JPS6327359B2

JPS6327359B2 -

Info

Publication number: JPS6327359B2
Application number: JP13744378A
Authority: JP
Inventors: Yukio Imada; Sumiko Mizuno
Original assignee: Mitsubishi Chemical Industries Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1978-11-08
Filing date: 1978-11-08
Publication date: 1988-06-02
Also published as: JPS5564600A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、下記構造を有する化合物即ち9α−ヒドロキシ−３−オキ
ソプレグナ−４，17（20）−ジエン−20−カルボン
酸（以下9α−OH−PCと略す）およびその微生
物による製造方法に関するものである。微生物による9α−OH−PCの製造方法として
は例えばその１つに３−オキソプレグナ−４，17
（20）−ジエン−20−カルボン酸（以下PCと略す）
を基質にして、コリネバクテリウム属に属する微
生物を培養し9α位に水酸基を導入する方法が挙
げられ、もう一つはステロール類を基質にしてミ
コバクテリウム・スピーシーズNRRL Ｂ−8054
号菌とコリネバクテリウム（Corynebacterium以
下C.と略す）属に属する微生物とを混合培養ない
しは二段培養して9α−OH−PCを製造する方法
が挙げられる。 9α−OH−PCはコルチコイド製造の為の極め
て重要な前駆体である。コルチコイド活性発現の
為に11β位に水酸基、17α位に水酸基があるのが
望ましいが、先ず本物質は９位に水酸基を有する
のでC9〜11位間二重結合導入を経由して容易に
11β位に合成法で水酸基が誘導される。もしＢ環のC9位に水酸基がなければ11β位に水
酸基を導入するには低濃度でしか進行しないと云
われる醗酵法に頼らざるを得なく効率が悪い。さ
らに9α位にフツ素原子などを含む高活性コルチ
コイドの合成にも9αに水酸基を有するステロイ
ドは有用な原料物質である。一方本物質はC17〜
20位間に二重結合を有するので通常は導入しにく
い17α水酸基が有機合成法で容易に導入されう
る。さらに本物質はＡ環C4〜５位間に二重結合が
存在する。通常コルチコイドはC4〜５位間に二
重結合を有するのでこの点でも都合がよい。コル
チコイドの中にはＡ環にC4〜５位間のみならず
C1〜２位間に二重結合を有するジエン化合物が
多いが、前駆体の段階でジエン構造を有すると、
11β位、17α位に水酸基を導入する時などにC1〜
２位間の二重結合の存在が邪魔になる事があるの
で、本物質の如く中間体の段階ではＡ環はモノエ
ン構造の方がのぞましい。さらに本物質は炭素数22のステロイドである
が、この事は脱炭酸などの工程を経て炭素数21を
基本骨格とするコルチコイドに容易に変換しう
る。このように本物質はコルチコイド製造の前駆
体として理想的な化合物である。本物質から典型的コルチコイドの１つであるハ
イドロコーチゾン・アセテートへの有機化学合成
のルートは種々あるが例えば次の如き方法があげ
られる。図中で、「NBr」はＮ−ブロモサクシイミド、
また「Ac」はアセチル基を表わす。最終のハイドロコーチゾン・アセテートからさ
らにプレドニソロンにしたいならアースロバクタ
ー・シンプレツクスなどの微生物を用い脱水素し
てC1〜２位間に二重結合を導入すればよい。本物質9α−OH−PCは例えば前述の如く微生
物を用いてPCより製造されうる。用いる微生物
としては、9α位に水酸基を導入しうる微生物な
らいずれでもよい。そのような微生物としては例
えばC.属菌が選ばれる。さらに詳しくはC.エクイ
（equi）に属する微生物が用いられる。C.エクイ
に属する菌としてはATCC6939、7698、7699、
10146、21107、21280、21329、21521〔サブスピー
シーズムシラギノーサス（subsp.
mucilaginosus）〕および21690号各菌ならびに
IAM1038号菌が知られている。その転換反応は
増殖菌体（growing cells）の状態でも休止菌体
（resting cells）の状態でもどちらでもよい。休
止菌体の場合は不溶物を含まぬ培地で培養し、遠
心分離などにより菌を集菌し、PCを含む緩衝液、
生理的食塩水、水などに再び懸濁して転換反応を
行なう。反応中に撹拌が必要で、場合によつては
通気も必要である。次に増殖菌体を用いる場合について詳述する
と、炭素源、窒素源、無機塩類および必要に応じ
てビタミン等の栄養素を含む培地を殺菌し、これ
にC.属菌を接種して振盪培養ないしは通気撹拌培
養を行なう。用いられる培地は次のようなもので
ある。炭素源としては、たとえば、ｎ−パラフイン、
α−オレフイン、キシレン等の炭化水素；メタノ
ール、エタノール、グリセリン、高級アルコール
等のアルコール類；コハク酸、酢酸、高級脂肪酸
等の有機酸およびその塩；澱粉、麦芽糖、シヨ
糖、ブドウ糖、ラムノース等の糖類；アマニ油、
大豆油、ゴマ油、トウモロコシ油、ナタネ油、パ
ーム油、魚油、牛脂、タロー油脂などの油脂類が
あげられる。炭素源、窒素源およびその他の栄養
物質を含む天然栄養源としては、たとえばアマニ
油脂、脱脂大豆粕、綿実油粕、ナタネ油粕などの
植物油脂粕類；ハイテスト糖蜜、精製糖蜜および
キシロース糖蜜を含む糖蜜類；バカス、コーンコ
ブ、アルフアルフア、コーンステイーブリカー、
デイステイラーズソルブル、味液、魚粉、フス
マ、肉エキス、酵母、酵母エキス、ポテトエキ
ス、麦芽エキス、グルテン、ペプトン、グルタミ
ン酸塩、アルパラギン、グリシン、カゼイン、カ
ゼイン分解物、スキムミルクがあげられる。また、培地に添加される無機物としては例えば
硫安、塩安などの窒素源；リン酸水素二カリウム
等のカリウムおよびリン源；鉄、銅、マグネシウ
ム、マンガン、コバルト、亜鉛、カルシウム等の
塩類；糖蜜等天然物の灰化物があげられる。その
他必要に応じてビタミン類を添加することもでき
る。培地の組成は用いる菌種の種類に応じて選ばれ
るが、炭素源、窒素源、カリウム、リンおよびマ
グネシウムは培地成分として不可欠である。消泡剤が必要な場合には周知のものを添加すれ
ばよい。具体的にはポリオキシアルキレングリコ
ールなどが挙げられるが必ずしも消泡剤を添加す
る必要はない。界面活性剤は乳化剤として有効である場合が多
い。界面活性剤としては、非イオン系及び陰イオ
ン系のものが好ましい。具体的にはたとえば、ポ
リオキシエチレンソルビタンモノステアレート、
ソルビタンモノパルミテート、ポリエチレングリ
コールモノステアレートなどを挙げることができ
る。増殖菌体、休止菌体を問わず反応温度は通常20
〜40℃であるが、28〜37℃付近が最適である。反応液（緩衝液、培地など）のPHは通常５〜10
に調整されるが、６〜９が好ましい。菌濃度が低いと、この転換反応は進まないの
で、C.属菌の濃度は１×10⁹／ml以上、のぞまし
くは１×10¹⁰／ml以上になるよう調整するか、培
養する事がのぞましい。原料であるPCは培地と共に殺菌したり、また
培養開始後、培地に添加してもよい。また分割添
加も可能である。この場合、乾燥殺菌あるいは湿
熱殺菌後そのまま添加するか、あるいはジメチル
ホルムアミド、メタノール等の溶媒に溶解して溶
液として添加するか、あるいは超音波処理により
微細に分散懸濁液として添加する。その際、界面
活性剤を同時に添加するとPCの分散がより促進
される場合が多い。転換に要する時間は、菌濃度、温度、PHなどに
より一律には云いがたいが、通常７日以内、早い
ときは１〜２日で反応停止した方がよい場合が多
い。通常生成した9α−OH−PCは時間が経過し
すぎるとさらに分解を受けて減少するので、その
生成量を時間と共に定量し、減少しはじめたら熱
殺菌、酸・アルカリ添加、有機溶媒添加などによ
り停止する必要がある。 PCから9α−OH−PCに転換する酵素、即ち9α
位水酸化酵素は、一般に誘導酵素と考えられるか
ら、C.属菌の種培養の段階で少量のPCを添加し、
酵素を誘導しておいた方がのぞましい。転換反応終了後、培養液中等に生成した9α−
OH−PCは既知の方法で採取、分離精製されう
る。例えば、培養液を硫酸などの無機酸で酸性に
した後、培養液から9α−OH−PCを等量ないし
は数倍量のクロロホルム、酢酸エチルなどの水と
混和しにくい有機溶媒で抽出し、抽出液から溶媒
を留去させたのち、得られた粗9α−OH−PCは
多孔性樹脂、シリカゲル、アルミナ等を吸着剤と
し、石油エーテル、ベンゼン、クロロホルム、エ
ーテル、アセトン、エタノール、メタノール、酢
酸エチル等を溶離剤とするカラムクロマトグラフ
イーにより、9α−OH−PCの分解物、基質PC、
他の副生物等から分離されうる。しかし、通常9α−OH−PCが主体となす場合
は、クロマト操作する事なく、メタノール、酢酸
エチル、アセトンなどに溶解させて再結晶を繰り
返せば9α−OH−PCの純結晶を得る事ができる。基質として用いられるPCは、通常はステロー
ル類を基質にして、微生物により生産させてから
単離して使用するか、もしくは、微生物で生産さ
れる中間体、例えば、アンドロスト−４−エン−
３，17−ジオン（以下4ADと略す）から有機合
成反応で製造させたものを使用する。このPCは
C.属菌の接種前に培地に加えられて一緒に殺菌し
て使用するのが通常であるが、培養途中に乾熱殺
菌して粉末のまま、ないしは水に懸濁後蒸気殺菌
して添加するか、メタノールなどの溶媒に溶解し
て添加してもよい。次にPC生産微生物により、ステロール類より
PCを生産させ、これにC.属菌を接種して9α−
OH−PCを培地中に生成させる方法について詳述
する。先ずステロール類よりPCを生産させるのに用
いられる微生物は既知のPC生産菌ならいずれで
もよい。そのような微生物としては、例えばミコ
バクテリウムスピーシーズNRRL Ｂ−8054号
菌が知られている。本菌によるPC生産に関して
は米国特許3994933、同4032408に詳述されてい
る。ここでステロール類とは各種ステロールまたは
それらの酸化中間体を総合してステロール類と称
す。各種ステロールとはペルヒドロシクロペンタ
ノフエナントレン核のＣ−３位にヒドロキシル基
を、通常Ｃ−５位に二重結合を、Ｃ−17位に炭素
数８ないし10個の鎖式の側鎖を有し、場合によつ
てはＣ−７、Ｃ−８、Ｃ−９(11)等に二重結合を有
してもよい。このような各種ステロールとしては、コレステ
ロール、スチグマステロール、カンペステロー
ル、β−シトステロール、エルゴステロール、ブ
ラツシカステロール、フコステロール、ラノステ
ロール、アグノステロール、ジヒドロラノステロ
ール、ジヒドロアグノステロール、α−シトステ
ロール等が挙げられる。好ましいステロールはコ
レステロール、カンペステロール、スチグマステ
ロールおよびβ−シトステロールである。魚油やいか油からのアルカリ洗浄ダーク油、さ
らに植物油の脱臭スカム、脱臭スラツジ、トール
油などのステロール含有天然物および加工物も同
様に原料として使用される。さらに各種ステロールの酸化中間体も基質とし
て使用される。このような酸化中間体の中には各
種ステロールの４−エン−３−オン誘導体等が挙
げられるが、具体的には、たとえば、コレスト−
４−エン−３−オン、ステイグマスタ−４，22−
ジエン−３−オン、コレスタ−４，22−ジエン−
３−オン、3β−ヒドロキシ−22，23−ビスノル
コル−５−エン−22−オイツクアシツド、3β−
ヒドロキシ−22，23−ビスノルコル−４−エン−
３−オン−22−オイツクアシツド等である。培養方法はPC生産をさせている間はPC生産菌
の最適の条件で培養し、C.属菌を接種した後は、
C.属菌の最適条件で培養した方がのぞましい。従
つてPC醗酵中にPHが極端にかたよつた場合など
にはC.属菌の接種時に、酸・アルカリを添加する
事によりPHを７付近に調整しなおしてもよいし、
その方が良い場合が多い。 C.属菌を接種する時期は、通常PC生産が始ま
つたばかりの時に行なうより、むしろPC生産が
最高値に近くなつてから行なつた方が結局9α−
OH−PC生産量が多くなる事が多い。 C.属菌の接種の際、PC生産醗酵を熱処理など
で必ずしも停止する必要はない。PC生産醗酵が
未だ進んでいるところへC.属菌を接種し、そのま
ま両菌が混合培養されている状態でもPCから9α
−OH−PCが多量生産される。このように二段培養ないしは混合培養が可能で
あるが、培地に関してはPC生産菌にとつて最適
な培地でPC生産醗酵を行ない、それに通常は新
成分を加える必要なく、C.属菌を接種して9α−
OH−PCを生成させて何らさしつかえない。ただ
PC醗酵後C.属菌の十分な生育には栄養不十分と
思われる時には、C.属菌接種の前後に殺菌した肉
エキス、脱脂大豆、硝酸アンモニウムなどの新成
分を殺菌して培養液に添加してもよい。 PC生産醗酵に用いる培地は、PC生産菌として
何れを使うかによつて異なるが、原則としてC.属
菌用の培地として前述した培地成分がすべて使用
可能である。 C.属菌に培養液の接種量は対PC生産菌培養液
あたり通常0.1〜30％位でのぞましくは１〜15％
である。本発明によれば9α−OH−PCを培地中に高濃
度で生成させる事ができる。またステロールから
PC、PCから9α−OH−PCの二段の反応を醗酵法
で有利に行うことにより、安価なステロール類よ
り9α−OH−PCを安価に生成することを可能に
した。以下の実施例で本発明をさらに詳細に説明する
が、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実
施例に限定されない。なお、以下の実施例におい
て、PC、9α−OH−PC、および他のステロイド
の定量は、シリル化後ガスクロマトグラフイーに
より行なつた。また以下の実施例において、パー
セントは重量による。実施例１グルコース1.0％、肉エキス0.3％、ペプトン1.0
％、食塩0.5％および水よりなる種培地（PH7.0）
を、500ml肩付コルベンに100ml分注し、120℃、
20分間蒸気殺菌する。これにC.エクイ（equi）
ATCC21329号菌を１白金耳接種し、30℃で120往
復／分、振幅７cmの往復振盪機で52時間種培養す
る。この種培養液４mlを、綿実粕4.0％、酵母1.5
％、大豆油1.5％、NaNO₃0.2％、K₂HPO₄0.1％、
MgSO₄・7H₂O0.1ｇおよび水よりなる本培養地
50ml（PH7.0、120℃で20分間蒸気殺菌）を含む
500ml肩付きフラスコ１本に接種する。本培養は
30℃で120往復／分、振幅７cmの往復振盪条件で
行い、培養開始後30時間目に殺菌済みのPC（粉
末）1.0ｇを無菌的に添加する。その後さらに培
養を続け、PC添加後48時間で培養を停止し、培
養液を硫酸で酸性にして50mlのクロロホルムで抽
出する。この抽出液をガスクロマトグラフイーで
分析した結果、0.75ｇの9α−OH−PCの存在が確
認された。この物質を同定する為に抽出液を濃縮
し、シリカゲルの薄層クロマトグラフイーで展開
し、該当部分をかき取り溶媒クロロホルムで溶出
し、さらに酢酸エチル、メタノールより再結晶を
繰り返した結果、約300mgの純結晶を得ることが
できた。この物質は融点241〜242℃を示す無色プリズム
晶（酢酸エチル）であつた。その赤外線吸収スペ
クトラム（KBr Disc）は3450cm^-1（OH由来）、
3300〜2500cm^-1（COOH由来）、1670cm^-1（α、β
−不飽和カルボン酸由来）に極大吸収を持つてい
た。NMR分析の結果は次の通りである。 (1) DMSO−d₆中 0.90ppmに3H分で一重線（ｓ）（18−CH₃） 1.24ppmに3H分で一重線（ｓ）（19−CH₃） 1.86ppmに3H分で一重線（ｓ）（21−CH₃） 4.54ppmに1H broadな一重線（br−ｓ）（−
OH） 5.62ppmに1Hで一重線（ｓ）（４−Ｈ） (2) CDCl₃中 0.96（3H、ｓ、18−CH₃） 1.32（3H、ｓ、19−CH₃） 1.96（3H、ｓ、21−CH₃） 5.84（1H、br−ｓ、４−Ｈ） (3) C₆D₅N中 0.98（3H、ｓ、18−CH₃） 1.27（3H、ｓ、19−CH₃） 2.22（3H、br−ｓ、21−CH₃） 6.00（1H、br−ｓ、４−Ｈ）質量分析の結果ｍ／ｅ＝358（M⁺分子イオンピーク）、340（Ｍ−H₂O、baseピーク）さらに本物質
をジアゾメタンでメチルエステル化して得た無色
柱状晶（エチルエーテル）〔mp.202〜204℃〕の
分析結果は、下記の通りであつた。 IR ν^KBr _naxcm^-1 3520（OH） 1690

【式】 1660（−CO−CH＝Ｃ＜） NMR（in CDCl₃） 0.97（3H、ｓ、18−CH₃） 1.33（3H、ｓ、19−CH₃） 1.95（3H、ｔ、Ｊ＝〜２Hz、21−CH₃） 3.68（3H、ｓ、COOCH₃） 5.86（1H、br−ｓ、４−Ｈ）（in C₆D₅N） 0.93（3H、ｓ、18−CH₃） 1.26（3H、ｓ、19−CH₃） 2.02（3H、ｔ、Ｊ＝〜２Hz、21−CH₃） 3.67（3H、ｓ、COOCH₃） 6.02（1H、br−ｓ、４−Ｈ）このメチルエステルは次の構造を有すると考え
られる。一方、前述と同じ組成でただ最初から1.0ｇの
PCを含有した本培養培地50mlを500ml肩付フラス
コ中で調製する。これを蒸気殺菌後、前述の種培
養を同量同時に接種する。これを途中にPCの添
加をすることなく同一条件で培養した後、48時間
で培養を停止する。この培養液を同じ硫酸で酸性
にて50mlのクロロホルムで抽出し、その中の9α
−OH−PC含量を測定した結果、0.65ｇの9α−
OH−PCの存在する事が確認された。実施例２グルコース1.0％、肉エキス0.3％、ペプトン1.0
％、酵母エキス0.5％、PC0.02％および水よりな
る種培地（PH7.0）を500ml肩付コルベンに100ml
分注し、120℃、20分間蒸気殺菌する。これにC.
エクイ（equi）ATCC21329号菌を１白金耳接種
し、30℃で120往復／分、振幅７cmの往復振盪機
で48時間培養する。この種培養をすべてあわせ、
冷却遠心分離にて菌を沈降させ集菌する。生理的
食塩水にて２回洗浄後、1.0％のPCを含有する燐
酸緩衝液（PH7.5、1/20Ｍ）25mlに菌体を懸濁す
る。この懸濁液30mlを500ml肩付フラスコに入れ、
種培養と同一条件にて振盪する。反応液を12時間
振とう後、硫酸で酸性にし50mlのクロロホルムで
抽出し、抽出液中の9α−OH−PC含量を測定し
た結果12時間目に約80mgの9α−OH−PCの存在
を確認した。実施例３実施例１と同様にしてC.エクイサブスピーシ
ズムシラギノーサス（C.equi subsp.
mucilaginosus）ATCC21521号菌を種培養した。
この種培養２mlを、脱脂大豆粉4.0％、酵母2.0
％、K₂HPO₄0.25％、MgSO₄・7H₂O0.1％、
NH₄NO₃0.2％、大豆油1.0％、PC1.0％および水
よりなる本培養培地50mlを含む500ml肩付フラス
コ（PH7.0、120℃、20分間蒸気殺菌）２本に接種
する。30℃、120往復／分、７cm振幅の条件で培
養し１本は35時間で培養を停止する。その後クロ
ロホルム50mlを用いて硫酸で酸性にした培養液を
抽出したところ、抽出液中に0.32ｇの9α−OH−
PCの存在が確認された。もう１本のフラスコは
59時間目に培養を停止し、50mlのクロロホルムで
硫酸酸性の培養液を抽出したところ抽出液中に
0.20ｇの9α−OH−PCの存在を確認した。実施例４グルコース1.0％、肉エキス1.0％、ペプトン1.0
％および水よりなる種培地（PH7.2）100mlを500
ml肩付きフラスコに分注し、120℃で15分間蒸気
殺菌後、ミコバクテリウムスピーシーズ
NRRL Ｂ−8054号菌を１白金耳接種し、30℃で
120往復／分、振幅７cmの往復振盪条件で72時間
種培養する。この種培養液２mlを丸大豆磨砕物
4.0％、酵母1.0％、NaNO₃0.2％、K₂HPO₄0.2％、
MgSO₄・7H₂O0.1％、コレステロール1.0％およ
び水からなる本培養培地100mlを含む500ml肩付き
フラスコ（PH7.0、120℃で20分間蒸気殺菌）５本
に接種する。本培養は30℃で、120往復／分、振
幅７cmの往復振盪条件で行う。培養開始後220時
間目にPHを無菌的に７付近に調整し、さらにここ
に実施例１と同様にして種培養したC.equi
ATCC21329号菌８mlを夫々のフラスコに接種す
る。接種後、同一振盪条件で30℃で48時間培養を
継続する。培養停止後培養液を全て併せ、１回に
1.5の酢酸エチルで２回抽出し、併せた抽出液
中のステロイド含量を測定した結果9α−OH−
PC0.48ｇの存在が確認された。実施例５グルコース1.0％、肉エキス1.0％、ペプトン1.0
％および水よりなる種培地（PH7.2）100mlを500
ml肩付きフラスコに分注し、120℃で15分間蒸気
殺菌後、ミコバクテリウムスピーシーズ
NRRL Ｂ−8054号菌を１白金耳接種し30℃で
120往復／分、振幅７cmの往復振盪条件で56時間
種培養する。この種培養液20mlを綿実粕4.0％、
酵母1.0％、大豆油1.0％、NaNO₃0.2％、
K₂HPO₄0.1％、MgSO₄・7H₂O0.01％、コレステ
ロール2.0％および水よりなる本培養地800ml（PH
7.0、120℃で20分間蒸気殺菌）を含む６容肩付
きフラスコ２本に接種する。本培養は30℃で100
往復／分、振幅７cmの往復振盪条件で行い、培養
開始後240時間目に１本は熱殺菌せずにPHを７付
近に調整し、それと同時に実施例３と同様にして
種培養したC.エクイサブスピーシーズムシラ
ギノーサス ATCC21521号菌を50ml接種する。
もう１本は120℃、30分の蒸気殺菌を施し、冷却
後、直ちにPHを７付近に調整後、同じC.エクイ
サブスピーシーズムシラギノーサス
ATCC21521号菌の種培養を50ml接種する。接種
後同時に２本のフラスコの培養を再開する。再開
後48時間で培養を中止し、各々のフラスコの培養
液を硫酸酸性にして1.6のクロロホルムで抽出
した結果、C.エクイ接種前熱殺菌した方は0.71
ｇ、熱殺菌しない方は0.78ｇの9α−OH−PCが生
成していた。実施例６グリセロール2.0％、丸大豆磨砕物2.0％、酵母
エキス1.0％、NaNO₃0.2％、K₂HPO₄0.1％およ
び水よりなる種培地（PH7.2に調整）100mlを含む
500ml肩付コルベンを120℃、20分間蒸気殺菌す
る。これにミコバクテリウムスピーシーズ
NRRL Ｂ−8054号菌を１白金耳接種する。接種
後、30℃で120往復／分、振幅７cmの往復振盪条
件で68時間種培養する。この種培養液２mlを脱脂
大豆磨砕物4.0％、酵母1.5％、綿実油粕1.0％、
NH₄NO₃0.1％、MgSO₄0.1％、K₂HPO₄0.1％、
花王アトラス社製ノニオン界面活性剤商標
“Tween−60”0.05％、表２の各種のステロール
類2.0％および水よりなる本培養培地50mlを含む
500ml肩付きフラスコ（合計５本）に接種する。
接種後30℃で120往復／分、７cm振幅の条件で培
養する。192時間培養後、実施例２と同様にして
培養したC.エクイ（equi）ATCC21329号菌の種
培養液４mlを接種する。同時にNH₄NO₃50mg、
酵母エキス200mgを含んだ殺菌水５mlを添加する。
そしてPHを７付近に調整する。このあとさらに48
時間培養を継続し48時間目に培養を停止し、各フ
ラスコを50mlのクロロホルムで、硫酸酸性にした
培養液からステロイドを抽出する。この抽出液中
の9α−OH−PCの量を表１にかかげる。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】１ 9α−ヒドロキシ−３−オキソプレグナ−４，
17（20）−ジエン−20−カルボン酸。２３−オキソプレグナ−４，17（20）−ジエン−
20−カルボン酸を基質として、コリネバクテリウ
ム属に属する微生物を培養することを特徴とする
9α−ヒドロキシ−３−オキソプレグナ−４，17
（20）−ジエン−20−カルボン酸の製造方法。３特許請求の範囲第２項記載の9α−ヒドロキ
シ−３−オキソプレグナ−４，17（20）−ジエン−
20−カルボン酸の製造方法において微生物がコリ
ネバクテリウム・エクイに属する事を特徴とする
方法。４特許請求の範囲第３項記載の9α−ヒドロキ
シ−３−オキソプレグナ−４，17（20）−ジエン−
20−カルボン酸の製造方法においてコリネバクテ
リウム・エクイに属する微生物が、コリネバクテ
リウム・エクイATCC21329号菌であることを特
徴とする方法。５特許請求の範囲第３項記載の9α−ヒドロキ
シ−３−オキソプレグナ−４，17（20）−ジエン−
20−カルボン酸の製造方法において、コリネバク
テリウム・エクイに属する微生物が、コリネバク
テリウム・エクイサブスピーシーズムシラギ
ノーサスATCC21521号菌であることを特徴とす
る方法。６ステロール類を基質として、ミコバクテリウ
ム・スピーシーズNRRL Ｂ−8054号菌およびコ
リネバクテリウム属に属する微生物を培養するこ
とを特徴とする9α−ヒドロキシ−３−オキソプ
レグナ−４，17（20）−ジエン−20−カルボン酸の
製造方法。７特許請求の範囲第６項記載の9α−ヒドロキ
シ−３−オキソプレグナ−４，17（20）−ジエン−
カルボン酸の製造方法において微生物がコリネバ
クテリウム・エクイに属する事を特徴とする方
法。８特許請求の範囲第７項記載の9α−ヒドロキ
シ−３−オキソプレグナ−４，17（20）−ジエン−
20−カルボン酸の製造方法においてコリネバクテ
リウム・エクイに属する微生物が、コリネバクテ
リウム・エクイATCC21329号菌であることを特
徴とする方法。９特許請求の範囲第７項記載の9α−ヒドロキ
シ−３−オキソプレグナ−４，17（20）−ジエン−
20−カルボン酸の製造方法において、コリネバク
テリウム・エクイに属する微生物が、コリネバク
テリウム・エクイサブスピーシーズムシラギ
ノーサスATCC21521号菌であることを特徴とす
る方法。