JPS6159639B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、下記構造 を有する化合物即ち９α−ヒドロキシ−３−オキ
ソプレグナ−４，17（20）−ジエン−20−カルボ
ン酸メチルエステル（以下９α−OH−PCMと略
すことがある）に関するものである。 ９α−OH−PCMは、コルチコイド製造の為の
極めて重要な前駆体である。コルチコイド活性発
現の為に11β位に水酸基、17α位に水酸基がある
のが望ましいが、先ず本物質は９α位に水酸基を
有するので、C9−11位間二重結合導入を経由し
て、容易に11β位に合成法で水酸基が誘導され
る。 もしＢ環のC9位に水酸基がなければ、11β位
に水酸基が導入するには低濃度でしか進行しない
と云われる醗酵法に頼らざるを得なくなり、効率
が悪い。さらに９α位にフツ素原子などを含む高
活性コルチコイドの合成にも、９αに水酸基を有
するステロイドは有用な原料物質である。一方本
物質は、C17〜20位間に二重結合を有するので通
常は導入しにくい17α水酸基が有機合成法で容易
に導入されうる。 さらに本物質は、Ａ環C4〜５位間に二重結合
が存在する。通常コルチコイドはC4〜５位間に
二重結合を有するので、この点でも都合がよい。 コルチコイドの中にはＡ環にC4〜５位間のみ
ならずC1〜２位間に二重結合を有するジエン化
合物が多いが、前駆体の段階でジエン構造を有す
ると、11β位、17α位に水酸基を導入する時など
にC1〜２位間の二重結合の存在が邪魔になる事
があるので、本物質の如く中間体の段階ではＡ環
はモノエン構造の方がのぞましい。 さらに本物質は炭素数22のステロイドのエステ
ルであるが、この事により脱炭酸などの工程を経
て炭素数21を基本骨格とするコルチコイドに容易
に変換しうる。このように本物質はコルチコイド
製造の前駆体として理想的な化合物である。 本物質から典型的コルチコイドの１つであるハ
イドロコーチゾン・アセテートへの有機化学合成
のルートは種々あるが例えば次の如き方法があげ
られる。 図中で、「NBr」はＮ−プロモサクシイミド、
また「Ac」はアセチル基を表わす。 最終のハイドロコーチゾン・アセテートからさ
らにプレドニソロンにしたいなら、アースロバク
ター・シンプレツクスなどの微生物を用い脱水素
してC1〜２位間に二重結合を導入すればよい。 ９α−OH−PCMは、例えば以下に述べる様に
して製造できる。 すなわち、下記構造 を有する３−オキソプレグナー４，17（20）−ジ
エン−20−カルボン酸メチルエステル（以下
PCMと略す）を基質とし、９α位に水酸基を導
入できる微生物を醗酵させることにより９α−
OH−PCMが製造できる。 このような９α位に水酸基を導入できる微生物
としては、ロドコツカス（以下「Ｒ」と略す）属
に属するものが好適である。 さらに詳しくはR.エクイ（equi）に属する微生
物が用いられる。R.エクイに属する菌としては
ATCC6939，7698，7699，10146，21107，
21280，21329，21521および21690号各菌ならびに
IAM1038号菌が知られている。 そのなかでもATCC21329号菌および
ATCC21521号菌が特にすぐれている。ここでこ
れらR.エクイなる種は従来コリネバクテリウ
ム・エクイ（以下「C.エクイ」と略す）と称さ
れてきたものである。 このC.エクイがR.エクイに変更された経緯は
次の如くである。 先ず、ツカムラ・ミチオ（M.Tsukamura）が
ジヤーナル・オブ・ジエネラル・マイクロバイオ
ロジー（J.Gen・Microbiol.）68巻、15〜26頁
（1971年）において抗酸性わずかで、アリルスル
フアターゼ（２週間）活性なく、シヨ糖を唯一炭
素源として利用出来、かつトリメチレンジアミン
を炭素・窒素源としては同時には利用出来ない一
群の微生物は、ミコバクテリウム（以下「M.」
と略す）属およびノカルデイア（以下「N.」と
略す）属とは明確に区別出来るとし、M.属、N.
属の中間でやゝＮ属よりの新たな属を創設し、そ
の中に入れるのが妥当であるとした。そして、こ
れら一群の微生物をゴルドナ（以下「G.」と略
す）属と呼ぶ事を提唱した。この際G.属中にツ
カムラ＃3410（＝ATCC，25592，NCTC
10667）を基準菌株（type strain）とするG.ブロ
ンチアリス（bronchialis）、ツカムラ＃3605（＝
ATCC 25593，NCTC 10668）を基準菌株とする
G.ルブラ（rubra）、ツカムラ＃3612（＝ATCC
25594，NCTC 10669）を基準菌株とするG.テラ
エ（terrae）の三種をおき、基準種（type
species）をG.ブロンチアリスとした。のちにG.
ルブラは、ジヤパニーズ・ジヤーナル・オブ・マ
イクロバイオロジー（Japan.J.Microbiol.）17
巻、３号、189〜197頁（1973年）において、ツカ
ムラ・ミチオによりG.ルブロパーテインクタ
（rubropertincta）と変名されている。翌年ツカ
ムラ・ミチオは同誌、18巻、１号、37〜44頁
（1974年）において、従来M.ロドクロウス
（rhodochrous）等として名付けられていたロド
クロウス群（“Rhodochrous”group）の分類学
的位置のみなおしを行ない、その中にはG.属に
属させるべきものが多いとした。そして既述の３
種のG.属に入らぬものを新たなる群にわけ、そ
れらに基づきG.オーランテイアカ
（aurantiaca）、G.ロドクロア（rhodochroa）およ
びG.ロゼア（rosea）なる三種を追加した。しか
しこの際G.属に属すべきと考えられるM.ロドク
ロウスATCC 13808号菌が既に古くゾプフ
（zopf）によりBer.Dtsch.Botan.Gas.9巻、22〜28
頁（1891年）においてロドコツカス・ロドクロウ
ス（Rhodococcus rhodochrous）と呼ばれていた
ものである事がわかり、合法的かつ最も古い属名
を優先させるべきとの命名規約に従つて、自ら名
付けたG.属なる名称はＲ属に変更すべきと主張
した。 一方グツトフエロー（Goodfellow）らはジヤ
ーナル・オブ・ジエネラル・マイクロバイオロジ
ー、100巻、99〜122頁（1977年）において、G.
属菌を含み所謂ロドクロウス混合群
（“rhodochrous”complex）およびその周辺菌の
分類再編成を行ない、ツカムラと同様従来のM.
属菌、N.属菌とは明確に異なる新属の存在を認
めツカムラ同様Ｒ属と呼ぶ事を確認した。そして
従来のM.属菌、N.属菌についても見なおしを行
ない、従来M.属菌またはN.属菌とされてきたも
のでR.属に編入させるべきものがかなりあると
して、これらに基づきＲ属をさらに修正
（emendation）し９種にわけた。それらは、R.ロ
ドクロウス（rhodochrous）、Ｒブロンチアリス
（bronchialis）、R.コラリナス（corallinus）、R.
エリスロポリス（erythropolis）R.エクイ
（equi）、R.ロードニー（rhodnii）、R.ルブラス
（rubrus）、R.ルブロパーテインクタス
（rubropertinctus）およびR.テラエ（terrae）で
ある。 ここでR.エクイを創設した際に、従来C.エク
イと称されてきた一群の微生物を基準菌株に
ATCC 25729号菌を指定して、その正名にR.エク
イ〔マグナツソン（Magnusson）〕グツドフエロ
ー・エ・アンダーソン（Goodfellow et
Anderson）を採用した。このATCC 25729号菌
はNCTC 1621号菌に由来し、バージーズ・マニ
ユアル・オブ・デターミナテイブ・バクテリオロ
ジー第８版におけるC.エタイの記載の中で参考
菌株（Reference strain）として（基準菌株は何
も指定されていない）記載されているものであ
る。 一方M.属およびN.属にも属さない新しい属
（Ｒ属）の創設の必要性について1974年にすでに
ジヤーナル・オブ・ジエネラル・マイクロバイオ
ロジー、85巻、291〜302頁（1974年）においてグ
ツドフエローとツカムラばかりでなくこの方向の
最も権威のある３つの分類研究グループであるリ
ンド（Lind）、モルダルスカ（Mordarska）およ
びパチン（Pattyn）も認めている。 さらには現在最も信頼のおける論文は詳細な菌
学的性質を記載したグツドフエロー（1977年、前
出）らのものであるから、C.エクイはグツドフ
エローらの分類に従つて、R.エクイと考えるの
が現在のところ最も妥当である。 これらの細菌
学的性質は、ツカムラ（前出、1971年）、ツカム
ラ（ジヤーナル・オブ・システマテイツク・バク
テリオロジー、25巻、377〜382頁（1975年））お
よびグツドフエローら（前出、1977年）に詳述さ
れている。 これらＲ属による９α位水酸化反応は、増殖菌
体（growing cells）の状態でも休止菌体
（resting cells）の状態でもどちらでもよい。 休止菌体の場合は、不溶物を含まぬ培地で培養
し、遠心分離などにより菌を集菌し、基質を含む
緩衝液、生理的食塩水、水などに再び懸濁して転
換反応を行なう。反応中の通気撹拌が必要であ
る。 次に増殖菌体を用いる場合について詳述する
と、炭素源、窒素源、無機塩類および必要に応じ
てビタミン等の栄養素を含む培地を殺菌し、これ
にＲ属菌を接種して振盪培養ないしは通気撹拌培
養を行なう。用いられる培地は次のようなもので
ある。 炭素源としては、たとえば、ｎ−パラフイン、
α−オレフイン、キシレン等の炭化水素；メタノ
ール、エタノール、グリセリン、高級アルコール
等のアルコール類；コハク酸、酢酸、高級脂肪酸
等の有機酸およびその塩；澱粉、麦芽糖、シヨ
糖、ブドウ糖、ラムノース等の糖類；アマニ油、
大豆油、ゴマ油、トウモロコシ油、ナタネ油、パ
ーム油、魚油、牛脂、タロー油脂などの油脂類が
あげられる。炭素源、窒素源およびその他の栄養
物質を含む天然栄養源としては、たとえばアマニ
油脂粕、脱脂大豆粕、綿実油粕、ナタネ油粕など
の植物油脂粕類；ハイテスト糖蜜、精製糖蜜およ
びキシロース糖蜜を含む糖蜜類；バカス、コーン
コブ、アルフアルフア、コーンステイ−ブリカ
ー、デイステイラーズソルブル、味液、魚粉、フ
スマ、肉エキス、酵母、酵母エキス、ポテトエキ
ス、麦芽エキス、グルテン、ペプトン、グルタミ
ン酸塩、アスパラギン、グリシン、カゼイン、カ
ゼイン分解物、スキムミルクがあげられる。 また、培地に添加される無機物としては例えば
硫安、塩安などの窒素源；リン酸水素二カリウム
等のカリウムおよびリン源；鉄、銅、マグネシウ
ム、マンガン、コバルト、亜鉛、カルシウム等の
塩類；糖蜜等天然物の灰化物があげられる。その
他必要に応じてビタミン類を添加することもでき
る。 培地の組成を用いる菌糖の種類の応じて選ばれ
るが、炭素源、窒素源、カリウム、リンおよびマ
グネシウムは培地成分として不可決である。 消泡剤が必要な場合には周知のものを添加すれ
ばよい。具体的にはポリオキシアルキレングリコ
ールなどが挙げられるが必ずしも消泡剤を添加す
る必要はない。 界面活性剤は乳化剤として有効である場合が多
い。界面活性剤としては、非イオン系及び陰イオ
ン系のものが好ましい。具体的にはたとえば、ポ
リオキシエチレンソルビタンモノステアレート、
ソルビタンモノパルミテート、ポリエチレングリ
コールモノステアレートなどを挙げることができ
る。 増殖菌体、休止菌体を問わず反応温度は通常20
〜40℃であるが、28〜37℃付近が最適である。 反応液（緩衝液、培地など）のPHは通常５〜10
に調整されるが、６〜９が好ましい。 菌濃度が低いと、この転換反応は遅れるので、
R.属菌の濃度は１×10⁹／ml以上、のぞましくは
１×10¹⁰／ml以上になるよう調整するか、培養す
る事がのぞましい。 原料であるPCMは培地と共に殺菌したり、ま
た培養開始後、培地に添加してもよい。また分割
添加も可能である。この場合、乾燥殺菌あるいは
湿熱殺菌後そのまま添加するか、あるいはジメチ
ルホルムアミド、メタノール等の溶媒に溶解して
溶液として添加するか、あるいは超音波処理によ
り微細に分散懸濁液として添加する。その際、界
面活性剤を同時に添加するとPCMの分散がより
促進される場合が多い。 転換に要する時間は、菌濃度、温度、PHなどに
より一律には云いがたいが、通常７日以内、早い
ときは１〜２日で反応停止した方がよい場合が多
い。通常生成した９α−OH−PCMは時間が経過
しすぎるとさらに分解を受けて減少するので、そ
の生成量を時間と共に定量し、減少しはじめたら
熱殺菌、酸・アルカリ添加、有機溶媒添加などに
より停止する必要がある。 ９α位水酸化酵素は、一般に誘導酵素と考えら
れるから、Ｒ属菌の種培養の段階で少量のPCM
を添加し、酵素を誘導しておいた方がのぞましい
ことがある。 転換反応終了後、培養液中等に生成した９α−
OH−PCMは既知の方法で採取、分離精製されう
る。例えば、培養液から９α−OH−PCMを等量
ないしは数倍量のクロロホルム、酢酸エチルなど
の水と混和しにくい有機溶媒で抽出し、抽出液か
ら溶媒を留去させたのち、得られた粗９α−OH
−PCMは多孔性樹脂、シリカゲル、アルミナ等
を吸着剤とし、石油エーテル、ベンゼン、クロロ
ホルム、エーテル、アセトン、エタノール、メタ
ノール、酢酸エチル等を溶離剤とするカラムクロ
マトグラフイーにより、残存基質、副生物等から
分離されうる。 しかし、通常９α−OH−PCMが主体となす場
合は、クロマト操作する事なく、メタノール、酢
酸エチル、アセトンなどに溶解させて再結晶を繰
り返せば９α−OH−PCMの純結晶を得る事がで
きる。 基質として用いられるPCM微生物反応で別の
原料から転換して製造する場合には、その醗酵液
にR.属菌を接種する事によりPCMを培養液から
単離する事なく所謂二段醗酵ないしは混合培養に
より目的の９α−OH−PCMを製造する事が可能
である。そのような例として例えばステロール類
よりＭスピーシーズNRRL Ｂ−8054号菌とＲ属
菌との二段培養による９α−OH−PCMの製造が
あげられる。このNRRL Ｂ−8054号菌はPCMだ
けでなくメチルエステルではないfreeのカルボン
酸である３−オキソプレグナ−４，17（20）ジエ
ン−20−カルボン酸も生成するが、通常ははるか
にPCMの方を多く生産する。従つてR.エクイと
の２段培養では９α−OH−PCMの方が９α−ヒ
ドロキシ−３−オキソプレグナ−４，17（20）−
ジエン−20−カルボン酸よりはるかに多く培養液
中に生産される。 ここでステロール類とは各種ステロールまたは
それらの酸化中間体を総合してステロール類と称
す。各種ステロールとはペルヒドロシクロペンタ
ノフエナントレン核のＣ−３位にヒドロキシル基
を、通常Ｃ−５位に二重結合を、Ｃ−17位に炭素
数８ないし10個の鎖式の側鎖を有し、場合によつ
てはＣ−７，Ｃ−８，Ｃ−９（11）等に二重結合
を有してもよい。 このような各種ステロールとしては、コレステ
ロール、スチグマステロール、カンペステロー
ル、β−シトステロール、エルゴステロール、ブ
ラツシカステロール、フコステロール、ラノステ
ロール、アグノステロール、ジヒドロラノステロ
ール、ジヒドロアグノステロール、α−シトステ
ロール等が挙げられる。好ましいステロールはコ
レステロール、カンペステロール、スチグマステ
ロールおよびβ−シトステロールである。 魚油やいか油からのアルカリ洗浄ダーク油、さ
らに植物油の脱臭スカム、脱臭スラツジ、トール
油などのステロール含有天然物および加工物も同
様に原料として使用される。 さらに各種ステロールの酸化中間体も基質とし
て使用される。このような酸化中間体の中には各
種ステロールの４−エン−３−オン誘導体等が挙
げられるが、具体的には、たとえば、コレスト−
４−エン−３−オン、ステイグマスタ．４，22−
ジエン−３−オン、コレスタ−４，22−ジエン−
３−オン等である。 この二段醗酵の培養方法は第１段の醗酵が進行
中はその最適の条件で培養し、R.属菌を接種し
た後は、R.属菌の最適条件で培養した方がのぞ
ましい。従つてPCM醗酵中にPHが極端にかたよ
つた場合などにはR.属菌の接種時に、酸・アル
カリを添加する事によりPHを７付近に調整しなお
してもよいし、その方が良い場合が多い。 R.属菌を接種する時期は、第１段の醗酵が始
まつたばかりの時に行なうより、むしろ終了に近
くなつてから行なつた方が結局９α−OH−PCM
生産量が多くなる事が多い。 R.属菌の接種の際、第１段に醗酵を熱処理な
どで必ずしも停止する必要はない。第１段醗酵が
未だ進んでいるところへR.属菌を接種し、その
まま両菌が混合培養されている状態でも９α−
OH−PCMが多量生産される。 このように二段培養ないしは混合培養が可能で
あるが、培地に関しては第１段醗酵にとつて最適
な培地でPCM生産醗酵を行ない、それに通常は
新成分を加える必要なく、R.属菌を接種して９
α−OH−PCMを生成させて何らさしつかえな
い。栄養不十分と思われる時には、R.属菌接種
の前後に殺菌した肉エキス、脱脂大豆、硝酸アン
モニウムなどの新成分を培養液に添加してもよ
い。 R.属菌の培養液の接種量は第１段培養液あた
り通常0.1〜30％位でのぞましくは１〜15％であ
る。 本発明によれば９α−OH−PCMを培地中に高
濃度で生成させる事ができる。またステロールか
らPCM，PCMから９α−OH−PCMの二段の反
応を醗酵法で有利に行うことにより、安価なステ
ロール類より９α−OH−PCMを安価に生成する
ことを可能にした。 以下の実施例で本発明をさらに詳細に説明する
が、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実
施例に限定されない。なお、以下の実施例におい
て、ステロイドの定量は、必要あらばシリル化後
ガスクロマトグラフイーおよび液体クロマトグラ
フイーにより行なつた。また以下の実施例におい
て、パーセントは重量による。 実施例 １ グルコース1.0％、肉エキス0.3％、ペプトン1.0
％、食塩0.5％および水よりなる種培地（PH7.0）
を、500ml肩付コルベンに100ml分注し、120℃、
20分間蒸気殺菌する。これにR.エクイ（equi）
ATCC 21329号菌を１自金耳接種し、30℃で120
往復／分、振幅７cmの往復振盪機で52時間種培養
する。この種培養液４mlを、綿実粕4.0％、酵母
1.5％、大豆油1.5％、NaNO₃0.2％、K₂HPO₄0.1
％、MgSO₄・7H₂O0.1ｇおよび水よりなる本培養
培地50ml（PH7.0，120℃で20分間蒸気殺菌）を含
む500ml肩付きフラスコ１本に接種する。本培養
は30℃で120往復／分振幅７cmの往復振盪条件で
行い、培養開始後30時間目に殺菌したPCM（粉
末）1.0ｇを無菌的に添加する。その後さらに培
養を続け、PCM添加後48時間で培養を停止し、
培養液を150mlの酢酸エチルで抽出する。この抽
出液をガスクロマトグラフイーで分析した結果、
0.50ｇの９α−OH−PCMの存在が確認された。
この物質を同定する為に抽出液を濃縮し、シリカ
ゲルの薄層クロマトグラフイーで展開し、該当部
分をかき取り溶媒（酢酸エチル）で溶出し、さら
に酢酸エチル、エチルエーテルより再結晶を繰り
返した結果、約300mgの純結晶を得ることができ
た。 この物質は融点202〜204℃を示す無色柱状晶
（エチルエーテル）であつた。その赤外線吸収ス
ペクトラム（KBr Disc）は3520cm^-1（OH由
来）、1690cm^-1、1660cm^-1に極大吸収を持つてい
た。質量分析の結果、Ｍ／ｅ＝372にM⁺分子イオンピ ークさらに340にＭ−CH₃OHに由来ると思われる
baseピークを持つていた。NMR分析の結果は次
の通りである。 NMR（CDCl₃中） 0.97（3H，ｓ，18−CH₃） 1.33（3H，ｓ，19−CH₃） 1.95（3H，ｔ，Ｊ＝〜２Hz，21−CH₃） 3.68（3H，ｓ，COOCH₃） 5.86（1H，br−ｓ，４−Ｈ） （C₅D₅N中） 0.93（3H，ｓ，18−CH₃） 1.26（3H，ｓ，19−CH₃） 2.02（3H，ｔ，Ｊ＝〜２Hz，21−CH₃） 3.67（3H，ｓ，COOCH₃） 6.02（1H，br−ｓ，４−Ｈ） この物質は次の構造を有する９α−OH−PCM
と考えられる。 一方、前述と同じ組成でただ最初から1.0ｇの
PCMを含有した本培養培地50mlを500ml肩付フラ
スコ中で調製する。これを蒸気殺菌後、前述の種
培養を同量同時に接種する。これを途中にPCM
の添加をすることなく同一条件で培養した後、48
時間で培養を停止する。この培養液を150mlの酢
酸エチルで抽出し、その中の９α−OH−PCM含
量を測定した結果、0.47ｇの９α−OH−PCMの
存在する事が確認された。 実施例 ２ グルコース1.0％、肉エキス0.3％、ペプトン1.0
％、酵母エキス0.5％、PCM0.02％および水より
なる種培地（PH7.0）を500ml肩付コルベンに100
ml分注し、120℃、20分間蒸気殺菌する。これに
R.エクイATCC 21329号菌を１白金耳接種し、30
℃で120往復／分、振幅７cmの往復振盪機で48時
間培養する。この種培養をすべてあわせ、冷却遠
心分離にて菌を沈降させ集菌する。生理的食塩水
にて２回洗浄後、1.0％のPCMを含有する燐酸緩
衝液（PH7.5，1/20Ｍ）25mlに菌体を懸濁する。
この懸濁液30mlを500ml肩付フラスコに入れ、種
培養と同一条件にて振盪する。反応液を12時間振
とう後、150mlの酢酸エチルで抽出し、抽出液中
の９α−OH−PCM含量を測定した結果12時間目
に約50mgの９α−OH−PCMの存在を確認した。 実施例 ３ 実施例１と同様にしてR.エクイATCC 21521号
菌を種培養した。この種培養液２mlを、脱脂大豆
粉4.0％、酵母2.0％、K₂HPO₄ 0.25％、MgSO₄・
7H₂O0.1％、NH₄NO₅0.2％、大豆油1.0％、
PCM1.5％および水よりなる本培養培地50mlを含
む500ml肩付フラスコ（PH7.0，120℃，20分間蒸
気殺菌）１本に接種する。30℃、120往復／分、
７cm振幅の条件で培養し59時間で培養を停止す
る。その後酢酸エチル150mlを用いて培養液を抽
出したところ、抽出液中に0.35ｇの９α−OH−
PCMの存在が確認された。 実施例 ４ グルコース1.0％、肉エキス1.0％、ペプトン1.0
％および水よりなる種培地（PH7.2）100mlを500
ml肩付きフラスコに分注し、120℃で15分間蒸気
殺菌後、ミコバクテリウム スピーシーズ
NRRL Ｂ−8054号菌を１白金耳接種し、30℃で
120往復／分、振幅７cmの往復振盪条件で72時間
種培養する。この種培養液２mlを丸大豆麿砕物
4.0％、酵母1.0％、NaNO₃0.2％、K₂HPO₄0.2
％、MgSO₄・7H₂O0.1％、コレステロール1.5％
および水からなる本培養培地100mlを含む500ml肩
付きフラスコ（PH7.0、120℃で20分間蒸気殺菌）
５本に接種する。本培養は30℃で、120往復／
分、振幅７cmの往復振盪条件で行う。培養開始後
220時間目にPHを無菌的に７付近に調整し、さら
にここに実施例１と同様にして種培養したR.equi
ATCC 21329号菌８mlを夫々のフラスコに接種す
る。接種後、同一振盪条件で30℃で48時間培養を
継続する。培養停止後培養液を全て併せ、１回に
1.5の酢酸エチルで２回抽出し、併せた抽出液
中のステロイド含量を測定した結果９α−OH−
PCM0.96ｇの存在が確認された。 実施例 ５ グルコース1.0％、肉エキス1.0％、ペプトン1.0
％および水よりなる種培地（PH7.2）100mlを500
ml肩付きフラスコに分注し、120℃で15分間蒸気
殺菌後、ミコバクテリウム スピーシーズ
NRRL Ｂ−8054号菌を１白金耳接種し30℃で120
往復／分、振幅７cmの往復振盪条件で56時間種培
養する。この種培養液20mlを綿実粕4.0％、酵母
1.5％、大豆油1.0％、NaNO₃0.2％、K₂HPO₄0.1
％、MgSO₄・7H₂O0.01％、コレステロール2.0％
および水よりなる本培養培地800ml（PH7.0、120
℃で20分間蒸気殺菌）を含む６容肩付きフラス
コ２本に接種する。本培養は30℃で100往復／
分、振幅７cmの往復振盪条件で行い、培養開始後
240時間目に１本は熱殺菌せずにPHを７付近に調
整し、それと同時に実施例３と同様にして種培養
したR.エクイ ATCC 21521号菌を50ml接種す
る。もう１本は120℃、30分の蒸気殺菌を施し、
冷却後、直ちにPHを７付近に調整後、同じR.エ
クイATCC 21521号菌の種培養を50ml接種する。
接種後同時に２本のフラスコの培養を再開する。
再開後48時間で培養を中止し、各々のフラスコの
培養液を1.6の酢酸エチルで抽出した結果、R.
エクイ接種前熱殺菌した方は1.67ｇ、熱殺菌しな
い方は1.60ｇの９α−OH−PCMが生成してい
た。 実施例 ６ グリセロール2.0％、丸大豆麿砕物2.0％、酵母
エキス1.0％、NaNO₃0.2％、K₂HPO₄0.1％および
水よりなる種培地（PH7.2に調整）100mlを含む
500ml肩付きコルベンを120℃、20分間蒸気殺菌す
る。これにミコバクテリウム スピーシーズ
NRRL Ｂ−8054号菌を１白金耳接種する。接種
後、30℃で120往復／分、振幅７cmの往復振盪条
件で68時間種培養する。この種培養20mlを脱脂大
豆麿砕物4.0％、酵母1.5％、綿実油粕1.0％、
NH₄NO₃0.1％、MgSO₄・7H₂O0.1％、K₂HPO₄0.1
％、花王アトラス社製ノニオン界面活性商標
“Tween−60”0.05％、表２の各種のステロール
類2.0％および水よりなる本培養培地50mlを含む
500ml肩付フラスコ（合計５本）に接種する。接
種後30℃で120往復／分、７cm振幅の条件で培養
する。192時間培養後、実施例２と同様にして培
養したR.エクイ（equi）ATCC 21329号菌の種培
養液４mlを接種する。同時にNH₄NO₃50mg、酵母
エキス200mgを含んだ殺菌水５mlを添加する。そ
してPHを７付近に調整する。このあとさらに48時
間培養を継続し48時間目に培養を停止し、各フラ
スコを150mlの酢酸エチルを用いて、培養液から
ステロイドを抽出する。この抽出液中の９α−
OH−PCMの量を表１にかかげる。 【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ９α−ヒドロキシ−３−オキソプレグナ−
   ４，17（20）−ジエン−20−カルボン酸メチルエ
   ステル。