JPS5851760B2 - 微生物によるステロイドの酸化方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物によるステロイドの酸化方法の改良に関
する。

さらに詳しくは、本発明はステロール類またはその４−
エン−３−オン誘導体もしくはｌ・４−ジエン−３−オ
ン誘導体の微生物酸化に使用する培地の改良に関する。

ステロール類を微生物酸化すると１７−β−ヒドロキシ
アントロスタート４−ジエン−３−オン（１−デヒドロ
テストステロン）（以下ＤＨＴと略称する）およびアン
トロスタート４〜ジエン−３・１７−ジオン（以下ＡＤ
Ｄと略称する）の得られることは知られている。

しかしステロール類の微生物酸化で生成するＤＨＴおよ
びＡＤＤはさらに酸化を受けやすく、培地中に高濃度の
ＤＨＴおよびＡＤＤを蓄積させることは実質的に不可能
である。

そこで生成したＡＤＤの酸化を防止する一つの方法とし
て、ＡＤＤの微生物酸化に関与する鉄および銅イオンを
ブロックすることのできるキレート剤を添加することが
提案され、大きな成果を収めることができた。

（特公昭４２−１０８６２） しかしこの方法によっても工業的に実施可能な程度に高
濃度のＤＨＴおよびＡＤＤを培地中に蓄積させることは
困難である。

そこで本発明者等はステロール類またはその４エン−３
−オン誘導体もしくは１・４−ジエン３−オン誘導体の
微生物酸化反応を工業上有利に行うべく種々検討を行っ
た結果、植物油脂粕、ならびに培地中に含まれるグリセ
リドの量が０．３重量％以上となるように、油種子およ
び油果実の少くとも１つを培地中に添加することにより
、ＤＨＴおよびＡＤＤが著しく高い収率で得られること
を見出し、本発明に到達した。

微生物によるステロール類の酸化は以下の経路※※で進
行するものと推定される。

１６１４７号公報参照） （特公昭４６− （上記式中でＲは炭素数８ないし１０個の鎖式の側鎖を
表わす。

）本発明の詳細な説明すると、本発明で原料として用い
られるステロール類はベルヒドロシクロペンタノフェナ
ントレン核のＣ−５に水酸基を、通常Ｃ−５に二重結合
を、Ｃ−１７に炭素数８ないし１０個の鎖式の側鎖を有
し、場合によってはＣ７に二重結合を有してもよい。

このようなステロール類トシテハ、コレステロール、ス
チグマステロール、カンペステロール、シトステロール
、エルゴステロール、プラツシ力ステロールおヨヒフコ
ステロール等が含まれる。

また上記した微生物によるステロール類の酸化経路から
予想されるステロール類の酸化中間体である、上記した
ステロール類の４−エン−３−オン誘導体および１・４
−ジエン−３−オン誘導体も同様に本発明の原料として
用いられることはいうまでもない。

油種子および油果実としては、各種油脂の原料として使
用されるものを使用することができる。

具体的には、例えば、アマニ エノ、キリ、ゴマ、トウ
モロコシ、ナタネ、綿実、サフラワー、大豆、ツバキ、
米ヌカ、オリーブ、ヒマ、落花生、ヤシ、パームなどを
あげることができる。

なお、油脂子および油果実は微生物による資化を受けや
すくするために、よく粉砕して添加されることが望まし
い。

油種子および油果実は単独でも使用されうるが、２以上
の同種または異種のものを混合して使用することもでき
る。

油種子および（または）油果実は、培地中のグリセリド
の濃度が培地重量に対し、通常約０．３〜４．０重量％
、好ましくは約０．５〜３．５重量％、さらに好ましく
は約０．７〜３．０重量％となるように培地に添加され
る。

実際に添加される油種子または油果実は、これらのもの
に含まれるグリセリド含量に基づいて計算される。

参考のために、主な油種子および油果実のグリセリド含
量を以下の表に示す。

本発明方法に従って、油種子および（または）油果実に
加え、培地中に添加される植物油脂粕としては、前記油
種子および油果実から脱油脂した粕の全てを使用するこ
とができる。

具体的には、例えば、脱脂大豆粉、アマニ粕、ナタネ油
粕、綿実油粕、ゴマ油粕、落花生油粕、サフラワー油粕
等があげられる。

なお、植物油脂粕の使用量は油種子および（または）油
果実の使用量によって大きく異なるが、油種子および（
または）油果実に含まれるグリセリド重量に対し、通常
約０．０２〜４０倍（重量）、好ましくは約０．０３〜
３０倍（重量）、さらに好ましくは約０．１〜１０倍（
重量）である。

ただし、植物油脂粕の濃度は培地重量に対し、通常約０
．３〜１５重量％、好ましくは約０．６〜１０重量％、
さらに好ましくは約１〜８重量％である。

本発明方法に従って、植物油脂粕ならびにグリセリドを
０．３重量％以上含有する油種子および油果実の少くと
も１つを培地中に添加すると、ＤＨＴおよびＡＤＤの生
成量は飛躍的に増大し、はじめてステロイド類の微生物
酸化によるＤＨＴおよびＡＤＤの工業的生産が可能とな
る。

しかし本発明方法によると、植物油脂粕ならびに油種子
および（または）油果実が培地中に添加されるため、こ
れらのものをよく資化する微生物を選択して使用する必
要がある。

従って本発明方法で使用され得る微生物は高いステロー
ル類および植物油脂粕、油果実および油種子に対する資
化性を有することが要求される。

このような微生物としては、たとえば、アースロバフタ
−属、ノカルジア属、フザリウム属、ミコバクテリウム
属、プロタミノバクタ−属、ブレビバクテリウム属、コ
リネバヒテリウム属、バシルス属、セラティア属、アゾ
トバクタ−属、ストレプトミセス属、アルカリ土類金属
、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する
微生物が好ましい。

上記した微生物の代表例としては、アースロバフタ−・
シンプレックス（ＩＡＭ １６６０）、ブレビバクテ
リウム・リポリチカム（ＩＡＭ １３９８）、ミコバ
クテリウム・スメグマチス（ＩＦＯ３０８３）、７’ロ
タミノバクター・アルボフラーバス（ＡＴＣＣ８４５８
）、ノカルジア・エリスロポリス（ＡＴＣＣ４２７７）
、ミコバクテリウム・フレイ（ＩＦＯ３１５８）等をあ
げることができるが、本発明方法で使用される微生物は
上記したものに限定されるものではない。

また上記した微生物を２以上混合して使用することもで
きる。

本発明方法で使用される培地には、上記した植物油脂粕
ならびに油種子および（または）油果実の他に、炭素源
、窒素源および無機物が適宜添加される。

炭素数としては、たとえば、ｎ−パラフィン、α−オレ
フィン、キシレン等の炭化水素；メタノール、エタノー
ル、グリセリン、高級アルコール等のアルコール類；コ
ハク酸、酢酸、高級脂肪酸等の有機酸およびその塩；澱
粉、麦芽糖、ショ糖、ブドウ糖、ラムノース等の糖類が
あげられる。

炭素源、窒素源およびその他の栄養物質を含む天然栄養
源としては、ハイテスト糖蜜、精製糖蜜およびキシロー
ス糖蜜を含む糖蜜類；バガス、コーンコブ、アルファル
ファ、コーンステイープリカーデイステイラーズソルブ
ル、味液、魚粉、酵母、フスマ、肉エキス、酵母エキス
、ポテトエキス、麦芽エキス、グルテン、ペプトン、グ
ルタミン酸塩、アスパラギン、グリシン、カゼイン、カ
ゼイン分解物、スキムミルり等があげられる。

無機物としては、硫安、塩安なとの窒素源；リン酸水素
ニカリウム等のカリウムおよびリン源；鉄、銅、マグネ
シウム、マンガン、コバルト、亜鉛、カルシウム等の塩
類があげられる。

その他必要に応じてビタミン類を添加することもできる
。

培地の組成を用いる菌種の種類に応じて選ばれるが、炭
素源、窒素源、カリウム、リンおよびマグネシウムは培
地成分として不可欠である。

消泡剤が必要な場合にはポリオキシアルキレングリコー
ルなどが添加されるが、必ずしも消泡剤を添加する必要
はない。

界面活性剤はステロール類およびその酸化中間体の乳化
剤として有効であり、培地中に添加されることが望まし
い。

界面活性剤としては、たとえば、ポリオキシエチレンソ
ルビタンモノステアレート、ソルビタンモノパルミテテ
ート、ポリエチレングリコールモノステアレートなどを
あげることができる。

本発明方法で、ＡＤＤを培地中に高濃度で蓄積させるた
めにはＡＤＤの酸化阻止剤を添加する必要力する。

ＡＤＤの酸化阻害剤としては、キレート剤マタはニッケ
ルもしくはコバルトの塩類等が使用されるが、キレート
剤の代表例は１・１０−フェナントロリン、２・２′−
ビピリジル、８−ヒドロキシキノリン、クペロン、イソ
ニコチン酸ヒドラジド、オルソフェニレンジアミン、Ｎ
−Ｎ−ジエチルジチオカルバミド酸ナトリウム等である
。

その使用量はキレート剤および培地によって大きく異な
るが、通常その使用濃度はｌＸｌ０−５〜ｌＸｌ０−２
Ｍである。

キレート剤の添加時期は培地および菌によって異なるが
、通常培養開始後１０〜６０時間である。

培養温度は通常２０〜３７℃であるが、アースロバフタ
−属やブレビバクテリウム属の微生物を使用する場合に
は、培養温度は３０℃付近が最適であり、ミコバクテリ
ウム属の微生物を使用する場合には、３５℃付近が最適
である。

培地のｐＨは通常５〜８に調整されるが、７付近が好ま
しい。

本発明方法の原料であるステロール類またはその４−エ
ン−３−オン誘導体もしくは１・４−ジエン−３−オン
誘導体は、乾熱殺菌あるいは湿熱殺菌後そのまま添加さ
れるか、あるいはジメチルホルムアミド等に溶解して添
加されるか、あるいは超音波処理により微細に分散懸濁
して添加される。

またステロール類の添加に際しては、界面活性剤を同時
に添加するとステロール類の乳化が促進されるので好ま
しい。

ステロール類の添加時期は原料ステロール類および使用
する微生物によってかなり異なるが、一般には培養開始
後３０時間以内である。

なお菌の生育が十分でない時には、培養開始前３０時間
以降に添加してもよい。

また菌の生育に応じて、ステロール類を分割添加するこ
とも可能である。

本発明方法に従って添加される植物油脂相ならびに油種
子および（または）油果実はステロール類の酸化の全段
階に於て有効であり、また菌の生育を促進するので、通
常は培養開始時培地に添加される。

しかし、上記植物？削−泊等はステロール類の１７位の
側鎖の酸化に特に有効であると考えられ、従って原料ス
テロール類の添加時、あるいは原料ステロール類の添加
後約５０時間内に添加しても、ＤＨＴおよびＡＤＤの生
成量は大きく増加する。

また、前記した濃度範囲の油種子および（または）油果
実を培養中分割して添加することも好ましい。

本発明方法によれば、ＤＨＴおよび（または）ＡＤＤが
得られる。

先に示したステロール類の酸化経路から推測されるとお
り、ＡＤＤは、ＤＨＴの１７位の水酸基が酸化されて生
成するものと考えられる。

事実、培養初期に於ては、ＤＨＴ濃度は高いが、酸化反
応が進行するにつれて、ＡＤＤ濃度が増加するとともに
、ＤＨＴ濃度が減少する。

従ってＤＨＴを高濃度で得ようとすれば、早い時期に培
養を中止し、逆にＡＤＤを高濃度で得ようとすれば、長
時間培養を続ければよいことになる。

ＤＨＴまたはＡＤＤを高濃度で得るための培養時間は、
使用微生物、培養温度、培地組成等によって大きく異な
るがＤＨＴを高濃度で得るためには、キレート剤添加後
約１５〜３５時間で培養を停止することが好ましく、他
方ＡＤＤを高濃度で得るためにはキレート剤添加後約３
５〜９０時間で培養を停止することが好ましい。

培養終了後、培養液中に蓄積したＤＨＴおよびＡＤＤは
既知の方法で分離精製することができる。

たとえば、培養液を約３倍量の酢酸エチルで抽出し、抽
出液から溶媒を留去したのち、シクロヘキサン等の溶媒
に溶解し、不溶物を除去して再結晶すると、精製された
目的物質が得られる。

またＤＨＴ、ＡＤＤならびにステロール類の４エン−３
−オン誘導体および１・４−ジエン−３−オン誘導体等
のその他の生成物の分離が必要な場合には、再結晶に先
立って、シリカゲルまたはアルミナを吸着剤とし、石油
エーテル、ベンゼン、クロロホルム、エーテル、メタノ
ール等を溶離剤として使用するカラムクロマトグラフィ
により、上記生成物を分離後、再結晶が行われる。

以下の実施例で、本発明をさらに詳細に説明するが、本
発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定さ
れない。

なお以下の実施例に於て、ステロール類およびその誘導
体、ＡＤＤならびにＤＨＴの定性および定量はガスクロ
マトグラフィにより行った。

また※※油種子、油果実および植物油脂粕は、いずれも
よく粉砕して用いた。

パーセントは重量による。実施例 １ 酵母エキス１．０％、肉エキス１．０％およびペプトン
ｉ、ｏ％よりなる種培地（ｐＨ７，０） １００ｍｌを
５００ｒＩｌｌ肩付きフラスコに分注し、１２０℃で１
５分殺菌後、アースロバフタ−・シンプレックス（ＩＡ
Ｍ １６６０）を１白金耳液種し、２８℃で４８時間
培養する。

この種培養液２ｍｌを、種培地と同じ組成を有し表１に
示される濃度を与える量のゴマおよび植物油脂粕を添加
した本培養培地（ｐＨ７，０，１２０℃２０分殺菌）５
０ａを含む５００ｍ１の肩付きフラスコに接種する。

培養は３０℃で開始され、培養開始後２０時間目に水２
ｍｌに懸濁したコレステロール２５０ｒｎ９を添加し、
さらに培養開始後２８時間目に２・２′ビピリジル６．
２■を添加する。

２・２′−ビピリジル添加後８５時間で培養を停止し、
培養液を酢酸エチル１５０ｗＬｌで抽出する。

これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかげ、ベ
ンゼン：アセトン（５：１）で溶出し、生成したＡＤＤ
、酸化中間体および残存基質を分離する。

ＡＤＤの生成量を表１に示す。

コレステロールの代すにβ−シトステロールとカンペス
テロールの２：１混合物、スチグマステロール、コレス
ト−４−エン−３−オンおヨヒコレスタート４−ジエン
−３−オンを用いテ、上記した培養を繰り返した結果を
同じく表１に示す。

なお、比較のためにゴマおよび植物油脂粕を添加しなか
った場合の結果をあわせて示す。

実施例２ コレステロール３００■を基質として使用し、表２に示
される濃度を与える量の丸太豆粉および脱脂大豆粉を添
加したことならびに丸太豆粉および脱脂大豆粉をその合
計濃度が８％以上となるように添加した時には２・２′
−ビピリジル７．８１ｎ９を添加したところを除いては
実施例１を繰り返す。

結果を表２に示す。

実施例 ３ 実施例１と同じようにして種培養したブレビバクテリウ
ム・リボリチカム（ＩＡＭ １３９８）の種培養液１
ＴＬｌをシヨ糖２．０％、ＮａＮＯ３１，０％、酵母エ
キス１．０％、Ｋ２ＨＰ０，０．２５％、ＭｇＳＯ４・
７Ｈ２００，０３％、各種油種子または油果実２．５％
および植物油脂粕２．０％よりなる培地（ｐＨ７，０，
１２０℃２０分間殺菌）５０ｒｒＬｌを含む５００１ｒ
Ｌｌ肩付きフラスコに接種する。

３０℃で振盪培養し、培養開始後１５時間目にコレステ
ロール３００■、培養開始後２８時間目に２・２′ビピ
リジル７、８１ｎ９を添加し、さらに培養を７０時間続
ける。

その後実施例１と同じようにして、酢酸エチルでアント
ロスタン系化合物を抽出する。

生成したアントロスタン系化合物は大部分ＡＤＤである
。

その生成量を表３に示す。実施例 ４ 添加物を表４に示されるように変え、２・２′−ビピリ
ジルの代りに１・１０−フェナントロリン１．３■を使
用し、且つこのキレート剤添加後２８時間（培養開始後
５６時間）で培養を停止することを除いては実施例３を
繰り返す。

このように早期に培養を停止する場合にはＡＤＤのほか
にＤＨＴが生成する。

結果を表４に示す。実施例 ５ グルコース１．０％、肉エキス０．３％、ヘフトン１．
０％および食塩０．５％からなる種培地１ｏＯ７７１１
を含む５００ｒＩＬｌ肩付フラスコにミコバクテリウム
・フレイ（ＩＦＯ３１５８）を接種し、７０時間種培養
する。

次にコーン・スチープ・リカー２．０％、グルコース２
．０％、グルタミン酸ソーダ０．４％、アスパラギン０
．２％、ＫＨ２ＰＯ４０，２％、油種子または油果実２
．５％および植物油脂粕２．０％からなる本培地（ｐＨ
７，０）５０ｍｌを含む５００ｍ１肩付きフラスコ（１
２０℃で２０分間殺菌）に種培養液２ｍｌを接種し、３
５℃で振盪培養を行う。

本培養開始後４０時間目にコレステロール１５０■を添
加し、さらに本培養開始後４８時間目に８−ヒドロキシ
キノリン４２■を添加し、８−ヒドロキシキノリン添加
後６０時間で培養を終了する。

培養終了後、実施例１と同様に処理するとＡＤＤが得ら
れる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ステロール類またはその４−エン−３−オン誘導体
   もしくは１・４−ジエン−３−オン誘導体を微生物酸化
   して、１７−ヒトロキシアンドロスタート４−ジエン−
   ３−オンおよび／またはアントロスタート４−ジエン−
   ３・１７−ジオンな製造するに際し、培地中に油種子お
   よび油果実の少くとも１つならびに植物油脂粕を添加し
   、かつ油種子および／または油果実に含まれるグリセリ
   ドの量が培地重量に対し０．３重量％以上であることを
   特徴とする微生物によるステロイドの酸化方法。