JPS62501677A - Ｄ−アミノ酸オキシダ−ゼ及びその単離方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ及びその単離方法この発明はセファロスポリンＣに対 して活性なり一アミノ醜オキシダーゼ及びトリゴノプシス・パリアビリス（Ｔｒ ｉｇｏｎｏｐｓｉｓ　ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）からのその単離方法に関する。

アミノ酸オキシダーゼ活性を用いて、α−ケト酸をその対応するアミノ酸から製 造することは長い間興味を引いているものである。なぜなら、α−ケト酸は、腎 不全の患者の栄養補給のために興味があるからである。酵母トリゴノプシス・ハ リアビリス中に見出されたＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性（プロプリウス・ピー 、エルシン・ケイ及びモスバラク・ケイ（１９８１）、　Ａｐｐｌ、　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ。

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　６．２９３−３０８）及び細菌プロビデンシア中に見 出されたし一アミノ酸オキシダーゼ活性（シュヮジュサー・イー、プロプリウス ・ピー及びモスバック・ケイ（１９８２）、　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ、　 Ｔｅｃｈｎｏｌ、　４．４０９−４１３）の両方とも用いられている。０−アミ ノ酸オキシダーゼはまた。

セファロスポリンＣを酸化的に脱アミノしてこれをケトアジピック７−アミツセ フアロスボラニル酸にする活性を有することが知られている。同じ活性はまた、 米国特許ｍ３，６５８，６４９号にも報告されている。しかしながら、用いられ た抽出物はｆ！ｔｍアンモニウム沈殿のみによって得られたものであり、そのた め、数種類のアミノ酸オキシダーゼを含む粗製剤であった。この活性に関し、以 下の生物を包含する多数の生物について試験された。ニジエリシア、コリ（Ｅ、 　ｃｏｌｉ）　、シュードモナス・スピシーズ（Ｐｓｃｕｄｏｍｏｎａｓ　５ｐ ｅｃｉｅｓ）、アエロバクタ−、スピシーズ（＾ｃｒｏｂａｃＬｃｒ　５ｐｅｃ ｉｅｓ）、カンディダ・トロピキャリス（Ｃａｎｄｉｄａ　Ｌｒｏｐｉｃａｌｉ ｓ）、ペニシリウム・ロク７ｔ−ティ（Ｐｃｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｒｏｃｒｏｒ Ｌｉ）、アスパラギルス・フラバス（八５ｐａｒ）Ｈｉｌｌｕｓ　ｆｌａｖｕｓ ）、アスパラギＪレス・ニガー（Ａ、　ｎｉｇｅｒ）、　＝ニーロスボラ・クラ ップ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ）　、ノカーディア（Ｎｏｃａｒｄｉ ａ）、シトロバクタ−（Ｃｉ　ＬｒｏｂａｃＬｅｒ）及びトリボノブシス・パリ アビリス、トリボノブシス・パリアビリスとシトロバクタ−のみがセファロスポ リンＣとケトアジピック７−アミツセフアロスボラニル酸に脱アミノすることが できた。シトロバクタ−中に見出された活性は非常に低く、酵素は膜に結合して いると思われる。一方、トリボノブシスからの酵素は細胞質中にはるかに高い濃 度で存在した。セファロスポリンＣに対する活性はまた豚の腎臓中にも見出され たことを述べておくべきであろう（マゼオ・ピーとロメオ・エイ（＋９７２）　 Ｊ、Ｃ，Ｓ、　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｉ（Ｐ：ｌ）、　２５３２）　、　７−アミツセ フアロスボラニル耐は、６−アミツベニシラノイル酩から゛ト合成ペニシリンを 製造するのと同様な方法で、半合成セファロスポリンを製造するための基本部分 として産業的な興味が非常に大きい。グルタリル−７−アミツセフアロスボラニ ル酸の側鎖を加水分解するアシラーゼか報告されている（シビバ・ケイ、マツモ ト・ケイ及び）１４ｉ１１ＢＧ２−５０１６７７　（３）ジ・ティ（１９８１） 、Ａｇｒ、　Ｒｉｏｔ、　Ｃｈｅｗ、　４５．　（１５６１−１５６７）。

グルタリル−７−アミツセフアロスボラニル酸は、７−アミツセフアロスボラニ ル酸から、同時に生成する過酸化水素によって自発的に生成する０次の式は、２ つの酵素の影響下での７−アミツセフアロスボラニル酸の生成を示しＣＯＯＩ＋ グルタリル−７−アミツセフアロスボラニル酸Ｃ００１１ ７−アミツセフアロスボラニル酸 この発ＩＪ１の目的は、実質的に純粋でかつセファロスポリンＣに対して活性な 形態のトリボノブシス・パリアビリスのＤ−アミノ酸オキシダーゼを製造するこ とである。

このｆｆｉ　ｌｊＪのもう１つの目的は、トリゴノブシス・パリアビリスからｐ −アミノ酸オキシダーゼを単離する方法を提供することである。

Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを単一成分になるまで精製するこの発す１の簡便な方 法は３段階で行なわれる。すなわち、この発明の方法は （ａ）トリボノブシス・パリアビリスの粗創胞抽出物を酸処理して加熱し、沈殿 及び上清分画を得る。

（ｂ）段階（ａ）で得られた上清分画を十分量の硫酸アンモニウムて処理して第 ２の沈殿を得る。この第２、特許請求の範囲第１項記載のＤ−アミノ酸オキシダ ーゼを含有している。

（ｃ）段階（ｂ）で得られた沈殿を再懸濁し１等電沈殿によって０−アミノ酸オ キシダーゼを回収する。

上記段階（ａ）の酸処理は、粗細胞抽出物に酢酸を加えることによって行なうこ とができる。細胞抽出物は、そのｐ＋１が約４ないし６．好ましくは約５．１な いし５．３゜最も好ましくは約５．３になるように酸処理される。

さらなる具体例においては、ａ処理によって生成したあらゆる沈殿か加熱前に除 去される。さらに、Ｄ、Ｌ−メチオニンを終Ｃ度が好ましくは約２５１Ｍになる ように加えることができる。

粗抽出物は上記段階（ａ）において約４０ないし約６０℃、好ましくは約４０な いし約５０℃、最も好ましくは約５０℃に加熱される。

もう１つの好ましい具体例では、段階（ａ）で得られた上清は硫酸アンモニウム の処理に先立って、好ましくは２０５Ｍのどロリン酸ナトリウムを含む緩衝液（ ｐｌ＋８．３）に対して透析される。

さらにまた別の好ましい具体例では１段階（ａ）で得られた上清分画は、透析の 後であって硫酸アンモニウム処理の前に濃縮化される。この濃縮化は好ましくは 蒸発によって行なわれる。

好ましい具体例では、硫酸アンモニウムによる処理は、以下の工程を含む。

（ｉ）硫酸アンモニウムを、その濃度が約３０重量％になるように上記上清分画 に加え、１１１られた沈殿を除去する。そして。

（ｉｉ）（ａ）の上清にさらに硫酸アンモニウムを加えて硫酸アンモニウム濃度 を約５５％とし、得られた沈殿を回収する。

上記段階（Ｃ）で得られた第２のＤ−アミノ酸オキシダーゼ含有沈殿は、等電沈 殿による回収に先立つて。

好ましくは２０５Ｍのどロリン酸ナトリウムを含む緩衝液（ｐＨ８，：ｌ）に対 して透析される。

等電沈殿は以下の工程を含む。

（ａ）前記第２の沈殿を、２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐｌ＋５．１）を含む緩 衝液に対して透析し、透析後に残留するあらゆる沈殿を除去する。そして、 （ｂ）ｌ記透析工程で得られた溶液を、　１００ｍＭの酢酸ナトリウムを含む緩 衝液（ｐＨ４，６）に対して透析し、精製されたＤ−アミノ酸オキシダーゼ沈殿 を回収する。

孝電沈殿によって得られたＤ−アミノ酸オキシダーゼは、ゲル電気泳動によって さらに精製することもできる。

キシダーゼをも提供する。

さらなる具体例において、この発明の方法は、以下のことを特徴とする。

（ａ）トリボノブシス・パリアビリスの細胞が崩壊されて粗抽出物を形成し、そ れが酸処理される。

（ｂ）酸処理された粗抽出物は５０℃に加熱され、精製した沈殿は除去され、上 清が透析される。

（Ｃ）　（ｂ）の生成物は硫酸アンモニウムで沈殿され透析される。そして、 （ｄ）　Ｄ−アミノ酸オキシダーゼが等電沈殿によって単離される。

この発明の方法のさらなる具体例は以下の工程を含む。

（ａ）トリボノブシス・パリアビリスの粗細的抽出物に酢酸をｐＨが約５．３に なるまて加えることによって粗、細胞抽出物を酸処理して沈殿及び上清分画を生 成させる。

（ｂ）上記上清にり、Ｌ−メチオニンを終濃度が２５諺閾になるまで加える。

（Ｃ）上記上清を５０°Ｃに加熱し、この温度で１０分間維持して第２の沈殿及 び上清分画を生成させる。

（ｄ）工程（Ｃ）で得られた上記上清を２０１Ｍの１ピロリン酸緩衝液、　ｐＨ ８，３に対して透析する。

（ｅ）工程（ｄ）で得られた溶液Ｃ硫酸アンモニウムナトリウムを終濃度３０％ になるように加え、（すられた沈殿を除去する。

（ｆ）工程（ｅ）で得られた溶液に固体の硫酸アンモニウムを終濃度５５％にな るように加え、得られた沈殿を回収する。

（ｇ）工程（ｆ）で得られた沈殿を先ず２０ａＭピロリン酸ナトリウム、ｐＨ８ １に対して透析し１次に２５震舗の酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨｓ、ｌに対して透 析し、透析後に残留する溶解されないあらゆる沈殿を除去する。

（ｈ）工程（ｇ）て得られた溶液を１００■關酢酸ナトリウム緩衝液ｐｔ目、６ に対して透析し、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ含有沈殿を回収する。

この発明を、添付の図面を参照して実施例でより詳細に説明する。

第１図は、生Ｘ＆、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼのポリアクリルアミドゲル電気泳 動を示す、ドデシル硫酸ナトリウム中の２５ｐｇの純粋なタンパク質のゲル電気 泳動において、１本のタンパク質バンドのみが現れた（左に見える弱いバンドは 、２本の「融合」ゲルの境界線を示す。

ゲルに加えられたマーカーはタンパク質染色の前に切り出された。

第２図は、トリボノブシス・パリアビリスからのドアミノ酸オキシダーゼの分子 量の測定結果を示す。

ＳＤＳゲル電気泳動はラエムリの方法（Ｌａｅ■ｍｌｉ、　Ｕ、Ｋ。

（１９７０）、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７．６８Ｇ−６８５）に従って１２％ポリ アクリルアミド中で行なりた０次のタンパク賀マーカーを用いた。Ａ＝７７１ｚ ブミ：／　（６６，０００）、ＯＶ　＝　ｔ　／＜　ルブミ、−／（４５，００ ０）、Ｔ「＝トリプシノーゲン（２４，０００）、Ｌ＝リゾチーム（１４，５Ｏ Ｄ） 第３図はドアミノ酩オキシダーゼに関するゲルの活性染色を示す０図示の分画は 、この発明の第３段階から取った。ゲルは次のものと共にインキュベートした。

ａ＝セファロスポリンＣ，ｂ＝Ｄ−ロイシン　分析は以下のようにして行なった 。

ペルオキシダーゼ（セイヨウワサビからの■型）。

全てのアミノ酸、セファロスポリンＣ、ジニトロフェニルヒドラジン及びＯ−ジ アニシジンはシグマ（米国ミズーリー州セントルイス）から得た。アクリルアミ ドおよびＮ、Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミドはメルク−シュチャツト（ 西独ミュンヘン）から得た。Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’−テトラメチルエチレンジア ミン、過硫酸アンモニウム及び０．２５−１のシリカゲルＦ　２　’ｉ−４で予 めコートされたシートはメルク（西独ダームシュタット）から得た。培地はディ フコ（米国デトロイト）の製品であった。酸素電極はランク・ブラザーズ・ボテ ィシャム（英国ケンブリッジ）かＬＫＢ１８０４−１０１システムを用いて分析 等重点電気泳動を行なった。担体両性電解質のｐＨ範囲は３．５ないし９．５で あった０等電点電気泳動は、ポリアクリルアミドゲル上での分析等重点電気泳動 のための両性電解質ＰＡＧプレートに関するＬＫＢ　（スウェーデン国、ブロマ 、エル・ケイ・ビー・プロダクター・エイ・ビー、　１９７９）からのリーフレ ットに記載された方法に従って行なった。

鉄はルンド大学分析化学部て原子吸収分光測光により測定した。

培養条件 実験に用いた微生物は、プロプリウスら（プロプリウス・ビー、エルシン・ケイ 及びモスバック・ケイ（１９８１）、Ａｐｐｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｔｅｃ ｈｎｏｌ、６．　２９３−３０８）によって用いられたのと同じ酵母トリボノブ シス・パリアビリスてあった。細胞のより大きなバッチは発酵器中の８リツトル 培養物中からｆ町ｔた。培地は酵母抽出物（１＄）。

０．２＄　ＤＬ−メチオニンが補充された麦芽抽出Ｔｈ（１，５り、　ｐＨ６， ５から成っていた。培養は２８°Ｃて４４時間行なった。ストック培養物は、２ ％寒天を含む同じ培地から成る到面培珀上に維持された。細胞は４０００ｇて３ ｏ分間遠心することによって集め、洗い、使用まで凍結状７ｇて保存した。異な る発酵からの細胞の平均収率は４５ないし５０ｇ細胞ペーストであった。

ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）及びノカーディア（Ｎｏｃａ ｒｄｉａ）はボーラント国つロクローの免疫学研究所微生物部から得た。細菌及 び菌類はＡＴＣＣから得た。

電気泳動 分析のために、ヘトリックとスミスの方法（ヘトリック・ジェイ・エル及びスミ ス・エイ・ジェイ（１９６８）＾ｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｃｓ、　［１ｉｏｐｈｙ ｓ、　１２６．１５５−１６４）並びにラエムリノ方法（ラエムリ、　Ｕ、に、 　（１９７０）、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７．６８０−６８５）に従って、ＳＤＳ 含有ゲルについてディスクポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なった。電気泳 動は８ないしｌＯｏＣて行なった。最初、染ネ１が分離ゲル中に移動するまての 間はチューブ当たり２■への低電流を流し。

その後はチューブ島たり４■Ａの一定電流を流した。

チューブの直径及び長さはそれぞれ０．８ｃｍ及び９．５６■であった。タンパ ク質の位置をつきとめるために、ゲルはコーマジ−ブリリアントブルーＲで染色 した。

ゲル上の酵素活性の位置はへドリウクとスミス（上記参照）の方法に従ってつき とめ、ゲルは０−デアニシジンを用い、形成された過醜化水素の検出によって染 色した。ゲルは、５　ｍＭのセファロスポリンＣ（又は他のアミノ酸）、ペルオ キシダーゼ（０，０２５り及び。−ジアニシジン（０−０２５２）を含む０．１ ｚリン酸ナトリウム緩衝液中でインキュベートした。インキュベーションは赤茶 色の染料が生成するまで３０ないし６０分間行なった。

酵素単離のために１本発明者らによって特殊な装置が設計された。ガラス管の直 径は２ｃｍ、長さは４ｃｍであった。ゲル（８％ポリアクリルアミド）は、　０ ．１９Ｍ　）リス−グリシン緩衝液ｐ　Ｉ＋　８　、３を用いて、ヘトリックと スミスの方法（上記参照）に従って行なった。上部ゲルは過硫酸アンモニウム、 及びリボフラビンに代わるＴＥＭＥＤの存在下で重合した（触媒の量はラエムリ （上記参照）の方法に従った）、電気泳動は最初の３０分間は２０ｍＡで、それ 以降は１１０　ｍＡで１０℃て３〜４時間行なった。

分子量測Σ タンパク質の分子量はへトリックとスミス（上記参照）によって記ａされたよう にして測定し、ＳＤＳゲル電気泳動はラエムリ（上記参照）の方法に従って行な った。前者の方法のために、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動用の分子量 マーカー（シグマ）を用い、後者の方法のためにＳＤＳ分子量マーカーを用いた 。タンパク賀測定はローリ−ら（ローリ−・オー・エイチ、ローズブロー・エヌ ・ジェイ、フェラ・エイ・エル及びランドール・アール・ジェイ（１９５１）、 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　１９３．２６５−２７５）らの方法に従って行なった 。

Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性に関する分析ランク酸素電極で酸素消費の速度を 測定することにより、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを５ないし１０分間５０℃で行 なった。この間、酵素の変性は起きなかった。分析混合物は、２１の終体積中に １．８ｍｌ　（２０ｍＭ）のどロリン酎ナトリウム、　ｐＨ８，０及び０．１ｍ ｌ　（１００■Ｍ）セファロスポリンＣ並びに酸素消費の正しい初速度な午える ための通出な量のセファロスポリンＣを含んでいた。１単位（Ｕ）は、用いた条 件下に３いて１分間当りＩＪＬモルの酸素の取り込みに対応する。ときどき、２ ．４−ジニトロフェニルヒドラジン又はＯ−ジアニシジンペルオキシダーゼ（ｈ 記参照）を用いて、３０℃で比色定量て生成したケト酩の量を測定することによ り、活性をチェックした。

実施例 トリボノブシス・ハリアビリスからのＤ−アミノ酸オキシダーゼの精製 全ての操作は５℃で行なった。

３２ｇの凍結細胞ペースト（−２０°Ｃ）を１．５倍体積の２０＋Ｍのどロリン 酸ｗｔ衝液、ｐＨ１ｌｌｌに懸濁して解凍した。

細胞懸濁液を等量の粉末トライアイスと混合し、ミキサー中で崩壊した。Ｄ−ア ミノ酸オキシダーゼは他の可溶性タンパク質と共に放出された。崩壊した細胞を １２，０００ｇで３０分間遠心した。破壊細胞を新鮮な緩衝液で数回洗い遠心し た０回収した上清な２１の酢酸でｐＨ５，３になるように酸処理し、生成した沈 殿を１２，０００ｇて３０分間遠心することによって除去した。

工程ｌで得られた酸性上清（７３０■Ｉ）に２５１閘のＤＬ−メチオニンを加え て酵素を保護した。上清は、水浴中で５０°Ｃに加熱し、この温度て１０分間維 持した。生成した沈殿を１２，０００ｇで３０分間遠心して沈殿させ、捨てた。

上清を２０■閘のピロリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８，３に対して一夜透析した 。

透析袋（試料を含む）に暖かい空気を吹き付けることによって１ｍｌ当たりのタ ンパク質の量を増加させて（Ｉり工程２て得られた試料を濃縮した。試料のｐＨ を２Ｍ酢酸で６．３に下げ、その後、固体硫酸アンモニウムと共に１〜２時間混 合した。３０％硫酸アンモニウムで塩析した分画か沈殿を生成し、これを１２， ０００ｇで３０分間遠心した。沈殿を捨て、上清を（ｐＨ６，０に調整した後） 固体の硫酸アンモニウム（ＳＳ＄）と混合した。２蒔間後に生成した沈殿を１２ ，０００ｇで３０分間遠心し、　２０■Ｍビロリン酸ナトリウム、Ｐ　Ｉ＋　８ 　、３に対して透析した。

工程３で（町シられた試料（１０，’１ｍ１）を２５−Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液 、ｐｌ＋５．１に対して１２時間透析した。生成した沈殿を１２，０００ｇで３ ０分間遠心することによって除去した。沈殿は微量の酵素活性を有していた。上 清な。

０．１ＭＳｉ酸ナトツナトリウム緩衝液１４．５に対して１２時間透析すること により再沈殿させた。生成した沈殿はＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性のほとんど を有していた。沈殿を２０−Ｍのどロリン酸緩衝液ｐＨ８，３に溶解し、同じ緩 衝液に対して一夜透析した。

プレバラティブディスクゲル電気泳動 工程４で得られた試料をプレバラテイブゲル電気泳動に用いた。工程４で得られ た５ｍｇのタンパク質な電気泳動試験に用いた。セファロスポリンＣに対するア ミノ酸オキシダーゼ活性を示すバンドを切り出し、ボッターホモジナイザー（ｌ 口ＯＯｒｐｍ）を用いて２０−Ｍピロリン酸緩衝液ｐｌ＋８．３中で５分間ホモ ジナイズし、得られた懸濁液を１０００ｇで２０分間遠心した。ゲルを等積の緩 衝液て３回洗い１回収した上清を上記と同様に暖かい空気で終体積３１になるよ うに濃縮し、次の試験に用いた。

結果及び議論 第１表 トリボノブシス・パリアビリスからのＤ−アミノ酸オキシダーゼの精製。活性は セファロスポリンＣに対して測定した。タンパク質含量はローリ−ら（上記参照 ）によつこの発明はＤ−アミノ酸オキシダーゼを単一成分になるまて精製する簡 便な方法を提供する０等電沈殿後のプレバラティブゲル電気泳動によりてゲル電 気泳動におし１て観察された追加的な２つの弱いバンドが除去された。

非活性は５．８Ｕ／＠ｇ（第１表）から３．８Ｕ／■ｇに減少した。これは、抽 出中に起きた部分的変性又は未だに同定されていないコファクターの損失に起因 すると推定される。

ドデシル硫酸ナトリウム中てのポリアクリルアミドゲル電気泳動により１分子量 約４：ｌ、０００　（第２図）の単一のバンド（第１図）が得られた。ヘドリ・ ンクとスミスの方？に（ヘトリック・ジエイ・エル及びスミス・エイ・ジェイ、 　（１９６８）、　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅａ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　１２６ ．１５５−１６４）ネイティブタンパク質の分子量は、約８６１口００であると 見積もられる。

従って、０−アミノ酸オキシダーゼは、その活性形態において、２つのサブユニ ・ントを有する分子量約８６，０００のダイマーとして存在する。

プレパラテイブゲル電気泳動後の試料では、Ｄ−ロイシン又はセファロスポリン Ｃとそれぞれインキュベートした後のゲルの酵素染色において、１つのノくント のみカイ得られた。一方、より精製されてし１なし％試料（工程３）では、０− ロイシンと共にインキュベートした場合に３つの大きなバンドが得られ、セファ ロスポリンＣとインキュベートした場合には１つの７ベントのみ力＜　１”Ｊら れた（第３図）。このことは、トリボノブシス中に数種のＤ−アミノ酩オキシダ ーゼ又はイソ酵素か存在する力ｔ、それらのうちの１つのみかセファロスポリン Ｃに対して１占性を示すことを示している。トリボノブシス・ノ＜１ノアヒ゛リ スからのｐ−アミノ酸オキシダーゼの精製に関し、文献１１１に１つの報告があ る（バーブ・シー・ピーとロデン・エフ・エイ（１９７６）　Ａｎａｌ、　Ｂｉ ｏｃｈｅｗ、　７１．２１４−２２２）。し力）しながら、著者等はこのタンパ ク質に関し０−ロイシンにｔＪする活性のみを試験した。彼らは酵素製剤の単一 性をチェックしなかった。その操作では不純な混合物が得られ、そのタンパク質 のいくつかはアミノ酸オキシダーゼのようであった・ セファロスポリンＣに対する活性を有する単離されたＤ−アミノ酸オキシダーゼ は次の性質を有していた。酵素の等電点は約４．６であった。原子吸収分析によ り、酵素は２モルの鉄を有しており、これは１モルのサブユニット当り１モルに 相当することが強く示された。ｌＯｓＭＥＤＴＡ又はｌ−開の０−フェナントロ リンに対する透析後にも、その活性は変わらなかった。濃度０−５ｍＭのヒ素又 はシアン化物て処理すると、活性はそれぞれ４６％及び３４％に低下した。セフ ァロスポリンＣ、フェニルアラニン、アラニン、メチオニン及びロイシンに対す るに、値はそれぞれ、１３．１０．７６．０．７６及び０．１２てあった。プレ バラティブゲル電気泳動後の試料は、　５＋＋ｇ／ｍｌの濃度において、フラビ ン依存性酵素に類似したスペクトルを示さなかった。これは予想通っである。な ぜなら、ブタの腎臓から得られる。セファロスポリンＣに対して活性なアミノ酸 オキシダーゼはＦＡＤ依存性であるからである（マゼオ、ピー及びロメオ・エイ （１９７２）　Ｊ、Ｃ，Ｓ、　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｉ（Ｐ３）２５３２）。ＦＭＮや ＦＡＤのような種々のフラビンコファクターを加えても減少した非活性は増加し なかった。酵素からのフラビンの単離は成功しなかった。すなわち、耐溶液中で のにＢ「に対する長時間にわたる透析（メイヒュー・ニス・ジー（１９７１）、 Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａｉ、　２８９−：１０２）及び 回じ〈アルカリｐ１１における透析（マ　を培地・ブイ・及びカーティ・ビー、 　（１９６６）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　た。

ｒ、　２４１．３４１７−３４２９）はいずれも失敗した。トリブシ解、煮滲又 は８５％フェノール溶液による抽出のいによってもフラビンは全く得られなかっ た。これ４Ａ者がフラビンな全く検出することができなかつアズバラギルス・ニ ガーから得られたＤ−アミノ酸オダーゼについての文献（キショアー・ジー及び パイナサン・シー・ニス　（１９７６）夏ｎｄｉａｎ　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

）ｐｔ＋ｙｓ、　１３．２１６−２２２）に報告された結果トロ様テア純粋な酵 素は、２０ｍＭピロリン酸緩衝液、ｐｌ＋８．３中鮎状態で安定であった。解凍 及び凍結によって活性環されなかった。８℃において、活性は非常にゆっと落ち 、室温ての安定性は比較的低かった。熱的安を改善するために、酵素をいくつか の方法で固定化。１つの例ては、工程３で得られた酵素を１７．５Ｕ／ｍ１度で 、１ｍｌの０．１Ｍホウ酸緩衝液、　ｐＨ８，３中「セファス４ＢＪに加え、３ ０°Ｃで３０分間処理したとこ７Ｕ／１の一貫した活性を有する「セファロース 」かれた。

バーブとロデンによって使用された培ｊｉ！（バーブ・−・ピーとロデン・エフ ・エイ（１９７６）、＾ｎａｌ。

：ｈｅｍ、　７１．２１４−２２２）、培養時間はこの発明において約５に短縮 することができた。　０．ＨのＯＬ−メチオニン１８ノ（日Ｕ６２−５０１６７ ７　（７）Ｌに加えることによって、酵素活性が５倍に増えＦｉｇ、１ オ巨刻−〇勤Ａ 国　ａｉｍｓ　鰯　失 １　＝。

エーデン国　ニス−２２００フルンド、ボックス　７４０　ケミセン

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．セファロスポリンＣに対する活性を有し、実質的に純粋な形態にあるトリゴ ノプシス・バリアビリスＤ−アミノ酸オキシダーゼ。
2. ２．トリゴノプシス・バリアビリスから単離されたことを特徴とする請求の範囲 第１項記載のＤ−アミノ酸オキシダーゼ。
3. ３．前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの等電点は約４．６であり、活性な形態では ２っのサブユニットを有し、分子量約８６，０００のダイマーとして存在するこ とを性徴とする請求の範囲第１項記載のＤ−アミノ酸オキシダーゼ。
4. ４．固定化された形態にある請求の範囲第１項記載のＤ−アミノ酸オキシダーゼ 。
5. ５．Ｄ−アミノ酸オキシダーゼはシアノーゲンプロミド活性化セファロースに結 合されている請求の範囲第４項記載のＤ−アミノ酸オキシダーゼ。
6. ６．（ａ）トリゴノプシス・バリアビリスの粗細胞抽出物を酸処理し、加熱して 沈殿及び上清分画を得る工程と、 （ｂ）工程（ａ）で得られた上清分画を十分量の硫酸アンモニウムで処理し、請 求の範囲第１項記載のＤーアミノ酸オキシダーゼを含む第２の沈殿を得る工程と 、（ｃ）工程（ｂ）で得られた沈殿を再懸濁し、等電沈殿によってＤ−アミノ酸 オキシダーゼを回収する工程とを含む、請求の範囲第１項記載のＤ−アミノ酸オ キシダーゼの単離方法。
7. ７．粗細胞抽出物は、酢酸を加えることによって酸処理される請求の範囲第６項 記載の方法。
8. ８．粗細胞抽出物は、ｐＨが約４ないし６になるように酸処理される請求の範囲 第４項記載の方法。
9. ９．ｐＨが約５．１ないし５．３である請求の範囲第８項記載の方法。
10. １０．ｐＨは約５．３である請求の範囲第９項記載の方法。
11. １１．酸処理した後、加熱前にあらゆる沈殿を除去する工程をさらに含む請求の 範囲第６項記載の方法。
12. １２．加熱の前にＤ．Ｌーメチオニンを粗細胞抽出物に加える工程をさらに含む 請求の範囲第６項記載の方法。
13. １３．Ｄ．Ｌ−メチオニンは、終濃度が約２５ｍＭになるように十分量加えられ る請求の範囲第１２項記載の方法。
14. １４．前記粗抽出物は約４０ないし約６０℃の温度に加熱される請求の範囲第６ 項記載の方法。
15. １５．前記温度は約４０ないし約５０℃である請求の範囲第１４項記載の方法。
16. １６．前記温度は約５０℃である請求の範囲第１５項記載の方法。
17. １７．工程（ａ）で得られる上清分画を、硫酸アンモニウムで処理する前に透析 する工程をさらに含む請求の範囲第６項記載の方法。
18. １８．前記透析は２０ｍＭのピロリン酸ナトリウムを含む緩衝液、ＰＨ８．３に 対して行なわれる請求の範囲第１７項記載の方法。
19. １９．透析後、硫酸アンモニウムで処理する前に前記上清分画を濃縮する工程を さらに含む請求の範囲第１７項記載の方法。
20. ２０．前記濃縮は蒸発によって行なわれる請求の範囲第１９項記載の方法。
21. ２１．硫酸アンモニウムによる前記処理は、（ａ）前記上清分画に、硫酸アンモ ニウム濃度が約３０重量％になるように硫酸アンモニウムを加え、化成した沈殿 を除去する工程と、 （ｂ）工程（ａ）の上清に、硫酸アンモニウム濃度が約５５％になるように硫酸 アンモニウムをさらに加え、化成した沈殿を回収する工程とを含む請求の範囲第 ６項記載の方法。
22. ２２．等電沈殿による回収の前に、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを合有する第２の 沈殿を透析する工程をさらに含む請求の範囲第６項記載の方法。
23. ２３．前記透析は、２０ｍＭのピロリン酸ナトリウムを含む緩衝液、ｐＨ８．３ に対して行なわれる請求の範囲第２２項記載の方法。
24. ２４．等電沈殿は、 （ａ）前記第２の沈殿を、２５ｍＭの酢酸ナトリウムを含む緩衝液に対して透析 し、該透析工程後に残留するあらゆる沈殿を除去する工程と、 （ｂ）前記透析工程において得られた透析溶液を、１００ｍＭの酢酸ナトリウム を含む緩衝液、ｐＨ４．６に対して行なう工程とを含む請求の範囲第６項記載の 方法。
25. ２５．等電沈殿により得られたＤ−アミノ酸オキシダーゼをゲル電気泳動によっ て精製する工程をさらに含む請求の範囲第６項記載の方法。
26. ２６．培地に約０．２％のＤ．Ｌ−メチオニンを添加することを含む、高い細胞 内濃度の請求の範囲第１項記載のＤ−アミノ酸オキシダーゼを得る、トリゴノプ シス・バリアビリスの培養方法。
27. ２７．（ａ）トリゴノプシス・バリアビリスの細胞を崩壊して粗抽出物を形成し 、これを酸処理し、（ｂ）酸処理した粗抽出物を５０℃に加熱し、生成した沈殿 を除去し、上清を透析し、 （ｃ）（ｂ）の生成物を硫酸アンモニウムで処理し、透析し、 （ｄ）等電沈殿によりＤ−アミノ酸オキシダーゼを単離することを特徴とする請 求の範囲第１項記載のＤ−アミノ酸オキシダーゼの単離方法。
28. ２８．（ａ）トリゴノプシス・バリアビリスの粗細胞抽出物に酢酸をｐＨが約５ ．３になるまで加えることによって粗細胞拙出物を酸処理して沈殿及び上清分画 を生成させる工程と、 （ｂ）上記上清にＤ．Ｌ−メチオニンを終濃度が２５ｍＭになるまで加える工程 と、 （ｃ）上記上清を５０℃に加熱し、この温度で１０分間維持して第２の沈殿及び 上清分画を生成させる工程と、 （ｄ）工程（ｃ）で得られた上記上清を２０ｍＭのビロリン酸緩衝液、ｐＨ８． ３に対して透析する工程と、（ｅ）工程（ｄ）で得られた溶液に硫酸アンモニウ ムナトリウムを終濃度３０％になるように加え、得られた沈殿を除去する工程と 、 （ｆ）工程（ｅ）で得られた溶液に固体の硫酸アンモニウムを終濃度５５％にな るように加え、得られた沈殿を回収する工程と、 （ｇ）工程（ｆ）で得られた沈殿を先ず２０ｍＭビロリン酸ナトリウム、ｐＨ８ ．３に対して透析し、次に２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．１に対して 透析し、透析後に残留する溶解されないあらゆる沈殿を除去する工程と、（ｈ） 工程（ｇ）で得られた溶液を１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．６に対し て透析し、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ合有沈殿を回収する工程とを含む、トリゴ ノプシス・バリアビリスから請求の範囲第１項記載のＤ−アミノ酸オキシダーゼ を単離する方法。