JPS5816877B2 - アシラ−ゼオモチイタｌ−アミノサンノセイゾウホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は５０℃以上でＮ−アシル−ＤＬ−アミノ酸を不
斉加水分解し、雑菌に侵されることなく、Ｌ−アミノ酸
を得る方法に関するものである。

Ｎ−アシル−ＤＬ−アミノ酸の光学分割に関しては、従
来より種々の方法が知られているが、アシラーゼを用い
て不斉加水分解する方法が収率及び純度の点で最も優れ
ており工業的にも確立されている。

従来、Ｎ−アシル−ＤＬ−アミノ酸の不斉加水分解酵素
としては豚腎臓アシラーゼ、糸状菌アシラーゼ、酵母ア
シラーゼ、細菌アシラーゼ等が知られている。

しかしながら、従来知られたアシラーゼはいずれも３７
〜３８℃に作用活性を有し、工業的にも又実験室的にも
３７℃〜３８℃の温度で分解を行っている為、工業的に
大量処理した場合、細菌或は酵母等の雑菌の生育温度と
ほぼ一致し、反応中或は反応液が、これらの雑菌にしば
しば汚染され、分解収率の低下或は汚染された製品が出
来る等の重大な欠点があった。

一旦雑菌に汚染された製品は精製を続けても容易に菌体
分解物を取除くことができず、製造工程上の大きな難点
となるのである。

だからといって、従来のアシラーゼを、雑菌を防止でき
る温度である５０℃以上に高めた媒質中で反応させても
、このアシラーゼではたちまち失活してＮ−アシル−Ｄ
Ｌ−アミノ酸の不斉加水分解を行うことは不可能であっ
た。

本発明者らは、このような従来のアシラーゼの非耐熱性
の欠点を解決するために、全く新らしい見地から５０℃
以上で作用活性を有するアシラーゼを求めて長年研究を
続けた結果、ケトミウム属、ダクチロマイセス属、フミ
コーラ属、マルプラン力属、ムコール属、バプラスポラ
属、ペシロマイセス属、スポロトリウム属、タラロマイ
セス属、サーモアスカス属、サーモマイセス属、チェラ
ビア属、トルラ属、ビソクラミス属、クリソスポリウム
属、ギルマニエラ属、モナスカス属、チェラビア属のそ
れぞれに属する菌株が５０℃以上で活性を有するアシラ
ーゼを生産することを見出したのである。

本発明は、この知見から完成されたもので、これら各属
に属し、５０℃以上で活性を有するアシラーゼを生産す
る菌を培養し、得られた培養物、分離菌体、これらの処
理物または分離アシラーゼもしくはこれらの固定化物を
Ｎ−アシル−ＤＬ−アミノ酸に５０℃以上で作用させ不
斉加水分解し、該加水分解液よりＬ−アミノ酸を採取す
る方法である本発明における大きな特色は５０℃以上、
特に５０〜７０℃でＮ−アシル−ＤＬ−アミノ酸を不斉
加水分解することである。

このような高温下で不斉加水分解することによって、従
来、細菌、酵母等の雑菌によって汚染されていたＮ−ア
シル−ＤＬ−アミノ酸の不斉加水分解から全く雑菌の混
入を排除し、いちじるしい高純度のＬ−アミノ酸を製造
、製品化することに成功したものである。

本発明において、５０℃以上で活性を有するアシラーゼ
を生産する菌の具体例は次の通りである１（１） ケ
トミウム・サーモフィル・パル・コブロフイルＡＴＣＣ
２８０７６ （Ｃｈａｅｆｏｍｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ
ｖａｒ。

ｃｏｐｒｏｐｈｉ １ｅ） （２）ケトミウムパサーモフイル・パル・ディジタムＡ
ＴＣＣ２８０７７ （Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ ｖ
ａｒ。

ｄｉｓｓｉｔｕｍ） （３）ダクチロマイセス・クラスタセウスＩＭＩ １
０２４７１ ０２４７０（Ｄａｃｔｙｌｏ ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ
）（４） フミコーラ・インソレンスＡＪ６７５５Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−３１０５ （Ｈｕｍｉｃｏｌａ １ｎｓｏｌｅｎｓ ＡＪ ６７
５５）（５） マルプラン力・プルケラ・パル・サル
フレアＡＴＣＣ２８０７８ （Ｍａｌｂｒａｎｃｈｅａ ｐｕｌｃｈｅｌｌａ ｖａ
ｒ。

５ｕｌｆａｒｅａ） （６）ムコール・プシルスＩＦＯ４５７８（Ｍｕｃｏｒ
ｐｕｓｉｌｌｕｓ ） （７）バブラスポラ・サーモフイラ ＡＴＣＣ２８０７９ （Ｐａｐｕｌｏｓｐｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）
（８） ペシロマイセス・クラスタセウスＡＪ ６
８０９ ＦＥＲＭ Ｐ−３１０６ （Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓＡ
Ｊ６８０９） （９） スポロトリタム・サーモフィルＪ６６９３ ＦＥＲＭ Ｐ−３１０３ （Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ
ＡＪ ６６９３） （１０）タラロマイセス・エマ−ソニー ＡＴＣＣ２８０８０ （Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ ）０
υ サーモアスカス・オーランティアカスＡＴＣＣ２８
０８２ （Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ａｕｒａｎｉａｃｕｓ）（
１２） サーモマイセス・ラヌーギノーサスＡＴＣＣ
２８０８３ （Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）
０．３） チェラビア・アルボマイセスＡＴＣＣ２８
０８４ （Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ａｌｂｏｍｙｃｅｓ）０４）ト
ルラ・サーモフイラ ＡＴＣＣ２８０８５ （Ｔｏｒｕｌａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）０■ ビソ
クラミス・フルバＡＪ７５１４ＦＥＲＭ Ｐ−３１０７ （Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ ｆｕｌｖａ ＡＪ ７５
１４）（１６） クリソスポリウム・ルテウムＣＢＳ
２２７．６７ （Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ Ｉｕｔｅｕｍ）（Ｌ７
）ギルマニエラ・フミコーラＡＪ６７４３ＦＥＲＭ Ｐ
−３１０４ （Ｇｉｌｍａｎｉｅｌｌａ ｈｕｍｉｃｏｌａ ＡＪ
６７４３ ）０８）モナスカス・アンカＡＴＣＣ１６
３６０（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ａｎｋａ） （１９） チェラビア・セペドニウムＡＪ７７６６Ｆ
ＥＲＭ Ｐ’−３１０８ （Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｓｅｐｅｄｏｎｉｕｍＡＪ７７
６６）これらの高温活性アシラーゼ生産菌はアシラーゼ
生産のために、液体培地または固体培地によって培養さ
れる。

液体培地は通常通気撹拌培養によって行われ、固体培地
は通常皺固体培地で静置もしくは通気培地によって行な
われる。

培養は３０〜５０℃で、２〜７日間行うことによって多
量の高温活性アシラーゼが生産される。

例えば、皺固体培地では、これにｐＨ６或は、ｐＨ７の
０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液を添加、或は生育を良くす
る為に適当な培養源を添加し、殺菌後、高温活性アシラ
ーゼ生産菌の胞子及び菌糸を接種し３０〜５０℃で本培
養を行う。

培養が終了すれば、液体培養、固体培養のいずれでも高
温活性アシラーゼはほとんど菌体中に存在するので、そ
のままＮ−アシル−ＤＬ−アミン酸の不斉加水分解に使
用することも可能であるが、一般的には培養菌体にリン
酸緩衝液を加え、ワーリンダブレンダー等で粉砕し通常
の方法で酵素抽出液を得ることができる。

更にこれを粗酵素にする場合にはこの酵素抽出液にエタ
ノール、プロパツール、アセトン等の水溶性溶媒を或は
硫安等の無機塩類を添加し、塩析するなどして粗酵素を
得ることができる。

Ｎ−アシル−ＤＬ−アミノ酸の不斉加水分解に用いられ
るのは、一般にこの粗酵素であるが、この粗酵素は更に
精製して使用することもでき、またこれらを一般的手法
によって固定化して固定化酵素として使用することも可
能である。

ここに得られる高温活性アシラーゼの性質を示せば次の
通りである。

１６作 用 二Ｎ−アシルーＤＬ−アミノ酸に作用し
て不斉加水分解し、Ｌ− アミノ酸を生成する。

２、基質特異性二Ｎ−アシルーＬ−アミノ酸のみに作用
して分解し、Ｌ−アミノ 酸を生成するが、Ｎ−アシル− Ｄ−アミノ酸には作用しない。

３、至 適ｐＨ：ｐＨ５〜９において基質によく作用す
る。

４、安 定ｐＨ： ｐＨ５〜９において安定である。

５、作用温度：きわめて広い温度範囲で作用するが、５
０〜７５℃で強いアシ ラーゼ活性を有する点で特異的 である。

このようにして得られた培養物、分離菌体、これらの処
理物または分離アシラーゼもしくはこれらの固定化物は
Ｎ−アシル−ＤＬ−アミノ酸に５０℃以上、特に５０〜
７０℃で作用させ、雑菌に侵されることなく有効に不斉
加水分解することができる。

不斉加水分解反応は、５０℃以上、好ましくは５０〜７
０℃の加温下で、ｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ＝’７で
、２０分以上行なわれる。

不斉加水分解されるＮ−アシル−ＤＬ−アミノ酸として
は、Ｎ−アセチル−ＤＬ−グリシン、Ｎ−アセチル−Ｄ
Ｌ−アラニン、Ｎ−アセチル−ＤＬ−バリン、Ｎ−アセ
チル−ＤＬ−ロイシン、Ｎ−アセチル−ＤＬ−インロイ
シン、Ｎ−アセチル−ＤＬ−セリン、Ｎ−アセデル−Ｄ
Ｌ−スレオニン、Ｎ−アセチル−ＤＬ−システィン、Ｎ
−アセチル−ＤＬ−メチオニン、Ｎ−アセチル−ＤＬ−
アスパラギン酸、Ｎ−アセチル−ＤＬ−グルタミン酸、
Ｎ−アセチル−ＤＬ−リジン、Ｎ−アセチル−ＤＬ−ア
ルギニン、Ｎ−アセチル−ＤＬ−フェニルアラニン、Ｎ
−アセチル−ＤＬ−チロシンなどがあげられる。

本発明における５０℃以上で活性を有するアシラーゼの
活性測定においては、酵素液を０．５ Ｔｉ１１採取し
、基質として０．１Ｍ、Ｎ−アセチル−ＤＬ−フェニル
アラニン（ＣｏＣＩ２・６Ｈ２０を１０−”Ｍ含有）１
７７２６及びリン酸バッファー（ｐＨ７）１．５ｍｌの
反応液を７０℃３０分反応させ、生成したＬ−フェニル
アラニンをバイオアッセイで定量する。

ここにおいて、１単位＝１時間当り１μｍ ｍｏｌｅの
Ｌ−フェニルアラニンを生成する活性である。

次に本発明の実施例を示す。

実施例 １ ｆ！ａ３グにＴ）Ｉ７のリン酸緩衝液３．９Ｔｌｌを添
加し、１２０℃３０分殺菌する。

冷却後Ｙｅａｓｔ−８ｔａｒｃｈ斜面培地（Ｙｅａｓｔ
ｅｘｔ、 ４ ？ ： Ｋ２ＨＰＯ４１ｔ ；Ｍｇ５
ｏ、−７Ｈ２００，５ｆ ； ５ｏｌｕｂｌｅ ５ｔａ
ｒｃｈ １．５、ｐ；Ａｇａｒ ２０，９：Ｄｉｓｔ
、ｗａｔｅｒ ｌｄ）を用い４５℃で前培養したケトミ
ウム・サーモフィル・パル・コブロフィル（Ｃｈａｅｔ
ｏｍｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ ｖａｒ。

ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｅ）ＡＴＣＣ２８０７６を接種し、
４５℃で６日間本培養を行う。

培養終了後ｐＨ７のリン酸バッファーを２０１１１１添
加し、ワーリンクフレンダーで粉砕し、遠心分離機を用
い、上澄液を採取する。

この上澄液を酵素液とし、Ｎ−アセチル−ＤＬ−フェニ
ルアラニンを基質とし、 酵素液 ０．５ ｍｍ １０１１ リン酸緩衝液 １．５ｍ１ Ｏ，ＩＭＮ−アセチル−ＤＬ− フェニルアラニン１．０ｍｌ からなる反応液中で５０℃及び７０℃で３０分反応させ
た。

得られたＬ−フェニルアラニンはバイオアッセイで定量
した。

定量の結果、アシラーゼ活性は５０℃で２．２ ｕ／ｍ
ｌ” ｈｒ、 ７０℃で５．２ｕ／ｍ１−ｈｒであった
。

実施例 ２−１９ 実施例２：＠３？にＹｅａｓｔ−８ｔａｒｃｈ液体培地
３．９ｍｌを添加し、加圧殺菌を行い、冷却後Ｙｅａｓ
ｔ−８ｔａｒｃｈ斜面培地を用い４５℃で前培養したケ
トミウム・サーモフィル・パル・テ′イシタム（Ｃｈａ
ｅｔｏｍｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ ｖａｒ、
ｄｉｓｓｉ−１ｕｍ）ＡＴＣＣ２８０７７を接種し、以
下実施例１と同様に行った。

実施例３：ＰＤＡ斜面培地を用い４５℃で前培養したダ
クチロマイセス・クラスタセウス（Ｄａｃｔｙｌｏｍｙ
ｃｅｓ ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ）ＩＭ１１０２４７０を
用い、実施例１と同様に行った。

実ａ例４：フミコーラ・インソレンスＡＪ６７５５（Ｈ
ｕｍｉｃｏｌａ １ｎｓｏｌｅｎｓ ＡＪ ６７５５
） ＦＥＲＭＰ−３１０５を用いて実施例１と同様に行
った。

実施例５：マルブラン力・プルケラ・パル・サルフレア
（Ｍａｌｂｒａｎｃｈｅａ ｐｕｌｃｈｅｌｌａ ｖａ
ｒ。

５ｕｌｆｕｒｅａ）ＡＴＣＣ２８０７８を用いて実施例
１と同様に行った。

実施例６：ＰＤＡ斜面培地を用い４５℃で前培養したム
コール・プシルス（Ｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ）Ｉ
Ｆｏ ４５７８を用いて実施例１と同様に行った。

実施例７：パブラスポラ・サーモフイラ （Ｐａｐｕｌｏｓｐｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）
ＡＴＣＣ２８０７９を用いて実施例１と同様に行った。

実施例８：ペシロマイセス・クラスタセウスＡＪ ６
８０９（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｃｒｕｓｔａｃｅ
ｕｓＡＪ ６８０９）ＦＥＲＭＰ−３１０６を用いて実
施例１と同様に行った。

実施例９ニスポロトリタム・サーモフィルＡＪ ６６９
３（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｅＡＪ−６６９３）ＦＥＲＭ Ｐ−３１０３を用いて
実施例１と同様に行った。

実施例１０ ： Ｍａｌｔ Ａｇａｒの斜面培地を用い
４５℃で前培養したタラロマイセス・エマ−ソニー （
Ｔａ ｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉ ｉ ）
ＡＴＣＣ２８０８０を用いて実施例１と同様に行った
。

実施例１１：サーモアスカス・オーランティアカス（Ｔ
ｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ａｕｒａｕｔｉａｃｕｓ） Ａ
ＴＣＣ２８０８２を用いた以外は実施例３と同様に行っ
た。

実施例１２：サーモマイセス・ラヌーギノーサス（Ｔｈ
ｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ） ＡＴ
ＣＣ２８０８３を用いた以外は実施例３と同様に行った
。

実施例１３：チェラビア・アルボマイセス（Ｔｈｉｅｌ
ａｖｉａ ａｌｂｏｍｙｃｅｓ） ＡＴＣＣ２８０８
４を用いた以外は実施例１と同様に行った。

実施例１４：トルラ・サーモフイラ（Ｔｏｒｕｌａｔｈ
ｅｒｍｏｐｈｉ ｌａ） ＡＴＣＣ２８０８５を用いた
以外は実施例１と同様に行った。

実施例１５：皺３ｒにｐＨ６のリン酸緩衝液を３．９ｍ
ｌ添加し１２０℃３０分殺菌、冷却後ＰＤＡ斜面培地
用い３５℃で前培養したビソクラミス・フルバＡＪ ７
５１４ （Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ ｆｕｌｖａＡＪ
７５１４）ＦＥＲＭＰ−３１０７を接種し、３５℃で６
日間本培養を行い、以下実施例１と同様に行った。

実施例１６：クリソスポリウム・ルテウム（Ｃｈｒｙｓ
ｏｓｐｏｒｉｕｍ Ｉｕｔｅｕｍ） ＣＢ Ｓ ２２７
、６７を用いた以外は実施例１６と同様に行った。

実ｍ例１７：ギルマニエラ・フミコーラ ＡＪ６７４３
（Ｇｉｌｍａｎｉｅｌｌａ ｈｕｍｉｃｏｌａ ＡＪ
６７４３ ）ＦＥＲＭ Ｐ−３１０４を用いた以
外は実施例１６と同様に行った。

実施例１８：モナスカス・アンカ（Ｍｏ ｎ ａ ｓ
ｃ ｕ ５ａｎｋａ）ＡＴＣＣ１６３６０を用いた以外
は実施例１６と同様に行った。

実施例１９：チェラビア・セペトニウム ＡＪ７７６６
（Ｔｈｉｅｌａｖｉ ａ ｓｅｐｅｄｏｎｉｕｍ Ａ
Ｊ ７７６６）ＦＥＲＭ Ｐ−３１０８を用いた以外
は実施例１６と同様に行った。

以上実施例２−１９において測定されたアシラーゼ活性
は次の表に示される。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ フミコーラ属、ムコール属、ペシロマイセス属、ス
   ポロトリウム属、ビソクラミス属、クリソスポリウム属
   、ギルマニエラ属、モナスカス属、チェラビア属に属し
   、５０℃以上で活性を有するアシラーゼを生産する菌を
   培養し、得られた培養物、分離菌体、これらの処理物ま
   たは分離アシラーゼもしくはこれらの固定化物をＮ−ア
   シル−ＤＬ−アミノ酸に５０℃以上で作用させ不斉加水
   分解し、該加水分解液よりＬ−アミノ酸を採取すること
   を特徴とするアシラーゼを用いたＬ−アミノ酸の製造法
   。