JPH0120877B2

JPH0120877B2 -

Info

Publication number: JPH0120877B2
Application number: JP55081943A
Authority: JP
Inventors: Yukio Imada; Tooru Osozawa; Hironori Morimoto; Masayuki Kinoshita
Original assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1980-06-17
Filing date: 1980-06-17
Publication date: 1989-04-18
Also published as: NL8102648A; DD159720A5; US4397946A; JPS578794A; DE3123413A1; HU185264B

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、アンドロスタン系ステロイドの製造
方法に関するものである。詳しくは、本発明はア
ンドロスタン系ステロイドの醗酵生産法における
培地の改良に関するものである。ミコバクテリウム（以下「M.」と略す。）属に
属する微生物を用いて、ステロール類を微生物変
換するとアンドロスタン系ステロイドを製造しう
ることは良く知られている。しかし、この方法は
生産量が未だ十分ではなく、また生産速度も遅い
といつた欠点がある。一方、リゾープス・ニグリカンスというカビに
よるプロゲステロンの11α位を水酸化するステロ
イド醗酵において、基質であるプロゲステロンを
生卵黄と混和して培養途中に添加すると、生卵黄
を使用せず、プロゲステロンをアセトンに溶解し
て添加する方法に比し、高い濃度での基質仕込み
が可能である事が知られている（特公昭32−9765
号公報参照）。本発明者等は、これらの事情に鑑み、M.属に
属する微生物を用いるアンドロスタン系ステロイ
ドの製造方法を改良すべく鋭意研究したところ、
卵黄を培地に添加すればよいことを見出し、本発
明に到達した。すなわち、本発明の要旨は、M.属に属する微
生物を用い、ステロール類を基質にして微生物変
換し、アンドロスタン系ステロイドを製造する
際、乾燥物として0.1重量％以上の卵黄を含む培
地を使用することを特徴とするアンドロスタン系
ステロイドの製造方法に存する。以下に本発明を詳細に説明する。本発明方法で製造の目的とするアンドロスタン
系ステロイドとしては、例えばアンドロスト−４
−エン−３，17−ジオン（以下「4AD」と略
す。）、アンドロスタ−１，４−ジエン−３，17−
ジオン（以下「ADD」と略す。）、9α−ヒドロキ
シアンドロスト−４−エン−３，17−ジオン（以
下「9α−OH−4AD」と略す。）、デヒドロエピア
ンドロステロン（以下「DHA」と略す。）、デヒ
ドロテストステロン（以下「DHT」と略す。）、
テストステロン（以下「TSN」と略す。）など従
来M.属に属する微生物を用い、ステロール類を
基質とした微生物変換によつて製造しうることが
知られているアンドロスタン系ステロイドが挙げ
られる。これらのアンドロスタン系ステロイドの
なかで、各種ステロイドの合成中間体として、と
くに重要なのは4AD、ADDおよび9α−OH−
4ADである。本発明方法で使用されるM.属に属する微生物
としては、アンドロスタン系ステロイドを生産す
る微生物であれば用い得るが、このような微生物
としては、アンドロスタン系ステロイドの分解酸
素が欠失または低活性化した突然変異株であるこ
とが好ましい。このような突然変異株と、当該微生物が主に生
産するアンドロスタン系ステロイドの例を表１に
まとめて示した。

【表】本発明で基質として用いられるステロール類と
は、各種ステロール、そのＣ−３エステル、エー
テル誘導体またはそれらの酸化中間体を総合して
ステロール類と称す。各種ステロールは、ペルヒ
ドロシクロペンタノフエナントレン核のＣ−３に
ヒドロキシル基を、通常Ｃ−５に二重結合を、Ｃ
−17に炭素数８ないし10個の鎖式の側鎖を有し、
場合によつてはＣ−７、Ｃ−８、Ｃ−９(11)等に二
重結合を有してもよいが、シクロペンタノフエナ
ントレン核が飽和のこともある。このような各種ステロールとしては、コレステ
ロール、スチグマステロール、カンペステロー
ル、β−シトステロール、エルゴステロール、ブ
ラツシカステロール、フコステロール、ラノステ
ロール、アグノステロール、ジヒドロラノステロ
ール、ジヒドロアグノステロール、α−シトステ
ロール等が挙げられる。好ましいステロールはコ
レステロール、カンペステロールおよびβ−シト
ステロールである。また各種ステロールの3β水酸基と硫酸等の無
機酸または脂肪酸等の有機酸とのＣ−３エステル
誘導体も本発明方法の原料として使用される。このようなＣ−３エステル誘導体としては、コ
レステリルオレエート、コレステリルパルミテー
ト、コレステリルサルフエート等が挙げられる。
さらに、たとえば各種ステロールの3β水酸基に
アルキレンオキシドを付加させる方法等により得
られるＣ−３エーテル誘導体も本発明方法の原料
として使用される。このようなＣ−３エステル誘導体としてはポリ
オキシエチレンコレステリルエーテル等が挙げら
れる。上記した各種ステロールのＣ−３エステル誘導
体を含有する羊毛脂（ウールワツクス）、ラノリ
ン、およびラノリンの加水分解で得られるコレス
テロールを含有するウールアルコールおよびウー
ルアルコールにエチレンオキシドを反応させて得
られる、Ｃ−３エーテル誘導体であるポリオキシ
エチレンラノリンアルコールエーテルも本発明方
法の原料として使用されることはいうまでもな
い。魚油やいか油からのアルカリ洗浄ダーク油さら
に植物油の脱臭スカム、脱臭スラツジ、トール油
などのステロール含有天然物および加工物も同様
に本発明方法の原料として使用される。さらに各種ステロールまたはそのＣ−３エステ
ルもしくはエーテル誘導体の酸化中間体も本発明
方法の基質として使用される。このような酸化中
間体としては各種ステロール、そのＣ−３エステ
ル、Ｃ−３−エーテル誘導体の４−エン−３−オ
ン又は１，４−ジエン−３−オン誘導体が挙げら
れるが、具体的には、たとえば、コレスト−４−
エン−３−オン、コレスタ−４，22−ジエン−３
−オン、3β−ヒドロキシ−23，24−ビスノルコ
ル−５−エン−22−オイツクアシツド、３−オキ
ソ−23，24−ビスノルコル−４−エン−22−オシ
ツクアシツド（以下「4BN」と略す）、３−オキ
ソ−プレグナ−４，17（20）ジエン−20−カルボ
ン酸、３−オキソ−プレグナ−４，17（20）ジエ
ン−20−カルボン酸メチル、コール酸、リトコー
ル酸等である。本発明方法において重要な点は、乾燥物として
0.1重量％以上の卵黄を含む培地を使用すること
である。卵黄は生のままでも、乾燥されたものでもまた
凍結されたものでも使用しうる。また、卵白が分
離されたものであつても、卵白と分離されていな
い全卵のままでもよい。全卵を使用する場合、殻
は通常除かれる。これらの卵黄の形態のなかで、
工業的には乾燥卵黄が使用しやすい。卵黄の培地中の含有量は、卵黄乾燥物に械算し
て0.1重量％以上あることが必要であり、３重量
％以下で十分である。卵黄の量が少なすぎると、
卵黄を添加する実質的な効果が認められないし、
また量が多すぎても逆に微生物への阻害があらわ
れやすくなるので好ましくない。なお、生卵黄中の水分量は、通常45〜50重量％
である。本発明方法で使用される培地には、上記卵黄以
外に炭素源、窒素源および無機物が適宜添加され
る。炭素源としては、たとえば、ｎ−パラフイン、
α−オレフイン、キシレン等の炭化水素；メタノ
ール、エタノール、グリセリン、高級アルコール
等のアルコール類；コハク酸、酢酸、高級脂肪酸
等の有機酸およびその塩；大豆油、綿実油等のグ
リセリド、油脂；澱粉、麦芽糖、シヨ糖、ブドウ
糖、ラムノース等の糖類があげられる。炭素源、
窒素源およびその他の栄養物質を含む天然栄養源
としては、ハイテスト糖蜜、精製糖蜜およびキシ
ロース糖蜜を含む糖蜜類；バガス、コーンコブ、
アルフアルフア、コーンステイ−ブリカー、デイ
ステイラーズソルブル、味液、魚粉、フスマ、肉
エキス、酵母、酵母エキス、ポテトエキス、麦芽
エキス、グルテン、ペプトン、グルタミン酸塩、
アスパラギン、グリシン、カゼイン、カゼイン分
解物、スキムミルク、大豆粕、菜種粕・ゴマ粕・
亜麻仁粕・綿実粕等の植物油脂粕および丸大豆・
菜種・ゴマ・亜麻仁・綿実等の油種子・油果実が
あげられる。無機物としては、硫安・塩安などの窒素源、リ
ン酸水素二カリウム等のカリウムおよびリン源、
鉄・銅・マグネシウム・マンガン・コバルト・亜
鉛・カルシウム等の塩類、さらには糖蜜等天然物
の灰化物があげられる。その他必要に応じてビタ
ミン類を添加することもできる。培地の組成は用いる菌種の種類に応じて選ばれ
るが、炭素源、窒素源、カリウム、リンおよびマ
グネシウムは培地成分として不可欠である。消泡剤が必要な場合には周知のものを添加すれ
ばよい。具体的にはポリオキシアルキレングリコ
ールなどが挙げられるが、必ずしも消泡剤を添加
する必要はない。界面活性剤はステロール類の乳化剤として有効
であり、培地中に添加されることが望ましい。界
面活性剤としては、非イオン系及び陰イオン系の
ものが好ましい。具体的にはたとえば、ポリオキ
シエチレンソルビタンモノステアレート、ソルビ
タンモノパルミテート、ポリエチレングリコール
モノステアレートなどを挙げることができる。培養温度は通常20〜40℃であるが、培養温度は
25〜35℃付近が最適である。培地のPHは通常５〜10に調整されるが、６〜９
が好ましい。本発明で使用する微生物がM.属に
属するものなので周知のように10付近のPHにも耐
えられる。本発明方法の原料であるステロール類は培地と
共に殺菌されるのが一般的であるが、培養開始
後、培地に添加されてもよい。また分割添加も可
能である。この場合、乾燥殺菌あるいは湿熱殺菌
後そのまま添加されるか、あるいはジメチルホル
ムアミド等の溶媒に溶解して添加されるか、ある
いは超音波処理により微細に分散懸濁して懸濁液
として添加される。また、界面活性剤を同時に添
加すると基質ステロール類等の乳化が促進される
ので好ましい。培養時間は特に制限されないが、通常、原料ス
テロール類等添加後２日目頃からアンドロスタン
系ステロイドの生産量が急増する。その後は、培
養時間と共に徐々にアンドロスタン系ステロイド
の生産量が増加するが20日以上培養するのは工業
的意味が薄い。培養終了後、培養液中に蓄積したアンドロスタ
ン系ステロイドは既知の方法で採取、分離精製さ
れうる。たとえば培養液を数倍量の酢酸エチルな
どの水と混和しにくい有機溶媒で抽出し、抽出液
から溶媒を留去したのち、得られたステロイド混
合物を多孔性樹脂、シリカゲル、アルミナ等を吸
着剤とし、石油エーテル、ベンゼン、クロロホル
ム、エーテル、アセトン、メタノール、酢酸エチ
ル等を溶離剤として使用するカラムクロマトグラ
フイにより、アンドロスタン系ステロイドを分離
することができる。しかし通常は培養条件を適当に選んで培養し、
かつ適当な抽出溶媒を選択する事により培養液の
溶媒抽出液中でアンドロスタン系ステロイドが主
体を占めれば、クロマト操作する事なく溶媒抽出
液から溶媒留去後、アセトン、ヘキサン、シクロ
ヘキサンなどに溶解させて再結晶を繰り返してア
ンドロスタン系ステロイド純結晶を得る事が出来
る。本発明方法によれば、卵黄を含有していない培
地を用いた場合に比して、ステロール類の側鎖の
切断効果が高まり、アンドロスタン系ステロイド
の生産速度が顕著に早くなる。また、ステロール
類からのアンドロスタン系ステロイドの生成収率
もあがる。さらに、原料ステロール類の分解速度
が大きくなるため、卵黄無添加の場合に比し、ス
テロール類の高濃度仕込みも可能となり、これら
の結果が総合されてアンドロスタン系ステロイド
の生産性が大幅に上昇し、本発明の工業的価値は
大きい。しかも、本発明方法で使用する卵黄は、生産物
に比してたいへん安価であることも有意義であ
る。以下の実施例で、本発明をさらに詳細に説明す
るが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の
実施例に限定されない。なお、以下の実施例に於て、アンドロスタン系
ステロイドの定量はガスクロマトグラフイにより
行つた。また、以下の実施例に於て、パーセントは重量
による。実施例１グルコース1.0％、肉エキス1.0％、ペプトン1.0
％および水よりなる種培地（PH7.2）100mlを500
ml肩付きフラスコに分注し、120℃で15分間蒸気
殺菌後、M.パラフオーツイタムMCI−1297号菌
を１白金耳接種し、30℃で120往復／分、振幅７
cmの往復振盪条件で48時間種培養する。この種培
養液２mlを丸大豆磨砕物5.0％、酵母1.5％、
K₂HPO₄0.15％、大豆油0.5％、MgSO₄・
7H₂O0.1％、シリコンオイル（信越化学社商標
KM−70）0.1％、コレステロール2.0％、乾燥卵
黄1.0％および水からなる本培養培地50ml（PH
7.0、120℃で20分間蒸気殺菌）を含む500ml肩付
きフラスコ10本ずつ２グループ合計20本に接種す
る。本培養は30℃で、120往復／分、振幅７cmの
往復振盪条件で行い、培養開始後140時間目およ
び210時間目に培養を停止し、夫々を酢酸エチル
１で２回抽出する。この抽出液から菌体などの不溶物を過除去
後、ステロイド含量をガスクロマトグラフイーで
分析した結果は、9α−OH−4ADが夫々1.65、
1.85ｇ生産されていた。一方、同じ本培養培地で卵黄無添加の培地で同
じ事を繰り返す。フラスコ10本ずつ合計20本を培
養開始後140時間目および210時間目で培養を中止
し、同様に抽出し、抽出液中のステロイド含量を
測定したところ、9α−OH−4ADが夫々0.94ｇ、
1.38ｇ存在していた。実施例２グルコース1.0％、肉エキス1.0％、ペプトン1.0
％および水よりなる種培地（PH7.2）100mlを500
ml肩付フラスコに分注し、120℃で15分間蒸気殺
菌後、M.バツカエMCI−1104号菌を１白金耳接
種し30℃で120往復／分、振幅７cmの往復振盪条
件で48時間種培養する。この種培養液20mlを脱脂
大豆磨砕物4.0％、酵母2.0％、大豆油1.0％、米ぬ
か1.0％、NaNO₃0.2％、K₂HPO₄0.1％、
MgSO₄・7H₂O0.1％、コレステロール1.5％、乾
燥卵黄0.5％および水よりなる本培養培地50ml
（PH7.0、120℃で20分間蒸気殺菌）を含む500ml容
肩付フラスコ２本に接種する。本培養は30℃で
100往復／分、振幅７cmの往復振盪条件で行い、
培養開始後１本は144時間目、もう１本は192時間
目に培養を停止し、夫々を酢酸エチル100mlで２
回抽出する。この抽出液中に、9α−OH−4ADが
夫々95mg、115mg存在していた。一方、同じ本培養培地で、卵黄無添加の培地で
同じ事を繰り返す。同様に培養開始後144、192時
間目に培養を中止し、抽出液中のステロイド含量
を測定したところ、9α−OH−4ADが夫々52mg、
98mg存在していた。実施例３実施例２において基質コレステロールの代り
に、粗β−シトステロール（β−シトステロール
８：カンペステロール１：α−シトステロール１
混合物）、β−シトステロールとカンペステロー
ルの２：１混合物、ステイグマステロール、コレ
スト−４−エン−３−オン、コレステリルオレエ
ートおよび4BNを用いて140時間培養した事を除
いては実施例２を繰り返す。蓄積された9α−OH
−4ADの量を表２に示す。

【表】実施例４グルコース1.0％、肉エキス1.0％、ペプトン1.0
％および水よりなる種培地（PH7.2）100mlを500
ml肩付きフラスコに分注し、120℃で15分間蒸気
殺菌後、M.パラフオーツイタムコンプレツクス
MCI−0801号菌を１白金耳接種し、30℃で120往
復／分、振幅７cmの往復振盪条件で48時間種培養
する。この種培養液２mlを、丸大豆磨砕物4.0％、
NaNO₃0.2％、K₂HPO₄0.2％、MgSO₄・7H₂O0.1
％、コレステロール1.0％および水からなる本培
養培地50ml（PH7.0、120℃で20分間蒸気殺菌）を
含む500ml肩付きフラスコ10本および同組成でさ
らに乾燥卵黄1.0％含んだ培地50ml（同上）を含
む500ml肩付きフラスコ10本に接種する。本培養
は30℃で、120往復／分、振幅７cmの往復振盪条
件で行い、培養開始後５本ずつを112時間および
170時間目に培養を停止し、５本ずつ培養液を併
せ酢酸エチル１で２回抽出する。この抽出液から不溶物を過後、ADD含量を
ガスクロマトグラフイーで分析した。結果を表３
に示す。

【表】実施例５グルコース1.0％、肉エキス1.0％、ペプトン1.0
％および水よりなる種培地（PH7.2）100mlを500
ml肩付フラスコに分注し、120℃で15分間蒸気殺
菌後、M.パラフオーツイタムコンプレツクス
MCI−0802号菌を１白金耳接種し30℃で120往
復／分、振幅７cmの往復振盪条件で48時間種培養
する。この種培養液20mlを、丸大豆磨砕物2.0％、
酵母2.0％、グリセリン4.0％、NaOH₃0.2％、
K₂HPO₄0.2％、MgSO₄・7H₂O0.1％、コレステ
ロール1.5％および水よりなる本培養培地800ml
（PH7.0、120℃で20分間蒸気殺菌）を含む６容
肩付フラスコ２本および同組成で乾燥卵黄1.5％
添加された培地800ml（同上）を含む６容肩付
フラスコ２本に接種する。本培養は30℃で100往
復／分、振幅７cmの往復振盪条件で行い、培養開
始後130、180時間目に培養を停止し、夫々の培養
液を酢酸エチル2.4で抽出する。この抽出液中のADD含量をガスクロマトグラ
フイーで測定した結果を表４に示す。

【表】実施例６グルコース1.0％、肉エキス1.0％、ペプトン1.0
％および水よりなる種培地（PH7.2）100mlを500
ml肩付きフラスコに分注し、120℃で15分間蒸気
殺菌後、M.パラフオーツイタムコンプレツクス
MCI−0807号菌を１白金耳接種し、30℃で120往
復／分、振幅７cmの往復振盪条件で48時間種培養
する。この種培養液２mlを、丸大豆磨砕物4.0％、
NaNO₃0.2％、K₂HPO₄0.2％、MgSO₄・7H₂O0.1
％、コレステロール2.0％、各種濃度の乾燥卵黄
および水からなる本培養培地100ml（PH7.0、120
℃で20分間蒸気殺菌）を含む500ml肩付きフラス
コに接種する。本培養は30℃で120往復／分、振
幅７cmの往復振盪条件で行い、培養開始後110時
間目に培養を停止し、酢酸エチル200mlで２回抽
出する。この抽出液をあわせて菌体などの不溶物を過
後、4AD含量をガスクロマトグラフイーで分析
した結果を表５に示す。

【表】実施例７グルコース1.0％、肉エキス1.0％、ペプトン1.0
％および水よりなる種培地（PH7.2）100mlを500
ml肩付フラスコに分注し、120℃で15分間蒸気殺
菌後、M.パラフオーツイタムコンプレツクス
MCI−0807号菌を１白金耳接種し、30℃で120往
復／分、振幅７cmの往復振盪条件で48時間培養す
る。この種培養液20mlを脱脂大豆磨砕物2.0％、
酵母2.0％、乾燥卵黄1.0％、NaNO₃0.2％、
K₂HPO₄0.2％、MgSO₄・7H₂O0.1％、コレステ
ロール2.0％および水よりなる本培養培地800ml
（PH7.0、120℃で20分間蒸気殺菌）を含む６容
肩付フラスコ２本（１本は卵黄無添加）に接種す
る。本培養は30℃で100往復／分、振幅７cmの往
復振盪条件で行い、培養中20mlずつをサンプリン
グし、それを夫々60mlの酢酸エチルで抽出し、そ
の抽出液中に存在する4AD量を表６に示す。

【表】実施例８実施例６において、乾燥卵黄にかえて、生卵黄
を用いた事を除いては実施例６を繰り返す。結果
を表７に示す。

【表】実施例９実施例６において、乾燥卵黄に代えて、全卵
（殻を除く）を用いた事を除いては、実施例６を
繰り返す結果を表８に示す。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】１ミコバクテリウム属に属する微生物を用い、
ステロール類を基質にして微生物変換し、アンド
ロスタン系ステロイドを製造する際、乾燥物とし
て0.1重量％以上の卵黄を含む培地を使用するこ
とを特徴とするアンドロスタン系ステロイドの製
造方法。２特許請求の範囲第１項記載のアンドロスタン
系ステロイドの製造方法において、アンドロスタ
ン系ステロイドがアンドロスト−４−エン−３，
17−ジオン、アンドロスタ−１，４−ジエン−
３，17−ジオンおよび9α−ヒドロキシアンドロ
スト−４−エン−３，17−ジオンからなる群から
選ばれたものであることを特徴とする方法。３特許請求の範囲第１項または第２項に記載の
アンドロスタン系ステロイドの製造方法におい
て、ステロール類が、ステロール、そのＣ−３エ
ステル誘導体、Ｃ−３エーテル誘導体またはそれ
らの酸化中間体からなる群から選ばれたものであ
ることを特徴とする方法。４特許請求の範囲第１項ないし第３項のいずれ
かに記載のアンドロスタン系ステロイドの製造方
法において、微生物がアンドロスタン系ステロイ
ドの分解酵素の欠失または低活性化した突然変異
株であることを特徴とする方法。５特許請求の範囲第１項ないし第４項のいずれ
かに記載のアンドロスタン系ステロイドの製造方
法において、微生物としてミコバクテリウムパラ
フオーツタイムコンプレツクスに属する突然変異
株を用いることを特徴とする方法。６特許請求の範囲第１項ないし第４項のいずれ
かに記載のアンドロスタン系ステロイドの製造方
法において、微生物としてミコバクテリウムバツ
カエに属する突然変異株を用いることを特徴とす
る方法。７特許請求の範囲第１項ないし第５項のいずれ
かに記載のアンドロスタン系ステロイドの製造方
法において、微生物がミコバクテリウムパラフオ
ーツイタムコンプレツクスMCI−0801号菌およ
び同MCI−0802号菌からなる群から選ばれたも
のであり、アンドロスタン系ステロイドがアンド
ロスタ−１，４−ジエン−３，17−ジオンである
ことを特徴とする方法。８特許請求の範囲第１項ないし第５項のいずれ
かに記載のアンドロスタン系ステロイドの製造方
法において、微生物がミコバクテリウムパラフオ
ーツイタムコンプレツクスMCI−0807号菌であ
り、アンドロスタン系ステロイドがアンドロスト
−４−エン−３，17−ジオンであることを特徴と
する方法。９特許請求の範囲第１項ないし第４項または第
６項のいずれかに記載のアンドロスタン系ステロ
イドの製造方法において、微生物がミコバクテリ
ウムバツカエMCI−1104号菌および同MCI−
1117号菌からなる群から選ばれたものであり、ア
ンドロスタン系ステロイドが9α−ヒドロキシア
ンドロスト−４−エン−３，17−ジオンであるこ
とを特徴とする方法。１０特許請求の範囲第１項ないし第４項のいず
れかに記載のアンドロスタン系ステロイドの製造
方法において、微生物がミコバクテリウムスピー
シーズNRRL Ｂ−3683号菌であり、アンドロス
タン系ステロイドがアンドロスタ−１，４−ジエ
ン−３，17−ジオンであることを特徴とする方
法。１１特許請求の範囲第１項ないし第４項のいず
れかに記載のアンドロスタン系ステロイドの製造
方法において、微生物がミコバクテリウムスピー
シーズNRRL Ｂ−3805号菌であり、アンドロス
タン系ステロイドがアンドロスト−４−エン−
３，17−ジオンであることを特徴とする方法。