JPS627917B2

JPS627917B2 -

Info

Publication number: JPS627917B2
Application number: JP54107817A
Authority: JP
Inventors: Kenzo Tamai; Isamu Saikawa; Takashi Yasuda; Shohachi Murakami; Toyoo Maeda; Hisatsugu Tsuda; Hiroshi Sakai; Masatoshi Sugita; Yoshiko Yamamoto; Takashi Minami; Takako Hori
Original assignee: Toyama Chemical Co Ltd
Current assignee: Toyama Chemical Co Ltd
Priority date: 1979-08-24
Filing date: 1979-08-24
Publication date: 1987-02-19
Also published as: JPS5630996A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規な制癌性物質、更に詳細にはフソ
バクテリウム属に属する菌を培養し、この培養液
から得られる制癌性物質TF−110に関する。更に
また、本発明はこの制癌性物質TF−110を製造す
る方法並びにこれを含有する制癌制に関する。近年、各種の癌患者の治療法において、宿主の
免疫機能を亢進させ、免疫機能の助けを借りなが
ら制癌効果を発現させる治療法が盛んとなつて来
た。斯る療法に使用される薬剤としては、各種細
菌の菌体、菌体培養物から得られる成分、あるい
は担子菌の子実体又はその培養菌体から得られる
多糖体が知られている。しかし、これらの薬剤は
効果、副作用及びその製造法等の点で未だ満足し
得るものではない。一方また、フソバクテリウム属に属する菌、例
えばフソバクテリウム・K031−3B、フソバクテ
リウム・フシフオミスＷ−12、フソバクテリウ
ム・ギランス1012及びフソバクテリウム・ヌクレ
アタム1010を培養して得た菌体及び上清液に関す
る報告がみられる。〔口科誌21、534〜539頁
（1972）、口科誌23、322〜333頁（1974）〕しかし
ながら、フソバクテリウム属に属する上記菌を培
養して得られる培養液から得られる成分並びにそ
の薬理作用については未だ研究されていない。そこで、本発明者は、本発明者によつてヒト口
腔内より分離したフソバクテリウム属に属する菌
を培養し、その培養液から菌体を除去した上清液
について、その薬理作用を調べていたところ、こ
の上清液から採取される特定の成分が強い制癌作
用を有すること、しかもこれは、コロニー形成抑
制法においては癌細胞の集落形成阻止作用は極め
て小さく、殺細胞による制癌作用ではなく、宿主
介在性あるいは宿主の免疫力を亢進させ、免疫力
の助けを借りながら間接的に制癌作用を発現させ
る作用を有するものであること、更にこの成分は
毒性が極めて低いことを見出し、本発明を完成し
た。本発明で使用される菌は、国立金沢大学医学部
附属病院歯科口腔外科において、ヒト口腔より分
離されたもので、次のような菌学的性状を有す
る。 (1) 形態細胞の形：紡鍾形（第１図）細胞の多形性の有無：なし運動性の有無：なし胞子の有無：なしグラム染色：グラム陰性抗酸性：陰性 (2) 培地における生育状態 TH−ａ寒天平板及び斜面培地外形：円形大きさ：約１mm 隆起：半球状構造：露滴状表面：平滑辺縁：平滑色：乳黄白色透明度：不透明 TF−ａ液体培地発育の程度：旺盛濁り：凝塊沈澱：なし表面の発育：なし、約５mmまでは発育なしガス：なし (3) 生理学的性質硫化水素の生成：＋硝酸塩の還元：− 酪酸の生成：＋インドールの生成：＋ウレアーゼ：− カタラーゼ：− デンプンの加水分解：− 酸素に対する態度：嫌気性アンモニアの生成：＋炭酸ガスの生成：＋生育の範囲：PH５〜7.5 温度30〜45℃ 糖からのガスの生成Ｌ−アラビノース（−）、Ｄ−キシロース
（−）、Ｄ−グルコース（−）、Ｄ−マンノー
ス（−）、Ｄ−フラクトース（−）、Ｄ−ガラ
クトース（−）、麦芽糖（−）、シヨ糖
（−）、トレハロース（−）、ソルビツト
（−）、マンニトール（−）、イノシツト
（−）、グリセリン（−）、デンプン（−）以上の諸性状をバージーズ・マニユアル・オ
ブ・デイタミネイテイブ・バクテリオロジー第８
版に照して検討すると、本菌株はフソバクテリウ
ム・ヌクレアタム（Fusobacteriumnucleatum）
に酷似するので、これに属する菌であると固定
し、本菌株をフソバクテリウム・ヌクレアタム
TF−031（Fusobacteriumnucleatum TF−031）
と命名して、工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託番号微工研菌寄第5077号（FERM−Ｐ No.
5077）として寄託した。本発明の制癌性物質TF−110は、例えば次の如
くして製造される。 (a) 培養フソバクテリウム・ヌクレアタムの培養は、
通常の嫌気性菌の培養法によつて行われる。す
なわち、各種ペプトン、牛の脳、心臓抽出物等
の窒素源；グルコース、ラクトース等の炭素
源；イースト・エクストラクト等のビタミン
源；Ｌ−シスチン、亜硫酸ソーダ、チオグリコ
レート等の還元剤；塩化ナトリウム等の無機塩
を含む培地を水酸化ナトリウムでPH７に調整し
たものを用いて、嫌気的条件下30〜40℃の温度
で１〜５日間静置培養を行う。特に次の成分を
含む培地（以下TF培地と称する）を使用する
のが好ましい。なお、寒天を使用しないときは
撹拌培養を行なうのが好ましい。

【表】

【表】 (b) 培養液から上清液の採取（菌体の除去）上で
得た培養液から菌体を除去して上清液を得る。
菌体の除去は常法、例えば遠心分離、ハイフロ
スーパーゲル等の過助剤を用いる過法を採
用できるが、特に遠心分離法は操作、菌の除去
度合、上清液の収得量の点で好ましい。又、菌
体の除去はこの段階で行なうのが好ましいが次
の(c)の操作において除去してもよい。 (c) 制癌性物質TF−110の採取上で得られた上清液又は培養液に親水性有機
溶媒を加えて、生ずる沈澱物を採取する。この
際の上清液又は培養液はPH３〜７に調整するの
が好ましい。親水性有機溶媒としては、例えば
エタノール、メタノール等のアルコール類、ア
セトン等のケトン類が挙げられるが、アルコー
ル類特にエタノールが最もよい結果を与える。
この親水性有機溶媒はその濃度が30〜70％、好
ましくは60％前後になるように添加するのが好
適である。親水性有機溶媒を加えた後、低温、
好ましくは約５℃の温度で数時間〜数日間放置
し、沈澱物の生成を完結させる。このようにして生じた沈澱物をデカンテーシ
ヨン、遠心分離、過等の通常の操作で分離す
る。次いで、上で得られた沈澱物に10〜15倍量の水
を加え、生ずる水不溶物を遠心分離、過等の通
常の方法で除去する。培養液を使用したときはこ
の処理により菌体が除去される。斯くして得られ
る溶液を凍結乾燥等によつて乾燥すれば制癌性物
質TF−110が得られる。更に上で得た分離液を透
析又は限外過する。又はTF−100を10〜15倍量
の水に溶解して透析又は限外過を行う。当該処
理によりアミノ酸等の低分子成分が除去される。
内液を採取し、これを乾燥すれば制癌性物質TF
−110が得られる。斯くして得られるTF−110は次のごとき物性を
有する。 (イ) 白灰色〜淡褐色 (ロ) マウスのエールリツヒ腹水型癌の増殖を阻止
し、免疫賦活作用を有する。 (ハ) 水に溶解し、その水溶液はほぼ中性を示し、
メタノール、エタノール、アセトン、ベンゼ
ン、クロロホルム、酢酸エチル、ジエチルエー
テルに不溶。 (ニ) 明確な融点を示さず、約110℃より分解を始
め、200℃以上で著しく分解する。 (ホ) KBr錠剤法による赤外線吸引スペクトルは
3600〜3200、2960〜2930、1670〜1640、1550、
1440〜1380、1240、1140〜1000及び820cm^-1の
近傍に吸収帯を有する（第２図）。 (ヘ) その水溶液の紫外部吸収スペクトルは吸収末
端に強い吸収があり、また256〜260nｍの近傍
に吸収ピークを示し、0.02％水溶液でO.D₂₆₀は
0.440〜0.590の吸収を示す（第３図）。 (ト) セフアデツクスＧ−200（フアルマシア社の
登録商標）を用いてゲル過（カラム：44mmφ
×500mm、溶出液：PH７の0.1モル燐酸緩衝液）
で分画すると、260nｍの紫外線吸光度測定に
おいてはボイドボリウム通過付近から380、600
から920ml付近にかけて吸収帯を有し、フエノ
ール硫酸法による490nｍの吸光度測定におい
てはボイドボリウム通過付近から380、410から
520、630から760ml付近にかけて吸収帯を有
し、アンスロン硫酸法による620nｍの吸光度
測定においては、ボイドボリウム通過付近から
380、420から520、620から760ml付近に吸収帯
を有する（第４図）。 (チ) TSK−GEL G300 SW（東洋曹達株式会社の
商品名、カラム：7.9mmφ×600mm×２）による
高速液体クロマトグラム（溶出液：PH７の0.1
モル燐酸緩衝液、流速0.8ml／分、室温）は、
220nmおよび260nｍの紫外線吸光度測定におい
てはそれぞれ溶媒先端部分、38〜60分、65分付
近にかけてピークを有する。（第５図）。 (リ) モーリツシユ反応、フエノール硫酸反応、ア
ンスロン硫酸反応、インドール塩酸反応、ロウ
リイー・フオリン反応は陽性、ニンヒドリン反
応は陰性。 (ヌ) 元素分析値Ｃ：35.9％〜41.0％、Ｈ：4.5％〜5.2％、
Ｎ：4.2％〜5.2％ (ル) フエノール硫酸法による糖の含有率は約
30.0％〜69.0％（グルコース換算）、およびロ
ウリイー・フオリン法による蛋白質の含有率は
約18.0％〜22.0％（牛血清アルブミン換算）で
ある。本発明の制癌性物質TF−110の薬理作用は次の
とおりである。 (1) 癌細胞の集落形成阻止作用キム・ジエー・エツチらの方法〔Cancer
Res.、25、698（1965）〕に従つて、Hela Ｓ−
３細胞を、ウシ血清10％添加イーグルスMEM
培地で３〜５日間培養後培養液を除去し、エチ
レンジアミンテトラ酢酸0.01％及びトリプシン
0.1％を含むPBS（−）溶液（１中に塩化ナ
トリウム8.0ｇ、塩化カリウム0.2ｇ、リン酸第
一水素ナトリウム1.15ｇ及びリン酸第二水素カ
リウム0.2ｇを含有する水溶液）を加え、培養
びんのガラス表面より細胞をはがし、ウシ血清
20％添加イーグルスMEM培地にて希釈し、希
釈液１ml当り200個の細胞を含むように調整す
る。この細胞懸濁液１mlをCO₂インキユベータ
ーで37℃、24時間培養した後、実施例１(1)で得
た上清液を1/16〜1/128倍希釈になるように加
える。また、前記の37℃、24時間培養したのち
本発明の制癌性物質TF−110を加え、７日間
Hela細胞を培養する。培養後培地を除去し、
ハンクス氏溶液にて培養皿を洗い、70％エタノ
ールにて細胞を固定し、次いで100％エタノー
ルで細胞を洗い、エタノールを除去した後ギム
ザ染色液で細胞を染色し、コロニー数を数えて
細胞の生存率を求めた。その結果は表１及び表２のとおりである。尚
表中の細胞の生存率は次式によつて算出し、５
枚のシヤーレの平均値で示した。細胞の生存率＝処理群のコロニー数／無処理群のコロ
ニー数×100

【表】

【表】この実験から明らかな如く、制癌性物質TF
−110は上清液と比較すると、直接的な細胞傷
害作用である癌細胞の集落形成阻止作用はきわ
めて弱い。 (2) 免疫賦活作用一群４匹のICR系マウスを用い、制癌性物質
TF−110を生理食塩水0.2mlに溶解し、５mg及
び20mg／Kgを腹腔内投与した。投与24時間後にPerikan Drawing InK17
Black（ギユンター・ワグナー社製）１mlとゼ
ラチン３％含有生理食塩水２mlを混合して調製
したカーボン浮遊液0.2mlをマウス尾静脈より
注入し、注入後１、５、10および15分後に眼窩
よりヘパリン被覆へマトクリツト毛細管を用い
て血液0.02mlを採取し、直ちに0.1％炭酸ナト
リウム水溶液1.6mlに希釈溶血させ、これを波
長675nｍで比色し貧食係数（phagocytotic
index）：Ｋ値をHalpernからの数式により求
めた。また対照群には生理食塩水0.2mlを投与し
た。Ｋ＝ｌｏｇＣｏ−ｌｏｇＣ／ｔ−ｔｏ（Co＝to時の血中炭末量、Ｃ＝ｔ時の血中炭末
量）その結果は表３のとおりである。

【表】この実験から明らかなごとく、対照群に比較
し、本発明のTF−110投与群は網内系マクロフ
アージが活性化され、正常マウスの細胞性免疫
が増大した。 (3) 制癌作用エールリツヒ腹水型腫瘍に対する抗腫瘍作
用： ICR系マウス（雌、６週令）にエールリツヒ
腹水型癌細胞をマウス１匹当り１×10⁵個腹腔
内接種した。ついでTF−110を生理食塩水に溶
解させ、癌細胞接触後１日目より、１日１回６
日間各量を連続投与した。また対照群には生理
食塩水0.1ml／１回を同様に投与した。その結果は表４のとおりである。Ｔ／Ｃ＝投与群の生存日数／対照群の生存日数×10
0（％）

【表】ず完全治癒マウスであつた。この実験から

【表】本発明の制癌性物質TF−110は次に示すごと
く極めて毒性が少ない。マウスにおける急性毒性（LD₅₀）静脈＞250mg／Kg 腹腔＞1000mg／Kg 以上の薬理実験の結果から明らかなように本発
明の制癌性物質TF−110は制癌剤として有用なも
のであり、各種の癌疾患に使用され効果が期待さ
れるものであるが、とりわけ固型癌に対して著し
い効果が期待できる。本発明のTF−110は常法により経口、注射、坐
薬等の剤形にして使用することができる。経口剤
としては種々の賦形剤を含んでもよく、カプセル
剤、錠剤、散剤、顆粒剤とすることができる。ま
た、注射剤としては皮下、筋肉内、静脈内注射剤
のいずれでもよく、懸濁液、溶液もしくは使用時
溶解させる粉末等の剤形が用いられる。また注射
剤には局所麻酔剤を含んでいてもよい。本発明のTF−110の投与量は患者の症状に応じ
て適宜選択されるが、一般に成人において0.01〜
50mg／Kgを１日１〜数回に分け投与するのが好ま
しく、投与方法としては経口又は皮下、筋肉内、
静脈内もしくは患部への注射によつてなされるの
が好ましい。次に本発明の実施例を挙げて説明する。実施例１ (1) ２容のスクリユーキヤツプ付培養瓶15本
に、それぞれ１本につきトリプトケース・ペプ
トン34ｇ、フアイトン・ペプトン６ｇ、プロテ
アーゼ・ペプトン20ｇ、ブレイン・ハート・イ
ンヒユージヨン70ｇ、イースト・エクストラク
ト６ｇ、食塩15ｇ、グルコース12ｇ、ラクトー
ス10ｇ、Ｌ−シスチン0.5ｇ、亜硫酸ソーダ0.2
ｇ、チオグリコレート・ナトリウム1.0ｇ、寒
天1.4ｇを加え、PH７に調整した培地２を入
れ、120℃で15分間加圧減菌したのち、ただち
に水冷冷却し、予め同組成の培地で前培養して
おいたフソバクテリウム・ヌクレアタムTF−
031（微工研受託番号微工研菌寄番号第5077
号（FERM−Ｐ No.5077））の前培養液を培養
瓶１本につき100mlの割合で滅菌条件下に接種
し、37℃のふ卵器中で48時間静置培養を行う。
培養終了後、５℃で4000r.p.m.、20分間この培
養液を遠心分離し、菌体を除去して上清液約27
を得た。 (2) (1)で得た上清液に５℃で撹拌下にエタノール
40を加え、無定形の沈澱物が完全に沈澱する
まで低温室で放置する。ついで５℃、6000r.p.
m.、15分間遠心分離し沈澱物を採取し、エタ
ノールで洗浄し、減圧乾燥して約60ｇの粗粉末
を得た。 (3) (2)で得た粗粉末20ｇを水120mlに溶解させ、
この際生じる水不溶物を7500r.p.m.、10分間遠
心分離で除去して得た上清液と、水不溶物を水
60mlで２回洗浄した洗浄液とを合した水可溶部
230mlをホローフアイバー型限外過システム
（使用膜番号HI−１：旭化成(株)製商品）を用い
て限外過し、内液を凍結乾燥し白灰色のTF
−110の粉末10ｇを得た。製剤例実施例１で得られた粉末５mgをバイアル瓶に充
填した。これは使用時滅菌水又はリドカイン0.5
％含有溶液等で溶解し注射液として用いる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明で用いるフソバクテリウム・ヌ
クレアタムTF−031の形態を示す顕微鏡写真、第
２図は本発明の制癌性物質TF−110の赤外線吸収
スペクトル、第３図は同物質の紫外線吸収スペク
トル、第４図は同物質をセフアデツクスＧ−200
を用いてゲル過したときの溶出パターン、第５
図は同物質の高速液体クロマトグラムを示す。

Claims

【特許請求の範囲】１フソバクテリウム属に属する制癌性物質TF
−110生産菌を培養し、その培養液から得られる
次の性状を有する制癌性物質TF−110。 (イ) 白灰色〜淡褐色 (ロ) マウスのエールリツヒ腹水型癌の増殖を阻止
し、免疫賦活作用を有する。 (ハ) 水に溶解し、その水溶液はほぼ中性を示し、
メタノール、エタノール、アセトン、ベンゼ
ン、クロロホルム、酢酸エチル、ジエチルエー
テルに不溶。 (ニ) 明確な融点を示さず、約110℃より分解を始
め、200℃以上で著しく分解する。 (ホ) KBr錠剤法による赤外線吸収スペクトルは
3600〜3200、2960〜2930、1670〜1640、1550、
1440〜1380、1240、1140〜1000及び820cm^-1の
近傍に吸収帯を有する。 (ヘ) その水溶液の紫外部吸収スペクトルは吸収末
端に強い吸収があり、また256〜260nｍの近傍
に吸収ピークを示し、0.02％水溶液でのO.D₂₆₀
は0.440〜0.590の吸収を示す。 (ト) セフアデツクスＧ−200（フアルマシア社の
登録商標）を用いてゲル過（カラム：44mmφ
×500mm、溶出液：PH７の0.1モル燐酸緩衝液）
で分画すると260nｍの紫外線吸光度測定にお
いては、ボイドボリウム通過付近から380、600
から920ml付近にかけて吸収帯を有し、フエノ
ール硫酸法による490nｍの吸光度測定におい
てはボイドボリウム通過付近から380、410から
520、630から760ml付近にかけて吸収帯を有
し、アンスロン硫酸法による620nｍの吸光度
測定においては、ボイドボリウム通過付近から
380、420から520、620から760ml付近に吸収帯
を有する。 (チ) TSK−GEL G300SW（東洋曹達株式会社の
商品名、カラム：7.9mmφ×600mm×２）による
高速液体クロマトグラム（溶出液：PH７の0.1
モル燐酸緩衝液、流速0.8ml／分、室温）は、
220nｍおよび260nｍの紫外線吸光度測定にお
いては、それぞれ溶媒先端部分、38〜60分、65
分付近にかけてピークを有する。 (リ) モーリツシユ反応、フエノール硫酸反応、ア
ンスロン硫酸反応、インドール塩酸反応、ロウ
リイー・フオリン反応は陽性、ニンヒドリン反
応は陰性。 (ヌ) 元素分析値Ｃ：35.9％〜41.0％、Ｈ：4.5％〜5.2％、
Ｎ：4.2％〜5.2％ (ル) フエノール硫酸法による糖の含有率は約
30.0％〜69.0％（グルコース換算）、およびロ
ウリイ−・フオリン法による蛋白質の含有率は
約18.0％〜22.0％（牛血清アルブミン換算）で
ある。２フソバクテリウム属に属する制癌性物質TF
−110生産菌を培養して得た培養液又は上清液に
親水性有機溶媒を加えて生ずる沈澱物を採取し、
これに水を加えて水不溶物を除去し、次いでこれ
を透析又は限外過して得られたものである特許
請求の範囲第１項記載の制癌性物質TF−110。３フソバクテリウム属に属する制癌性物質TF
−110生産菌がフソバクテリウム・ヌクレアタム
である特許請求の範囲第１項又は第２項記載の制
癌性物質TF−110。４フソバクテリウム属に属する制癌性物質TF
−110生産菌を培養して得た培養液又は上清液に
親水性有機溶媒を加えて生ずる沈澱物を採取し、
これに水を加えて水不溶物を除去し、次いでこれ
を透析又は限外過することを特徴とする制癌性
物質TF−110の製造法。５親水性有機溶媒がアルコールである特許請求
の範囲第４項記載の制癌性物質TF−110の製造
法。６親水性有機溶媒をその濃度が30〜70％になる
ように培養液又は上清液に加えることを特徴とす
る特許請求の範囲第４項又は第５項記載の制癌性
物質TF−110の製造法。７フソバクテリウム属に属する制癌性物質TF
−110生産菌を培養し、その培養液から得られる
次の性状、 (イ) 白灰色〜淡褐色 (ロ) マウスのエールリツヒ腹水型癌の増殖を阻止
し、免疫賦活作用を有する。 (ハ) 水に溶解し、その水溶液はほぼ中性を示し、
メタノール、エタノール、アセトン、ベンゼ
ン、クロロホルム、酢酸エチル、ジエチルエー
テルに不溶。 (ニ) 明確な融点を示さず、約110℃より分解を始
め、200℃以上で著しく分解する。 (ホ) KBr錠剤法による赤外線吸収スペクトルは
3600〜3200、2960〜2930、1670〜1640、1550、
1440〜1380、1240、1140〜1000及び820cm^-1の
近傍に吸収帯を有する。 (ヘ) その水溶液の紫外部吸収スペクトルは吸収末
端に強い吸収があり、また256〜260nｍの近傍
に吸収ピークを示し、0.02％水溶液でのO.D₂₆₀
は0.440〜0.590の吸収を示す。 (ト) セフアデツクスＧ−200（フアルマシア社の
登録商標）を用いてゲル過（カラム：44mmφ
×500mm、溶出液：PH７の0.1モル燐酸緩衝液）
で分画すると260nｍの紫外線吸光度測定にお
いてはボイドボリウム通過付近から380、600か
ら920ml付近にかけて吸収帯を有し、フエノー
ル硫酸法による490nｍの吸光度測定において
はボイドボリウム通過付近から380、410から
520、630から760ml付近にかけて吸収帯を有
し、アンスロン硫酸法による620nｍの吸光度
測定においては、ボイドボリウム通過付近から
380、420から520、620から760ml付近に吸収帯
を有する。 (チ) TSK−GEL G300 SW（東洋曹達株式会社の
商品名、カラム：7.9mmφ×600mm×２）による
高速液体クロマトグラム（溶出液：PH７の0.1
モル燐酸緩衝液、流速0.8ml／分、室温）は、
220nｍおよび260nｍの紫外線吸光度測定にお
いてはそれぞれ溶媒先端部分、38〜60分、65分
付近にかけてピークを有する。 (リ) モーリツシユ反応、フエノール硫酸反応、ア
ンスロン硫酸反応、インドール塩酸反応、ロウ
リイー・フオリン反応は陽性、ニンヒドリン反
応は陰性。 (ヌ) 元素分析値Ｃ：35.9％〜41.0％、Ｈ：4.5％〜5.2％、
Ｎ：4.2〜5.2％ (ル) フエノール硫酸法による糖の含有率は約
30.0％〜69.0％（グルコース換算）、およびロ
ウリイー・フオリン法による蛋白質の含有率は
約18.0％〜22.0％（牛血清アルブミン換算）で
ある。を有する制癌性物質TF−110を含有することを特
徴とする制癌制。