JPS62215867A - 核酸の塩基配列決定のためのオ−トラジオグラフ解析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、核酸の塩基配列決定のためのオートラジオグ
ラフ解析方法に関するものである。

［発明の背景］ 近年、急速に発達して来た分子−生物学の分野において
は、生物体の機能や複製のメカニズムを解明するために
、生物体のもつ遺伝情報を明らかにすることが必須のこ
ととなっている。とりわけ、特定の遺伝情報を担うＤＮ
Ａ　（もしくはＤＮＡ断片物、以下同様）などの核酸の
ｌｉ！基配列配列定することが必要不可欠なこととなっ
ている。

ＤＮＡ、ＲＮＡなとの核酸の塩基配列を決定するための
代表的な方法として、オートラジオグラフィーを利用す
るマキサム・ギルバート（Ｍａｘａｓ−Ｇｉｌｂｅｒｔ
　）法およびサンガー−クールソン（Ｓａｎｇｅｒ−Ｃ
ｏｕｌｓｏｎ）法が知られている。前者のマキサム・ギ
ルバート法は、まず、塩基配列を決定すべきＤＮＡある
いはＤＮＡ断片物の鎖状分子の−・方の端部に３２　ｐ
等の放射性同位元素を含む基を結合させて放射性標識を
付かしたのち、化学的な手段を利用して鎖状分子の構成
単位（塩基中位）間の結合を塩基特異的に切断する０次
に、得られた塩基特異的ＤＮＡ切断分解物の混合物をゲ
ル電気泳動法により支持媒体上に分離展開し、多数の切
断分解物がそれぞれ分ｇｌ展開されて形成された分離展
開パターン（ただし、視覚的には見ることができない）
を得る。この分離展開パターンをたとえばＸ線フィルム
上に可視化してそのオートラジオグラフを得、得られた
オートラジオグラフと各々の塩、！！特異的切断手段と
から、放射性同位元素が結合された鎖状分子の端部から
一定の位置関係にある塩基を順次決定し、これにより対
象物全ての塩基配列を決定するものである。

また、後者のサンガーφクールソン法は、ＤＮＡあるい
はＤＮＡ断片物の鎖状分子と相補的であって、かつ放射
性標識が付与されたＤＮＡ合成物を化学的な−Ｌ段を利
用して塩Ｍ特異的に合成し、得られた塩基特異的ＤＮＡ
合成物の混合物を用いて上記と同様にしてそのオートラ
ジオグラフから塩基配列を決定する方法である。

従来より、オートラジオグラフの可視画像は、放射性標
識が付′Ｐされた核酸の塩基特異的切断分解物もしくは
塩基特異的合成物（以下、単に核酸の塩基特異的断片物
と称する）が分離展開された支持媒体と、高感度Ｘ線フ
ィルムとを一定時間重ね合わせて該フィルムを感光させ
ることにより得られている。そして、核酸の塩基配列は
、フィルムとに可視化されたオートラジオグラフから核
酸のに１１基特異的断片物の分離展開位置（バンド）を
視覚的に判断し、それらバンドの位置を相互に比較する
ことにより決定されている。

具体的に、オートラジオグラフの解析は、まずオートラ
ジオグラフが可視化されたＸ線フィルムをシャーカステ
ン上に固定したのち、シャーカステンに設置されている
プラスチック酸のカーソル（読取用の目安板）を−ｒ動
によりフィルム上を上下（または左右）に移動させなが
ら、このカーソルを目安にしてバンドの相対的な位置関
係を目視によって判断することにより行なわれている。

プラスチック酸の透ＩＪＪなカーソルの中央には通常、
細い直線が引かれており（いわゆるヘアラインカーソル
）、ヘアラインカーソルはシャーカステンに［／］定さ
れた状態で−・方向・（フィルムに刊行な方向）に移動
することができる。この直線状のヘアラインカーソルを
目安にして各列のバンドの相対位置を求め、バンドに序
列を付けることができる。

あるいはまた、デジタイザボードなどを用いたコンピュ
ータシステムを利用する解析方法も試られている。すな
わち、オートラジオグラフがｉ＋ｆ視化されたＸ線フィ
ルムを、二次元の座標系を有し、コンピュータとオンラ
インで結ばれているデジタイザボード上に固定したのち
、フィルム上のバンドを指示スティックで指し示しなが
らキーボード等の別の入力手段を介してバンドが帰属さ
れるべきｋｕ基名を入力する方法である。この方法によ
れば、指示スティックによって入力された座標系に従っ
て自動的にバンドに序列および１１！ノふ名を付すこと
ができる。

しかしながら、上記のシャーカステンを利用する方法お
よびコンピュータシステムを利用する方法のいずれにお
いても、読取処理済みのバンドと未処理のバンドとを区
別しにくい、Ｘ線フィルム上でバンドを読み込む視線と
塩基名記入（入力）のための（キーボードへ向ける）視
線とが異なる、および両者の間に時間的に間隔があくな
どの欠点がある。そのために、バンドの順序の逆転、読
み落とし、重複読みなどの読取りミスおよび塩基名の記
入ミスを避けることができなかった。

［発明の要旨］ 未発ＩＪＪは、核酸の塩基配列を高精度でかっ鈴易に決
定することができるオートラジオグラフ解析方法を提供
するものである。

また、本発明は、決定された核酸の塩基配列を容易に確
認することができるオートラジオグラフ解析方法をも提
供するものである。

すなわち１本発明は、放射性標識が付与された塩、７．
（ｉ　ｌ＃異的ＤＮＡ断片物もしくはＲＮＡ断片物が支
持媒体上に一次元的方向に分離展開されて形成された複
数の分離展開列のオートラジオグラフを解析することに
より、核酸の塩基配列を決定する方法において、 ｌ）オートラジオグラフに対応するデジタル信号に基づ
いて該オートラジオグラフを電気的に画像表示する工程
、 ２）表示画像上に読取カーソルを表示する工程、および ３）読取カーソルを用いて決定された分Ｓ展開列のバン
ドが帰属される塩基の名称、および該読取カーソルを表
示画像上に同時に表示する工程、を含むことを特徴とす
る核酸の塩基配列決定のためのオートラジオグラフ解析
方法を提供するものである。

本発明の方法によれば、従来のシャーカステンを用いた
場合と異なり、読取用のカーソルをオートラジオグラフ
が可視画像化された画面上に表示させて自由自在に画面
上で動かすことができる。

また、従来のシャーカステンを用いた場合およびデジタ
イザボードを用いた場合と異なり、読取ヵ−ソルと該カ
ーソルに基づいて決定され入力されたバンドの塩基名と
が同時に画面りに表示される。そのために、どのバンド
まで読み取ったかが一口瞭然であるので、従来のような
読取り時におけるバンドの逆転読み、読み落とし、重複
読みなどを防ぐことができる。また、読み取って入力し
た塩基名が瞬時に同一画面上に表示されるから、読み取
ったバンド、カーソルおよび塩基名の対応関係を把握、
確認しながら読取操作を進めることができ、従来のよう
な時間的、空間的隔たりがあることによる塩基名の記入
（入力）漏れ、記入の誤りを解消することができる。

従って、核酸のＩｉ！基配列配列い精度でかつ短時間の
うちに決定することができる。

また、読取り時および記入時における間違いは、読取り
に使用されたカーソルとこれから使おうとするカーソル
とを色彩、模様、輝度などによって区別して表示するこ
とにより、更には記入された塩基名の箇所とこれから記
入しようとする塩基名の箇所とを同様に区別して表示す
ることにより、更に一層防１１：することができる。

特に、読取カーソルを、分子ａ、展開列（レーン）を横
切って各レーンのバンドに沿うように作成して画面に表
示する場合には、スマイリング現象、オフセット歪みな
どによってレーン間でバンドの位置ずれが生じている場
合であっても、カーソルに基づいてバンドの順序を一層
正確に読み取ることができる。ここで、スマイリング現
象とは、分離展開過程における放熱効果（エツジ効果）
などが原因となって生じるものであり、支持媒体の中央
部の分１ｌｌｉ展開距離に比べて両端部の分離展開距離
が短くなる現象をいう、またオフセット歪みとは、試料
注入口（スロット）の形状の相違等により試料の分離展
開開始位置、開始時間が各レーンで異なることなどが原
因となって生じるものであり、レーン間相互の全体的な
位置ずれをいう、これらのバンドの位置ずれのほかにも
バンド自体の欠陥、レーンの蛇行などが生じることがあ
る。

この読取カーソルは上下（または左右）の平行移動のみ
ならず任意の方向に移動することが可能であるから、分
子ａ展開パターンが蛇行している場合であってもパター
ンに最適にカーソルを動かすことができ、このことによ
っても読取りの精度を高めることができる。

なお、本出願人は、分離展開パターンのオートラジオグ
ラフを得る方法として放射線フィルムを用いる従来の放
射線写真法の代りに、蓄積性蛍光体シートを用いる放射
線像変換方法を利用する方法について既に特許出願して
いる（特開昭５９−８３０５７号、特願昭５８−２０１
２３１号）。

ここで、蓄積性蛍光体シートは輝尽性蛍光体からなるも
のであり、放射線エネルギーを該蛍光体シートの輝尽性
蛍光体に吸収させた後、可視乃至赤外領域の′１［磁波
（励起光）で励起することにより放射線エネルギーを輝
尽光として放出させることができるものである。この方
法によれば、露光時間を大幅に短縮化することができ、
また従来より聞届となっていた化学カブリ等が発生する
ことがない。さらに、放射性標識物質のオートラジオグ
ラフは、−置数射線エネルギーとして蛍光体シートに蓄
積されたのち輝尽光として光電的に読み取られるから、
直接にデジタル信号として得ることができる。

［発明の構成］ 本発明において用いられる試料の例としては、放射性標
識が付与、されたＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸。

のＩｉ！基特異的断片物の混合物を挙げることができる
。ここで、核酸の断片物とはＩｉ鎖状の分子の一部分を
意味する。たとえば、塩基特異的ＤＮＡ断片物混合物の
一種である塩基特異的ＤＮＡ切断分解物混合物は、前述
のマキサム・ギルバート法に従って、放射性標識が付与
されたＤＮＡを塩基特異的に切断分解することにより得
られる。また、塩基特異的ＤＮＡ合成物混合物は前体の
サンガー・クールラン法に従って、ＤＮＡをテンプレー
ト（ＰＪ型）として、放射性標識が付！トされたデオキ
シヌクレオシドトリフオスフェートとＤＮＡ合成酵素と
を用いて合成することにより得られる。

さらに、塩ノ＾特異的ＲＮＡ断片物の混合物も上記と同
様の方法により、切断分解物混合物とじてまたは合成物
混合物として得ることができる。なお、ＤＮＡはその構
成ｔｐ位としてアデニン、グアニン、チミン、シトシン
の四種類のＪｉＪ基からなるが、一方ＲＮＡはアデニン
、グアニン、ウラシル、シトシンの四種類のＰＡ、Ｕか
らなる。

放射性標識は、これらの物質に適当な方法で３２ｐ、ｌ
ＡＣ，３ｆ＋３．３　Ｈ、Ｌ２ｓＩ　ナトノア１ｔｌｔ
性同位元素を保持させることによって付′ｊされる。

試料である放射性標識が付！ｊされた核酸の塩基特異的
断片物の混合物はゲル状支持媒体など公知の各種の支持
媒体を用いて、電気泳動法、薄層クロマトグラフィー、
カラムクロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィ
ーなと種々の分離展開方法により支持媒体りに分１ｌｌ
ｌ展開される。

次に、本発明の方法を用いたオートラジオグラフ解析の
実施態様を、ＤＮＡの塩基配列決定を例にとって説明す
る。

以ドの四種類の放射性標識が付！ｊされた塩基特異的Ｄ
ＮＡ断片物の混合物が電気泳動によりゲル支持媒体上に
分離展開されてなる泳動パターンについて、従来の写真
感光材料を用いる放射線写真法により、あるいは蓄積性
蛍光体シートを用いる放射線像変換方法によりそのオー
トラジオグラフを得１次いで適当な読取り（読出し）系
を介して該オートラジオグラフに対応するデジタル信号
を得る。

ｌ）グアニン（Ｇ）特異的ＤＮＡ断片物２）アデニン（
Ａ）特異的ＤＮＡ断片物３）チミン（Ｔ）特異的ＤＮＡ
断片物 ４）シトシン（Ｃ）特異的ＤＮＡ断片物ここで、各ｉｉ
１基特異的ＤＮＡ断片物は、塩基特異的に切断分解もし
くは合成された、すなわち末端の塩基を同じくする種々
の長さのＤＮＡ断片物からなる。

前者の放射線写真法を利用する場合には、まず支持媒体
とＸ線フィルム等の写真感光材ネ１とを低温（−９０〜
−７０℃）で長時間（数十時間）重ね合わせて放射線フ
ィルムを感光させたのち、現像して放射性標識物質のオ
ートラジオグラフを放射線フィルム上に可視画像化する
６次いで、画像読取装置を用いて放射線フィルム上に可
視化されたオートラジオグラフを読み取る。たとえば、
放射線フィルムに光ビームを照射してその透過光または
反射光を光電的に検出することにより、オートラジオグ
ラフは電気信号として得られる。さらに、この電気信号
なＡ／Ｄ変換することにより、オートラジオグラフに対
応するデジタル信号を得ることができる。

後者の放射線像変換方法を利用する場合には、まず、支
持媒体と蓄積性蛍光体シートとを常温で短時間（数秒〜
数十分間）重ね合わせて蛍光体シートに放射性標識物質
から放出される放射線エネルギーを蓄積させることによ
り、そのオートラジオグラフを蛍光体シートに一種の潜
像として記録する。ここで、蓄積性蛍光体シートは、た
とえばプラスチックフィルムからなる支持体、二価ユー
ロピウム賦活弗化臭化バリウム（ＢａＦＢｒ：Ｅｕ”）
等の輝尽性蛍光体からなる蛍光体層、および透明な保護
膜がこの順に積層されたものである。、蕃請＋＋蛍Ｙ体
シートに合看されている婦Ｒにト蛍光体は、Ｘ線等の放
射線が照射されるとその放射線エネルギーを吸収して蓄
積し、そののち１１ｆ視乃至赤外領域の光で励起すると
蓄積していた放射線エネルギーを輝尽光として放、出す
るという特性を有する。

次いで、読出装置を用いて蓄積性蛍光体シートに蓄積記
録されたオートラジオグラフを読み出す、具体的には、
たとえば蛍光体シートをレーザー光で走査して放射線エ
ネルギーを輝尽光として放出させ、この輝尽光を光電的
に検出することにより、放射性標識物質のオートラジオ
グラフは可視画像化することなく直接に電気信号として
（１）られる、さらに、この電気信号をＡ／Ｄ変換する
ことにより、オートラジオグラフに対応するデジタル信
りを得ることができる。

Ｌ述のオートラジオグラフ測定操作およびオートラジオ
グラフに対応するデジタル信−（を得る方法の詳細につ
いては、前記特開昭５９−８３０５７−）公報等に記載
されている。

なお、上記においては、支持媒体上に分離展開された放
射性標識物質のオートラジオグラフに対応するデジタル
信りを得る方法として、従来の放射線写真法および放射
線像変換方法を利用する方法について述べたが、これら
の方法に限定されるものではなく、それ以外の如何なる
方法により得られたデジタル信号であっても放射性標識
物質のオートラジオグラフと対応関係がある限り１本発
明の解析方法に用いることがｊｉ）能である。

また、上記いずれの方法においてもオートラジオグラブ
の読取り（または読出し）は、放射線フィルム（または
蓄積性蛍光体シート）の全面に１１って行なう必要はな
く１画像領域のみについて行なうことも勿論可能である
− さらに、本発明においては、予め各分離展開列の位置お
よびバンドの幅等についての情報を入力して読取り（読
出し）条件を設定しておき、読取り（読出し）操作にお
いては各バンド上を二本以上の走査線が通過するような
走査線密度で光ビームによる走査を行なうことにより、
読取り（読出し）時間を短縮化して必要な情報を効率良
く得ることができる。なお、本発明においてオートラジ
オグラフに対応するデジタル信号とは、このようにして
得られたデジタル信号−をも包含する。

得られたデジタル信号Ｉ）ｘｙは、放射線フィルム（ま
たは蛍光体シート）に固定された座標系で表わされた座
標（ｘ　、　ｙ）とその座標における信号のレベル（Ｚ
）とからなる、信号のレベルはその座標における画像濃
度、すなわち放射性標識物質の量を表わしている。従っ
て、一連のデジタル信号（すなわち、デジタル画像デー
タ）は放射性標識物質の二次元的な位を情報を有してい
る。

第一に、このオートラジオグラフに対応するデジタル信
号を一旦メモリ（八ツファーメモリ、または磁気ディス
ク等の不揮発性メモリ）に記憶したのち、信号処理回路
と、オートラジオグラフ、カーソルおよび塩基名記人欄
を同時に表示することができるＣＲＴなどの表示手段と
、カーソル移動および塩基名表示のための入力を行なう
ことができる入力手段とを有する装置に送り、解析対象
のオートラジオグラフ（放射性標識物質の分離展開パタ
ーン）を表示画面上に可視画像化する。

なお、デジタル信号には予め、濃度およびコントラスト
が適正で観察読影性俺の優れた可視画像が得られるよう
に信号処理（画像処理）を行なっておいてもよい０画像
処理としては、たとえば、空間周波数処理、階調処理、
加算平均処理、縮小処理、拡大処理などが挙げられる。

画面とに画像表示されるオートラジオグラフは、画面に
設定された座標系における信号のレベル（画像濃度、す
なわち放射性標識物質の量）を色彩の明度で表わした。

従来の写真画像と同様のＣ淡画像であってもよいし、あ
るいは信号レベルを予め二値化することにより簡略化し
て表わした二値画像であってもよい。

あるいはまた、オートラジオグラフは、−次元の位置（
泳動方向に沿った位置）と信号レベルとからなる多数の
二次元波形を泳動方向に垂直な方向に一定間陥で多重表
示することにより表わした画像（いわゆる几轍図）であ
ってもよい、この鳥ｗ１図によれば故射轢ｔユ蜘竹の１
．）がｒｔ謝１ゾのχにりとして三次元的に表わされる
から、バンドのピーク位置を正確に読み取ることができ
、泳動列（レーン）間のバンドの位置関係の把握並びに
泳動開始位置近くのバンドの布な領域におけるバンドの
分離を容易に行なうことができる。なお、鳥轍図によっ
てオートラジオグラフを表示する方法の詳細については
、本出願人による特願昭８０−１８１４３１号用細書に
記載されている。

第１図に１画面上に濃淡画像として表示された泳動パタ
ーンのオートラジオグラフの例を示す。

また第２図に、鳥轍図として表示された泳動パターンの
オートラジオグラフの例を示す。

第二に、表示画面上に読取カーソルを表示する。

読取カーソルはレーンを横切る単なる直線として表示し
てもよいが、泳動パターンにスマイリング現象またはオ
フセット歪みなどが生じている場合には、各レーンのバ
ンドに沿った折れ線もしくは曲線として表示するのが好
ましい。

折れ線状もしくは曲線状の読取カーソルは、たとえば以
下のようにして画面上に作成して表示することができる
。

第３図は、画面上に濃淡画像として表示された泳動パタ
ーンのオートラジオグラフの別の例を示す図である。第
３図において泳動方向は右方向であり、泳動パターンに
はスマイリング現象が生じている。

まず、画面の上端から表示画面に基づいて入力された位
置まで垂直な線を引く、入力される最初の位置は、端部
のレーン上のバンドの位置であるのが好ましい（第３図
１）、端部のレーンとするのは読取カーソルがこの位置
を起点として作成されるからである。

位置情報の入力は、マウスカーソル、ライトペン、ジョ
イスティックなどの手段を用いて行なうことができる８
位置精度の点から、特にマウスカーソルが好ましい。

たとえば、画面上のオートラジオグラフが表示される四
角形の領域を座標（Ｘａ、７ａ）、（ｘｂ＋Ｖｂ）で表
わし、マウスカーソル（画面上の矢印２）の位置座標を
（ｘｍ　、ｙｍ）で表わすとすると、マウスカーソルに
よってｘｍ＝Ｘ　＋　＋　Ｖ　ｍ　＝　ｙＩなる位置情
報が入力されることにより、線分３　（Ｘ＋　、Ｖａ）
（Ｘ＋　、Ｖ＋）が画面上に表示される。

次に、起点４の位置から、それよりも泳動パターンの内
側の入力された位置（第二の位置）まで直線を引く０位
置の入力は上記と同様にしてマウスカーソル等を介して
行なわれる。まず始めに。

起点４（Ｘ＋、Ｖ＋）とマウスカーソル２の位が移動す
ると、この線分は画面上で消えて、新たに起点４と移動
した位置との間に線分が表示される。なお、マウスカー
ソルはＥ記座標（Ｘａ。

Ｙａ）、（Ｘｂ　、Ｖｂ）で仕νＪられた四角形の領域
内を自由に移動することができる。こうして。

マウスカーソルの移動とともに起点４とマウスカーソル
２の各移動位置とを結んだ線分が次々と表示される。該
線分が好適にレーンを横切るところで位置の入力を行な
うことにより、線分３に連結した次の線分が画面に固定
頃れて表示される。

このようにして、上端のレーンから下端のレーンまでレ
ーンを横切りかつ各レーンのバンドに沿うように順次、
線分（Ｘ＋、Ｙ＋）（Ｘ＋や１゜Ｙ＋＋ｔ）（ただし、
ｉは正整数である）を引く。

なお、試料は四種の塩基特異的ＤＮＡ断片物の排他的な
組合せであるので、各レーンのバンドは互いに同じ位２
ｉ（泳動距離）には存在しえない、従って、ｒバンドに
沿うように１とは、各レーンの泳動距離が笠しくなるよ
うに巨視的な意味でバンドに沿って線分を引くことを意
味し、厳密に各線分が各レーンのバンド上を通過するこ
とを意味するものではない。

次いで、第４図に示すように、線分が泳動パターンを完
全に横切った時点で最後に入力された位置が終点である
との入力情報に従って、該終点の位置５から画面下端ま
での垂直な線分６（ｘ、。

Ｖ＋）（Ｘ＋　、ｙｂ）を引く、このようにして画面上
には、泳動パターンを完全に横切った複数の連結した折
れ線からなる読取カーソル７が表示される。

読取カーソルは泳動パターン上の任意の領域で作成する
ことができ、泳動開始位置に近いパターン上部の領域で
あってもよいし、あるいは泳動距離の大きなパターン下
部の領域であってもよい。

また、入力される位置情報は、泳動パターンに応じてレ
ーンの個数程度であってもよいし、あるいはそれより多
くても少なくてもよい、少なくとも一つの位置が入力さ
れ、かつ起点と終点が認識できればよい、読取カーソル
は、入力位置を直線で結んだ折れ線状であってもよいし
、あるいは得られた折れ線に適当な演算処理（曲線近似
）を施すことにより曲線状であってもよい。

作成された読取カーソルは泳動パターンに合致している
から、このカーソルを用いて解析者は正確かつ容易にＤ
ＮＡの１１！基配列を決定することができる。なお、読
取カーソルの作成および表示方法の詳細については本出
願人による昭和６１年３月５１１出願の特願昭６１−　
　　号明細書に記載されている。

第三に、読取カーソルおよび該カーソルを用いて決定さ
れたバンドのルノ、（名を表示画面に同時に表示する。

第５図は、画面１−に表示された泳動パターンのオート
ラジオグラフ１１、読取カーソル１２．１３および塩基
名記入欄１４の例を示す図である。第５図において、泳
動方向は右方向であり、読取カーソル１２に基づいて既
に読み取られたバンドの塩基名（Ｇ、Ａ、ＴまたはＣの
頭文字で表示）が記入欄１４に表示されている。

まず、読取カーソルの移動についての入力情報に従って
、これから読取りに使おうとする読取カーソル（これを
アクティブカーソルと呼ぶ）１３を左または右に７行移
動させて、次に読み取るべきバンドの位置に合わせる。

この際に、既に読み取られた塩基名のみならず、読取り
に使用されたカーソル１２（これをマークカーソルと呼
ぶ）をそのまま画面に表示しておいてもよい、これによ
り、バンドと塩基名との一対−の対応関係を明確に表わ
すことができる。

なお、読取カーソルの移動開始位置、移動方向および移
動距離を予め設定しておくことにより、簡単な入力操作
でカーソルを一定の間隔で動かすことが可能である。カ
ーソルの移動は画面の左右方向への７行移動のみならず
、任意の角度をもって斜め方向に移動させることもでき
る。従って、レーンが蛇行している場合あるいはパター
ン全体が傾斜している場合であってもそれに沿ってカー
ソルを移動させることができる。

読取カーソルがバンドに固定されて該バンドの塩基名が
読み取られた段階で、読取りに使用済みのマークカーソ
ルと未使用のアクティブカーソルとを区別し、また読取
処理済みの塩基名記入欄と未処理の記入欄とを区別して
表示するのが好ましい、これにより、読取りミスおよび
記入ミスを一層確実に防止することができる。マークカ
ーソルとアクティブカーソルとの区別は、たとえばカー
ソルの色彩を変えたり、実線と点線で区別したり、ある
いはカーソルの輝度を変えることによって行なうことが
できる。また、処理済みの記入欄と未処理の記入欄との
区別は、たとえば第６図に示すように、未処理の記入欄
１５のみを反転させて表示したり、点滅させることによ
り行なうことができる。

また、バンドの帰属を行なう過程で読取カーソルが泳動
パターンに合致しなくなった場合には。

前記と同様の操作を繰り返すことにより簡単に所望の形
状のカーソルを作成表示することができる。

各バンドが属する（１）〜（４）のレーンはそれぞれ（
Ｇ）、（Ａ）、（Ｔ）、（Ｃ）からなる末端塩基につい
ての情報を有するから、バンドの屈するレーンに対応す
る塩基の名称がキーボード操作などによって入力される
と、直ちに未処理の記入欄１５に塩基名が表示される。

勿論１表示が正しくない場合には＋ｌＧ入力によりその
場で修正することができる。なお、この際に上記四種類
の塩ノ＾特異的ＤＮＡ断片物の組合せが排他的な組合せ
であることから、同じ位置に二つ以上のバンド（異なる
レーンのバンド）は存在しえないことを利用して、序列
を決定することができる。

このようにして、泳動パターンの下方から順にバンドに
塩基名を付すことができる。未使用の読取カーソルおよ
び未処理の塩基名記入欄の色彩などによる識別表示は１
次にカーソル移動のための入力が行なわれることにより
使用済みおよび処理済みと判断して直ちに表示が転換さ
れる。そして、入力情報に従って新たに画面上を移動し
ていくカーソルには未使用のアクティブカーソルの識別
がなされている。第７図には、マークカーソル１２°、
新たに表示されたアクティブカーソル１３′および読取
処理済みとして表わされた記入４１１１５°が示されて
いる。

読取りの終了した画面上には、各バンドに一対−で対応
した読取カーソルと、カーソルの下端の記入欄に記入さ
れた−・連の塩基名が表示されて残る。従って、終了後
あるいは途中段階において帰属されたバンドと塩基名と
の照合、確認を容易に行なうことができる。この一連の
塩基を端から順に結ぶことにより、ＤＮＡの塩基配列（
例えばＴ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−・・・）を得るこ
とができる。

上記においては、試料である塩基特異的ＤＮＡ断片物の
混合物として（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）の排他的組合せを利用
した場合について説明したが、本発明の解析方法はこの
組合せに限定されるものではなく、例えば（Ｇ、Ｇ＋Ａ
、Ｔ＋Ｃ，Ｃ）などの種々の組合せに適用することがで
きる。また同様に、塩基特異的ＲＮＡ断片物の混合物（
例えば、Ｇ、Ａ、Ｕ、Ｃの組合せ）についても未発Ｉｌ
ｌの方法を適用することができる。さらに、本発明の方
法は、−組の核酸の塩基特異的断片物の分離展開列に限
定されるものではなく、支持媒体上に同時に分離展開さ
れた全ての分ｇｌ展開列について塩基名記入欄を分けて
表示することなどにより同時に適用することが回部であ
る。

得られた核酸の塩基配列についての情報は、信号処理回
路を介して磁気ディスクや磁気テープなどの記憶保存手
段に保存したり、さらには別のＣＲＴ等の表示画面、感
光材料、感熱記録材料に表示記録することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、画面上にｅ淡画像として表示された泳動パタ
ーンのす一トラジオグラフを示す図である。 第２図は、画面上に鳥轍図として表示された泳動パター
ンのオートラジオグラフを示す図である。 第３図および第４図はそれぞれ、画面上に表示されたオ
ートラジオグラフを示す図であり、読取カーソルの作成
工程を説明する図である。 １：泳動ｚ＜ンド、２：マウスカーソル。 ３．６：線分、４：起点、５：終点。 ７：読取カーソル 第５図〜第７図はそれぞれ、画面上に表示されたオート
ラジオグラフを示す図であり１本発明に従う読取カーソ
ルおよびｋＭ基基肥記入欄同時表示する工程を説Ｉｌｌ
する図である。 １１ニオ−トラジオグラフ、 １２．１２°：使用済みのカーソル （マークカーソル）、 １３．１３’　：未使用のカーソル （アクティブカーソル）、 １４：塩基名記入欄、 １５：未処理の記入欄、 １５°：処理済みの記入欄 特許出願人　　富上写真フィルム株式会社代　理　人　
　ブ「埋土　　柳　川　泰　男第１図 第３図 第４図 第５図 第６図 手続７市正月 昭和６２年　４月１０日 昭和６１年　特許願　第５５４８１号 ２、発明の名称 核酸の塩基配列決定のための オートラジオグラフ解析方法 ３、補正をする者 事件との関係　　　　も許出願人 名　称　　（５２０）富士写真フィルム株式会社４、代
理人 住　所　　東京都新宿区四谷２−１４ミッヤ四谷ピル８
階６、補正により増加する発明の数　　な　し７、補ｉ
Ｅの対象 （１）明細害の「発明の詳細な説明」の欄。 （Ｌ）別紙のとおり。 （１）明細書の「発明の、ｉＴ細な説明」の欄を下記の
如く補正致します。 記 ＣＩ）　ＩＪ］Ａ１＋１’１９（７）第１６頁第［行〜
１７行目）ｔｒ低温（−９０〜−７０°Ｃ）て長時間（
数十詩間）Ｊをｒ低温もしくは常温で長時間（数時間〜
数１一時間）Ｊと補正する。 （２）明細書の第１９頁第１７行〜１８行目のＶ二本以
辷」をｒ一本以上１と補正する。 （３）明細書の第２６頁最終行のｒ特願昭６１−　　　
号」をｒ特願昭６１−４７９２４号」と補正する。 （４）明細書の第２８頁第１１行〜１３行目の「読取カ
ーソルがハンドに・・・・使用済みのＪを削除する。 （５）　［９Ｉ細書の第２８頁第１３行〜１５行１１の
ｒ未使用のアクティブ・・・記入欄とを区別して」を「
アクティブカーソルとを区別してＪと補正する。 （６）明細書の第２８真第１６行目のｒおよび記入ミス
Ｊを削除する。 （７）明細書の第２９頁第１行〜第５行目のｒまた、処
理済みの・・・かできる。」を削除する。 （８）４吐細書の第３０頁第２行目の「序列を決定する
ことができる。Ｊの次に改行して下記の文章を挿入する
。 「塩基名か表示された未処理の記入欄１５は、第６図に
示すように反転させて表示したり、点滅させることによ
り、他の塩基名記入欄と区別して表示するのか好ましい
。これにより、記入ミスを一層確実に防止することがで
きる。Ｊ （９）明細書の第３０頁第３行〜４行１１のｒこのよう
にして、・・・付すことがてきる。」を削除する。 （１０）明細書の第３０頁第４行〜８行１１のｒ未使用
の・・・表示か転換される。Ｊを「次にカーソル移動の
ための入力か行なわれると、第６図におけるアクティブ
カーソル１３および未処理の記入ｖＡｔｓの色彩などに
よる識別表示は、使用済みおよび処理済みと判断して直
ちに表示か転換される。」と補正する。 （１１）明細書の第３０頁第８行〜９行目の「そして、
１の前に下記の交信を挿入する。 「すなわち、アクティブカーソル１３の位置には新たに
マークカーソルか表示され、塩基名記入８１５は他の処
理済み記入欄と同じに表示される。Ｊ （１２）明細書の第３０頁第１Ｏ行〜１１行１１のｒカ
ーソルには未使用のアクティブカーソルの識別がなされ
ている。」を１カーソルはアクティフカ−ツルである。 」と補正する。 （１：１）ＩＩ細書の第３０頁第１２行目の「新たに表
示された」を削除する。 （１４）明細書の第３０頁第１４行目のｒ１５°が示さ
れている。」の次に改行して下記の文章を挿入する。 「このようにして、泳動パターンの下方から順にハンド
に塩基名を付すことかできる。ｊ −以上一 第６図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、放射性標識が付与された塩基特異的ＤＮＡ断片物も
   しくはＲＮＡ断片物が支持媒体上に一次元的方向に分離
   展開されて形成された複数の分離展開列のオートラジオ
   グラフを解析することにより、核酸の塩基配列を決定す
   る方法において、１）オートラジオグラフに対応するデ
   ジタル信号に基づいて該オートラジオグラフを電気的に
   画像表示する工程、 ２）表示画像上に読取カーソルを表示する工程、および ３）読取カーソルを用いて決定された分離展開列のバン
   ドが帰属される塩基の名称、および該読取カーソルを表
   示画像上に同時に表示する工程、を含むことを特徴とす
   る核酸の塩基配列決定のためのオートラジオグラフ解析
   方法。 ２、上記第二工程において、読取カーソルを分離展開列
   を横切りかつ各列のバンドに沿った折れ線もしくは曲線
   として表示することを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載の核酸の塩基配列決定のためのオートラジオグラフ
   解析方法。 ３、上記第二工程において、少なくとも一つの位置に関
   する入力情報に基づいて該位置を通る直線もしくは弧を
   描くことにより作成された読取カーソルを表示すること
   を特徴とする特許請求の範囲第２項記載の核酸の塩基配
   列決定のためのオートラジオグラフ解析方法。 ４、上記第三工程において、塩基の名称を読取カーソル
   の端部に文字および／または記号として表示することを
   特徴とする特許請求の範囲第１項記載の核酸の塩基配列
   決定のためのオートラジオグラフ解析方法。 ５、上記第三工程において、バンドの帰属のために既に
   使用された読取カーソルと、次に使用すべき読取カーソ
   ルとを区別して同時に表示することを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載の核酸の塩基配列決定のためのオー
   トラジオグラフ解析方法。 ６、上記第三工程において、既にバンドが帰属された塩
   基の名称と、次にバンドが帰属されるべき塩基の名称と
   を区別して同時に表示することを特徴とする特許請求の
   範囲第１項記載の核酸の塩基配列決定のためのオートラ
   ジオグラフ解析方法。 ７、上記第一工程において、オートラジオグラフを濃淡
   画像もしくは二値画像として画像表示することを特徴と
   する特許請求の範囲第１項記載の核酸の塩基配列決定の
   ためのオートラジオグラフ解析方法。 ８、上記第一工程において、分離展開方向に沿った位置
   と信号のレベルとからなる複数の二次元波形を分離展開
   方向に垂直な方向に一定間隔で多重表示することにより
   、オートラジオグラフを画像表示することを特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載の核酸の塩基配列決定のため
   のオートラジオグラフ解析方法。 ９、上記第一工程において、オートラジオグラフに対応
   するデジタル信号が、支持媒体と輝尽性蛍光体を含有す
   る蓄積性蛍光体シートとを重ね合わせて、支持媒体上の
   放射性標識物質のオートラジオグラフを該蛍光体シート
   に蓄積記録した後、該蛍光体シートに励起光を照射して
   該オートラジオグラフを輝尽光として光電的に読み出す
   ことにより得られたものであることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載の核酸の塩基配列決定のためのオー
   トラジオグラフ解析方法。 １０、上記第一工程において、オートラジオグラフに対
   応するデジタル信号が、支持媒体と写真感光材料とを重
   ね合わせて、支持媒体上の放射性標識物質のオートラジ
   オグラフを該感光材料に感光記録した後、該感光材料上
   に可視化されたオートラジオグラフを光電的に読み取る
   ことにより得られたものであることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載の核酸の塩基配列決定のためのオー
   トラジオグラフ解析方法。