JPS602192A - ジヒドロウラシルよりウラシルを製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ジヒドロウラシ、／Ｉ／をウラシルに変換す
る能力を有する微生物を利用してジヒドロウラシルから
ウラシルを製造する方法に関する。

本発明の目的は、医薬・農薬・化学と各方面に幅広く有
用なウラシルを工業的に有利に製造することにある。

従来、ウラシルの製造は、化学的合成法〔メソツズ・イ
ン・エンジモロジ−４，６２６（１９５７）ｉ共立出版
株式会社発行、化学大辞典第１巻第７９１頁（昭和４４
年版）；ジャーナル・オブ・アプライド・ケミストリー
２゜２３９（１９５２）’；ヘルヴエチカ・ヒミカ・ア
クタ８，８５０（１９２５）ｉ特開昭５６−８６１７２
号等〕、あるいは発酵法（酵母等を大量培養し、ＲＮＡ
抽出、加水分解した後分離採取する方法等）、あるいは
発酵蓄積法（特公昭４９−２２７１０号、特公昭５７−
１８８７３号、特公昭５７−３０４７６号等）等で行な
われている。

しかしなから、化学的合成法では、強酸下での加熱反応
であったり、強酸下で還元触媒を必要としかつ水素気流
下の反応であ？たりして、強烈な条件下の反応を必要と
する欠点がある。

また、発酵法では、酵母等を大蓋培養後、リボ核酸を抽
出し、加水分解し、生成されたウラシルをイオン交換樹
脂等で分離採取する必要があり、また発酵蓄積法では＠
養時間が長期であつたり・培地組成も複雑−多数必要と
し、かつ発酵生産物がウラシル以外を含むため、イオン
交換樹脂でウラシルを分離採取する必要がある等の欠点
を有する。

このため上述した如き従来の多くの欠点を有する化学合
成法、発酵法、発酵蓄積法とは異なり温和な条件下で反
応が進み簡便にウラシルを得るウラシルの製造法が望ま
れていた０本発明者等は、ジヒドロウラシルを原料とし
て、酵素反応を利用したウラシルの製造法を鋭意横割し
た結果、従来の化学合成法、発酵法、発酵蓄積法に比較
して、はるかに温和な条件下で反応が進みかつ簡便にウ
ラシルを製造する方法を見いだし、本発明を完成した。

本発明は、ジヒドロウラシルをウラシルに変換する能力
を有するロドトルラ（：Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　）机
の微生物菌体、あるいはその凍結処理を施した微生物菌
体、あるいはその微生物菌体より抽出した抽出物のうち
いずれかをジヒドロウラシルに作用せしめてウラシルに
変換する方法に関する。

また本発明は上記方法においてその反応溶液中に、フェ
ナンスロリンまたはポリオキシエチレンーアルキルフェ
ニルエーテルマタハその両者を添加してジヒドロウラシ
ルをウラシルに変換させる方法に関する。

本発明を実施するに当ってはロドトルラ層のジヒドロウ
ラシルをウラシルに変換する能力を有する微生物菌体、
あるいはその凍結処理を施した微生物菌体、またはその
微生物菌体より抽出した抽ｔＢ物を、水溶液あるいは有
機溶媒（例えはジヒドロウラシルの溶解性が良いジメチ
ルスルホキシドなど）を加えた水溶液に０６ＩＷ／Ｖ％
以上、好ましくは０．２　ｗ　／　ｖ％〜飽和譲度で溶
解したジヒドロウラシルに、苗温以上、好ましくは２０
〜４５°Ｃで、好ましくは好気的に作用せしめてウラシ
ルに変換する。また、上記方法において反応時に、フェ
ナンスロリンあるいハポリオキシエチレンーアルキルフ
ェニルエーテルまたはその両者を添加してジヒドロウラ
シルをウラシルに変換させる。

なお上述した方法でウラシルを製造した反応混合物は使
用した菌体を除いた後反応溶液を冷却するか、あるいは
濃縮冷却を行なうだけでウラシルを結晶化でき、簡便に
ウラシルを採取することができる。

本発明者等はジヒドロウラシルよりウラシルへの変換を
工業的に行なわせるには、温和な条件下で効率よく反応
が進む酵素を利用する方法が最適であると考えた。しか
してジヒドロウラシルよりウラシルへの変換を行なう酵
素は、動物Ｏ植物・微生物と各種起源より取合選択して
得ることが可能であるが、安価自大倉・簡便に得るには
微生物よりめることが適していると考えられる。このた
めに有用な微生物は、自然界に存在する野生株、あるい
は公的な微生物保存機関に保存されている菌株、あるい
はそれらを自然的または人為的に変異誘導させた菌株よ
り、ジヒドロウラシルをウラシルに変換する能力の有無
を調べることによって選択した。この変換能の検定方法
として、本発明者等は例えば、次のような方法を用いた
。先す）各種菌株に適応した栄養培地で菌体を培養し・
培１１〜１００ｍ／＋を遠心分離で集菌しＳ緩衝敢（ｐ
Ｈ５〜９）で洗滌後、得た菌体を２等分し、２４×２０
０＋＋＋ｍ試験管に採取する。一方の試験管には対照と
して緩衝液（ｐＨ５〜９）を１０麻、他方の試験管には
反応混合物として０．１〜１．０Ｗ／Ｖ％ジヒドロウラ
シルを含む緩衝液（ｐＨ５〜９）をｌＱｍ／ｉ加え１２
０〜４０°Ｃに保ッテ、振盪反応を行ない、反応溶液中
の変換されたウラシルを測定し、ジヒドロウラシルをウ
ラシルに変換する能力を持つ菌株を予備選択する。

上記方法で、ジヒドロウラシルをウラシルに変換しうる
微生物を０．５　ｗ　／　ｖ％ジヒドロウラシル反応液
（ｐＨ７，４）を用いて、３０°Ｃ振盪反応を４０時間
行ない反応溶液中の生成ウラシルを測定して検索したと
ころ、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌ
ａ　ｇｌｕｔｉｎｉｓ　）工ＦＯ−０３８９が０．９Ｐ
／ｌ、工ＦＯ−０４１５が０．２１−／ｌ。

工ＦＯ−０６８８（これらは発酵研究所より入手可能で
ある）が０．４Ｐ／ｌとそれぞれ反応溶液中にウラシル
を生成することを認め、なかでも１ＦＯ−０３８９が優
れたジヒドロウラシルをウラシルに変換する能力を有し
ていることを見いた゛した。

以下の実施例については、ロドトルラ・グルチニスエＦ
Ｏ−０３８９を用いて実施したか１本菌株だけに限定さ
れるものではなく１上述した工ＦＯ−０４１５および工
ＦＯ−０６８８の外ジヒドロウラシルよりウラシルへの
変換能を有するロドトルラ属に属する菌株であれば全て
応用可能であり、また変異処理を施すことでジヒドロウ
ラシルをウラシルに変換する能力を嶋めた菌体に誘導し
て本発明に使用することも可能である。

本発明で用いるロドトルラ・グルチニスエＦＯ−０３８
９は、一般的な天然栄養源を用いた通常の培地で培養し
た場合でも菌体中に、ジヒドロウラシルをウラシルに変
換する能力を生成蓄積するか、培地中に、ジヒドロウラ
シルあるいはウラシルを含有させることにより、ジヒド
ロウラシルをウラシルに変換する能力を一層増加させる
ことができることを見いだした。培地中に含有させるジ
ヒドロウラシル、あるいはウラシルの社は培地組成、経
済性などによって変化するが１通常ｏ、ｏｉｗｙｖ％以
上、好ましくは０．０５〜０．２ｗ／ｖ％の範囲から選
ばれる使用量か適当である。

培養条件は、温度１５〜３５℃、好ましくは２０〜３０
°ＣＮ　ｐＨ３〜９、好ましくはｐＨ４〜７において１
５〜５０時間培養するのが適当である。培養中には、通
気・攪拌を行なって、微生物の生育の増加と共にジヒド
ロウラシルをウラシルに変換する能力の増加を促進させ
うろこと見いだした。このようにして培養の経過と共に
、菌体中にジヒドロウラシルをウラシルに変換する能力
が生成蓄積された。

また本発明者等によれは培養集菌したロドトルラ・グル
チニスエＰＯ−０３８９１体を、１時間以上、好ましく
は１２時間以上、零下１０°Ｃ以下１好ましくは零下２
０〜７０°Ｃで凍結処理することにより、ジヒドロウラ
シルをウラシルに変換する能力が顕著に増加することも
見いだした。

また１０ドトルラ争グルチニスエｔｏ　−０３８９を利
用してジヒドロウラシルよりウラシルへの変換反応を行
なう際、反応効率を上げる各種添加剤をスクリーニング
しだところ、フェナンスロリンあるいは非イオン性界面
挿、性剤であるポリオキシエチレン−アルキルフェニル
エーテルまたはその両者を反応液中に添加することによ
り、ジヒドロウラシルよりウラシルへの変換カ画期的に
増加することも見いだした。その濃度として１フエナン
スロリンは反応液中にＱ、　ｌ　ｍＭ以上、好ましくは
０．５〜５ｍＭの範囲で使用し、ポリオキシアルキレン
−アルキルフェニルエーテルは反応液中に０．０５　ｗ
　／　ｖ％以上、好ましくは０．０５〜０．２　Ｗ　／
　Ｖ％の範囲で使用するのが好ましい。使用しうるフェ
ナンスロリンとしては”１０−＋　−＋Ｐ−７エナンス
ロリンの何れでもよいが、０−７エナンスロリンが好ま
しい。またポリオキシアルキレン−アルキルフェニルエ
ーテルとしては米国のローム・アンド・八−ス社より市
販されている商標名トリトンＸ−４５，１００，１０２
，１１４，１６５゜３０５、および４０５等がある。

ジヒドロウラシルは水難溶性であるため、本発明方法１
こよる反応時においては基質濃度を１ｗ　／　ｖ％以上
に上げることは不可能である。そこで、ジヒドロウラシ
ルを含有せし必た栄養培地で培養したロドトルラ・グル
チニスエＴＯ−０３８９を用いて、０．３５ｗ／ｖ％の
ジヒドロウラシルを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７，８）に
、ジヒドロウラシルを比較的よく溶解せしめるジメチル
スルホキシドを５　ｗ　／　ｖ％以上、好ましくは１０
〜５．　Ｏｗ　／　ｖ％添加した反応液で、好気下に３
０°Ｃ′に保ちＳ３９時間反応を行なった結果、ジメチ
ルスルホキシド１０〜４０　ｗ　／　ｖ％添加した反応
溶液で、７７〜８９％のジヒドロウラシルがウラシルに
変換していた。ジメチルスルホキシドの添加による反応
阻害が見られないことから、ジメチルスルホキシドを反
応数に添加することにより、水溶液反応に比べてジヒド
ロウラシル濃度を上けて反応を行なうことか可能である
ことを見いたしたＯ ロドトルラ・グルチニスエＦｏ　−０３８９は簡単な遠
沈操作、例えば４０００ｒｐｍｓ５分で容易に集菌可能
であるので、本自体を繰り返し利用するのに便利ではあ
るが、さらに連続反応を可能にせしめるには、最近行な
われている固定化菌体にすることが有利である。固定化
法については各種報告、参考文献に詳細に解説されてい
る（　「固定化酵素」千畑一部樹、Ｊ４談社刊；「酵素
工学」福井三部、千畑一部、鈴木周−編、東京化学同人
刊；等）。

本菌体も各種包括固定化法（ポリアクリルアミドゲル、
ポリビニールアルコール、光硬化樹脂、ポリウレタン樹
脂、コンニャク粉、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸
、カラギーナンなどを用いて菌体を包括する方法が一般
に行なわれている）で固定化することが可能である。本
発明で使用するロドトルラーグルチニスエＦＯ−０３８
９菌体をアルギン酸カルシウムゲル包括で固定化を行な
−い、振盪反応、および通気反応で繰り返し反応を行な
ったところ、菌体のままでは、２回目の反応で約５０％
まで反応性４〉低下していたのに比べ、固定化を行なっ
た場合は、２回目の反応でも９０％以上の反応性を保持
していて、固定化を行なうことで、安定性か増し、ジヒ
ドロウラシルよりウラシルに変換する反応を繰り返し行
うことの可能性を見いだした。

本発明によりロドトルラ・グルチニスエＦＯ−０３８９
をジヒドロウラシルに作用せしめてウラシルに変換させ
る際の反応条件を調べたところ、窒素置換の嫌気下では
反応はほとんど進まないが、静置、振盪、通気、攪拌の
いずれでも反応は進むが、好気化条件下で反応を行なっ
た方がより効率よくジヒドロウラシルよりウラシルへの
変換反応が起ることか判った、このため反応効率を上げ
るには酸素の必要性を見いだ、した０また１０ドトルラ
・グルチニスエＦＯ−０３８９菌体細胞を、集めた後緩
衝液で分散後通常行なわれている細胞破壊操作（例えば
・フレンチプレス１１Ｘプレス・イエダブレス等による
加圧型細胞破壊法、あるいは超音波処理法、あるいはボ
ールミルービプロゲンセルミル・ダイノーミル等による
掴潰法等の方法がある）で処理した後、遠心分離を行な
って無細胞抽出液を化１除核酸、硫安分画を行なった抽
出物をジヒドロ“ウラシルに作用せしめたところ、ウラ
シルへの変換と同時に、正確なる反応機構についての詳
細は不明ではめるが、ＨｔＯｚが反応溶液中に放出して
いることを見いたした。

発醇法や発酵蓄ｌｊｆ法によるウラシルの製造法では、
ウラシルだけをイオン交換樹脂などで分離採取する必要
があるが、本発明によるウラシルの製造法では、ロドト
ルラーグルチニスエＦＯ−０，３８９ｉ体をジヒドロウ
ラシルに作用せしめて、ウラシルに変換させた後、濾過
により反応溶液より除菌し、得られた反応清澄液を冷却
するか・あるいは濃縮冷却するかだけで容易にウラシル
の粗結晶を得ることかできた。

以下本発明方法の実施例を示すが、これにより本発明方
法は制限されるものではない。

なお、以下に示す実施例において、ウラシルの定量法は
高速液体クロマトグラフィーによる分離定量、および２
６０ｎｍにおける吸光度の増加をウラシルの２６″Ｏｎ
ｍにおける分子吸光係数８２００で除する方法とで行な
った０両者の定量法とも同一の値が得られた。

実施例　１ ５００祷容坂ロフラスコに、醇母エキス０．３ｗ　／　
ｖ％、麦芽エキスＱ、３ｗ／ｖ％、ポリペプトン０．５
Ｗ／ｖ％、グルコースｉ、ｏｗ／ｖ％、ジヒドロウラシ
ル０．１Ｗ／ｖ％（ｐＨ６，０）を１００ｍＡ投入し、
１２０°Ｃで１５分オートクレーブ処理後、ロドトルラ
−グルチニスエＦＤ−０３８９を三白金耳接種し、３０
°Ｃで２４時間振盪培養し前培養液とした。次いで、２
１容ミニジヤーに上記と同じ培地ＩＩ！とカラリン（登
録商椋：三洋化成工業株式会社製、ポリオキシアルキレ
ングライコールエーテル）１１を投入し、１２０″Ｃで
１５分オートクレーブ処理後１上記前培養液１０祷を接
種し、２７”Ｃ１６００ｒｐｍｓ　ｌ　ｖｖｍにて２４
時間通気攪拌培養を行なった。培養終了後、培養液を連
続遠心分Ｉｔ　（５０００ｒｐｍ　）で集菌したとこ・
ろ、３基の２１！容ミニジヤーで湿菌体１３５１を得た
０本湿菌体の一部をフリーザー（約零下３０°Ｃ）で凍
結保存し、使用の都度融、解して、リン酸緩衝液（１０
ｍＭ　ｐｆ１７，４）で３回洗滌後、ジヒドロラブシル
からウラシル・＼の変換反応に供した。

２４Ｘ２００ｍｍ試験管に、未凍結菌体および凍結保存
菌体を０．５３　Ｐずつ採取し、３５グジヒドロウラシ
ルを含むリン酸緩衝７１＋、　（１０ＱｍＭｐＨ７，８
）を１０祷投入し、３０’Ｃで撮盪反応を行ない、２０
時間目の反応浴液中に生成したウラシルを定量したその
結果、表１の如く、零下３０℃で１２時間以上凍結する
ことにより、ジヒドロウラシルからウラシルへの変換率
が未凍結の場合の１１％であるのに対し、６９％以上の
ジヒドロウラシルがウラシルに変換していた。

表　１ 実施例　２ ５００ｍＡ容坂ロフラスコに、醇母エキス０３ｗ　／　
ｖ％、麦芽エキス０．３　ｗ　／　ｖ％、ポリペプトン
Ｏ，，，５ｗ　／　ｖ％、グルコース１．ＯＷ／ｖ％、
ウラシル０．ＩＷ／Ｔ％（ｐＨ６，０）を１００ｍ６投
入し、１２０°Ｃで１５分オートクレーブ処堆後１０ド
トルラ′拳グルチニスエＦＯ−０３８，９を三白金耳接
種し、３０℃で３０時ｒｕＪ振盪培養を行ない１培養終
了後培養液を遠心分ｌｔＡ（４０００ｒｐｍｓ５分）で
集菌し・リン酸緩衝液（１０＋ｎＭｐＨ７，４）で２回
洗滌し、同緩街液で３Ｑ〃＋７に分散定容した。その菌
体分散液３ｍΔを加えた表２に示す反応液を用い、２４
　Ｘ　２００　ｎｎ試験管中で３０℃で！盪反応を行な
い、２０時間目の反応溶液中の生成ウラシルを定量した
結果、表２・、の如＜％Ｏ−７エナンスロリン、あるい
はトリトンｘ−ｉｏｏまたはその両者を添加した反応溶
液では、ジヒドロウラシルのウラシルへの変換率は無添
加の場合は１１％であるのに対し１８０％以上の変換率
を示した。

表　２ 実施例　３ 実施例２と同様にして、５００ｍｊ容坂ロフラスコにて
ロドトルラ・グルチニス１Ｆ’０−０３８９を培養して
、４９１の湿菌体を得た。得た湿菌体１．２ｙ−を水２
．８　ｍ＜で分散した。１２０″Ｃで１５分オートクレ
ーブ処理後室温まで冷却した５Ｗ／Ｖ％アル・ギン妙ナ
トリウム４？を上記分散液に加え、よく混合後、注射器
１よりｌ　ｗ　／　ｖ％塩化カルシウムを含むトリス−
塩酸緩衝液（１０ｍＭ’ｐＨ３，４）、５００ｍ１Ｖ中
へゆるやかに撹拌しながら、上記の菌体嗜アルギン酸ナ
トリウム混合溶液を滴下し、径３園前後のビーズ状の固
定化菌体を作製した。滴下後、さらに１時間・≧１温で
ゆるやかに攪拌下に放置した。得た固定化菌体をＰ紙濾
過にて集め、Ｐ紙上で５ｍＭ塩化カルシウムを含む５０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液で洗滌後、固定化菌体を２４Ｘ
−２００圏試験管に採取し、下記反応液ＩＱｍ６を投入
して、３０°Ｃで振盪反応を鞠り返し行なった。固定化
一体の対照として、湿菌体を０．６　ｇ−２４Ｘ　２０
０票試験管に採取し、下記反応液ＩＱ＋ａ６を投入して
、固定化菌体と同様に振盪反応を繰り返し行なった。

反応溶液中に生成したウラシルを定量した結果、表３の
如く、固定化固体の方が繰り返し反応時の安定性が高か
った。

表　３ 実施例　４ 実施例１での零下３０°Ｃで１０日問凍結保存した菌体
ロドトルラ・グルチニスエＦＯ−０３８９の１１１ｉ［
２，１２？を水４．６　ｍｔに分散後、１２０°Ｃで１
５分オートクレーブ処理した５　ｗ　／　ｖ％アルギン
酸ナトリウム溶ｆ！１．８ｙを用い、実ＭＬｉ　ｆＡｉ
３と同様に固定化を行ない、得た固定化歯体を４等分し
、２１×２００　ｒｔｍ試験管に採取し、下記反応液１
０縦投入し、３０’Ｃに保ぢ、ガラススバジャーによる
通気ｔＩ装置反応の繰り返しを行なった。固定化菌体の
対照としては、凍結１体を０５３１ずつ、２１ｘ２ｏＯ
団試験管に採取し、下記反応液ＩＱｍ８投入し、固定化
菌体と同様に反応を行なった。反応浴液中の生成ウラシ
ルを定量した結果・表４に示す如＜、固定化するごとに
より繰り返し反応時の安定性が増大した。

反応液 ０は変換率％を示す。

実施例　５ 実施例１で得た、２０日間零下３０℃の凍結保存した菌
体ロドトルラ・グルチニスエＦＣ＋　−０３８９の湿重
量８ｇ−を融解後・リン酸緩衝液（２０ｍＭ　ｐＨ７，
８）で３回洗滌、同緩衝液２０ｍ６で分散後１５〜２０
℃に保って、約３０分間超音波処理を行ない、処理後遠
心分離（１１００００ｒｐ、１０分）で無細胞抽出液を
得た。この無細胞抽出液による、ジヒドロウラシルから
ウラシル゛への変換反応を、２４Ｘ２００ｍ試験管を用
い、３０°Ｃに保って、振盪反応で行なった結果、表５
の如く、０−フェナンスロリンおよびトリトンＸ−１０
０の添加有無にかかわらず、１９時間で７４〜８２％の
ジヒドロウラシルがウラジノｋに変換された。

実施例　６ 実施例１で得た、４０日間零下３０℃の凍結保存した菌
体ロドトルラ・グルチニスエＦＯ−０３８９を融解後、
湿重量４９Ｐと１ジヒドロウラシル３．５　ｙ−、カラ
リン４ｙ、および１ｍＭの０−フェナンスロリンを含む
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，８）　１１とを２１
容ミニジヤーに投入し、３０℃に保って通気攪拌反応を
４７時間行なった。反応終了後為遠心分離（４０００ｒ
ｐｍ、５分）で除菌し、９７５ｍｔ、の清澄液を得た。

本清澄液を冷蔵庫で冷却保存したところ、針状の結晶物
を得た。本結晶物を硬質Ｆ紙で殴りＩＰｉｆ、　ｉｐ紙
上で少量のエタノールにて洗滌、約６０℃で乾燥、ｘ、
５６？の結晶を得た。本結晶標品１を高速液体クロマト
グラフィーで調べたところ、９７．４％のウラシル純度
を示していた（収率４５．４％）０結晶椋品Ｉを水に再
溶解して再結晶を二度行なって得られた精＠椋品の元紫
分析はＯ：４２．８９％、Ｈ：３．５７％、Ｎ：２５．
００％、ｏ；２８．５４％（理論値０−’　：　４２．
８６％　＋’　Ｈ：　ｓ、　６ｏ％、　Ｎ：２４．９９
％ｌ　Ｏ：２８．５５％）であり、そのＵＶスペクトル
は純粋なウラシルのものとよく一致していた。

先の結晶物を取り除いた母液約９７０ｍＡ・をエバポレ
ーターにて、約１００ｉ＃ｔで濃縮後、冷Ｍ庫に冷却保
存して結晶を生成し、得た結晶を硬質ｐ紙で殴り［濾過
後１Ｆ紙上にて少量のエタノールで洗滌、約６０℃で乾
燥１，１．３５Ｆの結晶を得た。本結晶標品Ｂを高速液
体クロマトグラフィーで調べたところＳ５２．８％のウ
ラシル純度を示していた（収率５１．４％）０手続補正
書（自発） 特許庁長官若杉和夫殿 １、事件の表示　昭和５８年特許願第１０９９９３号２
、発明の名称 ジヒドロウラシルよりウラシルを製造する方法３、補正
をする者 事件との関係　特許出願人 ＼入旌朧 Ｎ＼名称　ナガセ生化学工業株式会社 ４、代理人 ６、補正の内容 （１）明細書第１１頁下より第４行「ポリオキシアルキ
レン」を「ポリオキシエチレン」と訂正する。

（２）同第１２頁第３行「ポリオキシアルキレン」を「
ポリオキシエチレン」と訂正する。

（３）同第１５頁末行「ｐ過により」を「濾過または遠
心分離等により」と訂正する。

（４）同第１７頁第２行「ポリオキシアルキレングライ
コールエーテル」を「ポリアルキレングライコールエー
テル」と訂正する。

（５）同第２０頁下より＠５行〜第４行「湿菌体１．２
りを水２．８　ｆｆ１ｌ！’　Ｊを［湿菌体０．６９を
水１．４’ｍｌ’Ｊと訂正する。

（６）同第２０頁下より第２行「アルギン酸ナトリウム
４り」を「アルギン酸ナトリウム２ｇ」と訂正する。

（７ン同第２２頁下より第１０行［湿重量２．１２９を
水４．５　ｍｅ　Ｊを［湿重量１．０６９を水２．３　
ｍｅ　Ｊと訂正する。

（８）同第２２頁下より第８行「アルギン酸ナトリウム
溶液」の次の「８ｇ」を「４ｇ」と訂正する。

（９）同第２２頁下より第６行「４等分し、」を「２等
分し、」と訂正する。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　ジヒドロウラシルをウラシルに変換する能力を有
   するロドトルラ属に属する微生物菌体、あるいはその凍
   結処理を施した微生物菌体、あるいはその微生物菌体よ
   り抽出した抽出物の何れかをジヒドロウラシルに作用さ
   せることを特徴とするジヒドロウラシルよりウラシルを
   製造する方法。 ２、　ジヒドロウラシルをウラシルに変換する能力を有
   するロドトルラ属に属する微生物菌体、あるいはその凍
   結処理を施した微生物菌体、あるいはその微生物菌体よ
   り抽出した抽出物の何れかをジヒドロウラシルに作用さ
   せることによりジヒドロウラシルよりウラシルを製造す
   る方法において、反応溶液中に７エナンスロリンまたは
   ポリオキシエチレン−アルキルフェニルエーテルまたは
   その両者番添加することを特徴とするジヒドロウラシル
   よりウラシルを製造する方法。 ３、微生物菌体が固定化した微生物菌体である特許請求
   の範囲第１項または第２項記載の方法。 ４′、凍結、処理を施した微生物菌体か固定化した微生
   物菌体である特許請求の範囲第１項または第２項記載の
   方法。 ５、凍結処理を一１０℃以下で１時間以上行なう特許請
   求の範囲第１項または第２項記載の方法０ ６、凍結処理を−２０〜−７０°Ｃで１２時間以上行な
   う特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７、７エナンスロリンは０−７エナンスロリンである特
   許請求の範囲第２項記載の方法。 ８、ｏ−７エナンス四リンをＱ、　ｌ　ｍＭ以上使用す
   る特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、ｏ−７エナンスロリンヲ０．５〜５　ｍＭ使用する
   特許請求の範囲第８項記載の方法。 １０、ホ！Ｊオキシエチレン−アルキルフェニルエーテ
   ルがポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニルエ
   ーテルである特許請求の範囲第２項記載の方法。 １１、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニル
   エーテルを０．０５Ｗ／ｖ％以上使用する特許請求の範
   囲第１０項記載の方法。 １２、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニル
   エーテルを０．０５〜０．２ｗ／ｖ％使用スる特許請求
   の範囲第１１項記載の方法。 １３、ロドトルラ層に属する微生物菌体が工ＦＯ二０３
   ８９　、　ＩＦＯ−０４１５またはＩＦＯ−０６８８で
   ある特許請求の範囲第１項または第２項記載の方法。