の２個のスワッチ、 10×15cm 乾燥 ：タンブル乾燥 くりかえし：11回 商業上の洗剤の予備処理：電子オーブン中で85℃で８分間イン キュベーシヨン 評価 ：パネルの数は、測定されたスケールに従い可視的外観 （色彩明澄性およびぼやけ）に関し表面処理酵素対酵 素なしを等級づけすることが求められる。 等級： ０＝利益なし １＝認め得る利益 ２＝容易に認め得る利益 ３＝大きな利益 ４＝非常に大きな利益 ５＝新規な繊維 １．カレザイム対 A162P 洗剤 ：商業上の米国のコンパクトカラー粉末粒質物、 １ｇ／ｌ，ｐＨ 8.1 水硬度 ：１mMのCa⁺⁺および0.35mMのMg 平均パネル点数 酵素なし 0 カレザイム 15 S-CEVU／ｌ 1.5 カレザイム 30 S-CEVU／ｌ 2.0 A162P 15 S-CEVU／ｌ 1.8 A162P 30 S-CEVU／ｌ 2.7 Ｃ．条件 装置 ：トルグ−ロートメーター 液体量 ：800ml 攪拌 ：100 回の運動／分 洗浄時間 ：30分 すすぎ時間：水道水で10分 洗浄温度 ：40゜ 繊維 ：100 ％熟成された黒色綿の２個のスワッチ、 10×15cm 乾燥 ：タンブル乾燥 くりかえし：４回 商業上の洗剤の予備処理：電子オーブン中で85℃で８分間イン キュベーシヨン 評価 ：パネルの数は、測定されたスケールに従い可視的外観 （色彩明澄性およびぼやけ）に関し表面処理酵素対酵 素なしを等級づけすることが求められる。 等級： ０＝利益なし １＝認め得る利益 ２＝容易に認め得る利益 ３＝大きな利益 ４＝非常に大きな利益 ５＝新規な繊維 １．カレザイム対 W62E 洗剤 ：商業上のヨーロッパの粉末粒質物、6.5 ｇ／ｌ， pH 10.2 水硬度 ：３mM Ca⁺⁺ 平均パネル点数 酵素なし 0 カレザイム 50 S-CEVU／ｌ 1.0 カレザイム 80 S-CEVU／ｌ 1.3 カレザイム 120 S-CEVU／ｌ 1.8 カレザイム 150 S-CEVU／ｌ 2.0 W62E 100 S-CEVU／ｌ 1.9 例４ ペルオキシダーゼ安定化43kDセルラーゼ変異体 コプリナス シネレウス ペルオキシダーゼ（Cip，ヨーロッパ特許出願179,4 86 に従って得る）、過酸化水素、およびペルオキシダーゼ促進剤としてのｐ− ヒドロキシベンゼンスルホネート（pHBS） を含んでなる、染料移動阻止（DTI）のため用いられるペルオキシダーゼ系（POD 系）を、ブリトン−ロビンソン緩衝液（pH8.5）中でシミュレートした： ［pHBS］：50μM，［H₂O₂］：200μM，［Cip］：2 PODU／ml，［−セルラーゼ ］：1.4 ECU／ml，10 mM プリトン−ロビンソン緩衝液，pH 8.5. 43kDのセルラ ーゼおよびセルラーゼ変異体 Y147Sを、35℃で10分間 POD系と共にインキュベー トした。サンプルを取り出しそして氷冷の0.1Mリン酸ナトリウム（pH 7.0）で５ 回希釈した。セルラーゼの残留活性を、フェリシアン化物検出原理を用いるCMCU 法により測定した。 結果を下記の表に示すが、表は置換Y147S が POD系に対し安定であるセルラー ゼ変異体に勝れていることを示す。 例 ５ 非晶質セルロースに対するアルカリセルラーゼ活性の測定方法： 基質調製：20ｇの酸で膨潤させたアビセル（AVICEL）（商標）スストック溶液 （１ケ月間貯蔵できる調製品に対し下記参照）を、5000rpm で20分間遠心分離し 、上澄みを流し出し、そして沈降物を30mlの緩衝液中に再懸濁させた。次いで、 5000rpm で20分間遠心分離し、上澄みを流し出し、そして沈降物を緩衝液中に再 懸濁させ合計30ｇとした。これは、10ｇのアビセル／ｌの基質濃度に相当する。 緩衝液：pH8.5 の0.1Mのバルビタール又はpH10.0の0.1Mのグリシン 酵素溶液： 酵素をPH8.5 で0.5 S-CEVU／ml又はpH10.0で0.75 S-CEVU／mlの活性に希釈し た。 試薬： ２％NaOH，PHBAH −試薬： 1.5ｇのｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジドおよ び5.0ｇの酒石酸ナトリウムを２％NaOHの 100mlに溶解した。 基質、緩衝液および酵素溶液を次の如く混合した： 基質／緩衝液溶液を40℃で５分間予備処理した。次いで、酵素溶液を加え、溶 液を５秒間回転混合し、次いで40℃で20分間インキュベートした。 反応を、500μｌの２％NaOH溶液を加え、次いで５秒間回転混合することによ って停止した。サンプルを5000rpm で20分間遠心分離した。1000μｌの上澄みを 試験管から新しい試験管に移し、そして500μｌの PHBAH−試剤を加え、次いで1 0分間沸とうさせた。 サンプルの吸光度を分光光度計を用い 410nmで測定した。 標準グルコース曲線： 300mg／ｌを含有する原液を5，10，15および25mg／ｌに希釈した。 1000μｌの希釈標準物を 500μｌの PHBAH−試剤と混合し、次いで他のサンプ ルと同様に処理した、上記参照。 還元グルコース当量の放出を、標準曲線を用いて計算した。 酵素濃度を43kDエンドグルコースに対する613000のモル吸光度（ε）を用いて 計算した。Km，Vmax およびKcatを異なる基質濃度を用いる Cineulaver-BurKプ ロットから計算した。置換チロシンおよびトリプトファンを有するセルラーゼ変 異体のモル吸光度を、トリプトファンに対する吸光度値5690（ε）およびチロシ ンに対する吸光度値λ280（ε）およびシスティンに対する吸光度値120（ε）を 用い適宜に調節した。 吸光係数（ε）は、グル、s.c.およびヒピエル、 P.H.：Calculation of protein extinction coefficients fromamino acid se quence data； Analytical Biochemistry vol 182，（319-326），（1989）． 試験せられるセルラーゼ変異体の各々を高い同質性に精製しSDS-PAGE分析にお ける単一バンドを得た（割合A280／A260を前記 1.5の如くチェックした）。 膨潤セルロースの調整： 材料： ５ｇのアビセル（Avicel）（商標）（Art.2331 Merck）150mlの85％オルト− リン酸（Art．573 Merck）400mlのアセトン（Art．14Merck） 1．3ｌの脱イオン水（MillQ） １ｌのガラスビーカー １ｌのガラスフィルターロート １ｌの吸引フラスト ウルトラターラックス（Turrax）ホモジナイザー 手順： アセトンおよびリン酸を氷上で冷却した。 ５ｇのアゼセル（商標）を水で湿潤させ、次いで150mlの氷冷85％オルト−リ ン酸を加え次いで混合物を１時間弱くかくはんしながら氷浴上に置いた。100ml の氷冷アセトンをかくはんしながら加え、引き続き混合物をガラスフィルターロ ートに移し、次いで３×100ml の氷冷アセトンで洗いそして各洗浄後に乾燥吸収 した。 フィルターケークを２×500ml の水で洗いそして各洗浄後に可能な限り吸引乾 燥した。 フィルターケークを再懸濁させ全量300mlとし次いで（ウルトラターラックス ホモジナイザーを用い）同質性に至るまでブレンドした。 得られた生成物を冷蔵庫中で貯蔵した。 次の結果を43kDセルラーゼおよび変異体 A162PおよびW62Pについてそれぞれ得 た。 毎秒につきpH8.5 でのKcat 毎秒につきpH10でのKcat 43 kD 57 25 A162P 64 36 W62E 41 31 表から明らかなように、両置換はアルカリ条件下基質無定形アゼセルに対する 触媒活性を高めた。 例６ セルラーゼの LAS阻害 セルラーゼを異なる濃度の LAS（線状アルキルベンゼンスルホネート； Nansa 1169／P）を用い40℃で10分間インキュベートした。 残留活性を下記のCMCU法を用いて測定した。 LAS を0.1Mホスラェート緩衝液（pH7.5）中に希釈した。 LAS に対する500ppm，250ppm，100ppm，50ppm，25ppm，および10ppm，LASなし セルラーゼを、10mlの合計容量中0，2 S-CEVU／mlの最終濃度に異なる LAS緩 衝剤中で希釈しそして温度制御水浴中１分間インキュベートした。 次いで残留活性を、CMCU基質を用い還元糖を測定して２回測定した。0.5ml溶 液の２個のサンプルを、同じホスフェート緩衝液中で調製した1.5mlの１％ CMC 溶液（ハーキュレス クレ）と混合し、40℃で20分間インキュベートし、次いで PHBAH，２％NaOH中の酒石酸ナトリウムで停止させた。 0.5mlの同類のブランクサンプルを、停止試剤添加後 CMC溶液に加えた。 サンプルを10分間冷却し次いで吸光度を 410nmで測定した。 活性をブランクを減じた後に測定した。LAS のない場合の活性は100％であっ た。図10において、43kDセルラーゼおよびセルラーゼ変異体A162およびR1158Eの 残留活性がそれぞれ示される。43KDセルラーゼは「Wild」として示され、A162P 変異体は「248」として示され、そして R158E変異体は「280」として示される。 図面から明らかなように A162P又は R158Eの置換は LAS（アニオン界面活 性剤）に対しセルラーゼ安定性を増加する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９４年１２月１２日 【補正内容】 請求の範囲 １．ヘンリサット（Henrissat）、Ｂ等：Biochem.J.,（1993），293，p．781- 788 に記載されている如き科45に分類される触媒的に活性なドメインを有するセ ルラーゼから選ばれる親セルラーゼのセルラーゼ変異体であって、該変異体がセ ルロース結合ドメイン（CBD）、触媒的に活性なドメイン（CAD）およびセルロー ス結合ドメインと触媒的に活性なドメインを連結する領域（連結領域）を含んで なり、ここにおいて、セルラーゼ変異体の性質を改善するため、CBD，CAD又は連 結領域の１個又は複数のアミノ酸残基が欠失されているか、又は１種又は複数の アミノ酸残基により置換されているか、および／または１個又は複数のアミノ酸 が連結領域に加えられているか、および／またはもう一つのCBD が触媒に活性な ドメインの対向末端で加えられている、前記セルラーゼ変異体。 ２．１個又は複数のアミノ酸残基が連結領域から欠失されているか、又は１個 又は複数のアミノ酸が連結領域に加えられているか、又はプロテアーゼに対する セルラーゼ変異体の感受性が、プロテアーゼによる加水分解に対し感受性がある 該連結領域の１個又は複数のアミノ酸残基を欠失することにより、又はプロテア ーゼによる加水分解に対し抵抗する１個又は複数のアミノ酸残基により置換する ことにより減少せしめられている、請求の範囲第１項記載のセルラーゼ変異体。 ３．連結領域の１個又は複数のアミノ酸残基がＯ−グリコシル化に対し部位を 与える１個又は複数のアミノ酸残基、特にThr 又はSer により、又はPro により 置換されている、請求の範囲第２項記載のセルラーゼ変異体。 ４．セルラーゼ変異体の結合特性が次の（ａ）〜（ｄ）： （ａ）セルロース結合に関与する１個又は複数のアミノ酸残基を置換して改質 された結合親和力を得ること、 （ｂ）CBD の静電荷を、CBD の１個又は複数の負に荷電したアミノ酸残基を欠 失することにより、挿入することにより、又はCBD の１個又は複数の負に荷電し たアミノ酸残基を中性又は正に荷電したアミノ酸残基により置換させることによ り、又は１個又は複数の正に荷電したアミノ酸残基を正に荷電したアミノ酸残基 により置換すること、又は１個又は複数の正に荷電したアミノ酸残基を中性又は 負に荷電したアミノ酸残基により置換すること、又は１個又は複数の中性アミノ 酸残基を負に荷電したアミノ酸残基により置換することにより変化させること、 （ｃ）触媒的な活性なドメインの対向端末でもう一つのCBD を加えること、又 は （ｄ）１個又は複数のアミノ酸残基をプロリンにより置換すること により改質する、請求の範囲第１項記載のセルラーゼ変異体。 ５．セルラーゼ変異体の酵素活性を改質するため、触媒的に活性な部位を含有 する伸びたクレフト、セルラーゼ分子の表面から該クレフトに至りそして活性部 位でセルロースを加水分解するため該クレフトに水を供給する少なくとも１個の チャンネル、および活性部位の少なくとも１個のアミノ酸残基の近くの正に荷電 した表面領域を含んでなるCAD の１個又は複数のアミノ酸残基が欠失しているか 、又は１個又は複数の他のアミノ酸で置換されている、請求の範囲第１項記載の セルラーゼ変異体。 ６．アルカリ条件下セルラーゼ変異体の酵素活性を改善するため、活性部位の 近くの静電荷が該クレフトの１個又は複数の正に荷電したアミノ酸残基を１個又 は複数の中性又は負に荷電したアミノ酸 残基により置換することにより、又は１個又は複数の中性アミノ酸残基を１個又 は複数の負に荷電したアミノ酸残基により置換することにより、又は１個又は複 数の負に荷電したアミノ酸残基を（１又は複数の）より負に荷電したアミノ酸残 基により置換することによって変化している、請求の範囲第５項記載のセルラー ゼ変異体。 ７．柔軟性表面ループ領域が更に与えられているCAD を有する、請求の範囲第 ５項記載のセルラーゼ変異体であって、アルカリ条件下セルラーゼ変異体の酵素 活性を改善するため、該ループ領域の１個又は複数のアミノ酸残基、又は活性部 位のアミノ酸残基に対する水素結合網目内に含ましめられる１個又は複数アミノ 酸が該水素結合網目を改質するため１個又は複数のアミノ酸残基により置換され ている前記セルラーゼ変異体。 ８．柔軟性表面ループ領域が更に与えられているCAD を有する、請求の範囲第 ５項記載のセルラーゼ変異体であって、アルカリ条件下セルラーゼ変異体の酵素 活性を改善するため、柔軟性ループ領域の１個又は複数のアミノ酸残基が、活性 部位のアミノ酸残基に対する水素結合網目に関与するためのループの能力を保護 することによりループの柔軟性に対し変化するように１個又は複数のアミノ酸残 基により置換されている、請求の範囲第５項記載のセルラーゼ変異体。 ９．アルカリ条件下、セルラーゼ変異体の酵素活性を改善するため、活性部位 クレフトの表面の１個又は複数のアミノ酸残基が、基質と相互作用するため表面 の能力を改質するために１個又は複数のアミノ酸残基により置換されている、請 求の範囲第５項記載のセルラーゼ変異体。 10．アルカリ条件下、セルラーゼ変異体の酵素活性を改善するため、活性部位 クレフトに至るチャンネルの表面の１個又は複数のア ミノ酸残基がチャンネルを通る水の流れを改質するように１個又は複数のアミノ 酸残基により置換されている、請求の範囲第５項記載のセルラーゼ変異体。 11．アルカリ条件下、セルラーゼ変異体の酵素活性を改善するため、正に荷電 した表面領域の１個又は複数の中性又は負に荷電したアミノ酸残基が、領域の正 の正味電荷を増大させるため１個又は複数の正に荷電したアミノ酸残基により置 換されている、請求の範囲第５項記載のセルラーゼ変異体。 12．アニオン界面活性剤に対するセルラーゼ変異体の感受性を減少させるため 、CAD の表面上の１個又は複数の中性アミノ酸残基か１個又は複数の負に荷電し たアミノ酸残基により置換され、又はCAD の表面上の１個又は複数の正に荷電し たアミノ酸残基が１個又は複数の中性又は負に荷電したアミノ酸残基により置換 され、又はここにおいて１個又は複数の疎水性アミノ酸残基が１個又は複数の非 疎水性アミノ酸残基により置換され、又はここにおいて１個又は複数のアミノ酸 残基がプロリンにより置換され、CAD が触媒的に活性な部位を含有する伸びたク レフト、セルラーゼ表面から該クレフト に至りそして活性部位でセルロースの 加水分解のため該クレフトに水を供給する少なくとも１つのチャンネルおよび活 性部位の少なくとも１個のアミノ酸残基の近くで正に荷電した表面領域を含んで なる、請求の範囲第１項記載のセルラーゼ変異体。 13．酸化又は漂白剤の存在に対するセルラーゼ変異体の感受性を減少させるた め、CAD，CBD 又は連結領域の表面上の１個又は複数のアミノ酸残基が、酸化又 はペルオキシダーゼ漂白系の存在に対し感受性がより少ない１個又は複数のアミ ノ酸残基により置換され；CBD が触媒的に活性な部位を含有する伸びたクレフト 、セルラーゼ分子の表面から該クレフトに至りそして活性部位でセルロースの加 水分解のため該クレフトに水を供給する少なくとも１個のチャンネル、および活 性部位の少なくとも１個のアミノ酸残基付近で正に荷電した表面領域を含んでな る、請求の範囲第１項記載のセルラーゼ変異体。 14．メチオニン、トリプトファン又はチロシンが、セリン、アスパラギン、グ ルタミン、プロリン、フェニルアラニン、グルタミン酸、アルギニン又はグリシ ンにより置換されている、請求の範囲第13項記載のセルラーゼ変異体。 15．親セルラーゼが微生物セルラーゼである、請求の範囲第１〜14項のいずれ か１項に記載のセルラーゼ変異体。 16．親セルラーゼが、トリコデルマ（Trichoderma）、マイセリオフォトラ（M yceliophthora）、ペニシリウム（Penicillium）、イルペックス（Irpex）、ア スペルギルス（Aspergillus）又はフサリアム（Fusarium）から由来するもので ある、請求の範囲第15項記載のセルラーゼ変異体。 17．親セルラーゼが、フミコラ インソレンス（Humicola insolens）の菌株 から由来するものである、請求の範囲第16項記載のセルラーゼ変異体。 18．親セルラーゼがＨ．インソレンス（insolens）エンドグルカナーゼである 、請求の範囲第17項記載のセルラーゼ変異体。 19．親セルラーゼが、Ｈ．インソレンス（insolens）43kDエンドグルカナーゼ 又はその相同体である、請求の範囲第18項記載のセルラーゼ変異体。 20．連結領域の１個又は複数のアミノ酸残基が次の如く； V221S，T，P N222S，T，P Q223S，T，P V240S，T，P Q241S，T，P 置換されている、請求の範囲第19項記載のセルラーゼ変異体。 21．１個又は複数のアミノ酸残基が次の如く； V221S ＋N222S ＋Q223Tおよび／または V240P ＋ Q241P 置換されている、請求の範囲第20項記載のセルラーゼ変異体。 22．連結領域の１個又は複数のアミノ酸残基が欠失している、請求の範囲第19 項記載のセルラーゼ変異体。 23．セルロース結合領域（CBD）の１個又は複数のアミノ酸残基か次の如く； E251S，Q，N，P R252L，Q，H V268E A269E，R T265R，E W253Y，F A254S，D，G Q255E，R，K W261R，Y，F S262A，N，D T274R K275R，Q I276D，Q，N N277Q，D D278P W279Y，F Y280W，F H281S Q282N，R Y280F ＋ Q282N 置換されている、請求の範囲第19項記載のセルラーゼ変異体。 24．43kDエンドグルカナーゼの触媒活性ドメイン（CAD）の次の領域； 領域 残基 Ｉ 2− 21 II 44− 48 III 55− 60 IV 65− 67 V 72− 75 VI 95−103 VII 109−123 VIII 128−136 IX 142−148 X 175−185 の１個又はそれ以上において、又は科45において分類される相同セルラーゼ中の それに対応する１個はそれ以上領域において、１個又は複数のアミノ酸残基の置 換により改質されている、請求の範囲第19項記載のセルラーゼ変異体。 25．該活性部位クレフトの表面コンホメーションが、次の位置 4，5，6，7，8 ，10，11，12，13，15，18，20，21，44，45，48，74，82，90，110，114，117 ，119，121，128，131，132，147，176，178 または179 において、１個又は複 数のアミノ酸残基を置換することによって変化している、請求の範囲第24項記載 のセルラーゼ変 異体。 26．柔軟性ループ領域の水素結合特性が、次の位置 111，112，113，114，115 ，116，117，118 又は119 の１個又は複数において、１個又は複数のアミノ酸残 基を置換することによって変化している、請求の範囲第24項記載のセルラーゼ変 異体。 27．（１又は複数の）該チャンネルの表面コンホメーションが、次の位置 9， 14，28，37，55，58，59，60，63，72，73，78，109，118，123，129，131，132 ，133，136，142，145，146，158，163，176，179，186又は196 の１個はそれ以 上において、１個又は複数のアミノ酸残基を置換することによって変化している 、請求の範囲第24項記載のセルラーゼ変異体。 28．正に荷電した表面領域の正の静電荷が、次の位置 2，13，20，44，65，66 ，67，90，95，96，100，102，103，175，176，178，180，183又は185 において 、１個又は複数のアミノ酸残基を置換することによって変化せしめられている、 請求の範囲第24項記載のセルラーゼ変異体。 29．クレフトの負の電荷が、次の位置 55，74，90 又は123 の１又はそれ以上 において、１個又は複数のアミノ酸残基を置換することによって変化している、 請求の範囲第24項記載のセルラーゼ変異体。 30．１個又は複数のアミノ酸残基が次の如く； D2N S5A T6S Y8F W9S，G D10E K13R S15N，A，D W18H K20R V28T R37N，S，A K44R S45N，D，A E48D，Q，A S55E，D D58N，S，A Q59S，A，G N65R D66R，N D67R，N A74D，N，S Y90F S96R A100R K102R K103R S110N，A，D T111G，A，S G112A G113A L115I，V，F，H，T，N，Q，G G116A S116G．A，D，E，N，Q N118G，A，S，D，R H119Q，K S123D，E，Y K175R N179D，H，A S185R，K C11A＋ C135A C12A＋ C47A R37N＋ D58A 置換されている、請求の範囲第24〜29項のいずれか１項に記載のセルラーゼ変異 体。 31．アニオン界面活性剤に対するセルラーゼ変異体の感受性を減少させるため 、CBD の表面上の１個又は複数アミノ酸残基が、次の位置 37，62，63，78，118 ，129，131，133，136，142，146，158，163，175，176，179，186又は196 の１ 又はそれ以上において置換されている、請求の範囲第24項記載のセルラーゼ変異 体。 32．１個又は複数のアミノ酸残基が次の如く； R37N，S，A W62E，F A63D，T，R A78D N118D V129D，T，S I131L，V，T，N，Q，H，G D133Q T136D L142D，T，S R146E，Q，S R158D L163N N176D N179D N186D R196D 置換されている、請求の範囲第31項記載のセルラーゼ変異体。 33．アニオン界面活性剤に対するセルラーゼ変異体の感受性を減少させるため 、１個又は複数のアミノ酸が次の如く； A78P A162P K175G，S 置換されている、請求の範囲第19項記載のセルラーゼ変異体。 34．酸化又は漂白剤の存在に対するセルラーゼ変異体の感受性を減少させるた め、１個又は複数のアミノ酸残基が、次の位置 8，9，18，62，104又は147 の１ 又はそれ以上において置換されている、請求の範囲第24項記載のセルラーゼ変異 体。 35．１個又は複数のアミノ酸が次の如く； Y8F W9F，H，S，A W18H，F，A W62F，E M104S，N，Q Y147F，H，S，Q，N，E，D 置換されている、請求の範囲第34項記載のセルラーゼ変異体。 36．親セルラーゼが細菌セルラーゼである、請求の範囲第20〜23項のいずれか １項に記載のセルラーゼ変異体。 37．親セルラーゼが、シュードモナス（Pseudomonas）又はバシラルータス（B acillus lautus）セルラーゼである、請求の範囲第36項記載のセルラーゼ変異体 。 38．請求の範囲第１〜37項のいずれか１項に記載のセルラーゼ変異体を含んで なる洗剤組成物。 39．セルラーゼ変異体が、洗浄溶液１ｌ当たりセルラーゼタンパク質 0.001− 100mg の洗浄液体の濃度に相当する濃度で存在する、請求の範囲第38項記載の洗 剤組成物。 40．洗剤組成物が粉末組成物である、請求の範囲第38項記載の洗剤組成物。 41．洗剤組成物が、強力粉末組成物である、請求の範囲第40項記載の洗剤組成 物。 42．洗剤組成物が、圧縮強力粉末組成物である、請求の範囲第41項記載の洗剤 組成物。 43．洗剤組成物が液体組成物である、請求の範囲第38項記載の洗剤組成物。 44．液体組成物が、強力液体組成物である、請求の範囲第43項記載の洗剤組成 物。 45．液体組成物がコンパクト強力液体組成物である、請求の範囲第44項記載の 洗剤組成物。 46．プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、エステラーゼ、セルラーゼ 、エンドグルカナーゼ タイプII、オキシダーゼおよびアミラーゼから選ばれる １種又は複数の酵素を更に含んでなる、請求の範囲第38項記載の洗剤組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:00） (Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｒ 1:39） (31)優先権主張番号 １２２３／９２ (32)優先日 1992年10月６日 (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） (31)優先権主張番号 １２２２／９２ (32)優先日 1992年10月６日 (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） (31)優先権主張番号 １２２１／９２ (32)優先日 1992年10月６日 (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） (31)優先権主張番号 １５１５／９２ (32)優先日 1992年12月18日 (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） (31)優先権主張番号 １５１３／９２ (32)優先日 1992年12月18日 (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） (31)優先権主張番号 １５４３／９２ (32)優先日 1992年12月23日 (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＢＲ，ＦＩ，ＪＰ，ＫＲ，Ｕ Ｓ (72)発明者 ヨルト，カルステン マイランド デンマーク国，デーコー―4000 ロスキル デ，ゴーセアゲレン 43 (72)発明者 ラスムッセン，グレーテ デンマーク国，デーコー―2100 ケーベン ハウンエー，エステー．テーホー，ストラ ントバイエン 89アー (72)発明者 ニールセン，エーゴン デンマーク国，デーコー―2100 ケーベン ハウンエー，エステー．，ニールス ドベ ルドベー．ガゼス ガゼ 33 (72)発明者 ロスホルム，ペテル デンマーク国，デーコー―2100 ケーベン ハウンエー，１．テーベー，ロセンベーン ゲトス シデアレ ３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．セルロース結合ドメイン(CBD) 、触媒的に活性なドメイン(CAD)およびセ ルロース結合ドメインと触媒的に活性なドメインを連結する領域（連結領域）を 含んでなる親セルラーゼのセルラーゼ変異体であって、ここにおいて、セルラー ゼ変異体の性質を改善するため、CBD，CAD又は連結領域の１個又は複数のアミノ 酸残基が欠失されているか、又は１種又は複数のアミノ酸残基により置換されて いるか、および／または１個又は複数のアミノ酸が連結領域に加えられているか 、および／またはもう一つのCBD が触媒的に活性なドメインの対向末端で加えら れている、前記セルラーゼ変異体。 ２．１個又は複数のアミノ酸残基が連結領域から欠失されているか、又は１個 又は複数のアミノ酸が連結領域に加えられているか、又はプロテアーゼに対する セルラーゼ変異体の感受性が、プロテアーゼによる加水分解に対し感受性がある 該連結領域の１個又は複数のアミノ酸残基を欠失することにより、又は加水分解 に対し感受性がある該連結領域の１個又は複数のアミノ酸残基をプロテアーゼに よる加水分解に対し抵抗する１個又は複数のアミノ酸残基により置換することに より減少せしめられている、請求の範囲第１項記載のセルラーゼ変異体。 ３．連結領域の１個又は複数のアミノ酸残基がＯ−グリコシル化に対し部位を 与える１個又は複数のアミノ酸残基、特にThr 又はSer により、又はPro により 置換されている、請求の範囲第２項記載のセルラーゼ変異体。 ４．セルラーゼ変異体の結合特性が次の（ａ）〜（ｄ）： （ａ）セルロース結合に関与する１個又は複数のアミノ酸残基を置換して改質 された結合親和力を得ること、 （ｂ）CBD の静電荷を、CBD の１個又は複数の負に荷電したアミノ酸残基を欠 失することにより、挿入することにより、又はCBD の１個又は複数の負に荷電し たアミノ酸残基を中性又は正に荷電したアミノ酸残基により置換させることによ り、又は１個又は複数の正に荷電したアミノ酸残基を正に荷電したアミノ酸残基 により置換することにより、又は１個又は複数の正に荷電したアミノ酸残基を中 性又は負に荷電したアミノ酸残基により置換することにより、又は１個又は複数 の中性アミノ酸残基を負に荷電したアミノ酸残基により置換することにより変化 させること、 （ｃ）触媒的に活性なドメインの対向端末でもう一つのCBD を加えること、又 は （ｄ）１個又は複数のアミノ酸残基をプロリンにより置換すること により改質する、請求の範囲第１項記載のセルラーゼ変異体。 ５．セルラーゼ変異体の酵素活性を改質するため、触媒的に活性な部位を含有 する伸びたクレフト、セルラーゼ分子の表面から該クレフトに至りそして活性部 位でセルロースを加水分解するため該クレフトに水を供給する少なくとも１個の チャンネル、および活性部位の少なくとも１個のアミノ酸残基の近くの正に荷電 した表面領域を含んでなるCAD の１個又は複数のアミノ酸残基が欠失しているか 、又は１個又は複数の他のアミノ酸で置換されている、請求の範囲第１項記載の セルラーゼ変異体。 ６．アルカリ条件下セルラーゼ変異体の酵素活性を改善するため、活性部位の 近くの静電荷が該クレフトの１個又は複数の正に荷電したアミノ酸残基を１個又 は複数の中性又は負に荷電したアミノ酸残基により置換することにより、又は１ 個又は複数の中性アミノ酸残基を１個又は複数の負に荷電したアミノ酸残基によ り置換するこ とにより、又は１個又は複数の負に荷電したアミノ酸残基を（１又は複数の）よ り負に荷電したアミノ酸残基により置換することによって変化している、請求の 範囲第５項記載のセルラーゼ変異体。 ７．更に柔軟性表面ループ領域が与えられているCAD を有する、請求の範囲第 ５項記載のセルラーゼ変異体であって、アルカリ条件下セルラーゼ変異体の酵素 活性を改善するため、該ループ領域の１個又は複数のアミノ酸残基、又は活性部 位のアミノ酸残基に対する水素結合網目内に含ましめられる１個又は複数のアミ ノ酸が該水素結合網目を改質するために１個又は複数のアミノ酸残基により置換 されている、前記セルラーゼ変異体。 ８．柔軟性表面ループ領域が更に与えられているCAD を有する、請求の範囲第 ５項記載のセルラーゼ変異体であって、アルカリ条件下セルラーゼ変異体の酵素 活性を改善するため、柔軟性ループ領域の１個又は複数のアミノ酸残基が、活性 部位のアミノ酸残基に対する水素結合網目に関与するためのループの能力を保護 することによりループの柔軟性に対し変化するように１個又は複数のアミノ酸残 基により置換されている、請求の範囲第５項記載のセルラーゼ変異体。 ９．アルカリ条件下、セルラーゼ変異体の酵素活性を改善するため、活性部位 クレフトの表面の１個又は複数のアミノ酸残基が、基質と相互作用するため表面 の能力を改質するために１個又は複数のアミノ酸残基により置換されている、請 求の範囲第５項記載のセルラーゼ変異体。 10．アルカリ条件下、セルラーゼ変異体の酵素活性を改善するため、活性部位 クレフトに至るチャンネルの表面の１個又は複数のアミノ酸残基がチャンネルを 通る水の流れを改質するように１個又は複数のアミノ酸残基により置換されてい る、請求の範囲第５項記載 のセルラーゼ変異体。 11．アルカリ条件下、セルラーゼ変異体の酵素活性を改善するため、正に荷電 した表面領域の１個又は複数の中性又は負に荷電したアミノ酸残基が、領域の正 の正味電荷を増大させるため１個又は複数の正に荷電したアミノ酸残基により置 換されている、請求の範囲第５項記載のセルラーゼ変異体。 12．アニオン界面活性剤に対するセルラーゼ変異体の感受性を減少させるため 、CAD の表面上の１個又は複数の中性アミノ酸残基が１個又は複数の負に荷電し たアミノ酸残基により置換され、又はCAD の表面上の１個又は複数の正に荷電し たアミノ酸残基が１個又は複数の中性又は負に荷電したアミノ酸残基により置換 され、又はここにおいて１個又は複数の疎水性アミノ酸残基が１個又は複数の非 疎水性アミノ酸残基により置換され、又はここにおいて１個又は複数のアミノ酸 残基がプロリンにより置換され、CAD が触媒的に活性な部位を含有する伸びたク レフト、セルラーゼ表面から該クレフトに至りそして活性部位でセルロースの加 水分解のため該クレフトに水を供給する少なくとも１つのチャンネルおよび活性 部位の少なくとも１個のアミノ酸残基の近くで正に荷電した表面領域を含んでな る、請求の範囲第１項記載のセルラーゼ変異体。 13．酸化又は漂白剤の存在に対するセルラーゼ変異体の感受性を減少させるた め、CAD，CBD 又は連結領域の表面上の１個又は複数のアミノ酸残基が、酸化又 はペルオキシダーゼ漂白系の存在に対し感受性がより少ない１個又は複数のアミ ノ酸残基により置換され；CAD が触媒的に活性な部位を含有する伸びたクレフト 、セルラーゼ分子の表面から該クレフトに至りそして活性部位でセルロースの加 水分解のため該クレフトに水を供給する少なくとも１個のチャンネル、および活 性部位の少なくとも１個のアミノ酸残基付近で正に荷 電した表面領域を含んでなる、請求の範囲第１項記載のセルラーゼ変異体。 14．メチオニン、トリプトファン又はチロシンが、セリン、アスパラギン、グ ルタミン、プロリン、フェニルアラニン、グルタミン酸、アルギニン又はグリシ ンにより置換されている、請求の範囲第13項記載のセルラーゼ変異体。 15．親セルラーゼが微生物セルラーゼである、請求の範囲第１〜14項のいずれ か１項に記載のセルラーゼ変異体。 16．親セルラーゼが、ヘンリサット（Henrissat）、Ｂ等：Biochem.J.（1993 ），293，p.781-788 に記載されている如き科45に分類されるセルラーゼから選 択される、請求の範囲第15項記載のセルラーゼ変異体。 17．親セルラーゼが、トリコデルマ（Trichoderma）、マイセリオフォトラ（M yceliophthora）、ペニシリウム（Penicillium）、イルペックス（Irpex）、ア スペルギルス（Aspergillus）又はフサリアム（Fusarium）から由来するもので ある、請求の範囲第16項記載のセルラーゼ変異体。 18．親セルラーゼが、フミコラ インソレンス（Humicola insolens）の菌株 から由来するものである、請求の範囲第17項記載のセルラーゼ変異体。 19．親セルラーゼがＨ．インソレンス(insolens)エンドグルカナーゼである、 請求の範囲第18項記載のセルラーゼ変異体。 20．親セルラーゼが、Ｈ．インソレンス(insolens)43kDエンドグルカナーゼ又 はその相同体である、請求の範囲第19項記載のセルラーゼ変異体。 21．連結領域の１個又は複数のアミノ酸残基が次の如く； V221S，T，P N222S，T，P Q223S，T，P V240S，T，P Q241S，T，P 置換されている、請求の範囲第20項記載のセルラーゼ変異体。 22．１個又は複数のアミノ酸残基が次の如く； V221S ＋N222S ＋Q223T および／または V240P ＋Q241P 置換されている、請求の範囲第21項記載のセルラーゼ変異体。 23．連結領域の１個又は複数のアミノ酸残基が欠失している、請求の範囲第20 項記載のセルラーゼ変異体。 24．セルロース結合領域(CBD) の１個又は複数のアミノ酸残基が次の如く； E251S，Q，N，P R252L，Q，H V268E A269E，R T265R，E W253Y，E A254S，D，G Q255E，R，K W261R，Y，F S262A，N，D T274R K275R，Q 1276D，Q，N N277Q，D D278P W279Y，F Y280W，F H281S Q282N，R Y280F ＋ Q282N 置換されている、請求の範囲第20項記載のセルラーゼ変異体。 25．43KDエンドグルカナーゼの触媒活性ドメイン(CAD) の次の領域； 領域 残基 I 2− 21 II 44− 48 III 55− 60 IV 65− 67 V 72− 75 VI 95−103 VII 109−123 VIII 128−136 IX 142−148 X 175−185 の１個又はそれ以上において、又は科45において分類される相同セルラーゼ中の それに対応する１個はそれ以上領域において、１個又は複数のアミノ酸残基の置 換により改質されている、請求の範囲第20項記載のセルラーゼ変異体。 26．該活性部位クレフトの表面コンホメーションが、次の位置 4，5，6，7，8 ，10，11，12，13，15，18，20，21，44，45，48，74，82，90，110，114，117 ，119，121，128，131，132，147，176， 178 または179 において、１個又は複数のアミノ酸残基を置換することによって 変化している、請求の範囲第25項記載のセルラーゼ変異体。 27．柔軟性ループ領域の水素結合特性が、次の位置111，112，113，114，115 ，116，117，118 又は119 の１個又は複数において、１個又は複数のアミノ酸残 基を置換することによって変化している、請求の範囲第25項記載のセルラーゼ変 異体。 28．（１又は複数の）該チャンネルの表面コンホメーションが、次の位置 9， 14，28，37，55，58，59，60，63，72，73，78，109，118，123，129，131，132 ，133，136，142，145，146，158，163，176，179，186又は196 の１個はそれ以 上において、１個又は複数のアミノ酸残基を置換することによって変化している 、請求の範囲第25項記載のセルラーゼ変異体。 29．正に荷電した表面領域の正の静電荷が、次の位置 2，13，20，44，65，66 ，67，90，95，96，100，102，103，175，176，178，180，183又は185 において 、１個又は複数のアミノ酸残基を置換することによって変化せしめられている、 請求の範囲第25項記載のセルラーゼ変異体。 30．クレフトの負の電荷が、次の位置 55，74，90 又は123 の1又はそれ以上 において、１個又は複数のアミノ酸残基を置換することによって変化している、 請求の範囲第25項記載のセルラーゼ変異体。 31．１個又は複数のアミノ酸残基が次の如く； D2N S5A T6S Y8F W9S，G D10E K13R S15N，A，D W18H K20R V28T R37N，S，A K44R S45N，D，A E48D，Q，A S55E，D D58N，S，A Q59S，A，G N65R D66R，N D67R，N A74D，N，S Y90F S96R A100R K102R K103R S110N，A，D T111G，A，S G112A G113A L115I，V，F，H，T，N，Q，G G116A S116G，A，D，E，N，Q N118G，A，S，D，R H119Q，K S123D，E，Y K175R N179D，H，A S185R，K C11A＋ C135A C12A＋ C47A R37N＋ D58A 置換されている、請求の範囲第25〜30項のいずれか１項に記載のセルラーゼ変異 体。 32．アニオン界面活性剤に対するセルラーゼ変異体の感受性を減少させるため 、CAD の表面上の１個又は複数アミノ酸残基が、次の位置37，62，63，78，118 ，129，131，133，136，142，146，158，163，175，176，179，186又は196 の１ 又はそれ以上において置換されている、請求の範囲第25項記載のセルラーゼ変異 体。 33．１個又は複数のアミノ酸残基が次の如く； R37N，S，A W62E，F A63D，T，R A78D N118D V129D，T，S I131L，V，T，N，Q，H，G D133Q T136D L142D，T，S R146E，Q，S R158D L163N N176D N179D N186D R196D 置換されている、請求の範囲第32項記載のセルラーゼ変異体。 34．アニオン界面活性剤に対するセルラーゼ変異体の感受性を減少させるため 、１個又は複数のアミノ酸が次の如く； A78P A162P K175G，S 置換されている、請求の範囲第20項記載のセルラーゼ変異体。 35．酸化又は漂白剤の存在に対するセルラーゼ変異体の感受性を減少させるた め、１個又は複数のアミノ酸残基が、次の位置 8，9，18，62，104又は147 の１ 又はそれ以上において置換されている、請求の範囲第25項記載のセルラーゼ変異 体。 36．１個又は複数のアミノ酸が次の如く； Y8F W9F，H，S，A W18H，F，A W62F，E M104S，N，Q Y147F，H，S，Q，N，E，D 置換されている、請求の範囲第35項記載のセルラーゼ変異体。 37．親セルラーゼが細菌セルラーゼである、請求の範囲第21〜24項のいずれか １項に記載のセルラーゼ変異体。 38．親セルラーゼか、シュードモナス（Pseudomonas）又はバシラ ルータス （Bacillus lautus）セルラーゼである、請求の範囲第３７項記載のセルラーゼ 変異体。 39．請求の範囲第１〜38項のいずれか１項に記載のセルラーゼ変異体を含んで なる洗剤組成物。 40．セルラーゼ変異体が、洗浄溶液１ｌ当たりセルラーゼタンパク質 0.001− 100mg の洗浄液体の濃度に相当する濃度で存在する、請求の範囲第39項記載の洗 剤組成物。 41．洗剤組成物が粉末組成物である、請求の範囲第39項記載の洗剤組成物。 42．洗剤組成物が、強力粉末組成物である、請求の範囲第41項記載の洗剤組成 物。 43．洗剤組成物が、圧縮強力粉末組成物である、請求の範囲第42項記載の洗剤 組成物。 44．洗剤組成物が液体組成物である、請求の範囲第39項記載の洗剤組成物。 45．液体組成物が、強力液体組成物である、請求の範囲第44項記載の洗剤組成 物。 46．液体組成物がコンパクト強力液体組成物である、請求の範囲第45項記載の 洗剤組成物。 47．プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、エステラーゼ、セルラーゼ 、エンドグルカナーゼ タイプII、オキシダーゼおよびアミラーゼから選ばれる １種又は複数の酵素を更に含んでなる、 請求の範囲第39項記載の洗剤組成物。