JPS62500352A - キメラ抗体の産生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 キメラ抗体の産生 本発明は、組替えＤＮＡ技術を使用してキメラ抗体を産生ずる方法に関する。

本出願において、「キメラ抗体」という用語は、他のタンパク質の少くとも一部 にペプチド結合によって連結された免疫グロブリン分子（Ｉａ）の少くとも抗原 結合部を含むタンパク質を表現するために用いられる。

近来、組替えＤＮＡ技術にもとずく分子生物学の発展は、所望の産生物の産生を コードする異種ＤＮＡ配列によって宿主細胞を形質転換することにより広範囲の 異種ポリペプチドを産生ずる諸方法を提供した。

ＥＰ−Ａ−００８８９９４（シエリング、コーポレーション）は、所定のリガン ドに対して特異的なＩＣＩのＬ鎖またはＨ鎖の可変部をコードするｄｓＤＮＡ配 列を含む組替えＤＮＡベクターの構成を提案した。このｄｓＤＮＡ配列はその５ ′および３′端末においてそれぞれ開始コドンと終結コドンを備えているが、可 変部よりも過剰なアミノ酸をコードするヌクレオチドを欠いていた。このｄｓＤ ＮＡ配列は細菌細胞を形質転換するために用いられる。当該出願はキメラ抗体の 産生を考えていない。

ＥＰ−Ａ−１１０２６３４（武田薬品工業株式会社）は細菌宿主組織の中でのヒ トＩｑＥの１」鎖ポリペプチドの全部または一部をコードする遺伝子のクローニ ングおよび発現について記載しているが、キメラ抗体の産生については考えてい ない。

ＥＰ−Ａ−０１２５０２３（ジエネンテツク、インコーホレーテッド他）は本出 願の優先日の後に公開されたものであるが、細菌細胞中でを椎動物系で通常見出 されるＩＣＩに類似するＩＣＩを産生じ、かつそこに提案された遺伝子修飾技術 を利用してキメラＩＱまたはその他の修飾された形態のＩＣＩを作るために、組 替えＤＮＡを使用することを提案している。

上記ジエネンテツクの出願に記載された提案は、有意の量の■９ポリペプチド鎖 の発現につながらなかったし、ＩＱ活性の発生や各項を分泌し組立てて所望のキ メラＩＣＩを作ることにもつながらなかったと者えられる。

モノクローナル抗体の産生はコーラ−およびミルスティンによって最初に発見さ れた（Ｋｏｈｌｅｒ、Ｇ、およびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ，Ｎａｔｕｒｅ２５６巻 ４９５〜４９７頁、１９７５年）。このようなモノクローナル抗体は診断用試薬 （たとえば「８０年代の免疫学Ｊ　ＶＯｌｌｅｒ、Ａ、、Ｂａｒｔ　Ｉｅｔｔ、 　Ａ、およびＢｉｄＷｅｌｌ、Ｄ、　）ＩＴＰプレス、ランカスター、１９８１ 年参照）のみならず治療（たとえばＲｉｔＺ、、ＪおよびＳｃｈｌｏｓｓｍａｎ 、Ｓ、Ｆ、　、Ｂｌｏｏｄ　５９巻１−１１頁、１９８２年参照）にも広範囲の 用途を見出した。

ＩＣ＋遺伝子ＤＮＡをミエローマ細胞に安定に導入することを許容する諸技術が 最近用れることにより（たとえばＯｉ、Ｖ、丁、　ＨＯｒｒｉＳＯｎ、Ｓ、Ｌ、 　、ＨｅｒＺｅｎｂｅｒｇ、Ｌ、Ａ。

およびＢｅｒｇ、Ｐ、　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８０巻８２５〜８２９頁、１９８３ 年、ｔｔｅｕｂｅｒｇｅｒ、　）１．　Ｓ、、ＥＭＢＯＪ、　２巻１３７３〜１ ３７Ｂ頁、１９８３年、０ｃｈｉ、Ｔ、　、）ｌａ′１ｖｌｅｙ、Ｒ，Ｇ、、Ｈ ａｗｌｅｙ、Ｔ、　、Ｓｃｂｕｌｍａｎ、Ｈ，Ｊ、　、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ、 Ａ、　、に０ｈｌｅｒ、Ｇ、およびｌ−１−１ｏｚｕ、Ｎ、　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ ８０巻６３５１〜６３５５頁、１９８３年参照）、インビトロ突然変異とＤＮＡ 　トランスフェクションを使用して新しい性質を備えた組替えＩＣＩを構成する 可能性が開かれた。

しかしながら、Ｉｇ分子の機能はその三次元構造に依存しており、該三次元構造 はその一部アミノ酸配列に依存していることが知られている。したがって、ＩＱ のアミノ酸配列を変えることはその活性に悪影響を与えることが考えられる。ま たＩＱをコードするＤＮＡ配列における変化はそのＤＮＡ配列を含有する細胞の ＩＣＩを分泌し組立てる能力に影響するかも知れない。

したがって、組替えＤＮＡ技術によって機能的な改変された抗体を作ることが可 能かどうかはまったく不明である。

同様な考慮はその他のタンパク質にもあてはまる。

したがって、ＩＣＩの少くとも一部をコードする遺伝子を他のタンパク質の少く とも一部をコードする遺伝子と結合することが、前記するキメラ抗体を形成する ために分泌され組立てられるタンパク質の発現はおろか、なんらかのタンパク質 の発現につながるということは期待できない。

しかし、本発明者らは、予想に反して、組替えＤＮＡ技術により、タンパク質の どちらの部分も機能する、分泌され、組立てられたキメラ抗体を産生することが 可能なことを発見した。

この驚くべき結果は本発明の方法を用いることにより達成される。この方法は次 の工程を含むものである。

（ａ）１０分子のＨ鎮またはし鎖の可変部をエンコードする第１の部分と第２の タンパク質の少くとも一部をエンコードする第２の部分とを含むＤＮＡ配列に作 用可能に結合した適当なプロモーターを含む複製可能な発現ベクターを調整する 工程 （ｂ）必要に応じ、１０分子の相補的り鎖またはＨ鎖の少くとも可変部をエンコ ードするＤＮＡ配列に作用可能に結合した適当なプロモーターを含む複製可能な 発現ベクターを調整する工程 （Ｃ）イモータライズされた（ｉｍｍｏｒｔａｌ　１ｚｅｄ）吐乳動物　゛細胞 系を前記調整したベクターで形質転換する工程、および、 （ｄ）キメラ抗体を産生するため前記形質転換した細胞系を培養する工程。

イモータライズされた細胞系としてはリンパ球起源のちの、たとえばミエローマ 、ハイブリドーマ、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）またはカドロー？　（ｑｕａｄ ｒｏｍａ）各細胞系等が好ましい。細胞系はＥｐｓｔｅｉｎ　−Ｂａｒｒビール ス等のビールスによる形質転換によってイモータライズされたたとえばＢＩＩＩ Ｉ胞等の通常のリンパ球を含むことができる。もつとも好ましい細胞系はミエロ ーマ細胞系またはその誘導体である。

ミエローマ＃ｌｌｌ胞系等のイモータライズされたリンパ球系はその通常の状態 において分離したＩＱＬ鎖またはＨ鎖を分泌することが知られている。このよう な細胞系を本発明の方法の上記工程（ａ）において調製したベクターにより形質 転換すると、この通常分泌される鎖が工程（ａ）において調製されたベクターの 第一の部分によってエンコードされるＩＱ分子部分と相補的でおるならば、本発 明の方法の工程（ｂ）を実施する必要はない。

しかし、イモータライズされた細胞系が相補的な鎖を分泌しない場合は、工程（ ｂ）を実施する必要がある。

この工程は工程（ａ）において産生されたベクターが可変部と第２のタンパク質 の結合をエンコードするばかりでなく、相補的可変部分をエンコードするより、 このベクターをざらに操作することによって実施することができる。しかし、工 程（ｂ）はイモータライズされた細胞系を形質転換するために使用される第２の ベクターを調製することにより実施することが好ましい。

このようなベクターを産生しイモータライズされた細胞系を形質転換するために 使用する諸技術は周知であり、本発明のいかなる部分をも構成するものではない が、これらの技術は以下の実施例において充分に説明されている。

イモータライズされた細胞系が相補的なＬ鎖またはＨ鎖を分泌する場合は、適当 な細菌細胞をベクターで形質転換し、次いでこの細菌細胞をイモータライズされ た細胞系と融合させること、たとえばスフェロプラスト融合、によって形質転換 されたｍ胞系を産生することができる。

ＤＮＡ配列の第１の部分はその第２の部分に直接結合させることができる。また 第１の部分は、特異的な切断配列たとえば本出願人の同時に係属しているヨーロ ッパ特許出願第８５３０３４１４．８号に記載されたようなファクター＞（ａ切 断配列をエンコードする介在配列によって、第２の部分に結合させることができ る。特異的な切断配列の使用に関するこれ以上の説明については上記出願を参照 されたい。　、ＤＮＡ配列の第２の部分は次のものをエンコードすることができ る。

（１）異る種、クラスまたはサブクラスの１０分子の少くとも一部、たとえばＨ 鎖の不要部 （２）酵素の少くとも活性部位または全部（３）既知の結合特異性を有するタン パク質（４）既知の遺伝子によって発現されるが、その配列、は能または抗原性 は知られていないタンパク質、または、 （５）リジン等のタンパク質毒素 上記（１）の場合産生されるキメラ抗体は多くの応用、例を有する。たとえば、 ある確立された細胞系は有用な特異性を有するＩＣＩ分子を産生することができ る。

しかし診断用または治療用としては好ましくないクラスのものかも知れないし、 役に立つだけの量を分泌できないかも知・れない。たとえばクラスＭのＩｇは高 速な免疫検定技術において使用することは難しいし、また治療において使用する ことは一般に不便でおることが知られている一方、クラスＧのＩＱはこれらの技 術において容易に使用することができる。したがってＩＣＩＭのＨ鎖不変部をＩ ＣＩＧのＨ鎖不変部によって置換することによって有用な免疫検定用試薬を産生 ずることが可能となる。このような使用法の具体的な例は、ＩＣ７Ｍ分泌ミエロ ーマ由来の抗Ｒｈ特異性と、ＩＣＩＧ由来Ｈ由来交鎖不変部て提供されるＩＣＩ Ｇ反応性とを備えるキメラ抗体でおる。

また、キメラ抗体は、ＩｇＧ由来可変部とＩｇＥ由来Ｈ鎖不変部とを含むことが できる。このようなキメラ抗体は、たとえばカリブレーティングテスト法等診断 用検定において、肥満細胞に対するＩＣＩＥの作用を調べるために用いることが でき、または治療において通常のＩＱＥ分子の肥満細胞に対する作用によって生 じるアレルギー反応を抑止するために用いることができる。

さらに、キメラ抗体はＨ鎖不変部を変えることにより抗体の神体結合作用を変更 するために用いられる。

またさらに、キメラ抗体は、通常の抗体のＦ　（ａｂ）’　２フラグメントに類 似するように構成することができる。

上記（２）の場合に産生されるキメラ抗体は、特にエンザイムリンクトイムソア ツセイ（ＥＬＩＳＡ）システムにおいて、現在の抗体と酵素を別々に使用する方 法に代って使用することができる。

上記（３）の場合に産生されるキメラ抗体も免疫検定に使用することができる。

たとえば、そのタンパク質は容易に検知できる標識、たとえば重金属や放射性金 属または染色されたあるいは染色され得る分子等に対し結合特巽性を有すること ができる。たとえば、各末端部に異る可変部を有し、該末端部が不変部の少くと も一部によって連結されている二価キメラ抗体を産生ずることができる。

上記（４）の場合に産生されるキメラ抗体は既知の遺伝子の産生物を調べるため に使用することができる。

たとえば、特定の遺伝子が細胞の表面標識に関与するタンパク質を産生ずること が知られていたとしても、この表面標識物の性質は正確には知られていないかも 知れない。（４）において産生された抗体はこの遺伝子のタンパク質産生物を含 むことができ、したがってこの産生物はより容易に性格ずけすることができる。

その上この遺伝子産生物に対する抗体を産生させることができ、この抗体を使っ て細胞表面上の当該遺伝子産生物の分布を調べることができる。

上記（５）の場合産生されるキメラ抗体はたとえばガン治療用の目標とする細胞 障害性試薬として、明らかに治療に使用することができる。この点についてＴｈ ｏ−ｒｐｅ　ｅｔ　ａｔによる論文（Ｔｈｏｒｐｅ、Ｐ、Ｅ、　、Ｅｄｗａｒｄ ｓ、Ｄ、Ｃ，、Ｄａｖｉｅｓ、　Ａ、　Ｊ、Ｓ、およびＲｏｓｓ、Ｗ、Ｃ，Ｊ、 ｒ医療におけるモノクローナル抗体４１６７〜２０１頁　）ＩＣＨｉＣｈａｅｌ 、Ａ。

Ｊ、およびＦａｂｒｅ、　Ｊ、　Ｗ、　ｌアカデミツクプレス、１９８２年）を 参照することができる。

本方法によって産生されるキメラ抗体は、そのＤＮＡ配列が特異的切断部位をエ ンコードする場合は、第２のタンパン質を精製するために使用することができる 。たとえば、可変部をクロマトグラフィー媒体上で固定化されるハプテンに対し 特異的とすることができる。次いでキメラ抗体をアフィニティークロマトグラフ ィーによって固定化した後混交物質を洗い流す。

次に可変部をクロマトグラフィー培地から溶離する前か後に第２のタンパン質を 可変部から切断することができる。

上記（２）ないしく４）に記載した型のキメラタンパク質は本発明の諸態様を含 む。

添付図面を参照して、限定を含まない例示としてのみ本発明の詳細な説明する。

添付図面において、第１Ａ図はプラスミドｐｓｖ−ｖつ１の構造を示す。

第１Ｂ図はプラスミドｐＳｖ−■ｔ１１で形質転換したＪ５５８Ｌ細胞系によっ て産生される１ｇＭの予想される構造を示す。

第２図はプラスミドｐｓＶ−Ｖ、１によって形質転換したＪ５５８Ｌ細胞系によ り産生される精製ＩＣ１Ｍ分子のポリアクリルアミドゲルを示す。

第３Ａ図はプラスミドｐｓｖ−ｖＮｐγδの構造を示す。

第３Ｂ図はプラスミドｐｓｖ　ＶＮＰ７”δによって形質転換したＪ５５８Ｌ細 胞系によって産生されたＦ　（ａｆｉ）　′２キメラ抗体を示す。

第４図は種々のプラスミドで形質転換したＪ５５８Ｌ細胞系によって産生される 精製産生物のポリアクリルアミドゲルを示す。

第５図はツニカマイシンの存在下または不存在下で種々のプラスミドで形質転換 したＪ５５８ＬｉＤ胞系によって産生きれる精製産生物のポリアクリルアミドゲ ルを示す。

第６Ａ図はプラスミドｐＳＶ−ＶＨｐ７”５Ｎａｓｅの構造を示す。

第６Ｂ図はプラスミドｐＳＶ　ＶＨｐＴＳＮａＳｅ　テ形質転換した。Ｊ　５５ ８　Ｌ細胞系によって産生されたキメラ抗体の予想される構造を示す。

第７図は５Ｎａｓｅ活性をモニターするために使用されるポリアクリルアミドゲ ルを示す。

第８図はＥＩＳＡ型検定を示す。

第９図はプラスミドｐｓＶ−ＶＮｐＴｍｙｃの構造を示す。

第１０図はＦａｂ−ｍｙｃにおけるｃ−ｍｙｃ抗原決定基に対する検定を示す。

第１１図はプラスミドｐＳＶ　ｖＮＰ）−１εのに構造を示す。

第１２図は結合抑止検定によるキメラＩＣＩＥの血清分析を示す。

第１３図は精製キメラＴＣＩＥのポリアクリルアミドゲルを示す。

第１４Ａ図はプラスミドｐｓｖ　ＶＮＰ７にｌｅｎｏｗの構造を示す。

第１４Ｂ図はプラスミドｐｓＶ　ＶＮＰ７に＋　ｅｎｏｗで形質転換したＪ５５ ８Ｌ細胞系によって産生されたＦａｂ−γＫｌｅｎｏｗキメラ抗体の予想される 構造を示す。

第１５図は精製Ｆａｂ−γ旧ｅｎｏｗキメラ抗体のポリアクリルアミドゲルを示 す。

第１６図はＫｌｅｎｏｗフラグメント活性に関する検定を示す。

各プラスミドを示す各図において、細い水平線はｐｓｖ２ｃ＋ｐｔベクターを示 し、太い線はマウスまたはヒトＩＱＩ伝子ＤＮＡを示し、エクソンはボックスで 示し、斜線部は第２のく非Ｉｇ）タンパク質ＤＮＡを示す。

Ｈ鎖位置転写エンハンサ−要素（Ｅ）およびｇｐｔ遺伝子の各位置が示されてい る。制限エンドヌクレアーゼ切断部位は以下のとおり略記する。

Ｒ＝Ｅｃｏ　ＲＩ、Ｘｆｆ１＝ＸｈＯＩ、３＝３ａｃ■、Ｓｌ／Ｘｈ＝Ｓａｌ　 Ｉ部位をＸｈｏ　Ｉ部位に結合することによって形成される配列。この配列はプ ラスミドｐｓｖ−ＶＨｐ７ＳＮａＳｅのＸｈＯ■部位の周りに存在し、γ２ｂ　 ＣＨ２エクソンと５Ｎａｓｅ　Ｍ伝子の接合部を形成する。

ＩＣ１分子とキメラ抗体の予想される構造の図式的表現において、Ｈ鎖（Ｈ）と Ｌ鎖（λ）のジスルフィド結合は（−３−）で示す。また１０価のｐＳＶ−Ｖつ １によってエンコードされるＩＱＭの１サブユニツトのみが示されている。

以下の各実施例においては、２．Ｌ鎖を分泌するが　・ＩＱＩ−１鎖を産生じな い確立したマウス形質細胞腫細胞系Ｊ５５８Ｌを使用した。この形質細胞ｌｌ！ 細胞系についてはＱｉｅｔａｌによって記述がなされている（０１゜■、■、　 、）Ｉｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓ、Ｌ、　、Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ、Ｌ、Ａ、およびＢ ｅｒｇ、Ｐ、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　第８０巻８２５−８２９頁、１９８３年）。

これらの実施例において、還元した試料は１２％ポリアクリルアミドゲルにより 分析し、還元していない試料は７％ポリアクリルアミドゲルによって分析した。

これら実施例はＮｅｕｂｅｒｇｅｒ、）！、５．　ＥＨＢＯＪ、２巻１３７３〜 １３７８頁、１９８３年に記載されたプラスミドｐＳｖ−ｖつ］を使用している 。このプラスミドは発現ベクターｐＳＶ２（ｌＩ）ｔにりＯ−ンした完全なマウ ス免疫グロブリンμ遺伝子を含み、それは第１Ａ図に示されている。このプラス ミドによってエンコードされるＩＱμポリペプチドはバブテン４−ヒドロキシ− ３−二トロフエンアセチル（ＮＰ＞に特異的なλ１Ｌ鎖保有マウス抗体に特徴的 なＨ鎖可変部Ｖ■を有している。

ドされたＨ鎖とマウスλ１Ｌ鎖との会合にともなって形成されるはずである。

これを確認するために、ｐＳＶ−Ｖｔ１１ＤＮＡをスフエロプテスト融合により Ｊ５５８Ｌ細胞系に導入し、上記ＮｅＵｂｅｒｇｅｒ論文記載のものとほぼ同じ 選択培地で増殖させた。ただし、選択培地からＨＡＴを省略し、その代りに上記 Ｑｉｅｔａｌ論文に記載されたように、ミコフェノール酸５μｇ／７！を使用し た。細胞は限界希釈法によりクローンした。抗体試料は、５％ウシ胎児血清を含 むダルペツ＝＋修正Ｅａｇｌｅ培地（ｎｕ　Ｉ　ｂｅｃｃｏ　’　ｓｍｏｄｉｆ ｉｅｄ　Ｅａｇ＋ｅ’ｓ　ｍｅｄｉｌＪＩＩｌ　）中で増殖したクローンＪ５５ ８Ｌトランスフエクタント上清から精製した。上清（２リツトル）を４−ヒドロ キシ−５−ヨー素−３−ニトロフェンアセチル−アミノ−カプロン酸セファロー ズ（ＮＩＰｃａｐ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ）　２　ｒｎｌｌのカラムを通過させ、 リン酸塩緩衝生理食塩水中で１　ｍＨＮＩＰｃａｐＯＨを使用して抗体を洗浄ソ ルベントから溶離した。

Ｌ−（３５Ｓ）−メチオニンを含む培地中で３７℃で４時間インキュベートした 細胞上清から４０μＩＮＩ叶Ｃａｐ−セフ１０−ズ力ラム上で生合成的に標識し た抗体を精製した。標識の間および８μ９／ｍｌｌで２時間のブリインキュベー ションの間（ＩＱＥ分泌細胞系を用いて並行して行ったインキュベーションによ りこの処理方法の効果が確認された）、必要に応じツニカマイシンを使用した。

安定にトランスフェクトされた細胞を限界希釈法によって選択しクローンした。

２０のクローンをラジオイムノアッセイにより分析したところ、各々が高レベル のＮＰ特異的ＩＱＭ抗体を分泌した。第２図に示すように、等質の抗ＮＰＩＣＩ Ｍ抗体を、約３ｍ９／ｍｌの収率でｐｓｖ−ｖ、１でトランスフェクトされたク ローンの上清から精製することができる。

第２図において、レーン（ａ）は電気泳動前に２−メルカプトエタノールで煮沸 してクーマシーブルーで染・めた精製した抗体（３０μｇ）を示す。レーン（ｂ ）は鎖の分子量の測定を可能とするマーカー示す。ＰＶ−た１ｇ分子の予想され る構造は第１Ｂ図に示されている。

実施例１　Ｆ（ａｂ）’　２類似キメラ抗体・　ｐｓｖ−ｖつ１の誘導体が作ら れ、この誘導体においてはＣウエクソンがマウスγ２ｂ４伝子のＣＩ−１１、ｌ Ｉ’ｊよびじンジ部のエクソンよって置換された。礫訳終止配列およびポリアゾ ニレ−ジョン配列を提供するため、分泌されたマウスδ鎖をエンコードする遺伝 子に由来するエクソンＣδＳを遺伝子の３′末端に置いた。こうして構成された プラスミドｐｓｖ　ＶＮＰＴδは第３Ａ図に示されている。

プラスミドｐｓｖ　ＶＮＰγδを構成するため、共通のＥｃｏ　ＲＩフラグメン トに含まれるｐｓｖ−Ｖｔ１１由来ＶＮＰエクソンを、３ａｍ　ＨＩ部位に没四 −■アダプターを有するｐ　ｓ　ｖ　ｇ、ｔの１３ａｍＨＩ−ＥＣＯＲ１フラグ メント（Ｍｕ　Ｉ　ｌ　ｉ　ｇａｎ、　Ｒ，Ｃ，およびＢｅｒｇ。

Ｐ、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ７８巻、２０７２−２０７６頁、１９８１年参照）からな るベクター中に置く。該プラスミドはファージλＭ　Ｙ　Ｇ　９　（Ｎｅｕｂｅ ｒｇｅｒ、　Ｈ，Ｓ、およびＣａ１ａｂｉ、Ｆ。

Ｎａｔｕｒｅ３　Ｑ　５巻２４０〜２４３頁、１９８３年参照）由来Ｅｃｏ　Ｒ １−３ａｃ　Ｉ？ウスＣγ２ｂフラグメントを含んでいる。ｐｓＶ−ＶＮｐＴδ プラスミドとしてのマウスＣａＳエクソンはファージＣｉ　２５７ｅｎｇ、１１ ．Ｌ、　、Ｂｌａｔｔｎｅｒ、Ｆ、Ｒ，、Ｆｉｔｚｍａｕｒｉｃｅ、Ｌ、Ｈｕｓ ｈｉ−ｎｓｋｉ　、Ｊ、Ｆ、およびＴｕｃｋｅｒ、Ｐ、Ｗ、　Ｎａｔｕｒｅ２９ ６巻４１０〜４１５頁、１９８２年）、それはＭ１３ｍｌ）１１中でクローンし た後Ｓａｃ　ｌ−３ａｃ　Ｉフラグメントプラスミドｐｓｖ　ＶＮＰγδの切断 されたト１鎖遺伝子は、カルボキシ末端においてＣ５Ｓエクソンによってエンコ ードされる２１のアミノ酸尾部を有するγ２ｂヒンジを介してジスルフィド結合 された２つのＩＣＩＧ２ｂ　Ｆａｂ分子からなる、第３Ｂ図に図式的に示すよう なＦ（ａｂ）’　２類似キメ−ラ抗体の合成を司令することが予想される 一７ラスミｔ−’ｐｓＶ−ＶＮｐｙδ４１１５５８ＬＩｌｌ］胞ニトランスフエ クトされ、ラジオイムソアツセイにより、安定にトランスフエフ１へされた細胞 は高レベルの２１保有抗ＮＰ抗体を分泌することが明らかになった。このＮＰ特 異的抗体はいくつかのトランスフェクトされたクローンの培養上清から５〜１０ ｍｇ／ｌの収率で精製された。精製された物質のポリアクリルアミドゲル電気泳 動（第４図）は、主なタンパク質種は約１１０、０００ダルトンという減小して いない分子量を有することを示す。還元後、λＬ鎖とともに移動するバンドおよ びいくつかのより高分子量のポリペプチドが観測される。これらの大きいポリペ プチドの中で最も大きなものは分子ｆｉ３１，０００で、Ｆ（ａｂ）’　２類似 抗体のＨ鎖を構成する。しかし、ｐｓＶ−Ｖ、４ｐｒδＦ　（ａｂ）’　２抗体 は明らかに他のＮＰ結合物質によって汚染されており、このＮＰ結合物質は約５ ０，０００ダルトンの減少しない分子量を有し、λ１Ｌ鎖および分子量３６．０ ００ないし４０．０００の範囲のいくつかのＨ鎖中の１つから構成されている。

この小さな抗体成分はグリコシレージョンによる異分子を反映するものではない 。なぜならばｐｓｖ−ｖＮ、γδエンコード抗ＮＰ抗体の電気泳動移動度は、生 合成的標識実験（第５図〉の間インキュベーション媒体中にツニカマイシンを含 めることによっては影響を受けないからでおる。この小さなバンドは、多分ｐＳ Ｖ−ＶＮｐγδ免疫グロブリン遺伝子のＲＮＡ転写物の代替的処理の結果、Ｈ鎖 のカルボキシ末端部においてＦ（ａｂ）’　２抗体と異るようである。しかし、 汚染バンドにもかかわらず、ｐｓＶ−ＶＮｐγδをトランスフェクトしたＪ　５ ５８　ＬＩＩＩＩ胞にってよ良い収率でＦ（ａｂ）’　２類似抗ＮＰ抗体が合成 され分泌されることは明らかである。

実施例２　Ｆａｂ−ヌクレアーゼキメラ抗体ｓ、　ａｕｒｅｕｓヌクレアーゼ（ ５Ｎａｓｅ）ｉ１子を含むＤＮＡ制限フラグメントをマウスγ２ｂｍ仏子のＣＨ ２エクソン中のＸｈＯＩ部位中に挿入した。プラスミドｐ　Ｓ　Ｖ　−Ｖ　ＮＰ ＳＮａｓｅは、共通のＥｃｏ　ＲＩフラグメントに含まれるＶＮＰエクソンを、 実施例１に記載したように、ｘｈｏ　ＩアダプターをＢａｍ　Ｈ１部位に有する ｒ）　Ｓ　Ｖ　２　ｇｆ）ｔのＢａｎ　１−（１−Ｅｃｏ　ＲＩ’７ラグメント を含むベクター中に挿入することによって組立てられた。またベクターにはファ 由来ヌグメントも挿入したので、ｐｓｖ　ＶＨｐＴＳＮａＳｅはγ２ｂＣＨ１、 ヒンジおよびＣＨ２エクソンの５′末端を含んでいる。５ＮａＳｅコ一ド部は、 ［３ａｍ　ＨＩ部位に３．ａｕｒｅｕｓ　Ｓａｕ　３Ａフラグメントを含むＭ１ ３ｍｐ８クローンから得られる。５Ｎａｓｅ　遺伝子をＭ１３ｍｌ）８から［３ ａｍ−３ａｌ　Ｉフラグメントとして取出してＭ１３ｍｐ１２Ｗ中で再クローン することにより（Ｋａｒｎ。

Ｊ９、ＭａｔｈｅＳ，Ｈ．Ｗ．Ｄ．　、Ｇａ１ｔ，Ｈ．Ｊ．およびＢｒｅｎｎｅ ｒ，　Ｓ。

Ｇｅｎｅ３　２巻２１　７−２２４頁、１９８４年参照）、Ｄ　Ｓ　Ｖ　Ｖ　Ｈ ｐＳＮａＳｅの最終的な組立てのためのＸｈＯＩ−３ａｌ　Ｉフラグメントとし て単離することができる。ｐＳ　Ｖ　−　Ｖ　ＨｐＳＮａＳｅの構造は第６Ａ図 に示されている。

ｐｓＶ　ＶＨｐＴＳＮａＳｅのＨ８ｍＭ伝子は１Ｃｐｓエクソンを取除いて、ヌ クレアーゼコード部に相において（ｉｎ　ｐｈａｓｅ）融合したＴ２ｂ　ＣＨ２ エクソンの最初の４つのコドンを含むエクソンによって置換した以外は、１：） ＳＶ−ＶＮＰγδの１−１鎖遺伝子に類似している。ρＳＶ２ｇＤｔ由来ベクタ ーのＳＶ４０由来配列はポリアデレーション信号を提供する。

Ｊ５５８Ｌ細胞はｐＳ　Ｖ　Ｖ　ＨｐＴ　５Ｎａｓｅでトランクフエクトし、選 択培地において生き残った細胞を限界希釈法によってクローンした。クローンし たトランスフエクタントの上清をラジオイムノアッセイにより調べた結果、約３ 分の１はλ保有抗ＮＰ抗体の産生について陽性であることがあきらかになった。

陽性のクローンは１ｍ９／ｌ〜１０ｍ９／Ｉの収率のＮＰ結合抗体を産生じ、こ の抗体は第６Ｂ図に示す予想された構成を有している。

生合成的に標識した抗体をゲル電気泳動により分析した結果、λ１Ｌ鎖とともに 移動するバンドと分子邑４５．０００６よび４６．０００の２本のＨ鎖バンドが あることが判った（第５図）。これら２本のＨ鎖の相違は確認できなかったが、 これらの移動度はＶ　ＮＰＴ　５Ｎａｓｅ　Ｈ鎖の予想される移動度と良く一致 する。＾５Ｏ−ＡＳｎ−Ｔｈｒ配列は５ＮａＳｅには存在するが、２本のＶＨｐ ７ＳＮａｓｅ　）Ｉ鎖バンドはツニカマイシンの存在下で生合成的に標識した細 胞の上清から精製した試料にいぜん存在している（第５図）。これは２本のｐＳ 　Ｖ　Ｖ　Ｈｐ　７’　５Ｎａｓｅ　Ｈ鎖の間の相違はＮ結合グリコシレージョ ンによるものではないことを示している。還元されていないゲル中でＶ　Ｈｐ　 ７’　５Ｎａｓｅ抗体は幾分異成分的に見えＦ（ａｂ）’　２−３ＮａＳｅとＦ 　ａ　ｂ　−５ＮａＳｅの双方の予想される移動度を有するバンドを示している （第４図）。Ｈ鎖のカルボキシ末端における５ＮａＳｅの存在がγ２ｂヒンジ部 のジスルフィド結合を抑止するのかも知れない。

ＶＮＰγ５Ｎａｓｅ調製物のヌクレアーゼ活性をテストするため、ハブテン−セ ファローズカラム上で精製した試料を１本鎖ＤＮＡ基質でインキュベートした。

以下のようにアガロースゲル電気泳動後ＤＮＡの消化をモニターした。１本鎖Ｍ １３ＤＮＡ（２μ３）を、種々の巽る量のＶ　ＮＰｒ　５Ｎａｓｅキメラ抗体ま たは精製した針ａｕｒｅｕｓヌクレアーゼを含む２５ｍＭホー酸ナトリウム、２ ５０ｍＭ　ＮＡＣｌｌｏｍＭ　ＣａＣｌ２　Ｂ液１）Ｈ８，５（２０μｍ）中で ３７℃で３０分間インキュベートした。使用した杭体／酵素の量はナノグラム単 位で示されている。次いで試料中のＤＮＡを１，２％アガロースゲルで電気泳動 した後臭化エチジウム蛍光法で分析した。ファージＤＮＡの）−１ｉｎｄｌｎ消 化物は寸法標識を提供する。ヌクレアーゼ活性のＣａ　依存性は４０ｍＭ　Ｍｏ Ｃｌ３および２５ｍＭ　ＥＧＴＡの存在下でインキュベーションを行うことによ って確認された。

第７図に示すように、ＶＮＰγδでなくＶＮＰγ５Ｎａｓｅ抗体がヌクレアーゼ 活性を示し、この活性は、真正なｓ、　ａｕｒｅｕｓヌクレアーゼのように、Ｍ （ＩＩ　イオンではなくＣａ＋＋イオンに依存する。モル基準で判断すると、Ｖ Ｈｐ７ＳＮａＳｅ試料の触媒作用は真正なｓ、　ａｕｒｅｕｓヌクレアーゼの触 媒作用の約１０％である。

ｙ　ＮＰ　７５Ｎａｓｅキメラ抗体は、第８図に示すように、ＥＬＩＳＡ型検定 において遺伝子的に複合した酵素結合抗体として使用することができる。抗原を 塗布したプラスチックプレートを種々の量のＶＮＰγ５Ｎａｓｅタンパク質とと もにインキュベートし、次いで結合した抗体をそのヌクレアーゼ活性によって検 出した。これはＤＮＡと臭化エチジウムを含む溶液をプレートに添加することに よって達成された。固定化したＶＮＰγ５Ｎａ−ｓｅ抗体によるＤＮＡ基質の消 化に判いＤＮＡ／臭化エチジウム複合体による蛍光はかなり減少した。

特にポリビニルマイクロタイタープレートに（ＮＩＰ）２ｏウシ血清アルブミン （４０μ９ｍｌ＞を塗付した。

反応しない部位をＢＳＡでブロックした俊、ＶＮＰγ５ＮａｓｅまたはＶＮＰγ δキメラ抗体の希釈液をウェル中でインキュベートした。得られた抗体の量をナ ノグラム単位で第８図に示す。結合しない物質を洗い流した後、ｐＨ８，５の緩 衝液中のＨ１３−重鎖ＤＮＡおよび１μｇ／ｄ臭化エチジウム溶液１μびを含む 溶液（４０μｍ）を添加した。３７℃で１時間インキュベートした後プレートの 写真をとった。

第８図に示すように、１０ｎＯの範囲のＶ　ＮＰ　Ｔ　５Ｎａｓｅ抗体の諸量は 容易に検出され、ＶＮＰγδ抗体コントロールによっては蛍光の減少は生じなか った。ＤＮＡ基質によるインキュベーション時間を増加することにより、検定の 感度を少くとも１０倍上げることが可能であることを発見した。

」３　Ｆａｂ−ｍｙｃキメラ抗体 マウスｃ−ｍｙｃＭ伝子のカルボキシ末端部を抗体Ｆａｂに融合した。ｃ−ｍｙ ｃｌ伝子の産生物は多くのチオール基を有し通常は細胞内に存在するタンパン質 である。ｃ−ｍｙｃの第３のエクソンが自発的に機能的なタンパン質領域をエン コードするとは考えられない。したがって、ｌ”ａｂ−ｍｙｃ結合タンパク質が 細胞から分泌されるならば、それは抗ｍｙｃ抗血清を作るタンパク質源を提供す るであろう。

ｃ６ｓエクソンを含む１）ＳＶ−ＶＮＰ７δ　３ａｃＩ−Ｘｈｏ　Ｉフラグメン トをマウスｃ−ｍｙｃの３′エクソンを含むＳａｃ　Ｉ−ＢＯＩ　ＩＩフラグメ ントで置き換えた以外はｐＳＶ−ＶＮＰγδの組立てに関する前記の方法にほぼ したがってプラスミドｐＳＶＶＮＰγｍｙｃを組立てた。第９図において、Ｂに ｌ／Ｂと記した制限部位は、ｃ−ｍｙｃの３′末端のＢＣ１１■部位をｐｓｖ２ ｇｐｔの３μｍ　Ｈ１部位に接合することによって形成されたものである。ｃ− ｍｙｃフラグメントはファー２ス 形質細胞腫Ｘ６３ＡＱ８の転移したｃ−ｍｙｃｌ伝子・を含む（ＮｅＵｂｅｒｇ ｅｒおよびＣａ１ａｂｉ前掲文献参照）。

このプラスミドは、ＣδＳエクソンをマウスＣ−ｍｙｃｌ伝子の３′末端エクソ ンで置き換えた以外はｐＳＶ　ＶＮＰγδに構造上類似している。このＣ−ｍｙ Ｃエクソンは１８７のアミノ酸をエンコードしくＢｅｒｎａｒｄ、０．　、Ｃｏ ｒｙ、Ｓ、　、Ｇｅｒｏｎｄａｔｉｓ、Ｓ、　、Ｗｅｂｂ、Ｅ。

およびＡｄａｍｓ、Ｊ、Ｈ，ＥＭＢＯＪ、　２３７５−２３８３頁、１９８３年 参照〉、転写ポリアゾニレ−ジョン信号を提供するはずでおる。

該プラスミドをＪ５５８ｍ−にトランスフェクトし、抗ＮＰ抗体に関して陽性の ウェルからの細胞を限界希釈法によりクローンした。ハプテン結合タンパク質は 培養上清から精製し、間接ラジオイムノアッセイによりｃ−ｍｙｃ抗原決定基の 存在を調べるため分析した。

推定Ｆａｂ−ｍｙｃまたは抗ＮＰ　Ｆ（ａｂ）’　２　（コントロールとして作 用する〉のいずれかの試料をモノクローナル抗ｃ−ｍｙｃ抗体を塗布したポリビ ニルマイクロタイタープレート上のウェルでインキュベートした。次いで、抗Ｎ Ｐ抗体のＦａｂタンパク質を認識する放射性ヨー素化モノクローナル抗イデイオ トープ抗体を使用して結合した抗ＮＰ抗体を検出した。

第１０図に示すように、Ｆａｂ−ｍｙｃはあきらかにモノクローナル抗ｃ−ｍｙ ｃ抗体に結合する一方抗ＮＰ　Ｆ（ａｂ）’　２および他のコントロールは結合 しない。Ｆａｂ−ｍｙｃはｃ−ｍｙｃのカルボキシ末端に対し特異的な他の２つ のモノクローナル抗体によっても認識される。Ｆａｂ−ｍＶｃのＳＯ８／ポリア クリルアミドゲルＮ気泳動はそれが幾分異成分を含むことを明らかにする。λ１ Ｌ鎖とともに移動すルバンドと３８、０００ないし５５，０００ダルトンの範囲 のより大きい分子量のいくつかのバンドが観測され、１本の優勢なＨ鎖バンドも 現れない。Ｆａｂ−ｍｙｃの予想された大きざは５０．０００ダルトンである。

長期間保存するとＦａｂ−ｍｙｃ試料中に沈澱が生じ、ＳＤＳ／ポリアクリルア ミドゲル電気泳動はより広範囲のＨｉｌバンドの異成分性を示す。したがって、 ＳＤＳ／ポリアクリルアミド分析によって示されたＦａｂ−ｍｙｃタンパク質の 異成分性は多分タンパク分解によるものと考えられる。

圧倒４　キメラマウス−ヒト抗体 プラスミドｐＳ　Ｖ　Ｖ　ＮＰＨεは次のようにして作られた。ｐｓｖ−ｖＨｐ を１ｑるためプラスミドｐＳ−Ｖ、ＩのＥＣＯＲＩ−Ｂａｎ　Ｈｌフラグメント をプラスミドＤＳＶ２ＱＤｔ（ＤＥＣＯＲＩ部位と３ｑｍ　ＨＩ部位との間でク ローンした。ヒトε遺伝子のエクソンＣε１−ｃε４を含むファージλε１．２ の３ｑｍ　Ｈｌフラグメント（Ｆ　ｌ　ａｎａｇａｎ、　Ｊ、　Ｇ、およびＲａ ｂｔ）ｉｔｔｓ、丁、Ｈ，Ｅ）１８０　Ｊ、　１巻６５５−６６０頁、１９８２ 年参照＞ｔｐｓｖ−ｖＮ、中にクローンし、その唯一のＥＣＯＲＩ部位にマウス Ｈ鎖部のＸｂａＩ−ＥＣＯＲＩエンハンサ−含有フラグメントを含ましめること によりプラスミドｐｓＶ−Ｖ、１ｐＨεを完成した。

ｐｓＶ　ｖＮＰ）−１εプラスミドの構造は第１１図に示すとおりで必り、マウ スの可変部とヒトε不変部を含むＨ鎖をエンコードする。

１：）　Ｓ　Ｖ　Ｖ　ＮＰＨεをスフェロプラスト融合によりＪ５５１胞中に導 入した。安定にトランスフェクトされたクローンを上記方法で選択した。トラン スフエクタントは１０　と１０−４のびん度で得られた。培養上清を上記の方法 によりλ１保有ＮＰ抗体の産生に関して検定した。５０〜８０％のクローンが陽 性であった。上記アフィニティータロマドグラフィーによりいくつかのトランス フェクトされたクローンの培養上清から抗体を精製した。収率は１リツｉ・ル当 り約２ｍ９であった。

精製したキメラ抗体がヒト抗原決定基を現すことを示すため結合抑止アッセイを 使用した（第１２図）。

放射性ヨー素化ヒトミエローマＩＱＥのモノクローナル（ａ）またはポリクロー ナル（ｂ）抗ヒトε抗血清に対する結合が種々の濃度に無標識キメラＩ’にＩＥ （・〉または無標識ミエローマＩｇＥ（ＩＩ）によって抑止される検定を実施し た。

Ｄｌ／ｎａｔｅＣマイクロタイマープレートのウェルに１μ９・ｍｌ−１のモノ クローナル　マウス抗ヒトε抗体（Ｈ，Ｄ、　Ｃｏｏｐｅｒにより与えられた抗 体ＲＢ６−２＞または３μび・戴−１のポリクローナルヒツジ抗ヒトε抗血清（ Ｓｅｗａｒｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を塗布した。反応しない部位キメラ抗Ｎ Ｐ　ＩＣＩＥ抗体が真正なヒトＩＣＩＥの生理学的エフェクター機能を示すか否 かを決定するためをウシ血清アルブミンでブロックした後１２５１で放射性標識 したヒトミエローマＩ　Ｑ　Ｅ　（５ｅｒｏｔｅｃ）を巽る濃度のキメラＩｇＥ または無標識ミエローマＩＱＥ自身の存在下でウェル中でインキュベートした。

アフィニティーにより精製したキメラ抗体は、放射性標識したヒトミエローマＩ ＱＥのモノクローナル抗ε抗血清（第１２Ａ図）および多特異的抗ε抗血清（第 １２Ｂ図）に対する結合とそれぞれ競争する。ざらに、放射性標識したミエロー マＩＣＩＥの抗ε抗血清に対する結合は完全に抑止され（第１２Ｂ図）、キメラ 抗体はこのポリクローナル抗血清によって認識されるε抗原決定基を表示するこ とを示している。放射性標識されたミエローマＩｇＥの抗ε抗血清に対する結合 に対してキメラ抗体は無標識ミエローマＴＣＩＥ自身よりも良く競争した。これ は精製された抗体は本質的に等質であるのに対しく第１３図参照）、市販のミエ ローマＩｇＥ試料はそうではないという理由によるものであろう。

キメラタンパク質の製造を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ− ＰＡＧＥ）により調べた。還元された抗ＮＰ　ＩＱＥを調べると、マウスλ１「 鎖とともに移動するバンドと相対質ｆｆｉ（Ｍ、）〜７２．０００（７２Ｋ）の 拡散Ｈ鎖バンドを示す（第１３Ａ図）。これはＤＮＡ配列から予想されるεポリ ペプチド鎖のＭ、よりもかなり大きい。しかしこの不一致はツニカマイシンの存 在下に標識された細胞によって分泌される生合成的に標識ａれた抗ＮＰ　ＩＣＩ Ｅ（７）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解決される（第１３Ｂ図）。このグリコシレー ジョン抑止剤によるインキュベーションは分泌された抗ＮＰ　ＩＣＩＥの見かけ の相対分子質量にを７２Ｋから予想値の６２Ｋに減少させる。こうして、キメラ ＩＣＩＥはヒトミニローマ由来ＩＣＩＥ同様多分にグリコシレートされている。

ＳＤＳポリアクリルアミド中の還元されない抗ＮＰ　ＩＣＩＥの電気泳動移動性 はε２λ２構造を有する抗ＮＰ　ＩｇＥと一致する。

第１３Ａ図はＪ５５８Ｌ（Ｊ吋８１５／１３）のｐｓｖ−ｖＮＰＨεトランスフ エクタントから精製した抗体（３０μ９）から得た５ＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す 。

Ｊ５５８Ｌは２−メルカプトエタノールの存在下で煮沸し、９％ゲルで電気泳動 しクーマシーブルーで染色した。第１３Ｂ図は、Ｊ５５８Ｌまたはトランスフェ クシントＪＷＢ１５／１３からの生合成的に標識した抗体についての結果を示す 。この抗体はＮＩＰ−セファローズカラム上で精製し、還元後７％ゲルで分析し た。ツニカマイシンの存在下で標識した細胞から精製した試料は＋Ｔｍの記号で 示す。相対分子質量標識の各位置が示されている（９４に＝相対分子質量標識、 ０００）。（Ｌ−３５３）メチオニンによる生合成的標識および標識試料、無標 識試料のハプテン−セファローズカラムによる精製は前記の方法で行った。

に２種類の決定を行った。一つの検定においては、ヒト好塩基球からのヒスタミ ン放出を起させる抗体の能力をテストした。好塩基球１〜２％を含む末梢血液か らの単核細胞の調整物を、ウシ血清アルブミン（ＮＩＰ−ＢＳＡ）に結合したハ プテン（５−ヨー素−４−ヒドロキシー３−ニトロフェンアセチルカプロ゛ン酸 、ＮＩＰ）でインキュベートする前にキメラ抗体で受動的に感作させた。その結 果（表１）は、好塩基球のキメラＩＣＩＥによるプリインキュベーション後、Ｎ ＩＰ−ＢＳＡは投与量に依存するヒスタミン放出を生じさせうろことを示してい る。異種抗原である家のホコリダニｏｅｒｍａｔｏ−ｐｈａｇＯｉｄｅＳ　ｐｔ ｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓのＰＩ抗原はヒスタミン放出を誘起させ１坪なかった。

同様に、キメラ抗体またはＮ　ＩＰ−ＢＳＡのいずれか単独ではバックグラウン ドレベルのヒスタミン放出しか得られなかった。これらの結果は、抗ＮＩ　ＩＣ ＩＥは真正なヒトＩＣＩＥ同様それ自身は脱顆粒反応を生じさせず、抗原との架 橋にと　゛もなってヒスタミン放出を生じさせることを示している。

第２の検定においては、抗ＮＰ　ＩｇＥによるインキュベーションは、その後の 高ＩＣＩＥレベルを含むアトピー血清による好塩基球の受動感作を阻止できるこ とが示された。表２は、家ホコリダニ抗原ＰＩが抗ＰＩ　ＩＣＩＥ抗体を含む血 清でプリインキュベートされた好塩基球からのヒスタミン放出を誘起しうろこと を示している。しかし細胞を濃度〉０．１Ｂ９ｍ１ｌ−１でキメラ抗体で予めイ ンキュベートすると、この同じ血清はヒスタミン放出を起させることができなか った。

上記の結果は、ＤＮＡのマウスミエローマ細胞中へのトランスフェクションは、 マウス可変部が抗原結合特異性を提供し、ヒトＣＨ部がヒトエフェクター機能を 提供するキメラ抗体を大量に産生するための有効な方法であることを示している 。このような抗体の既知の抗原結合特異性は該抗体の精製を極めて単純なものに する。この方法によるキメラＩｇＥの産生は、既知の抗原特異性を有するモノク ローナル　ヒトＩＣＩＥがこれまで得られなかっただけに、特に魅力的であるこ とが判った。したがってキメラ抗体は日常の臨床検定において有用となり得るも のである。このモノクローナルＩＣＩＥは、インビトロでアレルギー源からの血 清により生じうるヒト好塩基球からのヒスタミン放出を阻止することができるこ とが実証された。同様な阻止がインビボできるか否かを皮膚感作アッセイを用い て見出すことが明らかに重要であろう。

表１：キメラＩＣＩＥで受動感作したヒト好塩基球から誘起されるヒスタミン放 出 抗　原　％ヒスタミン放出 １０μｇｍｌ！−’　ＮＩＰ−ＢＳＡ　１８．４＋２．４１Ｂ９ｍｌ−１８ＩＰ −ＢＳＡ　３６．０＋５．６０．１Ｂｇｄ−’　ＮＩＰ−ＢＳＡ　３１．２＋１ ２．００．０１　μ３ｒｄ−１ＮＩＰ−ＢＳＡ　２６．４＋２．４ｏ、ｏｏｉμ ９ｍ１ｌ−１ＮＩＰ−ＢＳＡ　７．２＋１．６０、０００１　μｇｍｌ！−’　 ＮＩＰ−ＢＳＡ　５．２＋１．２２０μｇｄ−’　ＰＩ抗原　４．５十〇”デキ ストラン−ＥＤＴＡ中で末梢血液を沈降させることによって単核細胞を末梢血液 から調製した。この調製物は１〜２％の好塩基球を含んでいた。完全ｒｙｒｏｄ ｅ緩衝液中で単核細胞を２本づつ１，５μｇ７！−’キメラ抗ＮＰ　ＩＣＩＥに より３７℃で２時間インキュベートした。次いで細胞を遠心分離し、表に示す濃 度の（Ｎ　Ｉ　Ｐ＞　３９−ＢＳＡを含む完全ｒＶｒｏｃｌｅｌ衝液中テ再懸濁 した。１５分後、上清中に放出されたヒスタミンを抽出し、蛍光定量法により検 定した。細胞を１００℃でインキュベートすることにより得られるヒスタミン放 出の最大値は６２．５ｎ（７”１である。結果は百分♀ヒスタミン放出として示 しである（すなわち、抗原によられるヒスタミン放出最大値（ｎｏｄ−１）　） 。繰返し行われた実験において得られた平均バックグラウンド百分率は６，０± ２．５であった。Ｎ　Ｉ　Ｐ−８ＳＡ　（ｏ、１μｇｄ−１）およびＰ１抗原（ ２０ｔ１ｇ７！−１）のいずれも単独では上記バックグラウンドレベル以上のヒ スタミン放出を誘起させることに繰返し失敗した。

本圃−ドーナーからの細胞を使って行った別の実験で得られたデータ 表２：キメラＩＣＩＥを使用したプリインキュベーションによるヒスタミン放出 の阻止 プリインキュベー　アレルギー　抗　原　％ヒスタミン放出にあける　源からの 　Ｐｌ　ン放出抗ＮＰ　ＩｇＥの濃度　血　清 ｍ−＋７．５＋　１．７ 単核細胞は表１について説明したように調製した。

種々嬰る濃度のキメラ抗ＮＰ　ＩＣＩＥで２時間インキュベートした後、Ｐ１抗 原（２０μ９ｄ”）に１５分間ざらず前にアレルギー血清く完全Ｔｌ／ｍｏｄｅ 緩衝液中で１：３０に希釈）とともに２時間インキュベートした。アレルギー血 清は、全ＩｇＥレベルが４，８００１Ｕ７！−１テ、Ｄ、　ＤｔｅｒＯｒ＋ｙＳ ＳｉｎｕＳ抗ＩｊｆｉＰ　１　ニ対シｊ％異的’）ＩｇＥが１，６００ＢＡユニ ットａ２−１であった。本実膜で使用した細胞を１００’Ｃでインキュベートす ることによって得られた最大ヒスタミン放出値は１０．４ｎｇ７−１であった。

Ｕ例５　Ｆａｂ　−−Ｋｌｅｎｏｗキメラ抗体ＤＮＡポリメラーゼエのＫｌｅｎ ｏｗフラグメントがマウスＩＱＥ２ｂ分子のＦａｂ部に結合した組替え抗体のＨ 鎖をエンコードするｐｓｖ　ＶＮＰγにｌｅｎｏｗプラスミドが組立てられた。

。 ｐｓＶ−ＶＮＰ７’にｌｅｎｏｗの構造は上記ｐＳＶ−Ｖ［ｐ７ＳＮａＳｅにつ いて述べた構造に類似する。ＤＮＡポリメラーゼ■のＫ　Ｉ　ｅｂｏｗフラグメ ントに対応するコード領域は、２つのプラスミドｐＣＪ　１４　（Ｃ，Ｈ，Ｊｏ ｙｃｅおよびＮ、Ｇ、Ｄ、Ｇｒｉｎｄｌｅｙ、　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８０巻１８ ３０−１８３４頁、１９８３年）および１）ＣＪ８９（Ｃ，Ｍ。

ＪｏｙｃｅおよびＮ、Ｇ、Ｄ、ＧｒｉｎｄｌｅｙｌＪ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１ ５８巻６３４−６４３頁、１９８４年）を組合せることに中でＫｌｅｎＯＷコー ド領域の両側にＢａｍＨＩリンカ−を挿入した。このＢａｍＨＩフラグメントを リンカ−を使ってＳａｌ　Ｉフラグメントに転換し、ｐｓｖ−ＶＮｐ７２ｂ　（ ＣＨ２，ＣＨ３）の唯一（７）Ｘｈｏ　Ｉ部位に挿入した。

この抗体／Ｍ素結合遺伝子は、ｐＳＶ〜ＶＮＰγＫｌｅｎｏｗｆ−１鎖とＪ５５ ８Ｌ細胞系由来マウス免疫グロブリンλｌとの会合によりハプテン４−ヒドロキ シ−３−ニトロフェンアセチル（ＮＰ＞に対する結合部位が形成されるように、 可変部ＶＮＰを有している。ＶＮＰ遺伝子はマウス免疫グロブリンγ２ｂｌ−１ 鎖のＣＨｌ、ヒンジおよびＣＨ２領域のアミン末端部をエンコードするエクソン に連結されている。ＣＨ２の他の部分およびＣＨ３の全部をエンコードするＤＮ Ａは、５′−３′ポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を 指定する［：、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼ■遺伝子のフラグメント（Ｋｌｅ ｎＯＷフラグメン１〜〉によって置換した。このＦａｂ−Ｋｌｅｎｏｗ結合遺伝 子は、Ｆａｂ−ＫｌｅｎＯＷ転写ユニットに対しポリアゾニレ−ジョン信号を与 え、かつ、ミコフェノール酸に対する抵抗力を与えることによって安定したトラ ンスフエフ１〜された哺乳動物細胞の選択を可能ならしめる標識ｃ＋ｐｔを与え るプラスミドベクター１）　Ｓ　Ｖ　２　Ｏｐｔ中にクローンされた。

ｐｓＶ　ＶＨｐ７ＫｌｅｎＯＷＤＮＡをＪ５５８Ｌ細胞中に導入するためスフェ ロプラスト融合法を使用した（プロトプラスト融合およびトランスフェクトされ たクローンの選択のために用いられる方法は）１．　Ｓ、　ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ およびＧ、　Ｔ、　Ｗｉ　ｌ　Ｉ　ｉａｍｓのタンパク質エンジニアリング：科 学、医学および産業における応用（Ｈ，ＩｎｏｕｅおよびＲ，Ｓａｒｍａ編）　 Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）に詳細に記載されている。このようなトランス フエクタントをミコフェノール酸を含む培地中で選択し、このようなトランスフ エクタントの培地中のＮＰ特異的抗体の存在をラジオイムノアッセイにより確認 した。トランスフエクタントを限界希釈法によりクローンし、高い抗体力価を示 した一つの特定のクローンであるＪＷ６４／７をさらに調査するために選／νだ 。

ＪＷ６４／７によって分泌されるタンパク質を、ハプテン−セファローズソルベ ントで精製した生合成的に標識した試別のＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気 泳動ニヨッテ調べた（第１５Ｂ図）　。Ｆａｂ−Ｋｌｅｎｏｗタンパク質の予知 された構成（第１４８図）から予想されるように、ゲルは２つのポリペプチド鎖 すなわちλ１Ｌ鎖に対応するバンドと分子量約９６．０００の１１鎖の存在を示 しテイル（第１５８図）　、　Ｆａｂ−Ｋｌｅｎｏｗｌ−（鎖のＫｌ（！ｎＯＷ 部内にはＡｓｎ−ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒという形の４配列が見出される。これらの 配列はＮ結合グリコシレージョンに対する部位を構成するのかも知れない。Ｆａ ｂ−ＫｌｅｎＯＷＨ鎖が実際にグリコシレートされなかったか否かを知るために 、グリコシレージョン抑止剤であるツニカマイシンの存在下で生合成標識実験を 行った。その結果（第１５Ｂ図）は、ツニカマイシンは実際に分子量が減少した Ｈ鎖の合成をもたらしたことを示している。

ＤＭＥＭ／１０％子ウシ血清中で増殖したＪＷ６４／７培養上清からＮＰ−セフ ァローズによるアフィニティークロマトグラフィーによってＦａｂ−Ｋｌｅｎｏ ｗタンパク質を精製し、等質の調製物を得たく第１５Ａ図）。

収率は培養上清１リツトルあたり１〜１５ｍ９の範囲であった。精製タンパク質 の５’−３’ポリメラーゼ活性を古典的な検定法によって測定した（この検定は Ｐ、Ｓｅｔｌｏｗ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｉｍｏｌ　２９巻３−１２頁、１ ９７４年に記載された方法で行った）。この方法では酵素を［活性化Ｊ　ＤＮＡ と１つが放射性標識された４つのｄＮＴＰとともにインキュベートし、次いで放 射能の酸沈澱可能物質中への導入を行った。活性化ウシ胸腺ＤＮＡを基質として 用いるこの検定においては、Ｅ、ｃｏ＋＋から精製したＤＮＡポリメラーゼ■の タン自分解フラグメント化によって調製した等質のＫ　ｌ　ｅｎＯＷフラグメン トの市販の試料を使用して同一検定条件下で得られた７Ｘ１０３ユニット／ｍｇ の活性と比べて、Ｆａｂ−Ｋ　ｌ　ｅｎｏｗは約１．１ｘ　’ｌ　Ｑ３ユニット ／η）活性を示した。通常の酵素と比較してＦａｂ−Ｋｌｅｎｏｗの減少した特 異的活性（タンパク質ｍｇ当りで表わしたもの）はその分子量の相違にかんがみ 予想しうるちのである。

しかしこれは活性上の相違の一部を説明しうるにすぎない。ＳＤＳ／ポリアクリ ルアミドゲル（図示せず〉中の還元されていないＦａｂ−Ｋｌｅｎｏｗの検査は 一価のタンパク質のほか２価のＦ（ａｂ’　）　２−Ｋｌｅｎｏｗの存在を示唆 している。Ｆ（ａｂ’＞２−にｌｅｎｏｗは半部位のみの反応性（ｈａｌｆ−ｓ ｉｔｅ　ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）を示すのかも知れない。またはグリコシレージ ョンがＦａｂ−Ｋ　ｌ　ｅｎｏｗの特異的活性を減少させるのかも知れない。

ＤＮＡポリメラーゼ■　にｌ　ｅｎＯＷフラグメントの主要な用途はＤＮＡ配列 決定における鎖終止である。第１６図に示すように、Ｆａｂ−にＩｅｎｏｗは実 際にこの目的のために用いて成功することができる。第１６図はチェーンターミ ネーションＤＮＡ配列決定法におけるＦａｂ−ＫｌｅｎＯＷを使用を示す。クロ ーン当り１単位のＦａｂ−ＫＩｅｎＯＷを使用してＳａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｔが 記載するようにＭ１３クローンからのＤＮＡ配列を決定した（　Ｆ、　Ｓａｎｇ ｅｒ。

Ｓ、Ｎ１ＣｋｌｅｎおよびＡ、Ｒ，Ｃｏｕｉｓｏｎ　、　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　７ ４巻かくして、組替え抗体技術は、特異的な酵素を細胞から分泌させ１工程精製 で等質性のものに精製できるように酵素を標識するために有効に応用することが で上記実施例は、本発明の方法を使用することにより、ＦＩＧ、　７ タンハ’７’Ｗ、３１ソＵ　（３Ｊｇ／ｍ１）ＦＩＧ−１０ ρｓｖ　−ＶＮＰ　Ｈｅ ＣｅＣパンＣ（ ＬＶＤＪ　１２３４Ｑｐｔ　８ｒｌ’ｌ）−Ｔｍ　＋７ｍ　−Ｔｍ 閑淳焦存鮒失 、７９．□ａｌｌｅＡＡＩ　Ａｔｅｆｌ（ａｌｌ。、。ＰＣＴ／ＧＢ　８５１０ ０３９２ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＨＥ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬＳＥＡＲＣＨ ＲＥＰＯＲＴ　０ＮＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＡＰＰＩＪＣＡＴＩＯＮ　Ｎ ｏ、　Ｉ’ＣＴ／ＧＢ　８５１００３９２　（ＳＡ　１０５８０）ＥＰ−Ａ−０ １０５５２１１８１０４／８４　ＪＰ−Ａ−５９０６５０９９１３１０４／８４ ＥＰ−Ａ−０１５０１２６３１１０７／８５　ＪＰ−Ａ−６０２２２４２９０７ ／１１／８５

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. １．次の工程を含むキメラ抗体を産生する方法（ａ）Ｉｇ分子のＨ鎖またはし鎖 の可変部をエンコードする第１の部分と第２のタンパク質の少なくとも一部をエ ンコードする第２の部分とを含むＤＮＡ配列に作用可能に結合した適当なプロモ ーターを含む複製可能な発現ベクターを調製する工程。 （ｂ）必要に応じ、１ｇ分子の相補的Ｌ鎖またはＨ鎖の少くとも可変部をエンコ ードするＤＮＡ配列に作用可能に結合した適当なプロモーターを含む複製可能な 発現ベクターを調製する工程。 （ｃ）イモータライズされた哺乳動物細胞系を前記調製したベクターで形質転換 する工程、および（ｄ）キメラ抗体を産生するため前記形質転換した細胞系を培 養する工程。
2. ２．前記イモータライズされた細胞系は骨髄に由来するものである請求の範囲第 １項記載の方法。
3. ３．前記イモータライズされた細胞系はミエローマ細胞系またはその誘導体であ る請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．前記イモータライズされた細胞系は相補的Ｌ鎖またはＨ鎖を分泌することに より工程（ｂ）が省略される請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかに記載の 方法。
5. ５．工程（ａ）において調製されたベクターとともにイモータライズされた細胞 系に形質転換される別個のベクターを調製することにより工程（ｂ）が実施され る請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかに記載の方法。
6. ６．工程（ａ）において調製されたベクターをさらに操作することにより工程（ ｂ）が実施される請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかに記載の方法。
7. ７．前記イモータライズされた細胞系は相補的Ｌ鎖またはＨ鎖をそれぞれ分泌し 、前記形質転換は適当な細菌細胞を工程（ａ）で調製したベクターで形質転換し 、次いで該細菌細胞を前記イモータライズされた細胞系と結合させることにより 達成される請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の方法。
8. ８．工程（ａ）で調製したベクターのＤＮＡ配列の前記第１の部分は前記第２の 部分に直接結合されている請求の範囲第１項ないし第７項のいずれかに記載の方 法。
9. ９．工程（ａ）で調製したベクターのＤＮＡ配列の前記第１の部分は特異的な切 断配列をエンコードする介在配列によって前記第２の部分に結合されている請求 の範囲第１項ないし第７項のいずれかに記載の方法。
10. １０．前記切断部位はファクターＸａに対し特異的である請求の範囲第９項記載 の方法。
11. １１．既知の特異性を有しかつ少くとも１つの異る種、クラスまたはサブクラス のＩｇ分子からの不変部の少くとも一部に結合した第１のクラスの抗原結合部位 を含むキメラ抗体。
12. １２．Ｆ（ａｂ）′２型抗体である請求の範囲第１１項記載のキメラ抗体。
13. １３．可変部はＮＰに対し特異的なマウス抗体由来のものであり、不変部はヒト ＣＥ部である請求の範囲第１１項記載のキメラ抗体。
14. １４．酵素の少くとも一部に連結した抗原結合部位を含むキメラ抗体。
15. １５．既知の結合特異性を有するタンパク質に連結した抗原結合部位を含むキメ ラ抗体。
16. １６．既知の遺伝子によって発現されたタンパク質に連結した抗原結合部位を含 むキメラ抗体。
17. １７．タンパク質毒素に連結した抗原結合部位を含むキメラ抗体。
18. １８．前記抗原結合部位は特異的に切断しうるリンカー配列によって前記第２の タンパク質に連結されている請求の範囲第１１項ないし第１７項のいずれかに記 載のキメラ抗体。
19. １９．ＥＬＩＳＡ型検定におけるクレーム１４のキメラ抗体の使用法。
20. ２０．請求の範囲第１５項記載のキメラ抗体のイムノアッセイにおける使用法。
21. ２１．クレーム１７のキメラ抗体の治療における使用法。
22. ２２．アフィニティークロマトグラフィーによる前記第２のタンパク質の精製に おいて請求の範囲第１８項記載のキメラ抗体の使用法。
23. ２３．プラスミドｐＳＶ−ＶＮＰγδ。
24. ２４．プラスミドｐＳＶ−ＶＮＰγＳＮａｓｅ。
25. ２５．プラスミドｐＳＶ−ＶＮＰγｍｙｃ。
26. ２６．プラスミドｐＳＶ−ＶＮＰＨε。
27. ２７．プラスミドｐＳＶ−ＶＮＰＫｌｅｎｏｗ。
28. ２８．請求の範囲第２３項ないし第２７項記載のプラスミドのいずれかで形質転 換したＪ５５８Ｌ細胞。
29. ２９．請求の範囲第２８項記載の形質転換したＪ５５８Ｌ細胞のいずれかを培養 することにより産生されるキメラ抗体。