JPH0912468A - 新規物質ｄｑ９０ｃ、その製造方法及び該ｄｑ９０ｃを含有する神経細胞突起再生因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 低分子で神経細胞突起再生作用を示す物質を
提供する。 【構成】 式（Ｉ）で示される新規物質ＤＱ９０Ｃ，そ
の製造方法ならびに当該物質を有効成分とする神経細胞
突起再生因子。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規物質ＤＱ９０Ｃ、
その製造方法及びＤＱ９０Ｃを有効成分とする神経細胞
突起再生因子に関する。

【従来の技術】神経成長因子（以下、ＮＧＦと称する）
は知覚および交感神経の分化・成長・機能維持に必要な
分子量１４万のポリペプチドである。このＮＧＦはα、
β、γの３種類のサブユニットから成るが、このうちβ
サブユニットは単独でＮＧＦ活性を発現するため、β−
ＮＧＦとも呼ばれている。ＮＧＦには、神経突起を伸ば
す作用、神経伝達物質の産生を調節する作用があり、老
動物の神経細胞に対して再生作用を示すことが試験管内
で証明されており、［エイジ、８巻、１９頁（１９８
５）］、このような作用があることから、近年、抗痴呆
薬として注目されているものの１つである。しかしなが
ら、ＮＧＦはその分子の大きさが障害となって、脳血液
関門を通過することができず、外部投与の治療剤とはな
り得ない。一方、ラット副腎髄質褐色細胞腫よりクロー
ン化された株細胞であるＰＣ−１２細胞は、ＮＧＦを添
加することにより、増殖を停止し、神経突起をもつ細胞
へと分化することが知られている。このため、ＰＣ−１
２細胞は神経分化のモデル系としてよく利用されてい
る。この細胞を用いてＮＧＦの他に、線維芽細胞成長因
子やインターロイキン６も突起の伸長を誘導することが
調べられたが、最近、微生物由来の低分子物質スタウロ
スポリン［神経化学、２６巻、２００頁（１９８７）］
や、ラクタシスチン（ＯＭ−６５１９物質）［lactacys
tin : S. Omuraら、J. Antibiotics、４４巻、１１３頁
（１９９１）］、［S. Omuraら、J. Antibiotics、４４
巻、１１７頁（１９９１）］、特開平３−９８５９４号
公報にも同様にＰＣ−１２細胞の神経突起の伸長をもた
らすことが示されている。これら以外にも、Neuro ２Ａ
細胞に対して神経突起伸長作用をもつＰＳ−９９０物質
［S. Toki ら、J. Antibiotics、４７巻、１１７５頁
（１９９４）］などの物質も示されているが、ＤＱ９０
Ｃ物質はこれらの既知化合物とは分子式が異なり明確に
区別される。

【０００２】また、本発明による新規物質ＤＱ９０Ｃと
構造が類似する化合物としては、蛋白質分解酵素阻害剤
であるチロスタチン［tyrostatin : K.Odaら、Agric. B
iol.Chem.、５３巻、４０５頁（１９８９）］がある
が、当該物質のＰＣ−１２細胞神経突起再生活性に関し
ての記述はなされておらず、またＤＱ９０Ｃ物質とは分
子式が異なり明確に区別される。同様の蛋白質分解酵素
阻害剤としてＰＣ−１２細胞に対するＮＧＦ効果増強作
用を示すロイペプチンアナログのＡｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ
−Ｎｌｅ−ａｌ［Y.Saito ら、Neuroscience Letters、
８９巻、１０２頁（１９８８）］等も示されているが、
ＤＱ９０Ｃ物質はこれらの既知化合物とは分子式が異な
り明確に区別される。抗痴呆薬としての利用を考えた場
合、脳血液関門を通過しうる分子サイズ（低分子）で、
より毒性が低く、より低濃度で神経細胞突起再生作用を
示す物質を提供することは、ヒトの医療上また社会問題
の解決策として極めて重要なことである。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、低分子で神
経細胞突起再生作用を示す物質を提供することを目的と
する。

【課題を解決するための手段】本発明者等は、ストレプ
スミセス属に属する１菌株の培養液中から神経細胞突起
再生活性を有する新規物質ＤＱ９０Ｃを単離し、本発明
を完成した。本発明は、式（Ｉ）で示される新規物質Ｄ
Ｑ９０Ｃを提供する。

【０００４】

【化２】

【０００５】本発明は、又、上記化合物ＤＱ９０Ｃを有
効成分とする神経細胞突起再生因子を提供する。本発明
は、又、ストレプトミセス属に属するＤＱ９０Ｃ物質生
産菌を培養し、培養物からＤＱ９０Ｃ物質を採取するこ
とを特徴とするＤＱ９０Ｃ物質の製造方法を提供する。
本発明のＤＱ９０Ｃ物質生産菌としては、ストレプトミ
セス属に属し、ＤＱ９０Ｃ物質生産能を有するものであ
ればいずれでも使用できる。具体的には、ストレプトミ
セス ハルステデイ（ Streptmyces halstedii ）２７
２３−ＳＶ２株（以下「ＤＱ−９０株」という）が有利
に使用できる。ＤＱ−９０株 ＤＱ９０Ｃ物質生産能を有するストレプトミセス属の菌
株として本発明者等の見い出しているＤＱ−９０株は下
記の内容のものである。

【０００６】１）由来及び寄託番号 ＤＱー９０株は、静岡県箱根峠で採取した土壌試料より
分離された放線菌であり、平成７年６月１３日に工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託されて「微工研寄託第
５１３５号」（ＦＥＲＭ ＢＰ−５１３５）の番号を得
ている ２）菌学的性状 ＤＱ−９０株の菌学的性状は以下の通りである。放線菌
ＤＱ−９０株の特徴づけは、「特許庁産業別審査基準」
の記載方法に従って行なった。本菌株の基生菌糸は分断
しない。気菌糸は主軸を形成し、それより不規則に分枝
した先端に、１０〜５０個又はそれ以上からなる直状又
は曲状の胞子鎖を形成する。この胞子鎖は鳥の巣状（ne
st-like ）の密集塊を形成する。胞子は非運動性で、円
柱形あるいは長楕円形を呈し、幅0.３〜0.５μｍ、長さ
1.０〜1.２μｍで、胞子表面は平滑である。菌核、胞子
のう、その他の特殊形態は観察されない。細胞壁化学型
はＩ型で、ＬＬジアミノピメリン酸を含んでいる。培養
性状を表１に示す。集落表面の菌叢色は灰色系列に属す
る。裏面色は不鮮明色を呈し、ｐＨで変化しない。拡散
性色素は淡橙色から明茶味灰色が認められた。

【０００７】

【表１】 表１ 培養性状 培地 集落表面の菌叢色 集落の裏面色 拡散性色素 シュクロース・ 気菌糸なし 明茶味灰色 なし硝酸塩寒天 （３ec） グルコース・アス 灰色系列 明茶色 淡橙色パラギン寒天 （２fe） （４le〜４ni） （４ea) グリセリン・アス 灰色系列 明茶味灰色 明茶味灰色パラギン寒天 （２fe） （４ge） （４ec） 無機塩・スターチ寒天 灰色系列 明茶味灰色 なし （５fe） （４ge） チロシン寒天 灰色系列 淡黄味茶色 なし （ｃ〜ｄ） （３gc〜３le） 栄養寒天 気菌糸なし 淡黄色 なし （２db） イースト・麦芽寒天 灰色系列 赤味茶色 淡茶色 （５fe） （６le〜６li) （４gc） オートミール寒天 灰色系列 明茶色から茶色 明茶味灰色 （５fe） （４lg〜４ni) （５ec） ＊（ ）内はカラー・ハーモニー・マニユアル（コンテナー・コポレーション ・オブ・アメリカ、1950）の色標コード。 生理的性状を表２に示す。本菌株は、中温性で炭素源の
同化能はグルコース、アラビノース、キシロース、フラ
クトースを利用する。本菌株の形態的性状と細胞壁化学
型から、ストレプトミセス（ Streptmyces、以後Ｓ．と
略す。）属に位置する。

【０００８】

【表２】 表２ 生理的性状 生育温度範囲 ２０〜３７℃ 最適温度 ２０〜３０℃ メラニン様色素 チロシン寒天 − ペプトン・イースト鉄寒天 ± トリプトン・イースト・ブロス − スターチの加水分解 ＋ ゼラチンの液化 − 脱脂粉乳のペプトン化 − 脱脂粉乳の凝固 ＋ 硝酸塩の還元 ＋ 炭素源の同化 Ｄ−グルコース ＋ Ｌ−アラビノース ＋ Ｄ−キシロース ＋ Ｄ−フラクトース ＋ シュクロース ＋ Ｌ−ラムノース − ラフィノース − ｉ−イノシトール − Ｄ−マンニット −

【０００９】上述の諸性状を基に「細菌名承認リスト、
１９８０」およびそれ以後の有効名リストに記載された
Ｓ．属の種について検索し、近縁種を選出した。Ｓ．ニ
グリファシエンス（S. nigrifaciens ）の診断的性状を
選択すると本菌株とＳ．ニグリファシエンス（S.nigrif
aciens）の性状は炭素源の同化能に僅かな違いがある
が、その他はよく一致している（表３）。しかしながら
Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Vol.
4 において、 Williams 等はＳ．ニグリファシエンスを
Ｓ．ハルステデイ（S.halstedii)の異名（シノニム）と
している。従って本菌株２７２３−ＳＶ２は、ストレプ
トミセス ハルステデイ（Streptmyceshalstedii ）２
７２３−ＳＶ２株と称する。

【００１０】

【表３】 表３ 本菌株と近縁種との比較 本菌株 ストレプトミセス ストプトミセス 2732−SV2 ニグリファシエンス ハルステディ 胞子鎖形態 直・曲状 ＋ ＋ ＋ 胞子表面 平滑 ＋ ＋ ＋ 菌叢色 灰色 ＋ ＋ ＋ 裏面色 不鮮明色 ＋ ＋ ＋ ｐＨ感受性 − − − 拡散性色素産生 ＋ ＋ − ｐＨ感受性 − − − メラニン色素産生 − − − スターチの加水分解 ＋ ＋ ＋ 硝酸塩の還元 ＋ ＋ ＋ 生育温度 ｌ０℃ − − − ３７℃ ＋ ＋ ＋ ４５℃ − − − 炭素源の同化 アラビノース ＋ ＋ ＋ キシロース ＋ ＋ ＋ イノシトール − − − マンニット − ＋ − ラムノース − − − ラフィノース − − − シュクロース ＋ − −

【００１１】ＤＱ９０Ｃ物質生産菌の培養法 ＤＱ９０Ｃ物質は、ストレプトミセス属に属するＤＱ９
０Ｃ物質生産菌を適当な培地で好気的に培養し、培養物
から目的物を分離・精製することによって製造すること
ができる。培地は、通常の微生物が利用しうる栄養物を
含有する物である。栄養源としては、従来放線菌の培養
に利用されている公知のものが使用できる。具体的に
は、炭素源としてはグルコース、水飴、デキストリン、
澱粉、糖蜜、油脂類などが使用できる。また、窒素源と
しては大豆粉、小麦胚芽、綿実粕、コーンスティプリカ
ー、肉エキス、ペプトン、酵母エキスなどの有機物なら
びに硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、などの無機
物が使用できる。その他必要に応じて、ナトリウム、カ
リウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、
燐酸、硫酸及びその他のイオンを生成することができる
無機塩類を添加することができる。また、菌の発育を助
け、ＤＱ９０Ｃ物質の生産を促進するような有機および
無機物を適当に添加することができる。

【００１２】培養方法としては、一般に行なわれている
抗生物質の生産方法と同じく、好気的液体培養法が最も
適している。培養に適当な温度は、２０〜３０℃である
が、多くの場合２７℃付近で培養する。ＤＱ９０Ｃ物質
の生産は培地や培養温度により異なるが、液体培養にお
いては通常１〜３日間でその蓄積が最高に達する。この
ようにしてＤＱ９０Ｃ物質が蓄積した培養物から目的物
質を単離精製する。ＤＱ９０Ｃ物質の精製方法 本発明によって得られるＤＱ９０Ｃ物質の培養物からの
採取に当たっては、その性状を利用した通常の分離手
段、例えば濾過、遠心分離、透析、濃縮、乾燥、凍結、
吸着、脱着、各種有機溶媒に対する溶解度の差を利用す
る方法、クロマトグラフィー等の手段を、単独でまたは
適宜組み合わせて抽出精製することができる。例えば、
合成吸着剤ＨＰ−２０（三菱化学社製）、ＯＤＳカラム
クロマトグラフィーやＭＰＬＣ、ＨＰＬＣを適宜組み合
わせて実施することができる。このようにして得られた
ＤＱ９０Ｃ物質は下記の物理化学的性状を有するもので
あり、各種スペクトルデータの解析の結果、前記式
（Ｉ）で示される化学構造を有することがわかった。

【００１３】物理化学的性状 （１）外観 ：白色粉末 （２）融点 ：１５２〜１５４℃ （３）分子式 ：Ｃ₂₈Ｈ₃₇Ｎ₃ Ｏ₅ （４）高分解能マススペクトル（ｍ／ｚ） ：４９6.２８１７（Ｍ＋Ｈ）⁺ 実測値 ：４９6.２８１３ 計算値 （５）比旋光度 ：−１2.０。（ｃ＝0.０２５、メタノール） （６）溶解性 ：メタノール、ジメチルスルホキシドに可溶で、 水、クロロホルムに不溶である。 （７）紫外吸収スペクトル λ max nm （メタノール中） ：２６０（１０００），２６９（１４００）， ２７８（１５００）

【００１４】 （８）赤外吸収スペクトル（ＫＢｒディスク法）図１に示す。 ：３２７７，２９６０〜２８５０，１７３６， １６３５，１５４０〜１４４０，１３８８， １２１６（cm^-1） （９） ¹Ｈ ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ，重ジメチルスルホキシド） 図２に示す。 （10）¹³Ｃ ＮＭＲスペクトル（１２５ＭＨｚ，重ジメチルスルホキシド） 図３に示す。

【００１５】ＤＱ９０Ｃ物質の生物活性 本発明によるＤＱ９０Ｃ物質のラット副腎髄質細胞腫Ｐ
Ｃ−１２細胞に対する神経突起再生作用について述べ
る。まず、ＰＣ−１２細胞を１０％牛胎児血清を含有す
るダルベッコ変法イーグル培地中、常法に従い、３７
℃、５％炭酸ガス雰囲気下でセミコンフルエントの状態
まで生育させた。次いでこれを、５０ｎｇ／ｍｌＮＧＦ
ならびに３％牛胎児血清を含有するダルベッコ変法イー
グル培地中に１／２〜１／５細胞濃度、好ましくは１／
４細胞濃度で継代し、３７℃、５％炭酸ガス雰囲気下で
２４時間培養した。続いてこのＮＧＦ処理した細胞を、
１％牛胎児血清を含有するダルベッコ変法イーグル培地
中に懸濁して、２４穴コラーゲンコートプレートにまき
こみ、サンプルを添加した。２４時間後に細胞の形態変
化を顕微鏡で観察して評価した。

【００１６】その結果、ＤＱ９０Ｃ物質のＰＣ−１２細
胞に対する神経突起再生作用活性有効濃度は、0.０５〜
0.５μｇ／ｍｌであった。本発明のＤＱ９０Ｃ物質はラ
ット副腎髄質細胞腫ＰＣ−１２細胞に対する神経突起再
生作用を有することから、神経障害の治療剤、例えば抗
痴呆薬として有用であると考えられる。

【発明の効果】本発明によれば、神経突起再生作用を有
し、神経障害の治療剤、例えば抗痴呆薬として有用な新
規化合物ＤＱ９０Ｃを提供することができた。次ぎに実
施例により本発明を説明する。

【００１７】

【実施例】実施例１ １）種母１の調製 使用した培地は、下記の組成の成分を１リットルの水に
溶解してｐＨ7.２に調整したものである。 可溶性澱粉 １0.０ｇ モラセス １0.０ｇ ポリペプトン １0.０ｇ 肉エキス １0.０ｇ 上記培地１５ｍｌを大試験管に分注し、殺菌後、ストレ
プトミセス ハルステデイ ２７２３−ＳＶ２株（以下
ＤＱ−９０株）をスラントより１白金耳接種し、２７℃
にて１日間振とう培養したものを種母１とした。

【００１８】２）種母２の調製 使用した培地は、下記の組成の成分を１リットルの水に
溶解してｐＨ7.０に調整したものである。 グリセリン ２0.０ｇ モラセス １0.０ｇ カゼイン 5.０ｇ ポリペプトン 1.０ｇ 炭酸カルシウム 4.０ｇ 上記培地１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコ（７
本）に分注し、殺菌後、これに前記種母１（各１ｍｌ）
を接種し、２７℃にて１日間振とう培養した。 ３）培養 使用した培地は、２）で示したものである。この培地２
７リットルを５０リットル容ジャーファーメンターに入
れ、殺菌後、これに前記種母２（全７本）を接種し、攪
拌速度２００ｒｐｍ．通気量３０リットル／分条件下で
２７℃にて１日間通気撹拌培養した。

【００１９】４）ＤＱ９０Ｃ物質の精製 上記条件で培養後、培養液８０リットルを遠心分離して
得た培養上清を、「ダイヤイオンＨＰ−２０」（三菱化
学社製）カラムに吸着させた。これを水、続いて３０％
メタノールで洗浄後、７０％メタノールを通し、得られ
た７０％メタノール溶液を濃縮乾固した。このようにし
て得た粗活性画分を MPLC LiChroprep C18 (MERCK社
製）カラムに供し、ＤＱ９０Ｃ物質を含む画分を得た。
さらにこの画分を濃縮後、HPLC TSKgel-80TM ODS (TOS
OH社製）カラムによって、ＤＱ９０Ｃ物質３ｍｇを得
た。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＤＱ９０Ｃ物質の赤外吸収スペクトルである。

【図２】ＤＱ９０Ｃ物質の重ジメチルスルホキシド溶液
中での５００MHz ¹ Ｈ ＮＭＲスペクトルである。

【図３】ＤＱ９０Ｃ物質の重ジメチルスルホキシド溶液
中での１２５MHz ¹³Ｃ ＮＭＲスペクトルである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:465） Ｃ０７Ｍ 7:00 (72)発明者 柘植 信昭 大阪府東大阪市御厨栄町１丁目５番７号 ハウス食品株式会社内 (72)発明者 平尾 宜司 大阪府東大阪市御厨栄町１丁目５番７号 ハウス食品株式会社内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式（Ｉ）で示される新規物質ＤＱ９０
   Ｃ。 【化１】
2. 【請求項２】 請求項１記載の化合物ＤＱ９０Ｃを有効
   成分とする神経細胞突起再生因子。
3. 【請求項３】 ストレプトミセス属に属するＤＱ９０Ｃ
   物質生産菌を培養し、培養物からＤＱ９０Ｃ物質を採取
   することを特徴とするＤＱ９０Ｃ物質の製造方法。