JPS62163692A - ヒトリゾチ−ム蛋白質 - Google Patents
ヒトリゾチ−ム蛋白質Info
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- JPS62163692A JPS62163692A JP61269494A JP26949486A JPS62163692A JP S62163692 A JPS62163692 A JP S62163692A JP 61269494 A JP61269494 A JP 61269494A JP 26949486 A JP26949486 A JP 26949486A JP S62163692 A JPS62163692 A JP S62163692A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明は、とトリゾチーム蛋白質をコードするＣＤＮＡ
の合成および単離、ヒトリゾチームの製造、ならびにヒ
１〜リゾチーム蛋白質自体に関する。 本発明はまた、以下の実ｆＩｆ４態様に例を示したＪ：
うなその治療的使用の可能性に関する。とくに本発明は
、ヒトリゾヂームシグナルペブチド部分のＣＤＮＡ配列
、全成熟リゾデーム蛋白質のＣＤＮＡ配列および、３′
末端にヒトリゾチーム遺伝子の非ｎ名号配列部分を含有
づる細菌プラスミドに関する。本発明はざらに、挿入体
としてヒトリゾデームをコードするヌクレオチド配列を
もつプラスミドのような発現ベクター、Ｊ３よびヒトリ
ゾチームの製造を可能にする各種宿主生物または培養物
に関する。 リゾチームは１．４−β−Ｎ−アセチルムラミダーぜと
定義され、細菌のペプチドグリカン中のＮ−アセチル−
ムラミン酸（ＭｕｒＮＡＣ）のＣ−１ａ３よびＮ−アセ
チルグルコサミン（ＧＪ！ｃＮＡｃ）のＣ−４間のグリ
コシド結合を切断する（１）、１９２２年に八Ｉｅｘａ
ｎｄｅｒ Ｆｌｅｍｉｎ。 は、各種組織および分泌物、ならびに鶏の卵白が、ある
種のダラム陽性菌を溶解する能力をもつことを発見した
。彼はこの溶菌因子をリゾデーム、すなわち、細菌を溶
解できる酵素と命名した。 ｒｌｅｍｉｎａは、リゾチームが軟骨および胃からのホ
モジナイズした組織、涙、唾液、喀痰、内分泌物、病的
な尿、血清ならびに白血球中に存在するが、健床な尿、
脳を髄液または汗には存在しないことを示した（２）。 リゾデームの抗菌剤としての活性は、その直接的な溶菌
活性と、マクロファージの６作用に関連した１１激作用
の両者に阜づくものと考えられている（３，４）。 胞状マクロファージによる病Ｂハ菌防禦におけるメディ
エータ−としてのりゾヂームの重要な役υ１がラツ１−
において明らかにされた。１′なりら、無（セの細菌に
は食作用はみられないが、リゾデームにより傷害された
細菌は速やかに食作用を受ける（３）。同時に、リゾチ
ームは、多形核白血球（５）Ｊ′３よびマクロファージ
（４）の食作用活性を直接１１１強することが明らかに
されている。口内微生物に対するリゾデームの作用につ
いての研究も、７種Ｔ１４のビルレントおよび非ビルレ
ント株において行われている。結果は、静菌、溶菌おＪ
、び殺菌作ｍには様々な機構が関与していて、この酵素
は口内微生物に対して選択因子であるのみでなく実効因
子であることを示している（６）。リゾチームの伯に推
測されている機能には、免疫刺激（７）ならびに宿主膜
の悪性形質転換に対する免疫学的および非免疫学的モニ
タリング（８）がある。血清および／または尿からのり
ゾチームの定量は、各種疾患の診断に、また各種疾患の
進展のインディケータ−として用いられる。急性リンパ
芽球白血病では血清リゾデームレベルは有意に低下する
が、慢性骨髄性白血病ならびに急性用芽球および骨髄性
単球白血病では血清中リゾチーム濃度は著しく上界する
（９．１０）。 リゾチームの治療的に有効な利用例としては、各種線−
Ｊ３ 、Ｊ：びウィルス感染（帯状庖疹）大１１９．炎
、各種の疼痛、アレルギー、炎症ならびに小児科領域（
リゾチームの添加により乳児に適した形への牛乳の変換
）の治療がある。 リゾデームは、他の生物学的に活性な蛋白質と、たとえ
ばその完全な活性発生を助ける等の形で相互作用するこ
ともできる（ Ａｄｉｎｏｌ ｒｉ ：Ｌａｍｐｅｒｔ
。 ＷＯＯｄＳ編、Δｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｌｏ
ｎｄｏｎ、 １９８１．１９〜４７）。このような成分
は、たとえば、鉄キレート複合体を形成することよりあ
る種の微生物の複製を阻害するラクトトランスフェリン
、およびラクトトランスフェリンの抗生物質活性を強化
する乳汁中の５ＩｏＡのような抗生物質を補足すること
がでさる（Ｓｐｉｋほか： Ｂｕｌｌ、 Ｅｕｒ。 Ｐｔ＋ｙｓｉｏｐａｔｈ、 Ｒａ５ｐ、 、工９ ：
１２３〜１３０．１９８３）。リゾデーム、ラクトト
ランスフェリンおよび免疫グロブリンはまた、各種の天
然分泌物たとえば唾液、涙、各種の乳Ｈ中に（Ｊｏｒｉ
ａｕｘはが：Ｐｒｏｔｉｄｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ ｒｌｕｉｄｓ、 Ｐｒｏｃ。 ３１ＳｔＣＯＩ＋、、１９８４）、気管支粘膜Ｊｊ Ｊ
、’び卵白中に共存する。リゾデームはまた、リウマブ
熱やリウマヂ痛の緩解に有利に使用でき、リウマチＪｊ
Ｊ：び関節炎型疾患に治療活性を有り“る（Ｔｈｉｒ
ｄｉｌｌｔ、 ５ＶＩＩＩＤ、 ０１１ Ｆｌｅｍｉｎ
ｇｓ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、 Ｍｉｌａｎ、 １９６４）
。その後、リゾチームは鎮痛活性を承りことし明らかに
された（ ＢｆａｎＣ１ｌ！ ： ｒｌｌｒ、 Ｊ。 Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、、 ７ユ：２１１〜２２１．１
’ｌｌ）。 さらに１は近になって、リゾブームｌメ抗癌覚活ヤ１を
ｂつことム示されている（Ｂｉａｎｃｌｌｉ： Ｃｌ１
ｎ、 Ｉｘｐ。 Ｐｔ＋ａｒｍａｃｏ１． Ｐｔ＋ｙｓｉｏ１． 、１０
： ４５〜５２．１９（３３）。リゾデームのこの広
範囲の活性は、相当り“る広スペクトルの治療的応用を
示唆するしのであり、これはか／、−りの経済内型０性
を危味・」るしのである。 以上挙げたリゾチームのすべての医薬的応用に際しては
、他種のりゾチームを用いるとアナヒラキシ−および／
またはアレルギー性の望ましくない副作用を生じやすく
、治療を妨げる可能性があるので、ヒトリゾチーム（Ｈ
ＬＺ）が鶏卵白から得られたりゾチームよりも好ましい
。 現在までのところ、ヒトリゾチームを得るにはヒ１−乳
汁およびヒ１〜胎盤のみが業務用の原料であった。しか
しながら、これらの出発原料の利用はきわめて限られて
いて、各バッチ毎に異なる製品が得られることになる。 古くから開発されている工業微生物学や最近開発された
紺換えＤＮＡ技術を用い、微生物によってヒトリゾリー
ムを生産することがＩＦ１利なことは当然である。 鶏卵白リゾチームの遺伝子は単離され（１１，１２）、
鶏卵白リゾチームｍＲＮＡのヌクレオチド配列、ならび
に遺伝子上にその側面領域とともに位置するエキソンに
ついては決定されている（１３）。さらに、バクテリオ
ファージＴ４のリゾブーム遺伝子のヌクレオブト配列し
明らかにされ−（いる（１４）。 Ｈｉ ７のアミノ酸配列も公知であるが（２１，２２，
２３１、本発明においで示されるｌ−Ｉ Ｌ Ｚを］−
ドラるヌクレＡｆ−ド配り１１は未知であった。ＥＰＡ
１８１ ６３／ｌ＞′″ｊには、ヒトリゾブー−ムの酵
母Ｊ３ Ｊ：び枯７．）菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ ）にＪｊ ４Ｊる発現が述へられている。 ［ＰΔ１８１ ６３４では特定の酵母ターミネータ−Ｊ
ｊ にび標品トＩＬＺｍ伝子が用５られでいないほか、
このＨＬ Ｚ Ｄ ＮΔ配列は酵母内での発現に際し
てリーダーペプチドをコード１６前置ＤＮＡ配列をもっ
ていない。したがって、生成したＩＩ Ｌ Ｚ ４．を
宿主から運搬され１９ず、その結果、正確な三次的構造
が相当するジスルフィド橋生成ににり形成されるのは困
難である。したがって、［ヨ１〕へ１８１ ６３４によ
っていかにして標品１１しＺを得るかについての記載は
ない。また、いかにして出発メチオニンを除去するかに
ついでも述べられていない。 本発明の基礎となる目的は、トＩＬＺのアミノ酸配列の
最小情報をちつｃＤＮＡを合成し、クローン化Ｊ゛る方
法を利用（）、このｃＤＮＡを用いＣ生物学的に粘付４
の合成および単離、ヒトリゾチームの製造、ならびにヒ
１〜リゾチーム蛋白質自体に関する。 本発明はまた、以下の実ｆＩｆ４態様に例を示したＪ：
うなその治療的使用の可能性に関する。とくに本発明は
、ヒトリゾヂームシグナルペブチド部分のＣＤＮＡ配列
、全成熟リゾデーム蛋白質のＣＤＮＡ配列および、３′
末端にヒトリゾチーム遺伝子の非ｎ名号配列部分を含有
づる細菌プラスミドに関する。本発明はざらに、挿入体
としてヒトリゾデームをコードするヌクレオチド配列を
もつプラスミドのような発現ベクター、Ｊ３よびヒトリ
ゾチームの製造を可能にする各種宿主生物または培養物
に関する。 リゾチームは１．４−β−Ｎ−アセチルムラミダーぜと
定義され、細菌のペプチドグリカン中のＮ−アセチル−
ムラミン酸（ＭｕｒＮＡＣ）のＣ−１ａ３よびＮ−アセ
チルグルコサミン（ＧＪ！ｃＮＡｃ）のＣ−４間のグリ
コシド結合を切断する（１）、１９２２年に八Ｉｅｘａ
ｎｄｅｒ Ｆｌｅｍｉｎ。 は、各種組織および分泌物、ならびに鶏の卵白が、ある
種のダラム陽性菌を溶解する能力をもつことを発見した
。彼はこの溶菌因子をリゾデーム、すなわち、細菌を溶
解できる酵素と命名した。 ｒｌｅｍｉｎａは、リゾチームが軟骨および胃からのホ
モジナイズした組織、涙、唾液、喀痰、内分泌物、病的
な尿、血清ならびに白血球中に存在するが、健床な尿、
脳を髄液または汗には存在しないことを示した（２）。 リゾデームの抗菌剤としての活性は、その直接的な溶菌
活性と、マクロファージの６作用に関連した１１激作用
の両者に阜づくものと考えられている（３，４）。 胞状マクロファージによる病Ｂハ菌防禦におけるメディ
エータ−としてのりゾヂームの重要な役υ１がラツ１−
において明らかにされた。１′なりら、無（セの細菌に
は食作用はみられないが、リゾデームにより傷害された
細菌は速やかに食作用を受ける（３）。同時に、リゾチ
ームは、多形核白血球（５）Ｊ′３よびマクロファージ
（４）の食作用活性を直接１１１強することが明らかに
されている。口内微生物に対するリゾデームの作用につ
いての研究も、７種Ｔ１４のビルレントおよび非ビルレ
ント株において行われている。結果は、静菌、溶菌おＪ
、び殺菌作ｍには様々な機構が関与していて、この酵素
は口内微生物に対して選択因子であるのみでなく実効因
子であることを示している（６）。リゾチームの伯に推
測されている機能には、免疫刺激（７）ならびに宿主膜
の悪性形質転換に対する免疫学的および非免疫学的モニ
タリング（８）がある。血清および／または尿からのり
ゾチームの定量は、各種疾患の診断に、また各種疾患の
進展のインディケータ−として用いられる。急性リンパ
芽球白血病では血清リゾデームレベルは有意に低下する
が、慢性骨髄性白血病ならびに急性用芽球および骨髄性
単球白血病では血清中リゾチーム濃度は著しく上界する
（９．１０）。 リゾチームの治療的に有効な利用例としては、各種線−
Ｊ３ 、Ｊ：びウィルス感染（帯状庖疹）大１１９．炎
、各種の疼痛、アレルギー、炎症ならびに小児科領域（
リゾチームの添加により乳児に適した形への牛乳の変換
）の治療がある。 リゾデームは、他の生物学的に活性な蛋白質と、たとえ
ばその完全な活性発生を助ける等の形で相互作用するこ
ともできる（ Ａｄｉｎｏｌ ｒｉ ：Ｌａｍｐｅｒｔ
。 ＷＯＯｄＳ編、Δｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｌｏ
ｎｄｏｎ、 １９８１．１９〜４７）。このような成分
は、たとえば、鉄キレート複合体を形成することよりあ
る種の微生物の複製を阻害するラクトトランスフェリン
、およびラクトトランスフェリンの抗生物質活性を強化
する乳汁中の５ＩｏＡのような抗生物質を補足すること
がでさる（Ｓｐｉｋほか： Ｂｕｌｌ、 Ｅｕｒ。 Ｐｔ＋ｙｓｉｏｐａｔｈ、 Ｒａ５ｐ、 、工９ ：
１２３〜１３０．１９８３）。リゾデーム、ラクトト
ランスフェリンおよび免疫グロブリンはまた、各種の天
然分泌物たとえば唾液、涙、各種の乳Ｈ中に（Ｊｏｒｉ
ａｕｘはが：Ｐｒｏｔｉｄｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ ｒｌｕｉｄｓ、 Ｐｒｏｃ。 ３１ＳｔＣＯＩ＋、、１９８４）、気管支粘膜Ｊｊ Ｊ
、’び卵白中に共存する。リゾデームはまた、リウマブ
熱やリウマヂ痛の緩解に有利に使用でき、リウマチＪｊ
Ｊ：び関節炎型疾患に治療活性を有り“る（Ｔｈｉｒ
ｄｉｌｌｔ、 ５ＶＩＩＩＤ、 ０１１ Ｆｌｅｍｉｎ
ｇｓ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、 Ｍｉｌａｎ、 １９６４）
。その後、リゾチームは鎮痛活性を承りことし明らかに
された（ ＢｆａｎＣ１ｌ！ ： ｒｌｌｒ、 Ｊ。 Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、、 ７ユ：２１１〜２２１．１
’ｌｌ）。 さらに１は近になって、リゾブームｌメ抗癌覚活ヤ１を
ｂつことム示されている（Ｂｉａｎｃｌｌｉ： Ｃｌ１
ｎ、 Ｉｘｐ。 Ｐｔ＋ａｒｍａｃｏ１． Ｐｔ＋ｙｓｉｏ１． 、１０
： ４５〜５２．１９（３３）。リゾデームのこの広
範囲の活性は、相当り“る広スペクトルの治療的応用を
示唆するしのであり、これはか／、−りの経済内型０性
を危味・」るしのである。 以上挙げたリゾチームのすべての医薬的応用に際しては
、他種のりゾチームを用いるとアナヒラキシ−および／
またはアレルギー性の望ましくない副作用を生じやすく
、治療を妨げる可能性があるので、ヒトリゾチーム（Ｈ
ＬＺ）が鶏卵白から得られたりゾチームよりも好ましい
。 現在までのところ、ヒトリゾチームを得るにはヒ１−乳
汁およびヒ１〜胎盤のみが業務用の原料であった。しか
しながら、これらの出発原料の利用はきわめて限られて
いて、各バッチ毎に異なる製品が得られることになる。 古くから開発されている工業微生物学や最近開発された
紺換えＤＮＡ技術を用い、微生物によってヒトリゾリー
ムを生産することがＩＦ１利なことは当然である。 鶏卵白リゾチームの遺伝子は単離され（１１，１２）、
鶏卵白リゾチームｍＲＮＡのヌクレオチド配列、ならび
に遺伝子上にその側面領域とともに位置するエキソンに
ついては決定されている（１３）。さらに、バクテリオ
ファージＴ４のリゾブーム遺伝子のヌクレオブト配列し
明らかにされ−（いる（１４）。 Ｈｉ ７のアミノ酸配列も公知であるが（２１，２２，
２３１、本発明においで示されるｌ−Ｉ Ｌ Ｚを］−
ドラるヌクレＡｆ−ド配り１１は未知であった。ＥＰＡ
１８１ ６３／ｌ＞′″ｊには、ヒトリゾブー−ムの酵
母Ｊ３ Ｊ：び枯７．）菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ ）にＪｊ ４Ｊる発現が述へられている。 ［ＰΔ１８１ ６３４では特定の酵母ターミネータ−Ｊ
ｊ にび標品トＩＬＺｍ伝子が用５られでいないほか、
このＨＬ Ｚ Ｄ ＮΔ配列は酵母内での発現に際し
てリーダーペプチドをコード１６前置ＤＮＡ配列をもっ
ていない。したがって、生成したＩＩ Ｌ Ｚ ４．を
宿主から運搬され１９ず、その結果、正確な三次的構造
が相当するジスルフィド橋生成ににり形成されるのは困
難である。したがって、［ヨ１〕へ１８１ ６３４によ
っていかにして標品１１しＺを得るかについての記載は
ない。また、いかにして出発メチオニンを除去するかに
ついでも述べられていない。 本発明の基礎となる目的は、トＩＬＺのアミノ酸配列の
最小情報をちつｃＤＮＡを合成し、クローン化Ｊ゛る方
法を利用（）、このｃＤＮＡを用いＣ生物学的に粘付４
【１１１−７蛋白質を発現さけることにある。
この問題は、ｍ ＲＮ△をｖＪ型として用い、１１Ｌ
Ｚをコードするｃ Ｉ） Ｎ Ａを含有するＩＩ菌ハイ
ブリッドプラスミドの構築が可能であることの発見によ
り解決された。細菌ハイブリッドベクターの部分として
のＨＬＺＤＮΔは、人体の任意のＨＬ Ｚ産生１１１ｒ
ｃ１から得ることができる。適当な細胞の例としては、
胎盤細胞、急竹甲芽球おＪ、び／または骨ｗＪ竹単球白
血病患名の白血球、ヒ１−結腸癌細胞、Ｕ −９３７Ｉ
Ｉ胞系あるいは他の＋−＋ ｌ−ｚ産生細胞系を挙げる
ことができる。本発明の好Ｊニジい態様にＪｊいては、
ヒトからのｔＪ −９３７ＩＩ胞（ΔＴＣＣＣＲＩ−１
５９３＞が用いられる。 １−Ｉ Ｌ Ｚ Ｄ Ｎ Ａは１１１− Ｚ逍伝子を
含むシーンバンクから単離してらよい。本発明では、染
色体ＤＮ八を用いるのは好ましくない。それは（のコー
ド領域内にイン１−ロンを含むことが多く［たとえば鶏
卵白リゾチーム迫伝子は３ ｖＪのイントロンを含有す
る（１３）］、これは酵母を用いて切断できないからで
ある。本発明にＪｊいては、ヒトリゾチームｃ ｌ）
ＮΔが好ましい。 Ｕ−９３７′ａ胞から単離したｍ ＲＮ Ａ ハヒｌ−
リゾブームｃＤＮΔの合成に好ましい鋳型である。 １１ＬＺ ｃＤＮＡの第−鎖の合成には、反応を、好
ましくは上述のｍ １１Ｎ Ａの３′末端と対になるＡ
リボ（ｄ −１−） １Ｂをブライマーとして１；ｌ始
する。 一本ｖｉｃＤＮΔをｄ Ｎ Ｔ Ｐ Ｓおよび逆転写酵
累の存在下にさらに増殖させる。−木ｍｃＤＮΔをつい
ぐ、公知の各種方法によって二本ｍ ｃ ［） Ｎ八に
変換できる。本発明にＪｊいてはＧｕｂｌｃｒとｌｌｏ
ｆｆｍａｎｎの方法（１５）がＯｆましい。−木鎖ｃＤ
ＮΔから第二のｃ Ｉ） Ｎ Ａ鎖の合成（よ、ｍ Ｒ
Ｎ Ａハイ１リッドをｄＮＩｌ’ｓの存在下にＲＮ ａ
ｓ ｃ ｌ−１８よびｌ） ＮΔポリメラーピ１で！
ｉ！ｌ ｌ’ｌ！ ゛りることにより行われた。 この方法を用いることにより、二本鎖Ｃｌ’） Ｎ△が
１１１られ、これは直接イのままり［１−ン化できる。 二本鎖ｃｌ）Ｎへの細菌ベクター中へのり１°ｌ−ニン
グ１よ、各種の公知方法（・実施て゛きる。二本鎖ｃＤ
ＮＡは、直接ブランｉ・末端として、合成リンｈ−を介
して、またはホモポリマーディリングとして公知の方法
によってクローン化できる。 ｔ−Ｉ Ｌ Ｚ ｃ Ｄ Ｎ Ａクローニングするに
際しては、ホモポリマーティリング法が好ましい。この
方法では、ターミナルトランスフ１ラー１を用い、ＨＬ
Ｚ ＤＮへの３′末端に一本鎖を、ブラン１−末端ま
たは（ＪＶ端へのヌクレオブト（好ましくはｄ Ｇ Ｔ
Ｐ）のイ４加により形成させる。別の反応で、細菌プラ
スミドを制限メクレ）７−ゼで線状化しく ＨＬ Ｚ
ｃ Ｉ） Ｎ Ａのクローニングには、ｐ ＬＪ Ｃ９
ベクターが好ましかった）、３′末端に相補的−木鎖を
１１１るために相補的−１゛イル（りｆましくｔよｄ
ＣＴ Ｐ ）をりえろ。次の１稈て・は、ホモポリ７−
延艮二本鎖Ｃ１）Ｎ八を相当・Ｊる相補的アイルベクタ
ーと混合しで、適当な条ｆ１下に結合させる。 組換えが起こったのＩう、ｃ ａ Ｃ１２処理大腸菌細
胞をこの況合物で形質転換し、選択プレー１〜上に＋９
ｆ ＜。Ｌｌ ｌ−Ｚ ｃ Ｄ Ｎ Ａを含イＩＪる
り【］−ンは各種の公知方法で同定Ｃさ・ろ。本発明に
おいては、放則能標識合成Ａリゴヌクレオチドによるス
クリーニングが好ましい。発表されているＨＬＺ蛋白質
のアミノ酸配列を用い、各１７塩阜艮の２組のＡリゴメ
クレＡｆ・ドを合成した。異なる＝１トンが１個の同じ
アミノ酸を１！■定できるというＩＩ実に、」：す、各
組は異なるＡリボヌクレオチドの況合物を与えられた。 すべての可能な組み合わせの合成により、存在りる１個
のＡリボヌクレオチドが１１ＬＺ３１１伝子とｈ１適の
対を形成りることが確認される。２個の１７−゛ンーＡ
゛リゴヌクレオヂドのブールを用いることにＪ：す、偽
正（ｆａｌＳｅ ｐｏｓｉ口ｖｅ）が選択される可能性
は低下する。 スクリーニング実験では、ｃＤＮＡ挿人体をもつ細菌ク
ローンのＤＮＡは二１−口セルロースろ紙に移され、１
１［Ｚ遺伝子を含む挿入体は］［に−ハイプリダイぜ−
シコンとして知られる方法を用いて同定された。二１へ
ロレルＯ−スろ紙は適当４【条ｆｌ’ １”にヒドリ１
′チーム遺伝子特異性１７−マーの敢Ｑ４標識プールと
ハイブリダイズさせた。相当するクローンを同定したの
ら、各り［１−ンのプラスミドＤＮＡを調製し、＋４Ｑ
Ｘａｍ 、！：Ｇ１１ｂ（！ｒｔ （１）方法（化学的
方法）またはＳａｎｇｅｒのＩノ法（ジデＡ１−シメク
レＡチドでの合成）を用いて挿入体の配り１１を決定し
た。正クローンからのＣ１）ＮΔ挿入体から１３ Ｎ
Ａ配列を決定づることにＪ、す、ｐｉ機能性ある蛋白質
のアミノ酸配列を１１［測りることかできる。 この配列を発表されているＩＩ Ｌ、 Ｚのアミノ前記
＆ｌｌと比較すれば、りに］−ン化されたｃ ｌ） Ｎ
Δが実際にｌ−Ｉ Ｌ Ｄ蛋白質をコードリ゛る領域を
含むかどうかを確立することがｊｉＩ能になる。 一般的には、レブリ：１ンａ′３よびコン１〜［］−ル
配＋Ｉｊを含むプラスミドベクターが使用できる。これ
らの配列は宿主細胞と適合性のある種に由来・Ｊるもの
でなければならない。ベクターは通常、複製部位に加え
て、認識間＋ｌｌを６し、したがつ（形質転換細胞内で
の表現型による選択を可能にり゛る。 たとえば、大腸菌（、Ｌ通常、大腸菌秤に由来Ｊるプラ
スミド、ｐ Ｂ Ｒ３２２にＪ、って形質転換される（
Ｂｏｌｉｖａｒはか：Ｇｅｎｃ、 ２ ： ９５．１９
７７）。 ｐ１３ Ｒ３２２はアンピシリンおよびテトラ勺イクリ
ン低抗性のｊ貞仏子を含み、したがって形質転換細胞を
同定Ｍるための鈴生な手段が与えられる。 ｐ Ｑ Ｒ３２２プラスミドまたはその他のプラスミド
はそれ自身プロモーターも含有するが、あるいはその微
生物にＪ、りそれ自体の蛋白質を発現づ゛るために使用
されるように改変されな（）ればならない。組換えＤＮ
への製造にＩｎら頻繁に利用されるプロし一ターには、
β−ラクタマーピ（ベニシリナーｔ２ ） Ｊ３よびラ
フ１−−スプロＬ−ターシスデム（Ｃｂａｎｇはか：
Ｎａｔｕｒｅ、 ２７５ ： ６１５．１９７８ ：
１Ｌａｋｕｒａほか：５ｃｉｃｎｃｃ、 １９８ ：
１０５６．１９７７ ； Ｇｏｃ＋１Ｊｃｌ ｌ：Ｕ
か： Ｎａｔｕｒｅ、 ２８１ ： Ｅ）／１４．１９
７９）、ｌ・リブトファン（ｔ ｒ ｐ ）プロ七−タ
ーシスデム（Ｇｏｃｄｄｅｌはか：Ｎｕｃ１．＾ｃｉｄ
ｓｌｉｅｓ、、 Ｂ ： ４０５７．１９８０ ； ］
−ロツバ特許出願公告第００３６ ７７６号）がある。 −１述のブ１１ Ｅ−一ターが最し一般的であるが、仙
の微生物プ［１し一夕一ら開発され、使用されている。 １−Ｉ Ｌ Ｚの遺伝子配列ｔよ、たとえば、バクテリ
オファージラムダ（ＰＬ）の左方ブ１］［−ターの］シ
トロール下に使用できる。このブ［１モーターはどくに
強力なことが知られているプ［１［−一ターのひとつで
、制御も可能である。隣接制限切断部位が知られている
遺伝子、ラムダレブレツナ−によってコントロールでき
る。 熱不安定性レプレッサ゛−をコードＪるこの遺伝子の突
然変異体を、全１１Ｌ／配ケ１を含むベクター内に包含
させることができる。温瓜を４２℃に１−冒させるとレ
プレッサーは不活性化され、ブ【１し−ターは最大の粘
付を示１゜これらの条（’Ｉ ’Ｆ ｒ産生される全ｍ
ＲＮΔ【よ、その新しい合成リボ核酸中に１）１ブＬＩ
Ｔニーターに由来する約１０％を含む細胞をｊｉＩる
のに十分なはずである。この方法で、機能性ＩＩ Ｌ
Ｚ配列がリボソーｌＸ結合部位に隣接し、ラムダＰしプ
ロし一ターからｔ、Ｌ種々の間隔にあるクローンバンク
を確〜″ノすることが可能になる７、これらのクローン
を調べ（゛、Ｉｔ：Ｉ Ｑ収Ｖを示すり［゛１−ンを選
択できる。 １１Ｌ／配列の５１現Ｊｊ Ｊ、び翻訊は、Ｊ１形質転
換望での４体に対して同種とみなされる他の調節シス１
ムの」ント［１−ル下にし進行できる。たとえば、ラフ
１−−ス依ｑ竹人賜菌株からの染色体ＤＮＡはラフ１〜
−スｊ、た覧よ１ｉ１ Ｇオペ〔１ンを含イｊし、これ
が酵木β−万うク１〜シダーピの発現を支１、ＩＪるこ
とによりラクｌ〜−スの分解が行われる。 １ａＣＡ−ぺ【コン制御要素はバクテリオ”ファージラ
ムダＤ Ｉ ＦＩ Ｃ５から１ｑられ、これは大腸菌に
感染づる。ファージの１ａｃ′Ａペロンは同じ細菌種か
ら形質導入によって１！７ることもできる。本発明の方
法に使用できる調節シス１ムは同じ生物体からのプラス
ミドｌ） ＮΔに由来するものであってｂにい。１ａＣ
ブ「１〔−ターーＡ−ペレーターはＩＰＴＧにＪニリ誘
導できる。 他のブ１］″Ｕニーター−オペレーターシステムまたは
その部分ら等しく良９ｆに使用できる。たとえば、フｌ
ラビノースオペレーター、］リシン［１オペレータ〜、
ガラクトースオペレーター、アルカリホスフｊ′クーピ
Ａベレーター、ｔｒｐオペレーター、−１ニジロース△
Ａベレーター、ｔａＣ〜プロモーター等である。 Ｍｌゑ１プロモーターをＩＩ Ｌ Ｚ ｍｌ−ド領域に
、１１Ｌ／の有効な発現が保証される。」、うに結合づ
ることが好ましい。さらに訝しくは、Ｍ１々Ｊブ［Ｊヒ
ーターを成熟ＩＩ Ｌ Ｚの：１−ド領域の直１１ｊ１
に位１どずさＵ、翻訳開始シグナル（△１−Ｇ）をこの
結合ｎ５位に沖入りる。さらに、この１＋ ＋−２発現
＋４ｉ位（ま、＾７Ｆｌ内にそれを確立させるため、公
知の酵１ｕ形質転換法を用いて各種りり母ベクターに挿
入１」ることがきる。 ハイブリッドプラスミドを含むＭ１１］細胞を各種メジ
ウム中で培養し、所望の生成物１１し７をそれから甲離
し、公知方法Ｃ精製Ｊる。別ｖ１として、１」［ｚ発現
単位の構築体内に＾’ｔ ＩＩＩシグナル配夕１１を挿
入することもできる。この場合、この種のプラスミドで
形質転換されＩＣＦｌ？ ＩＴＩ粗胞はその細胞壁を通
してＪ３ ｉメジウム中に１１Ｌ／をＩＪｌ出て・き、
したがってメジウムから所９！の生成物、１１［／を回
収でき、さらに精製できる。 酵母細胞は培養が容易で、大規模な醗酵巣作がずでに確
立されＪｊす、しかもＸＬンド１−キシンを金線ないの
で、発現のための宿１生物としてはとくに好３１、しい
。したがって、本発明には１８徨！ｌｉ？母のＪ：うな
真核生物微生物が右利に使用できる。ヒール酵Ｂ１菌が
最す頻繁に使用されるが、池の多くの種にも一般に取得
可能である。 酸１１菌での発現に【よ、通常、プラスミドＹ ｌ＜
ｐ ７ （Ｓｔｉｎｃｔｔｃｏｍｂほか： Ｎａｔ
ＬｌｒＯ，２Ｂ ２ ： ３９．１９７２：にｉｎｇｓ
ｍａｎほか： Ｇｅｎｅ、ヱ：１４１．１９７９ ：
ｌｓｃｈｕｍｐｃｒほか： Ｇｅｎｅ、 １０ ： １
５７．１９８０ ） ｄ３よびプラスミドＹＥ Ｄ １
３ （Ｂｒｏａｃｈはか： Ｇｅｎｅ、 Ｂ ： １２
１〜１３３．１９７９ ）が用いられる。プラスミドＹ
Ｒｐ７はＴＲＰＩＷ伝了を含有し、これが１〜リブ１−
ファンを含Ｊ、ないメジウ１１中では／）−育できない
、酵母変異体、ｌことえば△Ｔ ＣＣＮｏ ／＋ ４０
７６に’Ｍ ＩＪｌ、！マーカーを５える。 酸１ｕ宿主ゲノムの特徴としてＴ ＲＰ ｌが欠失して
いる揚台（よ、１８査を１〜リブ１〜フアンを加えイｉ
いで７ｊうことにより、形質転換体の検出に右力な手助
けが１１ｔられる。酵母遺伝子ＬＥＵ２を含むプラスミ
ドＹ ［ｐ １３の場合−し全く同様で、これ覧よＬＥ
ｔＪ−２変異体を補足Ｊるために使用できる。 ′Ｐ？Ｐ母ベクターに適当なプロモーター配列として（
よ、ΔＤ ｌ−１１Ｊ１ｉ仏子の５′隣接領域（静ｍｅ
ｒｅｒ。 Ｇ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｒ ｌＥｎｚｙｍｏｌｏ（Ｉ
Ｖ、 １０１ ： １９２〜２０１．１９８３）、３
−ホスホグリセレートギナーケ遺伝子（Ｉｔ ｉ ｔｚ
ｅｍａｎほか： Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｂａｍ、、
２５５ ： ２０７３．１９８０ ） Ｊ：たは他の解
糖ＰＩ＃木迫伝子（にａＷｉｌｓａｋ！ ＆ ｒｌ’ａ
ｅｎｋｅｌ ： ＢＢＲＣ，上立旦：１１０７・〜１１
１２．１９８２）たとえば、エノラーピ、グリセロール
アルデヒド−３−小スフエートデヒドロゲナーロ、ＩＸ
＼−ソＶプー口、ビルベー１〜デカルボ４−シラー口、
ホス１１＼フラク１〜１−ノ゛−ピ、グル：１−スー６
−ホスフ」−−１−イソメノーＵ、ホスホグルコースイ
ソメシーｔ！ま／＝ １．１グルー１）ノーピの遺伝子
を含む配！Ｊ１１がある。適当な発現プラスミドの構築
には、これらの遺伝子に関連覆るクーミネーシ］ン配＋
１１を、発現リベさ配列の３′末端の５１現ベクター内
に用いることもＣさ、Ｃれによりボリアデニレーシ１ン
ｄ３Ｊ、びｍ ＲＮ△のターミネーシー１ンがイ・１ｔ
−ｊ２きれる。 生台条ｆ１にＪ、って制御される転ち゛の利＋：Ｘをも
つ他のプロし一ターにｔよ、アルコールデヒド［１ゲ少
−ぜ２、イソシトク［１−へ〇、Ｍホスファターピ、窒
素代謝に関連１゛る分解Ｍ索、上述のグリトロアルデヒ
ド−３−ボスフエートデヒド（］ゲナーゼならびにマル
］・−スおよびガラクトース代謝に関与づ゛る酵木の遺
伝子のブ［１［−ター領域がある。Ｍ１ｕ重合壁遺伝了
座にＪ：つて調節されるプロ［−ター、たとえば遺伝子
ＢＡＲ１、ＭＥＣｌ、ＭＩＥＣ２、Ｓ Ｔ Ｆ ２．５
ＴＥ５のプロモーターを、温磨依存性ｓｉｒ突然変異を
用いて温度ＶＡ節ヤシステム挿入することができる（Ｒ
ｈｉｎｅ 、 Ｐｈ、 Ｄ、学位論文、オレゴン大学、
［ｕｇｃｎｅ、 Ｏｒｅｇｏｎ、 １９７９ ： ｌ
ｌｃｒｓｋｏｗｉｔｚ ＆ Ｏｓｈｉｍａ： Ｔｈｅ
ｍｏｌｅｃｕｌａｒＢｉＯＩＯＵｙｏｒ ｔｈｅ Ｙｅ
ａｓｔ ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｃｓ、第１部、１８１
−２０９頁、１９８１ 、Ｃｏ１ｄ ５ｐｒｉｎ。 １１ａｌ’１）Ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ） 。こ
れらの突然変異は、酵母の静止、接合型カセットの発現
に影賢し、１７ｓロ＆的に接合型依存プロモーターに影
響を与える。しかしながら、一般的には、酵母適合性ブ
〇七−ター、元の複製およびターミネーション配列を含
む（［意のプラスミドベクターが適している。 無傷の１１ Ｌ Ｚ ＣＤ ＮＡ配列の存在は、曲の
微生物たとえば酵母での発現のためのＩ１１／’ｍ仏子
の構築を可能にする。 したがって、本発明における＾ν母細胞での１−Ｉ Ｌ
Ｚの発現には、ΔＤ Ｉ−１１ブ［１七−ター−（Ｘ
因子リーダー−ＩＩ Ｌ Ｚ遺伝子−ΔＤｌｌ１１クー
ミネーターの各要素またはα因子プロモーターーα因子
リーダー−１１ＬＺｍ伝子−α囚了ターミネータ−の各
要素からなる分泌プラスミドを使用することが可能であ
る。ＡＤＩ１１プロモーター、ＡＤ＋−１１１ターミネ
ータ−およびα因子遺伝了のＤＮＡ配列は公知である（
Ｊｅｆｒｃｒｙ、 ｌ 、 ４．Ｕ ７）１ ： Ｊ
。 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、 ２５７：３０１８〜２Ｆ）
、１９Ｅ３２ ： Ｒｕ５ｓｅｌｌ、 ｏ、 ｈ、はか
： Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｂｃｍ、。２５８ ：
２６７４ 〜Ｂ２ 、１ ９ ８ ３ ： Ｎｕ
ｃｌ、 八ｃ １ｄｓｌｉｅｓ、、 １２ ： ／Ｉ
Ｏ４９〜６３．１９ Ｂ ３ ）。 この方法で調製されたｌ−Ｉ Ｌ Ｚ ３ｍｍ壬子選択
されたＭ母ブ［ｌモーターと機能的に接続できる。この
秤の発現中位はまた、各種の酵母ベクターに統合できる
。これらは酵Ｒ１の形！１転換が可能で、ヒトリゾデー
ムの合成が行われる。 △Ｄ ＋−１１７ＩＩ ’Ｅ−ターの優先的制御下での
ＩＩ １． Ｚの発現のために、ΔＤ Ｌｌ ［プロモ
ーターの３′末端の１１２流に完全α因子リーダーを８
右さＵたプラスミドを構築することができる。成熟ＬＩ
Ｌ Ｚ （ＨＬ Ｚ遺伝子）を＝１−ドするＤＮＡ配
列はα囚ｒリーダーの３′末端に、α因子に向かつ−Ｃ
ｉ［シいｈ向で接合させる。Ｉ−１１−Ｚ遺伝子の発現
に際し、正ｂ１１なＮ末端を生じるような横築が好まし
い。発現カレットの最終的構築には、１１１７遺伝了の
均一へ終結を達成しｍ ＲＮへの安定↑りに奇’ｊ′Ｊ
６ＡＩ）ｔｌｌｌターミネータ−配列を、それが１１１
−Ｚｉｕ伝子の停止コドンにすぐ隣接１ＪるＪ、うに導
入Ｊる。この種の発現プラスミドは、上述のすべ（の要
素が、ｉＥ シい配列でまた相！ｉ ＣｉｌＥ Ｌ／い
方＋ｒ＋１１’ｌで、へＤｌｌｌブ［１し一ター、α因
子リーダー、ｔｌ Ｌ Ｚ 還１７．；子Ｊｊ、［ＦＡ
Ｄｌｌ ｌ ｌ ’／−：ｚネー’／ −Ｕ）各要木問
が正（１（「に移り変わるように含イｊされる。 α因子リーダーとそれに続＜ＩＩＬ／Ｊｆ仏子間の接続
は、α因子の成熟に役立つブＯデアーピ’Ｊ） Ｉｇｉ
ｉ’ｔｌｓ位が成熟ＨＬ Ｚの最初のアミノ酸の配列の
正確に前流、ＬＹＳ ＡＲＧの後に位置し、宿主細胞
によって生成されるｌ−Ｉ Ｌ Ｚ蛋白質の正しいＮ末
端が１！？られるにうに行われるのが右利である。 この種の発現カセットは、各種Ｍ母発現プラスミド中に
結合させることもできる。多コビーノラスミドＹ Ｅ
Ｄ １３ （Ｂｒｏａｃｈ、 Ｊ、 Ｉｌ、はか： ａ
ｅｎｃ。 旦＝１２１へ・１３３．１９７ ’Ｊ ） 、Ｉ） Ｊ
Ｉ） ＋３２０７ （ＤＳＭ３１８１．１９８１１’
＋２月２８ ＩＩ ’＋；７託） 、Ｙ Ｉ Ｏ５（５
ｔｒｕｂｌ、に、【ヨか： Ｐｒｏｃ、 Ｎａ口。 八ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＩＩｓ＾、 ７６
： １ ０ ３５− １ ０３９ 、１９７９）お
よびｐＥΔＳ １０２はこのためにとくに好ましい。ベ
クターｐ１ヨＡＳ１０２は、ＹＩｐ５をＰｓｔｌで部分
消化し、Ｙ Ｉ Ｉ） ５を１’３ ａ ｍ ｌ−１１
て・完全に消化し、単離された４、３ｋｌ＋フラグメン
Ｉ−（ＵＲ△３遺伝了を含む）をｐ Ｊ Ｄ ｒ３２０
７の４ 、 ／Ｉ ｋｂ １３ ｊｔｒｒＮＩ Ｉ
／−ＰｓＬｌフシグメントと結合さＵることにＪ、す１
！１られる。この種類の発現力セラ１〜をもつこれらの
酵母ベクターににす、両接合へ°！のＰ？ｔＰＪ細１泡
が公知方法で形質転換′Ｃさる。このような形質転換体
で産生され、１２３養メジウム中に放出される＋１１−
Ｚ ｉよ、蛋白ｘｌ粕装に関し公知の方法で容易に単
離される。 １−．１１７遺伝子の発現はα因子プロモーターの制御
ｌ＋ １”に行うこともできる。このためには、成熟＋
１ＬＺを：ｌ−ド・ＪｏるＤＮΔ配列を正しい方向性で
α因子プロを一ターとα因子リーダーの聞に結合さける
。完全へ発現カセットの構築には、α因子−ｔ ｏ ｘ
−ター、（Ｚ 因子ＩＪ −ター、ｌ−Ｉ Ｌ Ｚ
ｍ伝了ａ３、」：びα因子ターミネーターを順次配列さ
せる。この場合ら、α因ｒ−リーダーの３′末端とｌ−
Ｉ Ｌ Ｚ遺伝了の５′末端の間の遷移には、ΔＤＨ［
ブロモ−クーのｉｌ＋ｌ ｆａｌｌ下にお４Ｊる発現カ
セットの作成に際し）ボべたと同じ移り変わりが確立さ
れる。この種類の発現カレットは上述の酵母発現プラス
ミドに導入し、ＩＩＷ Ｉｎ細胞の公知方法による形質
転換に使用でさる１゜ この場合の好ましい宿主は接合型αのＭ Ｉｎ株である
。このような形質転換体の１１養Ｊ３よびそれに、Ｊ、
つて放出されるｌ−Ｉ Ｌ Ｚのｉｌｌま公知方法によ
って行われる。 これらの構築により多くの利息が生じる。 ｆｉｌ ｍ ｌＩ Ｎへの均一な終結、したがってｍ
ＲＮ△の安定性の増大 ＋２１ １８孜メジウムト澄液／）ｓ ｒらの１１しＺ
の容易な単離 （３） 酵母細胞内よりも分泌蛋白質中ではジスルフ
ィド橋が８μに形成されるので、正しい三次構造をもつ
ＨＬ Ｚの高比率 （４） 分泌時にお【ノる、成熟１１ＬＺｈらのシグ
ナルペプチドまたはリーダーペプチドのｌンドブ［１デ
オリテイツクな正確な分離。 この方法で、正確に決定された蛋白質Ｎ末端が得られる
。成熟ＨＬ Ｚ ／Ｆｉ白質はＮ末端にリジンを右する
。プラスミド構築は、プＯテアーピ切断部位が分泌プラ
スミド中のりジンコドンの萌に位置するにうに選択でき
る。したがって、分泌１１［Ｚの最初のアミノ酸はリジ
ンである。細胞内産生に＋３いて１よ、翻訳が開始され
るために成熟リゾブ−ムの最初のアミノ酸の前に開始Δ
゛「Ｇ（メチオニン）を位ｆＦ？さＵなｔプればならな
い。このメ１Ａ二ンが細胞機構によって除去されないと
きわめて喰われや１い（粘性、安定性、抗原性）。 微り物のほかに、培養多細胞生物も１−１１，７の発１
１、！に適当な宿主である。Ｌ１１！論的には、を椎仙
物６３Ｊ、びＪ１ｎ柑動物の培養細胞のいずれもが使用
できる。しかしながら、最近では、培養液中での１゜初
物細胞の複製〈組織培養）はルーチンの操作となってい
るので、とくに脊椎動物細胞に興味がしｌコ れる （
Ｔｉ５ｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ、 八ｃａｄｃｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ。 にｕｒｓｃ ａｎｄ ＰａＬｔｃｒｓｏｎ １．ｄ、、
１９７３ ） 、この種類のイ１用な宿二ｉ ｆｉｌ
ｌ胞系にはＶ Ｅ ＩＩ Ｏ−に Ｊ、び１１０１ｉｌ
−細胞、チＶイニーズ・ハムスター卵胞（ＣＩＩ Ｏ）
−細胞４工らびにＷ２Ｂ５．１３１１Ｋ。 ＣＯＳ −７Ｊ’ｊ 、Ｊ、びＭ Ｄ ＣＫ−細胞系が
包含される。 これらの細胞に用いられる発現ベクターを上通常、複ツ
Ｊ部位（必尺に応じて）、発現リベぎ逍伝イの」１流に
ＩＩＩ′？ｉするプロモーターならびにリポソーム結合
部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアゾニレ−ジョ
ン部位、転写終結配列を金石する。 １ｌｌｉ乳動物細胞中に使用するに際しては、発現ベク
ターの制御様能はウィルス材料から選ばれることが多い
。たとえば、通常用いられるプロし一ターはＰｏｌｙｏ
ｍａ、 ＾ｄ（！ｎ０Ｖｉｒｌｌｓ ２に出来するも
のであり、とくに５１ｍ１ａｎ ｖｉｒｕｓ ４０ （
Ｓ Ｖ ／Ｉ Ｏ）に出来するものが頻繁に用いられる
。ＳＶ４０の開始および終結プロ［−ターはとくに有用
である。 いずれしウィルスから７ラグメントとじて容易に１！１
られ、またＳＶ４０のウィルス複製部（Ωを含むからで
ある（ｒｉｅｒｓ＋まか： Ｎａｔｕｒｅ、 ２７３
： １１３．１９７８）。また、それがウィルス複製
部１１／の１１ｉｎｄｌｎ切断部４ｉ／から１３（Ｊｊ
！ｌ切断部ｉイＩに及ぶ約２ＥｉＯｂｌ）’７）ｌざの
配列を含むことを条ｆ１に、Ｓ Ｖ ４０の大または小
フラグメントも使用でさる。 ざらに、通常、所望の；頁１ム了配’ｙ１１に結合して
いるプロし一ターまたは］ン１〜し１−ル配ｌｌＩが、
これらの制御配列が宿主１ｕ胞系に適合性を示１限り、
使用でき、またそれが１！ましいことが多い。 複製ＲＩＳ位は、たとえばＳＶ４０もしくは他のウィル
ス源（／、−とえばＰｏｌｙｏｍａ、八ｄｃｎｏ、 Ｖ
ＳＶ、ＰＢＶ ’ｌ ）から眉仏子外部位に導入するた
め、相当りるベクター構築にＪ：るか、またｔよ、宿主
細胞の染邑体複装（１崩にＪ：つて！）えられる。ベク
ターを宿主細胞の染色体中に沖入りる場合には、通常、
復古の方法が適当である。 ビークルにＪ、る細胞の形質転換は、多くの方法によっ
て実施できる。たとえば、カルシウムを用いて行うこと
ができる。この場合、細胞をマグネシラ１１中で洗浄し
、カルシウム中に懸濁した細胞にＩ）ＮΔを添加するか
、あるいはＩＩｌ胞をＤＮＡとリン酸カルシウムの共沈
１股物に隅露する。以復の遺伝子発現には、細胞を形質
転換細胞を選択するメジウムに移１Ｊ０木発明のポリペ
プチドは５Ｔ細に述べた成熟ヒトリゾチーム（ＨＬＺ）
に限定されるものではなく、このポリペプチドの任意の
ｒｉ篩も包含する。これらの修飾にはたとえば、活性に
実質的む影響を与えない、Ｎ末ＱｂしくはＣ末端にＪハ
ノる分子のり、０縮およびアミノ酸の他の基による置換
がある。 本発明は上述の１〜ＩＬＺを１４異的に］−ドする遺伝
子配列のみでなく、突然変５゛シ、分解、遷移またはイ
・１加によって容易かつルーチンに（ｉｌられるその修
飾体をＣ）包含する。上述の）−Ｉ Ｌ Ｚ （すイ１
わ１３、相当する既知の生物学的活性スペクＩ−ルをイ
ｉ １Ｊる）をコードする任意の配＋ＩＩ Ｊｊ Ｊ、
びそれに匹敵りる活性をもつ分解物である任意の配９１
が包含される。１本技術分野の熟練名にはコード領域の
分＋ＩＲＤ Ｎへ配列を決定することは容易である。同
様に、ト１１−Ｚのｒ＋’ｒ性スベクＩ・ルを有し、上
述の配列（またはその部分）と緊縮条ｆ１下に（たとえ
ば、８５％以上、好ましくは９０％以上のホモロジーを
選択する条ｆ［下に）ハイブリダイズした（ｆ息の配）
ＩＩも包含する。 本発明の物質は、公知方法で処方して、医薬として使用
できる組成物を装造することができる。 本発明のポリペプチドはそれ１１１独で使用できるが、
まＩこ、他の成分たとえば各種の抗生物質（デ１−ラサ
イクリン、バシトラシン）、酵素（α−アミラーピ、パ
パイン）またはビタミンと配合して投与りることもでさ
°る。 次に本発明を、以下の実施例によってさらに詳細に説明
するが、これは本発明を例示するものであって、いかな
る意味でも本発明を限定するものではない。 実施例中に使用した暗号は次のとおりである。 ＋１１Ｚ：ヒトリゾチーム ＲＰ Ｍ ｌ ： Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａ
ｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ１
ｒ ｉ ５−Ｉｆ（１！ ： １−リス＝（ヒドロキ
シメチル）−アミノメタン、ｐＨをｌ−Ｉ ＣＩで調整
ｌ Ｉ）ＴΔ： Ｔｆ・レンジアミン四酢酸１） Ｆ
ｌ） ：ジエブールピ［１カルボネー１〜ＳＤＳ ニド
デシル１ｉｆｔ酸±トリウｌ＼Ｎ ａ△０：ｍ酸す１−
リウム ＢＳ△：ウシ血清アルブミン １’）Ｔ’ｌ−：１．／ｌ−ジブＡスレイ１ヘール（１
，４−ジメルカプト−２，３−ブタノール）１）８Ｉ：
フ土ノール：り日ロボルム：イソアミルアル＝１−ル（
１５：２／Ｉ：１） β−ＮＡＤ ：β−ニコチン酸アミドアデニンジヌクレ
オチド ５ｓｃＤＮＡニー木鎖ＤＮＡ ［、ｃｏｌｉ：人賜菌 ｓｓｃ：ｏ、１５ＨＮａＣ１）、０．１５Ｍクエン酸ナ
トリウムの溶液、１ＯＮＮａＯＨでｐｌ＋７に調整 デンハルト溶液＝０．１％Ｆ ｉ ＣＯ１１，０，１％
ポリビニルビ［１リドン、０．１％ＢＳへの溶液 Ｔ １３ １三 ： ０． ０８ ２８ １− ｒ
ｉ ｓ、 ０． ０８ ２０ホウ酸、０．００
２Ｈしｔ）＋への溶液、ｐＨＥ３例１：細胞系ｊＪ −
９３７中の１１１７活（１１の−しに１〜ｊΔ血細胞系
ＬＪ −９３７がヒトリゾブーｌ＼を産生Ｊることは報
告されている（１６）。Ｕ −９：３７ａｌｌ Ｉｌｄ
系をＩＩＬＺ ｃｌ）ＮＡ含成川用００１ ’）’Ａ
ｌＲＮＡ源としＣ使用Ｊるために、Ｕ 、−９コ３７細
胞にＪ、リメジウム中に放出されるＨ Ｌ Ｚ ｆ／）
活性を定早しＩこ。１０％胎仔ウシつ？＋’ｉ、ペニシ
リン（１００中位／ ｍＱ ） に Ｊ、びスｌ−レブ
トマイシン（５）０単位／ｄ）を合む１゛≧ＰＭ［１６
／ｌｏメジウムに、ＩＪ −９３７細胞系培養液を新た
に接種し、３７℃で３０間、密度が３Ｘ１０５細胞／Ｉ
ｄになるまで！、１育ざＵた。ついで遠心分離１して細
胞を除去し、メジウ１１中に放出されたＨ Ｌ Ｚの活
性をＧＯＩ（ＩとＳｃｌ＋ｗａｉｇｃｒ （１７）によ
って報告された方法にＪ、って定量した。放射活性基質
と２時間インギュベー１〜したのら、２ｄのインキュベ
ーション混合物から１００ ｔｔ １のサンプルを取り
、放出されＩこ族ｎ＝１能の吊を測定した。陰性コン１
〜［１−ルどしてはＲｌ） Ｍ ｌメジウムのみを用い
た。（ノー９３７１１１胞にＪ、って分泌されたｌ−Ｉ
Ｌ Ｚのｍは、作成した標ｒ（Ｌ−曲線［ヒト乳汁か
らのヒトリゾチーム（Ｓｉｇｍａ ）のＲｌ）Ｍ Ｉメ
ジウム中粘付］から工１専した。 結末は第１表に示す。 第１人に承りように、ＬＪ−９３７１１＋１Ｊ２４ｔユ
Ｐ ＲＭ ｌメジウムにメジウム１ｄあたり約１．５μ
Ｕの＋１ Ｌ Ｚを放出する。（Ｊ−９３７１［１胞系
はＨｌ−Ｚ ｍ ＲＮ Ａの有用な原料であると結論
されＩこ 。 例２：と１〜リゾデ一ムｍＲＮＡ含有ＲＮΔの１造 ｉ＋）全ｌ？ ＮΔの中麺 ヒ１−組織球リンパ腫細胞系Ｕ −９３７を１０％胎仔
ウシ血清、ペニシリン（１００単位／ｄ）おＪ、びス１
−レブトンイシン（５０単位／−）を含む「≧１）〜１
１メジウム１６４０中、３７℃で生白さＵた（Ｈｉｄ＠
培養液１．６１からの細胞を遠心カー１にＪ、って集め
、水冷した１０ｎＨＴｒｉｓ−１１Ｃｊ！１１１１７、
４／ １４０１ｎＨＮ ａ Ｇ１／ １ 、５ｍＨＭＯ
Ｃｊ！２５０ｍ１！ｒ１回洗１ＩＮｔ、、水冷した１０
＋１１１４１−ｒｉｓ−１ｉｃ１１１１１Ｆ３．４／１
／ｌ０ＩｎＨＮ ＦＩＣｆｌ／ １ 、 ５ｎｒＨＭ’
］ ＣＪ！２１０ｒｄ、に懸濁しｌこ。非イＡンＷ面粘
付剤、Ｎｏｎ１ｄｃｔ Ｐ ４０をＮ Ｓｔ’濃度０．
５％になるＪ、うに加えた。懸濁液を氷上に５分間保持
し、ついで１０秒間激しく混合して細胞膜を分解さけた
。次１．：４℃で遠心分離して核を除去した。上澄液１
０ｄに以下の溶液：２％ＳＤＳ ０．５ｄ、２８ Ｔ
ｒ ｉ ５−ＨＣｊ！（ａｌ１９．０）０．２５ｄ、５
００＠ＩＨＥＤＴ八（ＤＩＩ７．５）Ｏ，ｌ＃ｆを加え
た。等容の新たに蒸留し、１０ｍｔ４ −１’ｒ ｉ
５−８０ｊ！ Ｉ）ｌＩＥ３／１ｍＨＥｌ）ＴＡと１
１衡化したフェノールを加え、このリンプルを１０分聞
激しり′＆揺し、ついで遠心分離して相を分離した３、
水相をＦ述したようにして２１（す抽出し、１！復に等
容の’ｐ ｕ ｏホルｌ＼で抽出した。 ３Ｈの酢酸カリウム（水相の容Ｍの１／１０） 、つい
で２．５５容のＪタノールを加えた。この溶液を一良−
２０℃に保ち、ＲＮ△の沈殿を遠心分離により集め、７
０ ％ ｒ−タノール３ ａｔ！ −Ｃ−１回洗浄し、
真空中で乾燥した。Ｉ Ｎ八を水３ ｕにに溶解し、沈
殿さＵ１捕果し、乾燥し、土とＩ＋１１様に出溶解した
。 約８■のＲＮＡが得られた。 ｐｏｌｙ Δ４＋＜ＮΔは全１＜ Ｎ ＡからＡリゴ
（ｄ ’ｒ ）−１Ｚル［Ｉ−ス（Ｐ −１−１１ｉｏ
ｃｔ＋ａ＋ｎ１ｃａｌｓ。 Ｉｎｃ、）上に単離した。、オリゴ（ｄ ’ｒ ）−セ
ル［１−ス０．５！Ｊを滅菌水に懸濁し、−皮１４°Ｃ
に敢ｊＺした。：Ｗ日、ｌ） ［１つ処１１滅菌水で洗
ｒｐシたカラム（Ｂｉｏｒａｄ ｐｌａｓｔｉｃ、 １
８ｃｍ、０ １ 、５ｃｍ）にオリゴ（０丁）−セルロ
ース０．５ＬＪを充填し、ついでプロアナ−Ｌ’Ｋ（Ｘ
Ｉ型、ｓｉｇｍａ ）溶液３−で洗浄し、１５分間室温
に放置した。プロテナービＫを０．１×充填緩衝液（１
×充填緩衝液：５０ｍＨＴｒｉｓ −トＩＣｊ！
ｐＨ７，４、１ＨＮａＣｊ！ 、１＋ｎＨ［Ｅ
ＤＴΔ、０．２％５ＤＳ）に最終濶磨１ｍ９ ／ ｄに
なるＪ、うに溶解した。カラムをついで滅菌０．ＩＨＮ
ａＯｔｌ、次に滅菌水で溶出液のｐｌ＋が８になるまで
洗浄し、最少に１×充填緩衝液１０ＩＩｆで洗浄した。 滅菌水５００μｌに再懸濁した全１’＜ Ｎ八を４．５
威の充填緩衝液ぐ希釈し、６５℃（水浴）に５分間加熱
し、調製オリゴ（（Ｉ Ｔ ） −レルロース力ラムに
充填した。溶出液を集め、６５℃に５分間再加熱し、カ
ラムに再充填した。カラ１１を７ｄの充填緩衝液で洗浄
して、ｐｏ＊ｙＡ ＲＮＡを洗い出した。各１−の分
画を集め、各分画の００ を測定した。ｐｏｚｙ
Ａ”ＲＮＡは５ｍｌの滅菌水で溶出した。ＤＯｊ！Ｖ
ＡＲＮＡおよびＰｏ１ｙ Ａ＋ＲＮ△はいずれも
、０．３）Ｉ ＮａＡｃからエタノールで、−２０’Ｃ
に一夜おいて沈殿させた。 １−（Ｌ Ｚと相同な混合配列のオリゴヌクレオチドの
２個のプールを固相リン酸１−リエスデル法（２０）で
合成した。ヒトリゾチーム蛋白ｉ （２１，２２，２３
）のＮＨ２末端からアミノ！ｌワ残基６３〜６Ｂ（Ｔｙ
ｒＴｒｐ Ｃｙｓ Ａｓｎ ＡＳｐ Ｇｊ！ｙ）
の配列を１７−マーオリゴヌクレオチド混合プローブＥ
ｉ−ＯＮ１９の（１１１築に選択した。Ｅ ｉ −ＯＮ
１９プローブは次のような１６個の混合オリゴヌクレ
オチドからなる。 ｓ’ （弓寸Ｔ：ＣＡ ＣＣＡ含ＴＡ３’ヒトリゾチー
ム蛋白質（２１，２２，２３１のＮ Ｉ−１２末端から
アミノ酸残塁２６〜３１ （Ａｊ２ａ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｍｅｔ
Ｃ’ｉ／５ｌｅｕ）の配列を１７−マーオリゴヌクレ
オチド混合プローブＥｉＯＮ２０の構築に選択した。 Ｅｉ−ＯＮ２０プローブは次に示すような３２個の混合
オリゴヌクレオチドからなる。 ５’ Ａ含ΩＣＡ ＣＡＴ ＣＣＡΩＴＴ 、！ＧＣ３
’ｂ）ブライマー延長解析 Ｕ −９３７ＩＩ胞系から単口されたｍＲＮＡについて
ＨＬ Ｚ ｍ ＲＮ Ａの存在を、ブライマー延長法
で解析した。Ｅｉ−ＯＮ１９またはＥ ｉ −０Ｎ２０
．１００ ＩＩ ９を、７０ｍ１４ Ｔｒ ｉ ５−
１−１ｃｉｐｌ＋７．６．１＋ｎＨｔｖ１ｇｃｊ！
、３０．ｃｚｃ ｉの（γ−”２Ｐ） ＡＴＰ （５，
０ＯＯＣｉ ／ｍｍｏｌ、Ａｍｃｒｓｈａｍ ＰＢ、２
１８ ） 、１００１１９／ｍａｌ ＢＳＡ。 １００ｎ＋ｔｌ ＤＴＴ、１ｍＭスペルミジンおよび
２〜４単位のポリヌクレオヂドキナーぜ（ＮｅｗＥｌｌ
（ｌｌａｌｌｄ ＢｉｏＬａｂｓ ）を含有する反応混
合物２０μｌ中、３７℃で６０分間、５′末端を標識し
た。 反応は、混合物を７０℃に１５分間加熱して停止させた
。 ブライマー延長反応は、５０ｍ１４ １−ｒｉｓ −ト
ＩＣｊ！ ｐＨ８，３、１０ｍＨＭ＜＞Ｃ’ｆｔ
２ 、 １ ０ｍＨＤＴＴ１４ｍＨピロリン酸す１
−リウム、１．２５ｍＨｄＧＴＰ、１．２５ｍＨｄＡＴ
Ｐ、１．２５ｍｔ４ｄＣＴＰ、１．２５ｍＨｄＴＴＰ、
ｕ−９３７１１１胞系から単離されたｍＲＮＡ１５０
ｎｏｂ’ｉ ＱＪ Ｉ票識した Ｅｉ−ＯＮ１９ ま
た は Ｅ １−ＯＮ２０ 、４０ｎｑＪ３よび
逆転写酵素（１３Ｉｔ ｆ−） ２００中位を含む反応
容量４０ Ｉｌ、ｔ２中、／１２°Ｃｒ Ｇ Ｏ分聞実
Ｍ’ｑ Ｊ ６ 、、反応は５０ｍＨＦｌ）ｌ’△５０
μｍを加えて停止１させ、ついで「）ＣＩで抽出し、１
クノールにＪ、り沈殿さける。ブライマー延長の／ｌ成
物は遠心分店ににつてベレツ１−化し、乾燥し、９０％
の１１１２イＡン化ホルムアミド、１０％の１０Ｘ Ｉ
ｍｌ、 ０． ”１％−１ニシレンシアノール１「
おＪ、び０ 、１ ′、Ｙ＋ブ１−ＩＬフ１ノールブル
ーからなる染色ホルムアミド溶液に溶解する。 各リンプルから１０μ！ ’ｊ−５％アクリルアミド／
８８尿拳グルにＣ１（ｊｉ Ｌ／、２ ｌｌ’ｌ ｌ：
’Ｊ １ ｂワラ１−で°市気ｉＡ４すＪを行う。ゲル
を乾燥し、Ｋｏｄａｋ Ｘ−０ｍ、Ｉｔ＋ｃｃａｓｓｃ
ｔｔｃ Ｃ−２１＋Ｋｏｄａｋ Ｘ−Ｏｍａｔ ＲＰ
Ｘ線フィルムに暴露する。この実験の結果は第１図に示
す。 両ブライーンー、Ｅ ｉ −ＯＮ １９Ｊ３Ｊ：びＥｉ
ＯＮ−２０はＩＩＬＺ ｒｒ＋ＲＮＡに相補的なので
、Ｉｆ １．７ ｍＲＮΔ鋳型上、逆転′８酵索によ
るこれらのブラーマーの延長特責的生成物の検出が期待
でさる（２４１．、ＩＩＬＺ ｍＲＮΔの長さは未知
Ｔｅアったので、合成１） Ｎ Ａの良さは予測できな
かった。 しかしｈがら、以下の事柄、プライマーＬＥｉ−ＯＮ
１９ Ｌ；口Ｉ Ｌ ７ ｍ ＩＩ Ｎ Ａとアミノ
酸残！＋４６３〜６８を］−ドする領域内で結合するこ
と、換言ずれぽ合成されたｌ） Ｎ Ａの長さは少なく
とも２０３ｂＨＸ （Ｘはリーダー配＋１１および５′
非昭９領域に属するスクレＡチドの数である）と考えら
れることが明らかにｂつだ。同じ計ｑをブライマー、ｃ
ｒ −０Ｎ２０について行うと値は９２ｂｐ−＋−Ｘ
となる。したがって２１１！！１のバンドを良さに１１
１ ｂｐの差があることになる。第１図に示す結果から
、ブライマーＥｉ−ＯＮ１９で合成された最も強力なバ
ンドは約２９０ｂｐ、プライマー［１−ＯＮ２０から合
成された最も強力むバンド１．１約１７５ｂｐである。 その差１１５ｔｌｐは予測１的にきわめて近似し、（ノ
ー９３７細ｊ泡系からｔｔｔ ！ｌ！Ｉｔされたｍ Ｒ
Ｎへの分析用プレパレーシニ」ンＬ；Ｌ ｌ−Ｉ Ｌ
Ｚ汀１１≧ＮΔを含イｊすると結論された。 第−鎖ｃＤＮＡの合成は、５０ ｍＨｌ−ｒ ｉ ｓ
−ＩＣ１ｐＨ８，３，１０ｍＨＭｏＣｊ！ 、１０ｍ
ＨＤＴＴ、４ＩＩＩＨビロリンＦｋｌｌ−リウム、１．
２５ｍＨｄＧＴＰ、１ 、２５ ｍｕ ｄ Ａ −Ｉ
’ Ｐ、１ 、 ２５１！１Ｈｄ Ｔ Ｔ Ｐ、０．５
ｍＨｄｃｌＰ、（α−３２１） ＞ｄＣＴＰ （３，０
００（〕ｉ ／ｍｍｏｌ、Ａｍｃｒｓｈａｍ。 ＰＢ、１０２０５） ２０ ＩＩ Ｃｉ 、 Ａリボｄ
（１’ ） １８ （Ｎｅｗ［ｎｇｌａｎｄ ８ｉｏ
Ｌａｂｓ ） １００１１”、ｉ／ｌｅ１． ＬＪ−９
３７Ｉ［Ｉ胞系から単離されたｐｏｌｙ Δ°［＜Ｎ
Δ４０〜１００μｇ／ｗｌおにび逆転’ｒ’ Ｍ ｄ＝
（Ｅ３ ＲＬ ） ２５Ｏｔｔｔ位を含有する反応容
量５０μ矛で実施する。 反応は４２℃で６０分間行う。５Ｑａ＋ＨＥＤＴ△５０
μｌを加えて反応を停止さけ、反応の９成物をＰｃｔで
抽出する。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを２８ＭＭアン
モニウムからエタノールににす、−２０”Ｃで一夜放置
して沈殿ざＵる。合成された第−鎖のｈｌは１ＣΔ不溶
性放ＱＪ ｍを定石して測定りる。１回の反応で、通常
、単一鎖ｃＤＮΔ２００・〜３００ｎｇが１ｕられる。 第二鎖の合成には、甲−鎖ｃＤＮΔを遠心分離してベレ
ット化し、８０％］クノールで洗浄し、乾燥し、適当量
の蒸留水に溶解した。５ｓｃＤＮＡを二重鎖ｃ ｌ）
Ｎ△（ｄ ｓ ＣＬ） Ｎ Ａ ） ニｌａ＄ ’Ｊる
には、５００ ＋＋ｇまでのＳ Ｓ ＣＩ） Ｎ Ａを
２０ｍＨ”ｒ’ ｒ ｉ ５−ＨＯｊ！＋＋Ｉ１７．５
．５ｍＨＭＱＣＪ！ 、１０１Ｈ（Ｎｌｌ ）
Ｓｏ 、１０ｎ＋ＨＫＣｊ！、０．１５ｉＨβ−ＮＡ
Ｄ、５０μｆｆ／ｍ１の１３ ＳΔ、ｄ Ｎ Ｔ Ｐ
ｓ ４０ ｔｔ Ｍ 、 １日、ｃｏｌｉ ｌｌＮａ
５ｃＩＩ （ＢＲＬ ”） Ｂｔｎ位／ ｍＱ 、 Ｌ
） ＮΔボリメラーＬ”１（Ｎｅｗ ［ｎｑｌａｎｄ
ＢｉｏＬａｂｓ）２ ３ ０ ＋１ｉ位／ｄ。 （：、ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーｔ （ｆｌｅｗ Ｉｎ
ｔｊｌａｎｄＢｉｏＬ、ａｂｓ ） １０甲位／Ｍ１を
含ｆＴする反応容量１００μｌ中で処理することができ
る２１反応混合物をついで、１２℃で６０分間、２２℃
で６０分聞インキュベー１・する。反応はＥＤＴΔを最
終濃度２ＱｍＨになるようにｆ’Ｐ ＋ｌ： Ｔる。ｄ
ｓ ｃ Ｄ Ｎ Ａ ＧマＰｃｔで抽出し、上述のよ
うにして沈殿さ゛する（１５）。 Ｌ＋）ｄ ｓ ｃ Ｄ ＮΔのり１］−ニング低形質転
換バックグラウンドをイｊするり［Ｉ−ユングベクター
は次のようにし−Ｃ装ｊΔする。１ＤｔＪＣ９プラスミ
ドＤ ＮＡ３００ μＪをｐｓｔｌ制限エンドヌクレア
ーピで完全に明所する。消化されたプラスミドｌ） Ｎ
八をアガロースゲル電気泳動ににって精製し、電気溶出
し、エタノールで沈殿さＵる。アガ■−スーゲル粕装ベ
クター；よ形ｔ′１転換実験中に１・〜２」Ｌに一／ｎ
（Ｊ生成し、スーパーコイルｐＵｃ９での形質転換効率
はプラスミドＤＮＡ１ｎａあたり約２．０００〜４．（
’）００：１１に一であった。 かくして１１１られたＣ） ｊＪ Ｃ９プラスミドＩ）
Ｎ八をついで、１００ｍＮカー１ジル酸ノ」リウムｐ
Ｈ７，５、２ｍｌ Ｇｏ（１！２．０．２ｍＨＤＴＴ
、０．９ｍＨｄＣＴＰ、（５−３Ｈ） ｄＣＴＰ （１
９０ｉ ／ｍｍｏｌ、＾ｍｃｒｓｂａｍ、 ＴＲＫ、
３５２）ｓμｃ ｉ 。 ８ＳΔ５ ｍｇ／ ｍｌ、ＰＳｔ［切断ｐＵＣ９プラス
ミドＤＮＡ２８μＥＦ Ｊｊよび末端トランスフエラー
ピ（Ｉ）ｌ−Ｂｉｏｃｈｃｍｉｃａｌｓ） ４５甲位を
含む反応容重５０μｌ中でディリングを行った。反応混
合物を２２℃で５分間イン−１ユベートし、２５ＩＩＩ
ＨＥ ｌ） ＴΔ５０μｌを添加して反応を停止させ、
ついて・７０℃で１５分間インキュベートした。これら
の条１′１下に、最大の形質転換効率に必要な長さの２
２ヌクレＡチドを各３′末端に伺加する。 ｄ ｓ に ＯＮへのｄ Ｇ Ｐ Ｔによるティリング
は、約１１００ｎのｄ Ｓ ＣＤ Ｎ Ａを各反応あた
り、末端トランスフエラーピ３０単位により、３７℃で
３０分間処理したほかは類似の条イ′１下に実施した。 ２５１ＨＩＥＤＴ△５０μｌを添加して反応を停止さけ
、７０℃で１５分間加熱して不活性化した。 ｄ Ｃ−ｒ ＰでティリングしたｐＵＣ９ベクターＤＮ
ＡににるｄＧＴＰティリングｄｓｃＤＮΔの分析用アニ
ーリングは、１０ｍＨ王ｒ ｉ ｓ −１１Ｃｊ！
Ｆ１１Ｉ７．５、ｉ＋ｎＨ［ＥＤＴ△、１５０ｍ１４Ｎ
；Ｉ ＣＩを含有する溶液５０μβ中、５ Ｅ’ｐ℃
で・１２０分間行った。ｄ ｓ ｃ Ｄ Ｎ Ａどベク
ター１）ＮＡの比を変えて、添加ｄ ｓ ｃ Ｄ Ｎ
Ａ ｆＩｉ泣市呈あたりの１１ノられるクローンの最大
数を求めた。 ＣａＣｆ２．Ｊンビデンｔ−Ｅ、ｃｏｌｉ ＩＩＲＩ
ｌｌ胞（１９）の形質転換は、これらの細胞１００μ夕
をアニーリング反応混合物５０μｌと混合し、ついでア
ンピシリン５０μ’Ｊ／ｄ含イｉ ｔ、 ｎプレー１−
りで平板培養した。１４人数の形°ｌ′４転換体を′ｊ
えた；’ａ１合を用いて大規模実験を（ｊい、最終的な
ＣＤＮ△ライブラリーを確立した。ｄ ｓ ｃ Ｄ Ｎ
Ａ Ｅ） Ｏｎりを用いて約２０．０００個の独へ″
ｌしたクローンが１１：成した。 ｃＤＮＡライブラリーを、全ｌ−Ｉ Ｌ ／ ｎ仏子ま
たはフラグメントを含む陽性形質転１％体に″ついてス
クリーニングした。ＣＤＮ△ライブラーは最初コ［に−
ハイプリダイゼーシ］ンによりスクリーニングした。陽
性と思われた形質転換体はざらに、ドツトブロワ１−解
析によってスクリーニングした。 形質転換体はＬ Ｂ ＋アンピシリン（５０Ｈｇ／Ｉｄ
）プレー１−上、３７℃で一夜生育させた。ついで、コ
ロニーをニトロヒルロースろ紙（０，４５μｍ ％５ｃ
ｈｌｃｉｃｈｅｒ ＆ ５ｃｂｕｅｌｌ）上に移した。 プレー］−およびろ紙の両とを、陽性形質転換体の同定
が可能な方法で標識した。プレート上に注意深く冒いた
ろ紙を′ｆｉ！温（ＲＴ ）に２０分間放置し、とり−
Ｌげ、０．５８ Ｎａ０Ｉｌ／１．５８ ＮａＣｊ！飽
和３８Ｍろ紙（３８８Ｃｈｒ ＷｈａＬｍａｎ ）上に
置いた（ １ｉＪ 、１： 層コロニー）。１５分間イ
ンＶユベートしたのら、ろ紙を乾燥３８Ｍろ紙に移して
過剰のＮ ａ ＯＩ＋を除ムし、あらかじめＩＨＴｒｉ
ｓ−ＬＩＣＪ！ ｐＨ７／１．５８ ＮａＣｊ！で湿
潤さまた３８Ｈろ紙上に３弁開放置した。次にろ紙を３
×ＳＳＣ中に２０秒間浸し、風乾し、８０ ’Ｃｒ ２
＋１．’ｉ間乾燥した。かくして得られたろ紙を３Ｘ
ＳＳＣ１０，１％ＳＤＳ （Ｓｅｒｖａ ） 、１０ｍ
１４ Ｅｌ）−ｌ−△含有ｖａ衝液中穏やかに攪拌し
ながら６１５℃に一定ｉ９いて湿潤させた。緩衝液は数
回とりかえた。ろ紙上に肉眼で細菌コロニーの痕跡が検
知でさなりｌｆつだとき、前湿潤は完全と考えられた。 洗浄自ｊ！２に、ろ紙を６ＸＳＳＣ，１Ｘダンハルｌ−
溶液、０．５％Ｓ Ｄ Ｓ 、変性ウシ胸腺Ｄ ＮＡ（
Ｓｉｇｍａ ）１００μｇ／ＩｎＩ！、、０ 、０５％
ビ［」リン酸すトリウム含有溶液中でプレハイブリダイ
ズした。３７゛Ｃで３時間インｌユベートしたのｔ）、
ろ紙を（３Ｘ５ＳＣ１１×ダンハル１〜溶液、酵ＩＩＩ
ｔ ＲＮ Ａ（ＸＸ型、Ｓｉｇｍａ ） ２０１１ｇ
／ｍ（１，０、５′、′＜、ビ１１リン酸す１〜リウム
、カイネース四（埋１７−マーＥ ｉ −ＯＮ １９ヲ
２（ｒ’Ｊ ロｉ’ＦＮ＆中、（Ｔ ”２１））へＴ
ｌ）標識１７−マー［ｉ−ＯＮ １９ど、３７゛Ｃで
一夜ハイブリダイズした。カイネース反応（よ１列３に
記載されている。バイブリクイピーシ三１ン（（、ろ紙
を６ＸＳＳＧ、０．５％ビロリン酸ツノ１〜リウ中ＲＴ
で５分間３回、３７°０で３０分、４７°０で１０分Ｊ
３よびう）：３℃Ｃ１０分く任意）、洗１吊した。つい
ぐろ紙を風乾し、Ｏｕ ｐ ｏ ｎ を増感スクリーン
を用い、−７０”０で２４時間、Ｘ線フィルＡ（Ｘ−Ｏ
ｍ ａ ｔ ＲＰ 、 Ｋｏｄａｋ ）に：α露した
。−） −１’ ／Ｉｚムを現像して、バックグラウン
ドより強いジグノールが疑われた４８個の＝１０ニーを
選び、さらに解ｖｉシた（ドツト−プロット解Ｊｆｉ）
。 ｂ）ドラ１−−ブロツｌ−解析 ３０１１９ ／ ｍＱのアンピシリンを含むＬ Ｅ３の
１ノンプル２ ｔｎｆｌに、選択された４８叫のコロニ
ーを接種した。ＪＲｌ液を３７℃で激しく旧痒して一疫
牛合さＵた。ＤＮＡプレバレーシコンはＢｉｒｎｂｏｉ
ｍ ＆ＤＯＩＶ（２５）の方法で得られた。各１”）Ｎ
Ａブレパレーシ３ンを水６７．５μ夕中に懸濁した。４
ＮＮＦｌＯｌ１７．Ｅ）１１ｆｔを加え、水浴中６５℃
で１時間イン−１゛コベートした。リンプルを氷上で冷
）」１し、’ｌ 、５８ ＨＣｊ！２０μｍ Ａ３よび
２ＸＳＳＣ１９５μｌをそれぞれ加えた。各リンプルの
総容量は２９５μ！であった。その一部１４５μｌをＢ
１０−ｏａｔ ｇ置（Ｂｉｏ−１ｔａｄ ）によりろ過
し、ＤＮＡを２ｉ＋ａの二ｌ−ｒ、ｌセル［１−スフイ
ルクーに固着さＵた。 ろ過＋”＋Ｉ′Ｉに、ニトロヒル［ｊ−ス１，１あらか
じめ２ＸＳＳＣ中に２０分間浸漬した。ろ過１！／、ろ
組／！−１：ｒ！＋乾し、８０’ｆ；て” ２ ＋１Ｆ
ｉ間乾燥した。一方のろ爪１よ〈γ−３２ｒｉ ＞Δ１
−１）標識［−１−ＯＮＩりの１７７−と、他方は（γ
−３２Ｐ）ΔＴ ＋） ＋！冒みｌ−１−ＯＮ２０の１
７−マーとハイブリダイズした３、ハイブリダイげ−シ
コンＪｊよびＡ浄の条１′１は例ｉ ｊンｉ】に記載し
たとおりである。ろ紙を−７０１：で（３１１，’１問
、Ｋｏｄａｋ Ｘ−Ｏｍａｌ ＲＰ Ｘ Ｉ！＋！フィ
ルｌイに！Ｊ（露した９゜陽性ハイブリグイぜ一シ」ン
シグＪルを産生した６個の］〔に−を同定し、元の形質
転（受体を１） １１ １ ２ 、 Ｆ） Ｈｌ
−８、ｏ ＬＩ Ｌ １ ／１−１ 、ｐＬ
Ｉ １２１ 、Ｄ １１ Ｌ ２３ ＪりＪ、びｒ）
Ｉｔ １．３５と命名した。選択されたコロニー中のＣ
ｌ） ＮΔ挿入体の大きさは、制限解析にＪ、って計価
しＡ： 、、 １３ｉｒｎｂｏｉｍ＆ Ｄｏｌｙのｈ゛
法で１テ１られた上記ＯＮ△を１３８ ｍ １１１Ｊｊ
Ｊ：びｌ１ｉｎｄ■で消化し、０ 、８％ ／ツガ目
＝スミニゲル上、４峙間（１５０Ｖ）泳ｆ）＋さけた。 ／ラスミドＤ Ｉ−Ｉ Ｌ １ ’Ｉ −１、Ｆ） Ｉ
−１１−２１Ｊｊ Ｊ、びｐｌＩＬ２３ｔよ５００ｂｐ
のｋさの１中人体をイｉす３、Ｄ ＨＬ ２ Ａ３ Ｊ
、びＤ ＨＬ ８の挿入体は３００ ｈｐである。 陽性クローン（例５ｂ）を消化したＭ ｌ−１／Ｉ −
１は約５００ｂｐ良のＣＤＮΔＤＮＡを金石し、ざらに
詳細な解析を行うために選択されＩこ。１１シＺｃ ｌ
） ＮΔの構造を第３ａ図に示す。 ｐＨＬ−１４〜１プラスミドＤ ＮＡ２００μびを１３
：）ｍ Ｉｔ ｌ Ｊ：ＡＣは１ｌｉｎｄ［Ｉ［制限
エンドスクレアーピで完全にＡ１化し、５′末端を（γ
−３２１））Ａｌ１）（ＶＩＩ３ｂ）で標識し、ついで
第二の一■ンドメクレアーピで分解しｔこ。単独に標識
されたＤＮＡフラグメン１〜をポリアクリル７ミド、１
．たは／ガ］゛１−スゲル電気泳動で分離した（第３３
図）、。 標識１） Ｎ△は電気溶出にＪ、って回収し、ついてＨ
ａｘａｍ Ｆｔ Ｇ１１ｂｃｒＬの方法（２６）による
配ｌＩｌ ’１８ 析に付した。第３ ｂ図の上の矢印
はこの方法に」、って１ｊつた配シ１１解析の／ｊ向Ｊ
ｊ 、Ｊ、び範囲を、６．を印はビニ１識部位を示１゜ ｐ ｌ−Ｉ Ｌ １４−１ ｃ Ｉ） Ｎ Ａの内部部
分はｓａｎｇｃＨ）方法（２７）によって配列を調べた
。ＨＬ ＺＣＤＮΔを含むＤＩ（ＬＩ４−１の［３ａｒ
ｒＮ−１１−Ｈｉ ｎ ｄ ｌｌ制限フラグメントをＭ
ｎ１１制限１ンドヌクレアーぜで部分Ａ１１化し、末端
Ｚをコードするｃ Ｉ） Ｎ Ａを含有するＩＩ菌ハイ
ブリッドプラスミドの構築が可能であることの発見によ
り解決された。細菌ハイブリッドベクターの部分として
のＨＬＺＤＮΔは、人体の任意のＨＬ Ｚ産生１１１ｒ
ｃ１から得ることができる。適当な細胞の例としては、
胎盤細胞、急竹甲芽球おＪ、び／または骨ｗＪ竹単球白
血病患名の白血球、ヒ１−結腸癌細胞、Ｕ −９３７Ｉ
Ｉ胞系あるいは他の＋−＋ ｌ−ｚ産生細胞系を挙げる
ことができる。本発明の好Ｊニジい態様にＪｊいては、
ヒトからのｔＪ −９３７ＩＩ胞（ΔＴＣＣＣＲＩ−１
５９３＞が用いられる。 １−Ｉ Ｌ Ｚ Ｄ Ｎ Ａは１１１− Ｚ逍伝子を
含むシーンバンクから単離してらよい。本発明では、染
色体ＤＮ八を用いるのは好ましくない。それは（のコー
ド領域内にイン１−ロンを含むことが多く［たとえば鶏
卵白リゾチーム迫伝子は３ ｖＪのイントロンを含有す
る（１３）］、これは酵母を用いて切断できないからで
ある。本発明にＪｊいては、ヒトリゾチームｃ ｌ）
ＮΔが好ましい。 Ｕ−９３７′ａ胞から単離したｍ ＲＮ Ａ ハヒｌ−
リゾブームｃＤＮΔの合成に好ましい鋳型である。 １１ＬＺ ｃＤＮＡの第−鎖の合成には、反応を、好
ましくは上述のｍ １１Ｎ Ａの３′末端と対になるＡ
リボ（ｄ −１−） １Ｂをブライマーとして１；ｌ始
する。 一本ｖｉｃＤＮΔをｄ Ｎ Ｔ Ｐ Ｓおよび逆転写酵
累の存在下にさらに増殖させる。−木ｍｃＤＮΔをつい
ぐ、公知の各種方法によって二本ｍ ｃ ［） Ｎ八に
変換できる。本発明にＪｊいてはＧｕｂｌｃｒとｌｌｏ
ｆｆｍａｎｎの方法（１５）がＯｆましい。−木鎖ｃＤ
ＮΔから第二のｃ Ｉ） Ｎ Ａ鎖の合成（よ、ｍ Ｒ
Ｎ Ａハイ１リッドをｄＮＩｌ’ｓの存在下にＲＮ ａ
ｓ ｃ ｌ−１８よびｌ） ＮΔポリメラーピ１で！
ｉ！ｌ ｌ’ｌ！ ゛りることにより行われた。 この方法を用いることにより、二本鎖Ｃｌ’） Ｎ△が
１１１られ、これは直接イのままり［１−ン化できる。 二本鎖ｃｌ）Ｎへの細菌ベクター中へのり１°ｌ−ニン
グ１よ、各種の公知方法（・実施て゛きる。二本鎖ｃＤ
ＮＡは、直接ブランｉ・末端として、合成リンｈ−を介
して、またはホモポリマーディリングとして公知の方法
によってクローン化できる。 ｔ−Ｉ Ｌ Ｚ ｃ Ｄ Ｎ Ａクローニングするに
際しては、ホモポリマーティリング法が好ましい。この
方法では、ターミナルトランスフ１ラー１を用い、ＨＬ
Ｚ ＤＮへの３′末端に一本鎖を、ブラン１−末端ま
たは（ＪＶ端へのヌクレオブト（好ましくはｄ Ｇ Ｔ
Ｐ）のイ４加により形成させる。別の反応で、細菌プラ
スミドを制限メクレ）７−ゼで線状化しく ＨＬ Ｚ
ｃ Ｉ） Ｎ Ａのクローニングには、ｐ ＬＪ Ｃ９
ベクターが好ましかった）、３′末端に相補的−木鎖を
１１１るために相補的−１゛イル（りｆましくｔよｄ
ＣＴ Ｐ ）をりえろ。次の１稈て・は、ホモポリ７−
延艮二本鎖Ｃ１）Ｎ八を相当・Ｊる相補的アイルベクタ
ーと混合しで、適当な条ｆ１下に結合させる。 組換えが起こったのＩう、ｃ ａ Ｃ１２処理大腸菌細
胞をこの況合物で形質転換し、選択プレー１〜上に＋９
ｆ ＜。Ｌｌ ｌ−Ｚ ｃ Ｄ Ｎ Ａを含イＩＪる
り【］−ンは各種の公知方法で同定Ｃさ・ろ。本発明に
おいては、放則能標識合成Ａリゴヌクレオチドによるス
クリーニングが好ましい。発表されているＨＬＺ蛋白質
のアミノ酸配列を用い、各１７塩阜艮の２組のＡリゴメ
クレＡｆ・ドを合成した。異なる＝１トンが１個の同じ
アミノ酸を１！■定できるというＩＩ実に、」：す、各
組は異なるＡリボヌクレオチドの況合物を与えられた。 すべての可能な組み合わせの合成により、存在りる１個
のＡリボヌクレオチドが１１ＬＺ３１１伝子とｈ１適の
対を形成りることが確認される。２個の１７−゛ンーＡ
゛リゴヌクレオヂドのブールを用いることにＪ：す、偽
正（ｆａｌＳｅ ｐｏｓｉ口ｖｅ）が選択される可能性
は低下する。 スクリーニング実験では、ｃＤＮＡ挿人体をもつ細菌ク
ローンのＤＮＡは二１−口セルロースろ紙に移され、１
１［Ｚ遺伝子を含む挿入体は］［に−ハイプリダイぜ−
シコンとして知られる方法を用いて同定された。二１へ
ロレルＯ−スろ紙は適当４【条ｆｌ’ １”にヒドリ１
′チーム遺伝子特異性１７−マーの敢Ｑ４標識プールと
ハイブリダイズさせた。相当するクローンを同定したの
ら、各り［１−ンのプラスミドＤＮＡを調製し、＋４Ｑ
Ｘａｍ 、！：Ｇ１１ｂ（！ｒｔ （１）方法（化学的
方法）またはＳａｎｇｅｒのＩノ法（ジデＡ１−シメク
レＡチドでの合成）を用いて挿入体の配り１１を決定し
た。正クローンからのＣ１）ＮΔ挿入体から１３ Ｎ
Ａ配列を決定づることにＪ、す、ｐｉ機能性ある蛋白質
のアミノ酸配列を１１［測りることかできる。 この配列を発表されているＩＩ Ｌ、 Ｚのアミノ前記
＆ｌｌと比較すれば、りに］−ン化されたｃ ｌ） Ｎ
Δが実際にｌ−Ｉ Ｌ Ｄ蛋白質をコードリ゛る領域を
含むかどうかを確立することがｊｉＩ能になる。 一般的には、レブリ：１ンａ′３よびコン１〜［］−ル
配＋Ｉｊを含むプラスミドベクターが使用できる。これ
らの配列は宿主細胞と適合性のある種に由来・Ｊるもの
でなければならない。ベクターは通常、複製部位に加え
て、認識間＋ｌｌを６し、したがつ（形質転換細胞内で
の表現型による選択を可能にり゛る。 たとえば、大腸菌（、Ｌ通常、大腸菌秤に由来Ｊるプラ
スミド、ｐ Ｂ Ｒ３２２にＪ、って形質転換される（
Ｂｏｌｉｖａｒはか：Ｇｅｎｃ、 ２ ： ９５．１９
７７）。 ｐ１３ Ｒ３２２はアンピシリンおよびテトラ勺イクリ
ン低抗性のｊ貞仏子を含み、したがって形質転換細胞を
同定Ｍるための鈴生な手段が与えられる。 ｐ Ｑ Ｒ３２２プラスミドまたはその他のプラスミド
はそれ自身プロモーターも含有するが、あるいはその微
生物にＪ、りそれ自体の蛋白質を発現づ゛るために使用
されるように改変されな（）ればならない。組換えＤＮ
への製造にＩｎら頻繁に利用されるプロし一ターには、
β−ラクタマーピ（ベニシリナーｔ２ ） Ｊ３よびラ
フ１−−スプロＬ−ターシスデム（Ｃｂａｎｇはか：
Ｎａｔｕｒｅ、 ２７５ ： ６１５．１９７８ ：
１Ｌａｋｕｒａほか：５ｃｉｃｎｃｃ、 １９８ ：
１０５６．１９７７ ； Ｇｏｃ＋１Ｊｃｌ ｌ：Ｕ
か： Ｎａｔｕｒｅ、 ２８１ ： Ｅ）／１４．１９
７９）、ｌ・リブトファン（ｔ ｒ ｐ ）プロ七−タ
ーシスデム（Ｇｏｃｄｄｅｌはか：Ｎｕｃ１．＾ｃｉｄ
ｓｌｉｅｓ、、 Ｂ ： ４０５７．１９８０ ； ］
−ロツバ特許出願公告第００３６ ７７６号）がある。 −１述のブ１１ Ｅ−一ターが最し一般的であるが、仙
の微生物プ［１し一夕一ら開発され、使用されている。 １−Ｉ Ｌ Ｚの遺伝子配列ｔよ、たとえば、バクテリ
オファージラムダ（ＰＬ）の左方ブ１］［−ターの］シ
トロール下に使用できる。このブ［１モーターはどくに
強力なことが知られているプ［１［−一ターのひとつで
、制御も可能である。隣接制限切断部位が知られている
遺伝子、ラムダレブレツナ−によってコントロールでき
る。 熱不安定性レプレッサ゛−をコードＪるこの遺伝子の突
然変異体を、全１１Ｌ／配ケ１を含むベクター内に包含
させることができる。温瓜を４２℃に１−冒させるとレ
プレッサーは不活性化され、ブ【１し−ターは最大の粘
付を示１゜これらの条（’Ｉ ’Ｆ ｒ産生される全ｍ
ＲＮΔ【よ、その新しい合成リボ核酸中に１）１ブＬＩ
Ｔニーターに由来する約１０％を含む細胞をｊｉＩる
のに十分なはずである。この方法で、機能性ＩＩ Ｌ
Ｚ配列がリボソーｌＸ結合部位に隣接し、ラムダＰしプ
ロし一ターからｔ、Ｌ種々の間隔にあるクローンバンク
を確〜″ノすることが可能になる７、これらのクローン
を調べ（゛、Ｉｔ：Ｉ Ｑ収Ｖを示すり［゛１−ンを選
択できる。 １１Ｌ／配列の５１現Ｊｊ Ｊ、び翻訊は、Ｊ１形質転
換望での４体に対して同種とみなされる他の調節シス１
ムの」ント［１−ル下にし進行できる。たとえば、ラフ
１−−ス依ｑ竹人賜菌株からの染色体ＤＮＡはラフ１〜
−スｊ、た覧よ１ｉ１ Ｇオペ〔１ンを含イｊし、これ
が酵木β−万うク１〜シダーピの発現を支１、ＩＪるこ
とによりラクｌ〜−スの分解が行われる。 １ａＣＡ−ぺ【コン制御要素はバクテリオ”ファージラ
ムダＤ Ｉ ＦＩ Ｃ５から１ｑられ、これは大腸菌に
感染づる。ファージの１ａｃ′Ａペロンは同じ細菌種か
ら形質導入によって１！７ることもできる。本発明の方
法に使用できる調節シス１ムは同じ生物体からのプラス
ミドｌ） ＮΔに由来するものであってｂにい。１ａＣ
ブ「１〔−ターーＡ−ペレーターはＩＰＴＧにＪニリ誘
導できる。 他のブ１］″Ｕニーター−オペレーターシステムまたは
その部分ら等しく良９ｆに使用できる。たとえば、フｌ
ラビノースオペレーター、］リシン［１オペレータ〜、
ガラクトースオペレーター、アルカリホスフｊ′クーピ
Ａベレーター、ｔｒｐオペレーター、−１ニジロース△
Ａベレーター、ｔａＣ〜プロモーター等である。 Ｍｌゑ１プロモーターをＩＩ Ｌ Ｚ ｍｌ−ド領域に
、１１Ｌ／の有効な発現が保証される。」、うに結合づ
ることが好ましい。さらに訝しくは、Ｍ１々Ｊブ［Ｊヒ
ーターを成熟ＩＩ Ｌ Ｚの：１−ド領域の直１１ｊ１
に位１どずさＵ、翻訳開始シグナル（△１−Ｇ）をこの
結合ｎ５位に沖入りる。さらに、この１＋ ＋−２発現
＋４ｉ位（ま、＾７Ｆｌ内にそれを確立させるため、公
知の酵１ｕ形質転換法を用いて各種りり母ベクターに挿
入１」ることがきる。 ハイブリッドプラスミドを含むＭ１１］細胞を各種メジ
ウム中で培養し、所望の生成物１１し７をそれから甲離
し、公知方法Ｃ精製Ｊる。別ｖ１として、１」［ｚ発現
単位の構築体内に＾’ｔ ＩＩＩシグナル配夕１１を挿
入することもできる。この場合、この種のプラスミドで
形質転換されＩＣＦｌ？ ＩＴＩ粗胞はその細胞壁を通
してＪ３ ｉメジウム中に１１Ｌ／をＩＪｌ出て・き、
したがってメジウムから所９！の生成物、１１［／を回
収でき、さらに精製できる。 酵母細胞は培養が容易で、大規模な醗酵巣作がずでに確
立されＪｊす、しかもＸＬンド１−キシンを金線ないの
で、発現のための宿１生物としてはとくに好３１、しい
。したがって、本発明には１８徨！ｌｉ？母のＪ：うな
真核生物微生物が右利に使用できる。ヒール酵Ｂ１菌が
最す頻繁に使用されるが、池の多くの種にも一般に取得
可能である。 酸１１菌での発現に【よ、通常、プラスミドＹ ｌ＜
ｐ ７ （Ｓｔｉｎｃｔｔｃｏｍｂほか： Ｎａｔ
ＬｌｒＯ，２Ｂ ２ ： ３９．１９７２：にｉｎｇｓ
ｍａｎほか： Ｇｅｎｅ、ヱ：１４１．１９７９ ：
ｌｓｃｈｕｍｐｃｒほか： Ｇｅｎｅ、 １０ ： １
５７．１９８０ ） ｄ３よびプラスミドＹＥ Ｄ １
３ （Ｂｒｏａｃｈはか： Ｇｅｎｅ、 Ｂ ： １２
１〜１３３．１９７９ ）が用いられる。プラスミドＹ
Ｒｐ７はＴＲＰＩＷ伝了を含有し、これが１〜リブ１−
ファンを含Ｊ、ないメジウ１１中では／）−育できない
、酵母変異体、ｌことえば△Ｔ ＣＣＮｏ ／＋ ４０
７６に’Ｍ ＩＪｌ、！マーカーを５える。 酸１ｕ宿主ゲノムの特徴としてＴ ＲＰ ｌが欠失して
いる揚台（よ、１８査を１〜リブ１〜フアンを加えイｉ
いで７ｊうことにより、形質転換体の検出に右力な手助
けが１１ｔられる。酵母遺伝子ＬＥＵ２を含むプラスミ
ドＹ ［ｐ １３の場合−し全く同様で、これ覧よＬＥ
ｔＪ−２変異体を補足Ｊるために使用できる。 ′Ｐ？Ｐ母ベクターに適当なプロモーター配列として（
よ、ΔＤ ｌ−１１Ｊ１ｉ仏子の５′隣接領域（静ｍｅ
ｒｅｒ。 Ｇ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｒ ｌＥｎｚｙｍｏｌｏ（Ｉ
Ｖ、 １０１ ： １９２〜２０１．１９８３）、３
−ホスホグリセレートギナーケ遺伝子（Ｉｔ ｉ ｔｚ
ｅｍａｎほか： Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｂａｍ、、
２５５ ： ２０７３．１９８０ ） Ｊ：たは他の解
糖ＰＩ＃木迫伝子（にａＷｉｌｓａｋ！ ＆ ｒｌ’ａ
ｅｎｋｅｌ ： ＢＢＲＣ，上立旦：１１０７・〜１１
１２．１９８２）たとえば、エノラーピ、グリセロール
アルデヒド−３−小スフエートデヒドロゲナーロ、ＩＸ
＼−ソＶプー口、ビルベー１〜デカルボ４−シラー口、
ホス１１＼フラク１〜１−ノ゛−ピ、グル：１−スー６
−ホスフ」−−１−イソメノーＵ、ホスホグルコースイ
ソメシーｔ！ま／＝ １．１グルー１）ノーピの遺伝子
を含む配！Ｊ１１がある。適当な発現プラスミドの構築
には、これらの遺伝子に関連覆るクーミネーシ］ン配＋
１１を、発現リベさ配列の３′末端の５１現ベクター内
に用いることもＣさ、Ｃれによりボリアデニレーシ１ン
ｄ３Ｊ、びｍ ＲＮ△のターミネーシー１ンがイ・１ｔ
−ｊ２きれる。 生台条ｆ１にＪ、って制御される転ち゛の利＋：Ｘをも
つ他のプロし一ターにｔよ、アルコールデヒド［１ゲ少
−ぜ２、イソシトク［１−へ〇、Ｍホスファターピ、窒
素代謝に関連１゛る分解Ｍ索、上述のグリトロアルデヒ
ド−３−ボスフエートデヒド（］ゲナーゼならびにマル
］・−スおよびガラクトース代謝に関与づ゛る酵木の遺
伝子のブ［１［−ター領域がある。Ｍ１ｕ重合壁遺伝了
座にＪ：つて調節されるプロ［−ター、たとえば遺伝子
ＢＡＲ１、ＭＥＣｌ、ＭＩＥＣ２、Ｓ Ｔ Ｆ ２．５
ＴＥ５のプロモーターを、温磨依存性ｓｉｒ突然変異を
用いて温度ＶＡ節ヤシステム挿入することができる（Ｒ
ｈｉｎｅ 、 Ｐｈ、 Ｄ、学位論文、オレゴン大学、
［ｕｇｃｎｅ、 Ｏｒｅｇｏｎ、 １９７９ ： ｌ
ｌｃｒｓｋｏｗｉｔｚ ＆ Ｏｓｈｉｍａ： Ｔｈｅ
ｍｏｌｅｃｕｌａｒＢｉＯＩＯＵｙｏｒ ｔｈｅ Ｙｅ
ａｓｔ ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｃｓ、第１部、１８１
−２０９頁、１９８１ 、Ｃｏ１ｄ ５ｐｒｉｎ。 １１ａｌ’１）Ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ） 。こ
れらの突然変異は、酵母の静止、接合型カセットの発現
に影賢し、１７ｓロ＆的に接合型依存プロモーターに影
響を与える。しかしながら、一般的には、酵母適合性ブ
〇七−ター、元の複製およびターミネーション配列を含
む（［意のプラスミドベクターが適している。 無傷の１１ Ｌ Ｚ ＣＤ ＮＡ配列の存在は、曲の
微生物たとえば酵母での発現のためのＩ１１／’ｍ仏子
の構築を可能にする。 したがって、本発明における＾ν母細胞での１−Ｉ Ｌ
Ｚの発現には、ΔＤ Ｉ−１１ブ［１七−ター−（Ｘ
因子リーダー−ＩＩ Ｌ Ｚ遺伝子−ΔＤｌｌ１１クー
ミネーターの各要素またはα因子プロモーターーα因子
リーダー−１１ＬＺｍ伝子−α囚了ターミネータ−の各
要素からなる分泌プラスミドを使用することが可能であ
る。ＡＤＩ１１プロモーター、ＡＤ＋−１１１ターミネ
ータ−およびα因子遺伝了のＤＮＡ配列は公知である（
Ｊｅｆｒｃｒｙ、 ｌ 、 ４．Ｕ ７）１ ： Ｊ
。 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、 ２５７：３０１８〜２Ｆ）
、１９Ｅ３２ ： Ｒｕ５ｓｅｌｌ、 ｏ、 ｈ、はか
： Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｂｃｍ、。２５８ ：
２６７４ 〜Ｂ２ 、１ ９ ８ ３ ： Ｎｕ
ｃｌ、 八ｃ １ｄｓｌｉｅｓ、、 １２ ： ／Ｉ
Ｏ４９〜６３．１９ Ｂ ３ ）。 この方法で調製されたｌ−Ｉ Ｌ Ｚ ３ｍｍ壬子選択
されたＭ母ブ［ｌモーターと機能的に接続できる。この
秤の発現中位はまた、各種の酵母ベクターに統合できる
。これらは酵Ｒ１の形！１転換が可能で、ヒトリゾデー
ムの合成が行われる。 △Ｄ ＋−１１７ＩＩ ’Ｅ−ターの優先的制御下での
ＩＩ １． Ｚの発現のために、ΔＤ Ｌｌ ［プロモ
ーターの３′末端の１１２流に完全α因子リーダーを８
右さＵたプラスミドを構築することができる。成熟ＬＩ
Ｌ Ｚ （ＨＬ Ｚ遺伝子）を＝１−ドするＤＮＡ配
列はα囚ｒリーダーの３′末端に、α因子に向かつ−Ｃ
ｉ［シいｈ向で接合させる。Ｉ−１１−Ｚ遺伝子の発現
に際し、正ｂ１１なＮ末端を生じるような横築が好まし
い。発現カレットの最終的構築には、１１１７遺伝了の
均一へ終結を達成しｍ ＲＮへの安定↑りに奇’ｊ′Ｊ
６ＡＩ）ｔｌｌｌターミネータ−配列を、それが１１１
−Ｚｉｕ伝子の停止コドンにすぐ隣接１ＪるＪ、うに導
入Ｊる。この種の発現プラスミドは、上述のすべ（の要
素が、ｉＥ シい配列でまた相！ｉ ＣｉｌＥ Ｌ／い
方＋ｒ＋１１’ｌで、へＤｌｌｌブ［１し一ター、α因
子リーダー、ｔｌ Ｌ Ｚ 還１７．；子Ｊｊ、［ＦＡ
Ｄｌｌ ｌ ｌ ’／−：ｚネー’／ −Ｕ）各要木問
が正（１（「に移り変わるように含イｊされる。 α因子リーダーとそれに続＜ＩＩＬ／Ｊｆ仏子間の接続
は、α因子の成熟に役立つブＯデアーピ’Ｊ） Ｉｇｉ
ｉ’ｔｌｓ位が成熟ＨＬ Ｚの最初のアミノ酸の配列の
正確に前流、ＬＹＳ ＡＲＧの後に位置し、宿主細胞
によって生成されるｌ−Ｉ Ｌ Ｚ蛋白質の正しいＮ末
端が１！？られるにうに行われるのが右利である。 この種の発現カセットは、各種Ｍ母発現プラスミド中に
結合させることもできる。多コビーノラスミドＹ Ｅ
Ｄ １３ （Ｂｒｏａｃｈ、 Ｊ、 Ｉｌ、はか： ａ
ｅｎｃ。 旦＝１２１へ・１３３．１９７ ’Ｊ ） 、Ｉ） Ｊ
Ｉ） ＋３２０７ （ＤＳＭ３１８１．１９８１１’
＋２月２８ ＩＩ ’＋；７託） 、Ｙ Ｉ Ｏ５（５
ｔｒｕｂｌ、に、【ヨか： Ｐｒｏｃ、 Ｎａ口。 八ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＩＩｓ＾、 ７６
： １ ０ ３５− １ ０３９ 、１９７９）お
よびｐＥΔＳ １０２はこのためにとくに好ましい。ベ
クターｐ１ヨＡＳ１０２は、ＹＩｐ５をＰｓｔｌで部分
消化し、Ｙ Ｉ Ｉ） ５を１’３ ａ ｍ ｌ−１１
て・完全に消化し、単離された４、３ｋｌ＋フラグメン
Ｉ−（ＵＲ△３遺伝了を含む）をｐ Ｊ Ｄ ｒ３２０
７の４ 、 ／Ｉ ｋｂ １３ ｊｔｒｒＮＩ Ｉ
／−ＰｓＬｌフシグメントと結合さＵることにＪ、す１
！１られる。この種類の発現力セラ１〜をもつこれらの
酵母ベクターににす、両接合へ°！のＰ？ｔＰＪ細１泡
が公知方法で形質転換′Ｃさる。このような形質転換体
で産生され、１２３養メジウム中に放出される＋１１−
Ｚ ｉよ、蛋白ｘｌ粕装に関し公知の方法で容易に単
離される。 １−．１１７遺伝子の発現はα因子プロモーターの制御
ｌ＋ １”に行うこともできる。このためには、成熟＋
１ＬＺを：ｌ−ド・ＪｏるＤＮΔ配列を正しい方向性で
α因子プロを一ターとα因子リーダーの聞に結合さける
。完全へ発現カセットの構築には、α因子−ｔ ｏ ｘ
−ター、（Ｚ 因子ＩＪ −ター、ｌ−Ｉ Ｌ Ｚ
ｍ伝了ａ３、」：びα因子ターミネーターを順次配列さ
せる。この場合ら、α因ｒ−リーダーの３′末端とｌ−
Ｉ Ｌ Ｚ遺伝了の５′末端の間の遷移には、ΔＤＨ［
ブロモ−クーのｉｌ＋ｌ ｆａｌｌ下にお４Ｊる発現カ
セットの作成に際し）ボべたと同じ移り変わりが確立さ
れる。この種類の発現カレットは上述の酵母発現プラス
ミドに導入し、ＩＩＷ Ｉｎ細胞の公知方法による形質
転換に使用でさる１゜ この場合の好ましい宿主は接合型αのＭ Ｉｎ株である
。このような形質転換体の１１養Ｊ３よびそれに、Ｊ、
つて放出されるｌ−Ｉ Ｌ Ｚのｉｌｌま公知方法によ
って行われる。 これらの構築により多くの利息が生じる。 ｆｉｌ ｍ ｌＩ Ｎへの均一な終結、したがってｍ
ＲＮ△の安定性の増大 ＋２１ １８孜メジウムト澄液／）ｓ ｒらの１１しＺ
の容易な単離 （３） 酵母細胞内よりも分泌蛋白質中ではジスルフ
ィド橋が８μに形成されるので、正しい三次構造をもつ
ＨＬ Ｚの高比率 （４） 分泌時にお【ノる、成熟１１ＬＺｈらのシグ
ナルペプチドまたはリーダーペプチドのｌンドブ［１デ
オリテイツクな正確な分離。 この方法で、正確に決定された蛋白質Ｎ末端が得られる
。成熟ＨＬ Ｚ ／Ｆｉ白質はＮ末端にリジンを右する
。プラスミド構築は、プＯテアーピ切断部位が分泌プラ
スミド中のりジンコドンの萌に位置するにうに選択でき
る。したがって、分泌１１［Ｚの最初のアミノ酸はリジ
ンである。細胞内産生に＋３いて１よ、翻訳が開始され
るために成熟リゾブ−ムの最初のアミノ酸の前に開始Δ
゛「Ｇ（メチオニン）を位ｆＦ？さＵなｔプればならな
い。このメ１Ａ二ンが細胞機構によって除去されないと
きわめて喰われや１い（粘性、安定性、抗原性）。 微り物のほかに、培養多細胞生物も１−１１，７の発１
１、！に適当な宿主である。Ｌ１１！論的には、を椎仙
物６３Ｊ、びＪ１ｎ柑動物の培養細胞のいずれもが使用
できる。しかしながら、最近では、培養液中での１゜初
物細胞の複製〈組織培養）はルーチンの操作となってい
るので、とくに脊椎動物細胞に興味がしｌコ れる （
Ｔｉ５ｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ、 八ｃａｄｃｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ。 にｕｒｓｃ ａｎｄ ＰａＬｔｃｒｓｏｎ １．ｄ、、
１９７３ ） 、この種類のイ１用な宿二ｉ ｆｉｌ
ｌ胞系にはＶ Ｅ ＩＩ Ｏ−に Ｊ、び１１０１ｉｌ
−細胞、チＶイニーズ・ハムスター卵胞（ＣＩＩ Ｏ）
−細胞４工らびにＷ２Ｂ５．１３１１Ｋ。 ＣＯＳ −７Ｊ’ｊ 、Ｊ、びＭ Ｄ ＣＫ−細胞系が
包含される。 これらの細胞に用いられる発現ベクターを上通常、複ツ
Ｊ部位（必尺に応じて）、発現リベぎ逍伝イの」１流に
ＩＩＩ′？ｉするプロモーターならびにリポソーム結合
部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアゾニレ−ジョ
ン部位、転写終結配列を金石する。 １ｌｌｉ乳動物細胞中に使用するに際しては、発現ベク
ターの制御様能はウィルス材料から選ばれることが多い
。たとえば、通常用いられるプロし一ターはＰｏｌｙｏ
ｍａ、 ＾ｄ（！ｎ０Ｖｉｒｌｌｓ ２に出来するも
のであり、とくに５１ｍ１ａｎ ｖｉｒｕｓ ４０ （
Ｓ Ｖ ／Ｉ Ｏ）に出来するものが頻繁に用いられる
。ＳＶ４０の開始および終結プロ［−ターはとくに有用
である。 いずれしウィルスから７ラグメントとじて容易に１！１
られ、またＳＶ４０のウィルス複製部（Ωを含むからで
ある（ｒｉｅｒｓ＋まか： Ｎａｔｕｒｅ、 ２７３
： １１３．１９７８）。また、それがウィルス複製
部１１／の１１ｉｎｄｌｎ切断部４ｉ／から１３（Ｊｊ
！ｌ切断部ｉイＩに及ぶ約２ＥｉＯｂｌ）’７）ｌざの
配列を含むことを条ｆ１に、Ｓ Ｖ ４０の大または小
フラグメントも使用でさる。 ざらに、通常、所望の；頁１ム了配’ｙ１１に結合して
いるプロし一ターまたは］ン１〜し１−ル配ｌｌＩが、
これらの制御配列が宿主１ｕ胞系に適合性を示１限り、
使用でき、またそれが１！ましいことが多い。 複製ＲＩＳ位は、たとえばＳＶ４０もしくは他のウィル
ス源（／、−とえばＰｏｌｙｏｍａ、八ｄｃｎｏ、 Ｖ
ＳＶ、ＰＢＶ ’ｌ ）から眉仏子外部位に導入するた
め、相当りるベクター構築にＪ：るか、またｔよ、宿主
細胞の染邑体複装（１崩にＪ：つて！）えられる。ベク
ターを宿主細胞の染色体中に沖入りる場合には、通常、
復古の方法が適当である。 ビークルにＪ、る細胞の形質転換は、多くの方法によっ
て実施できる。たとえば、カルシウムを用いて行うこと
ができる。この場合、細胞をマグネシラ１１中で洗浄し
、カルシウム中に懸濁した細胞にＩ）ＮΔを添加するか
、あるいはＩＩｌ胞をＤＮＡとリン酸カルシウムの共沈
１股物に隅露する。以復の遺伝子発現には、細胞を形質
転換細胞を選択するメジウムに移１Ｊ０木発明のポリペ
プチドは５Ｔ細に述べた成熟ヒトリゾチーム（ＨＬＺ）
に限定されるものではなく、このポリペプチドの任意の
ｒｉ篩も包含する。これらの修飾にはたとえば、活性に
実質的む影響を与えない、Ｎ末ＱｂしくはＣ末端にＪハ
ノる分子のり、０縮およびアミノ酸の他の基による置換
がある。 本発明は上述の１〜ＩＬＺを１４異的に］−ドする遺伝
子配列のみでなく、突然変５゛シ、分解、遷移またはイ
・１加によって容易かつルーチンに（ｉｌられるその修
飾体をＣ）包含する。上述の）−Ｉ Ｌ Ｚ （すイ１
わ１３、相当する既知の生物学的活性スペクＩ−ルをイ
ｉ １Ｊる）をコードする任意の配＋ＩＩ Ｊｊ Ｊ、
びそれに匹敵りる活性をもつ分解物である任意の配９１
が包含される。１本技術分野の熟練名にはコード領域の
分＋ＩＲＤ Ｎへ配列を決定することは容易である。同
様に、ト１１−Ｚのｒ＋’ｒ性スベクＩ・ルを有し、上
述の配列（またはその部分）と緊縮条ｆ１下に（たとえ
ば、８５％以上、好ましくは９０％以上のホモロジーを
選択する条ｆ［下に）ハイブリダイズした（ｆ息の配）
ＩＩも包含する。 本発明の物質は、公知方法で処方して、医薬として使用
できる組成物を装造することができる。 本発明のポリペプチドはそれ１１１独で使用できるが、
まＩこ、他の成分たとえば各種の抗生物質（デ１−ラサ
イクリン、バシトラシン）、酵素（α−アミラーピ、パ
パイン）またはビタミンと配合して投与りることもでさ
°る。 次に本発明を、以下の実施例によってさらに詳細に説明
するが、これは本発明を例示するものであって、いかな
る意味でも本発明を限定するものではない。 実施例中に使用した暗号は次のとおりである。 ＋１１Ｚ：ヒトリゾチーム ＲＰ Ｍ ｌ ： Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａ
ｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ１
ｒ ｉ ５−Ｉｆ（１！ ： １−リス＝（ヒドロキ
シメチル）−アミノメタン、ｐＨをｌ−Ｉ ＣＩで調整
ｌ Ｉ）ＴΔ： Ｔｆ・レンジアミン四酢酸１） Ｆ
ｌ） ：ジエブールピ［１カルボネー１〜ＳＤＳ ニド
デシル１ｉｆｔ酸±トリウｌ＼Ｎ ａ△０：ｍ酸す１−
リウム ＢＳ△：ウシ血清アルブミン １’）Ｔ’ｌ−：１．／ｌ−ジブＡスレイ１ヘール（１
，４−ジメルカプト−２，３−ブタノール）１）８Ｉ：
フ土ノール：り日ロボルム：イソアミルアル＝１−ル（
１５：２／Ｉ：１） β−ＮＡＤ ：β−ニコチン酸アミドアデニンジヌクレ
オチド ５ｓｃＤＮＡニー木鎖ＤＮＡ ［、ｃｏｌｉ：人賜菌 ｓｓｃ：ｏ、１５ＨＮａＣ１）、０．１５Ｍクエン酸ナ
トリウムの溶液、１ＯＮＮａＯＨでｐｌ＋７に調整 デンハルト溶液＝０．１％Ｆ ｉ ＣＯ１１，０，１％
ポリビニルビ［１リドン、０．１％ＢＳへの溶液 Ｔ １３ １三 ： ０． ０８ ２８ １− ｒ
ｉ ｓ、 ０． ０８ ２０ホウ酸、０．００
２Ｈしｔ）＋への溶液、ｐＨＥ３例１：細胞系ｊＪ −
９３７中の１１１７活（１１の−しに１〜ｊΔ血細胞系
ＬＪ −９３７がヒトリゾブーｌ＼を産生Ｊることは報
告されている（１６）。Ｕ −９：３７ａｌｌ Ｉｌｄ
系をＩＩＬＺ ｃｌ）ＮＡ含成川用００１ ’）’Ａ
ｌＲＮＡ源としＣ使用Ｊるために、Ｕ 、−９コ３７細
胞にＪ、リメジウム中に放出されるＨ Ｌ Ｚ ｆ／）
活性を定早しＩこ。１０％胎仔ウシつ？＋’ｉ、ペニシ
リン（１００中位／ ｍＱ ） に Ｊ、びスｌ−レブ
トマイシン（５）０単位／ｄ）を合む１゛≧ＰＭ［１６
／ｌｏメジウムに、ＩＪ −９３７細胞系培養液を新た
に接種し、３７℃で３０間、密度が３Ｘ１０５細胞／Ｉ
ｄになるまで！、１育ざＵた。ついで遠心分離１して細
胞を除去し、メジウ１１中に放出されたＨ Ｌ Ｚの活
性をＧＯＩ（ＩとＳｃｌ＋ｗａｉｇｃｒ （１７）によ
って報告された方法にＪ、って定量した。放射活性基質
と２時間インギュベー１〜したのら、２ｄのインキュベ
ーション混合物から１００ ｔｔ １のサンプルを取り
、放出されＩこ族ｎ＝１能の吊を測定した。陰性コン１
〜［１−ルどしてはＲｌ） Ｍ ｌメジウムのみを用い
た。（ノー９３７１１１胞にＪ、って分泌されたｌ−Ｉ
Ｌ Ｚのｍは、作成した標ｒ（Ｌ−曲線［ヒト乳汁か
らのヒトリゾチーム（Ｓｉｇｍａ ）のＲｌ）Ｍ Ｉメ
ジウム中粘付］から工１専した。 結末は第１表に示す。 第１人に承りように、ＬＪ−９３７１１＋１Ｊ２４ｔユ
Ｐ ＲＭ ｌメジウムにメジウム１ｄあたり約１．５μ
Ｕの＋１ Ｌ Ｚを放出する。（Ｊ−９３７１［１胞系
はＨｌ−Ｚ ｍ ＲＮ Ａの有用な原料であると結論
されＩこ 。 例２：と１〜リゾデ一ムｍＲＮＡ含有ＲＮΔの１造 ｉ＋）全ｌ？ ＮΔの中麺 ヒ１−組織球リンパ腫細胞系Ｕ −９３７を１０％胎仔
ウシ血清、ペニシリン（１００単位／ｄ）おＪ、びス１
−レブトンイシン（５０単位／−）を含む「≧１）〜１
１メジウム１６４０中、３７℃で生白さＵた（Ｈｉｄ＠
培養液１．６１からの細胞を遠心カー１にＪ、って集め
、水冷した１０ｎＨＴｒｉｓ−１１Ｃｊ！１１１１７、
４／ １４０１ｎＨＮ ａ Ｇ１／ １ 、５ｍＨＭＯ
Ｃｊ！２５０ｍ１！ｒ１回洗１ＩＮｔ、、水冷した１０
＋１１１４１−ｒｉｓ−１ｉｃ１１１１１Ｆ３．４／１
／ｌ０ＩｎＨＮ ＦＩＣｆｌ／ １ 、 ５ｎｒＨＭ’
］ ＣＪ！２１０ｒｄ、に懸濁しｌこ。非イＡンＷ面粘
付剤、Ｎｏｎ１ｄｃｔ Ｐ ４０をＮ Ｓｔ’濃度０．
５％になるＪ、うに加えた。懸濁液を氷上に５分間保持
し、ついで１０秒間激しく混合して細胞膜を分解さけた
。次１．：４℃で遠心分離して核を除去した。上澄液１
０ｄに以下の溶液：２％ＳＤＳ ０．５ｄ、２８ Ｔ
ｒ ｉ ５−ＨＣｊ！（ａｌ１９．０）０．２５ｄ、５
００＠ＩＨＥＤＴ八（ＤＩＩ７．５）Ｏ，ｌ＃ｆを加え
た。等容の新たに蒸留し、１０ｍｔ４ −１’ｒ ｉ
５−８０ｊ！ Ｉ）ｌＩＥ３／１ｍＨＥｌ）ＴＡと１
１衡化したフェノールを加え、このリンプルを１０分聞
激しり′＆揺し、ついで遠心分離して相を分離した３、
水相をＦ述したようにして２１（す抽出し、１！復に等
容の’ｐ ｕ ｏホルｌ＼で抽出した。 ３Ｈの酢酸カリウム（水相の容Ｍの１／１０） 、つい
で２．５５容のＪタノールを加えた。この溶液を一良−
２０℃に保ち、ＲＮ△の沈殿を遠心分離により集め、７
０ ％ ｒ−タノール３ ａｔ！ −Ｃ−１回洗浄し、
真空中で乾燥した。Ｉ Ｎ八を水３ ｕにに溶解し、沈
殿さＵ１捕果し、乾燥し、土とＩ＋１１様に出溶解した
。 約８■のＲＮＡが得られた。 ｐｏｌｙ Δ４＋＜ＮΔは全１＜ Ｎ ＡからＡリゴ
（ｄ ’ｒ ）−１Ｚル［Ｉ−ス（Ｐ −１−１１ｉｏ
ｃｔ＋ａ＋ｎ１ｃａｌｓ。 Ｉｎｃ、）上に単離した。、オリゴ（ｄ ’ｒ ）−セ
ル［１−ス０．５！Ｊを滅菌水に懸濁し、−皮１４°Ｃ
に敢ｊＺした。：Ｗ日、ｌ） ［１つ処１１滅菌水で洗
ｒｐシたカラム（Ｂｉｏｒａｄ ｐｌａｓｔｉｃ、 １
８ｃｍ、０ １ 、５ｃｍ）にオリゴ（０丁）−セルロ
ース０．５ＬＪを充填し、ついでプロアナ−Ｌ’Ｋ（Ｘ
Ｉ型、ｓｉｇｍａ ）溶液３−で洗浄し、１５分間室温
に放置した。プロテナービＫを０．１×充填緩衝液（１
×充填緩衝液：５０ｍＨＴｒｉｓ −トＩＣｊ！
ｐＨ７，４、１ＨＮａＣｊ！ 、１＋ｎＨ［Ｅ
ＤＴΔ、０．２％５ＤＳ）に最終濶磨１ｍ９ ／ ｄに
なるＪ、うに溶解した。カラムをついで滅菌０．ＩＨＮ
ａＯｔｌ、次に滅菌水で溶出液のｐｌ＋が８になるまで
洗浄し、最少に１×充填緩衝液１０ＩＩｆで洗浄した。 滅菌水５００μｌに再懸濁した全１’＜ Ｎ八を４．５
威の充填緩衝液ぐ希釈し、６５℃（水浴）に５分間加熱
し、調製オリゴ（（Ｉ Ｔ ） −レルロース力ラムに
充填した。溶出液を集め、６５℃に５分間再加熱し、カ
ラムに再充填した。カラ１１を７ｄの充填緩衝液で洗浄
して、ｐｏ＊ｙＡ ＲＮＡを洗い出した。各１−の分
画を集め、各分画の００ を測定した。ｐｏｚｙ
Ａ”ＲＮＡは５ｍｌの滅菌水で溶出した。ＤＯｊ！Ｖ
ＡＲＮＡおよびＰｏ１ｙ Ａ＋ＲＮ△はいずれも
、０．３）Ｉ ＮａＡｃからエタノールで、−２０’Ｃ
に一夜おいて沈殿させた。 １−（Ｌ Ｚと相同な混合配列のオリゴヌクレオチドの
２個のプールを固相リン酸１−リエスデル法（２０）で
合成した。ヒトリゾチーム蛋白ｉ （２１，２２，２３
）のＮＨ２末端からアミノ！ｌワ残基６３〜６Ｂ（Ｔｙ
ｒＴｒｐ Ｃｙｓ Ａｓｎ ＡＳｐ Ｇｊ！ｙ）
の配列を１７−マーオリゴヌクレオチド混合プローブＥ
ｉ−ＯＮ１９の（１１１築に選択した。Ｅ ｉ −ＯＮ
１９プローブは次のような１６個の混合オリゴヌクレ
オチドからなる。 ｓ’ （弓寸Ｔ：ＣＡ ＣＣＡ含ＴＡ３’ヒトリゾチー
ム蛋白質（２１，２２，２３１のＮ Ｉ−１２末端から
アミノ酸残塁２６〜３１ （Ａｊ２ａ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｍｅｔ
Ｃ’ｉ／５ｌｅｕ）の配列を１７−マーオリゴヌクレ
オチド混合プローブＥｉＯＮ２０の構築に選択した。 Ｅｉ−ＯＮ２０プローブは次に示すような３２個の混合
オリゴヌクレオチドからなる。 ５’ Ａ含ΩＣＡ ＣＡＴ ＣＣＡΩＴＴ 、！ＧＣ３
’ｂ）ブライマー延長解析 Ｕ −９３７ＩＩ胞系から単口されたｍＲＮＡについて
ＨＬ Ｚ ｍ ＲＮ Ａの存在を、ブライマー延長法
で解析した。Ｅｉ−ＯＮ１９またはＥ ｉ −０Ｎ２０
．１００ ＩＩ ９を、７０ｍ１４ Ｔｒ ｉ ５−
１−１ｃｉｐｌ＋７．６．１＋ｎＨｔｖ１ｇｃｊ！
、３０．ｃｚｃ ｉの（γ−”２Ｐ） ＡＴＰ （５，
０ＯＯＣｉ ／ｍｍｏｌ、Ａｍｃｒｓｈａｍ ＰＢ、２
１８ ） 、１００１１９／ｍａｌ ＢＳＡ。 １００ｎ＋ｔｌ ＤＴＴ、１ｍＭスペルミジンおよび
２〜４単位のポリヌクレオヂドキナーぜ（ＮｅｗＥｌｌ
（ｌｌａｌｌｄ ＢｉｏＬａｂｓ ）を含有する反応混
合物２０μｌ中、３７℃で６０分間、５′末端を標識し
た。 反応は、混合物を７０℃に１５分間加熱して停止させた
。 ブライマー延長反応は、５０ｍ１４ １−ｒｉｓ −ト
ＩＣｊ！ ｐＨ８，３、１０ｍＨＭ＜＞Ｃ’ｆｔ
２ 、 １ ０ｍＨＤＴＴ１４ｍＨピロリン酸す１
−リウム、１．２５ｍＨｄＧＴＰ、１．２５ｍＨｄＡＴ
Ｐ、１．２５ｍｔ４ｄＣＴＰ、１．２５ｍＨｄＴＴＰ、
ｕ−９３７１１１胞系から単離されたｍＲＮＡ１５０
ｎｏｂ’ｉ ＱＪ Ｉ票識した Ｅｉ−ＯＮ１９ ま
た は Ｅ １−ＯＮ２０ 、４０ｎｑＪ３よび
逆転写酵素（１３Ｉｔ ｆ−） ２００中位を含む反応
容量４０ Ｉｌ、ｔ２中、／１２°Ｃｒ Ｇ Ｏ分聞実
Ｍ’ｑ Ｊ ６ 、、反応は５０ｍＨＦｌ）ｌ’△５０
μｍを加えて停止１させ、ついで「）ＣＩで抽出し、１
クノールにＪ、り沈殿さける。ブライマー延長の／ｌ成
物は遠心分店ににつてベレツ１−化し、乾燥し、９０％
の１１１２イＡン化ホルムアミド、１０％の１０Ｘ Ｉ
ｍｌ、 ０． ”１％−１ニシレンシアノール１「
おＪ、び０ 、１ ′、Ｙ＋ブ１−ＩＬフ１ノールブル
ーからなる染色ホルムアミド溶液に溶解する。 各リンプルから１０μ！ ’ｊ−５％アクリルアミド／
８８尿拳グルにＣ１（ｊｉ Ｌ／、２ ｌｌ’ｌ ｌ：
’Ｊ １ ｂワラ１−で°市気ｉＡ４すＪを行う。ゲル
を乾燥し、Ｋｏｄａｋ Ｘ−０ｍ、Ｉｔ＋ｃｃａｓｓｃ
ｔｔｃ Ｃ−２１＋Ｋｏｄａｋ Ｘ−Ｏｍａｔ ＲＰ
Ｘ線フィルムに暴露する。この実験の結果は第１図に示
す。 両ブライーンー、Ｅ ｉ −ＯＮ １９Ｊ３Ｊ：びＥｉ
ＯＮ−２０はＩＩＬＺ ｒｒ＋ＲＮＡに相補的なので
、Ｉｆ １．７ ｍＲＮΔ鋳型上、逆転′８酵索によ
るこれらのブラーマーの延長特責的生成物の検出が期待
でさる（２４１．、ＩＩＬＺ ｍＲＮΔの長さは未知
Ｔｅアったので、合成１） Ｎ Ａの良さは予測できな
かった。 しかしｈがら、以下の事柄、プライマーＬＥｉ−ＯＮ
１９ Ｌ；口Ｉ Ｌ ７ ｍ ＩＩ Ｎ Ａとアミノ
酸残！＋４６３〜６８を］−ドする領域内で結合するこ
と、換言ずれぽ合成されたｌ） Ｎ Ａの長さは少なく
とも２０３ｂＨＸ （Ｘはリーダー配＋１１および５′
非昭９領域に属するスクレＡチドの数である）と考えら
れることが明らかにｂつだ。同じ計ｑをブライマー、ｃ
ｒ −０Ｎ２０について行うと値は９２ｂｐ−＋−Ｘ
となる。したがって２１１！！１のバンドを良さに１１
１ ｂｐの差があることになる。第１図に示す結果から
、ブライマーＥｉ−ＯＮ１９で合成された最も強力なバ
ンドは約２９０ｂｐ、プライマー［１−ＯＮ２０から合
成された最も強力むバンド１．１約１７５ｂｐである。 その差１１５ｔｌｐは予測１的にきわめて近似し、（ノ
ー９３７細ｊ泡系からｔｔｔ ！ｌ！Ｉｔされたｍ Ｒ
Ｎへの分析用プレパレーシニ」ンＬ；Ｌ ｌ−Ｉ Ｌ
Ｚ汀１１≧ＮΔを含イｊすると結論された。 第−鎖ｃＤＮＡの合成は、５０ ｍＨｌ−ｒ ｉ ｓ
−ＩＣ１ｐＨ８，３，１０ｍＨＭｏＣｊ！ 、１０ｍ
ＨＤＴＴ、４ＩＩＩＨビロリンＦｋｌｌ−リウム、１．
２５ｍＨｄＧＴＰ、１ 、２５ ｍｕ ｄ Ａ −Ｉ
’ Ｐ、１ 、 ２５１！１Ｈｄ Ｔ Ｔ Ｐ、０．５
ｍＨｄｃｌＰ、（α−３２１） ＞ｄＣＴＰ （３，０
００（〕ｉ ／ｍｍｏｌ、Ａｍｃｒｓｈａｍ。 ＰＢ、１０２０５） ２０ ＩＩ Ｃｉ 、 Ａリボｄ
（１’ ） １８ （Ｎｅｗ［ｎｇｌａｎｄ ８ｉｏ
Ｌａｂｓ ） １００１１”、ｉ／ｌｅ１． ＬＪ−９
３７Ｉ［Ｉ胞系から単離されたｐｏｌｙ Δ°［＜Ｎ
Δ４０〜１００μｇ／ｗｌおにび逆転’ｒ’ Ｍ ｄ＝
（Ｅ３ ＲＬ ） ２５Ｏｔｔｔ位を含有する反応容
量５０μ矛で実施する。 反応は４２℃で６０分間行う。５Ｑａ＋ＨＥＤＴ△５０
μｌを加えて反応を停止さけ、反応の９成物をＰｃｔで
抽出する。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを２８ＭＭアン
モニウムからエタノールににす、−２０”Ｃで一夜放置
して沈殿ざＵる。合成された第−鎖のｈｌは１ＣΔ不溶
性放ＱＪ ｍを定石して測定りる。１回の反応で、通常
、単一鎖ｃＤＮΔ２００・〜３００ｎｇが１ｕられる。 第二鎖の合成には、甲−鎖ｃＤＮΔを遠心分離してベレ
ット化し、８０％］クノールで洗浄し、乾燥し、適当量
の蒸留水に溶解した。５ｓｃＤＮＡを二重鎖ｃ ｌ）
Ｎ△（ｄ ｓ ＣＬ） Ｎ Ａ ） ニｌａ＄ ’Ｊる
には、５００ ＋＋ｇまでのＳ Ｓ ＣＩ） Ｎ Ａを
２０ｍＨ”ｒ’ ｒ ｉ ５−ＨＯｊ！＋＋Ｉ１７．５
．５ｍＨＭＱＣＪ！ 、１０１Ｈ（Ｎｌｌ ）
Ｓｏ 、１０ｎ＋ＨＫＣｊ！、０．１５ｉＨβ−ＮＡ
Ｄ、５０μｆｆ／ｍ１の１３ ＳΔ、ｄ Ｎ Ｔ Ｐ
ｓ ４０ ｔｔ Ｍ 、 １日、ｃｏｌｉ ｌｌＮａ
５ｃＩＩ （ＢＲＬ ”） Ｂｔｎ位／ ｍＱ 、 Ｌ
） ＮΔボリメラーＬ”１（Ｎｅｗ ［ｎｑｌａｎｄ
ＢｉｏＬａｂｓ）２ ３ ０ ＋１ｉ位／ｄ。 （：、ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーｔ （ｆｌｅｗ Ｉｎ
ｔｊｌａｎｄＢｉｏＬ、ａｂｓ ） １０甲位／Ｍ１を
含ｆＴする反応容量１００μｌ中で処理することができ
る２１反応混合物をついで、１２℃で６０分間、２２℃
で６０分聞インキュベー１・する。反応はＥＤＴΔを最
終濃度２ＱｍＨになるようにｆ’Ｐ ＋ｌ： Ｔる。ｄ
ｓ ｃ Ｄ Ｎ Ａ ＧマＰｃｔで抽出し、上述のよ
うにして沈殿さ゛する（１５）。 Ｌ＋）ｄ ｓ ｃ Ｄ ＮΔのり１］−ニング低形質転
換バックグラウンドをイｊするり［Ｉ−ユングベクター
は次のようにし−Ｃ装ｊΔする。１ＤｔＪＣ９プラスミ
ドＤ ＮＡ３００ μＪをｐｓｔｌ制限エンドヌクレア
ーピで完全に明所する。消化されたプラスミドｌ） Ｎ
八をアガロースゲル電気泳動ににって精製し、電気溶出
し、エタノールで沈殿さＵる。アガ■−スーゲル粕装ベ
クター；よ形ｔ′１転換実験中に１・〜２」Ｌに一／ｎ
（Ｊ生成し、スーパーコイルｐＵｃ９での形質転換効率
はプラスミドＤＮＡ１ｎａあたり約２．０００〜４．（
’）００：１１に一であった。 かくして１１１られたＣ） ｊＪ Ｃ９プラスミドＩ）
Ｎ八をついで、１００ｍＮカー１ジル酸ノ」リウムｐ
Ｈ７，５、２ｍｌ Ｇｏ（１！２．０．２ｍＨＤＴＴ
、０．９ｍＨｄＣＴＰ、（５−３Ｈ） ｄＣＴＰ （１
９０ｉ ／ｍｍｏｌ、＾ｍｃｒｓｂａｍ、 ＴＲＫ、
３５２）ｓμｃ ｉ 。 ８ＳΔ５ ｍｇ／ ｍｌ、ＰＳｔ［切断ｐＵＣ９プラス
ミドＤＮＡ２８μＥＦ Ｊｊよび末端トランスフエラー
ピ（Ｉ）ｌ−Ｂｉｏｃｈｃｍｉｃａｌｓ） ４５甲位を
含む反応容重５０μｌ中でディリングを行った。反応混
合物を２２℃で５分間イン−１ユベートし、２５ＩＩＩ
ＨＥ ｌ） ＴΔ５０μｌを添加して反応を停止させ、
ついて・７０℃で１５分間インキュベートした。これら
の条１′１下に、最大の形質転換効率に必要な長さの２
２ヌクレＡチドを各３′末端に伺加する。 ｄ ｓ に ＯＮへのｄ Ｇ Ｐ Ｔによるティリング
は、約１１００ｎのｄ Ｓ ＣＤ Ｎ Ａを各反応あた
り、末端トランスフエラーピ３０単位により、３７℃で
３０分間処理したほかは類似の条イ′１下に実施した。 ２５１ＨＩＥＤＴ△５０μｌを添加して反応を停止さけ
、７０℃で１５分間加熱して不活性化した。 ｄ Ｃ−ｒ ＰでティリングしたｐＵＣ９ベクターＤＮ
ＡににるｄＧＴＰティリングｄｓｃＤＮΔの分析用アニ
ーリングは、１０ｍＨ王ｒ ｉ ｓ −１１Ｃｊ！
Ｆ１１Ｉ７．５、ｉ＋ｎＨ［ＥＤＴ△、１５０ｍ１４Ｎ
；Ｉ ＣＩを含有する溶液５０μβ中、５ Ｅ’ｐ℃
で・１２０分間行った。ｄ ｓ ｃ Ｄ Ｎ Ａどベク
ター１）ＮＡの比を変えて、添加ｄ ｓ ｃ Ｄ Ｎ
Ａ ｆＩｉ泣市呈あたりの１１ノられるクローンの最大
数を求めた。 ＣａＣｆ２．Ｊンビデンｔ−Ｅ、ｃｏｌｉ ＩＩＲＩ
ｌｌ胞（１９）の形質転換は、これらの細胞１００μ夕
をアニーリング反応混合物５０μｌと混合し、ついでア
ンピシリン５０μ’Ｊ／ｄ含イｉ ｔ、 ｎプレー１−
りで平板培養した。１４人数の形°ｌ′４転換体を′ｊ
えた；’ａ１合を用いて大規模実験を（ｊい、最終的な
ＣＤＮ△ライブラリーを確立した。ｄ ｓ ｃ Ｄ Ｎ
Ａ Ｅ） Ｏｎりを用いて約２０．０００個の独へ″
ｌしたクローンが１１：成した。 ｃＤＮＡライブラリーを、全ｌ−Ｉ Ｌ ／ ｎ仏子ま
たはフラグメントを含む陽性形質転１％体に″ついてス
クリーニングした。ＣＤＮ△ライブラーは最初コ［に−
ハイプリダイゼーシ］ンによりスクリーニングした。陽
性と思われた形質転換体はざらに、ドツトブロワ１−解
析によってスクリーニングした。 形質転換体はＬ Ｂ ＋アンピシリン（５０Ｈｇ／Ｉｄ
）プレー１−上、３７℃で一夜生育させた。ついで、コ
ロニーをニトロヒルロースろ紙（０，４５μｍ ％５ｃ
ｈｌｃｉｃｈｅｒ ＆ ５ｃｂｕｅｌｌ）上に移した。 プレー］−およびろ紙の両とを、陽性形質転換体の同定
が可能な方法で標識した。プレート上に注意深く冒いた
ろ紙を′ｆｉ！温（ＲＴ ）に２０分間放置し、とり−
Ｌげ、０．５８ Ｎａ０Ｉｌ／１．５８ ＮａＣｊ！飽
和３８Ｍろ紙（３８８Ｃｈｒ ＷｈａＬｍａｎ ）上に
置いた（ １ｉＪ 、１： 層コロニー）。１５分間イ
ンＶユベートしたのら、ろ紙を乾燥３８Ｍろ紙に移して
過剰のＮ ａ ＯＩ＋を除ムし、あらかじめＩＨＴｒｉ
ｓ−ＬＩＣＪ！ ｐＨ７／１．５８ ＮａＣｊ！で湿
潤さまた３８Ｈろ紙上に３弁開放置した。次にろ紙を３
×ＳＳＣ中に２０秒間浸し、風乾し、８０ ’Ｃｒ ２
＋１．’ｉ間乾燥した。かくして得られたろ紙を３Ｘ
ＳＳＣ１０，１％ＳＤＳ （Ｓｅｒｖａ ） 、１０ｍ
１４ Ｅｌ）−ｌ−△含有ｖａ衝液中穏やかに攪拌し
ながら６１５℃に一定ｉ９いて湿潤させた。緩衝液は数
回とりかえた。ろ紙上に肉眼で細菌コロニーの痕跡が検
知でさなりｌｆつだとき、前湿潤は完全と考えられた。 洗浄自ｊ！２に、ろ紙を６ＸＳＳＣ，１Ｘダンハルｌ−
溶液、０．５％Ｓ Ｄ Ｓ 、変性ウシ胸腺Ｄ ＮＡ（
Ｓｉｇｍａ ）１００μｇ／ＩｎＩ！、、０ 、０５％
ビ［」リン酸すトリウム含有溶液中でプレハイブリダイ
ズした。３７゛Ｃで３時間インｌユベートしたのｔ）、
ろ紙を（３Ｘ５ＳＣ１１×ダンハル１〜溶液、酵ＩＩＩ
ｔ ＲＮ Ａ（ＸＸ型、Ｓｉｇｍａ ） ２０１１ｇ
／ｍ（１，０、５′、′＜、ビ１１リン酸す１〜リウム
、カイネース四（埋１７−マーＥ ｉ −ＯＮ １９ヲ
２（ｒ’Ｊ ロｉ’ＦＮ＆中、（Ｔ ”２１））へＴ
ｌ）標識１７−マー［ｉ−ＯＮ １９ど、３７゛Ｃで
一夜ハイブリダイズした。カイネース反応（よ１列３に
記載されている。バイブリクイピーシ三１ン（（、ろ紙
を６ＸＳＳＧ、０．５％ビロリン酸ツノ１〜リウ中ＲＴ
で５分間３回、３７°０で３０分、４７°０で１０分Ｊ
３よびう）：３℃Ｃ１０分く任意）、洗１吊した。つい
ぐろ紙を風乾し、Ｏｕ ｐ ｏ ｎ を増感スクリーン
を用い、−７０”０で２４時間、Ｘ線フィルＡ（Ｘ−Ｏ
ｍ ａ ｔ ＲＰ 、 Ｋｏｄａｋ ）に：α露した
。−） −１’ ／Ｉｚムを現像して、バックグラウン
ドより強いジグノールが疑われた４８個の＝１０ニーを
選び、さらに解ｖｉシた（ドツト−プロット解Ｊｆｉ）
。 ｂ）ドラ１−−ブロツｌ−解析 ３０１１９ ／ ｍＱのアンピシリンを含むＬ Ｅ３の
１ノンプル２ ｔｎｆｌに、選択された４８叫のコロニ
ーを接種した。ＪＲｌ液を３７℃で激しく旧痒して一疫
牛合さＵた。ＤＮＡプレバレーシコンはＢｉｒｎｂｏｉ
ｍ ＆ＤＯＩＶ（２５）の方法で得られた。各１”）Ｎ
Ａブレパレーシ３ンを水６７．５μ夕中に懸濁した。４
ＮＮＦｌＯｌ１７．Ｅ）１１ｆｔを加え、水浴中６５℃
で１時間イン−１゛コベートした。リンプルを氷上で冷
）」１し、’ｌ 、５８ ＨＣｊ！２０μｍ Ａ３よび
２ＸＳＳＣ１９５μｌをそれぞれ加えた。各リンプルの
総容量は２９５μ！であった。その一部１４５μｌをＢ
１０−ｏａｔ ｇ置（Ｂｉｏ−１ｔａｄ ）によりろ過
し、ＤＮＡを２ｉ＋ａの二ｌ−ｒ、ｌセル［１−スフイ
ルクーに固着さＵた。 ろ過＋”＋Ｉ′Ｉに、ニトロヒル［ｊ−ス１，１あらか
じめ２ＸＳＳＣ中に２０分間浸漬した。ろ過１！／、ろ
組／！−１：ｒ！＋乾し、８０’ｆ；て” ２ ＋１Ｆ
ｉ間乾燥した。一方のろ爪１よ〈γ−３２ｒｉ ＞Δ１
−１）標識［−１−ＯＮＩりの１７７−と、他方は（γ
−３２Ｐ）ΔＴ ＋） ＋！冒みｌ−１−ＯＮ２０の１
７−マーとハイブリダイズした３、ハイブリダイげ−シ
コンＪｊよびＡ浄の条１′１は例ｉ ｊンｉ】に記載し
たとおりである。ろ紙を−７０１：で（３１１，’１問
、Ｋｏｄａｋ Ｘ−Ｏｍａｌ ＲＰ Ｘ Ｉ！＋！フィ
ルｌイに！Ｊ（露した９゜陽性ハイブリグイぜ一シ」ン
シグＪルを産生した６個の］〔に−を同定し、元の形質
転（受体を１） １１ １ ２ 、 Ｆ） Ｈｌ
−８、ｏ ＬＩ Ｌ １ ／１−１ 、ｐＬ
Ｉ １２１ 、Ｄ １１ Ｌ ２３ ＪりＪ、びｒ）
Ｉｔ １．３５と命名した。選択されたコロニー中のＣ
ｌ） ＮΔ挿入体の大きさは、制限解析にＪ、って計価
しＡ： 、、 １３ｉｒｎｂｏｉｍ＆ Ｄｏｌｙのｈ゛
法で１テ１られた上記ＯＮ△を１３８ ｍ １１１Ｊｊ
Ｊ：びｌ１ｉｎｄ■で消化し、０ 、８％ ／ツガ目
＝スミニゲル上、４峙間（１５０Ｖ）泳ｆ）＋さけた。 ／ラスミドＤ Ｉ−Ｉ Ｌ １ ’Ｉ −１、Ｆ） Ｉ
−１１−２１Ｊｊ Ｊ、びｐｌＩＬ２３ｔよ５００ｂｐ
のｋさの１中人体をイｉす３、Ｄ ＨＬ ２ Ａ３ Ｊ
、びＤ ＨＬ ８の挿入体は３００ ｈｐである。 陽性クローン（例５ｂ）を消化したＭ ｌ−１／Ｉ −
１は約５００ｂｐ良のＣＤＮΔＤＮＡを金石し、ざらに
詳細な解析を行うために選択されＩこ。１１シＺｃ ｌ
） ＮΔの構造を第３ａ図に示す。 ｐＨＬ−１４〜１プラスミドＤ ＮＡ２００μびを１３
：）ｍ Ｉｔ ｌ Ｊ：ＡＣは１ｌｉｎｄ［Ｉ［制限
エンドスクレアーピで完全にＡ１化し、５′末端を（γ
−３２１））Ａｌ１）（ＶＩＩ３ｂ）で標識し、ついで
第二の一■ンドメクレアーピで分解しｔこ。単独に標識
されたＤＮＡフラグメン１〜をポリアクリル７ミド、１
．たは／ガ］゛１−スゲル電気泳動で分離した（第３３
図）、。 標識１） Ｎ△は電気溶出にＪ、って回収し、ついてＨ
ａｘａｍ Ｆｔ Ｇ１１ｂｃｒＬの方法（２６）による
配ｌＩｌ ’１８ 析に付した。第３ ｂ図の上の矢印
はこの方法に」、って１ｊつた配シ１１解析の／ｊ向Ｊ
ｊ 、Ｊ、び範囲を、６．を印はビニ１識部位を示１゜ ｐ ｌ−Ｉ Ｌ １４−１ ｃ Ｉ） Ｎ Ａの内部部
分はｓａｎｇｃＨ）方法（２７）によって配列を調べた
。ＨＬ ＺＣＤＮΔを含むＤＩ（ＬＩ４−１の［３ａｒ
ｒＮ−１１−Ｈｉ ｎ ｄ ｌｌ制限フラグメントをＭ
ｎ１１制限１ンドヌクレアーぜで部分Ａ１１化し、末端
【よｏａｎｉａ口Ｓらの方法（２８）ににすにｌｃｎｏ
ｗポリメラーＵでプラント末端とし、３ａｍｌ′Ｃ−切
断したＭ １３ ｆｖｌ Ｉ）≦）中に９１−゛１−ン
化した。Ｍ１３にＪ、るＩＪべてのｌ） ＮΔ操作むら
びに配９＋１決定はへｍｃｒｓｈａｍのパンフレットゝ
″Ｍ １ ３ ｃｌｏｎｉｎｇ ａ＋ｏｌ ５ｅ
ｑｕｅｎｃｉｎＣ）ｌ＋ａｎｔｌｂｏｏｋ″ ｋ：１］
確に従って行った１、り１１−ン化し、このＩＪ法で一
配ＩＪ１１決定した制限フラグメンｌ−ｔよ第：３１）
図（トの矢印）に示・ｊｏりｒｉ−ンｌ１ｌ−１／ｌ−
１には問題の＆Ｉ＋限部位の荀１ｖ（を指示する。、［
ンドメクレア−ＵＭ ｎ １１ 、 Ｍ ｉｌ ｅ Ｉ
ｌｌ Ｊｊ Ｊ、びＩｔ ｉ ｒ）Ｉ’ ｌにス・１り
ろ１．Ｒ点部（ひの存在は実験的に賄；、Ｒされた１゜
１） Ｎ△配％１１決定の結末は第４図に承す１．読み
ｆｒｙり枠はメクレＡ’ｆド２０の１−ンＡこの１１１
／ＣＩ） Ｎへ中にシめら七しろ。メクレＡｆｌ・６２
・〜・４５１は、じ１ヘリゾブー−１，のアミノ酸配り
１１（第１）図）に１１確に一致し、次に翻訳停止］ト
ン−［Δ△が続＜、１／ＩＩＲ，Ｉの１とし−（疎水性
のアミノ酸＝５′１１ ｃ Ｖ ａ Ｉｔ ｌ−ｅ
ｕ Ｇ １ ｙ Ｉ−ｃ ｕＶ Ｑ ｊ７ １
（３ＬＪ ｌ（３ＬＪ ３ ｅ ｒ Ｖ ａ １
’ｌ ｈｒ Ｖ ａ Ｉ Ｇ ！ ｎ Ｇ Ｉ
Ｖ Ｉ−ｙＳ５′ Ｖ ｌ １等を］−ドするヌクレＡチド２０〜６１は、
他の分泌蛋白質（２９）に類似するＩ−Ｉ Ｌ Ｚリー
ダーまたｔよシグプルペブブドの部分をコードする。ヒ
トルリゾブー−ムのスプライスジ−フンクシ三１ンのア
ミノ酸組成は鶏卵白リゾデームのそれときわめて類似す
る（ヒトプレリゾデーム： Ｇ １ ｎ Ｇ １ ｙ
Ｌ Ｖ Ｓ Ｖ ；１ ｊ！に対し鶏卵白リゾブーム
： Ｌ ｅ ＬＪＧｊ！ｙｌ−ｙｓ Ｖａｎり （１
４ｅｉｓ−ｍａｎ、 １．、 Ｓ、ほか：Ｊ、Ｂｉｏｌ
、Ｃｈｃｍ、、 ２６１ ： ２３０９〜２３１３．１
９ ８ ６ ） 。 例７ ： ｐＩｌｌ １４−２３の構築ＩＩ Ｌ Ｚを
製造するための発現プラスミドの構築にｔよ、ＩＩＬＺ
Ｉ小人体の最長５′末端（り［ｌ−ン１１ Ｌ １４−
１ 、プラスミドｐｌ−ＩＬ１４−１）をＩＩ Ｌ ７
１ｉｆｉ人体のｂｉ長３′末端（クローンＩＩ １２３
．７ ラ’：）、 ミドｌ） ｌ−Ｉ Ｌ−２３） ト
結合すｔ！Ｊ、：（例５ｂ）。 Ｄ ｌ−Ｉ １２３の１１ＬＺＤＮΔの３′末９１１：
は次の配列を右する。 ＰｓｔＩ １０ ２０
３０ ４
０Ｇ入ｑゴ工匹ンｙ２τＧ ＣＴＴＴＧＣＴ
ＧＣＡ ＡＧＡＴＡＡＣＡＴＣＧＣＴにＡＴ
ＧＣＴＧＳｏ ６０
７０ １１０
ＴＡＧＣＴＴＧＴＧＣＡＡＡＧＡＧＧＧＴＴ
ＧＴＣＣＧＴＧＡＴＣＣＡＣλＡＧにＣＡＴＴλＧＡＧ
ＣＡＴＧＧ ＧＴＧＧＣＡＴＧＧＡ
ＧＡＡＡＴＣＧＴＴＧ ＴＣＡＡＡＡＣＡＧＡ
ａｅＩＩＺ ＩＪＱ Ｌ４０
ＬＳＯ１６０ＧＡＴにＴＣＣＧ’ｒＣＡＧＴＡＴ
にτＴＣＡ ＡＧＧＴＴＧＴＧＧＡ
ＧＴＧＴＡＡＣＴＣＣＡＧＡＡｍＴＣＣＴＴＣＴＴ
ＣＡＧＣＴ ＣＡＴＴＴＴＧＴＣＴ
ＣＴＣＴＣＡＣＡＡでａｅＩ１１ ．２１０ ２２０
２コ０ ２４
０ＴＡＡＧＧＧＡにＴＡ ＧＧＴＴＡＡＧＴＧＡ
ＡＡＧＧＴＣＡＣＡＴ ＡＣＣＡＴＴＡＴＴＴ
２５０ ２６Ｇ ＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ ＧＧＧＧＧＧＧＣＧＧ
３’ｒ） ｓ ｔ、１部位ｊ；での５′末端
（第４図）ｔよりｌ１ｌ−１４−１のｌ） Ｎ Ａ配列
に相当する。 ｐ ＩＩ １２３約１μびを３６℃ｒＰｓｔｌおよび１
１ｉｎｄｌ［Ｉににり消化しテ（５０ｍＭ −１’ｒ
ｉ ｓ −１１Ｃｊ！ ｐＨ８，０，１ｍＨＭａＣ
ｌ 、５０ｍＮＮａＣ１，１％？ガロースゲル中で分
離した。 Ｄｒｃｔｚｅｎ、 Ｇ、の方法（Ｄｒｅｔｚｃｎ、 Ｇ
、ほか： Ａｎａｌ。 Ｒｉｏ＜：ｈｅｍ、、 １１２ ： ２９５〜２９Ｂ
、１９８１）によりアガロースゲルから単離した２ ６
Ｏｂｐ艮のＩ’ｓ ｔ Ｉ／ｌ−ｌ ｉ ｎｄ ［［
フラグメントは、ＨＬ Ｚ構）ΔＭ ｌｚ；子の３′末
端を含有づる。このフラグメント（約５００ｎ（Ｊ）を
、ｐｌ−１１−１４−１からの１９０ｂｔ＋ Ｐｓ
ｔ、 ｌ、／ＩＩ ｉ ｎｄＤ１フラグメンＩ−の分離
ｉｔ＋１ｌｌ−１ｆｌ １ （約５０ｎ（１）中で結
合させた。 １） ＮΔの結合は、リゲーシ”ｉンＭＶｊＪ’ａ （
６６ｍＭ丁ｒ ｉ ５−Ｉ−１ｃｊ！ １）１１７．
６．６．６１１１８ＭＱＣｊ！ 、１０ｎ＋ＨＤＴ−
ｒ、１ｍＨｒΔ−１’ Ｐ ）Ｊ３ Ｊ、σ−ｒ ／Ｉ
ｌ） ＮΔリガーピ１中位中、１４℃で一汝、２０
ｕ ｆｌ ｉＩａ合物として実施し、このリゲーシ］ン
混合物を公知方法（Ｈａｎｉａｔｉｓ、 ｒ、ほか：Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏ１ｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ １ｌａｒｌ）ｏｒ Ｐｒｅｓｓ。 ３２２０、１９８２）でのＥ、ｃａｌ ｉ Ｉｌ［３
１０１のコンビテン１〜細胞の形質転換に用いた。 結合 使用した出発原石は、ΔＤＩ−Ｉｔブ１１シークーを１
、５ｋｂＬ％Ｂ ａｍｌ−１１／Ｘ ｈｏ Ｉフラグ
メン１〜どして含有するｐ Ｕ Ｃ１８、Ａ導体Ｆ）
Ｉ： Ｓ １０３とした。ｐＢＳ １０３（１）変ワリ
ニ、ＹＩ’Ｅｃ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）し同様に（
八ｍ１ｌｏｒ（！ｒ。 Ｇ、：ＨｃＬｈｏｄｓ ｉｎ ｒｎｚｙｇ＋ｏｌｏ
ｇｙ、 １ ０１ ： １ ≦３２−２０１．
１９８３）使用できるａＸｔ＋ｏ［部位のＧ、Ｔかに、
ｐｓｊｌＪｊよび１ｌｉｒ１ｄｎ１部位があり、したが
って、大部分のα因子リーグーを３む。 ｐα１：からのα因子迫伝子の２５０ｂｐ長１−４ ｉ
ｎｄ ｉｌｌ／ｐｓ ｔ Ｉフラグメント−（第７図
１よｐ［５１０３のＨｉ ｎ ｄ ｌ［ｌとＰｓｔ１部
位の間にリゲー１〜できる。 Ｉｔ ｉ ｎｄ ＩＩＩ／Ｐｓ ｔ Ｉフラグメンｌ−
のＤＮ△配列は、α因子リーダーとともに公表されてい
る（Ｓｉｎｇｈ、 八、 【よか ：Ｎｕｃｌ、＾ｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ、、−コー１（１２）：４０４９−（
５３，１９８３）。 この［」的には、１μＵのｌ） Ｅ Ｓ １０３および
ｐｃｒＦ５μｙを５ＧｍＨｌ−ｒ ｉ ５−１−１ｃｊ
！１）＋１８．０、Ｉ ＱｍＨＭ（ＪＣＪ！ 、５０
ａ＋ＨＮ ａ Ｃｐ中、３３６℃で１ｌｉｎｄ［ｌおよ
びｐｓｔｌで完全に演化し、上述したと同様にして（例
７）ｐ１ヨＳ １ ０３ （Ｉｆ ｉ ｎｄｌ
ｎ／Ｐｓ ｔ ［） 約５００ｇＪ３ 、Ｉ
び ｐ α １” （Ｈｉ ｎｄ ［［
／Ｐｓ に Ｉ ） 約 ５００ｎｇを用いて
リグ−１−シた。生成したプラスミドはｊ、ｃｏｌｉ
ＨＦ３１０１を形質転換し、α因子リーダーをΔ１）
ＩＩＩプロモーターに対して正しい方向性で含有し、Ｄ
ＷＳ−２０５０と命名された。 Δ０１１１ブ［ｌ′ＩＥ−ターとのスプライスジャンク
ションにＪ３いて２５ｂｌ）のα因子リーダーとＡ １
− Ｇ聞！Ｉｆｆ ］トンを欠くが、これはホスホトリ
エステル法で合成された４０−マーで置換された（Ｅｆ
ｉｍｏｖ、 Ｖ。 八、ばか ：Ｎｕｃｌ、 八ｃｉｄｓ Ｒｃｓ、、
１ ０ ： ６６ ７ ５〜９４．１９８２）。 この目的には、ｐｗｓ ２０５ Ｄを５０ｍＨＴｒ ｉ
５−ＨＣＪ！ ｐＨｓ、 Ｏ１ｉｏｍ＋１ＭｇＣｌ
、５０ＩＩｌ！Ｉ ＮａＣ１中、３６℃にＪ３いて、
Ｘｈｏ ＩおよびＰｓｔＩで完全に洞化した。 ＸｈＯＩおよびｐｓｔｌ末端を与えるオリゴヌクレオチ
ド をＸｈＯＩ−Ｐｓｔｌ切１１７ｉ ｐＷｓ ２０５ Ｄ
とリゲートした。すなわち、オリゴヌクレオチドを１０
ｐｍｏ Ｉ ／μｍの両度で水に取り、２個のＤＮＡ「
１の溶１５０μｍ部を合して６５℃に１０分間加熱し、
室温に冷ｆＪＩ後、このｒＪ′ａ１μｌをリガーゼ緩衝
液中、例７に記載の条件下、リゲーション反応に用いた
。生成したプラスミドＤＷＳ−２０９Ｄはα因子のコー
ド領域の始まりまでに約１．５ｋｂｔｉｉのＡＤＨＩプ
ロモーターと完全α因子リーダーをもつ領域を含有する
。 １））ＨＬ−Ｚｍｍ壬子のα因子リーダーの結合ｐＷｓ
２０９ｆ）中のα因子リーダー配列は１−１ ｉ ｎ
＜１ ｍ部位で終わり、ｐＨｌ−１４−２３中のＨＬ
Ｚ遺伝ｒμ３′末端においてＩ−１ｉ ｎ ｄ Ｉ［１
部位と結合し５′末端にＪ３いて３ａｊ！ Ｉ部位と結
合するので、ｏｌ１１４−２３をＱｍＨＴｒｉｓ−１１
ｃｊ！ｒ＋ｌ１８．ｏ、６ｍＨＭＯＣＩ 、１５０閣
ＨＮ ａ Ｃ１１３６℃においてＳａｊ！Ｉにより完全
にｄ′１化し、突出端をＫ１６ｎＯＷポリメラーゼで充
填した（例７の場合と同様にリガーピ緩衝液中総′ｆ￥
吊２５μ１１切所ＤＮＡ０．５μ９、ｄ Ａ １−１）
、ｄ ｌ−１−Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄｃｔＴＰそれぞれ１０
０ｔｔ Ｍ、にｌｃｎｏｗボリメラーピ１単位、室温、
３０分）。プラン１〜末端化５ａ１ｒ消化生成物の精製
は１％アガ［］−スグル中で実施した。次に、合成１１
ｉｎ（オニリンカ−（Ｎｅｗ ［ｎｇｌａｎｄ ８ｉｏ
Ｌａｂｓ ）を用いてリンノノーリゲーションを行った
（ＨａｎｉａＬｉＳ。 ［、はか： Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ。 １１ａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、 ３１６真、１９８２）
、リンノｊ−（よ、水に１μＪ／μｍになるように取っ
た。 １１ｉｎｄｌ［Ｉリンカ−のキナーＬＪ処ＩＩＩ！は１
０×リンカ−キナ−ぜ処Ｉ！ＩＩ！ＦＪｆｉ液（０，６
６ＨＴｒ ｉ ｓ −１−ＩＣｊ！ ｐＨ７，９，１
０ｍｔ４ Δ］°Ｐ、１０ｍ）ｌスペルミジン、０．
１ＨｆｖｌａＣＪ！ 、１０ｍＨｌ）ｒ’ｒ、ＢＳＡ
２ＩＩＩ！Ｆ／ｄ）１μ１１リンカ−１μｌ、水６μｌ
およびＴ ４ Ｄ Ｎ Ａキナ−ぜ２単位の反応涙金物
中、３７℃で１時間実施した。＝ｌ’ Ｊ−−Ｌ’処理
１１ｉｎｄｌ［［リンカ−とのリンカーリゲージコンは
、３ａｊ！ＩＪ３よびにＩｃｎｏｗボリメラービで処理
したｐｌ−Ｉ １１４−２３約５μｌと、Ｔ ／Ｉ ｌ
） Ｎ△リノＪ−ゼ１０単位を含む１Ｘリンカーキノー
−ピ処理緩衝液中、１４℃で一夜実施した。Ｈ１７’ｒ
貞仏子が２個のト１ ｉ ｎ ｄ ［［部位が側面に置
かれた生成プーノスミドｐＳＷ２０７ＤにＪ、すＦ、ｃ
ｏｊ！１１−１ ［３１０１を形′ｄ転換した。 １μびのｐＷｓ２０７ＤをＩｆ ｉ ｒ）ｄ ＩＩＩ
Ｆ消１ｔ（５０ｍＨ王ｒｉｓ−ｌ−１にｊ！ ｐｌ＋
ｓ、ｏ、１０ ｍＮＭＱＣｊ！ 、５０ｍＨＮａＣ〕
！、３Ｇ℃）Ｌ、たのら、＋１ Ｌ Ｚ項仏子は１１ｉ
ｎｄＩ［［切断ｐＷｓ２０９Ｄ （５μ’１ ） ＋ｌ
ＮＩ ｉ ｎｄ ［１フラグメン１〜としてα因子リー
ダーの’＋’ｉ ｊｊにリグ−１−りることがでさ°た
。リガーＵ１シ応には、１ｌｉｎｄｌｌｌフラグメント
を１％アガ〔−１−スグル中で分頗１、甲離したの＃；
（Ｄｒｅｔｚｃｎはか＝１１を出）、ｐＷｓ２０７１
）約５５００りおよびｐＷｓ２０９Ｄ５００ ＋＋ｇを
リグ−ジョン緩衝液（６６ｎ＋ＨＴｒｉｓ−１ＩＣｊ！
ｐＨ７、Ｇ、６６ｉＨｆｖｌｏｃｊ！ 、１０ｍ
ＨＤＴＴ、１ｍＨｒΔＴ ｌ）およびＴ ４ Ｄ Ｎ
Ａり万−Ｌ’ １ ｊｒｉ位）からなる混合物２０μｌ
中で使用しＩ、：、、反応ｔよ１４℃で一夜実施した。 、＋−＋ １−２遺伝子をα因子リーダーまたはへＤ
ＨＩプロモーターに対して正しい方向性に含有する生成
プラスミドをＦ）ＷＳ２１５Ｄと命名した。 Ｃ）α因子リーダーと１１１． Ｚ遺伝子間の正確な変
５１−： １−１１７遺伝子の正確ξＮ末端を生成させるに髪よ、
α因子の成熟に必要なプロテアーゼ切断部位が成熟ＩＩ
Ｌ Ｚの最初のアミノ酸の配列の前に正確に位ｉｉ’
ｆ ’Ｊることが必要である。すなわら、ＣＤＮΔの構
築に由来づる過剰のヌクレオチド（約２０ｄＧ−（１０
対）ＪｊＪ、び標品トＩ Ｌ Ｄリーダー配列をコード
するヌクレオチドを除ムしな警Ｊれｉ、【ムらか′、）
ｌこ。 プラスミドＤＷＳ２１５ＤをＩ−）Ｓ ｔ、 Ｉ （５
０ｐＩｌｌ（Ｉ−ｒｉｓ−１ｔＣｊ！ Ｃｉｌ８．Ｏ
１１０ｍＭｆＶＩｇｃｊ！ 、５０ｉＨＮａＣ１，３
６℃）で完全に演化し、α因子リーダーの大きな部分と
１１１２遺伝子の５′末端を含む５００ ｂｌ）艮フラ
グメントを１％アガロースゲルから１’−ｆｉｔ した
（ ｌ１ｒｃｔｚｅｎ ＬＪか一＋Ｍｒ出） 。ｃａｒ
ｔｅｒらの方法に従イ（Ｃｉｌ「ｔｏｒ、 ｐ、 。 Ｂｃｄｏｕｌｌｅ、１１．、Ｗｉｎｔｅｒ、Ｇ、：Ｎｕ
ｃｌ、＾ｃｉｄｓ ｌ１ｅｓ、 、ニーａ：４４３
１〜４３．１９８５）、Ｍ１３ ａｍＤ１８−ａｍ４中にり１］−ン化し、［、ｃｏｊ！
ｉ ＴＧＩ株を形′ｄ転換した。 所望の方向性をもつ組換えファージ、△２を１ｎＶｉＬ
ｒＯ突然変異のための一本鎖１） Ｎ Ａの原ｒ１とし
て用いた。ｔＡ 望Ｄ Ｎ△をジデオキシ配ｌす決定の
１こめに調製した（ Ｍ １３ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎ
ｄ ｓＨｕｅｎｃｉｎｇｈａｎｄｂｏｏｋ、 八ｍｅ
ｒｓｈａｎ＋ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐｌ
ｃ。 Ａｍｃｒｓｈａｍ Ｉｔに）、１α囚子リーダーとｌ−
Ｉ Ｌ Ｚ Ｗ ７’ ＩＪｉｌに所望の変異を含む２
０−マーオリゴヌクレオブトＥＤ Ｉ １２４、ｄＬＪ
、ヒＭ １３ヘクタ−中ニ？’７：在するアンバー変異
を矯正する１７一マー選択ＡリゴメクレＡチド［１３１
２３４をホスボトリエステルン人 （ｒ：ｒｉｍｏｖ、
Ｖ 八、 はか ： Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ、、１ ０ ：６６７５・〜・０４．１９８２
）によって合成し、ベレバラテイブポリアクリルアミド
ゲル電気泳仙にＪ、って精製し、第二のＤＮＡ鎖の合成
用のブライン−として用いた。Ａリゴメクレオｆ−ド突
然変異講発ｉ、Ｌ、はぼ１ｏｌｌｃｒの方法（Ｚｏｌｌ
ｃｒ、 Ｈ，Ｊ、 ＆５ｌｉｔｈ、 Ｈ，： ＤＮＡ、
３ ： ４７９〜４８８．１９Ｅ３ ／Ｉ ）に従っ
て実施した。配列！）゛ へへＧＡＧｒＣ
ＩＧＩＣＣへ１Ｃ八八 ３゜をイ１゛りる
選ＩＲＡリボヌクレオチドＥ ｒ３＋ ２３／１．１
：）Ｏｐｍ ＯＩ によび配＆ｌＩ！）°
Ｇ６八１Ａ八八八ＧＡ＾＾ＧＯＩＣｒｔｌ（ｉ
３゜を４ｉ−Ｊる突然変安講光ブライマーＦ １３１
１２ ／Ｉを５０ｍ１（ｌ ｒ ｉ ５−１−１ｃｊ！
Ｄｌ１８．０．１０１１１１＋１’ｖ１６ｃ夕 、
１ｍＨｒ八−１−Ｐ、５ ＋ｕＨｔ） ’ｌ’ １の２
０Ｊｊ申、’Ｉ ５ ”Ｃ：でｌ”４ポリヌクレオブト
（）−−ｔＦ （Ｎ（！Ｗ ｌｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬ
ａｂｓ ） ４単１＜ｚ ｔ＝ ４５分間ホスホリル化
し、ついで７０℃に１０分間加熱した。 キナーゼ処理ブライマー各７．５０１１１０１を１０μ
ｌの１０ｍＨＴｒ ｉ ５−ＨＣｊ！ Ｄｌ１８．
Ｏ１１０ｍ１４ＭＯＣｊ！ 、５０ｉＨＮａＣｊ！中
、ＶＩ型ＲＮ八へ ０．５１１＋１１０１と１００℃に３分間加熱してハイ
ブリダイズし、ついで１時間を要して室温まで冷１Ｊ１
シた。再生した混合物を氷上で冷ＩＪ１シ、容ＩＩｌを
２０μｍの１０ｍＨ’ｒｒ ｉ ５−１１ｃｊ！ ｐ
Ｈ８，ＯｌｌｏｍＨＶｇＧｌ 、２５ｉＨＮａＣｊ！
、０．２５ｎ＋ＨｄＮＴＰ（ｄＡ−ｒＰ、（１−ｒ Ｔ
Ｐ、ｄ Ｃ−ｌ−Ｐ、ｄＱＴＰ）、０．２５報１４【
゛Δ丁１〕ぐ゛容ζ１を調整し、ブライマーをＩ／ＩＤ
ＮΔリガーＱ （Ｂ＋ｏＬａｈ！；）１０甲（ひの存在
下にＤ ＮＡボリメラーＬ’１（ＢｉｏＬａｂｓ ）の
人フラグメント１甲ｉｌｌで延１、シた。 反応は１４℃で１（３時間実施した。混合物の小１１１
９分、０．１．１ 、５Ｊｊよび１０μｍを用いて二１
ンピーｙントＥ、ｃａｌ ｉ ｌｌ［３２１５／Ｉ羽
１１泡（リプレツリーなし）の１−ランスノ１りジ」ン
ｔこ用い、細胞ローン（よＨＢ２１５５にＪ、って９え
た（Ｃａｒｔｅｒ、Ｐ、 Ｌまか ：Ｎｕｃｌ、八ｃ
ｉｄＳ １ｔｃｓ、、１ ３ ： ４ ４３１へ一
／Ｉ４／１３．１９８５ ）。 トランスノーＪクシ］ンをｂつたＤＮＡからイ１−じた
２２２個のプラーク中８４個を［Ｂ−プレー１〜十に移
し、３７°０で１６時間生１ｊ？させて感染バクテリア
のコ［に−を１１また。二ｌ−１］ １ｚルロースブ口
ツ１−を調製し、３２１）標識突然変異誘発Ａす゛ｆヌ
クレＡヂド［Ｆ３１１２４でスクリーニングした。二１
〜Ｌルル「ｌ−スろ紙は６ Ｘ Ｓ Ｓ Ｐ Ｅ（０、
９ＭＮａＣｌ、０．０６８ Ｎａ１−Ｉ Ｐｏ 、
６ｍＭ１−ｉ １） ＴΔ）中、室温で５分間前洗浄し
、ハイプリダイピーシ三１ン緩衝液ｔ ６ Ｘ Ｓ Ｓ
ｌ） Ｅ、１％５ａｒｋｏｓＶ＋（ｓ；Ｕｍａ＞ 、
ランダムに切断したｔＲＮΔ１００μＩＪ／ｍｌ中、３
７℃で１５分間ブレハイブリダイズし、ついｒｏ、４ｘ
ｌＯ６ｃｐｍ／ｄのプローブを含有するハイプリダイピ
ージョン緩衝液中、室４（２２℃）で１６時間ハイブリ
ダイズした。、ブ［１−ブは５′末端を（７−３２Ｐ）
Δ丁［）で標識した。突然変異誘発プライマーＬＥＬ３
１１２４ （３０ｒｍｏｌ）を２０ｕｌの５シｍＨＴｒ
ｉ ５−ＬＩＣＪ！ ＤＩＩ７．６．１０＋ＨＭＯ
ＣＩ 、１０ｍＭ ＤＴＴ、Ｉｍ）４スペルミジン
、ＢＳ△１００ｔ１９／ｒｒｔｌｄ３よび１０ｒｍａｌ
の（γ−３２Ｐ）ＡｒＰ （５，０ＯＯＣｉ ／ｍｍｏ
ｌ、八ｍｃｒＳｈａｍ）中３７℃において、−１−４ボ
リメクレ、４ブードキナーゼ（ＢｉｏＬａｂｓ ） ／
ｌ甲（イｌにＪ、す１１−スホリル化した。ついで反応
混合物をＢｉｏｇｃｌ Ｐ−６ｔ） （：１（Ｂｉｏｒ
ａｄ） −ｔ 、 ＴＥＢｍ、ｅＩ（１０１１１８１ｒ
ｉ ５−＝ＨＣｊ！ Ｄｔ１７．５．１ｍＨＥｔ）
ｒΔ）を用イテクＩ：１７１−グラフィーに（＝Ｊ Ｌ
、導入されなかった（γ−３２Ｐ ） Ａ Ｔ ＋）を
３２ｐ標識ＡリゴヌクレＡブトから分離した。 ハイブリダイピーシコン後、ろ紙を６ Ｘ Ｓ Ｓ Ｃ
（０，ＯＨＮ ａｃｊ２．０．０９８りＩ ンＭ ）’
ｌ−’Ｊウム）巾、室温で５分間ずつ３回洗浄し、６
×ＳＳＣ中３７．４７．５．５０おＪ、び５６°（／
’ｌ’ ５分間ずつ各１回洗浄し、各洗浄（なに、４−
１〜ラジＡグラフイーにｆ・１シた。５６℃（ＩＤ１２
°Ｃ）ｉ股のオー１−ラジオグラフィーで、突然変ｌＩ
ｌ、ｌ講発オリゴヌクレオヂドに強ツノにハイブリダイ
ズした１個のクローン、Ａ２／２５が現れた。１１［定
された突然変廊体ファージをプラーク精製し、純粋な突
！！Ｓ変責捧ファージを同定するために再スクリーニン
グし、欠失を１市ミ２りるため配列決定を行った。 クローンΔ２／２５からの二本ｔｔｌＤＮΔはＹａｎｉ
ｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら（Ｙａｎｉｓｃｌ＋−Ｐｅｒｒ
ｏｎ、 Ｃ，Ｖｉｃｉｒａ。 Ｊ、 ＆ Ｍｅｓｓｉｎｇ、 Ｊ、：Ｇｃｎｅ、、１．
ｌ ： １０３〜１１９．１９８５ ）の記載と同様に
して調製し、ｒ）ｓｌ、１で切断した（５シｍＨＴｒ
ｉ ５−１−１ｃｊ！ｐＨ８，ｏ、１０ｎ＋ＨＭＯＣｊ
！ 、５０ａ＋ＨＮａＣｊ！中約５μ９．３６℃）。 所望のα因子と成熟ＩＩ Ｌ Ｚ遺伝子間の変異を右す
る４４０ｂｐｌ）ｓｔｌフラグメントを１述のようにし
て１％アガ１１−スからｔｉ離しく Ｄｒｃｔｚｃｎほ
か：前出）、以ドにさらにＫＶ Ｉｔに説明Ｊるリゲー
シ］ンに用いた（ １シリ８ Ｑ Ｊ３ 、Ｊ： び
９ ｄ ） 。 ｄ）八〇 ｌ−１１１ターミネータ−おＪ、び１１（７
遺伝了の３′末罎； Δｌ）＋１１１ターミネータ−（Ｂａｉｃｒ、 ０．１
１．。 Ｙｏｕｎｇ、 ［、Ｔ、：Ｎａｔｕｒｅ 、３００
： ７ ２４ 〜７ ２Ｂ 、Ｉ Ｑ ８２
： Ｒｕ５ｓｅｌｌ、Ｄ、Ｗ、ほか： Ｊ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｃｎ＋、、 ２５８：２６７４・〜２６８２．１
９８３ ）を、プラスミドｏ Ａ Ｓ ５５ ｔｌｇの
５ｐｈｌ／Ｘｂｒｌｌによる消化（６ｍＭ １７ｒ
ｉ ５−１１ｃｊ！ ＤＩ１７．４ 、６ｍＭ Ｍ
ＯＣｊ！ 、１５０ｍＭ ＮａＣｊ！ 、１ｍＭ
ＤＴＴ、３６℃）でｐΔＳ５から甲１１ｆｌｌ Ｌ、、
ｌ二）本のように１％アガロースゲルからｌｌ’［した
。 ＡＤ１１１１ターミネータ−のＤＮＡ配シリｔよｌ１ｕ
ＳＳＯＩ。 ロー４．ら（前出）ににつて報告さ札ている。 ＯＬＪ Ｃ１８（Ｖｉｃｉｒａ、 Ｊ、、Ｍａｓｓｉｎ
ｇ、 Ｊ、：ＧＣｎｃ、 １９ ：２５９〜２６８ 、
１ ９ ８２ ； Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｃｒｒｏ
ｎｓよ か ：Ｇ橿１０．３３：１０３ 〜１１９ 、
１ ９ ８ ５ ） の（白化は一ヒに１４定され
た条１′１下、Ｓ ｐ ｈ ｌおＪ、びＸ ｂ ａ ｌ
にＪ、って実施した。次に約ｒ）Ｏｎりの間化ベクター
および約５００ ｎりのＡ１）１１１１ターミンーター
（Ｓ ｐｈ Ｉ ／ Ｘ ｂ ａ Ｉノングメントを、
リゲーシー］ン緩肖液（６６ｍＭ ’Ｉ ｒ ｉ ５
−Ｉｔ Ｃｊ！ｐＨ７，６，６、６ｍＭ Ｍ Ｑ Ｃ
，、Ｑ 、 １０ｍ１４１） Ｔ Ｔ、１ ｍＨｒ
Ａ ｌ’ Ｉ））中反１．６ ’ｒｌ ：ｔｉ ２０
ｕ Ｑで、Ｔ ４１） ＮΔリガーピ１甲位にＪ、す１
４ ”Ｃで−（ｋリグ−１〜した。生成したプラスミド
ｐＷｓ２１３１）でＬＥ、ｃａｌ ｉ １１［３１０
１を；１ぢ７′１転換した。。 ＦＮｌ１１／Ｉ ２３からのＩＩＬＺ ｌ’）ＮΔ
は停止コドン後にしさらに非１１３号領域のヌクレＡブ
トどｃ Ｉ） Ｎ Ａブレバレージョンに由来Ｊる２
０ ｄ Ｃ−ｄ Ｇり・１のス１−レッｙ−を有するの
で、これらを除去した。この１−１的で、ｐｌ−１１１
／１−２３をＭ ａ ｃ ＩＩＩにＪ、す８１１化しく
２０ｍＨＴｒ ｉ ５−１ｌｃｊ！＋＋ｌ１８．０．６
ｍＨＭ（ＪＣｊ！ 、３５０ｍＭＮ ａ Ｃ！、１ｍ
ＨＤ１−１°、４５℃）、単離した（ Ｄｒｃｔｚｃｎ
ほか：前出）、２８０ｂｌ）［４の１１７られたＭ ａ
ｃ ｌｌ−フラグメントを正確に停止コドンで明所し
た。ＬＩ Ｌ Ｚ 遺伝子の３′末端を含有する。 反応容１儂２５μｌ、リガーｆ！緩衝液（上述）中、Ｍ
ａ ｅ ［１１切断ＤＮＡ約０．５μｑを１１００Ｉ
Ｉのｄ△”「［）、ｄ ’Ｔ Ｔ Ｐ、（Ｉ ＣＴ Ｉ
）、ｄ Ｇ −ｒ Ｐおよび１単位のに１ｏｎＯＷポリ
メラーぜと室温で３０分間反応さＵ、突出端をにｌｃｎ
ｏｗポリメラーゼで充填した。 ｐＷｓ２１３Ｄ約１μｊを３６℃でＳｍａｌｔ、：Ｊ：
つて）肖化しく６ｍＨ−ｒｒ ｉ ５−ＨＣｊ！ ｐ
Ｈ８，ＯｌＧｍＨＭ＜ｘＣｆ 、２０ｍＨＫＣｊり、
ｐＷｓ２１３１）（約５Ｏｒ＋ｏ）のＳ ａ ｒＴＩ
１部（Ｑに、ｐＮ１１４−２３（約５００１１！＋）の
プラン１〜未喘化Ｍ 、’ｌ ＯＩフラグメントをリゲ
ー１−した（条（′１は−に連 ） 。 ＡＤ ＨＩ １ターミネークーに対してｌｌｌ−７ｉ貞
伝子が正しい方向性で９有される生成プラスミドはｐＷ
ｓ ２３５ Ｄと命名された。このプラスミドは＋１Ｌ
Ｚ遺伝子の３′末端を停止コドンまでとついでＡＤ Ｈ
Ｉ ｌクーミネーターを含有Ｊる。１１１７遺伝子とＡ
ＤＮ１１ターミネークーの間に４．ＬプラスミドｐＵｃ
１８の多クローニング部位に由来りるＢａｍＨＩおよび
Ｘ ｂ ａ Ｉ切断部位がある。 ［３有ｍＨ［部位は以下の＋１４築に問題を生じるので
、それを除去した。このし１的には、ｐＷｓ−２３５Ｄ
を３６℃にＬＩ３イて１３有ｍｌｌｌによりリノ断しく
６ｍＨ１’ ｒ ｉ ５−１１ｃｊ！ ｌ’１ｌ１８
．０１０ｍＭＭＯＣｊ！ 、１５０ｍＭ ＮａＣｊ
！、Ｉ ＩＮＤ ’ｒ １’ ） 、突出端をにｌｅｎ
ｏｗボリメラ−１で充填しく上記参照）、上）ホの条ｆ
１下に（例８ｂ）ＳＤＩ ＋リンカーを導入した。生成
したプラスミドはＤＷ２５７Ｄと命名し、くれによって
Ｅ、ｃｏＡｉ ｔｌＢｌｏｌを形質転換した。 ）−Ｉ Ｌ Ｚ遺伝子の３′末端とＡＤＩ−１１１ター
ミネータ−の５′末端の間の結合配列は次のとおりであ
る。 Ｓ’ＨＬＺ−−ＧＴＡＡＣＧＧＧ にＧＡＴＣＧＧＴ
ＣＧＡＣＣＧへＴＣＣＴＣＴＡＧＡ −−ＡＤＨＩｔ
−Ｔｊ’ ｍ−ＣＡＴＴＧ ＣＣＣＣＣＴＭ： ＣＣＡＧＣＴ
ＧＧ ＣＴＡＧＧ ＡＧＡＴＣ’ｒ −−１＝
Ｍ ａ Ｏｍで消化され、にｌｃｎｏｗポリメラーゼで
充填されたｌ−Ｉ Ｌ Ｚの３′末端と停止コドンＡＡ ２＝Ｓｍａ Ｉクローニング部位の残部（ｐＷ Ｓ−２
１３Ｄ） ３−にｌ０ＩＩＯＷポリメラーゼで充填された３ａｒｒ
Ｎ−１１部位 ４＝Ｓａｉｌリンカ−（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏＬａＬ＋ｓ ）５＝３のＢａｍｆ−１１部位の他端（
にＩｃｎｏｗポリメラーゼで開裂、充填） ６ ＝ Ｘ ｂ ａ １部位およびＡＤＩ−１１１ター
ミネータ−の開始 Ｃ）発現力レツ］−の構築 例８ｂで構築されたプラスミドｐＷＳ２１５１つ（約１
μシ）をＰｓｔｌＪ３Ｊ、び１ｌｉｎｄｌｌで澗化しく
例８ａの条件参照）、その結果仝ＩＩ ｌ ｉ ｒｍ伝
子およびα因子リーダーの大部分、４，２ｋｂフラグメ
ントが切り出された。同一条件下でｐＷｓ２５７Ｌ）を
ＰｓｔｌおＪ、び１Ｉｉｎｄ［ｌて・消化し、生じたフ
ラグメン１−を△Ｄｕ１１ターミネーターおよびｌ−Ｉ
Ｌ Ｚ ｍ包子の３′宋喘とｐ ｓ ｔ： １／ Ｌ
ｌ ｉ ｎ ｄ Ｉ１１部位でリグ−１〜した。す７Ｊ
−ピ反応は上述のとおりとした（例８ ｄ ）。生成し
たノ°シスミドｐＷｓ２１８Ｄ中に【３Ｌ、佇由］トン
で終結’Ｊ ７．、） ＨＬ Ｚ １３伝子の３′木端
ト、（ｔ’Ｌ ニＦＡｉ Ｉ！ Ｊ ？ａＡＤＨＩ＋タ
ーミネーターが直接α囚１′−リーグ−の開始部に荀ｋ
ｙｆする。発現力ヒツトを完成Ｊるためには、α因子リ
ーダーの大部分と１１ ｌ ｌ 逍（ｔ：了の５）′末
端およびこれらの２敢累間のｉＩ シい変γ−：をＪ、
だ欠いている。したがって、１列８ｃ′Ｃ−調１１ Ｌ
ｌコ突然変責講ブｉ：４４０１１ｒｌｌＱｌ〕Ｓ Ｌ
１ノラグメン１〜（約５０Ｏｎ！Ｊ）を上述の条件下に
Ｌ）Ｗ３２１ Ｆ’Ｓ ｌ）（約５０ｎす）のｌ） Ｓ
ｌ： ｌ切断部位にリグ−１−シた。 ４ ／Ｉ Ｏｂｐ艮１）ｓＬｌフラグメン１−（Ｉｌｌ
−Ｚ項仏子の５′末端とα因子リーグーの大部分−３′
末端）がΔＤ ｌ−１１ノ［１■−ターまたはＩＩ Ｌ
Ｚ遺伝子の３′末端に対して正しい方向性をｂつプラ
スミドはＤＷＳ２９ＯＬ）と命名した。上１本の要素寸
べてを正しい配列、相ｎに正しい方向性で含み、各費木
問に改良された正確な変異を有１゛る。各要本は、１／
１５０ｂＤ ΔＤ ＋１１ブＯ′ｌ−一ター、２ （
Ｓ Ｏｂｐ（Ｘ因子リーダー（プロテアービ切１ｇｉ部
位を丁１−ドする配列で終わる） 、３６０ｂｌ）
ＬＩ Ｌ Ｚ遺伝子（成熟ＨＬ Ｚ蛋白質の配列に隣接
するリジンの］トンで始まり、ｌＩＬＺｍ伝子の停止コ
ドンで終わる）、３３０ｂｐ ＡＤＩ−１１ｔターミ
ネークーである。 ｆ ） Ｍ Ｉｌｌ内でのｌ−Ｉ Ｌ 、７の発現発現
カレツｈｐＷｓ２９０Ｄ（５μ！？）を３６℃において
ｌ−１ｉｎｄｌ［ＩＩ３よび３μｍＨ［ｒ消化しく５０
ＩＮ Ｔｒ ｉ ５−１−１ｃｊ！ １１８．０１
ｌＱ＋ａＨＭ＜］Ｃｊ！ 、５０ＩＮ Ｎａ（，１
）、これｂあらかじめｌ！ ｉ ｎ ｄ ｌ［［に、Ｌ
びＢａｍ１ｌｌで切断した多コピーベクターＦ） Ｊ
ｌ） ［３−２０７（１μ！Ｉ）中にリグ−１−シた。 発現力レツｈ ｐＷ Ｓ ２９０１） （５１１す）に
、Ｊ、び多コピーベクターｐ Ｊ Ｉ） ［３２０７（
１μｒＪ）（Ｂｃｇｇｓ、 Ｊ、Ｄ、 ：Ｇｅ＋＋ｅ
ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ ｙｅａｓｔ。 ＷｉｌｌｉａＩｌｌｓｏｎ、 ｒ＜、 Ｎ 、 ｃ
ｃｎｃｔｔｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ。 Ｖｏｌ、２． ＾ＣａｄＱＩｌｉＣｐｒｅｓｓ、
１Ｏｎ（Ｉｏｎ １’ＪＩ口、１７５〜２０３頁、Ｉ
’）８Ｍ３１８１）を３３６℃にＪｊい−（Ｌｌ ｉ
ｎ ｄ ｍ によび１３ ａ ｍ Ｌｌ ｌで消化した
（ ５０ ＋ｎｔｌＴ ｒ ｉ ５−１１ｃＪ！
１１１１８． ０、１０ＩＮＭＱＣ！ 、５０
ＩＮ ＮａＣｌ ）、 得られたＨｉ ｎ ｄ ｌ［
［／１１ ａｍｌｌ ｌフラグメン１−（約５００ｎｏ
＞を、開裂した多コピープラスミドｐＪＤＢ２０７ （
約５Ｏｎ＋１）中にリグ−１〜した（リゲーシ］ン緩衝
液との混合物２０μｌ、例７に特定した条件下、Ｔ ４
１） Ｎへリガーげ１単位）。 ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｃｓ ｃｅｒｃｖｉｓｉａｅの
各種へ５１コリリックｆｒｔｍ株をこのＩラスミド１２
９／２９で次のにうに形質転換した（ Ｂｃｇｇｓ、
Ｊ、口、 ：Ｎａｔｕｒｃ、 ２７ Ｅ＞ ：１０４
〜１０９．１９７８）。−夜ＹＰＩ）（１％バクｈ Ｍ
ＤＩ抽出液、２％バクトペブトン、２％グル］−ス）
中で一模予備培養を行い、Ｙ Ｐ Ｄ ５０ｄニ１０７
１１Ｆ、ｌ＃！（７）１１１１１４１１’Ｌ、、、２８
℃Ｆ ２１！！代ｊ８養したく通常３Ｉ１１間）。生成
物を５．０００ｒｐａ＋で５分間遠心分離し、細胞をＳ
ＥＤ （１８ソルビＩ・−ル、２５ｍＨＥＩ）Ｉ−Δ、
ｐＨ８，０１５０叶 ｌ″） ’Ｉ−Ｔ’ ＞ ５ ａ
ｔｅ中に再懸濁し、３０℃で１０分間穏やかに攪１′ｒ
シた。生成物を１．６０Ｏｒｐｍで５分間遠心分離し、
ＳＣ［（ＩＨソルビ１〜−ル、０．１Ｈり１ン酸三ナト
リウム、ｐＨ５，８，１０＋ｎＨｌｌ） Ｉ−Ａ ＞中
に再懸濁し、この１００μｌをとって、水２．９ｄに懸
濁した。スフ」−１１ブラストの／１成を６００ ｎｍ
で測定した。ついで５０μｌのグラスラーピ処理を２８
℃Ｃ徐やかに攪ｆｆ Ｌながら実施した。処！ＩＩＩ
Ｉｌ、’ｉ問を変えてさらにスフ土［１ブうスト１００
／１１を採取し、水２．９＋＋ｆに懸濁し、［を測定
した。６００１１０１の吸光１ｑが初１！１１狛の約３
０％に低下したとぎ（通常２０〜３０分後）、細胞を１
，６００ｒｒ１ｍで遠心分離しＩご（ベンチ遠心分ｍ１
ｌｌ）。スフエロプラストをＣｒ１Ｓ（ＩＨソルビトー
ル、１０ＩＮ ＣａＣｊ！ 、１０ｍＭＴｒ ｉ
５−ｌ−１ｃｊ！ ＤＩＩ７．５） ５ｄで１回洗浄
し、再びゆっくり遠心分−１し、Ｃａ５０．５ｄに取っ
た。スフエロプラス１−の一部を取り、プラスミド１）
ＮＡ （１２９／２９）１μりを加え（大官Ｍのｌ）Ｎ
Δ溶液の場合は、これを１Ｍソルビ１−−ルに調整する
必要がある）、１５分間室温に改質したのらＰＥＧ（２
０％ｗ／ｖ ＰＦ−Ｇ／１０００．１０ＩＮ （：ａＱ
Ｊ 、 １０＋１１）Ｉ ＴｒｉＳ−１１ｃＪ！回７．
５、滅菌ろ過）を加えた。この混合物を１５分間室温に
放置し、Ｉ 、 ６００ ｒｐｍ ′Ｃ’ ｊｑ心分！
ＩＩシ（ベンチ遠心分子ｉ１＋＞、ベレットを５Ｏ３（
１８ソルビトール、３３％ｖ／ｖ Ｙ Ｐ ｌ）、（３
、５） ｍＨＣａＣｌ 、選択された滅菌アミノ酸１３
．５ｕｌ）１５０ｕｊ！に再懸濁し、３０℃に２０分間
敢放置た。この混合物を前６つ−（”Ｉ ５）℃に冷１
」１シたトツアアガールＴＩＭソルビトール、２．５％
アガール、０ 、６７９ＣＩ’３ Ｙ Ｎ ［３Ｗ Ｏ
；ｘ ａ（バク１〜酵１ｕ′省克１ｑ ３Ｊ、アミノ酸
を含まない）、２％グルＴ１−ス、１％１００ Ｘアミ
ノ酸混合物］３Ｉｄ中で・穏やかに撮画し、ボトルアガ
ールプレ−１・（２するアガール、０．６７％１３ Ｙ
Ｎ ［３ｗ 。 Ｆｌ ａ、２％グル−１−ス、１・゛ンブアガールと同
じアミノ酸混合物）Ｌに注さ′、３０”Ｃｒ２〜／Ｉ［
１間培養した。、１００ｘアミノ酸混合物−１０ＬＪ
ｆよ２Ｕ／ｌの７ ｉ’ニン硫酸塩、アルギニン、ウラ
シル、アスパラ１゛ン、グルタミン、じス升ジン、メチ
Ａ二ン、リジン、ｆロジン、）−［ニルアラニン、バリ
ン、スレ４ニン、Ｉ・リブトファンを含（−４シた。 形１１転Ｊ＆ 酵１７１株（ＳａＣＣ１１ａｒＱＩ！Ｉ
Ｉ／ＣｅＳ Ｃｅｌ”ｌＯＶ！Ｓ！１ｌＱ）はｓ ＜：
−ｊ！ Ｑ ｕ （０、６７％バクト酵母窒素塩単−
７ミノ醇）ｌ含イｊ、５％グルコース、１％１００×ノ
′ミノ酎混含物−１ｅ ＩＪ ）上、３０℃で培養した
。 以１；の人はリゾデーム発現の結果を示１」１．リゾブ
ームの１１１はりゾブームに対する１４異的抗体の結合
にＪ、って（Ｆｊ！ｉｓａ試験）定立した。 形質転換体 株 リゾブー１１（ｍシ、
、／ 、ｙ ｌｒ；苺液） １／２９ ＷＳ２１−り ０． ／１１／
３１． ＷＳ２１−５ ０．３１２／３０
ＷＳ２１−３ ０．８≦）２／３１
ＷＳ２１−３ ０．／Ｉ２６／３０ ＷＳ
２１−１ １．０６／３１ ＷＳ２１−’Ｉ
１． ２Ｗ Ｓ ２１ −１ ＝ ａ １ｃ
ｕ２ １＋ｉｓ３ １゛ｐｌ １＋ｃｐ４ＷＳ ２１
−３ ＝ａ １ｃｕ２ ｔ＋ｉｓ３ ｕｒａ３ ｐｃｐ
４ＷＳ ２１ ５ ＝ａ １ｃｕ２１１！３３ ｔｒｐ
ｉ ａｒｇＩ Ｉｔ（４９４例９：α囚子ブ［：］ ］
ｌｌクーー制御の発現カレットの構築 α因子遺伝子のｌ−ｌ ｉ ｎ ｄ ［１およびｓａｘ
１部（＜／の間への５１４種遺伝子の１誘人について
は報告がある（ Ｂｉｔｔｅｒ、 Ｇ八、ほか： Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａ１１．＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ。 ＩＩｓ＾、Ｅ３１：／ｌ６４２〜４６．１９８４）
。 １’ ｃ ＯＲＩ Ｊ Ｊ、び１Ｉｉｎｄｌ［１部位間
の配’／１１はプ【コＥ−りＪｊよびリーダーベブヂド
として作用し、一方、Ｓａｊ！ ｌと［ｃｏＲ１部位間
の配列は転写ターミネークーとして作用する。 ａ）適当なベクター内へのα因子遺伝子のクローニング α因子ｊＷ伝子をｐ（）Ｃ１３誘）＃体ρα［：（５Ｉ
Ｉ Ｊ ）からＥ ｃ ｏ ＲＩフラグメントどしく甲
１１１１１ Ｌ。 （１００１１１８’Ｉ’ ｒ ｉ ５−１ｔＣＪ！
０１１７．５．５〜ｌＭ ＜Ｅ Ｃｆｔ 、 ５０
ｍＨＮ ａ Ｃｊ！、１ｍＨＤＴ−Ｔ、３６’Ｃ）、ベ
クターＶ２中にり１コーン化した。ベクターＶ２は次の
Ｊ、うにしで構染しＩこ。すなわら、Ｄ Ｕ Ｃ１（３
を３ ｉｌ ｒＴｌ ｌおよび１ｌｉｎｄｌｌ［で開裂
し、末端（よＬ述のＪ、−）にしくＫｌｃｎｏｗボリメ
”／−１２”（’ｆ色填し、残ｈ１のｒ＋ ＬＪ Ｃ１
ε３を生成したベクターＶ２が九Ｉ／） １０１１１．
ｌ （７） ’） Ｌｌ −Ｌ ン’／ ＲＩＳ ｆ
Ｑ （Ｊ） ’） ラ：”Ｓ ｆｌ１４、・Ｊ４ｃわら
ｌ−、ｃ Ｏｌ？ Ｉ 、 Ｓ ｓ ｔ ｌおよびＫ
ｐ ｎ ） シがした／、ｆいように再すゲー１−シた
。したかつ（ベクターＶ２は１１ｉｎｄ１［１また（よ
Ｓ；１４！１部位（よら１１！したず、これらの２酵素
の切断部ＩＩ／はα因子遺伝子中にしか存在しない。ベ
クターＶ２（１１１１をＥ ｃ ｏ Ｒｌ テ消化し、
にＧ ＯＩ＜［ｉ白化１）α］−約５０ Ｏｒ＋すをＥ
ＣＯ＋＜［消化２約５０ｎｇ中にリゲー１〜した（リガ
ーゼ反応は例７に記載）。生成したプラスミドρＷＳ２
３０Ｄで［、−、ｃｏｆｉｌ−１１３１０１を形質転換
し、以後の横築に用いた（例９ｂ、ｃ）。プラスミドＤ
ＷＳ２３０１）（第１４ａ図）のＰｓｔｌ／［１０Ｊ！
ＩＩノラグメントは約≦）００ｂｐ艮のブ［−１し一タ
ーを含有１Ｊる。モの隣のｌ） ｓ １．１部（ひは翻
訳領域の内側約２５１＋Ｈにある。 ４０月の１−１ ｉｎ （Ｉ １１１部１１／に隣）３
１」るｐ ｓ １．１部位の前約２５ ｂｐＪｊよ（ｆ
サ’Ｊ Ｌ−Ｊ流ニ、α囚Ｔ Ｏ） ｌｌｌ１． ’
す°に必用な１）ＮΔ領領域ある１、α囚「のリーグ−
＾ｉ！ ９１１＋、’Ｌ コ（７）第２（７）ＰＳＬＩ
部位、 （７） ｌｉ方ＦＪ ２５ ｂｐ（ΔＴ Ｇ
）に始まり、かなり１１゛（イ「に４個のＩｆ ｉ ｎ
、ｄ ｍ部位の最初（・終結する。、クーミネークーは
Ｓ ａ Ｑ Ｉど［二ｃ ｏ Ｉ’＜ １部（Ｑの間に
ある。 １））１〜ｌ １．７ ｉ貞包子のα因子ｊ真（ｌ、子
への結合ＬＩ Ｌ ｉ ｉＭ １／１了をα因ｒブ【］
」［−クーニしたはり−ミネークーにス・１シ１１−シ
い方向＋ｔ１で導入するためには、ｐＨｌ−１／ｌ−２
３の側部に位置−・ＪるＩＩ ｉ ｎ ｄ ＩＩＩ Ｊ
ｊＪ、びＳａｆ！制限切断部（ＣＩを変化さｔ！わぽな
ら＜ｋい９．このためには、Ｄ ＩＩ １１ ’１−２
３約５μりを５ａ１１ （６ｍ）ｌ Ｔｒ″１ｓ−１
１ｃｊ！ｐＨＬ３，ｏ、ＯｍＨＭ＜】Ｃｊ！ 、１５
０ｍＨＮ ａ Ｃｆｌ 、 ３６°Ｃ）まｔｓはｌ−１
ｉ ｎｄＩ［［（ｂｏｍＨｌ−ｒ ｉ ５−１１ｃｊ！
＋１１１８．０．１ＧｍＨＭ ＜］ Ｇ １ 、
！’５０ ｍｆ４ Ｎ ａ Ｃ１、３６℃）で切断し
、突出端をそれぞれにｌｃｎｏｗポリメシービで充填し
く Ｍ ８ ｂのＪ、うに切断１） Ｎ八 〇、５ｔｔ
ｙ、反応８ ｈ３２５μ！＞、反応混合物を１％アガロ
ースゲル中で精製した。１Ｉｉｎｄ［［リンカ−（Ｎｅ
ｗｌ’ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｔ＋Ｓ）は５ａｊＮ部
位（ｐ Ｗ Ｓ ２０７ Ｄ ）にリグ−１−シ、ＳＯ
Ｎ ＋リンカー（Ｎｅｗ ［ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ ）はｌ−ｌ ｉ ｎ （１■部位（ｔ）Ｗｓ２０
６Ｄ）にリゲートシ（例８ｂの記載参照） 、［Ｅ、ｃ
ｏｊ！ ｉ Ｈｔ３１０１を形質転換した。１．成し
たプラスミドｐＷｓ２０６ＤおよびｐＷｓ２０７１）（
それぞれ約５μび）を［ｃｏＲＩＪｊＪ、びＰｓｔｉＣ
切断しく ：〕Ｏｗ＋Ｈ１−ｒ ｉ ５−１１ｃｊ
！ ＤＩＩＥＩ Ｏｌ １０ｍｔ４Ｍ ＯＣ１、
５０ｍＨＮ ａ Ｃｊ！ 、 ３６℃）、Ｌ述のりガー
ゼ反応条ｆ１下に（例７〉たがいにリゲーｌ−ｃ５１ｉ
、プラスミドｐ Ｗ Ｓ ２０ ＲＩ）をＩＩｌ／こ。 この場合し、例８（１に記載のＩＩ ｌ−Ｚ ｉ貞伝丁
の３′末端に（よ１”）止〕トンの復にざらにヌクレＡ
ｆドがあるという問題がある。このため、Ｉｌｌ／ｉ貞
伝了の３包子端を次のＪ、うにＰ：’ ＋Ｉ： Ｊトン
まで−に’）、：＋縮した。プラスミドｐＷｓ２５７［
）（例８ （ｉの（１１１簗）は１１１７逍伝子の鈴止
−１トン、１、ζ・の３′未喘に続いて５ａｉ１部（１
／とΔＤｌｌ１１クーミネークーを含み、これはこの場
合の構築に無関係て゛ある。。 プラスミドｐＷ Ｓ ２０８１）おＪ、ひＤ Ｗ Ｓ
２５７１）をＳａｊ！ ｌおにび）） Ｓ ｔ ｌ Ｃ
完全に消化しＣ（５）ＱｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！
Ｄｌｌε１．０．１０ｍＨＭＯＧ１．５０ｍＨＮ；ｌ
Ｇｉ中１）ｓｔｌ、３Ｇ℃で１時間、ついでＮ ａ Ｃ
１ｆＪ 麿を１５０ｍ旧こ上げて５Ｆ１１１を加える）
、１％アガ１１−ス申で７．１製し、１１− ｔｉｌｌ
ｔ、た（ｏｒｅｔｌｃｎ Ｇｌか：前出）。ｌｌＬ、
／遺１五子の３′末喘を含むｐｗｓ ２５７ ｏのＳａ
ｆ ｔ／Ｐｓ ｔ Ｉ １＝ｉ’／メ＞トをＯＷ ３２
０８１）のＳａＪ Ｉ／Ｐｓｔ ｌフラグメン１−で置
換し、ｐＷｓ ２５７ Ｄフラグメン１〜（約５００１
１（Ｊ）を上述のように、ＤＷＳ２０８Ｄ （約５０ｎ
ｅ）のＳａｊ！［／Ｐｓｔ１部位にリゲートηる。 ｉ１成したプラスミドｐＷｓ２１２ＤはＮ１ｎｄｎｌ／
５ｒｌｊ！ｌフラグメントとして全１」Ｌ Ｚ遺伝子を
含み、一方３′宋喘でＨＬ Ｚ遺伝子は停止コドンをｂ
つて終わる。プラスミドｐＷｓ−２１２１）おＪ、びｐ
Ｗｓ２３０Ｄ（例９ａ）をＩ−１ｉ ｎ ｄ Ｉ［ｌお
よびＳ Ｅｌ １１により完全に消化しく５０ｍＭ１’
ｒ ｉ ｓ −ＨＣｊ！ ｐｔ１８ 、０．１０ｍ
ＨＭＯＣｊ！ 、Ｆ）ＯｍＨＮａＣ１中３３６°Ｃｒ
１時間１１ｉｎｄｌにＪ、って処即し、ついでＮ ａ
Ｇ ｐ ｆ５ ＋（ｘを１５０ｍ旧に上背させて５Ｆ１
ｆ［を加える）、ｐＷｓ２１２Ｄから切り出した１１１
７遺伝子を１１ｉｎｄ［１７ラグメントどして（約５０
０ｎす）（」ユ述のＪ、うにして、１％アガロースゲル
から甲ｆｆ１） ｌｌｉ ｒ）ｄｌＩｌ／Ｓａｊ！ Ｉ
Ｆ開裂したベクターニリゲートした（リガーＣ反応は例
７に記、１又のとＪｉす）。生成したプラスミドｐＷｓ
２３１１）中で【、１、ＨＬ Ｚ遺伝子は、α因子ブ［
１し一ターＪｊＪ、びクーミネーターに対して正しい／
ｉｉｆ１で存イＩＪる。 虹１人工ｊ伝−からのＰｓｔ１部１６の除ムα因子遺伝
子は２個のＰｓＬ１部（ひをＴｉ１Ｉろ。 ］−ド領１或内に存在しないひとつが今１１２の（１４
築の主な障害となるので、それをＬス１この操作しごＪ
、って除去した。すなわら、ブ）スミドｐ Ｗ Ｓ ２
：１． ＯＩ）（構築についてはｌ？Ｉ ９ ａ 参
照）１０ｆｌＵを！−） ＯｍＮｌ ｒ ｉ ５−ＩＩ
Ｃ１ｐｌ＋８．０．１０ｍ１Ｍ ＯＣＩ 、５ Ｏｍ
ＨＮ ；） （／ ｊ！中、Ｐｓｌ１１０甲（ずｌによ
り３６℃で１０分間消化しＣ１１）ＷＳ２３０ＤをＰ
Ｓ ｔ ［’（” ｉ’＋ｌｆ ５）’ＪＪ ｆｌｌ
ｉ Ｌ／ ／コ。ＩＴ ｉ、Ｉｒに１個の力゛ントを含
イｉＩＪるフラグメント〈；君′１４ａ図の７ラグメン
１−１３おＪ、ＯＣ） ’ｊ’ １ ％７ ）Ｊ ＩＴ
Ｉ −スゲルから弔１１１１ した ３ ＋ 突出宋◇
＝：を８１＋１１０Ｂ （！ ｉｆ ＩｆヌクレアーＵ
で除去１」るため、［）Ｗ Ｓ ２３０１） ＩＩ）生
成した線状化ＤＮＡ約１μＩＩを水１；１μｍ（ことり
、１０ｍＨＺｎＣｊ！２２ｕｆ１．４８ Ｎａ（、！１
μＪ、０．３ＨＦＩｔ酸ノ１−リウム（ｐＨ４，７５）
２ ｔｔ ｊ！ 、 Ｈｕｎｏ Ｂｅａｎメクレアーｔ
？ （３００甲１◇、ｐＨａｒｌｎａＣ！ｎ ）を加え
／コ。この混合物を１５分間室温に敢防し、ついＣ直接
１％アガ１コースゲルに適用し、゛フラグメン１〜をゲ
ルから１ＩＩ１１シた（ＤＩ’（！ｔ１０ｎほか：前出
参照）。ついでフラグメント１３ Ｊｊ Ｊ、びＣをＭ
リゲートすると（条件は例７に１２１定）、部分消化時
に切断されたｐｓｔ１部位は破壊され、切断されなかっ
た１１［１ｉ１はそのまま残った。この方法で、所望の
ｐｓｔｔ部位はム〒存在しないが、他は残っているプラ
スミドの単離が可能であった（Ｃ’）。このプラスミド
（Ｃ′ ）とＪ、たｐＷｓ２３１Ｄをｐｓ虹［Ｊｊよび
ｒ３ （３１１で完全に消化した（５０ｍＭ ’ｒｒ
ｉ ５−ＮＣｊ！ｐＨ８，ｏ、１０ｍＨＭＱＣｊ！
、５０＋ＨＮａＣｚ、３６℃）、Ｃ’（約５００ｎｏ
）の単離０２フラグメント（８５０ｂｐ）をｐｓ ｔ／
１３ （］ ＩＩＩＩ ８′ｊ化ｐＷＳ２３１Ｄ（約５
０ｎｏ）中にリグ−１〜しくリガーピ反応は例７に記載
したと同様）、プラスミドｐＷｓ−２９４Ｄをｌｒ７た
。このプラスミドｐＷＳ２９４＋）はぼ因子遺伝子を含
イーし、Ｐｓｔ１部位に１１ＬＺ′ｌｉ伝了のご３′末
９：ｔがｉ［しい方向性でｈａ人される。 ｄ）発現カレツ１−の構築 プラスミドＤＷＳ ２９４ Ｄは、α因子ブｌ’ｌ Ｅ
−ターおよびα因子ペブブドの最初からＰ ｓ ｔ
Ｉ ＶＪ断部位まで（約２０ｂｐリーダーベブブド）、
ナらびにその後にＩ−Ｉ Ｌ、 Ｚ ｍ包子の３′末端
をＩ’）ｓｌ、１部位から停止コドンまで含ｎづる。完
全な発現力セラ１〜としてはまだ、α因子リーダーの３
′末端、＋１ＬＺ１１伝了の５′末端、おＪ、びこれら
の２個の要木の間の正しい変異を欠いている。プラスミ
ドｐＷｓ２９４Ｄ（約１μＪ）をＰｓＬＩで完全に消化
しく５０ｍＭ −１−ｒｉｓ−１１ｃｊ！ ｐＨ８
，０，１０ｍＭ ＭＯｃｊ！ 、５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｊ！、３６℃）、プラスミドΔ２／２５からの突然変
１，１．！誘発／１４０ｂｐ Ｐｓｔｌフラグメン１
−（例８Ｃ１約５００ｎｏ＞を例８ｅのにうにしで、ｐ
Ｗｓ ２９４ Ｄのｌ） Ｓ ｔ １部位にリゲーｌ〜
した。生成したプラスミドＤ Ｗ Ｓ ２９ Ｃ５１）
は、α因子遺１五子のプロ七−ウー配＋１Ｉ９００ｂｐ
、α因子リーダー（例Ｑ ｅ ニ３Ｍべた配列の艮ざと
同一）２６０ｂｐ、ＩＩＬＺ遺伝子（例８Ｃに述べた配
列の長さと同一）３６０ｂｐおＪ、びα因子ターミネー
ター２９０ ｂｐからなる発現力Ｕツ１〜を含有する。 文 献 （１） Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ、 Ｄ、Ｃ，： Ｓｃｉ、八
ｍ、、 ２１５ニアＢ〜９０（１９６６） （２） Ｆｌｅｅｃｉｎｇ、 八、： Ｐｒ
ｏｃ、Ｒｏｙ、Ｓｏｃ、５ｃｒＢ ９ ３ ：３
０６〜３０７ （１９２２） （３） Ｂｉｇｇａｒ、 Ｗ、Ｄ、 ＆ ＳＬｕｒｇｃ
ｓｓ、 Ｊ、Ｈ，： Ｉｎｆｅｃｔ。 １ｍｍｕｎｏ１．、１６：９７４〜９Ｂ２ （１９７７
）（４） Ｉｈａｃｏｒｃ、 Ｈ，＆ Ｍｉｌｌｅｔ、
Ｉｌ、Ｐ、：＾Ｉ１１．ＲＯＶ。 １１ｃｓｐ、Ｄｉｓ、、 ９３ニア８６〜７９０（１９
６６）（５） Ｋｌｏｃｋａｒｓ、 Ｈ，１，
＆ ｌ１ｏｂｃｒｌｓ、 Ｐ、： 八Ｃ（，１１１
１ａｃｍａｔｏ１．、 ５ ５ ： ２ ８
≦） ”−２９２（１９７６）（６） １ｎｃＯ
ｎＯ，Ｖ、Ｊ、、 Ｈａｃｋａｙ、 Ｉ”Ｊ、＋１旧（
！１１７０゜Ｓ、 ＆ Ｐｏ１ｌｏｋ、 Ｊ、Ｊ、：
Ｉｎｆｅｃｔ、 Ｉｎ＋ｎ＋ｕｎｏ１．、２＜）：６２
３□−６３２（１９８０） （γ） 、Ｊｏｌｌｃｓ、 Ｉ）、： Ｂｉ
ｏｍｅｄｉｃｉｎａ、 ２ ？） ： ２７
り・〜２７６（１９７６） Ｃ８） ｏｓｓｃｒｍａｎｎ、 ｒ、ｌ−、：
八（１ｖ １ゝｎｔｈ０１１ｉ０１．、 ４
：９８〜１０２ （１９７６） （Ｑ） 、Ｉｏｌｌｃｓ、 Ｐ、、 ｓｔｃｒｎｂｃｒ
ｇ、 ＋４．、 Ｈａｌｌ１１３．Ｇ。 ｌｓｒ、Ｊ、Ｈｃｄ、ｓｃｉ、、Ｉ： ４ ／ｌ ’、
）□〜’１４７（１≦）６５ ）（１０） ０ｓｓｅ
ｒ＋ｎａｎｎ、１−．１．＆ Ｉａｗｌｏｒ、Ｄ、Ｐ
、： Ｊ、Ｌｘｐ。 ｔ４ｃｄ、、 １ ２ Ａ ： ≦） ２１
〜９ ニー＞ ２ （１９６６）（１１）
５ｉｐｐｃｌ、 八 １．．１．ａｎｄ、
Ｉｆ、、 ｌｉｎｄｅｎｍａｉｒ。 １４、Ｎｇｕｙｃｎ−１１ｕｍ、Ｈ，Ｃ、ｗｕｒｔｚ、
１’、、Ｔｉｍｍ１ｓ、 Ｋ、Ｎ、。 Ｇ１０８Ｓ（ＩＣｋ（！、 に ＆ Ｓｃｔ＋１
ｉｔｌ、 Ｇ、： Ｎｕｃｌ、八ｃｉｄｓｌｔｃｓ
、、 Ｅ）： ３２７５〜３２９４ （１９７８
）（１２１Ｂａ１ｄａｃｃｉ、 ｌ’、、ｌ１ｏｙａ
１．八、、Ｃａｍ１．Ｂ、、Ｐｅｒｒｉｎ。 １ 、にｒｕｓｔ、Δ、、Ｇａｒａｐｉｎ、 八、
＆ にｏｕｒｉｌｓｋｙ、 Ｐ、：ＮＬＩＣＩ ＾
ｃｉｔｌｓ ！＋＋！Ｓ、、 ６ ： ２６
６７〜２６８１ （１９７つ） （１３） Ｊｕｎｇ、＾、、５ｉｐｐｃｌ、八、［
、、Ｇｒｃｚ、Ｈ，＆ ５ｃｂｉｉｌｚ。 Ｇ、： Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
ＬＩＳ八、 ７ ７ ： ’、） ７ ５
９〜５７６３（１９８０） （１４） Ｏｗｃｎ、 Ｊ、［、，５ｃｂｕ
ｌｔｚ、Ｄ、Ｗ、ｊａｙｌｏｒ、 八 ＆Ｓｍ已
１＋、Ｇ、ｌｉ、： Ｊ、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ、、 １
６５ ： ２２９ ＝ ２／Ｉ Ｏ（１９ε） ご３
） （１！＋） Ｇ１１ｂｌ（！ｒ、Ｉｆ、 ＆ ｌｌｏ
ｒｆｍａｎｎ、Ｂ、Ｊ、： Ｇｃｎｃ、 ２５ ：２
Ｇ ３ ・−２６９（１９８３） （１（ｉ） Ｒａ１ｐｂ、Ｐ、、Ｈｏｏｒｃ、Ｈ，
八 Ｓ、＆ Ｎｉ１ｌＳＯｎ 、に、Ｊ、：［ｘｐ
、Ｈｃｄ、、 １ ４３ ： １ ５２８〜１５
３３（１９７（１７） Ｇｏｌｄ、１．Ｈ，＆ Ｓ
ｃｌ＋ｗｃｉｇｃｒ、Ｈ，： Ｈｃｔｔ＋ｏｔｌｓ
１ｎｒｒ＋ｚｙｍｏｌｏｇｙ、 Ｖｏｌ、ＸＸ、Ｐ
ａｒｔ Ｃ，ｐＤ ５３７〜５４２ 。 Ｌｄ、に、Ｈｏ１ｄａｖ、 １．ＧｒＯ３ＳＩＩｌｉ
ｌｎ、 八Ｃ１１ｄ（！ｍＩＣＰｒｅｓｓ、 Ｎ（
！ＷＹｏｒｋ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ、 １
９７１（１８） Ｖｉｃｉｒａ、Ｊ、 ＆ Ｍａｓ
ｓｉｎｇ、 Ｊ、： Ｇｅｎｅ、 １９ ：
２５９〜２６８ （１≦）８２） （１９） Ｐｅａｃｏｃｋ、 Ｓ、１．、Ｈ
ｃｌｖｅｒ、Ｃ，Ｈ，ＩＧ Ｈｏｎ 旧１ａｎ、、Ｊ
。 Ｊ、： Ｂｉｏｃｈｉｍ、１Ｓｉｏｐｈｙｓ、＾ｃｔａ
、 ６５）Ｅ）： ２ ＩＩ ３ ＝−（２０）
＾１ｖａｒａｄｏ−１１ｒｂｉｎａ、 Ｇ、、５ａｔ
ｈｅ、 Ｇ、 Ｈ，、ｌｉｖ。 ＩＪ、［：、、Ｇ１１ｌｃｎ、 Ｈ，Ｆ、、Ｄｕｃｋ
、 Ｐ、Ｄ、、Ｂｃｎｄｃｒ、 Ｒ，８０ｇ１ｌｉ
ｖｉｃ、 Ｋ、に、： ５ｃｉｅｎｃｅ、
２ １ ４ ： ２ ７ ０ 〜２７／ｌ （１
９８１） （２１） Ｊｏｌｌｅｓ、Ｊ、＆ Ｊｏｌｌｃｓ、
Ｐ、： １ｌｃｌｖ、Ｃｂｉｍ八ｃｔへ、 ５４：
２６６８−２６７５（１９７１）（２２） Ｃａｎｆ
ｉｅｌｄ、Ｒ，Ｅ、、に１１１１１１１（！ｒｌｌｌａ
ｎ１１． Ｓ、 ５（ｉｌｌ（！ ｌ 、 Ｊ 、 Ｉ
ｆ 。 ＆ Ｍｏｒｇａｎ、ｒ、Ｊ、： Ｎａｔｕｒｅ
Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ、、 ２ ３ ２ ：
１６〜１７（１９７１） （２３） Ｊｏｌｌｅｓ、Ｐ、＆ ｊｏｌｌｃｓ、
Ｊ、： Ｈｏ１．Ｃｃｌｌ。 Ｂｉｏｃｈｃｍ、、 ０３ ： １ ６５〜１
８９ （１９８／ｌ ） Ａ（２４）
ｌｅｅ、Ｃ，Ｄ、＆ Ｌｕ５ｃ、ｌ）、Ｃ，：
ｒｏｃｕｓ、 ４ ： １〜（２！＋） Ｂ
ｉｒｎｂ（ｌｉＪ Ｉｌ、Ｃ，＆ Ｄｏｌｙ、Ｊ、
： Ｎｕｃｌ、 八ａｉｄｓｌｔｃｓ、７：１５１
３へ・１５２３（１９７９）（２ｆｉ） ＨａＸｉｌ
ｍ、Δ、Ｈ，＆ Ｇ１１ｂｅｒｔ、Ｗ、： Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎｌｎｚｙｍｏｌｏｑｙ、 ６ ５
： ／１９ ８ 〜５ ６０ （１９ε３０ ）
（２７） ＳａｎｇｅｒＪ、、Ｎ１ｃｋｌｃｎ、Ｓ
、 ＆ Ｃｏｕｌｓｏｎ、 八、Ｒ：Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ＾、 ７４ ：
５４６３−５４［２＋１） ＨａｎｉａｔｉＳ、
１．： Ｎ０１６ＣＬＩＩＩ Ｃｌ０１１ｉｎ（１−Ａ
ｌｉｌｌｌｏｒｉｌｌＯｒｌｌｌ Ｈｉｌｎｕａｌ、
Ｃｏ１ｄ ５ｌｌｒ！ｎｊｌ １ｌｉｌｒｌ）
Ｏｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９ε３２）Ｉ’９
） ｌ！Ｉ１６ａｌｌｐｉ１．Ｖ、Ｒ，＆ Ｂ！０
１１（！ｌ、 Ｇ、： ｌｌ０ＣＯＩｌ［。 Ｐｒｏｑ、ｌｌｏｒｍ、Ｉｔｅｓ、、 ３６ ：
７Ｉ ５’ｌ〜 ４ ７Ｇ （’１ ’Ｊ
ε３
ｗポリメラーＵでプラント末端とし、３ａｍｌ′Ｃ−切
断したＭ １３ ｆｖｌ Ｉ）≦）中に９１−゛１−ン
化した。Ｍ１３にＪ、るＩＪべてのｌ） ＮΔ操作むら
びに配９＋１決定はへｍｃｒｓｈａｍのパンフレットゝ
″Ｍ １ ３ ｃｌｏｎｉｎｇ ａ＋ｏｌ ５ｅ
ｑｕｅｎｃｉｎＣ）ｌ＋ａｎｔｌｂｏｏｋ″ ｋ：１］
確に従って行った１、り１１−ン化し、このＩＪ法で一
配ＩＪ１１決定した制限フラグメンｌ−ｔよ第：３１）
図（トの矢印）に示・ｊｏりｒｉ−ンｌ１ｌ−１／ｌ−
１には問題の＆Ｉ＋限部位の荀１ｖ（を指示する。、［
ンドメクレア−ＵＭ ｎ １１ 、 Ｍ ｉｌ ｅ Ｉ
ｌｌ Ｊｊ Ｊ、びＩｔ ｉ ｒ）Ｉ’ ｌにス・１り
ろ１．Ｒ点部（ひの存在は実験的に賄；、Ｒされた１゜
１） Ｎ△配％１１決定の結末は第４図に承す１．読み
ｆｒｙり枠はメクレＡ’ｆド２０の１−ンＡこの１１１
／ＣＩ） Ｎへ中にシめら七しろ。メクレＡｆｌ・６２
・〜・４５１は、じ１ヘリゾブー−１，のアミノ酸配り
１１（第１）図）に１１確に一致し、次に翻訳停止］ト
ン−［Δ△が続＜、１／ＩＩＲ，Ｉの１とし−（疎水性
のアミノ酸＝５′１１ ｃ Ｖ ａ Ｉｔ ｌ−ｅ
ｕ Ｇ １ ｙ Ｉ−ｃ ｕＶ Ｑ ｊ７ １
（３ＬＪ ｌ（３ＬＪ ３ ｅ ｒ Ｖ ａ １
’ｌ ｈｒ Ｖ ａ Ｉ Ｇ ！ ｎ Ｇ Ｉ
Ｖ Ｉ−ｙＳ５′ Ｖ ｌ １等を］−ドするヌクレＡチド２０〜６１は、
他の分泌蛋白質（２９）に類似するＩ−Ｉ Ｌ Ｚリー
ダーまたｔよシグプルペブブドの部分をコードする。ヒ
トルリゾブー−ムのスプライスジ−フンクシ三１ンのア
ミノ酸組成は鶏卵白リゾデームのそれときわめて類似す
る（ヒトプレリゾデーム： Ｇ １ ｎ Ｇ １ ｙ
Ｌ Ｖ Ｓ Ｖ ；１ ｊ！に対し鶏卵白リゾブーム
： Ｌ ｅ ＬＪＧｊ！ｙｌ−ｙｓ Ｖａｎり （１
４ｅｉｓ−ｍａｎ、 １．、 Ｓ、ほか：Ｊ、Ｂｉｏｌ
、Ｃｈｃｍ、、 ２６１ ： ２３０９〜２３１３．１
９ ８ ６ ） 。 例７ ： ｐＩｌｌ １４−２３の構築ＩＩ Ｌ Ｚを
製造するための発現プラスミドの構築にｔよ、ＩＩＬＺ
Ｉ小人体の最長５′末端（り［ｌ−ン１１ Ｌ １４−
１ 、プラスミドｐｌ−ＩＬ１４−１）をＩＩ Ｌ ７
１ｉｆｉ人体のｂｉ長３′末端（クローンＩＩ １２３
．７ ラ’：）、 ミドｌ） ｌ−Ｉ Ｌ−２３） ト
結合すｔ！Ｊ、：（例５ｂ）。 Ｄ ｌ−Ｉ １２３の１１ＬＺＤＮΔの３′末９１１：
は次の配列を右する。 ＰｓｔＩ １０ ２０
３０ ４
０Ｇ入ｑゴ工匹ンｙ２τＧ ＣＴＴＴＧＣＴ
ＧＣＡ ＡＧＡＴＡＡＣＡＴＣＧＣＴにＡＴ
ＧＣＴＧＳｏ ６０
７０ １１０
ＴＡＧＣＴＴＧＴＧＣＡＡＡＧＡＧＧＧＴＴ
ＧＴＣＣＧＴＧＡＴＣＣＡＣλＡＧにＣＡＴＴλＧＡＧ
ＣＡＴＧＧ ＧＴＧＧＣＡＴＧＧＡ
ＧＡＡＡＴＣＧＴＴＧ ＴＣＡＡＡＡＣＡＧＡ
ａｅＩＩＺ ＩＪＱ Ｌ４０
ＬＳＯ１６０ＧＡＴにＴＣＣＧ’ｒＣＡＧＴＡＴ
にτＴＣＡ ＡＧＧＴＴＧＴＧＧＡ
ＧＴＧＴＡＡＣＴＣＣＡＧＡＡｍＴＣＣＴＴＣＴＴ
ＣＡＧＣＴ ＣＡＴＴＴＴＧＴＣＴ
ＣＴＣＴＣＡＣＡＡでａｅＩ１１ ．２１０ ２２０
２コ０ ２４
０ＴＡＡＧＧＧＡにＴＡ ＧＧＴＴＡＡＧＴＧＡ
ＡＡＧＧＴＣＡＣＡＴ ＡＣＣＡＴＴＡＴＴＴ
２５０ ２６Ｇ ＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ ＧＧＧＧＧＧＧＣＧＧ
３’ｒ） ｓ ｔ、１部位ｊ；での５′末端
（第４図）ｔよりｌ１ｌ−１４−１のｌ） Ｎ Ａ配列
に相当する。 ｐ ＩＩ １２３約１μびを３６℃ｒＰｓｔｌおよび１
１ｉｎｄｌ［Ｉににり消化しテ（５０ｍＭ −１’ｒ
ｉ ｓ −１１Ｃｊ！ ｐＨ８，０，１ｍＨＭａＣ
ｌ 、５０ｍＮＮａＣ１，１％？ガロースゲル中で分
離した。 Ｄｒｃｔｚｅｎ、 Ｇ、の方法（Ｄｒｅｔｚｃｎ、 Ｇ
、ほか： Ａｎａｌ。 Ｒｉｏ＜：ｈｅｍ、、 １１２ ： ２９５〜２９Ｂ
、１９８１）によりアガロースゲルから単離した２ ６
Ｏｂｐ艮のＩ’ｓ ｔ Ｉ／ｌ−ｌ ｉ ｎｄ ［［
フラグメントは、ＨＬ Ｚ構）ΔＭ ｌｚ；子の３′末
端を含有づる。このフラグメント（約５００ｎ（Ｊ）を
、ｐｌ−１１−１４−１からの１９０ｂｔ＋ Ｐｓ
ｔ、 ｌ、／ＩＩ ｉ ｎｄＤ１フラグメンＩ−の分離
ｉｔ＋１ｌｌ−１ｆｌ １ （約５０ｎ（１）中で結
合させた。 １） ＮΔの結合は、リゲーシ”ｉンＭＶｊＪ’ａ （
６６ｍＭ丁ｒ ｉ ５−Ｉ−１ｃｊ！ １）１１７．
６．６．６１１１８ＭＱＣｊ！ 、１０ｎ＋ＨＤＴ−
ｒ、１ｍＨｒΔ−１’ Ｐ ）Ｊ３ Ｊ、σ−ｒ ／Ｉ
ｌ） ＮΔリガーピ１中位中、１４℃で一汝、２０
ｕ ｆｌ ｉＩａ合物として実施し、このリゲーシ］ン
混合物を公知方法（Ｈａｎｉａｔｉｓ、 ｒ、ほか：Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏ１ｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ １ｌａｒｌ）ｏｒ Ｐｒｅｓｓ。 ３２２０、１９８２）でのＥ、ｃａｌ ｉ Ｉｌ［３
１０１のコンビテン１〜細胞の形質転換に用いた。 結合 使用した出発原石は、ΔＤＩ−Ｉｔブ１１シークーを１
、５ｋｂＬ％Ｂ ａｍｌ−１１／Ｘ ｈｏ Ｉフラグ
メン１〜どして含有するｐ Ｕ Ｃ１８、Ａ導体Ｆ）
Ｉ： Ｓ １０３とした。ｐＢＳ １０３（１）変ワリ
ニ、ＹＩ’Ｅｃ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）し同様に（
八ｍ１ｌｏｒ（！ｒ。 Ｇ、：ＨｃＬｈｏｄｓ ｉｎ ｒｎｚｙｇ＋ｏｌｏ
ｇｙ、 １ ０１ ： １ ≦３２−２０１．
１９８３）使用できるａＸｔ＋ｏ［部位のＧ、Ｔかに、
ｐｓｊｌＪｊよび１ｌｉｒ１ｄｎ１部位があり、したが
って、大部分のα因子リーグーを３む。 ｐα１：からのα因子迫伝子の２５０ｂｐ長１−４ ｉ
ｎｄ ｉｌｌ／ｐｓ ｔ Ｉフラグメント−（第７図
１よｐ［５１０３のＨｉ ｎ ｄ ｌ［ｌとＰｓｔ１部
位の間にリゲー１〜できる。 Ｉｔ ｉ ｎｄ ＩＩＩ／Ｐｓ ｔ Ｉフラグメンｌ−
のＤＮ△配列は、α因子リーダーとともに公表されてい
る（Ｓｉｎｇｈ、 八、 【よか ：Ｎｕｃｌ、＾ｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ、、−コー１（１２）：４０４９−（
５３，１９８３）。 この［」的には、１μＵのｌ） Ｅ Ｓ １０３および
ｐｃｒＦ５μｙを５ＧｍＨｌ−ｒ ｉ ５−１−１ｃｊ
！１）＋１８．０、Ｉ ＱｍＨＭ（ＪＣＪ！ 、５０
ａ＋ＨＮ ａ Ｃｐ中、３３６℃で１ｌｉｎｄ［ｌおよ
びｐｓｔｌで完全に演化し、上述したと同様にして（例
７）ｐ１ヨＳ １ ０３ （Ｉｆ ｉ ｎｄｌ
ｎ／Ｐｓ ｔ ［） 約５００ｇＪ３ 、Ｉ
び ｐ α １” （Ｈｉ ｎｄ ［［
／Ｐｓ に Ｉ ） 約 ５００ｎｇを用いて
リグ−１−シた。生成したプラスミドはｊ、ｃｏｌｉ
ＨＦ３１０１を形質転換し、α因子リーダーをΔ１）
ＩＩＩプロモーターに対して正しい方向性で含有し、Ｄ
ＷＳ−２０５０と命名された。 Δ０１１１ブ［ｌ′ＩＥ−ターとのスプライスジャンク
ションにＪ３いて２５ｂｌ）のα因子リーダーとＡ １
− Ｇ聞！Ｉｆｆ ］トンを欠くが、これはホスホトリ
エステル法で合成された４０−マーで置換された（Ｅｆ
ｉｍｏｖ、 Ｖ。 八、ばか ：Ｎｕｃｌ、 八ｃｉｄｓ Ｒｃｓ、、
１ ０ ： ６６ ７ ５〜９４．１９８２）。 この目的には、ｐｗｓ ２０５ Ｄを５０ｍＨＴｒ ｉ
５−ＨＣＪ！ ｐＨｓ、 Ｏ１ｉｏｍ＋１ＭｇＣｌ
、５０ＩＩｌ！Ｉ ＮａＣ１中、３６℃にＪ３いて、
Ｘｈｏ ＩおよびＰｓｔＩで完全に洞化した。 ＸｈＯＩおよびｐｓｔｌ末端を与えるオリゴヌクレオチ
ド をＸｈＯＩ−Ｐｓｔｌ切１１７ｉ ｐＷｓ ２０５ Ｄ
とリゲートした。すなわち、オリゴヌクレオチドを１０
ｐｍｏ Ｉ ／μｍの両度で水に取り、２個のＤＮＡ「
１の溶１５０μｍ部を合して６５℃に１０分間加熱し、
室温に冷ｆＪＩ後、このｒＪ′ａ１μｌをリガーゼ緩衝
液中、例７に記載の条件下、リゲーション反応に用いた
。生成したプラスミドＤＷＳ−２０９Ｄはα因子のコー
ド領域の始まりまでに約１．５ｋｂｔｉｉのＡＤＨＩプ
ロモーターと完全α因子リーダーをもつ領域を含有する
。 １））ＨＬ−Ｚｍｍ壬子のα因子リーダーの結合ｐＷｓ
２０９ｆ）中のα因子リーダー配列は１−１ ｉ ｎ
＜１ ｍ部位で終わり、ｐＨｌ−１４−２３中のＨＬ
Ｚ遺伝ｒμ３′末端においてＩ−１ｉ ｎ ｄ Ｉ［１
部位と結合し５′末端にＪ３いて３ａｊ！ Ｉ部位と結
合するので、ｏｌ１１４−２３をＱｍＨＴｒｉｓ−１１
ｃｊ！ｒ＋ｌ１８．ｏ、６ｍＨＭＯＣＩ 、１５０閣
ＨＮ ａ Ｃ１１３６℃においてＳａｊ！Ｉにより完全
にｄ′１化し、突出端をＫ１６ｎＯＷポリメラーゼで充
填した（例７の場合と同様にリガーピ緩衝液中総′ｆ￥
吊２５μ１１切所ＤＮＡ０．５μ９、ｄ Ａ １−１）
、ｄ ｌ−１−Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄｃｔＴＰそれぞれ１０
０ｔｔ Ｍ、にｌｃｎｏｗボリメラーピ１単位、室温、
３０分）。プラン１〜末端化５ａ１ｒ消化生成物の精製
は１％アガ［］−スグル中で実施した。次に、合成１１
ｉｎ（オニリンカ−（Ｎｅｗ ［ｎｇｌａｎｄ ８ｉｏ
Ｌａｂｓ ）を用いてリンノノーリゲーションを行った
（ＨａｎｉａＬｉＳ。 ［、はか： Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ。 １１ａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、 ３１６真、１９８２）
、リンノｊ−（よ、水に１μＪ／μｍになるように取っ
た。 １１ｉｎｄｌ［Ｉリンカ−のキナーＬＪ処ＩＩＩ！は１
０×リンカ−キナ−ぜ処Ｉ！ＩＩ！ＦＪｆｉ液（０，６
６ＨＴｒ ｉ ｓ −１−ＩＣｊ！ ｐＨ７，９，１
０ｍｔ４ Δ］°Ｐ、１０ｍ）ｌスペルミジン、０．
１ＨｆｖｌａＣＪ！ 、１０ｍＨｌ）ｒ’ｒ、ＢＳＡ
２ＩＩＩ！Ｆ／ｄ）１μ１１リンカ−１μｌ、水６μｌ
およびＴ ４ Ｄ Ｎ Ａキナ−ぜ２単位の反応涙金物
中、３７℃で１時間実施した。＝ｌ’ Ｊ−−Ｌ’処理
１１ｉｎｄｌ［［リンカ−とのリンカーリゲージコンは
、３ａｊ！ＩＪ３よびにＩｃｎｏｗボリメラービで処理
したｐｌ−Ｉ １１４−２３約５μｌと、Ｔ ／Ｉ ｌ
） Ｎ△リノＪ−ゼ１０単位を含む１Ｘリンカーキノー
−ピ処理緩衝液中、１４℃で一夜実施した。Ｈ１７’ｒ
貞仏子が２個のト１ ｉ ｎ ｄ ［［部位が側面に置
かれた生成プーノスミドｐＳＷ２０７ＤにＪ、すＦ、ｃ
ｏｊ！１１−１ ［３１０１を形′ｄ転換した。 １μびのｐＷｓ２０７ＤをＩｆ ｉ ｒ）ｄ ＩＩＩ
Ｆ消１ｔ（５０ｍＨ王ｒｉｓ−ｌ−１にｊ！ ｐｌ＋
ｓ、ｏ、１０ ｍＮＭＱＣｊ！ 、５０ｍＨＮａＣ〕
！、３Ｇ℃）Ｌ、たのら、＋１ Ｌ Ｚ項仏子は１１ｉ
ｎｄＩ［［切断ｐＷｓ２０９Ｄ （５μ’１ ） ＋ｌ
ＮＩ ｉ ｎｄ ［１フラグメン１〜としてα因子リー
ダーの’＋’ｉ ｊｊにリグ−１−りることがでさ°た
。リガーＵ１シ応には、１ｌｉｎｄｌｌｌフラグメント
を１％アガ〔−１−スグル中で分頗１、甲離したの＃；
（Ｄｒｅｔｚｃｎはか＝１１を出）、ｐＷｓ２０７１
）約５５００りおよびｐＷｓ２０９Ｄ５００ ＋＋ｇを
リグ−ジョン緩衝液（６６ｎ＋ＨＴｒｉｓ−１ＩＣｊ！
ｐＨ７、Ｇ、６６ｉＨｆｖｌｏｃｊ！ 、１０ｍ
ＨＤＴＴ、１ｍＨｒΔＴ ｌ）およびＴ ４ Ｄ Ｎ
Ａり万−Ｌ’ １ ｊｒｉ位）からなる混合物２０μｌ
中で使用しＩ、：、、反応ｔよ１４℃で一夜実施した。 、＋−＋ １−２遺伝子をα因子リーダーまたはへＤ
ＨＩプロモーターに対して正しい方向性に含有する生成
プラスミドをＦ）ＷＳ２１５Ｄと命名した。 Ｃ）α因子リーダーと１１１． Ｚ遺伝子間の正確な変
５１−： １−１１７遺伝子の正確ξＮ末端を生成させるに髪よ、
α因子の成熟に必要なプロテアーゼ切断部位が成熟ＩＩ
Ｌ Ｚの最初のアミノ酸の配列の前に正確に位ｉｉ’
ｆ ’Ｊることが必要である。すなわら、ＣＤＮΔの構
築に由来づる過剰のヌクレオチド（約２０ｄＧ−（１０
対）ＪｊＪ、び標品トＩ Ｌ Ｄリーダー配列をコード
するヌクレオチドを除ムしな警Ｊれｉ、【ムらか′、）
ｌこ。 プラスミドＤＷＳ２１５ＤをＩ−）Ｓ ｔ、 Ｉ （５
０ｐＩｌｌ（Ｉ−ｒｉｓ−１ｔＣｊ！ Ｃｉｌ８．Ｏ
１１０ｍＭｆＶＩｇｃｊ！ 、５０ｉＨＮａＣ１，３
６℃）で完全に演化し、α因子リーダーの大きな部分と
１１１２遺伝子の５′末端を含む５００ ｂｌ）艮フラ
グメントを１％アガロースゲルから１’−ｆｉｔ した
（ ｌ１ｒｃｔｚｅｎ ＬＪか一＋Ｍｒ出） 。ｃａｒ
ｔｅｒらの方法に従イ（Ｃｉｌ「ｔｏｒ、 ｐ、 。 Ｂｃｄｏｕｌｌｅ、１１．、Ｗｉｎｔｅｒ、Ｇ、：Ｎｕ
ｃｌ、＾ｃｉｄｓ ｌ１ｅｓ、 、ニーａ：４４３
１〜４３．１９８５）、Ｍ１３ ａｍＤ１８−ａｍ４中にり１］−ン化し、［、ｃｏｊ！
ｉ ＴＧＩ株を形′ｄ転換した。 所望の方向性をもつ組換えファージ、△２を１ｎＶｉＬ
ｒＯ突然変異のための一本鎖１） Ｎ Ａの原ｒ１とし
て用いた。ｔＡ 望Ｄ Ｎ△をジデオキシ配ｌす決定の
１こめに調製した（ Ｍ １３ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎ
ｄ ｓＨｕｅｎｃｉｎｇｈａｎｄｂｏｏｋ、 八ｍｅ
ｒｓｈａｎ＋ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐｌ
ｃ。 Ａｍｃｒｓｈａｍ Ｉｔに）、１α囚子リーダーとｌ−
Ｉ Ｌ Ｚ Ｗ ７’ ＩＪｉｌに所望の変異を含む２
０−マーオリゴヌクレオブトＥＤ Ｉ １２４、ｄＬＪ
、ヒＭ １３ヘクタ−中ニ？’７：在するアンバー変異
を矯正する１７一マー選択ＡリゴメクレＡチド［１３１
２３４をホスボトリエステルン人 （ｒ：ｒｉｍｏｖ、
Ｖ 八、 はか ： Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ、、１ ０ ：６６７５・〜・０４．１９８２
）によって合成し、ベレバラテイブポリアクリルアミド
ゲル電気泳仙にＪ、って精製し、第二のＤＮＡ鎖の合成
用のブライン−として用いた。Ａリゴメクレオｆ−ド突
然変異講発ｉ、Ｌ、はぼ１ｏｌｌｃｒの方法（Ｚｏｌｌ
ｃｒ、 Ｈ，Ｊ、 ＆５ｌｉｔｈ、 Ｈ，： ＤＮＡ、
３ ： ４７９〜４８８．１９Ｅ３ ／Ｉ ）に従っ
て実施した。配列！）゛ へへＧＡＧｒＣ
ＩＧＩＣＣへ１Ｃ八八 ３゜をイ１゛りる
選ＩＲＡリボヌクレオチドＥ ｒ３＋ ２３／１．１
：）Ｏｐｍ ＯＩ によび配＆ｌＩ！）°
Ｇ６八１Ａ八八八ＧＡ＾＾ＧＯＩＣｒｔｌ（ｉ
３゜を４ｉ−Ｊる突然変安講光ブライマーＦ １３１
１２ ／Ｉを５０ｍ１（ｌ ｒ ｉ ５−１−１ｃｊ！
Ｄｌ１８．０．１０１１１１＋１’ｖ１６ｃ夕 、
１ｍＨｒ八−１−Ｐ、５ ＋ｕＨｔ） ’ｌ’ １の２
０Ｊｊ申、’Ｉ ５ ”Ｃ：でｌ”４ポリヌクレオブト
（）−−ｔＦ （Ｎ（！Ｗ ｌｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬ
ａｂｓ ） ４単１＜ｚ ｔ＝ ４５分間ホスホリル化
し、ついで７０℃に１０分間加熱した。 キナーゼ処理ブライマー各７．５０１１１０１を１０μ
ｌの１０ｍＨＴｒ ｉ ５−ＨＣｊ！ Ｄｌ１８．
Ｏ１１０ｍ１４ＭＯＣｊ！ 、５０ｉＨＮａＣｊ！中
、ＶＩ型ＲＮ八へ ０．５１１＋１１０１と１００℃に３分間加熱してハイ
ブリダイズし、ついで１時間を要して室温まで冷１Ｊ１
シた。再生した混合物を氷上で冷ＩＪ１シ、容ＩＩｌを
２０μｍの１０ｍＨ’ｒｒ ｉ ５−１１ｃｊ！ ｐ
Ｈ８，ＯｌｌｏｍＨＶｇＧｌ 、２５ｉＨＮａＣｊ！
、０．２５ｎ＋ＨｄＮＴＰ（ｄＡ−ｒＰ、（１−ｒ Ｔ
Ｐ、ｄ Ｃ−ｌ−Ｐ、ｄＱＴＰ）、０．２５報１４【
゛Δ丁１〕ぐ゛容ζ１を調整し、ブライマーをＩ／ＩＤ
ＮΔリガーＱ （Ｂ＋ｏＬａｈ！；）１０甲（ひの存在
下にＤ ＮＡボリメラーＬ’１（ＢｉｏＬａｂｓ ）の
人フラグメント１甲ｉｌｌで延１、シた。 反応は１４℃で１（３時間実施した。混合物の小１１１
９分、０．１．１ 、５Ｊｊよび１０μｍを用いて二１
ンピーｙントＥ、ｃａｌ ｉ ｌｌ［３２１５／Ｉ羽
１１泡（リプレツリーなし）の１−ランスノ１りジ」ン
ｔこ用い、細胞ローン（よＨＢ２１５５にＪ、って９え
た（Ｃａｒｔｅｒ、Ｐ、 Ｌまか ：Ｎｕｃｌ、八ｃ
ｉｄＳ １ｔｃｓ、、１ ３ ： ４ ４３１へ一
／Ｉ４／１３．１９８５ ）。 トランスノーＪクシ］ンをｂつたＤＮＡからイ１−じた
２２２個のプラーク中８４個を［Ｂ−プレー１〜十に移
し、３７°０で１６時間生１ｊ？させて感染バクテリア
のコ［に−を１１また。二ｌ−１］ １ｚルロースブ口
ツ１−を調製し、３２１）標識突然変異誘発Ａす゛ｆヌ
クレＡヂド［Ｆ３１１２４でスクリーニングした。二１
〜Ｌルル「ｌ−スろ紙は６ Ｘ Ｓ Ｓ Ｐ Ｅ（０、
９ＭＮａＣｌ、０．０６８ Ｎａ１−Ｉ Ｐｏ 、
６ｍＭ１−ｉ １） ＴΔ）中、室温で５分間前洗浄し
、ハイプリダイピーシ三１ン緩衝液ｔ ６ Ｘ Ｓ Ｓ
ｌ） Ｅ、１％５ａｒｋｏｓＶ＋（ｓ；Ｕｍａ＞ 、
ランダムに切断したｔＲＮΔ１００μＩＪ／ｍｌ中、３
７℃で１５分間ブレハイブリダイズし、ついｒｏ、４ｘ
ｌＯ６ｃｐｍ／ｄのプローブを含有するハイプリダイピ
ージョン緩衝液中、室４（２２℃）で１６時間ハイブリ
ダイズした。、ブ［１−ブは５′末端を（７−３２Ｐ）
Δ丁［）で標識した。突然変異誘発プライマーＬＥＬ３
１１２４ （３０ｒｍｏｌ）を２０ｕｌの５シｍＨＴｒ
ｉ ５−ＬＩＣＪ！ ＤＩＩ７．６．１０＋ＨＭＯ
ＣＩ 、１０ｍＭ ＤＴＴ、Ｉｍ）４スペルミジン
、ＢＳ△１００ｔ１９／ｒｒｔｌｄ３よび１０ｒｍａｌ
の（γ−３２Ｐ）ＡｒＰ （５，０ＯＯＣｉ ／ｍｍｏ
ｌ、八ｍｃｒＳｈａｍ）中３７℃において、−１−４ボ
リメクレ、４ブードキナーゼ（ＢｉｏＬａｂｓ ） ／
ｌ甲（イｌにＪ、す１１−スホリル化した。ついで反応
混合物をＢｉｏｇｃｌ Ｐ−６ｔ） （：１（Ｂｉｏｒ
ａｄ） −ｔ 、 ＴＥＢｍ、ｅＩ（１０１１１８１ｒ
ｉ ５−＝ＨＣｊ！ Ｄｔ１７．５．１ｍＨＥｔ）
ｒΔ）を用イテクＩ：１７１−グラフィーに（＝Ｊ Ｌ
、導入されなかった（γ−３２Ｐ ） Ａ Ｔ ＋）を
３２ｐ標識ＡリゴヌクレＡブトから分離した。 ハイブリダイピーシコン後、ろ紙を６ Ｘ Ｓ Ｓ Ｃ
（０，ＯＨＮ ａｃｊ２．０．０９８りＩ ンＭ ）’
ｌ−’Ｊウム）巾、室温で５分間ずつ３回洗浄し、６
×ＳＳＣ中３７．４７．５．５０おＪ、び５６°（／
’ｌ’ ５分間ずつ各１回洗浄し、各洗浄（なに、４−
１〜ラジＡグラフイーにｆ・１シた。５６℃（ＩＤ１２
°Ｃ）ｉ股のオー１−ラジオグラフィーで、突然変ｌＩ
ｌ、ｌ講発オリゴヌクレオヂドに強ツノにハイブリダイ
ズした１個のクローン、Ａ２／２５が現れた。１１［定
された突然変廊体ファージをプラーク精製し、純粋な突
！！Ｓ変責捧ファージを同定するために再スクリーニン
グし、欠失を１市ミ２りるため配列決定を行った。 クローンΔ２／２５からの二本ｔｔｌＤＮΔはＹａｎｉ
ｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら（Ｙａｎｉｓｃｌ＋−Ｐｅｒｒ
ｏｎ、 Ｃ，Ｖｉｃｉｒａ。 Ｊ、 ＆ Ｍｅｓｓｉｎｇ、 Ｊ、：Ｇｃｎｅ、、１．
ｌ ： １０３〜１１９．１９８５ ）の記載と同様に
して調製し、ｒ）ｓｌ、１で切断した（５シｍＨＴｒ
ｉ ５−１−１ｃｊ！ｐＨ８，ｏ、１０ｎ＋ＨＭＯＣｊ
！ 、５０ａ＋ＨＮａＣｊ！中約５μ９．３６℃）。 所望のα因子と成熟ＩＩ Ｌ Ｚ遺伝子間の変異を右す
る４４０ｂｐｌ）ｓｔｌフラグメントを１述のようにし
て１％アガ１１−スからｔｉ離しく Ｄｒｃｔｚｃｎほ
か：前出）、以ドにさらにＫＶ Ｉｔに説明Ｊるリゲー
シ］ンに用いた（ １シリ８ Ｑ Ｊ３ 、Ｊ： び
９ ｄ ） 。 ｄ）八〇 ｌ−１１１ターミネータ−おＪ、び１１（７
遺伝了の３′末罎； Δｌ）＋１１１ターミネータ−（Ｂａｉｃｒ、 ０．１
１．。 Ｙｏｕｎｇ、 ［、Ｔ、：Ｎａｔｕｒｅ 、３００
： ７ ２４ 〜７ ２Ｂ 、Ｉ Ｑ ８２
： Ｒｕ５ｓｅｌｌ、Ｄ、Ｗ、ほか： Ｊ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｃｎ＋、、 ２５８：２６７４・〜２６８２．１
９８３ ）を、プラスミドｏ Ａ Ｓ ５５ ｔｌｇの
５ｐｈｌ／Ｘｂｒｌｌによる消化（６ｍＭ １７ｒ
ｉ ５−１１ｃｊ！ ＤＩ１７．４ 、６ｍＭ Ｍ
ＯＣｊ！ 、１５０ｍＭ ＮａＣｊ！ 、１ｍＭ
ＤＴＴ、３６℃）でｐΔＳ５から甲１１ｆｌｌ Ｌ、、
ｌ二）本のように１％アガロースゲルからｌｌ’［した
。 ＡＤ１１１１ターミネータ−のＤＮＡ配シリｔよｌ１ｕ
ＳＳＯＩ。 ロー４．ら（前出）ににつて報告さ札ている。 ＯＬＪ Ｃ１８（Ｖｉｃｉｒａ、 Ｊ、、Ｍａｓｓｉｎ
ｇ、 Ｊ、：ＧＣｎｃ、 １９ ：２５９〜２６８ 、
１ ９ ８２ ； Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｃｒｒｏ
ｎｓよ か ：Ｇ橿１０．３３：１０３ 〜１１９ 、
１ ９ ８ ５ ） の（白化は一ヒに１４定され
た条１′１下、Ｓ ｐ ｈ ｌおＪ、びＸ ｂ ａ ｌ
にＪ、って実施した。次に約ｒ）Ｏｎりの間化ベクター
および約５００ ｎりのＡ１）１１１１ターミンーター
（Ｓ ｐｈ Ｉ ／ Ｘ ｂ ａ Ｉノングメントを、
リゲーシー］ン緩肖液（６６ｍＭ ’Ｉ ｒ ｉ ５
−Ｉｔ Ｃｊ！ｐＨ７，６，６、６ｍＭ Ｍ Ｑ Ｃ
，、Ｑ 、 １０ｍ１４１） Ｔ Ｔ、１ ｍＨｒ
Ａ ｌ’ Ｉ））中反１．６ ’ｒｌ ：ｔｉ ２０
ｕ Ｑで、Ｔ ４１） ＮΔリガーピ１甲位にＪ、す１
４ ”Ｃで−（ｋリグ−１〜した。生成したプラスミド
ｐＷｓ２１３１）でＬＥ、ｃａｌ ｉ １１［３１０
１を；１ぢ７′１転換した。。 ＦＮｌ１１／Ｉ ２３からのＩＩＬＺ ｌ’）ＮΔ
は停止コドン後にしさらに非１１３号領域のヌクレＡブ
トどｃ Ｉ） Ｎ Ａブレバレージョンに由来Ｊる２
０ ｄ Ｃ−ｄ Ｇり・１のス１−レッｙ−を有するの
で、これらを除去した。この１−１的で、ｐｌ−１１１
／１−２３をＭ ａ ｃ ＩＩＩにＪ、す８１１化しく
２０ｍＨＴｒ ｉ ５−１ｌｃｊ！＋＋ｌ１８．０．６
ｍＨＭ（ＪＣｊ！ 、３５０ｍＭＮ ａ Ｃ！、１ｍ
ＨＤ１−１°、４５℃）、単離した（ Ｄｒｃｔｚｃｎ
ほか：前出）、２８０ｂｌ）［４の１１７られたＭ ａ
ｃ ｌｌ−フラグメントを正確に停止コドンで明所し
た。ＬＩ Ｌ Ｚ 遺伝子の３′末端を含有する。 反応容１儂２５μｌ、リガーｆ！緩衝液（上述）中、Ｍ
ａ ｅ ［１１切断ＤＮＡ約０．５μｑを１１００Ｉ
Ｉのｄ△”「［）、ｄ ’Ｔ Ｔ Ｐ、（Ｉ ＣＴ Ｉ
）、ｄ Ｇ −ｒ Ｐおよび１単位のに１ｏｎＯＷポリ
メラーぜと室温で３０分間反応さＵ、突出端をにｌｃｎ
ｏｗポリメラーゼで充填した。 ｐＷｓ２１３Ｄ約１μｊを３６℃でＳｍａｌｔ、：Ｊ：
つて）肖化しく６ｍＨ−ｒｒ ｉ ５−ＨＣｊ！ ｐ
Ｈ８，ＯｌＧｍＨＭ＜ｘＣｆ 、２０ｍＨＫＣｊり、
ｐＷｓ２１３１）（約５Ｏｒ＋ｏ）のＳ ａ ｒＴＩ
１部（Ｑに、ｐＮ１１４−２３（約５００１１！＋）の
プラン１〜未喘化Ｍ 、’ｌ ＯＩフラグメントをリゲ
ー１−した（条（′１は−に連 ） 。 ＡＤ ＨＩ １ターミネークーに対してｌｌｌ−７ｉ貞
伝子が正しい方向性で９有される生成プラスミドはｐＷ
ｓ ２３５ Ｄと命名された。このプラスミドは＋１Ｌ
Ｚ遺伝子の３′末端を停止コドンまでとついでＡＤ Ｈ
Ｉ ｌクーミネーターを含有Ｊる。１１１７遺伝子とＡ
ＤＮ１１ターミネークーの間に４．ＬプラスミドｐＵｃ
１８の多クローニング部位に由来りるＢａｍＨＩおよび
Ｘ ｂ ａ Ｉ切断部位がある。 ［３有ｍＨ［部位は以下の＋１４築に問題を生じるので
、それを除去した。このし１的には、ｐＷｓ−２３５Ｄ
を３６℃にＬＩ３イて１３有ｍｌｌｌによりリノ断しく
６ｍＨ１’ ｒ ｉ ５−１１ｃｊ！ ｌ’１ｌ１８
．０１０ｍＭＭＯＣｊ！ 、１５０ｍＭ ＮａＣｊ
！、Ｉ ＩＮＤ ’ｒ １’ ） 、突出端をにｌｅｎ
ｏｗボリメラ−１で充填しく上記参照）、上）ホの条ｆ
１下に（例８ｂ）ＳＤＩ ＋リンカーを導入した。生成
したプラスミドはＤＷ２５７Ｄと命名し、くれによって
Ｅ、ｃｏＡｉ ｔｌＢｌｏｌを形質転換した。 ）−Ｉ Ｌ Ｚ遺伝子の３′末端とＡＤＩ−１１１ター
ミネータ−の５′末端の間の結合配列は次のとおりであ
る。 Ｓ’ＨＬＺ−−ＧＴＡＡＣＧＧＧ にＧＡＴＣＧＧＴ
ＣＧＡＣＣＧへＴＣＣＴＣＴＡＧＡ −−ＡＤＨＩｔ
−Ｔｊ’ ｍ−ＣＡＴＴＧ ＣＣＣＣＣＴＭ： ＣＣＡＧＣＴ
ＧＧ ＣＴＡＧＧ ＡＧＡＴＣ’ｒ −−１＝
Ｍ ａ Ｏｍで消化され、にｌｃｎｏｗポリメラーゼで
充填されたｌ−Ｉ Ｌ Ｚの３′末端と停止コドンＡＡ ２＝Ｓｍａ Ｉクローニング部位の残部（ｐＷ Ｓ−２
１３Ｄ） ３−にｌ０ＩＩＯＷポリメラーゼで充填された３ａｒｒ
Ｎ−１１部位 ４＝Ｓａｉｌリンカ−（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏＬａＬ＋ｓ ）５＝３のＢａｍｆ−１１部位の他端（
にＩｃｎｏｗポリメラーゼで開裂、充填） ６ ＝ Ｘ ｂ ａ １部位およびＡＤＩ−１１１ター
ミネータ−の開始 Ｃ）発現力レツ］−の構築 例８ｂで構築されたプラスミドｐＷＳ２１５１つ（約１
μシ）をＰｓｔｌＪ３Ｊ、び１ｌｉｎｄｌｌで澗化しく
例８ａの条件参照）、その結果仝ＩＩ ｌ ｉ ｒｍ伝
子およびα因子リーダーの大部分、４，２ｋｂフラグメ
ントが切り出された。同一条件下でｐＷｓ２５７Ｌ）を
ＰｓｔｌおＪ、び１Ｉｉｎｄ［ｌて・消化し、生じたフ
ラグメン１−を△Ｄｕ１１ターミネーターおよびｌ−Ｉ
Ｌ Ｚ ｍ包子の３′宋喘とｐ ｓ ｔ： １／ Ｌ
ｌ ｉ ｎ ｄ Ｉ１１部位でリグ−１〜した。す７Ｊ
−ピ反応は上述のとおりとした（例８ ｄ ）。生成し
たノ°シスミドｐＷｓ２１８Ｄ中に【３Ｌ、佇由］トン
で終結’Ｊ ７．、） ＨＬ Ｚ １３伝子の３′木端
ト、（ｔ’Ｌ ニＦＡｉ Ｉ！ Ｊ ？ａＡＤＨＩ＋タ
ーミネーターが直接α囚１′−リーグ−の開始部に荀ｋ
ｙｆする。発現力ヒツトを完成Ｊるためには、α因子リ
ーダーの大部分と１１ ｌ ｌ 逍（ｔ：了の５）′末
端およびこれらの２敢累間のｉＩ シい変γ−：をＪ、
だ欠いている。したがって、１列８ｃ′Ｃ−調１１ Ｌ
ｌコ突然変責講ブｉ：４４０１１ｒｌｌＱｌ〕Ｓ Ｌ
１ノラグメン１〜（約５０Ｏｎ！Ｊ）を上述の条件下に
Ｌ）Ｗ３２１ Ｆ’Ｓ ｌ）（約５０ｎす）のｌ） Ｓ
ｌ： ｌ切断部位にリグ−１−シた。 ４ ／Ｉ Ｏｂｐ艮１）ｓＬｌフラグメン１−（Ｉｌｌ
−Ｚ項仏子の５′末端とα因子リーグーの大部分−３′
末端）がΔＤ ｌ−１１ノ［１■−ターまたはＩＩ Ｌ
Ｚ遺伝子の３′末端に対して正しい方向性をｂつプラ
スミドはＤＷＳ２９ＯＬ）と命名した。上１本の要素寸
べてを正しい配列、相ｎに正しい方向性で含み、各費木
問に改良された正確な変異を有１゛る。各要本は、１／
１５０ｂＤ ΔＤ ＋１１ブＯ′ｌ−一ター、２ （
Ｓ Ｏｂｐ（Ｘ因子リーダー（プロテアービ切１ｇｉ部
位を丁１−ドする配列で終わる） 、３６０ｂｌ）
ＬＩ Ｌ Ｚ遺伝子（成熟ＨＬ Ｚ蛋白質の配列に隣接
するリジンの］トンで始まり、ｌＩＬＺｍ伝子の停止コ
ドンで終わる）、３３０ｂｐ ＡＤＩ−１１ｔターミ
ネークーである。 ｆ ） Ｍ Ｉｌｌ内でのｌ−Ｉ Ｌ 、７の発現発現
カレツｈｐＷｓ２９０Ｄ（５μ！？）を３６℃において
ｌ−１ｉｎｄｌ［ＩＩ３よび３μｍＨ［ｒ消化しく５０
ＩＮ Ｔｒ ｉ ５−１−１ｃｊ！ １１８．０１
ｌＱ＋ａＨＭ＜］Ｃｊ！ 、５０ＩＮ Ｎａ（，１
）、これｂあらかじめｌ！ ｉ ｎ ｄ ｌ［［に、Ｌ
びＢａｍ１ｌｌで切断した多コピーベクターＦ） Ｊ
ｌ） ［３−２０７（１μ！Ｉ）中にリグ−１−シた。 発現力レツｈ ｐＷ Ｓ ２９０１） （５１１す）に
、Ｊ、び多コピーベクターｐ Ｊ Ｉ） ［３２０７（
１μｒＪ）（Ｂｃｇｇｓ、 Ｊ、Ｄ、 ：Ｇｅ＋＋ｅ
ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ ｙｅａｓｔ。 ＷｉｌｌｉａＩｌｌｓｏｎ、 ｒ＜、 Ｎ 、 ｃ
ｃｎｃｔｔｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ。 Ｖｏｌ、２． ＾ＣａｄＱＩｌｉＣｐｒｅｓｓ、
１Ｏｎ（Ｉｏｎ １’ＪＩ口、１７５〜２０３頁、Ｉ
’）８Ｍ３１８１）を３３６℃にＪｊい−（Ｌｌ ｉ
ｎ ｄ ｍ によび１３ ａ ｍ Ｌｌ ｌで消化した
（ ５０ ＋ｎｔｌＴ ｒ ｉ ５−１１ｃＪ！
１１１１８． ０、１０ＩＮＭＱＣ！ 、５０
ＩＮ ＮａＣｌ ）、 得られたＨｉ ｎ ｄ ｌ［
［／１１ ａｍｌｌ ｌフラグメン１−（約５００ｎｏ
＞を、開裂した多コピープラスミドｐＪＤＢ２０７ （
約５Ｏｎ＋１）中にリグ−１〜した（リゲーシ］ン緩衝
液との混合物２０μｌ、例７に特定した条件下、Ｔ ４
１） Ｎへリガーげ１単位）。 ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｃｓ ｃｅｒｃｖｉｓｉａｅの
各種へ５１コリリックｆｒｔｍ株をこのＩラスミド１２
９／２９で次のにうに形質転換した（ Ｂｃｇｇｓ、
Ｊ、口、 ：Ｎａｔｕｒｃ、 ２７ Ｅ＞ ：１０４
〜１０９．１９７８）。−夜ＹＰＩ）（１％バクｈ Ｍ
ＤＩ抽出液、２％バクトペブトン、２％グル］−ス）
中で一模予備培養を行い、Ｙ Ｐ Ｄ ５０ｄニ１０７
１１Ｆ、ｌ＃！（７）１１１１１４１１’Ｌ、、、２８
℃Ｆ ２１！！代ｊ８養したく通常３Ｉ１１間）。生成
物を５．０００ｒｐａ＋で５分間遠心分離し、細胞をＳ
ＥＤ （１８ソルビＩ・−ル、２５ｍＨＥＩ）Ｉ−Δ、
ｐＨ８，０１５０叶 ｌ″） ’Ｉ−Ｔ’ ＞ ５ ａ
ｔｅ中に再懸濁し、３０℃で１０分間穏やかに攪１′ｒ
シた。生成物を１．６０Ｏｒｐｍで５分間遠心分離し、
ＳＣ［（ＩＨソルビ１〜−ル、０．１Ｈり１ン酸三ナト
リウム、ｐＨ５，８，１０＋ｎＨｌｌ） Ｉ−Ａ ＞中
に再懸濁し、この１００μｌをとって、水２．９ｄに懸
濁した。スフ」−１１ブラストの／１成を６００ ｎｍ
で測定した。ついで５０μｌのグラスラーピ処理を２８
℃Ｃ徐やかに攪ｆｆ Ｌながら実施した。処！ＩＩＩ
Ｉｌ、’ｉ問を変えてさらにスフ土［１ブうスト１００
／１１を採取し、水２．９＋＋ｆに懸濁し、［を測定
した。６００１１０１の吸光１ｑが初１！１１狛の約３
０％に低下したとぎ（通常２０〜３０分後）、細胞を１
，６００ｒｒ１ｍで遠心分離しＩご（ベンチ遠心分ｍ１
ｌｌ）。スフエロプラストをＣｒ１Ｓ（ＩＨソルビトー
ル、１０ＩＮ ＣａＣｊ！ 、１０ｍＭＴｒ ｉ
５−ｌ−１ｃｊ！ ＤＩＩ７．５） ５ｄで１回洗浄
し、再びゆっくり遠心分−１し、Ｃａ５０．５ｄに取っ
た。スフエロプラス１−の一部を取り、プラスミド１）
ＮＡ （１２９／２９）１μりを加え（大官Ｍのｌ）Ｎ
Δ溶液の場合は、これを１Ｍソルビ１−−ルに調整する
必要がある）、１５分間室温に改質したのらＰＥＧ（２
０％ｗ／ｖ ＰＦ−Ｇ／１０００．１０ＩＮ （：ａＱ
Ｊ 、 １０＋１１）Ｉ ＴｒｉＳ−１１ｃＪ！回７．
５、滅菌ろ過）を加えた。この混合物を１５分間室温に
放置し、Ｉ 、 ６００ ｒｐｍ ′Ｃ’ ｊｑ心分！
ＩＩシ（ベンチ遠心分子ｉ１＋＞、ベレットを５Ｏ３（
１８ソルビトール、３３％ｖ／ｖ Ｙ Ｐ ｌ）、（３
、５） ｍＨＣａＣｌ 、選択された滅菌アミノ酸１３
．５ｕｌ）１５０ｕｊ！に再懸濁し、３０℃に２０分間
敢放置た。この混合物を前６つ−（”Ｉ ５）℃に冷１
」１シたトツアアガールＴＩＭソルビトール、２．５％
アガール、０ 、６７９ＣＩ’３ Ｙ Ｎ ［３Ｗ Ｏ
；ｘ ａ（バク１〜酵１ｕ′省克１ｑ ３Ｊ、アミノ酸
を含まない）、２％グルＴ１−ス、１％１００ Ｘアミ
ノ酸混合物］３Ｉｄ中で・穏やかに撮画し、ボトルアガ
ールプレ−１・（２するアガール、０．６７％１３ Ｙ
Ｎ ［３ｗ 。 Ｆｌ ａ、２％グル−１−ス、１・゛ンブアガールと同
じアミノ酸混合物）Ｌに注さ′、３０”Ｃｒ２〜／Ｉ［
１間培養した。、１００ｘアミノ酸混合物−１０ＬＪ
ｆよ２Ｕ／ｌの７ ｉ’ニン硫酸塩、アルギニン、ウラ
シル、アスパラ１゛ン、グルタミン、じス升ジン、メチ
Ａ二ン、リジン、ｆロジン、）−［ニルアラニン、バリ
ン、スレ４ニン、Ｉ・リブトファンを含（−４シた。 形１１転Ｊ＆ 酵１７１株（ＳａＣＣ１１ａｒＱＩ！Ｉ
Ｉ／ＣｅＳ Ｃｅｌ”ｌＯＶ！Ｓ！１ｌＱ）はｓ ＜：
−ｊ！ Ｑ ｕ （０、６７％バクト酵母窒素塩単−
７ミノ醇）ｌ含イｊ、５％グルコース、１％１００×ノ
′ミノ酎混含物−１ｅ ＩＪ ）上、３０℃で培養した
。 以１；の人はリゾデーム発現の結果を示１」１．リゾブ
ームの１１１はりゾブームに対する１４異的抗体の結合
にＪ、って（Ｆｊ！ｉｓａ試験）定立した。 形質転換体 株 リゾブー１１（ｍシ、
、／ 、ｙ ｌｒ；苺液） １／２９ ＷＳ２１−り ０． ／１１／
３１． ＷＳ２１−５ ０．３１２／３０
ＷＳ２１−３ ０．８≦）２／３１
ＷＳ２１−３ ０．／Ｉ２６／３０ ＷＳ
２１−１ １．０６／３１ ＷＳ２１−’Ｉ
１． ２Ｗ Ｓ ２１ −１ ＝ ａ １ｃ
ｕ２ １＋ｉｓ３ １゛ｐｌ １＋ｃｐ４ＷＳ ２１
−３ ＝ａ １ｃｕ２ ｔ＋ｉｓ３ ｕｒａ３ ｐｃｐ
４ＷＳ ２１ ５ ＝ａ １ｃｕ２１１！３３ ｔｒｐ
ｉ ａｒｇＩ Ｉｔ（４９４例９：α囚子ブ［：］ ］
ｌｌクーー制御の発現カレットの構築 α因子遺伝子のｌ−ｌ ｉ ｎ ｄ ［１およびｓａｘ
１部（＜／の間への５１４種遺伝子の１誘人について
は報告がある（ Ｂｉｔｔｅｒ、 Ｇ八、ほか： Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａ１１．＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ。 ＩＩｓ＾、Ｅ３１：／ｌ６４２〜４６．１９８４）
。 １’ ｃ ＯＲＩ Ｊ Ｊ、び１Ｉｉｎｄｌ［１部位間
の配’／１１はプ【コＥ−りＪｊよびリーダーベブヂド
として作用し、一方、Ｓａｊ！ ｌと［ｃｏＲ１部位間
の配列は転写ターミネークーとして作用する。 ａ）適当なベクター内へのα因子遺伝子のクローニング α因子ｊＷ伝子をｐ（）Ｃ１３誘）＃体ρα［：（５Ｉ
Ｉ Ｊ ）からＥ ｃ ｏ ＲＩフラグメントどしく甲
１１１１１ Ｌ。 （１００１１１８’Ｉ’ ｒ ｉ ５−１ｔＣＪ！
０１１７．５．５〜ｌＭ ＜Ｅ Ｃｆｔ 、 ５０
ｍＨＮ ａ Ｃｊ！、１ｍＨＤＴ−Ｔ、３６’Ｃ）、ベ
クターＶ２中にり１コーン化した。ベクターＶ２は次の
Ｊ、うにしで構染しＩこ。すなわら、Ｄ Ｕ Ｃ１（３
を３ ｉｌ ｒＴｌ ｌおよび１ｌｉｎｄｌｌ［で開裂
し、末端（よＬ述のＪ、−）にしくＫｌｃｎｏｗボリメ
”／−１２”（’ｆ色填し、残ｈ１のｒ＋ ＬＪ Ｃ１
ε３を生成したベクターＶ２が九Ｉ／） １０１１１．
ｌ （７） ’） Ｌｌ −Ｌ ン’／ ＲＩＳ ｆ
Ｑ （Ｊ） ’） ラ：”Ｓ ｆｌ１４、・Ｊ４ｃわら
ｌ−、ｃ Ｏｌ？ Ｉ 、 Ｓ ｓ ｔ ｌおよびＫ
ｐ ｎ ） シがした／、ｆいように再すゲー１−シた
。したかつ（ベクターＶ２は１１ｉｎｄ１［１また（よ
Ｓ；１４！１部位（よら１１！したず、これらの２酵素
の切断部ＩＩ／はα因子遺伝子中にしか存在しない。ベ
クターＶ２（１１１１をＥ ｃ ｏ Ｒｌ テ消化し、
にＧ ＯＩ＜［ｉ白化１）α］−約５０ Ｏｒ＋すをＥ
ＣＯ＋＜［消化２約５０ｎｇ中にリゲー１〜した（リガ
ーゼ反応は例７に記載）。生成したプラスミドρＷＳ２
３０Ｄで［、−、ｃｏｆｉｌ−１１３１０１を形質転換
し、以後の横築に用いた（例９ｂ、ｃ）。プラスミドＤ
ＷＳ２３０１）（第１４ａ図）のＰｓｔｌ／［１０Ｊ！
ＩＩノラグメントは約≦）００ｂｐ艮のブ［−１し一タ
ーを含有１Ｊる。モの隣のｌ） ｓ １．１部（ひは翻
訳領域の内側約２５１＋Ｈにある。 ４０月の１−１ ｉｎ （Ｉ １１１部１１／に隣）３
１」るｐ ｓ １．１部位の前約２５ ｂｐＪｊよ（ｆ
サ’Ｊ Ｌ−Ｊ流ニ、α囚Ｔ Ｏ） ｌｌｌ１． ’
す°に必用な１）ＮΔ領領域ある１、α囚「のリーグ−
＾ｉ！ ９１１＋、’Ｌ コ（７）第２（７）ＰＳＬＩ
部位、 （７） ｌｉ方ＦＪ ２５ ｂｐ（ΔＴ Ｇ
）に始まり、かなり１１゛（イ「に４個のＩｆ ｉ ｎ
、ｄ ｍ部位の最初（・終結する。、クーミネークーは
Ｓ ａ Ｑ Ｉど［二ｃ ｏ Ｉ’＜ １部（Ｑの間に
ある。 １））１〜ｌ １．７ ｉ貞包子のα因子ｊ真（ｌ、子
への結合ＬＩ Ｌ ｉ ｉＭ １／１了をα因ｒブ【］
」［−クーニしたはり−ミネークーにス・１シ１１−シ
い方向＋ｔ１で導入するためには、ｐＨｌ−１／ｌ−２
３の側部に位置−・ＪるＩＩ ｉ ｎ ｄ ＩＩＩ Ｊ
ｊＪ、びＳａｆ！制限切断部（ＣＩを変化さｔ！わぽな
ら＜ｋい９．このためには、Ｄ ＩＩ １１ ’１−２
３約５μりを５ａ１１ （６ｍ）ｌ Ｔｒ″１ｓ−１
１ｃｊ！ｐＨＬ３，ｏ、ＯｍＨＭ＜】Ｃｊ！ 、１５
０ｍＨＮ ａ Ｃｆｌ 、 ３６°Ｃ）まｔｓはｌ−１
ｉ ｎｄＩ［［（ｂｏｍＨｌ−ｒ ｉ ５−１１ｃｊ！
＋１１１８．０．１ＧｍＨＭ ＜］ Ｇ １ 、
！’５０ ｍｆ４ Ｎ ａ Ｃ１、３６℃）で切断し
、突出端をそれぞれにｌｃｎｏｗポリメシービで充填し
く Ｍ ８ ｂのＪ、うに切断１） Ｎ八 〇、５ｔｔ
ｙ、反応８ ｈ３２５μ！＞、反応混合物を１％アガロ
ースゲル中で精製した。１Ｉｉｎｄ［［リンカ−（Ｎｅ
ｗｌ’ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｔ＋Ｓ）は５ａｊＮ部
位（ｐ Ｗ Ｓ ２０７ Ｄ ）にリグ−１−シ、ＳＯ
Ｎ ＋リンカー（Ｎｅｗ ［ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ ）はｌ−ｌ ｉ ｎ （１■部位（ｔ）Ｗｓ２０
６Ｄ）にリゲートシ（例８ｂの記載参照） 、［Ｅ、ｃ
ｏｊ！ ｉ Ｈｔ３１０１を形質転換した。１．成し
たプラスミドｐＷｓ２０６ＤおよびｐＷｓ２０７１）（
それぞれ約５μび）を［ｃｏＲＩＪｊＪ、びＰｓｔｉＣ
切断しく ：〕Ｏｗ＋Ｈ１−ｒ ｉ ５−１１ｃｊ
！ ＤＩＩＥＩ Ｏｌ １０ｍｔ４Ｍ ＯＣ１、
５０ｍＨＮ ａ Ｃｊ！ 、 ３６℃）、Ｌ述のりガー
ゼ反応条ｆ１下に（例７〉たがいにリゲーｌ−ｃ５１ｉ
、プラスミドｐ Ｗ Ｓ ２０ ＲＩ）をＩＩｌ／こ。 この場合し、例８（１に記載のＩＩ ｌ−Ｚ ｉ貞伝丁
の３′末端に（よ１”）止〕トンの復にざらにヌクレＡ
ｆドがあるという問題がある。このため、Ｉｌｌ／ｉ貞
伝了の３包子端を次のＪ、うにＰ：’ ＋Ｉ： Ｊトン
まで−に’）、：＋縮した。プラスミドｐＷｓ２５７［
）（例８ （ｉの（１１１簗）は１１１７逍伝子の鈴止
−１トン、１、ζ・の３′未喘に続いて５ａｉ１部（１
／とΔＤｌｌ１１クーミネークーを含み、これはこの場
合の構築に無関係て゛ある。。 プラスミドｐＷ Ｓ ２０８１）おＪ、ひＤ Ｗ Ｓ
２５７１）をＳａｊ！ ｌおにび）） Ｓ ｔ ｌ Ｃ
完全に消化しＣ（５）ＱｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！
Ｄｌｌε１．０．１０ｍＨＭＯＧ１．５０ｍＨＮ；ｌ
Ｇｉ中１）ｓｔｌ、３Ｇ℃で１時間、ついでＮ ａ Ｃ
１ｆＪ 麿を１５０ｍ旧こ上げて５Ｆ１１１を加える）
、１％アガ１１−ス申で７．１製し、１１− ｔｉｌｌ
ｔ、た（ｏｒｅｔｌｃｎ Ｇｌか：前出）。ｌｌＬ、
／遺１五子の３′末喘を含むｐｗｓ ２５７ ｏのＳａ
ｆ ｔ／Ｐｓ ｔ Ｉ １＝ｉ’／メ＞トをＯＷ ３２
０８１）のＳａＪ Ｉ／Ｐｓｔ ｌフラグメン１−で置
換し、ｐＷｓ ２５７ Ｄフラグメン１〜（約５００１
１（Ｊ）を上述のように、ＤＷＳ２０８Ｄ （約５０ｎ
ｅ）のＳａｊ！［／Ｐｓｔ１部位にリゲートηる。 ｉ１成したプラスミドｐＷｓ２１２ＤはＮ１ｎｄｎｌ／
５ｒｌｊ！ｌフラグメントとして全１」Ｌ Ｚ遺伝子を
含み、一方３′宋喘でＨＬ Ｚ遺伝子は停止コドンをｂ
つて終わる。プラスミドｐＷｓ−２１２１）おＪ、びｐ
Ｗｓ２３０Ｄ（例９ａ）をＩ−１ｉ ｎ ｄ Ｉ［ｌお
よびＳ Ｅｌ １１により完全に消化しく５０ｍＭ１’
ｒ ｉ ｓ −ＨＣｊ！ ｐｔ１８ 、０．１０ｍ
ＨＭＯＣｊ！ 、Ｆ）ＯｍＨＮａＣ１中３３６°Ｃｒ
１時間１１ｉｎｄｌにＪ、って処即し、ついでＮ ａ
Ｇ ｐ ｆ５ ＋（ｘを１５０ｍ旧に上背させて５Ｆ１
ｆ［を加える）、ｐＷｓ２１２Ｄから切り出した１１１
７遺伝子を１１ｉｎｄ［１７ラグメントどして（約５０
０ｎす）（」ユ述のＪ、うにして、１％アガロースゲル
から甲ｆｆ１） ｌｌｉ ｒ）ｄｌＩｌ／Ｓａｊ！ Ｉ
Ｆ開裂したベクターニリゲートした（リガーＣ反応は例
７に記、１又のとＪｉす）。生成したプラスミドｐＷｓ
２３１１）中で【、１、ＨＬ Ｚ遺伝子は、α因子ブ［
１し一ターＪｊＪ、びクーミネーターに対して正しい／
ｉｉｆ１で存イＩＪる。 虹１人工ｊ伝−からのＰｓｔ１部１６の除ムα因子遺伝
子は２個のＰｓＬ１部（ひをＴｉ１Ｉろ。 ］−ド領１或内に存在しないひとつが今１１２の（１４
築の主な障害となるので、それをＬス１この操作しごＪ
、って除去した。すなわら、ブ）スミドｐ Ｗ Ｓ ２
：１． ＯＩ）（構築についてはｌ？Ｉ ９ ａ 参
照）１０ｆｌＵを！−） ＯｍＮｌ ｒ ｉ ５−ＩＩ
Ｃ１ｐｌ＋８．０．１０ｍ１Ｍ ＯＣＩ 、５ Ｏｍ
ＨＮ ；） （／ ｊ！中、Ｐｓｌ１１０甲（ずｌによ
り３６℃で１０分間消化しＣ１１）ＷＳ２３０ＤをＰ
Ｓ ｔ ［’（” ｉ’＋ｌｆ ５）’ＪＪ ｆｌｌ
ｉ Ｌ／ ／コ。ＩＴ ｉ、Ｉｒに１個の力゛ントを含
イｉＩＪるフラグメント〈；君′１４ａ図の７ラグメン
１−１３おＪ、ＯＣ） ’ｊ’ １ ％７ ）Ｊ ＩＴ
Ｉ −スゲルから弔１１１１ した ３ ＋ 突出宋◇
＝：を８１＋１１０Ｂ （！ ｉｆ ＩｆヌクレアーＵ
で除去１」るため、［）Ｗ Ｓ ２３０１） ＩＩ）生
成した線状化ＤＮＡ約１μＩＩを水１；１μｍ（ことり
、１０ｍＨＺｎＣｊ！２２ｕｆ１．４８ Ｎａ（、！１
μＪ、０．３ＨＦＩｔ酸ノ１−リウム（ｐＨ４，７５）
２ ｔｔ ｊ！ 、 Ｈｕｎｏ Ｂｅａｎメクレアーｔ
？ （３００甲１◇、ｐＨａｒｌｎａＣ！ｎ ）を加え
／コ。この混合物を１５分間室温に敢防し、ついＣ直接
１％アガ１コースゲルに適用し、゛フラグメン１〜をゲ
ルから１ＩＩ１１シた（ＤＩ’（！ｔ１０ｎほか：前出
参照）。ついでフラグメント１３ Ｊｊ Ｊ、びＣをＭ
リゲートすると（条件は例７に１２１定）、部分消化時
に切断されたｐｓｔ１部位は破壊され、切断されなかっ
た１１［１ｉ１はそのまま残った。この方法で、所望の
ｐｓｔｔ部位はム〒存在しないが、他は残っているプラ
スミドの単離が可能であった（Ｃ’）。このプラスミド
（Ｃ′ ）とＪ、たｐＷｓ２３１Ｄをｐｓ虹［Ｊｊよび
ｒ３ （３１１で完全に消化した（５０ｍＭ ’ｒｒ
ｉ ５−ＮＣｊ！ｐＨ８，ｏ、１０ｍＨＭＱＣｊ！
、５０＋ＨＮａＣｚ、３６℃）、Ｃ’（約５００ｎｏ
）の単離０２フラグメント（８５０ｂｐ）をｐｓ ｔ／
１３ （］ ＩＩＩＩ ８′ｊ化ｐＷＳ２３１Ｄ（約５
０ｎｏ）中にリグ−１〜しくリガーピ反応は例７に記載
したと同様）、プラスミドｐＷｓ−２９４Ｄをｌｒ７た
。このプラスミドｐＷＳ２９４＋）はぼ因子遺伝子を含
イーし、Ｐｓｔ１部位に１１ＬＺ′ｌｉ伝了のご３′末
９：ｔがｉ［しい方向性でｈａ人される。 ｄ）発現カレツ１−の構築 プラスミドＤＷＳ ２９４ Ｄは、α因子ブｌ’ｌ Ｅ
−ターおよびα因子ペブブドの最初からＰ ｓ ｔ
Ｉ ＶＪ断部位まで（約２０ｂｐリーダーベブブド）、
ナらびにその後にＩ−Ｉ Ｌ、 Ｚ ｍ包子の３′末端
をＩ’）ｓｌ、１部位から停止コドンまで含ｎづる。完
全な発現力セラ１〜としてはまだ、α因子リーダーの３
′末端、＋１ＬＺ１１伝了の５′末端、おＪ、びこれら
の２個の要木の間の正しい変異を欠いている。プラスミ
ドｐＷｓ２９４Ｄ（約１μＪ）をＰｓＬＩで完全に消化
しく５０ｍＭ −１−ｒｉｓ−１１ｃｊ！ ｐＨ８
，０，１０ｍＭ ＭＯｃｊ！ 、５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｊ！、３６℃）、プラスミドΔ２／２５からの突然変
１，１．！誘発／１４０ｂｐ Ｐｓｔｌフラグメン１
−（例８Ｃ１約５００ｎｏ＞を例８ｅのにうにしで、ｐ
Ｗｓ ２９４ Ｄのｌ） Ｓ ｔ １部位にリゲーｌ〜
した。生成したプラスミドＤ Ｗ Ｓ ２９ Ｃ５１）
は、α因子遺１五子のプロ七−ウー配＋１Ｉ９００ｂｐ
、α因子リーダー（例Ｑ ｅ ニ３Ｍべた配列の艮ざと
同一）２６０ｂｐ、ＩＩＬＺ遺伝子（例８Ｃに述べた配
列の長さと同一）３６０ｂｐおＪ、びα因子ターミネー
ター２９０ ｂｐからなる発現力Ｕツ１〜を含有する。 文 献 （１） Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ、 Ｄ、Ｃ，： Ｓｃｉ、八
ｍ、、 ２１５ニアＢ〜９０（１９６６） （２） Ｆｌｅｅｃｉｎｇ、 八、： Ｐｒ
ｏｃ、Ｒｏｙ、Ｓｏｃ、５ｃｒＢ ９ ３ ：３
０６〜３０７ （１９２２） （３） Ｂｉｇｇａｒ、 Ｗ、Ｄ、 ＆ ＳＬｕｒｇｃ
ｓｓ、 Ｊ、Ｈ，： Ｉｎｆｅｃｔ。 １ｍｍｕｎｏ１．、１６：９７４〜９Ｂ２ （１９７７
）（４） Ｉｈａｃｏｒｃ、 Ｈ，＆ Ｍｉｌｌｅｔ、
Ｉｌ、Ｐ、：＾Ｉ１１．ＲＯＶ。 １１ｃｓｐ、Ｄｉｓ、、 ９３ニア８６〜７９０（１９
６６）（５） Ｋｌｏｃｋａｒｓ、 Ｈ，１，
＆ ｌ１ｏｂｃｒｌｓ、 Ｐ、： 八Ｃ（，１１１
１ａｃｍａｔｏ１．、 ５ ５ ： ２ ８
≦） ”−２９２（１９７６）（６） １ｎｃＯ
ｎＯ，Ｖ、Ｊ、、 Ｈａｃｋａｙ、 Ｉ”Ｊ、＋１旧（
！１１７０゜Ｓ、 ＆ Ｐｏ１ｌｏｋ、 Ｊ、Ｊ、：
Ｉｎｆｅｃｔ、 Ｉｎ＋ｎ＋ｕｎｏ１．、２＜）：６２
３□−６３２（１９８０） （γ） 、Ｊｏｌｌｃｓ、 Ｉ）、： Ｂｉ
ｏｍｅｄｉｃｉｎａ、 ２ ？） ： ２７
り・〜２７６（１９７６） Ｃ８） ｏｓｓｃｒｍａｎｎ、 ｒ、ｌ−、：
八（１ｖ １ゝｎｔｈ０１１ｉ０１．、 ４
：９８〜１０２ （１９７６） （Ｑ） 、Ｉｏｌｌｃｓ、 Ｐ、、 ｓｔｃｒｎｂｃｒ
ｇ、 ＋４．、 Ｈａｌｌ１１３．Ｇ。 ｌｓｒ、Ｊ、Ｈｃｄ、ｓｃｉ、、Ｉ： ４ ／ｌ ’、
）□〜’１４７（１≦）６５ ）（１０） ０ｓｓｅ
ｒ＋ｎａｎｎ、１−．１．＆ Ｉａｗｌｏｒ、Ｄ、Ｐ
、： Ｊ、Ｌｘｐ。 ｔ４ｃｄ、、 １ ２ Ａ ： ≦） ２１
〜９ ニー＞ ２ （１９６６）（１１）
５ｉｐｐｃｌ、 八 １．．１．ａｎｄ、
Ｉｆ、、 ｌｉｎｄｅｎｍａｉｒ。 １４、Ｎｇｕｙｃｎ−１１ｕｍ、Ｈ，Ｃ、ｗｕｒｔｚ、
１’、、Ｔｉｍｍ１ｓ、 Ｋ、Ｎ、。 Ｇ１０８Ｓ（ＩＣｋ（！、 に ＆ Ｓｃｔ＋１
ｉｔｌ、 Ｇ、： Ｎｕｃｌ、八ｃｉｄｓｌｔｃｓ
、、 Ｅ）： ３２７５〜３２９４ （１９７８
）（１２１Ｂａ１ｄａｃｃｉ、 ｌ’、、ｌ１ｏｙａ
１．八、、Ｃａｍ１．Ｂ、、Ｐｅｒｒｉｎ。 １ 、にｒｕｓｔ、Δ、、Ｇａｒａｐｉｎ、 八、
＆ にｏｕｒｉｌｓｋｙ、 Ｐ、：ＮＬＩＣＩ ＾
ｃｉｔｌｓ ！＋＋！Ｓ、、 ６ ： ２６
６７〜２６８１ （１９７つ） （１３） Ｊｕｎｇ、＾、、５ｉｐｐｃｌ、八、［
、、Ｇｒｃｚ、Ｈ，＆ ５ｃｂｉｉｌｚ。 Ｇ、： Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
ＬＩＳ八、 ７ ７ ： ’、） ７ ５
９〜５７６３（１９８０） （１４） Ｏｗｃｎ、 Ｊ、［、，５ｃｂｕ
ｌｔｚ、Ｄ、Ｗ、ｊａｙｌｏｒ、 八 ＆Ｓｍ已
１＋、Ｇ、ｌｉ、： Ｊ、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ、、 １
６５ ： ２２９ ＝ ２／Ｉ Ｏ（１９ε） ご３
） （１！＋） Ｇ１１ｂｌ（！ｒ、Ｉｆ、 ＆ ｌｌｏ
ｒｆｍａｎｎ、Ｂ、Ｊ、： Ｇｃｎｃ、 ２５ ：２
Ｇ ３ ・−２６９（１９８３） （１（ｉ） Ｒａ１ｐｂ、Ｐ、、Ｈｏｏｒｃ、Ｈ，
八 Ｓ、＆ Ｎｉ１ｌＳＯｎ 、に、Ｊ、：［ｘｐ
、Ｈｃｄ、、 １ ４３ ： １ ５２８〜１５
３３（１９７（１７） Ｇｏｌｄ、１．Ｈ，＆ Ｓ
ｃｌ＋ｗｃｉｇｃｒ、Ｈ，： Ｈｃｔｔ＋ｏｔｌｓ
１ｎｒｒ＋ｚｙｍｏｌｏｇｙ、 Ｖｏｌ、ＸＸ、Ｐ
ａｒｔ Ｃ，ｐＤ ５３７〜５４２ 。 Ｌｄ、に、Ｈｏ１ｄａｖ、 １．ＧｒＯ３ＳＩＩｌｉ
ｌｎ、 八Ｃ１１ｄ（！ｍＩＣＰｒｅｓｓ、 Ｎ（
！ＷＹｏｒｋ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ、 １
９７１（１８） Ｖｉｃｉｒａ、Ｊ、 ＆ Ｍａｓ
ｓｉｎｇ、 Ｊ、： Ｇｅｎｅ、 １９ ：
２５９〜２６８ （１≦）８２） （１９） Ｐｅａｃｏｃｋ、 Ｓ、１．、Ｈ
ｃｌｖｅｒ、Ｃ，Ｈ，ＩＧ Ｈｏｎ 旧１ａｎ、、Ｊ
。 Ｊ、： Ｂｉｏｃｈｉｍ、１Ｓｉｏｐｈｙｓ、＾ｃｔａ
、 ６５）Ｅ）： ２ ＩＩ ３ ＝−（２０）
＾１ｖａｒａｄｏ−１１ｒｂｉｎａ、 Ｇ、、５ａｔ
ｈｅ、 Ｇ、 Ｈ，、ｌｉｖ。 ＩＪ、［：、、Ｇ１１ｌｃｎ、 Ｈ，Ｆ、、Ｄｕｃｋ
、 Ｐ、Ｄ、、Ｂｃｎｄｃｒ、 Ｒ，８０ｇ１ｌｉ
ｖｉｃ、 Ｋ、に、： ５ｃｉｅｎｃｅ、
２ １ ４ ： ２ ７ ０ 〜２７／ｌ （１
９８１） （２１） Ｊｏｌｌｅｓ、Ｊ、＆ Ｊｏｌｌｃｓ、
Ｐ、： １ｌｃｌｖ、Ｃｂｉｍ八ｃｔへ、 ５４：
２６６８−２６７５（１９７１）（２２） Ｃａｎｆ
ｉｅｌｄ、Ｒ，Ｅ、、に１１１１１１１（！ｒｌｌｌａ
ｎ１１． Ｓ、 ５（ｉｌｌ（！ ｌ 、 Ｊ 、 Ｉ
ｆ 。 ＆ Ｍｏｒｇａｎ、ｒ、Ｊ、： Ｎａｔｕｒｅ
Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ、、 ２ ３ ２ ：
１６〜１７（１９７１） （２３） Ｊｏｌｌｅｓ、Ｐ、＆ ｊｏｌｌｃｓ、
Ｊ、： Ｈｏ１．Ｃｃｌｌ。 Ｂｉｏｃｈｃｍ、、 ０３ ： １ ６５〜１
８９ （１９８／ｌ ） Ａ（２４）
ｌｅｅ、Ｃ，Ｄ、＆ Ｌｕ５ｃ、ｌ）、Ｃ，：
ｒｏｃｕｓ、 ４ ： １〜（２！＋） Ｂ
ｉｒｎｂ（ｌｉＪ Ｉｌ、Ｃ，＆ Ｄｏｌｙ、Ｊ、
： Ｎｕｃｌ、 八ａｉｄｓｌｔｃｓ、７：１５１
３へ・１５２３（１９７９）（２ｆｉ） ＨａＸｉｌ
ｍ、Δ、Ｈ，＆ Ｇ１１ｂｅｒｔ、Ｗ、： Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎｌｎｚｙｍｏｌｏｑｙ、 ６ ５
： ／１９ ８ 〜５ ６０ （１９ε３０ ）
（２７） ＳａｎｇｅｒＪ、、Ｎ１ｃｋｌｃｎ、Ｓ
、 ＆ Ｃｏｕｌｓｏｎ、 八、Ｒ：Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ＾、 ７４ ：
５４６３−５４［２＋１） ＨａｎｉａｔｉＳ、
１．： Ｎ０１６ＣＬＩＩＩ Ｃｌ０１１ｉｎ（１−Ａ
ｌｉｌｌｌｏｒｉｌｌＯｒｌｌｌ Ｈｉｌｎｕａｌ、
Ｃｏ１ｄ ５ｌｌｒ！ｎｊｌ １ｌｉｌｒｌ）
Ｏｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９ε３２）Ｉ’９
） ｌ！Ｉ１６ａｌｌｐｉ１．Ｖ、Ｒ，＆ Ｂ！０
１１（！ｌ、 Ｇ、： ｌｌ０ＣＯＩｌ［。 Ｐｒｏｑ、ｌｌｏｒｍ、Ｉｔｅｓ、、 ３６ ：
７Ｉ ５’ｌ〜 ４ ７Ｇ （’１ ’Ｊ
ε３
第１図は粒子構造を示ｔＪ ’Ｆｊ貞であって、ブライ
マー延長実験の結果を示Ｊ０ブライマーはＥｉ−ＯＮ
１９Ｊｊヨヒ［ｉ −ＯＮ ２０ ’Ｃ”＆＞’）、
ｕ型は細胞系Ｕ−９３７から単離されたＲＮＡであった
１゜第２図は粒子構造を示づ写真であって、ドラ１−−
プロツトバイブリクイピーシ］ンの結果を示・」。 第３ａ図ｔまＨＬＺ ＤＮＡ（り【−１−ン１１１１
４−１）の構造を示り一模式図であり、第３１）図は１
１Ｌ７ ｃｌ）ＮＡのメクレオブドの配り１１庖決定
−１Ｊるための、１１画を示す模式図（・ある。第４
ａ図は１１１７ ｃｌ）ＮＡり［１−ンｌ１１．ｉ／
Ｉ−１のｌ） Ｎへ配列を承り図Ｃあり、第１１１）図
ｔよＩＩ １１ ＩＩ−１り１１−ンの１ｌｔＺ ｃ
ｉ）Ｎへの制限酵Ａ、地図Ｃあ口１゜第５）図（よ、定
尺されているＩＩＬＺアミノＡり配シリ（上列）とクロ
ーンＩＩ ｉ １４−１のに ｌ） ＮＡから誘導され
たアミノ＾々配ＩＪｌｌ （’Ｉ・列）の比較ｔ＞＋
ｃあろ、。 第６図は多］ビーハイブリッドベクター、ｐ［二へ３１
０２を示１」模式図で・ある（ぞの４７４染６３Ｊ、び
利用については発明の、、Ｔ ＩＩ口ｆ説明のＪｌ’＋
４＝１ ＞ 、。 り）７図はΔ１）Ｉｌｌブ［１［−ターのα因子リーダ
ーへの結合と、１ｌＬＺｉ頁１ｊ−子がα因子リーダー
と正しいｒＪｆｉｌ ｔ！ｌ’、 Ｃ結合しているプラ
スミドｐＷｓ ２１ ！−） Ｄを形成づるためのぞの
１９の＋１４榮を承り模式図である。。 第８図ｔま１ｌｉｒ＋ｄＩ［Ｉリンカ−とのリンカーリ
ゲージＦｌ ン（例８ ｂ ）ならびにＳａｊ！ Ｉお
よび１１ｉｒ１ｄｎｌリンカ−（例９ ｂ 、 ｐＷ
Ｓ ２０８Ｄを７りく）とのリンカーリゲージコンの両
者を示Ｊ１６式図である。ｌ−＋ １ Ｚ ｍ転子をα
囚ｒリーダーまた（１α囚了ブ［Ｊ Ｕ−ター乙しくは
ターミネータ−に関しく正しい方向性で導入Ｊる目的の
ものである。 第９図は、α因子リーダーと１１ Ｌ−Ｚ ３’ａ伝イ
間のｉｆ’ １ｌｆｆなｉｔＪ移を（イ「〜７する目的
での合成ヌクレオブト１１３１コ２ ’ｌ ｊｊ Ｊ、
びＥ［３１２３’ｌにＪ、るｉｎ Ｖｉｌ、ｒＯ突然変
責誘弁を示す模式図である１゜ 第１０図は、ＩＩ Ｌ Ｚ遺伝子の正確４３′末端がＡ
ＤＨＩ＋クーミネークーの前に正しい方向ｖ１で導入さ
れたｐＷｓ２３５Ｄの構築を示す模式図である。 第１１図は、上に、Ｉｔ Ｌ Ｚ Ｗ伝ｉ”、！＝ＡＩ
）ｌｌｌＩターミネークー間Ｑａｍｌｌ１部（Ｏの距−
１（１） Ｗ Ｓ ２５７ Ｄ ）ど、光１１３カレ゛
ン１−（ｐＷｓ２９０Ｄ）を形成覆る最終（ＩＩ１築を
承り模式図である。 第１２図（まα因子逍包子をベクター■２中ｔこ［ｃｏ
Ｒ１フラグメントとして、Ｌ） （Ｊ Ｃ１其１１７体
ｐαＦからり［１−ン化するｈ法を示す（ｐ Ｗ Ｓ−
２３００＞模式図である。Ｖ２ＣよｐＬＪ （Ｃ１８ｎ
Ａ導体であり、その構築１例９ａに示されでいる。 第１３図はｔｉ ＋−ｚ遺伝子をα因子ブｌ−］シータ
ーおよびターミネータ−に正しい方向性で接合υる方法
を例示りる模式図である（ｐＷｓ２３１１））、。 第１４ａ図おＪ、び第１４ｂ図は、α因子頂仏子の５′
末端に最し近いＰｓｔ１部位の距離（ｐＷｓ２９４Ｄ）
、および第９図に示した突然変巽誘光Ｐｓｔｌフラグメ
ン１−Δ２のＤＷＳ２９／ＩＤの甲−））ｓｔ１部（Ｑ
内すグーシＨンににすα因子プロ［−ターの制御下にあ
る発現カセツ１〜ｐＷｓ２９６Ｄの最終佑首を示づ模式
図である。
マー延長実験の結果を示Ｊ０ブライマーはＥｉ−ＯＮ
１９Ｊｊヨヒ［ｉ −ＯＮ ２０ ’Ｃ”＆＞’）、
ｕ型は細胞系Ｕ−９３７から単離されたＲＮＡであった
１゜第２図は粒子構造を示づ写真であって、ドラ１−−
プロツトバイブリクイピーシ］ンの結果を示・」。 第３ａ図ｔまＨＬＺ ＤＮＡ（り【−１−ン１１１１
４−１）の構造を示り一模式図であり、第３１）図は１
１Ｌ７ ｃｌ）ＮＡのメクレオブドの配り１１庖決定
−１Ｊるための、１１画を示す模式図（・ある。第４
ａ図は１１１７ ｃｌ）ＮＡり［１−ンｌ１１．ｉ／
Ｉ−１のｌ） Ｎへ配列を承り図Ｃあり、第１１１）図
ｔよＩＩ １１ ＩＩ−１り１１−ンの１ｌｔＺ ｃ
ｉ）Ｎへの制限酵Ａ、地図Ｃあ口１゜第５）図（よ、定
尺されているＩＩＬＺアミノＡり配シリ（上列）とクロ
ーンＩＩ ｉ １４−１のに ｌ） ＮＡから誘導され
たアミノ＾々配ＩＪｌｌ （’Ｉ・列）の比較ｔ＞＋
ｃあろ、。 第６図は多］ビーハイブリッドベクター、ｐ［二へ３１
０２を示１」模式図で・ある（ぞの４７４染６３Ｊ、び
利用については発明の、、Ｔ ＩＩ口ｆ説明のＪｌ’＋
４＝１ ＞ 、。 り）７図はΔ１）Ｉｌｌブ［１［−ターのα因子リーダ
ーへの結合と、１ｌＬＺｉ頁１ｊ−子がα因子リーダー
と正しいｒＪｆｉｌ ｔ！ｌ’、 Ｃ結合しているプラ
スミドｐＷｓ ２１ ！−） Ｄを形成づるためのぞの
１９の＋１４榮を承り模式図である。。 第８図ｔま１ｌｉｒ＋ｄＩ［Ｉリンカ−とのリンカーリ
ゲージＦｌ ン（例８ ｂ ）ならびにＳａｊ！ Ｉお
よび１１ｉｒ１ｄｎｌリンカ−（例９ ｂ 、 ｐＷ
Ｓ ２０８Ｄを７りく）とのリンカーリゲージコンの両
者を示Ｊ１６式図である。ｌ−＋ １ Ｚ ｍ転子をα
囚ｒリーダーまた（１α囚了ブ［Ｊ Ｕ−ター乙しくは
ターミネータ−に関しく正しい方向性で導入Ｊる目的の
ものである。 第９図は、α因子リーダーと１１ Ｌ−Ｚ ３’ａ伝イ
間のｉｆ’ １ｌｆｆなｉｔＪ移を（イ「〜７する目的
での合成ヌクレオブト１１３１コ２ ’ｌ ｊｊ Ｊ、
びＥ［３１２３’ｌにＪ、るｉｎ Ｖｉｌ、ｒＯ突然変
責誘弁を示す模式図である１゜ 第１０図は、ＩＩ Ｌ Ｚ遺伝子の正確４３′末端がＡ
ＤＨＩ＋クーミネークーの前に正しい方向ｖ１で導入さ
れたｐＷｓ２３５Ｄの構築を示す模式図である。 第１１図は、上に、Ｉｔ Ｌ Ｚ Ｗ伝ｉ”、！＝ＡＩ
）ｌｌｌＩターミネークー間Ｑａｍｌｌ１部（Ｏの距−
１（１） Ｗ Ｓ ２５７ Ｄ ）ど、光１１３カレ゛
ン１−（ｐＷｓ２９０Ｄ）を形成覆る最終（ＩＩ１築を
承り模式図である。 第１２図（まα因子逍包子をベクター■２中ｔこ［ｃｏ
Ｒ１フラグメントとして、Ｌ） （Ｊ Ｃ１其１１７体
ｐαＦからり［１−ン化するｈ法を示す（ｐ Ｗ Ｓ−
２３００＞模式図である。Ｖ２ＣよｐＬＪ （Ｃ１８ｎ
Ａ導体であり、その構築１例９ａに示されでいる。 第１３図はｔｉ ＋−ｚ遺伝子をα因子ブｌ−］シータ
ーおよびターミネータ−に正しい方向性で接合υる方法
を例示りる模式図である（ｐＷｓ２３１１））、。 第１４ａ図おＪ、び第１４ｂ図は、α因子頂仏子の５′
末端に最し近いＰｓｔ１部位の距離（ｐＷｓ２９４Ｄ）
、および第９図に示した突然変巽誘光Ｐｓｔｌフラグメ
ン１−Δ２のＤＷＳ２９／ＩＤの甲−））ｓｔ１部（Ｑ
内すグーシＨンににすα因子プロ［−ターの制御下にあ
る発現カセツ１〜ｐＷｓ２９６Ｄの最終佑首を示づ模式
図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）挿入体としてヒトリゾチーム（ＨＬＺ）をコード
するヌクレオチド、その一部またはこの配列の分解変異
体を含有するハイブリッドプラスミド （２）宿主生物内で複製および発現が可能な特許請求の
範囲第１項記載のハイブリッドプラスミド（３）原核生
物内で複製可能な特許請求の範囲第２項記載のハイブリ
ッドプラスミド （４）真核生物内で複製可能な特許請求の範囲第２項記
載のハイブリッドプラスミド （５）ヌクレオチド配列 【遺伝子配列があります】 を含有することを特徴とするハイブリッドプラスミド （６）成熟ＨＬＺをコードするヌクレオチド配列【遺伝
子配列があります】 を含有することを特徴とするハイブリッドプラスミド （７）挿入体はプラスミドｐＵＣ９のＰｓｔ I 切断部
位間に位置する特許請求の範囲第１項記載のハイブリッ
ドプラスミド （８）プラスミドｐＨＬ２、ｐＨＬ８、 ｐＨＬ１４−１、ｐＨＬ２１、ｐＨＬ２３、ｐＨＬ１４
−２３またはｐＨＬ３５である特許請求の範囲第１項記
載のハイブリッドプラスミド（９）特許請求の範囲第１
項に記載のＨＬＺをコードする配列がプラスミドｐＨＬ
２、ｐＨＬ８、ｐＨＬ１４−１、ｐＨＬ２１、ｐＨＬ２
３、ｐＨＬ１４−２３またはｐＨＬ３５の挿入体とハイ
ブリダイズされ、８５％以上のホモロジーを示すことを
特徴とするハイブリッドプラスミド（１０）ＨＬＺをコ
ードするＤＮＡ領域がプロモーター、リーダー配列また
はターミネーターに結合され、翻訳開始シグナルはＨＬ
Ｚのコード領域とプロモーターの間に位置させる特許請
求の範囲第２項記載のハイブリッドプラスミド （１１）発現ベクターである特許請求の範囲第１項記載
のハイブリッドプラスミド （１２）成熟ＨＬＺをコードすることを特徴とする発現
ベクター （１３）ＡＤＨＩプロモーター、α因子リーダー、ＨＬ
Ｚ遺伝子およびＡＤＨＩターミネーターの各要素から構
成される特許請求の範囲第１２項記載の発現ベクター （１４）α因子プロモーター、α因子リーダー、ＨＬＺ
遺伝子およびα因子ターミネーターの各要素から構成さ
れる特許請求の範囲第１２項記載の発現ベクター （１５）合成した成熟ＨＬＺを分泌可能とする特許請求
の範囲第１２項記載の発現ベクター （１６）ＨＬＺをコードするヌクレオチド配列（１７）
ＨＬＺリーダーまたはシグナルペプチドについての遺伝
情報を含有する特許請求の範囲第１６項記載のヌクレオ
チド配列 （１８）全成熟ＨＬＺ蛋白質またはその生物学的に活性
な変異体を含有する特許請求の範囲第１６項記載のヌク
レオチド配列 （１９）配列 【遺伝子配列があります】 を含有するリーダーまたはシグナルペプチドをコードす
る特許請求の範囲第１７項記載のヌクレオチド配列 （２０）特許請求の範囲第６項に記載の配列を含有する
成熟ＨＬＺをコードする特許請求の範囲第１８項記載の
ヌクレオチド配列 （２１）このヌクレオチド配列後に停止コドンがある特
許請求の範囲第２０項記載のヌクレオチド配列 （２２）アミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチド （２３）アミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチド （２４）ＨＬＺをコードする遺伝情報を含有する形質転
換宿主 （２５）原核生物である特許請求の範囲第２４項記載の
形質転換宿主 （２６）真核生物である特許請求の範囲第２４項記載の
形質転換宿主 （２７）宿主細胞中で複製可能なベクター中にヌクレオ
チド配列を含有する特許請求の範囲第２４項記載の形質
転換宿主 （２８）含有するヌクレオチド配列を発現する特許請求
の範囲第２４項記載の形質転換宿主 （２９）大腸菌である特許請求の範囲第２５項記載の形
質転換宿主 （３０）大腸菌ＲＲＩである特許請求の範囲第２９項記
載の形質転換宿主 （３１）酵母である特許請求の範囲第２６項記載の形質
転換宿主 （３２）ビール酵母（￥Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ￥）である特許請求の範囲第３１
項記載の形質転換宿主 （３３）哺乳類細胞系である特許請求の範囲第２６項記
載の形質転換宿主 （３４）ＨＬＺを製造するにあたり、（ａ）この蛋白質
をコードするＤＮＡ配列で適当な宿主を形質転換しそこ
で複製させ、（ｂ）上記のＤＮＡを宿主内で発現させ、
（ｃ）宿主によって分泌させ、ついで（ｄ）上記蛋白質
を単離することを特徴とする方法（３５）暗号ヌクレオ
チド配列は特許請求の範囲第１項から第１５項までのい
ずれかに記載のハイブリッドプラスミド中に含有される
特許請求の範囲第３４項記載の方法 （３６）暗号ヌクレオチド配列は特許請求の範囲第１６
項から第２１項までのいずれかに定義したとおりである
特許請求の範囲第３４項記載の方法（３７）宿主生物は
特許請求の範囲第２４項から第３３項までのいずれかに
定義したとおりである特許請求の範囲第３４項記載の方
法 （３８）特許請求の範囲第３４項から第３７項までのい
ずれかに記載の方法によって製造される組換えＨＬＺ蛋
白質 （３９）標品ＨＬＺと完全に同一であるかまたはその生
物学的に活性な変異体を構成する特許請求の範囲第３８
項記載のＨＬＺ蛋白質 （４０）リーダーまたはシグナルペプチドを含有する特
許請求の範囲第３８項記載のＨＬＺ蛋白質（４１）リー
ダーまたはシグナルペプチドは、アミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 を含有する特許請求の範囲第３８項記載のＨＬＺ蛋白質 （４２）成熟ＨＬＺを決定するアミノ酸配列【アミノ酸
配列があります】 を含有する特許請求の範囲第３８項記載のＨＬＺ蛋白質 （４３）疾病の処置に対するＨＬＺの利用 （４４）特許請求の範囲第３８項から第４２項までのい
ずれかに記載のＨＬＺの有効量を、医薬的に不活性な担
体および／または添加物とともに含有することを特徴と
するヒトの治療処置用組成物
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19853540075 DE3540075A1 (de) | 1985-11-12 | 1985-11-12 | Human-lysozym |
| DE3540075.7 | 1985-11-12 |
Publications (1)
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|---|---|
| JPS62163692A true JPS62163692A (ja) | 1987-07-20 |
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
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| EP (1) | EP0222366B1 (ja) |
| JP (1) | JPS62163692A (ja) |
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| NZ (1) | NZ218247A (ja) |
| PT (1) | PT83719B (ja) |
| ZA (1) | ZA868540B (ja) |
Cited By (1)
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1986
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