JPS6259124B2 - - Google Patents
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- JPS6259124B2 JPS6259124B2 JP54500459A JP50045979A JPS6259124B2 JP S6259124 B2 JPS6259124 B2 JP S6259124B2 JP 54500459 A JP54500459 A JP 54500459A JP 50045979 A JP50045979 A JP 50045979A JP S6259124 B2 JPS6259124 B2 JP S6259124B2
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Description
本発明の背景及び要約
本発明は固相触媒および生物特異性吸破剤を製
造するために強力な共有化学結合により蛋白質お
よび多種の非蛋白質親和性配位子を固相担体にカ
ツプリングさせるための活性化担体を製造する方
法に関するものである。 生物特異性吸着剤は生体高分子の単離のための
極めて重要な道具となつてきたが、固定化酵素
(immobilizedenzymes)が耐久性の固相触媒と
して広く用いられている。このような物質は酵素
または抑制剤または他の生物特異性化合物を固相
担体に化学的に結合させることによつて製造され
る。カツプリングのための種々の方法および試薬
が記載されているが、おのおのが特別な欠点を有
し、これらの欠点には(a)弱い化学的結合と、(b)イ
オン結合と、(c)反応を起こさせるために高い温度
およびPHのような強い条件が必要なことと、(d)副
反応と、(e)カツプリング剤が反応することができ
る化学基の範囲が限定されることなどがある。 従来のカツプリング用試薬には、カツプラーと
して最も広く用いられ、ジヤコビー(Jacoby)
氏等がMeihods Enzymol.34,1974に記載してい
る試薬臭化シアンがある。この試薬は強アルカリ
性溶液中でアガロースおよびセルロースのような
担体と反応するが、多数の副反応が起こる。臭化
シアン活性化担体は次にアルキルアミン以外の求
核剤との反応性が乏しく、カツプリングすること
ができる酵素、配位子および他の化合物の種類に
厳しい制限がある。カツプリング結合、恐らくイ
ソ尿素結合は中程度の安定性しかなく、実際的条
件下でかなりの量の結合物質が“ブリード
(bleed)”する可能性がある。この不安定性のた
めに吸着剤または固相触媒の有効寿命が制限さ
れ、生成物に好ましくない汚染物質または潜在的
に有毒な汚染物質が加わる可能性がある。しか
も、これらのイソ尿素結合は中性PHで正に荷電し
ており、非特異的吸着を生じる可能性がある。 これに反して、染料工業では“反応性”染料の
導入以来、温和な条件下で種々の担体と種々の配
位子の求核性基との間の強力な共有結合を与える
ことができる型の試薬が用いられている。これら
のカツプリング用試薬の中で最も多用性で且つ広
く用いられているものはトリクロロ―s―トリア
ジン(TsT)である。この試薬は3個の反応性
塩素を含み、第一の塩素を置換すると置換ジクロ
ロ―s―トリアジン(DsT)が得られ、第二の塩
素を置換すると二置換モノクロロ―s―トリアジ
ン(MsT)が得られる。種々の求核剤による調
節された置換の条件が比較的少量の研究で可能と
なつている。 臭化シアンと同様、TsTは加水分解的副反応
が優先する強アルカリ性水性媒質中で担体と反応
させられていた。ネーチヤー(Nature)217,
641(1968)にケイ(kay)氏等が記載している
方法では、担体と反応し且つ加水分解するTsT
の量は温度とPHと試薬濃度との競合関数であり、
担体の活性化の程度は正確に推定することができ
ない。その上、活性化された担体も加水分解を受
けやすい。最近、ケイおよびリリー氏(Kay and
Lilly)はBiochim.Biophys.Acta,198:276
(1970)に記載の通り、より反応性の低いカツプ
ラー2―アミノ―4,6―ジクロロ―s―トリア
ジンを導入したが、しかし、この試薬はアルカリ
性水性媒質中で活性化反応中にTsTと同じ欠点
をもちやすく、しかも配位子のカツプリングのた
めに激しい条件が所要である。かゝる先行技術に
おける主な問題は(1)他のものが臭化シアンを用い
たようにカツプラーが実験的に用いられているこ
と、(2)トリアジンカツプリングは担体と蛋白質と
の間の強力な結合を与えるが、従来は競合的加水
分解副反応および吸着性イオン部位の導入に注意
が払われていないこと、(3)結合される配位子の量
を正確に調節または推定することができないこ
と、および(4)有機相中で小配位子を結合させる方
法が満足できないことである。 TsTの加水分解の問題を克服し且つTsTの
個々の塩素の段階的反応を行わせるために、本発
明において非水媒質中での反応方法を開発した。
臨界的条件が適当な極性有機溶媒と発生するHcl
を中和するための適当な有機塩基とを含むことを
発見した。J.Chromatogr.60,167(1971)にポ
ラス(Porath)氏等により記載された通り、セル
ロースまたは架橋アガロースのようなポリオール
担体の場合、TsTとの反応が有機相中で円滑に
且つ予想可能的に起こつて(DsT)―ジクロロ―
s―トリアジン置換担体を与えることがわかつ
た。こゝに得た活性化担体は、用いる求核剤およ
び反応条件によつて、有機相中で残りの塩素の一
方または両方を反応させることができる。 本発明によつて、アニリンのような弱求核剤は
室温において有機溶媒中でDsT―担体の塩素の1
個と反応してその後の反応のための部位1個を残
すことも見いだされた。要するに、初期“活性
化”反応を副反応なしにDsT―担体を与えるよう
に十分に調節することができ且つ次の弱求核剤と
の反応を副反応なしに行わせてMsT―担体を与
えることができる。また、MsT―担体の1個の
残留塩素はDsT―担体またはTsTより反応性が
低く且つ普通の温度およびPHで加水分解を受けに
くい。従つて、MsT―担体は有機溶液中または
水溶液中で、温和なPHおよび温度の条件下で反応
させて所要の生成物を得ることができる。 アブコウスキー(Abuchowski)氏等はJ.Biol.
Chem.252,3578(1977)で、TsTを架橋剤とし
て用いるポリエチレングリコール(PEG)の蛋
白質との共有結合を報告している。有機相中にお
ける脂肪族アルコールとTsTとのカツプリング
はアブコウスキーらの方法と本発明の方法の両方
の初期反応であり、この初期カツプリングは完全
な類似の範囲である。 アブコウスキー氏等の初
期カツプリング反応では、PEGとTsTの両方の
溶媒としてベンゼンを用いており、発生するHcl
の中和にはNa2CO3を用いている。この方法は
TsTとPEGとの溶液相中でのカツプリングのみ
には十分であるが、親和性調製物(affinity
preparations)に用いられる、セフアロース,セ
ルロースまたはポリビニルアルコールのような固
相担体のいずれかとTsTとのカツプリングには
不十分である。ベンゼンはセフアロースおよび他
の親水性重合体を含む反応には不良媒質であるこ
とがわかつている。これは多分ベンゼンの無極性
によるものである。最初水相中にあるセフアロー
スまたは他の重合体の場合の主な問題はベンゼン
への移行である。ベンゼンがセフアロース構造に
悪影響を与えるように思われる観察もなされてい
る。更に、「複素環式化合物の化学(The
Chemistry of Hetercyclic Compounds),イー
エム スモリン(E.M.Smolin)およびオー ラ
ポポート(O.Rapoport)編集」,ニユーヨーク州
のインターサイエンス.パブリツシヤー インコ
ーポレーテツド社発行,1959年度、第13巻中のs
―トリアジンおよび誘導体(s―Triazines and
Derivatives)に記載されているように、ベンゼ
ンはTsTの特に良好な溶媒ではない。 発生するHclの中和は、塩基がNa2CO3のよう
にベンゼンに不溶である場合には不十分である。
Hclの中和が不十分の場合には、これらの条件下
で起ることが知られている副反応、即ちアルコー
ルの対応する塩化アルキルへの転化を起こす可能
性がある。また、セフアロースマトリツクス中へ
の塩素の混入も好ましくない性質を与えるようで
ある。 本発明では、ジオキサンまたは他の有機溶媒中
で初期活性化反応を行うことにより、且つ発生す
るHclを、有機相中でTsTと不溶性錯体を形成し
ないN,N―ジイソプロピルエチルアミンまたは
他の第三アミンのような可溶性有機塩基で中和す
ることにより、アブコウスキー氏等の方法に固有
な問題の多くを解決することができた。試みた数
種の反応媒質の中で、セフアロースおよび他の親
水性重合体と相溶性であり且つTsTに対する優
れた溶媒でもあるという両方の点でジオキサンが
最も良いことがわかつた。可溶性有機塩基の使用
も新規であり、且つ多くのものがTsTと不溶性
錯体を形成するので、正しい塩基の選択は臨界的
である。 初期活性化工程後、2つの方法は明らかに異な
る。アブコウスキー氏等は水相中におけるアルカ
リ性条件下でのジクロロ―s―トリアジン―
PEGの実験的カツプリングで満足している。こ
の参考文献には、トリアジンの第二の塩素の加水
分解が起こり易いのでかなり過剰量の活性化
PEGを使用せねばならないことも記載されてい
る。このことは水相中または水―有機混合相中の
トリアジン反応に共通の特徴であり、このために
反応の正確な制御および予想ができない。 未反応のおよび加水分解したPEG―ジクロロ
―s―トリアジンは勿論可溶性であり、PEGカ
ツプリング蛋白質から分離することが可能であ
る。しかし、より広い目的、すなわち加水分解の
ような副反応が所望の生成物に影響を与えるとこ
ろのセルロース―ジクロロ―s―トリアジンのよ
うな不溶性固相化合物と配位子とのカツプリング
を欲する場合には、このことは真実ではない。本
発明の方法では、トリアジンの第二番目の塩素を
アニリンのような弱求核剤で置換することによつ
て制御を確立する。この結果、固定しようとする
蛋白質または他の物質の求核性基との反応に有効
な塩素1個が残る。この1個の塩素は穏和な条件
の下で脂肪族アミンで定量的に置換することが可
能であり、しかも室温においてPH9以下では容易
に加水分解しない。 本発明の方法で種々の担体(ポリオール)を
TsTと反応させることができるが、かゝる担体
はすべて初期反応を行う前に水分を除去せねばな
らない。適当な場合、真空中で加熱することによ
つて乾燥を行うことができ、あるいは1,4―ジ
オキサン,アセトニトリルおよび同様な溶媒のよ
うな乾燥した混和性有機溶媒で洗浄することによ
つて水を担体から分散させることができる。ま
た、反応温度、試薬濃度および反応時間を含む反
応条件のパラメーターを変化させて、担体と反応
するTsT量を変化させることができる。 有機相中でのTsTと担体との反応には適当な
有機塩基の存在が必要である。類似の塩化アシル
型反応に一般に用いられる、トリエチルアミン,
ピリジン,N―エチルモルホリンおよびルチジン
のような塩基は有機溶媒中でTsTと不溶性錯体
を形成することがわかつた。しかし、N,N―ジ
メチルアニリンおよびN,N―ジイソプロピルエ
チルアミンのような第三アミンはかゝる錯体を形
成せず、満足に働くことを発見した。
造するために強力な共有化学結合により蛋白質お
よび多種の非蛋白質親和性配位子を固相担体にカ
ツプリングさせるための活性化担体を製造する方
法に関するものである。 生物特異性吸着剤は生体高分子の単離のための
極めて重要な道具となつてきたが、固定化酵素
(immobilizedenzymes)が耐久性の固相触媒と
して広く用いられている。このような物質は酵素
または抑制剤または他の生物特異性化合物を固相
担体に化学的に結合させることによつて製造され
る。カツプリングのための種々の方法および試薬
が記載されているが、おのおのが特別な欠点を有
し、これらの欠点には(a)弱い化学的結合と、(b)イ
オン結合と、(c)反応を起こさせるために高い温度
およびPHのような強い条件が必要なことと、(d)副
反応と、(e)カツプリング剤が反応することができ
る化学基の範囲が限定されることなどがある。 従来のカツプリング用試薬には、カツプラーと
して最も広く用いられ、ジヤコビー(Jacoby)
氏等がMeihods Enzymol.34,1974に記載してい
る試薬臭化シアンがある。この試薬は強アルカリ
性溶液中でアガロースおよびセルロースのような
担体と反応するが、多数の副反応が起こる。臭化
シアン活性化担体は次にアルキルアミン以外の求
核剤との反応性が乏しく、カツプリングすること
ができる酵素、配位子および他の化合物の種類に
厳しい制限がある。カツプリング結合、恐らくイ
ソ尿素結合は中程度の安定性しかなく、実際的条
件下でかなりの量の結合物質が“ブリード
(bleed)”する可能性がある。この不安定性のた
めに吸着剤または固相触媒の有効寿命が制限さ
れ、生成物に好ましくない汚染物質または潜在的
に有毒な汚染物質が加わる可能性がある。しか
も、これらのイソ尿素結合は中性PHで正に荷電し
ており、非特異的吸着を生じる可能性がある。 これに反して、染料工業では“反応性”染料の
導入以来、温和な条件下で種々の担体と種々の配
位子の求核性基との間の強力な共有結合を与える
ことができる型の試薬が用いられている。これら
のカツプリング用試薬の中で最も多用性で且つ広
く用いられているものはトリクロロ―s―トリア
ジン(TsT)である。この試薬は3個の反応性
塩素を含み、第一の塩素を置換すると置換ジクロ
ロ―s―トリアジン(DsT)が得られ、第二の塩
素を置換すると二置換モノクロロ―s―トリアジ
ン(MsT)が得られる。種々の求核剤による調
節された置換の条件が比較的少量の研究で可能と
なつている。 臭化シアンと同様、TsTは加水分解的副反応
が優先する強アルカリ性水性媒質中で担体と反応
させられていた。ネーチヤー(Nature)217,
641(1968)にケイ(kay)氏等が記載している
方法では、担体と反応し且つ加水分解するTsT
の量は温度とPHと試薬濃度との競合関数であり、
担体の活性化の程度は正確に推定することができ
ない。その上、活性化された担体も加水分解を受
けやすい。最近、ケイおよびリリー氏(Kay and
Lilly)はBiochim.Biophys.Acta,198:276
(1970)に記載の通り、より反応性の低いカツプ
ラー2―アミノ―4,6―ジクロロ―s―トリア
ジンを導入したが、しかし、この試薬はアルカリ
性水性媒質中で活性化反応中にTsTと同じ欠点
をもちやすく、しかも配位子のカツプリングのた
めに激しい条件が所要である。かゝる先行技術に
おける主な問題は(1)他のものが臭化シアンを用い
たようにカツプラーが実験的に用いられているこ
と、(2)トリアジンカツプリングは担体と蛋白質と
の間の強力な結合を与えるが、従来は競合的加水
分解副反応および吸着性イオン部位の導入に注意
が払われていないこと、(3)結合される配位子の量
を正確に調節または推定することができないこ
と、および(4)有機相中で小配位子を結合させる方
法が満足できないことである。 TsTの加水分解の問題を克服し且つTsTの
個々の塩素の段階的反応を行わせるために、本発
明において非水媒質中での反応方法を開発した。
臨界的条件が適当な極性有機溶媒と発生するHcl
を中和するための適当な有機塩基とを含むことを
発見した。J.Chromatogr.60,167(1971)にポ
ラス(Porath)氏等により記載された通り、セル
ロースまたは架橋アガロースのようなポリオール
担体の場合、TsTとの反応が有機相中で円滑に
且つ予想可能的に起こつて(DsT)―ジクロロ―
s―トリアジン置換担体を与えることがわかつ
た。こゝに得た活性化担体は、用いる求核剤およ
び反応条件によつて、有機相中で残りの塩素の一
方または両方を反応させることができる。 本発明によつて、アニリンのような弱求核剤は
室温において有機溶媒中でDsT―担体の塩素の1
個と反応してその後の反応のための部位1個を残
すことも見いだされた。要するに、初期“活性
化”反応を副反応なしにDsT―担体を与えるよう
に十分に調節することができ且つ次の弱求核剤と
の反応を副反応なしに行わせてMsT―担体を与
えることができる。また、MsT―担体の1個の
残留塩素はDsT―担体またはTsTより反応性が
低く且つ普通の温度およびPHで加水分解を受けに
くい。従つて、MsT―担体は有機溶液中または
水溶液中で、温和なPHおよび温度の条件下で反応
させて所要の生成物を得ることができる。 アブコウスキー(Abuchowski)氏等はJ.Biol.
Chem.252,3578(1977)で、TsTを架橋剤とし
て用いるポリエチレングリコール(PEG)の蛋
白質との共有結合を報告している。有機相中にお
ける脂肪族アルコールとTsTとのカツプリング
はアブコウスキーらの方法と本発明の方法の両方
の初期反応であり、この初期カツプリングは完全
な類似の範囲である。 アブコウスキー氏等の初
期カツプリング反応では、PEGとTsTの両方の
溶媒としてベンゼンを用いており、発生するHcl
の中和にはNa2CO3を用いている。この方法は
TsTとPEGとの溶液相中でのカツプリングのみ
には十分であるが、親和性調製物(affinity
preparations)に用いられる、セフアロース,セ
ルロースまたはポリビニルアルコールのような固
相担体のいずれかとTsTとのカツプリングには
不十分である。ベンゼンはセフアロースおよび他
の親水性重合体を含む反応には不良媒質であるこ
とがわかつている。これは多分ベンゼンの無極性
によるものである。最初水相中にあるセフアロー
スまたは他の重合体の場合の主な問題はベンゼン
への移行である。ベンゼンがセフアロース構造に
悪影響を与えるように思われる観察もなされてい
る。更に、「複素環式化合物の化学(The
Chemistry of Hetercyclic Compounds),イー
エム スモリン(E.M.Smolin)およびオー ラ
ポポート(O.Rapoport)編集」,ニユーヨーク州
のインターサイエンス.パブリツシヤー インコ
ーポレーテツド社発行,1959年度、第13巻中のs
―トリアジンおよび誘導体(s―Triazines and
Derivatives)に記載されているように、ベンゼ
ンはTsTの特に良好な溶媒ではない。 発生するHclの中和は、塩基がNa2CO3のよう
にベンゼンに不溶である場合には不十分である。
Hclの中和が不十分の場合には、これらの条件下
で起ることが知られている副反応、即ちアルコー
ルの対応する塩化アルキルへの転化を起こす可能
性がある。また、セフアロースマトリツクス中へ
の塩素の混入も好ましくない性質を与えるようで
ある。 本発明では、ジオキサンまたは他の有機溶媒中
で初期活性化反応を行うことにより、且つ発生す
るHclを、有機相中でTsTと不溶性錯体を形成し
ないN,N―ジイソプロピルエチルアミンまたは
他の第三アミンのような可溶性有機塩基で中和す
ることにより、アブコウスキー氏等の方法に固有
な問題の多くを解決することができた。試みた数
種の反応媒質の中で、セフアロースおよび他の親
水性重合体と相溶性であり且つTsTに対する優
れた溶媒でもあるという両方の点でジオキサンが
最も良いことがわかつた。可溶性有機塩基の使用
も新規であり、且つ多くのものがTsTと不溶性
錯体を形成するので、正しい塩基の選択は臨界的
である。 初期活性化工程後、2つの方法は明らかに異な
る。アブコウスキー氏等は水相中におけるアルカ
リ性条件下でのジクロロ―s―トリアジン―
PEGの実験的カツプリングで満足している。こ
の参考文献には、トリアジンの第二の塩素の加水
分解が起こり易いのでかなり過剰量の活性化
PEGを使用せねばならないことも記載されてい
る。このことは水相中または水―有機混合相中の
トリアジン反応に共通の特徴であり、このために
反応の正確な制御および予想ができない。 未反応のおよび加水分解したPEG―ジクロロ
―s―トリアジンは勿論可溶性であり、PEGカ
ツプリング蛋白質から分離することが可能であ
る。しかし、より広い目的、すなわち加水分解の
ような副反応が所望の生成物に影響を与えるとこ
ろのセルロース―ジクロロ―s―トリアジンのよ
うな不溶性固相化合物と配位子とのカツプリング
を欲する場合には、このことは真実ではない。本
発明の方法では、トリアジンの第二番目の塩素を
アニリンのような弱求核剤で置換することによつ
て制御を確立する。この結果、固定しようとする
蛋白質または他の物質の求核性基との反応に有効
な塩素1個が残る。この1個の塩素は穏和な条件
の下で脂肪族アミンで定量的に置換することが可
能であり、しかも室温においてPH9以下では容易
に加水分解しない。 本発明の方法で種々の担体(ポリオール)を
TsTと反応させることができるが、かゝる担体
はすべて初期反応を行う前に水分を除去せねばな
らない。適当な場合、真空中で加熱することによ
つて乾燥を行うことができ、あるいは1,4―ジ
オキサン,アセトニトリルおよび同様な溶媒のよ
うな乾燥した混和性有機溶媒で洗浄することによ
つて水を担体から分散させることができる。ま
た、反応温度、試薬濃度および反応時間を含む反
応条件のパラメーターを変化させて、担体と反応
するTsT量を変化させることができる。 有機相中でのTsTと担体との反応には適当な
有機塩基の存在が必要である。類似の塩化アシル
型反応に一般に用いられる、トリエチルアミン,
ピリジン,N―エチルモルホリンおよびルチジン
のような塩基は有機溶媒中でTsTと不溶性錯体
を形成することがわかつた。しかし、N,N―ジ
メチルアニリンおよびN,N―ジイソプロピルエ
チルアミンのような第三アミンはかゝる錯体を形
成せず、満足に働くことを発見した。
本発明の利点および特徴を添付図面に示した好
ましい実施態様について以下詳細に説明する。第
1図はCNBrと結合した配位子の安定性とTsTと
結合した配位子の安定性との比較を示すグラフで
あり、第2図はTsT活性化樹脂にカツプリング
した蛋白質の種々の特性を示すグラフである。 好ましい実施態様の説明 以下は架橋アガロースのような担体の水性懸濁
液で開始するトリアジン結合された生物親和性樹
脂の反応生成物の一般的製造方法を示す、この方
法は下記の通りである。 担体の水性懸濁液を、ジオキサン量が0から
100%まで増加する一連のジオキサン―水溶液で
洗浄する。この担体をガラスシール撹拌機
(glass―sealed stirrer)および水冷式冷却器の
付いた丸底フラスコに少量のジオキサンを用いて
移す。この反応フラスコを恒温油浴中に浸漬し、
内容物を低速度で撹拌する。N,N―ジイソプロ
ピルエチルアミンまたはN,N―ジメチルアニリ
ンのジオキサン溶液を加え、反応を平衡させる。
ジオキサンに溶解したトリクロロ―s―トリアジ
ンの添加によつて反応を開始させる。液相と固相
とは等容積であり、塩基の濃度はトリクロロ―s
―トリアジンの濃度の2倍である。担体樹脂中に
結合するトリアジンの量はトリクロロ―s―トリ
アジン濃度と反応時間と反応温度とに依存する。 得られた活性化DsT―担体を次に数床容量のジ
オキサンで洗う。この時点で、この活性化担体を
数種の異なる方法で反応させることができ、(1)有
機ジオキサン中でアルキルアミンのような強求核
剤と反応させてジアルキル―トリアジン―樹脂を
得ることができ、あるいは(2)ジオキサン中でアリ
ールアミンのような弱求核剤と反応させてその後
の反応に有効な塩素1個を有するモノアリール―
トリアジン―樹脂を得ることができ、あるいは(3)
モノアリール―トリアジン―樹脂をジオキサン量
が次第に減少する一連のジオキサン―水溶液で洗
い、今や水溶液中にある樹脂を蛋白質または他の
求核剤と反応させることができ、あるいは(4)凍結
乾燥またはその他の穏やかな方法でモノアリール
モノクロロ―s―トリアジン―樹脂から有機溶媒
を除去し、この乾燥した活性化樹脂を後で使用す
るために貯蔵しておくこともできる。 実施例 1 特殊な実施例として、100mlのセフアロースCL
―4Bを水:ジオキサン(30:70)の混合物の200
mlで洗い、次いで水:ジオキサン(70:30)200
mlで洗い、最後にジオキサン1000mlで洗つた。洗
浄は減圧下で半融ガラス漏斗で行つた。この樹脂
を1晩中ガラス製の栓をした目盛付きシリンダー
中に放置して床容積を正確に測定し、過剰のジオ
キサンを除去した後、沈降したゲルを60mlのジオ
キサンで、水冷式冷却器とガラスシール撹拌機の
付いた500mlの3つ口丸底フラスコに移した。こ
の反応フラスコを50±2℃に保つた恒温油浴中に
浸漬し、内容物を100rpmで撹拌した。次にN,
N―ジイソプロピルエチルアミンの2Mジオキサ
ン溶液20mlを加え、30分後、トリクロロ―s―ト
リアジンの1Mジオキサン溶液20mlを加えて反応
を開始させた。50℃で60分間後、得られた活性化
樹脂を半融ガラス漏斗上で1000mlのジオキサンで
洗浄した。この樹脂は樹脂1g当たり112μモル
のトリアジンを含んでいた。この樹脂の一部分を
次に樹脂1床容量当たり2容量の1Mエチレンジ
アミンジオキサン溶液と室温で30分間反応させた
ところ、樹脂1g当たり224μモルのジアミンが
カツプリングしたことがわかつた。 樹脂の第二部分を2容量のアニリンジオキサン
溶液と室温で30分間反応させた後、半融ガラス漏
斗上で5床容量のジオキサンで洗浄した。この後
者の樹脂の一部分を2床容量の1Mエチレンジア
ミンジオキサン溶液と室温で30分間反応させたと
ころ、樹脂1g当たり112μモルのジアミンがカ
ツプリングしたことがわかつた。アニリン処理樹
脂の第二部分を2床容量の水:ジオキサン(70:
30)で4℃で洗浄し、最後に半融ガラス漏斗上で
10床容量の4℃の水で洗浄した。 水相中の樹脂の一部分を0.66Mイプシロンアミ
ノカプロン酸、0.30M硼酸ナトリウム、0.30M塩
化ナトリウム緩衝液(PH8.5)の2床容量と共に
室温で22時間定温放置した後、111μモルの6―
アミノヘキサン酸が樹脂に結合した。水相中の樹
脂の第二部分を0.30M硼酸ナトリウム,0.30M塩
化ナトリウム緩衝液(PH8.0)中の牛血清アルブ
ミン(10mg/ml)溶液4床容量と室温で22時間反
応させた。この樹脂は樹脂1g当たり42.3mgの蛋
白質とカツプリングしたことがわかつた。 実施例 2 CNBrによつてアガロースに結合される配位子
の安定性とTsTによつて結合される配位子の安
定性とを比較するため、 14C―牛血精アルブミン
(BSA)および 14C―EACAのおのおのをこれら
の2種のカツプリング試薬を用いてセフアロース
CL―6Bに結合させた。次にこれらの樹脂をカツ
プリング結合の加水分解を促進する条件下で、す
なわち第1図に示したような高温および高PH下で
処理した。第1図のグラフは50℃で0.33M
Na2CO3(PH11.2)中における 14C―EACA―セ
フアロースおよび 14C―BSA―セフアロースの加
水分解の結果を示す。充填樹脂を緩衝液中に懸濁
し、所定の時間間隔で一部分を取り、放射能の分
析を行つた。全放射能は樹脂に結合した配位子の
全量を示す。例えば、フインレイ(Finlay)氏等
によつてJ.Biol.Chem.,245,5258(1970)に示
された方法によつて製造した 14C―ヨードアセト
アミドでアルキル化され且つ蛋白質1モル当たり
0.6モルのカルボキシアミドメチル基を含む 14C
―EACAおよび 14C―BSA(1.8×105cpm/mg)
をパリク(Parikh)氏等がMethods
Enzymol.34,77(1974)に記載した方法によ
り、0.3M硼酸ナトリウム,0.3M NaCl(PH8.0)
中でCNBr活性化セフアロースCL―6Bにカツプ
リングさせた。CNBrによつて結合させたBSA―
セフアロースは樹脂1g当たり35.3mgの蛋白質を
含み、EACA―セフアロースは樹脂1g当たり
317μモルのアミンを含んでいた。 14C―BSAお
よび 14C―EACAを0.22M硼酸ナトリウム,
0.22M NaCl(PH8.0)中でトリアジン活性化セフ
アロースCL―6Bにカツプリングさせた。トリア
ジン活性化によつて製造したBSA―セフアロー
スは樹脂1g当たり42.3mgの蛋白質を含み、
EACA―セフアロースは樹脂1g当たり140μモ
ルのアミンを含んでいた。充填樹脂1mlを50℃で
0.5M Na2CO3(PH11.2)2.0ml中に懸濁させた。
第1図に示した時間間隔で、樹脂懸濁液を遠心分
離し且つ上澄液フラクシヨンから一部分を取り、
計数した。データは明らかに、蛋白質および小分
子配位子の両方に対してトリアジン結合の方が
CNBr結合より優れていることを示している。 第2図はトリアジン活性化樹脂にカツプリング
する蛋白質の量がカツプリング反応中に存在する
遊離蛋白質の量に依存することを示している。 第2図のデータは牛血精アルブミンのセフアロ
ースCL―MsTへのカツプリングの影響に関する
ものである。ジオキサンから凍結乾燥したセフア
ロースCL―6B―MsT試料(100mg)を0.15M
NaCl,0.1M硼酸ナトリウム(PH8.0)5.0ml中に
懸濁した。0゜で1分間混合した後、懸濁液を遠
心分離し、懸濁液を吸引して全容1.5mlの樹脂+
液を得た。次に、この同じ緩衝液1mlに14C―
CM―牛血精アルブミンを加え、この反応混合物
を室温で振盪しながら定温放置した。44時間後、
樹脂を1.0M Tris―HCl(PH8.8),水および50%
エタノールで洗つた後、凍結乾燥した。乾燥した
樹脂の一定重量を計数した後、カツプリングして
いる蛋白質の量を計算した。この特別なロツトの
樹脂について1g当たり125mgのアルブミンがカ
ツプリングしており、樹脂が飽和になつたという
兆候を示していないことは注目すべき興味あるこ
とである。 第1表は、PH範囲6〜9で温度がPHよりカツプ
リング効率に大きな影響を与えることを示してい
る。第1表中に示す資料の作成には、ジオキサン
から凍結乾燥したセフアロースCL―MsT試料
(100mg)を0.15M NaClを含む緩衝液(PH6およ
び7:0.1M燐酸ナトリウム;PH8および9:
0.1M硼酸ナトリウム)中に懸濁させ。0℃で1
分間混合した後、懸濁液を遠心分離し、上澄液を
吸引して全容1.9mlの樹脂+液を得た。 14C―CM
牛血精アルブミン(0.1ml,9.98mg,1.17×
105cpm)を加え、反応混合物を振盪しながら24
時間定温放置した。試料を第1図に関して説明し
たようにして洗浄し且つ計数した。 第2表および第3表には、TsT活性化セフア
ロースにカツプリングさせた酵素、他の蛋白質お
よび他の物質の幾つかを示してある。本発明の方
法でカツプリングさせた酵素の中で商業的に最も
大きい価値のあるものは殿粉をデキストリンに転
化する細菌α―アミラーゼであり、紙および織物
工業ならびにグルコースの製造に用いられる。
ましい実施態様について以下詳細に説明する。第
1図はCNBrと結合した配位子の安定性とTsTと
結合した配位子の安定性との比較を示すグラフで
あり、第2図はTsT活性化樹脂にカツプリング
した蛋白質の種々の特性を示すグラフである。 好ましい実施態様の説明 以下は架橋アガロースのような担体の水性懸濁
液で開始するトリアジン結合された生物親和性樹
脂の反応生成物の一般的製造方法を示す、この方
法は下記の通りである。 担体の水性懸濁液を、ジオキサン量が0から
100%まで増加する一連のジオキサン―水溶液で
洗浄する。この担体をガラスシール撹拌機
(glass―sealed stirrer)および水冷式冷却器の
付いた丸底フラスコに少量のジオキサンを用いて
移す。この反応フラスコを恒温油浴中に浸漬し、
内容物を低速度で撹拌する。N,N―ジイソプロ
ピルエチルアミンまたはN,N―ジメチルアニリ
ンのジオキサン溶液を加え、反応を平衡させる。
ジオキサンに溶解したトリクロロ―s―トリアジ
ンの添加によつて反応を開始させる。液相と固相
とは等容積であり、塩基の濃度はトリクロロ―s
―トリアジンの濃度の2倍である。担体樹脂中に
結合するトリアジンの量はトリクロロ―s―トリ
アジン濃度と反応時間と反応温度とに依存する。 得られた活性化DsT―担体を次に数床容量のジ
オキサンで洗う。この時点で、この活性化担体を
数種の異なる方法で反応させることができ、(1)有
機ジオキサン中でアルキルアミンのような強求核
剤と反応させてジアルキル―トリアジン―樹脂を
得ることができ、あるいは(2)ジオキサン中でアリ
ールアミンのような弱求核剤と反応させてその後
の反応に有効な塩素1個を有するモノアリール―
トリアジン―樹脂を得ることができ、あるいは(3)
モノアリール―トリアジン―樹脂をジオキサン量
が次第に減少する一連のジオキサン―水溶液で洗
い、今や水溶液中にある樹脂を蛋白質または他の
求核剤と反応させることができ、あるいは(4)凍結
乾燥またはその他の穏やかな方法でモノアリール
モノクロロ―s―トリアジン―樹脂から有機溶媒
を除去し、この乾燥した活性化樹脂を後で使用す
るために貯蔵しておくこともできる。 実施例 1 特殊な実施例として、100mlのセフアロースCL
―4Bを水:ジオキサン(30:70)の混合物の200
mlで洗い、次いで水:ジオキサン(70:30)200
mlで洗い、最後にジオキサン1000mlで洗つた。洗
浄は減圧下で半融ガラス漏斗で行つた。この樹脂
を1晩中ガラス製の栓をした目盛付きシリンダー
中に放置して床容積を正確に測定し、過剰のジオ
キサンを除去した後、沈降したゲルを60mlのジオ
キサンで、水冷式冷却器とガラスシール撹拌機の
付いた500mlの3つ口丸底フラスコに移した。こ
の反応フラスコを50±2℃に保つた恒温油浴中に
浸漬し、内容物を100rpmで撹拌した。次にN,
N―ジイソプロピルエチルアミンの2Mジオキサ
ン溶液20mlを加え、30分後、トリクロロ―s―ト
リアジンの1Mジオキサン溶液20mlを加えて反応
を開始させた。50℃で60分間後、得られた活性化
樹脂を半融ガラス漏斗上で1000mlのジオキサンで
洗浄した。この樹脂は樹脂1g当たり112μモル
のトリアジンを含んでいた。この樹脂の一部分を
次に樹脂1床容量当たり2容量の1Mエチレンジ
アミンジオキサン溶液と室温で30分間反応させた
ところ、樹脂1g当たり224μモルのジアミンが
カツプリングしたことがわかつた。 樹脂の第二部分を2容量のアニリンジオキサン
溶液と室温で30分間反応させた後、半融ガラス漏
斗上で5床容量のジオキサンで洗浄した。この後
者の樹脂の一部分を2床容量の1Mエチレンジア
ミンジオキサン溶液と室温で30分間反応させたと
ころ、樹脂1g当たり112μモルのジアミンがカ
ツプリングしたことがわかつた。アニリン処理樹
脂の第二部分を2床容量の水:ジオキサン(70:
30)で4℃で洗浄し、最後に半融ガラス漏斗上で
10床容量の4℃の水で洗浄した。 水相中の樹脂の一部分を0.66Mイプシロンアミ
ノカプロン酸、0.30M硼酸ナトリウム、0.30M塩
化ナトリウム緩衝液(PH8.5)の2床容量と共に
室温で22時間定温放置した後、111μモルの6―
アミノヘキサン酸が樹脂に結合した。水相中の樹
脂の第二部分を0.30M硼酸ナトリウム,0.30M塩
化ナトリウム緩衝液(PH8.0)中の牛血清アルブ
ミン(10mg/ml)溶液4床容量と室温で22時間反
応させた。この樹脂は樹脂1g当たり42.3mgの蛋
白質とカツプリングしたことがわかつた。 実施例 2 CNBrによつてアガロースに結合される配位子
の安定性とTsTによつて結合される配位子の安
定性とを比較するため、 14C―牛血精アルブミン
(BSA)および 14C―EACAのおのおのをこれら
の2種のカツプリング試薬を用いてセフアロース
CL―6Bに結合させた。次にこれらの樹脂をカツ
プリング結合の加水分解を促進する条件下で、す
なわち第1図に示したような高温および高PH下で
処理した。第1図のグラフは50℃で0.33M
Na2CO3(PH11.2)中における 14C―EACA―セ
フアロースおよび 14C―BSA―セフアロースの加
水分解の結果を示す。充填樹脂を緩衝液中に懸濁
し、所定の時間間隔で一部分を取り、放射能の分
析を行つた。全放射能は樹脂に結合した配位子の
全量を示す。例えば、フインレイ(Finlay)氏等
によつてJ.Biol.Chem.,245,5258(1970)に示
された方法によつて製造した 14C―ヨードアセト
アミドでアルキル化され且つ蛋白質1モル当たり
0.6モルのカルボキシアミドメチル基を含む 14C
―EACAおよび 14C―BSA(1.8×105cpm/mg)
をパリク(Parikh)氏等がMethods
Enzymol.34,77(1974)に記載した方法によ
り、0.3M硼酸ナトリウム,0.3M NaCl(PH8.0)
中でCNBr活性化セフアロースCL―6Bにカツプ
リングさせた。CNBrによつて結合させたBSA―
セフアロースは樹脂1g当たり35.3mgの蛋白質を
含み、EACA―セフアロースは樹脂1g当たり
317μモルのアミンを含んでいた。 14C―BSAお
よび 14C―EACAを0.22M硼酸ナトリウム,
0.22M NaCl(PH8.0)中でトリアジン活性化セフ
アロースCL―6Bにカツプリングさせた。トリア
ジン活性化によつて製造したBSA―セフアロー
スは樹脂1g当たり42.3mgの蛋白質を含み、
EACA―セフアロースは樹脂1g当たり140μモ
ルのアミンを含んでいた。充填樹脂1mlを50℃で
0.5M Na2CO3(PH11.2)2.0ml中に懸濁させた。
第1図に示した時間間隔で、樹脂懸濁液を遠心分
離し且つ上澄液フラクシヨンから一部分を取り、
計数した。データは明らかに、蛋白質および小分
子配位子の両方に対してトリアジン結合の方が
CNBr結合より優れていることを示している。 第2図はトリアジン活性化樹脂にカツプリング
する蛋白質の量がカツプリング反応中に存在する
遊離蛋白質の量に依存することを示している。 第2図のデータは牛血精アルブミンのセフアロ
ースCL―MsTへのカツプリングの影響に関する
ものである。ジオキサンから凍結乾燥したセフア
ロースCL―6B―MsT試料(100mg)を0.15M
NaCl,0.1M硼酸ナトリウム(PH8.0)5.0ml中に
懸濁した。0゜で1分間混合した後、懸濁液を遠
心分離し、懸濁液を吸引して全容1.5mlの樹脂+
液を得た。次に、この同じ緩衝液1mlに14C―
CM―牛血精アルブミンを加え、この反応混合物
を室温で振盪しながら定温放置した。44時間後、
樹脂を1.0M Tris―HCl(PH8.8),水および50%
エタノールで洗つた後、凍結乾燥した。乾燥した
樹脂の一定重量を計数した後、カツプリングして
いる蛋白質の量を計算した。この特別なロツトの
樹脂について1g当たり125mgのアルブミンがカ
ツプリングしており、樹脂が飽和になつたという
兆候を示していないことは注目すべき興味あるこ
とである。 第1表は、PH範囲6〜9で温度がPHよりカツプ
リング効率に大きな影響を与えることを示してい
る。第1表中に示す資料の作成には、ジオキサン
から凍結乾燥したセフアロースCL―MsT試料
(100mg)を0.15M NaClを含む緩衝液(PH6およ
び7:0.1M燐酸ナトリウム;PH8および9:
0.1M硼酸ナトリウム)中に懸濁させ。0℃で1
分間混合した後、懸濁液を遠心分離し、上澄液を
吸引して全容1.9mlの樹脂+液を得た。 14C―CM
牛血精アルブミン(0.1ml,9.98mg,1.17×
105cpm)を加え、反応混合物を振盪しながら24
時間定温放置した。試料を第1図に関して説明し
たようにして洗浄し且つ計数した。 第2表および第3表には、TsT活性化セフア
ロースにカツプリングさせた酵素、他の蛋白質お
よび他の物質の幾つかを示してある。本発明の方
法でカツプリングさせた酵素の中で商業的に最も
大きい価値のあるものは殿粉をデキストリンに転
化する細菌α―アミラーゼであり、紙および織物
工業ならびにグルコースの製造に用いられる。
【表】
【表】
【表】
【表】
第2表の資料の作成において、反応混合物は第
2表の第1欄に示した蛋白質濃度で、全容2mlの
0.1M硼酸ナトリウム,0.15M NaCl(PH8.0)中に
100mgの活性化樹脂を含んでいた。反応は25±2
℃で穏やかに振盪しながら24時間行つた。この樹
脂を次にまず1.0Mトリス―Cl(PH8.8)で過
し、次いで0.05Mトリス―Cl,0.15M NaCl(PH
8.3)で過して洗浄した。得られた樹脂を前述
したようにして蛋白質および酵素活性度について
分析した。 本発明ならびにそれに付随する多くの利点は以
上の説明から十分に理解されると考える。また、
以上本文中に記載した形態は本発明の好ましい実
施態様にすぎず、本発明の精神および範囲から逸
脱することなく、また本発明の本質的利点を犠牲
にすることなく種々の変化を行うことが可能であ
る。
2表の第1欄に示した蛋白質濃度で、全容2mlの
0.1M硼酸ナトリウム,0.15M NaCl(PH8.0)中に
100mgの活性化樹脂を含んでいた。反応は25±2
℃で穏やかに振盪しながら24時間行つた。この樹
脂を次にまず1.0Mトリス―Cl(PH8.8)で過
し、次いで0.05Mトリス―Cl,0.15M NaCl(PH
8.3)で過して洗浄した。得られた樹脂を前述
したようにして蛋白質および酵素活性度について
分析した。 本発明ならびにそれに付随する多くの利点は以
上の説明から十分に理解されると考える。また、
以上本文中に記載した形態は本発明の好ましい実
施態様にすぎず、本発明の精神および範囲から逸
脱することなく、また本発明の本質的利点を犠牲
にすることなく種々の変化を行うことが可能であ
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 不溶性固体担体物質をトリクロロ―s―トリ
アジンと反応させて活性化担体を製造する工程
と、その後この活性化担体に配位子をカツプリン
グさせる工程とから成る固相触媒および生物特異
性吸着剤を製造するために共有化学結合によつて
蛋白質および非蛋白質親和性配位子を不溶性固体
担体にカツプリングさせるために使用できる活性
化担体を製造する方法において、 (a) 担体物質と相溶性であり且つトリクロロ―s
―トリアジンの溶媒でもある有機溶媒から成る
非水媒質中で、ポリオールを含有する無水の不
溶性固体担体物質とトリクロロ―s―トリアジ
ンとを反応させる工程と、 (b) 反応中に発生するHClを、上記有機溶媒に可
溶であり且つ上記有機溶媒中でトリクロロ―s
―トリアジンと不溶性錯体を形成しない第三ア
ミンで中和する工程と、 (c) 得られたジクロロ―s―トリアジン活性化担
体を追加量の上記有機溶媒で洗浄する工程と から構成した活性化担体を製造する方法。 2 担体物質が初めに水を含んでおり、工程(a)の
前に担体物質から水を除去するための処理を行う
特許請求の範囲第1項に記載の方法。 3 担体物質を有機溶媒で洗浄することによつて
担体物質の前処理を行う特許請求の範囲第2項に
記載の方法。 4 担体物質を真空下で乾燥することによつて担
体物質の前処理を行う特許請求の範囲第2項に記
載の方法。 5 第三アミンがN,N―ジイソプロピルエチル
アミンとN,N―ジメチルアニリンとから成る群
から選ばれる特許請求の範囲第1項に記載の方
法。 6 有機溶媒がジオキサンとアセトニトリルとか
ら成る群から選ばれる特許請求の範囲第1項に記
載の方法。 7 有機溶媒中において、洗浄済みのジクロロ―
s―トリアジン活性化担体に求核剤を添加してト
リアジン環上の塩基原子の一方または両方を置換
する工程を含んだ特許請求の範囲第1項に記載の
方法。 8 求核剤が脂肪族アミン,アリールアミン,フ
エノールおよびアルコキシアミンから選ばれる特
許請求の範囲第7項に記載の方法。 9 有機溶媒中において、洗浄済みのジクロロ―
s―トリアジン活性化担体に弱求核剤を加えてト
リアジン環上の1個の塩素原子を置換し、第二の
求核剤によるその後の置換のために有効な残留塩
素原子を残しておく工程を含んだ特許請求の範囲
第1項に記載の方法。 10 弱求核剤がアニリンである特許請求の範囲
第9項に記載の方法。 11 得られたモノクロロ―s―トリアジン活性
化担体を貯蔵ならびにその後の使用のために乾燥
する特許請求の範囲第9項に記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US05/876,240 US4229537A (en) | 1978-02-09 | 1978-02-09 | Preparation of trichloro-s-triazine activated supports for coupling ligands |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JPS6259124B2 true JPS6259124B2 (ja) | 1987-12-09 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP54500459A Expired JPS6259124B2 (ja) | 1978-02-09 | 1979-02-09 |
Country Status (7)
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| JP (1) | JPS6259124B2 (ja) |
| CA (1) | CA1124190A (ja) |
| DE (1) | DE2965887D1 (ja) |
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