JPH10113197A - 高分子量ヒアルロン酸もしくはその塩の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】これまでの方法に比べて容易にかつ安定して高
分子量ヒアルロン酸もしくはその塩を取得できる製造法
を提供すること。 【解決手段】微生物を用いてヒアルロン酸もしくはその
塩を生産する際にアミノ態窒素を０．０５％（％は重量
（ｇ）／容量（ｄｌ）％）以下含有する培地で培養し、
培養液中に高分子量ヒアルロン酸もしくはその塩を蓄積
させ、該培養液を１０℃以下の温度で分離精製処理する
ことを特徴とする高分子量の、好ましくは分子量３００
万以上の高分子量ヒアルロン酸もしくはその塩の製造法
である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、医薬、化粧品等広
範囲に利用される高分子量ヒアルロン酸もしくはその塩
を微生物による発酵法で製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒアルロン酸もしくはその塩はその分子
量により特有の生理作用を有する。このため化粧品、医
薬品等の分野でその目的にあった分子量のヒアルロン酸
もしくはその塩が使用されている。近年、特に医薬向け
のヒアルロン酸もしくはその塩には平均分子量２５０万
以上、好ましくは３００万以上のものが使用されるよう
になってきている。ヒアルロン酸もしくはその塩の工業
的規模での製造法は、抽出法と発酵法とに大きく分けら
れる。前者すなわち抽出法では高分子量ヒアルロン酸も
しくはその塩が得られるもののその操作が煩雑であり、
一方後者の発酵法は前者に比べ操作は簡単であるものの
高分子量のものが得られにくいという欠点がある。

【０００３】これまで発酵法による高分子量のヒアルロ
ン酸もしくはその塩の製造法はヒアルロン酸生産株を変
異処理してヒアルロニダーゼ非生産性にした微生物を培
地に培養する方法（特開昭６０−１３３８９４号公報，
特開昭６２−２５７３９３号公報、特開平６−３１９５
８０号公報）、培養時のｐＨをアルカリ側に調整して高
分子量ヒアルロン酸もしくはその塩を製造する方法（特
開昭６３−２８３９８号公報）、培地の炭素源としてグ
ルコースのほかにフルクトースを添加して培養する方法
（特開平６−３１９５７９号公報）やウリジンを添加し
て培養する方法（特開平６−３１９５８０号公報）が提
案されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明はこれまでの方
法に比べて容易にかつ安定して高分子量ヒアルロン酸も
しくはその塩を取得できる製造法を提供することを目的
とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】この目的を達成するため
の本発明の手段は、ヒアルロン酸生産菌を培養する際
に、窒素源として使用するアミノ態窒素の濃度を低濃度
に維持することによりその菌が有するヒアルロニダーゼ
様活性を抑制し、それにより培養段階で高分子量のヒア
ルロン酸もしくはその塩を製造し、ついで該培養液を１
０℃以下の温度で精製処理して、分子量２５０万以上、
好ましくは３００万以上の高分子量ヒアルロン酸もしく
はその塩を製造するものであり、本発明でいう高分子量
とは、分子量２５０万以上、好ましくは３００万以上を
いう。

【０００６】本発明に使用するヒアルロン酸生産菌とし
ては、ヒアルロン酸生産能を有する微生物であればとく
に制限はなく、ストレプトコッカス属、例えばストレプ
トコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ス
トレプトコッカス・エクイシミリス(Streptococcus equ
isimilis)、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcu
s equi)、ストレプトコッカス・デイスガラクテイエ(St
reptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ズ
ーエピデミカス(Streptococcus zooepidemicus)等を挙
げることができる。

【０００７】本発明で培地に添加する窒素源としては、
通常、微生物培養に使われる有機体窒素源、例えば酵母
エキス、肉エキス、ポリペプトン、大豆ペプトン等であ
れば特に制限はない。また、添加される窒素源の濃度
は、アミノ態窒素換算で０．０５％（以下、％はことわ
りのない限りすべて重量（ｇ）／容量（ｄｌ）％を表
す）以下、好ましくは０．０１％〜０．０４％である。

【０００８】本発明に用いる培地の窒素源を除いた培地
成分はヒアルロン酸生産菌を培養するのに通常用いられ
る培地を用いればよく、例えばグルコース３．０％、リ
ン酸１カリウム０．３％、リン酸２カリウム０．２％、
チオ硫酸ナトリウム０．０１％、硫酸マグネシウム７水
塩０．０１％、亜硫酸ナトリウム０．００２％、塩化コ
バルト０．００１％、塩化マンガン０．００１％を含む
成分でｐＨ６．０〜８．５に調整されたものを用いるこ
とができる。

【０００９】本発明の培養では通気攪拌培養や振盪培養
のいずれを用いてもよく、また、培養温度は２０℃〜４
０℃、好ましくは３０℃〜３８℃である。

【００１０】培養時間は２０時間〜３０時間であり、培
養液の粘度上昇がみられなくなった時点で培養を停止
し、得られた培養液を１０℃以下の温度で分離精製処理
することにより、目的の高分子量のヒアルロン酸もしく
はその塩が得られる。該塩としては、ナトリウム塩、カ
リウム塩が一般的である。なお、本発明で分離精製処理
とは、得られた培養液を遠心分離等により菌体を除去し
たのち、その上澄み液にエタノール等の貧溶媒を添加し
てヒアルロン酸もしくはその塩を析出、沈殿させる処理
のことをいい、該分離精製処理を１０℃以下の温度で行
うものである。

【００１１】

【実施例】以下にその実施例を示す。ヒアルロン酸もし
くはその塩の分子量は極限粘度を薬局方粘度測定法また
は粧原基粘度測定法第１法によって測定し、その数値を
用いて下記の式より算出した値である。 ［η］＝０．０００４０３ ｘ Ｍ ^0.775 ［η］： 極限粘度（ｄｌ／ｇ） Ｍ ： 分子量（ダルトン）

【００１２】実施例１、比較例１〜３ 炭素源としてブドウ糖２．０％、窒素源はアミノ態窒素
量として酵母エキスを、その他の塩類として、リン酸１
カリウム０．３％、リン酸２カリウム０．２％、チオ硫
酸ナトリウム０．０１％、硫酸マグネシウム７水塩０．
０１％、亜硫酸ナトリウム０．００２％、塩化コバルト
０．００１％、塩化マンガン０．００１％および消泡剤
として大豆油０．０２％を添加した培地に、ストレプト
コッカス・ズーエピデミカス ＦＥＲＭＢＰ８７８（微
工研条寄 第８７８号）を接種し、ｐＨを６．０〜８．
５になるように調製しながら、温度３７℃で培養した。
培養終了後、該培養液を１０℃以下に冷却し、遠心分離
により菌体を除去したのち、その上澄みを１０℃以下に
冷却したエタノールで２回沈殿処理するという精製処理
を行い、最後に沈殿を２０℃で真空乾燥して、表１記載
の分子量を有する精製ヒアルロン酸のナトリウム塩を得
た。また、比較例１〜３として、比較例１は精製処理の
温度を２５℃とする以外は実施例１に準拠して、比較例
２はアミノ態窒素の添加量を０．１０５％とし、精製処
理温度を２５℃とする以外は実施例１に準拠して、比較
例３はアミノ態窒素の添加量を０．１７５％とし、精製
処理温度を２５℃とする以外は実施例１に準拠して、表
１に記載の分子量を有する精製ヒアルロン酸のナトリウ
ム塩のそれぞれを得た。

【００１３】

【表１】

【００１４】

【発明の効果】本発明の製造法によれば、ヒアルロン酸
発酵時に低濃度のアミノ態窒素を添加して培養し、つい
で該培養液を１０℃以下の温度で精製処理することによ
り、高分子量のヒアルロン酸もしくはその塩を容易にか
つ安定して製造することができる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】微生物を用いてヒアルロン酸もしくはその
   塩を生産する際にアミノ態窒素を０．０５％（％は重量
   （ｇ）／容量（ｄｌ）％）以下含有する培地で培養し、
   培養液中に高分子量ヒアルロン酸もしくはその塩を蓄積
   させ、ついで該培養液を１０℃以下の温度で分離精製処
   理することを特徴とする高分子量ヒアルロン酸もしくは
   その塩の製造法。
2. 【請求項２】得られるヒアルロン酸もしくはその塩の分
   子量が３００万以上である請求項１記載のヒアルロン酸
   もしくはその塩の製造法。
3. 【請求項３】微生物がストレプトコッカス・ピオゲネス
   (Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・エク
   イシミリス(Streptococcus equisimilis)、ストレプト
   コッカス・エクイ(Streptococcus equi)、ストレプトコ
   ッカス・デイスガラクテイエ(Streptococcus dysgalact
   iae)、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス(Strepto
   coccus zooepidemicus)のなかから選ばれた１種以上で
   ある請求項１記載の高分子量ヒアルロン酸もしくはその
   塩の製造法。
4. 【請求項４】アミノ態窒素が微生物、植物もしくは動物
   由来の物質である請求項１記載の高分子量ヒアルロン酸
   もしくはその塩の製造法。