JPS62215868A - 核酸の塩基配列決定のためのオ−トラジオグラフ解析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、核酸の塩基配列決定のためのオートラジオグ
ラフ解析方法に関するものである。

［発明の背景］ 近年、急速に発達して来た分子生物学の分野においては
、生物体の機能や複製のメカニズムを解明するために、
生物体のもつ遺伝情報を明らかにすることが必須のこと
となっている。とりわけ。

特定の遺伝情報を担うＤＮＡ　（もしくはＤＮＡＩｔｌ
ｉ片物、以下同様）などの核酸の塩基配列を決定するこ
とか必要不可欠なこととなっている。

、ＤＮＡ、ＲＮＡなとの核酸の＃１基配Ａを決定するた
めの代表的な方法として、オートラジオグラフィーを利
用するマキサム・ギルバート（Ｍａｘａ＠−ＧｉｌｂＣ
ｒＬ　）法およびサンガー・クールソン（ＳａＩＩｇｅ
ｒ−Ｃｏｕｌｓｏｎ）法が知られている。前者のマキサ
ム・ギルバート法は、まず、塩基配列を決定すべきＤＮ
ＡあるいはＤＮＡ断片物の鎖状分子の一方の端部に３２
　ｐ等の放射性同位元素を含む基を結合させて放射性標
識を付与したのち、化学的な手段を利用して鎖状分子の
構成単位（塩）ふ単位）間の結合を塩基特異的に切断す
る。次に、得られた塩基特異的ＤＮＡ切断分解物の混合
物をゲル電気泳動法により支持媒体上に分離展開し、多
数の切断分ｋｎ＆耳り柄工柄へ鰻１間七柄プで小七柄杷
ハ鹸Ｕ開パターン（ただし、視覚的には見ることかでき
ない）を得る。次いで、この分離展開パターンをたとえ
ばＸ線フィルムＬに可視化してそのオートラジオグラフ
を得、得られたオートラジオグラフと各々の塩基特異的
切断手段とから、放射性同位元素か結合された鎖状分子
の端部から一定の位を関係にある塩基を順次決定し、こ
れにより対象物全ての塩基配列を決定するものである。

また、後者のサンガー・クールラン法は、ＤＮ゛Ａある
いはＤＮＡ断片物の鎖状分子と相補的であって、かつ放
射性標識が付与されたＤＮＡ合成物を化学的な手段を利
用して塩基特異的に合成し、得られた塩基特異的ＤＮＡ
合成物の混合物を用いて上記と同様にしてそのオートラ
ジオグラフから塩基配列を決定する方法である。

従来より、オートラジオグラフの可視画像は。

放射性標識が付与された核酸の塩基特異的切断分解物も
しくは塩基特異的合成物（以下、単に核酸の塩基特異的
断片物と称する）が分ａ展開された支持媒体と、高感度
Ｘ線フィルムとを一定時間重ね合わせて該フィルムを感
光させることによりフィルム上に得られている。また、
核酸の塩基配列は、フィルム上に可視化されたオートラ
ジオグラフから核酸の塩基特異的断片物の分離展開位置
（バンド）を視覚的に判断し、それらバンドの位置を相
互に比較することにより決定され、そののち紙などの記
録材料あるいは磁気ディスクなどの記録媒体に記録保存
されている。従って、分離展開パターンのオートラジオ
グラフに関する情報とそれに基づいて決定された核酸の
塩基配列に関する情報とは全く別々の媒体に記録保存さ
れるために、両者を関連づけることか困難であった。

すなわち、分離展開パターンとパターンが包含する塩基
配列情報との関係はオートラジオグラフの解析時には明
確であるが、解析終了後に塩基配列情報か他の媒体に記
録されてしまうと再度両者の関連性を引き出すのか非常
に難しく、解析を中断して再開する場合には始めからや
り直さなければならなかったり、解析結果を確認する場
合には解析と同様の手間がかかるなどの問題かあった。

異なる媒体に相異なる形７８て蓄積保存されたパターン
情報と塩）＆配列情報は、それぞれの媒体においては一
連の情報としての価値があるが、両媒体間で一対一の対
応づけを即座に行なうことは殆ど無理であった。

［発明の要旨コ 本発明は、分離展開パターン情報と塩基配列情報とを一
対一の対応関係を維持したまま蓄積保存することができ
るオートラジオグラフ解析方法を提供するものである。

また、本発明は、核酸の塩基配列決定を随時中断、　ｉ
ｌＴ開することができるオートラジオグラフ解析方法を
も提供するものである。

さらに、未発ＩＪ１は、決定された核酸の塩基配列を容
易に確認することができるオートラジオグラフ解析方法
をも提供するものである。

すなわち、本発明は、放射性標識が付与された塩基特異
的ＤＮＡ断片物もしくはＲＮＡ断片物か支持媒体上に一
次元的方向に分離展開されて形成された複数の分離展開
列からなる分離展開パターンのオートラジオグラフを解
析することにより、核酸の塩基配列を決定する方法にお
いて、オートラジオグラフおよびそれに基づいて決定さ
れた核酸の塩基配列に関する情報を、 （１）該分離展開パターンのオートラジオグラフに関す
る情報、 （２）該オートラジオグラフ上のバンドを通り、バンド
の相対的な位置を指し示す複数の読取カーソルに関する
情報、および （３）該オートラジオグラフ上のバンドか帰属された塩
基の名称に関する情報、 からなる三種類に分離し、かつ（１）のパターン情報と
（２）のカーソル情報、および（２）のカーソル情報と
（３）の塩基多情報をそれぞれ対応づけて記録保存する
ことを特徴とする核酸の塩基配列決定のためのオートラ
ジオグラフ解析方法を提供するものである。

分離展開パターンのオートラジオグラフおよびそれに基
づいて決定された核酸の塩基配列は、オートラジオグラ
フ上の一つのバンドを通過する読取カーソルとバンドか
帰属される塩基の名称とによってＩＪ確に一対一の対応
関係をもって表示することができる。本発明においては
、これら分離展開パターン、読取カーソルおよび塩基名
に関する情報をそれぞれ分けて適当な記録媒体に記録保
存することにより、何時でも一対一の対応関係を維・持
した状態で任意の記録材料あるいはＣＲＴ等の表示画面
に表示記録することができる。

すなわち、従来のオートラジオグラフ（パターン）情報
および塩基配列情報のほかに、オートラジオグラフ上の
各バンドに対応する読取カーソルについての情報も記録
保存され、かつ塩基配列情報がこのカーソル（すなわち
、バンド）に対応する塩ノ人名として記録保存されるた
めに、オートラジオグラフおよび核酸の塩基配列につい
ての情報を、一対一の対応関係を維持したままで記録保
存することかてきる。

このことにより、解析済みのオートラジオグラフについ
て他人かその核酸の塩基配列を確認しようとする場合あ
るいは中断した才一トラジオグラフの解析を再開する場
合に、何時ても容易に確認もしくは途中から＋１間する
ことかてきる。具体的に、塩基配列の確認の場合におい
てはバンドの帰属が正しいか否かか一目瞭然に判Ｉｌｌ
する。また、中断した解析を再開する場合には、始めか
ら読み取ることなく中断したところから続行することか
できる。

また、上記パターン情報、カーソル情報および塩基多情
報をそれぞれ分離して記録保存することにより、任意の
一種もしくは二種の情報のみを引き出すことができる。

これにより、同一の核酸についての別の分離展開パター
ンへの塩基多情報の適用、あるいは全く異なる分離展開
パターンへのカーソル情報のみの利用か可能となる。

従って、本発明によれば、核酸の塩基配列のためのオー
トラジオグラフ解析における種々の制約を取り払って、
塩ノフ配列決定をより有利に進めることかてきるもので
ある。

なお、本出願人は、支持媒体上に分離展開された放射性
標識物質のオートラジオグラフを得る方法として放射線
フィルムを用いる従来の放射線写真法の代りに、蓄積性
蛍光体シートを用いる放射線像変換方法を利用する方法
について既に特許出願しテイル（特開１１／（５９−８
３０５７号、特願昭５８−２０１２３１す）。ここで、
蓄積性蛍光体シートは輝尽性蛍光体からなるものであり
、放射線エネルギーを該蛍光体シートの輝尽性蛍光体に
吸収させた後、可視乃至赤外領域の電磁波（励起光）で
励起することにより放射線エネルギーな輝尽光として放
出させることができるものである。

この方法によれば、′Ａ光時間を大幅に短縮化すること
かでき、また従来より聞届となっていた化学カブリ等が
発生することがない。さらに、放射性標識物質のオート
ラジオグラフは、−置数射線エネルギーとして蛍光体シ
ートに蓄積されたのち輝尽光として光電的に読み取られ
るから、直接にデジタル信号として得たのち適当な記録
媒体に記録保存することができる。

［発明の構成］ 未発１１において用いられる試料の例としては。

放射性標識か付与されたＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸の塩基
特異的断片物の混合物を挙げることかできる。ここで、
核酸の断片物とは長鎖状の分子の一部分を意味する。た
とえば、塩基特異的ＤＮＡ断片物混合物の一種である塩
基特異的ＤＮＡ切断分解物混合物は、前述のマキサム・
ギルバート法に従って、放射性標識か付与されたＤＮＡ
を塩基特異的に切断分解することにより得られる。また
、１１！基特異的ＤＮＡ合成物混合物は前述のサンガー
・クールノン法に従って、ＤＮＡをテンプレート（ＦＪ
型）として、放射性標識が付与されたデオキシヌクレオ
シドトリフオスフェートとＤＮＡ合成酵素とを用いて合
成することにより得られる。

さらに、塩基特異的ＲＮＡ断片物の混合物も上記と同様
の方法により、切断分解物混合物としてまたは合成￥ｗ
Ｊ混合物として１１）ることかできる。なお、ＤＮＡは
その構成中位としてアデニン、グアニン、チミン、シｌ
〜シンの四種類の塩基からなるが、一方ＲＮＡはアデニ
ン、グアニン、ウラシル、シトシンの四種類の１１！基
からなる。

放射性標識は、これらの物質に適当な方法で３２ｐ、Ｉ
ｎ（：、δＳ、コＨ，Ｌ３Ｉなどの放射性同位元素を保
持させることによって付与される。

試料である放射性標識が付与された核酸の１１！基特異
的断片物の混合物はゲル状支持媒体など公知の各種の支
持媒体を用いて、電気泳動法、薄層クロマトグラフィー
、カラムクロマトグラフィー。

ベーパークロマトグラフィーなど種々の分離展開方法に
より支持媒体−りに分離展開される。

本発明の解析方法において記録保存すべき情報は、たと
えば以下に述べるような方法により得ることかできる。

以下の四種類の放射性標識が付与された塩基特異的ＤＮ
Ａ断片物の混合物が電気泳動によりゲル支持媒体上に分
離展開されてなる泳動パターンを例にとって説明する。

■）グアニン（Ｇ）特異的ＤＮＡ断片物２）アデニン（
Ａ）特異的ＤＮＡ断片物３）チミン（Ｔ）特異的ＤＮＡ
断片物 ４）シトシン（Ｃ）特異的ＤＮＡ断片物ここて、各１１
！基特異的ｏＮＡＦＩｉ片物は、塩基特異的に切断分解
もしくは合成された、すなわち末端」ｉ！基を同じくす
る種々の長さのＤＮＡＦｌｉ片物からなる。

まず、支持媒体にの泳動パターンについて従来の写真感
光材料を用いる放射線写真法により、あるいは蓄積性蛍
光体シートを用いる放射線像変換方法によりそのオート
ラジオグラフを得たのち、適当な読取り（読出し）系を
介して該オートラジオクラブに対応するデジタル信号を
得る。

前者の放射線写真法を利用する場合には、まず支持媒体
とＸ線フィルム等の写真感光材料とを低温（−９０〜−
７０°Ｃ）て長時間（数十時間）重ね合わせて放射線フ
ィルムを感光させたのち、現像して放射性標識物質のオ
ートラジオグラフを放射線フィルム上に可視画像化する
。次いで１画像読取装置を用いて放射線フィルム上に可
視化されたオートラジオグラフを読み取る。たとえば、
放射線フィルムに光ビームを照射してその透過光または
反射光を光電的に検出することにより、オートラジオグ
ラフは電気信号−とじて得られる。さらに、この電気信
りをＡ／Ｄ変換することにより、オートラジオグラフに
対応するデジタル信号を得ることかできる。

後者の放射線像変換方法を利用する場合には、まず、支
持媒体と蓄積性蛍光体シートとを常温で短時間（数秒〜
数十分間）重ね合わせて蛍光体シートに放射性標識物質
から放出される放射線エネルギーを蓄積させることによ
り、そのオートラジオグラフを蛍光体シートに一種の潜
像として記録する。ここで、蓄積性蛍光体シートは、た
とえばプラスチックフィルムからなる支持体、二価ユー
ロピウム賦活弗化臭化バリウム（ＢａＦＢｒ：Ｅ　ｕ　
”　）等の輝尽性蛍光体からなる蛍光体層、および透明
な保護膜かこの順に積層されたものである。蓄積性蛍光
体シートに含有されている輝尽性蛍光体は、Ｘ線等の放
射線が照射されるとその放射線エネルギーを吸収して蓄
積し、そののち可視乃至赤外領域の光で励起すると蓄積
していた放射線エネルギーな輝尽光として放出するとい
う特性を有する。

次いて、読出装養を用いて蓄積性蛍光体シートに？Ｂ積
記録されたオートラジオグラフを読み出す。几体的には
、たとえば蛍光体シートをレーザー光で走査して放射線
エネルギーな輝尽光として放出させ、この輝尽光を光電
的に検出することにより、放射性標識物質のオートラジ
オグラフは可視画像化することなく直接に電気信号とし
て得られる。さらに、この電気信号なＡ／Ｄ変換するこ
とにより、オートラジオグラフに対応するデジタル信号
を得ることができる。

上述のオートラジオグラフ測定操作およびオートラジオ
グラフに対応するデジタル信号を１−Ｉる方法の詳細に
ついては、前記特開昭５９−８３０５７号公報等に記・
戒されている。

なお、上記においては、支持媒体上に分蕩展開された放
射性標識物質のオートラジオグラフに対応するデジタル
信号を得る方法として、従来の放射線写真法および放射
線像変換方法を利用する方法について述べたが、これら
の方法に限定されるものではなく、それ以外の如何なる
方法により得られたデジタル信号であっても放射性Ｐｉ
ｎ物質のオートラジオグラフと対応関係がある限り、未
発ＩＪＪの信号処理方法を適用することか回部である。

また、上記いずれの方法においてもオートラジオグラフ
の読取り（または読出し）は、放射線フィルム（または
Ｊａ性蛍光体シート）の全面に亘って行なう必要はなく
１画像領域のみについて行なうことも勿論可滝である。

さらに、本発明においては、予め各泳動列の位置および
バンドの幅等についての情報を入力して読取り（読出し
）条件を設定しておき、読取り（読出し）操作において
は各バンド上を二本以上の走査線が通過するような走査
線密度で光ビームによる走査を行なうことにより、読取
り（読出し）時間を短縮化して必要な情報を効率良く得
ることができる。なお、本発明においてオートラジオグ
ラフに対応するデジタル信−）とは、このようにして得
られたデジタル信号をも包含する。

得られたデジタル信号Ｄｘｙは、放射線フィルム（また
は蛍光体シート）に固定された座標系て表わされた座標
（ｘ、ｙ）とその座標における信号のレベル（Ｚ）とか
らなる。信号のレベルはその座標における画像濃度、す
なわち放射性標識物質の量を表わしている。従って、一
連のデジタル信す（すなわち、デジタル画像データ）は
放射性標識物質の二次元的な位置情報を有している。

次に、このオートラジオグラフに対応するデジタル信号
を一旦メモリ（バッファーメモリ、または磁気ディスク
等の不揮発性メモリ）に記憶したのち、信号処理回路と
、オートラジオグラフ、カーソルおよび塩基名記入欄を
同時に表示することができるＣＲＴなどの表示手段と、
カーソル移動３よび塩基名表示のための入力を行なうこ
とができる入力丁一段と、パターン情報、カーソル情報
および塩基名情報を記録保存することがてきる保存手段
とを有する装置に送り、解析対象のオートラジオグラフ
（放射性標識物質の泳動パターン）を表示画面上に可視
画像化する。

なお、デジタル信号には予め、膿度およびコントラスト
か適１［て観察読影性濠の優れた可視画像が得られるよ
うに信Ｖ）処理（画像処理）を行なっておいてもよい。

画像処理としては、たとえば、空間周波数処理、階調処
理、加算ｆ均処理、縮小処理、拡大処理などが挙げられ
る。

画面上に画像表示されるオートラジオグラフは１画面に
設定された座標系における信号のレベル（画像Ｃ度、す
なわち放射性標識物質の量）を色彩の明度で表わした、
従来の写真画像と同様の濃淡画像であってもよいし、あ
るいは信号レベルを予め二値化することにより筒略化し
て表わした二値画像であってもよい。

あるいはまた、オートラジオグラフは、−次元の位２１
（泳動方向に沿った位置）と信号レベルとからなる多数
の二次元波形を泳動方向に垂直な方向に一定間隔で多重
表示することにより表わした画像（いわゆる鳥ｗｉ図）
であってもよい。この鳥轍図によれば放射性標識物質の
量が鳥Ｗ＆図の高さとして三次元的に表わされるから、
バンドのピーク位置を正確に読み取ることかでき、泳動
列（し−ン）間のバンドの位置関係の把握並びに泳動開
始位置近くのバンドの密な領域におけるバントの分離を
容易に行なうことができる。なΣ、鳥緻図によってオー
トラジオグラフを表示する方法の詳細については、本出
願人による特願昭６０−１８１４３１号用細書に記載さ
れている。

第１図に、画面上に濃淡画像として表示された泳動パタ
ーンのオートラジオグラフの例を示す。

また第２図に、烏ｉ１図として表示された泳動パターン
のオートラジオグラフの例を示す。

次に、表示画面にに基本となる読取カーソルを表示し、
このカーソルに基づいてバンドの序列づけ（帰属）を行
なう。

読取カーソルはレーンを横切る単なる直線として表示し
てもよいが、スマイリング現象またはオフセット歪みな
どによって泳動パターンにハントの位置ずれあるいはバ
ンドの欠陥か生じている場合には、各レーンのバンドに
沿った折れ線もしくは曲線を作成して表示するのが好ま
しい。

ける放熱効果（エツジ効果）などが原因となって生じる
ものであり、支持媒体の中央部の泳動距離に比べて両端
部の泳動距離が短くなる現象をいう。またオフセット歪
みとは、試料注入口（スロット）の形状の相違等により
試料の泳動開始位置、開始時間が各レーンで異なること
などが原因となって生じるものであり、レーン間相互の
全体的な位置ずれをいう。これらのバンドの位置ずれの
ほかにもバンド自体の欠陥、レーンの蛇行などが生じる
ことかある。

基本となる折れ線状もしくは曲線状の読取カーソルは、
たとえば以下のようにして作成することができる。

第３図は、画面上に濃淡画像として表示された泳動パタ
ーンのオートラジオグラフの別の例を示す図である。第
３図において泳動方向は右方向であり、泳動パターンに
はスマイリング現象か生じている。

まず、画面の上端から表示画面に基づいて入力−【１１
ナ一ノ！１Ｍ−１ニーアシ＋Ｇ古ｔ〉く１）’ｒｅ山／
山内１ｈ÷＊ｚＩＪｔｋｎの位置は、端部のレーン上の
ハントの位置であるのか好ましい（第３図１）。端部の
レーンとするのは読取カーソルがこの位置を起点として
作成されるからである。

位置情報の入力は、マウスカーソル、ライトベン、ジョ
イスティックなどのＬ段を用いて行なうことがてきる。

位置精度の点から、特にマウスカーソルが好ましい。

たとえば、画面上のオートラジオグラフが表示される四
角形の領域を座標（Ｘａ、　ｙａ）、（Ｘ　ｂ　＊　Ｙ
　ｂ　）で表わし、マウスカーソル（画面上の矢印２）
の位置座標を（ｘｍ　＊　’／　ｍ　）で表わすとする
と、マウスカーソルによってＸ、＝ｘ８．ｙＩｎ＝ｙＩ
なる位置情報か人力されることにより、線分３　（ｘ＋
＋　３’ａ）（Ｘ＋、Ｖ＋）が画面上に表示される。

次に、起点４の位とから、それよりも泳動パターンの内
側の入力された位置（第二の位２１）まで直線を引く。

位置の入力は上記と同様にしてマウスカーソル等を介し
て行なわれる。まず始めに、起点４　（ｘ　＋　、　ｙ
　＋　）とマウスカーソル２の位１　（Ｘ　ｍ　＋　３
’　ｍ　）との間に線分（’Ｘ＋＋３／＋）（ｘｍ、ｙ
ｍ）か表示される。マウスカーソル２が移動すると、こ
の線分離画面・上で消えて、新たに起点４と移動した位
置との間に線分が表示される。なお、マウスカーソルは
上記座標（Ｘ　ａ　＋ｙａ）、（Ｘ　ｂ　＋　３／　ｂ
　）で仕切られた四角形の領域内を自由に移動すること
がてきる。こうして、マウスカーソルの移動とともに起
点４とマウスカーソル２の各移動位置とを結んだ線分が
次々と表示される。該線分か好適にレーンを横切るとこ
ろで位置の入力を行なうことにより、線分３に連結した
次の線分が画面に固定されて表示される。

このようにして、上端のレーンから下端のレーンまでレ
ーンを横切りかつ各レーンのバンドに沿うように順次、
線分（Ｘ　＋　＋　３’　＋　）　　（Ｘ　１０１１ｙ
、や、）（ただし、ｉは正整数である）を引く。

なお、試料は四種の塩基特異的ＤＮＡ断片物の排他的な
組合せであるので、各レーンのバンドは互いに同じ位置
（泳動距離）には存在しえない。従って、ｆバンドに沿
うように１とは、各レーンの泳動距離が等しくなるよう
に巨視的な意味でバンドに沿って線分を引くことを意味
し、厳密に各線分か各レーンのハント１−を通過するこ
とを意味するものではない。

次いて、第４図に示すように、線分が泳動パターンを完
全に横切った時点で最後に入力された位置が終点である
との入力情報に従って、該終点の位置５から画面下端ま
での垂直な線分６（ｘ１、Ｖ＋）（Ｘ＋＋　ｙｂ）を引
く。このようにして画面上には、泳動パターンを完全に
横切った複数の連結した折れ線からなる読取カーソル７
か表示される。

読取カーソルは泳動パターン上の任意の領域で作成する
ことができ、泳動開始位置に近いパターン上部の領域で
あってもよいし、あるいは泳動距離の大きなパターン下
部の領域であってもよい。

また、入力される位置情報は、泳動パターンに応してレ
ーンの個数程度であってもよいし、あるいはそれより多
くても少なくてもよい。少なくとも一つの位置が入力さ
れ、かつ起点と終点か認識できればよい。読取カーソル
は、入力位置を直線で結んだ折れ線状であってもよいし
、あるいは得られた折れ線に適当な演算処理（曲線近似
）を施すことにより曲線状であってもよい。

作成された読取カーソルは泳動パターンに合致している
から、このカーソルを用いて解析者は正確かつ容易にＤ
ＮＡの塩基配列を決定することができる。なお、読取カ
ーソルの作成および表示方法の詳細については本出願人
による昭和６１年３Ｊ１５１１出願の特願昭６１−　　
　号明細書に記載されている。

バンドの帰属は、この基本の読取カーソルを泳動パター
ンヒの各バンドに固定しながら行なう。

その際に、バンドか帰属されたに１Ｘ基の名称も同時に
画面上に表示することにより、読み落とし１重複読みな
どの読取りミスおよび記入漏れなどの記入ミスを防１ト
することができる。

第５図は１画面りに表示された泳動パターンのオートラ
ジオグラフ１１、読取カーソル１２、ｌ３および塩基名
記入ｆｌ１４の例を示す図である。第３図において、泳
動方向は右方向であり、読取カーソル１２に基づいて既
に読み取られたバンドの塩基名（Ｇ、Ａ、ＴまたはＣの
頭文字で表示）か記入欄１４に表示されている。

まず、カーソル移動についての入力情報に従って、これ
から読取りに使おうとする基本の読取カーソル（これを
アクティブカーソルと呼ぶ）１３を左または右にｆ行移
動させて、次に読み取るべきバンドの位置に合わせる。

既に読取りに使用されたカーソル１２（これをマークカ
ーソルと呼ぶ）は、読み取られた塩基名とともにそのま
ま画面に表示しておく。

この際に、読取りに使用済みのパターンに固定されたマ
ークカーソルと未使用の移動可癒なアクティブカーソル
とを区別し、また読取処理済みの塩基名記入欄と未処理
の記入欄とを区別して表示するのか好ましい。これによ
り、読取りミスおよび記入ミスをより確実に防１にする
ことができる。

これらの区別は、色彩、模様、輝度の相違などによって
行なう。

なお、ハントの帰属を行なう過程てアクティブカーソル
か泳動パターンに合致しなくなった場合には、前記と同
様の操作を繰り返すことにより筒中に所望の形状のカー
ソルを作成表示することかてきる。

各ハントが属する（１）〜（４）のレーンはそれぞれ（
、Ｇ）、（Ａ）、（Ｔ）、（Ｃ）からなる末端塩基につ
いての情報を有するから、ハントの属するレーンに対応
する塩基の名称がキーボード操作などによって入力され
ると、直ちに未処理の記入欄１５に塩基名が表示される
。勿論、表示か正しくない場合には再入力によりその場
て修正することができる。また、後になって誤り箇所の
訂正をすることもできる。なお、この際に上記四種類の
ａ！基特異的ＤＮＡｌｌｌ１片物の組合せが排他的な組
合せであることから、同じ位置に二つ以上のバンド（異
なるレーンのバンド）は存在しえないことを利用して、
バンドの帰属を行なうことがてきる。

このようにして、順にハントに塩基名を付すことができ
る。未使用のアクティブカーソルおよび未処理の塩基名
記入欄の色彩などによる識別表示は、次にカーソル移動
のための入力が行なわれることにより使用済み（マーク
カーソル）および処理済みと判断して直ちに表示が転換
される。そして、入力情報に従って新たに画面上を移動
していく読取カーソルにはアクティブカーソルの識別が
なされている。

なお、読取カーソルと塩基名記入欄の同時表示方法の詳
細については本出願人による昭和６１年３月１２目出願
（２）の特願昭６１−　　　　Ｌ３明細書に記載されて
いる。

読取りの終了した画面上には、各バンドに−・対−で対
応した読取カーソルと、カーソルの゛ド端の記入欄に記
入された一連の塩基名が表示されて残る。この一連の塩
基を端から順に結ぶことにより、ＤＮＡの塩基配列（例
えばＴ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−・・・）を得ること
ができる。

１−１　１−　ｒＡ　ＩＡ＆　νｒ　ル認？　　ｉｌ；
　ｉ？ｉｉ　　ｌ−Ｌ：”　　訂’Ｊｊ　−ｋ　　ｈ　
　ｆ−す　−　ｋ　４ジオグラフおよび核酸の塩基配列
に関する情報を、本発明の特徴的な要件であるパターン
情報。

カーソル情報および塩基多情報の三種類に分離して記録
保存する。

第一に、画面上に表示された泳動パターンのオートラジ
オグラフについての情報のみを、パターン情報として記
録保存する。具体的には、第１図に示したような濃淡画
像、第２図に示したような烏轍図、あるいは二値画像に
対応するデジタル画像データとして記録保存する。デジ
タル画像データは、上述したように一画素に対応する二
次元の座標（ｘ、ｙ）と信号レベル（ｚ）とからなる。

第二に、画面上の泳動パターンに重ね合わせて固定され
た多数ρ読取カーソルについ°ての情報のみを、カーソ
ル情報として独立に記録保存する。

このカーソル情報は、帰属されたバンドの個数に相当す
る個数のカーソルについてのデータであり、各カーソル
、にはバンドの序列に従う番号が付されており、そして
たとえば読取カーソルが折れ線状である場合には各折れ
線の筒口の二次−ｊ、座縛かデータとして記録保存され
る。具体的には、第６図に示すような多数の読取カーソ
ルについてのデータか記録保存される。

第三に、バンドの帰属された塩基の名称についての情報
のみを独立に塩基名情報として記録保存する。この塩基
名情報にはバンドの序列に従う番号が付されており、具
体的には、第７図に示すような文字列データが記録保存
される。

従って、パターン情報とカーソル情報とは、画面に固定
された二次元座標て対応づけられて（これをアドレス対
応という）保存され、カーソル情報と塩基名情報とは泳
動パターン上のバンドの序列類の番号で対応づけられて
（これを順序対応という）保存されることになる。

これら三種類の情報は、たとえば二次記憶装置などの保
存手段に記録保存されて三つの情ｔ＆！ファイルか形成
される。そして、別々に記録保存された情報ファイルは
、何時ても再び組み合わせてＣＲＴ笠の表示画面あるい
は感光材料、感熱記録材料等の記録材料上に再現するこ
とができる。すなわち、たとえば第１図、第６図および
第７図にそれぞれ対応したパターン情報、カーソル情報
および塩ノ＾名情報か記録保存された三つの情報ファイ
ルを統合して、再び第５図に示すような表示形態て表わ
すこと′ができる。

ただし、情報が記録保存される保存り段（記録媒体）は
二次記憶装置に限られるものではなく、上記三種の情報
を一対一の対応関係を維持したまま別個に保存でき、か
つ随時組み合わせて再現することができる限り、任意の
記録媒体を選択することかできる。また、必ずしも三種
類の情報全部を同一の記録媒体に記録保存する必要はな
い。

さらに、情報の記録保存はオートラジオグラフの解析終
了後のみならず、解析の途中て随時性なうことができる
。使用される記録媒体か磁気ディスク等のように随時書
込みおよび読出し可能なものである場合には、一度記録
保存された媒体に繰り返し情報を記録することかできる
。

従って、解析済みのオートラジオグラフについて後日そ
の確認をする場合に帰属されたバンドと塩基名との照合
、確認を容易に行なうことがてきる。また、オートラジ
オグラフの解析を中断した場合には中断したところから
バンドの帰属を続行することがてきる。

上記においては、試料である塩基特異的ＤＮＡ断片物の
混合物として（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）の排他的組合せを利用
した場合について説明したが、本発明の解析方法はこの
組合せに限定されるものではなく１例えば（Ｇ、Ｇ＋Ａ
、Ｔ＋Ｃ，Ｃ）などの種々の組合せに適用することがで
きる。また同様に、塩基特異的ＲＮＡ断片物の混合物（
例えば、Ｇ、Ａ、Ｕ、Ｃの組合せ）についても本発明の
方法を適用することかできる。

【図面の簡単な説明】

第１図は１画面上にｅ淡画像として表示された泳動パタ
ーンのオートラジオグラフの例を示す図である。 ：５２図は、画面上に島轍図として表示された泳動パタ
ーンのオートラジオグラフの例を示す図である。 第３図および第４図はそれぞれ、画面上に表示されたオ
ートラジオグラフを示す図であり、読取カーソルの作成
工程を説明する図である。 ｌ：泳動ハント、２：マウスカーソル。 ３．６：線分、４：起点、５：終点、 ７：読取カーソル 第５図は、画面上に表示されたオートラジオグラフ、読
取カーソルおよび塩基名記入欄の例を示す図である。 ｌにオートラジオグラフ １２：使用済みのカーソル （マークカーソル） １３：未使用のカーソル （アクティブカーソル） １４１１Ｊ基名記入欄、１５：未処理の記入欄第６図は
、カーソル情報と記録保存される多数の折れ線状の読取
カーソルの例を示す図である。 ：ＪＳ７　ｒｇは、塩基名情報として記録保存される一
連の塩基名の例を示す図である。 第１図 第３図 第４図 第５図 第６図 第７図 ＧＡＧＡＴＴＣＣＣＡＴＧＣＡＧＧ・・・・甲・・・山
手続補正書 昭和６２年　４月１０日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、放射性標識が付与された塩基特異的ＤＮＡ断片物も
   しくはＲＮＡ断片物が支持媒体上に一次元的方向に分離
   展開されて形成された複数の分離展開列からなる分離展
   開パターンのオートラジオグラフを解析することにより
   、核酸の塩基配列を決定する方法において、オートラジ
   オグラフおよびそれに基づいて決定された核酸の塩基配
   列に関する情報を、 （１）該分離展開パターンのオートラジオグラフに関す
   る情報、 （２）該オートラジオグラフ上のバンドを通り、バンド
   の相対的な位置を指し示す複数の読取カーソルに関する
   情報、および （３）該オートラジオグラフ上のバンドが帰属された塩
   基の名称に関する情報、 からなる三種類に分離し、かつ（１）のパターン情報と
   （２）のカーソル情報、および（２）のカーソル情報と
   （３）の塩基名情報をそれぞれ対応づけて記録保存する
   ことを特徴とする核酸の塩基配列決定のためのオートラ
   ジオグラフ解析方法。 ２、上記パターン情報とカーソル情報とが座標系によっ
   て対応づけられており、カーソル情報と塩基名情報とが
   順序によって対応づけられていることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項記載の核酸の塩基配列決定のためのオ
   ートラジオグラフ解析方法。 ３、上記パターン情報、カーソル情報および塩基名情報
   を二次記憶装置に記録保存することを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載の核酸の塩基配列決定のためのオー
   トラジオグラフ解析方法。 ４、上記パターン情報、カーソル情報および塩基名情報
   を、同一の記録媒体に記録保存することを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載の核酸の塩基配列決定のための
   オートラジオグラフ解析方法。 ５、上記パターン情報が、濃淡画像、二値画像、もしく
   は分離展開方向に沿った位置と画像濃度とからなる複数
   の二次元波形を分離展開方向に垂直な方向に一定間隔で
   多重表示してなる画像からなることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載の核酸の塩基配列決定のためのオー
   トラジオグラフ解析方法。 ６、上記カーソル情報が、分離展開列を横切りかつ各列
   のバンドに沿った複数の折れ線もしくは曲線からなるも
   のであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
   核酸の塩基配列決定のためのオートラジオグラフ解析方
   法。 ７、上記塩基名情報が、文字および／または記号からな
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の核酸の
   塩基配列決定のためのオートラジオグラフ解析方法。 ８、上記オートラジオグラフが、支持媒体と輝尽性蛍光
   体を含有する蓄積性蛍光体シートとを重ね合わせて、支
   持媒体上の放射性標識物質のオートラジオグラフを該蛍
   光体シートに蓄積記録した後、該蛍光体シートに励起光
   を照射して該オートラジオグラフを輝尽光として光電的
   に読み出すことにより、デジタル信号として得られるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の核酸の塩基
   配列決定のためのオートラジオグラフ解析方法。 ９、上記オートラジオグラフが、支持媒体と写真感光材
   料とを重ね合わせて、支持媒体上の放射性標識物質のオ
   ートラジオグラフを該感光材料に感光記録した後、該感
   光材料上に可視化されたオートラジオグラフを光電的に
   読み取ることにより、デジタル信号として得られること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の核酸の塩基配
   列決定のためのオートラジオグラフ解析方法。