JPH021156B2 - - Google Patents
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- JPH021156B2 JPH021156B2 JP56022276A JP2227681A JPH021156B2 JP H021156 B2 JPH021156 B2 JP H021156B2 JP 56022276 A JP56022276 A JP 56022276A JP 2227681 A JP2227681 A JP 2227681A JP H021156 B2 JPH021156 B2 JP H021156B2
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- anticancer substance
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
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- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Description
本発明は新規な制癌性物質、更に詳細にはフソ
バクテリウム属に属する菌を培養し、この培養液
から得られる制癌作用を有する有効画分を蛋白質
分解酵素による酵素処理に付して得られる制癌性
物質TF―340及びその塩に関する。更にまた、本
発明はこの制癌性物質TF―340及びその塩を製造
する方法並びにこれを含有する制癌剤に関する。 近年各種の癌患者の治療法において、宿主の免
疫機能を亢進させ、免疫機能の助けを借りながら
制癌効果を発現させる治療法が盛んとなつてき
た。かかる療法に使用される薬剤としては、各種
細菌の菌体、菌体培養物から得られる成分、ある
いは担子菌の子実体又はその培養菌体から得られ
る多糖体が知られている。しかし嫌気性菌を培養
し、その培養液から優れた制癌作用を有する成分
の研究は少なく、特にフソバクテリウム属に属す
る菌を培養し、その培養液から得られる成分並び
にその制癌作用については未だ知られていない。 本発明者は、ヒト口腔内より分離したフソバク
テリウム属に属する菌を培養し、その培養液から
菌体を除去した上清液から採取される成分につい
てその薬理作用を調べていたところ、特定の成分
が強い制癌作用を有すること、しかもこれは、コ
ロニー形成抑制法においては癌細胞の集落形成阻
止作用は小さく、殺菌胞による制癌作用でははな
く、宿主介在性あるいは宿主の免疫力を亢進さ
せ、免疫力の助けを借りながら間接的に制癌作用
を発現させる作用を有するものであることを見い
だした。そして得られた制癌作用を有する有効画
分を更に蛋白質分解酵素による酵素処理に付して
得られる特定の成分は、同様に好ましい制癌作用
を有し、かつ副作用が少ない等制癌剤として好ま
しい性質を有することを見いだし本発明を完成し
た。 本発明で利用される菌としては、菌を培養した
上清液から得られる制癌作用を有する有効画分を
蛋白質分解酵素による酵素処理に付せば制癌性物
質TF―340を生成するフソバクテリウム属に属す
る菌であればよく、好適なものとしてはフソバク
テリウム・ヌクレアタムが挙げられる。具体的に
は、例えば、フソバクテリウム・ヌクレアタム
TF―031（FERM―ＰNo.5077、ATCC―31647）
および微生物学の一般常識としてその性質を有す
る菌株、すなわち、自然変異株あるいは人工的に
改良された菌株等が利用される。 フソバクテリウム・ヌクレアタムTF―031の菌
学的性状を記載すれば以下のとおりである。 (1) 形態 細胞の形：紡錘形（第１図） 細胞の多形性の有無：なし 運動性の有無：なし 胞子の有無：なし グラム染色：グラム陰性 抗酸性：陰性 (2) 培地における生育状態 TF―ａ寒天平板及び斜面培地 外形：円形 大きさ：約１mm 隆起：半球状 構造：露滴状 表面：平滑 辺緑：平滑 色：乳黄白色 透明度：不透明 TF―ａ液体培地 発育の程度：旺盛 濁り：凝塊 沈殿：なし 表面の発育：なし、約５mmまでは発育なし ガス：なし (3) 生理学的性質 硫化水素の生成：＋ 硝酸塩の還元：− 酪酸の生成：＋ インドールの生成：＋ ウレアーゼ：− カタラーゼ：− デンプンの加水分解：− 酸素に対する態度：嫌気性 アンモニアの生成：＋ 炭酸ガスの生成：＋ 生育の範囲：PH５〜8.5 温度30〜45℃ 糖からのガスの生成 Ｌ―アラビノース（−）、Ｄ―キシロース
（−）、Ｄ―グルコース（−）、Ｄ―マンノース
（−）、Ｄ―フラクトース（−）、Ｄ―ガラクトー
ス（−）、麦芽糖（−）、シヨ糖（−）、トレハロ
ース（−）、シルビツト（−）、マンニトール
（−）、イノシツト（−）、グリセリン（−）、デン
プン（−） 以上の諸性状をバージーズ・マニユアル・オ
ブ・デイタミネイテイブ・バクテリオロジー第８
版に照らして検討すると、本菌株はフソバクテリ
ウム・ヌクレアタム（Fusobacterium
nucleatum）に酷似し、これに属する。 つぎに本発明の制癌性物質TF―340の製造法の
一例を図式化して説明すれば、次のとおりであ
る。
バクテリウム属に属する菌を培養し、この培養液
から得られる制癌作用を有する有効画分を蛋白質
分解酵素による酵素処理に付して得られる制癌性
物質TF―340及びその塩に関する。更にまた、本
発明はこの制癌性物質TF―340及びその塩を製造
する方法並びにこれを含有する制癌剤に関する。 近年各種の癌患者の治療法において、宿主の免
疫機能を亢進させ、免疫機能の助けを借りながら
制癌効果を発現させる治療法が盛んとなつてき
た。かかる療法に使用される薬剤としては、各種
細菌の菌体、菌体培養物から得られる成分、ある
いは担子菌の子実体又はその培養菌体から得られ
る多糖体が知られている。しかし嫌気性菌を培養
し、その培養液から優れた制癌作用を有する成分
の研究は少なく、特にフソバクテリウム属に属す
る菌を培養し、その培養液から得られる成分並び
にその制癌作用については未だ知られていない。 本発明者は、ヒト口腔内より分離したフソバク
テリウム属に属する菌を培養し、その培養液から
菌体を除去した上清液から採取される成分につい
てその薬理作用を調べていたところ、特定の成分
が強い制癌作用を有すること、しかもこれは、コ
ロニー形成抑制法においては癌細胞の集落形成阻
止作用は小さく、殺菌胞による制癌作用でははな
く、宿主介在性あるいは宿主の免疫力を亢進さ
せ、免疫力の助けを借りながら間接的に制癌作用
を発現させる作用を有するものであることを見い
だした。そして得られた制癌作用を有する有効画
分を更に蛋白質分解酵素による酵素処理に付して
得られる特定の成分は、同様に好ましい制癌作用
を有し、かつ副作用が少ない等制癌剤として好ま
しい性質を有することを見いだし本発明を完成し
た。 本発明で利用される菌としては、菌を培養した
上清液から得られる制癌作用を有する有効画分を
蛋白質分解酵素による酵素処理に付せば制癌性物
質TF―340を生成するフソバクテリウム属に属す
る菌であればよく、好適なものとしてはフソバク
テリウム・ヌクレアタムが挙げられる。具体的に
は、例えば、フソバクテリウム・ヌクレアタム
TF―031（FERM―ＰNo.5077、ATCC―31647）
および微生物学の一般常識としてその性質を有す
る菌株、すなわち、自然変異株あるいは人工的に
改良された菌株等が利用される。 フソバクテリウム・ヌクレアタムTF―031の菌
学的性状を記載すれば以下のとおりである。 (1) 形態 細胞の形：紡錘形（第１図） 細胞の多形性の有無：なし 運動性の有無：なし 胞子の有無：なし グラム染色：グラム陰性 抗酸性：陰性 (2) 培地における生育状態 TF―ａ寒天平板及び斜面培地 外形：円形 大きさ：約１mm 隆起：半球状 構造：露滴状 表面：平滑 辺緑：平滑 色：乳黄白色 透明度：不透明 TF―ａ液体培地 発育の程度：旺盛 濁り：凝塊 沈殿：なし 表面の発育：なし、約５mmまでは発育なし ガス：なし (3) 生理学的性質 硫化水素の生成：＋ 硝酸塩の還元：− 酪酸の生成：＋ インドールの生成：＋ ウレアーゼ：− カタラーゼ：− デンプンの加水分解：− 酸素に対する態度：嫌気性 アンモニアの生成：＋ 炭酸ガスの生成：＋ 生育の範囲：PH５〜8.5 温度30〜45℃ 糖からのガスの生成 Ｌ―アラビノース（−）、Ｄ―キシロース
（−）、Ｄ―グルコース（−）、Ｄ―マンノース
（−）、Ｄ―フラクトース（−）、Ｄ―ガラクトー
ス（−）、麦芽糖（−）、シヨ糖（−）、トレハロ
ース（−）、シルビツト（−）、マンニトール
（−）、イノシツト（−）、グリセリン（−）、デン
プン（−） 以上の諸性状をバージーズ・マニユアル・オ
ブ・デイタミネイテイブ・バクテリオロジー第８
版に照らして検討すると、本菌株はフソバクテリ
ウム・ヌクレアタム（Fusobacterium
nucleatum）に酷似し、これに属する。 つぎに本発明の制癌性物質TF―340の製造法の
一例を図式化して説明すれば、次のとおりであ
る。
【表】
上記の製造法を具体的に示すと次の通りであ
る。 (1) 培養及び培養液から得られる有効画分の分離
工程 (a) 培養 フソバクテリウム属に属する菌の培養は、通常
の嫌気性菌の培養方法によつて行われる。即ち、
牛の脳、心臓抽出物、各種ペプトン類等の窒素
源；イースト・エクストラクト等のビタミン源；
塩化ナトリウム等の無機塩類；グルコース、ラク
トース等の炭素源；Ｌ―シスチン、亜硫酸ナトリ
ウム、チオグリコレート・ナトリウム等の還元剤
を含むような培地を水酸化ナトリウムでPH６〜
8.5好ましくは7.2〜8.2に調整し、菌を植えつけ、
嫌気的条件下、35〜42℃好ましくは36〜38℃で１
〜５日、好ましくは１〜４日静置あるいは撹拌培
養を行う。あるいは１〜２日、35〜42℃好ましく
は36〜38℃で培養後25〜35℃で更に１〜４日培養
してもよい。特に、下記成分表に記載の培地（以
下TF培地と称する）を使用するのが好ましい。
しかし、窒素源として、牛の脳、心臓抽出物のプ
レイン・ハート・インヒユージヨンは必ずしも必
要ではなく、牛の心臓抽出物であるハート・イン
ヒユージヨン、牛肉エキス、魚肉エキス、トウモ
ロコシより抽出されたコーンステイプリカ等を代
用してもよく、また各種ペプトンにおいてプロテ
オース・ペプトン、フアイトン・ペプトンは必ず
しも必要ではなく、またトリプトケース・ペプト
ンをポリペプトンで代用することもできる。 尚、寒天を使用しないときは撹拌培養を行うの
が好ましい。
る。 (1) 培養及び培養液から得られる有効画分の分離
工程 (a) 培養 フソバクテリウム属に属する菌の培養は、通常
の嫌気性菌の培養方法によつて行われる。即ち、
牛の脳、心臓抽出物、各種ペプトン類等の窒素
源；イースト・エクストラクト等のビタミン源；
塩化ナトリウム等の無機塩類；グルコース、ラク
トース等の炭素源；Ｌ―シスチン、亜硫酸ナトリ
ウム、チオグリコレート・ナトリウム等の還元剤
を含むような培地を水酸化ナトリウムでPH６〜
8.5好ましくは7.2〜8.2に調整し、菌を植えつけ、
嫌気的条件下、35〜42℃好ましくは36〜38℃で１
〜５日、好ましくは１〜４日静置あるいは撹拌培
養を行う。あるいは１〜２日、35〜42℃好ましく
は36〜38℃で培養後25〜35℃で更に１〜４日培養
してもよい。特に、下記成分表に記載の培地（以
下TF培地と称する）を使用するのが好ましい。
しかし、窒素源として、牛の脳、心臓抽出物のプ
レイン・ハート・インヒユージヨンは必ずしも必
要ではなく、牛の心臓抽出物であるハート・イン
ヒユージヨン、牛肉エキス、魚肉エキス、トウモ
ロコシより抽出されたコーンステイプリカ等を代
用してもよく、また各種ペプトンにおいてプロテ
オース・ペプトン、フアイトン・ペプトンは必ず
しも必要ではなく、またトリプトケース・ペプト
ンをポリペプトンで代用することもできる。 尚、寒天を使用しないときは撹拌培養を行うの
が好ましい。
【表】
(b) 培養液から上清液の採取（菌体の除去）
上で得た培養液から菌体を除去して上清液を得
る。菌体の除去は常法、例えば遠心分離、ハイフ
ロスーパーセル等の過助剤を用いる過法を採
用できるが、特に遠心分離法は操作、菌の除去度
合、上清液の収量の点で好ましい。 (c) 制癌性物質TF―240の採取 上で得られた上清液に親水性有機溶媒を加え
て、生ずる沈殿物を採取する。この際の上清液は
PH５〜７好ましくはPH２付近（PH1.5〜2.5）に調
整する。親水性有機溶媒としては、例えばエタノ
ール、メタノール等のアルコール類、アセトン等
のケトン類が挙げられるが、アルコール類特にエ
タノールが最もよい結果を与える。この親水性有
機溶媒はその濃度が30〜80％（容量比）、好まし
くは50〜80％（容量比）になるように添加するの
が好適である。親水性有機溶媒を加えた後、低
温、好ましくは約4゜〜５℃の温度で数時間〜数日
間放置し、沈殿物の生成を完結させる。 このようにして生じた沈殿物をデカンテーシヨ
ン、遠心分離、過等の通常の操作で分離する。 次いで、この沈殿物に一般には５〜20倍量の水
を加え、PHにより分割する。例えば、PH7.5〜８
に調整した後、PH４付近（PH3.5〜4.5）に調整し
水不溶部と水可溶部を遠心分離、過等の通常の
方法で分離する。このようにして得られた水可溶
部を更にPH２付近（PH1.5〜2.5）に調整して生ず
る沈殿物をその水可溶部と遠心分離、過等の通
常の方法によつて分離し、沈殿物を採取すれば有
効画分TF―240が得られる。上記のようにして得
られる制癌性物質TF―240は次のような性状を有
する。 (イ) 白灰色ないし淡褐色の粉末。 (ロ) マウスのエールリツヒ腹水型癌、エールリツ
ヒ結節型癌、ザルコーマー180癌細胞およびＢ
―16メラノーマ癌細胞の増殖を阻止し、免疫賦
活作用を有する。 (ハ) メタノール、エタノール、アセトン、ベンゼ
ン、クロロホルム、酢酸エチル、ジエチルエー
テルに不溶。 (ニ) 明確な融点を示さず200℃〜215℃で分解す
る。 (ホ) KBr錠剤法による赤外線吸収スペクトルは、
3600〜3200、2950〜2920、1680〜1620、1550〜
1520、1410〜1360、1280〜1210、1060、960お
よび820cm-1の近傍に吸収帯を有する（第２
図）。 (ヘ) PH７の水溶液の紫外線吸収スペクトルは吸収
末端に強い吸収があり、また250〜265nmの近
傍に吸収を示す（第３図）。 (ト) モーリツシユ反応、フエノール硫酸反応、ア
ンスロン硫酸反応、インドール塩酸反応、ロウ
リー・フオリン反応は陽性。 (チ) 元素分析値 Ｃ：35％〜38％ H4％〜５％ Ｎ：12％〜14％ (リ) フエノール硫酸法による糖の含有率は約15％
〜35％（グルコース換算）、およびロウリー・
フオリン法による蛋白質の含有率は約20〜30％
（牛血清アルブミン換算）である。 (2) 酵素処理及び目的物の採取工程 まず、上記の如くして得られた制癌作用を有す
る画分を水または緩衝液に溶解又は懸濁し、蛋白
質分解酵素を加え、常法に従つて酵素処理を行
う。 蛋白質分解酵素としては、プロナーゼ、パパイ
ン、トリプシンおよびキモトリプシン等が挙げら
れ、好ましくはプロナーゼおよびトリプシンが挙
げられる。酵素処理にあたつてあるいは酵素処理
中、水溶液をPH７〜８に調整保持するのが好まし
く、そのためには、水酸化ナトリウム、水酸化カ
リウム、炭酸ソーダ、重炭酸ソーダ等が用いられ
る。また、酵素処理中、反応液の腐敗を防止する
ために、クロロホルム、トルエン等の有機溶媒を
少量添加するのが望ましい。そして、酵素の使用
量は、通常は酵素処理に付す粉末（固体）に対し
て、約１〜２％（重量比）付近の量が使用され
る。 上記酵素処理は通常30〜40℃にて１〜72時間、
好ましくは24〜48時間行う。また、例えば粉体
（固体）に対して酵素約１％（重量比）を加えて、
１〜24時間酵素処理を行い、更に約１％（重量
比）の酵素を加えて酵素処理を行つてもよい。 上記酵素処理後、制癌性物質TF―340の画分を
採取する。TF―340の画分を採取するには、例え
ばPHによる分割法、親水性有機溶媒による沈殿別
法およびイオン交換体による分割法等を１つ以上
組み合わせ処理すればよい。具体的にその採取方
法を例示すれば、上記酵素処理液をPH2.5以下に
調整し（所望により、トリクロロ酢酸を添加して
もよい）生ずる沈殿物を除去し、可溶部に親水性
有機溶媒、例えばアルコールを30〜80％（容量
比）、好ましくは60〜80％（容量比）になるよう
に加え、生ずる目的の有効画分の沈殿物を採取
し、所望により、ついでこの沈殿物を例えばダウ
エツクス１―Ｘ（商品名）、アンバーライトIRA―
400（商品名）等の強塩基性陰イオン交換体等で処
理して（この操作は数回行つてもよい）その非吸
着画分を採取し、常法によつて濃縮、乾燥あるい
は親水性有機溶媒による沈殿法等の処理をすれ
ば、本発明の制癌性物質TF―340が得られる。 上記のようにして得られる制癌性物質TF―340
の性状は次のとおりである。 (イ) 白灰色ないし淡褐色の粉末。 (ロ) マウスのエールリツヒ腹水型癌の増殖を阻止
し、免疫賦活作用を有する。 (ハ) 水に溶解し、メタノール、エタノール、アセ
トン、ベンゼン、クロロホルム、酢酸エチル、
ジエチルエーテルに不溶。 (ニ) 明確な融点を示さず、約140℃より分解を始
め、200℃以上で著しく分解する。 (ホ) KBr錠剤法による赤外線吸収スペクトルは、
3500〜3300、2920，2850、1660〜1640、1580〜
1520、1460〜1440、1410〜1340、1250〜1220、
1120〜1030、970および835cm-1の近傍に吸収帯
を有する。（第４図） (ヘ) PH７の水溶液の紫外線吸収スペクトルは吸収
末端に強い吸収があり、また250〜265nmの近
傍に吸収を示す。（第５図） (ト) TSK―GEL G3000SW（東洋曹達株式会社の
商品名、カラム：7.5mmφ×600mm×２）による
高速液体クロマトグラム（溶出液：PHの0.11モ
ルリン酸緩衝液、流速0.8ml／分、室温）は
220nmの紫外線吸収度測定においては、溶媒先
端部分、36〜62分付近にかけて吸収を有し、
260nmの紫外線吸光度測定においては溶媒先端
部分、34〜62分付近にかけて吸収を有する。
（第６図） (チ) モーリツシユ反応、フエノール硫酸反応、ア
ンスロン硫酸反応、インドール塩酸反応、ロウ
リー・フオリン反応は陽性、ニンヒドリン反応
は陰性。 (リ) 元素分析値 Ｃ：32％〜34％ Ｈ：４％〜６％ Ｎ：３％〜５％ （ヌ） フエノール硫酸法による糖の含有率は約
20％〜50％（グルコース換算）、およびロウリ
ー・フオリン法による蛋白質の含有率は約10％
以下（牛血清アルブミン換算）である。 （ル） 分子量 数1000以上であるが、特定は極めて困難であ
る。 上記の如くして得られた制癌性物質TF―340
は、常法に従つて医薬上許容される非毒性塩とし
てもよい。具体的には例えばナトリウム塩、カリ
ウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カ
ルシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられ
る。 次に本発明の制癌性物質TF―340の薬理作用を
示せば次のとおりである。 (1) 免疫賦活作用 一群４匹のICR系マウスを用い、被検物質を生
理食塩水に溶解させ、その溶液を0.2ml腹腔内投
与した。投与24時間後にPerikan Drawing
Ink17Black（ギユンター・ワグナー社製）１mlと
ゼラチン３％含有生理食塩水２mlを混合して調製
したカーボン浮遊液0.2mlをマウス尾静脈から注
入し、注入後１，５，10および15分後に眼窩から
ヘパリン被覆へマトクリツト毛細管を用いて血液
0.02mlを採取し、直ちに0.1％炭酸ナトリウム水
溶液1.6mlに希釈溶血させ、これを波長675nmで
比色し貧食係数（phagocytotic index）：Ｋ値を
Halpernらの数式により求めた。 また対照群には生理食塩水0.2mlを投与した。 Ｋ＝log Co―log Ｃ／ｔ―to （Co＝to時の血中炭末量、Ｃ＝ｔ時の血中炭
末量） その結果は表―１のとおりである。
る。菌体の除去は常法、例えば遠心分離、ハイフ
ロスーパーセル等の過助剤を用いる過法を採
用できるが、特に遠心分離法は操作、菌の除去度
合、上清液の収量の点で好ましい。 (c) 制癌性物質TF―240の採取 上で得られた上清液に親水性有機溶媒を加え
て、生ずる沈殿物を採取する。この際の上清液は
PH５〜７好ましくはPH２付近（PH1.5〜2.5）に調
整する。親水性有機溶媒としては、例えばエタノ
ール、メタノール等のアルコール類、アセトン等
のケトン類が挙げられるが、アルコール類特にエ
タノールが最もよい結果を与える。この親水性有
機溶媒はその濃度が30〜80％（容量比）、好まし
くは50〜80％（容量比）になるように添加するの
が好適である。親水性有機溶媒を加えた後、低
温、好ましくは約4゜〜５℃の温度で数時間〜数日
間放置し、沈殿物の生成を完結させる。 このようにして生じた沈殿物をデカンテーシヨ
ン、遠心分離、過等の通常の操作で分離する。 次いで、この沈殿物に一般には５〜20倍量の水
を加え、PHにより分割する。例えば、PH7.5〜８
に調整した後、PH４付近（PH3.5〜4.5）に調整し
水不溶部と水可溶部を遠心分離、過等の通常の
方法で分離する。このようにして得られた水可溶
部を更にPH２付近（PH1.5〜2.5）に調整して生ず
る沈殿物をその水可溶部と遠心分離、過等の通
常の方法によつて分離し、沈殿物を採取すれば有
効画分TF―240が得られる。上記のようにして得
られる制癌性物質TF―240は次のような性状を有
する。 (イ) 白灰色ないし淡褐色の粉末。 (ロ) マウスのエールリツヒ腹水型癌、エールリツ
ヒ結節型癌、ザルコーマー180癌細胞およびＢ
―16メラノーマ癌細胞の増殖を阻止し、免疫賦
活作用を有する。 (ハ) メタノール、エタノール、アセトン、ベンゼ
ン、クロロホルム、酢酸エチル、ジエチルエー
テルに不溶。 (ニ) 明確な融点を示さず200℃〜215℃で分解す
る。 (ホ) KBr錠剤法による赤外線吸収スペクトルは、
3600〜3200、2950〜2920、1680〜1620、1550〜
1520、1410〜1360、1280〜1210、1060、960お
よび820cm-1の近傍に吸収帯を有する（第２
図）。 (ヘ) PH７の水溶液の紫外線吸収スペクトルは吸収
末端に強い吸収があり、また250〜265nmの近
傍に吸収を示す（第３図）。 (ト) モーリツシユ反応、フエノール硫酸反応、ア
ンスロン硫酸反応、インドール塩酸反応、ロウ
リー・フオリン反応は陽性。 (チ) 元素分析値 Ｃ：35％〜38％ H4％〜５％ Ｎ：12％〜14％ (リ) フエノール硫酸法による糖の含有率は約15％
〜35％（グルコース換算）、およびロウリー・
フオリン法による蛋白質の含有率は約20〜30％
（牛血清アルブミン換算）である。 (2) 酵素処理及び目的物の採取工程 まず、上記の如くして得られた制癌作用を有す
る画分を水または緩衝液に溶解又は懸濁し、蛋白
質分解酵素を加え、常法に従つて酵素処理を行
う。 蛋白質分解酵素としては、プロナーゼ、パパイ
ン、トリプシンおよびキモトリプシン等が挙げら
れ、好ましくはプロナーゼおよびトリプシンが挙
げられる。酵素処理にあたつてあるいは酵素処理
中、水溶液をPH７〜８に調整保持するのが好まし
く、そのためには、水酸化ナトリウム、水酸化カ
リウム、炭酸ソーダ、重炭酸ソーダ等が用いられ
る。また、酵素処理中、反応液の腐敗を防止する
ために、クロロホルム、トルエン等の有機溶媒を
少量添加するのが望ましい。そして、酵素の使用
量は、通常は酵素処理に付す粉末（固体）に対し
て、約１〜２％（重量比）付近の量が使用され
る。 上記酵素処理は通常30〜40℃にて１〜72時間、
好ましくは24〜48時間行う。また、例えば粉体
（固体）に対して酵素約１％（重量比）を加えて、
１〜24時間酵素処理を行い、更に約１％（重量
比）の酵素を加えて酵素処理を行つてもよい。 上記酵素処理後、制癌性物質TF―340の画分を
採取する。TF―340の画分を採取するには、例え
ばPHによる分割法、親水性有機溶媒による沈殿別
法およびイオン交換体による分割法等を１つ以上
組み合わせ処理すればよい。具体的にその採取方
法を例示すれば、上記酵素処理液をPH2.5以下に
調整し（所望により、トリクロロ酢酸を添加して
もよい）生ずる沈殿物を除去し、可溶部に親水性
有機溶媒、例えばアルコールを30〜80％（容量
比）、好ましくは60〜80％（容量比）になるよう
に加え、生ずる目的の有効画分の沈殿物を採取
し、所望により、ついでこの沈殿物を例えばダウ
エツクス１―Ｘ（商品名）、アンバーライトIRA―
400（商品名）等の強塩基性陰イオン交換体等で処
理して（この操作は数回行つてもよい）その非吸
着画分を採取し、常法によつて濃縮、乾燥あるい
は親水性有機溶媒による沈殿法等の処理をすれ
ば、本発明の制癌性物質TF―340が得られる。 上記のようにして得られる制癌性物質TF―340
の性状は次のとおりである。 (イ) 白灰色ないし淡褐色の粉末。 (ロ) マウスのエールリツヒ腹水型癌の増殖を阻止
し、免疫賦活作用を有する。 (ハ) 水に溶解し、メタノール、エタノール、アセ
トン、ベンゼン、クロロホルム、酢酸エチル、
ジエチルエーテルに不溶。 (ニ) 明確な融点を示さず、約140℃より分解を始
め、200℃以上で著しく分解する。 (ホ) KBr錠剤法による赤外線吸収スペクトルは、
3500〜3300、2920，2850、1660〜1640、1580〜
1520、1460〜1440、1410〜1340、1250〜1220、
1120〜1030、970および835cm-1の近傍に吸収帯
を有する。（第４図） (ヘ) PH７の水溶液の紫外線吸収スペクトルは吸収
末端に強い吸収があり、また250〜265nmの近
傍に吸収を示す。（第５図） (ト) TSK―GEL G3000SW（東洋曹達株式会社の
商品名、カラム：7.5mmφ×600mm×２）による
高速液体クロマトグラム（溶出液：PHの0.11モ
ルリン酸緩衝液、流速0.8ml／分、室温）は
220nmの紫外線吸収度測定においては、溶媒先
端部分、36〜62分付近にかけて吸収を有し、
260nmの紫外線吸光度測定においては溶媒先端
部分、34〜62分付近にかけて吸収を有する。
（第６図） (チ) モーリツシユ反応、フエノール硫酸反応、ア
ンスロン硫酸反応、インドール塩酸反応、ロウ
リー・フオリン反応は陽性、ニンヒドリン反応
は陰性。 (リ) 元素分析値 Ｃ：32％〜34％ Ｈ：４％〜６％ Ｎ：３％〜５％ （ヌ） フエノール硫酸法による糖の含有率は約
20％〜50％（グルコース換算）、およびロウリ
ー・フオリン法による蛋白質の含有率は約10％
以下（牛血清アルブミン換算）である。 （ル） 分子量 数1000以上であるが、特定は極めて困難であ
る。 上記の如くして得られた制癌性物質TF―340
は、常法に従つて医薬上許容される非毒性塩とし
てもよい。具体的には例えばナトリウム塩、カリ
ウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カ
ルシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられ
る。 次に本発明の制癌性物質TF―340の薬理作用を
示せば次のとおりである。 (1) 免疫賦活作用 一群４匹のICR系マウスを用い、被検物質を生
理食塩水に溶解させ、その溶液を0.2ml腹腔内投
与した。投与24時間後にPerikan Drawing
Ink17Black（ギユンター・ワグナー社製）１mlと
ゼラチン３％含有生理食塩水２mlを混合して調製
したカーボン浮遊液0.2mlをマウス尾静脈から注
入し、注入後１，５，10および15分後に眼窩から
ヘパリン被覆へマトクリツト毛細管を用いて血液
0.02mlを採取し、直ちに0.1％炭酸ナトリウム水
溶液1.6mlに希釈溶血させ、これを波長675nmで
比色し貧食係数（phagocytotic index）：Ｋ値を
Halpernらの数式により求めた。 また対照群には生理食塩水0.2mlを投与した。 Ｋ＝log Co―log Ｃ／ｔ―to （Co＝to時の血中炭末量、Ｃ＝ｔ時の血中炭
末量） その結果は表―１のとおりである。
【表】
表―１で明らかなように、対照群に比し、TF
―340物質投与群は網内系マクロフアージが活性
化され正常マウスの細胞性免疫が増大した。 (2) 制癌作用 エールリツヒ腹水型腫瘍における抗腫瘍効果 ICR系マウス（雌、６週令）にエールリツヒ腹
水型癌細胞をマウス１匹当り１×105個腹腔内接
種した。ついで被検物質を生理食塩水に溶解さ
せ、その溶液0.2mlを癌細胞接種後１日目から、
１日１回、７日間連続腹腔内投与した。また対照
群には生理食塩水0.2ml／１回を同様に投与した。 その結果は表―２のとおりである。 Ｔ／Ｃ＝投与群の生存日数／対照群の生存日数×100
（％）
―340物質投与群は網内系マクロフアージが活性
化され正常マウスの細胞性免疫が増大した。 (2) 制癌作用 エールリツヒ腹水型腫瘍における抗腫瘍効果 ICR系マウス（雌、６週令）にエールリツヒ腹
水型癌細胞をマウス１匹当り１×105個腹腔内接
種した。ついで被検物質を生理食塩水に溶解さ
せ、その溶液0.2mlを癌細胞接種後１日目から、
１日１回、７日間連続腹腔内投与した。また対照
群には生理食塩水0.2ml／１回を同様に投与した。 その結果は表―２のとおりである。 Ｔ／Ｃ＝投与群の生存日数／対照群の生存日数×100
（％）
【表】
(3) 急性毒性
マウス（ICR系、♀、６週令：iv投与）におけ
るLD50値は200mg／Kg以上であつた。 以上の薬理実験から明らかなように、本発明方
法によつて得られた制癌性物質TF―340は、制癌
剤として有用なものであり、各種の癌疾患に使用
され効果が期待される。 本発明の制癌性物質TF―340は、そのままある
いは非毒性塩として常法により経口、注射、坐薬
等の剤形として利用される。経口剤としては、
種々の賦形剤を含んでもよく、カプセル剤、錠
剤、散剤、顆粒剤とすることができる。また注射
剤としては、皮下、筋肉内、静脈内注射剤のいず
れでもよく、懸濁液、溶液もしくは使用時溶解さ
せる粉末等の剤形が用いられる。また注射剤には
局所麻酔剤を含んでいてもよい。 本発明の制癌性物質TF―340及びその非毒性塩
を患者に使用する場合、その投与量は患者の症状
に応じて適宜選択されるが、一般に成人では0.01
〜50mg／Kgを１日１〜数回に分け投与するのが好
ましく、投与方法としては経口又は皮下、筋肉
内、静脈内もしくは患部への注射によるのが好ま
しい。 次に本発明の実施例及び製剤例を挙げて説明す
る。 実施例 １ (1) 10のジヤー・フアメンター（丸菱理化研究
所製）に、１の蒸留水に対し、トリプトケー
ス・ペプトン17ｇ、ハート・インヒユージヨン
10ｇ、イースト・エクストラクト３ｇ、食塩
7.5ｇ、グルコース12ｇ、ラクトース10ｇ、亜
硫酸ナトリウム0.1ｇおよびチオグリコレー
ト・ナトリウム0.5ｇを含有するTF―ｅ培地８
を加え、120℃で30分間滅菌する。培養液に
冷却後、窒素ガスを100ml／分にて１時間通気
する。あらかじめ上述のTF―ｅ培地にて前培
養したフソバクテリウム・ヌクレアタムTF―
031（FERM―ＰNo.5077，ATCC―31647）の前
培養液１を滅菌条件下で接種する。培養は37
℃で窒素ガスを流入（65ml／分）しながら、撹
拌（30rpm）下、３日間おこなう。培養終了
後、培養液にセライト160ｇおよびセルロース
パウダー80ｇを加え撹拌し、これを減圧下で
過し、除菌した培養液上清液7.8を得た。 (2) (1)で得られた培養液上清7.8に濃塩酸117ml
を加え、PH2.0に調整した後、エタノール11.7
を加え、60％エタノール溶液とし、４℃で24
時間放置する。次いで、デカンテーシヨンにて
溶液部分を除き、沈殿物を採取するために４℃
で遠心分離（６×103rpm、５分）する。この
沈殿物をPH2.0の60％エタノール水溶液400ml、
エタノール400ml、アセトン200mlおよびジエチ
ルエーテル200mlで順次洗浄した後、減圧乾燥
して粉末3.9ｇを得る。 (3) (2)で得られた粉末を水25mlに懸濁し、1N―
水酸化ナトリウム水溶液を加えPH7.5〜8.0とな
し、室温で30分間撹拌した後、1N―塩酸を加
えPH6.0に調整する。次いで、氷冷下、２時間
撹拌した後、遠心分離（１×104rpm、10分）
し、沈殿物と上清液を分離する。この沈殿物を
PH6.0に調整した水５mlで洗浄し、沈殿物と洗
浄液を遠心分離（１×104rpm、10分）し、先
に得られた上清液と洗浄液を合わせ、この溶液
に1N―塩酸を加えてPH4.0に調整した後、５℃
以下で12時間放置する。次いで、遠心分離（１
×104rpm、10分）し、沈殿物と上清液を分離
する。この沈殿物をPH4.0に調整した水５mlで
洗浄し、沈殿物と洗浄液を遠心分離（１×
104rpm、10分）し、洗浄液と先に得られた上
清液を合わせ、この溶液に1N―塩酸を加えて
PH2.0に調整した後、氷水冷却下２時間放放置
する。次いで、遠心分離（６×103rpm、10分）
し、沈殿物と上清液に分離する。この沈殿物を
PH2.0に調整した水３mlで洗浄し、沈殿物と洗
浄液を遠心分離（６×103rpm、10分）し、沈
殿物をエタノール５mlで洗浄した後、減圧乾燥
して制癌性物質TF―240を0.11ｇ得る。 (4) 上記(1)，(2)，(3)のようにして得られた制癌性
物質TF―240の0.9ｇを水10mlに懸濁し、撹拌
下に1N―水酸化ナトリウム水溶液を加えてPH
7.8に調整する。37℃に加温し、プロナーゼＥ
（科研化学製商品名；1000000チロジン単位／
ｇ）９mgを添加した後、トルエンを数滴加え
て、撹拌下、PH7.8〜8.0、37〜40℃で24時間酵
素処理を行う。処理液を遠心分離（4000rpm、
10分）し、上清液と沈殿物を分離し、沈殿物に
PH8.0に調整した水３mlを加え、遠心分離
（4000rpm、10分）し、沈殿物と洗浄液を分離
する。洗浄液に先に上清液を合わせて、これに
1N―塩酸を加えてPH2.0に調整すれば沈殿が析
出する。この溶液を５℃で12時間放置した後、
遠心分離（１×104rpm、10分）し、上清液と
沈殿物に分離し、沈殿物にPH2.0に調整した水
５mlを加え、遠心分離（１×104rpm、10分）
し、沈殿物と洗浄液を分離する。洗浄液に先の
上清液を合わせて、エタノールを加え80％エタ
ノール溶液とし、氷冷下で２時間撹拌した後、
遠心分離（１×104rpm、10分）し、沈殿物と
上清液を分離する。沈殿物を80％エタノール水
溶液５mlおよびエタノール５mlで順次洗浄した
後、減圧乾燥して制癌性物質TF―340の画分を
170mg得る。 この粉末150mgを水５mlに溶解させ、1N―水
酸化ナトリウム水溶液を加えてPH7.0に調整し、
あらかじめ1N―水酸化ナトリウム水溶液にて
OH型に調整したアンバーライトIRA400（ロー
ム・アンド・ハアス社製商品名）25mlを充填し
たカラムにかけ、水100mlを流した際のカラム
通過液を全て合わせて、1N―塩酸を加えてPH
7.0に調整する。これを減圧下に濃縮し孔径
0.3μｍのミリポアフイルター（日本ミリポア・
リミテツド製商品名）にて過、次いで凍結乾
燥して制癌性物質TF―340の凍結乾燥品を110
mg得る。 実施例 ２ (1) 10のジヤー・フアメンター（丸菱理化研究
所製）に、１の蒸留水に対し、トリプトケー
ス・ペプトン17ｇ、ハート・インヒユージヨン
20ｇ、イースト・エクストラクト３ｇ、食塩
7.5ｇ、グルコース12ｇ、ラクトース10ｇ、亜
硫酸ナトリウム0.1ｇおよびチオグリコレー
ト・ナトリウム0.5ｇを含有するTF―ｄ培地８
を加え、120℃で30分間滅菌する。培養液に
冷却後、窒素ガスを100ml／分にて１時間通気
する。あらかじめ上述のTF―ｄ培地にて前培
養したフソバクテリウム・ヌクレアタムTF―
031（FERM―ＰNo.5077、ATCC―31647）の前
培養液１を滅菌条件下で接種する。培養は37
℃で窒素ガスを流入（65ml／分）しながら、撹
拌（30rpm）下、３日間おこなう。培養終了
後、培養液にセライト160ｇおよびセルロース
パウダー80ｇを加え撹拌し、これを減圧下で
過し除菌した培養液上清7.8を得た。 (2) (1)で得られた培養液上清7.8に濃塩酸117ml
を加え、PH2.0に調整した後、エタノール11.7
を加え、60％エタノール溶液とし、４℃で24
時間放置する。次いで、デカンテーシヨンにて
溶液部分を除き、沈殿物を採取するために４℃
で遠心分離（６×103rpm、５分）する。この
沈殿物をPH2.0の60％エタノール水溶液400ml、
エタノール400ml、アセトン200mlおよびジエチ
ルエーテル200mlで順次洗浄した後、減圧乾燥
して粉末4.5ｇを得る。 (3) (2)で得られた粉末を水45mlに懸濁し、1N―
水酸化ナトリウム水溶液を加えPH7.5〜8.0とな
し、室温で30分間撹拌した後、1N―塩酸を加
えPH4.0に調整する。次いで遠心分離（１×
104rpm、10分）し、沈殿物と上清液を分離す
る。この沈殿物をPH4.0に調整した水５mlで洗
浄し、沈殿物と洗浄液を遠心分離（１×
104rpm、10分）し、洗浄液と先に得られた上
清液を合わせ、この溶液に1N―塩酸を加えて
PH2.0に調整した後、氷水冷却下２時間放置す
る。次いで遠心分離（６×103rpm、10分）し、
沈殿物と上清液を分離する。この沈殿物をPH
2.0に調整した水３mlで洗浄し、沈殿物と洗浄
液を遠心分離（６×103rpm、10分）し、沈殿
物をエタノール５mlで洗浄した後、減圧乾燥し
て制癌性物質TF―240を0.12ｇ得る。 (4) 上記(1)，(2)，(3)のようにして得られた制癌性
物質TF―240の0.9ｇを実施例１―(4)と同様に
処理して、制癌性物質TF―340の凍結乾燥品を
115mg得る。 実施例 ３ 実施例１―(3)で得られた制癌性物質TF―240の
0.9ｇを、プロナーゼＥの代りにトリプシン（デ
イフコ社製）９mgを用いて酵素処理する点、およ
び酵素処理後PH２に調整した水可溶部から沈殿物
を採取する際に、80％エタノール溶液の代りに60
％エタノール溶液とする点以外は実施例１―(4)と
同様に操作し、制癌性物質TF―340の凍結乾燥品
105mgを得る。 実施例 ４ 実施例１―(3)で得られた制癌性物質TF―240を
実施例１―(4)と同様に酵素処理した後、PH２に調
整した水可溶部から沈殿物を採取する際、80％エ
タノール溶液とする代りに60％エタノール溶液に
調整し、以後その実施例と同様の操作を行い制癌
性物質TF―340の凍結乾燥品を101mg得る。 実施例 ５ 実施例１―(3)で得られた制癌性物質TF―240
を、実施例１―(4)と同様に酵素処理した後、PH２
に調整した水可溶部から沈殿物を採取する代りに
40％トリクロロ酢酸を加え、トリクロロ酢酸の濃
度を10％としたときの水可溶部を80％エタノール
溶液に調整して沈殿物を採取し、以後その実施例
と同様の操作を行い制癌性物質TF―340の凍結乾
燥品を90mg得る。 制剤例 制癌性物質TF―340の凍結乾燥品１mgをバイア
ル瓶に充填した。これは使用時滅菌生理食塩水又
はリドカイン0.5％含有溶液等に溶解させ注射液
として用いる。
るLD50値は200mg／Kg以上であつた。 以上の薬理実験から明らかなように、本発明方
法によつて得られた制癌性物質TF―340は、制癌
剤として有用なものであり、各種の癌疾患に使用
され効果が期待される。 本発明の制癌性物質TF―340は、そのままある
いは非毒性塩として常法により経口、注射、坐薬
等の剤形として利用される。経口剤としては、
種々の賦形剤を含んでもよく、カプセル剤、錠
剤、散剤、顆粒剤とすることができる。また注射
剤としては、皮下、筋肉内、静脈内注射剤のいず
れでもよく、懸濁液、溶液もしくは使用時溶解さ
せる粉末等の剤形が用いられる。また注射剤には
局所麻酔剤を含んでいてもよい。 本発明の制癌性物質TF―340及びその非毒性塩
を患者に使用する場合、その投与量は患者の症状
に応じて適宜選択されるが、一般に成人では0.01
〜50mg／Kgを１日１〜数回に分け投与するのが好
ましく、投与方法としては経口又は皮下、筋肉
内、静脈内もしくは患部への注射によるのが好ま
しい。 次に本発明の実施例及び製剤例を挙げて説明す
る。 実施例 １ (1) 10のジヤー・フアメンター（丸菱理化研究
所製）に、１の蒸留水に対し、トリプトケー
ス・ペプトン17ｇ、ハート・インヒユージヨン
10ｇ、イースト・エクストラクト３ｇ、食塩
7.5ｇ、グルコース12ｇ、ラクトース10ｇ、亜
硫酸ナトリウム0.1ｇおよびチオグリコレー
ト・ナトリウム0.5ｇを含有するTF―ｅ培地８
を加え、120℃で30分間滅菌する。培養液に
冷却後、窒素ガスを100ml／分にて１時間通気
する。あらかじめ上述のTF―ｅ培地にて前培
養したフソバクテリウム・ヌクレアタムTF―
031（FERM―ＰNo.5077，ATCC―31647）の前
培養液１を滅菌条件下で接種する。培養は37
℃で窒素ガスを流入（65ml／分）しながら、撹
拌（30rpm）下、３日間おこなう。培養終了
後、培養液にセライト160ｇおよびセルロース
パウダー80ｇを加え撹拌し、これを減圧下で
過し、除菌した培養液上清液7.8を得た。 (2) (1)で得られた培養液上清7.8に濃塩酸117ml
を加え、PH2.0に調整した後、エタノール11.7
を加え、60％エタノール溶液とし、４℃で24
時間放置する。次いで、デカンテーシヨンにて
溶液部分を除き、沈殿物を採取するために４℃
で遠心分離（６×103rpm、５分）する。この
沈殿物をPH2.0の60％エタノール水溶液400ml、
エタノール400ml、アセトン200mlおよびジエチ
ルエーテル200mlで順次洗浄した後、減圧乾燥
して粉末3.9ｇを得る。 (3) (2)で得られた粉末を水25mlに懸濁し、1N―
水酸化ナトリウム水溶液を加えPH7.5〜8.0とな
し、室温で30分間撹拌した後、1N―塩酸を加
えPH6.0に調整する。次いで、氷冷下、２時間
撹拌した後、遠心分離（１×104rpm、10分）
し、沈殿物と上清液を分離する。この沈殿物を
PH6.0に調整した水５mlで洗浄し、沈殿物と洗
浄液を遠心分離（１×104rpm、10分）し、先
に得られた上清液と洗浄液を合わせ、この溶液
に1N―塩酸を加えてPH4.0に調整した後、５℃
以下で12時間放置する。次いで、遠心分離（１
×104rpm、10分）し、沈殿物と上清液を分離
する。この沈殿物をPH4.0に調整した水５mlで
洗浄し、沈殿物と洗浄液を遠心分離（１×
104rpm、10分）し、洗浄液と先に得られた上
清液を合わせ、この溶液に1N―塩酸を加えて
PH2.0に調整した後、氷水冷却下２時間放放置
する。次いで、遠心分離（６×103rpm、10分）
し、沈殿物と上清液に分離する。この沈殿物を
PH2.0に調整した水３mlで洗浄し、沈殿物と洗
浄液を遠心分離（６×103rpm、10分）し、沈
殿物をエタノール５mlで洗浄した後、減圧乾燥
して制癌性物質TF―240を0.11ｇ得る。 (4) 上記(1)，(2)，(3)のようにして得られた制癌性
物質TF―240の0.9ｇを水10mlに懸濁し、撹拌
下に1N―水酸化ナトリウム水溶液を加えてPH
7.8に調整する。37℃に加温し、プロナーゼＥ
（科研化学製商品名；1000000チロジン単位／
ｇ）９mgを添加した後、トルエンを数滴加え
て、撹拌下、PH7.8〜8.0、37〜40℃で24時間酵
素処理を行う。処理液を遠心分離（4000rpm、
10分）し、上清液と沈殿物を分離し、沈殿物に
PH8.0に調整した水３mlを加え、遠心分離
（4000rpm、10分）し、沈殿物と洗浄液を分離
する。洗浄液に先に上清液を合わせて、これに
1N―塩酸を加えてPH2.0に調整すれば沈殿が析
出する。この溶液を５℃で12時間放置した後、
遠心分離（１×104rpm、10分）し、上清液と
沈殿物に分離し、沈殿物にPH2.0に調整した水
５mlを加え、遠心分離（１×104rpm、10分）
し、沈殿物と洗浄液を分離する。洗浄液に先の
上清液を合わせて、エタノールを加え80％エタ
ノール溶液とし、氷冷下で２時間撹拌した後、
遠心分離（１×104rpm、10分）し、沈殿物と
上清液を分離する。沈殿物を80％エタノール水
溶液５mlおよびエタノール５mlで順次洗浄した
後、減圧乾燥して制癌性物質TF―340の画分を
170mg得る。 この粉末150mgを水５mlに溶解させ、1N―水
酸化ナトリウム水溶液を加えてPH7.0に調整し、
あらかじめ1N―水酸化ナトリウム水溶液にて
OH型に調整したアンバーライトIRA400（ロー
ム・アンド・ハアス社製商品名）25mlを充填し
たカラムにかけ、水100mlを流した際のカラム
通過液を全て合わせて、1N―塩酸を加えてPH
7.0に調整する。これを減圧下に濃縮し孔径
0.3μｍのミリポアフイルター（日本ミリポア・
リミテツド製商品名）にて過、次いで凍結乾
燥して制癌性物質TF―340の凍結乾燥品を110
mg得る。 実施例 ２ (1) 10のジヤー・フアメンター（丸菱理化研究
所製）に、１の蒸留水に対し、トリプトケー
ス・ペプトン17ｇ、ハート・インヒユージヨン
20ｇ、イースト・エクストラクト３ｇ、食塩
7.5ｇ、グルコース12ｇ、ラクトース10ｇ、亜
硫酸ナトリウム0.1ｇおよびチオグリコレー
ト・ナトリウム0.5ｇを含有するTF―ｄ培地８
を加え、120℃で30分間滅菌する。培養液に
冷却後、窒素ガスを100ml／分にて１時間通気
する。あらかじめ上述のTF―ｄ培地にて前培
養したフソバクテリウム・ヌクレアタムTF―
031（FERM―ＰNo.5077、ATCC―31647）の前
培養液１を滅菌条件下で接種する。培養は37
℃で窒素ガスを流入（65ml／分）しながら、撹
拌（30rpm）下、３日間おこなう。培養終了
後、培養液にセライト160ｇおよびセルロース
パウダー80ｇを加え撹拌し、これを減圧下で
過し除菌した培養液上清7.8を得た。 (2) (1)で得られた培養液上清7.8に濃塩酸117ml
を加え、PH2.0に調整した後、エタノール11.7
を加え、60％エタノール溶液とし、４℃で24
時間放置する。次いで、デカンテーシヨンにて
溶液部分を除き、沈殿物を採取するために４℃
で遠心分離（６×103rpm、５分）する。この
沈殿物をPH2.0の60％エタノール水溶液400ml、
エタノール400ml、アセトン200mlおよびジエチ
ルエーテル200mlで順次洗浄した後、減圧乾燥
して粉末4.5ｇを得る。 (3) (2)で得られた粉末を水45mlに懸濁し、1N―
水酸化ナトリウム水溶液を加えPH7.5〜8.0とな
し、室温で30分間撹拌した後、1N―塩酸を加
えPH4.0に調整する。次いで遠心分離（１×
104rpm、10分）し、沈殿物と上清液を分離す
る。この沈殿物をPH4.0に調整した水５mlで洗
浄し、沈殿物と洗浄液を遠心分離（１×
104rpm、10分）し、洗浄液と先に得られた上
清液を合わせ、この溶液に1N―塩酸を加えて
PH2.0に調整した後、氷水冷却下２時間放置す
る。次いで遠心分離（６×103rpm、10分）し、
沈殿物と上清液を分離する。この沈殿物をPH
2.0に調整した水３mlで洗浄し、沈殿物と洗浄
液を遠心分離（６×103rpm、10分）し、沈殿
物をエタノール５mlで洗浄した後、減圧乾燥し
て制癌性物質TF―240を0.12ｇ得る。 (4) 上記(1)，(2)，(3)のようにして得られた制癌性
物質TF―240の0.9ｇを実施例１―(4)と同様に
処理して、制癌性物質TF―340の凍結乾燥品を
115mg得る。 実施例 ３ 実施例１―(3)で得られた制癌性物質TF―240の
0.9ｇを、プロナーゼＥの代りにトリプシン（デ
イフコ社製）９mgを用いて酵素処理する点、およ
び酵素処理後PH２に調整した水可溶部から沈殿物
を採取する際に、80％エタノール溶液の代りに60
％エタノール溶液とする点以外は実施例１―(4)と
同様に操作し、制癌性物質TF―340の凍結乾燥品
105mgを得る。 実施例 ４ 実施例１―(3)で得られた制癌性物質TF―240を
実施例１―(4)と同様に酵素処理した後、PH２に調
整した水可溶部から沈殿物を採取する際、80％エ
タノール溶液とする代りに60％エタノール溶液に
調整し、以後その実施例と同様の操作を行い制癌
性物質TF―340の凍結乾燥品を101mg得る。 実施例 ５ 実施例１―(3)で得られた制癌性物質TF―240
を、実施例１―(4)と同様に酵素処理した後、PH２
に調整した水可溶部から沈殿物を採取する代りに
40％トリクロロ酢酸を加え、トリクロロ酢酸の濃
度を10％としたときの水可溶部を80％エタノール
溶液に調整して沈殿物を採取し、以後その実施例
と同様の操作を行い制癌性物質TF―340の凍結乾
燥品を90mg得る。 制剤例 制癌性物質TF―340の凍結乾燥品１mgをバイア
ル瓶に充填した。これは使用時滅菌生理食塩水又
はリドカイン0.5％含有溶液等に溶解させ注射液
として用いる。
第１図は本発明で用いるフソバクテリウム・ヌ
クレアタムTF―031の形態を示す顕微鏡写真、第
２図は制癌性物質TF―240の赤外線吸収スペクト
ル、第３図は同物質の紫外線吸収スペクトル、第
４図は制癌性物質TF―340の赤外線吸収スペクト
ル、第５図は同物質の紫外線吸収スペクトル、第
６図は同物質の高速液体クロマトグラムを示す。
クレアタムTF―031の形態を示す顕微鏡写真、第
２図は制癌性物質TF―240の赤外線吸収スペクト
ル、第３図は同物質の紫外線吸収スペクトル、第
４図は制癌性物質TF―340の赤外線吸収スペクト
ル、第５図は同物質の紫外線吸収スペクトル、第
６図は同物質の高速液体クロマトグラムを示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ フソバクテリウム属に属する制癌性物質TF
―340生産菌を培養し、その培養液から得られる
制癌作用を有する画分を、蛋白質分解酵素による
酵素処理に付して得られる次の性状を有する制癌
性物質TF―340及びその塩。 (イ) 白灰色ないし淡褐色の粉末。 (ロ) マウスのエールリツヒ腹水型癌の増殖を阻止
し免疫賦活作用を有する。 (ハ) 水に溶解し、メタノール、エタノール、アセ
トン、ベンゼン、クロロホルム、酢酸エチル、
ジエチルエーテルに不溶。 (ニ) 明確な融点を示さず、約140℃より分解を始
め、200℃以上で著しく分解する。 (ホ) KBr錠剤法による赤外線吸収スペクトルは、
3500〜3300、2920，2850、1660〜1640、1580〜
1520、1460〜1440、1410〜1340、1250〜1220、
1120〜1030、970および835cm-1の近傍に吸収帯
を有する。 (ヘ) PH７の水溶液の紫外線吸収スペクトルは、吸
収末端に強い吸収があり、また250〜265nmの
近傍に吸収を示す。 (ト) TSK―GEL Ｇ 3000SW（東洋曹達株式会社
の商品名、カラム：7.5mmφ×600mm×２）によ
る高速液体クロマトグラム（溶出液：PH７の
0.1モルリン酸緩衝液、流速0.8ml／分、室温）
は220nmの紫外線吸光度測定においては、溶媒
先端部分、36〜62分付近にかけて吸収を有し、
260nmの紫外線吸光度測定においては溶媒先端
部分、34〜62分付近にかけて吸収を有する。 (チ) モーリツシユ反応、フエノール硫酸反応、ア
ンスロン硫酸反応、インドール塩酸反応、ロウ
リー・フオリン反応は陽性、ニンヒドリン反応
は陰性 (リ) 元素分析値 Ｃ：32％〜34％ Ｈ：４％〜６％ Ｎ：３％〜５％ （ヌ） フエノール硫酸法による糖の含有率は、
約20％〜50％（グルコース換算）、およびロウ
リー・フオリン法による蛋白質の含有率は約10
％以下（牛血清アルブミン換算）である。 ２ フソバクテリウム属に属する制癌性物質TF
―340生産菌を培養して得た上清液に親水性有機
溶媒を加えて生ずる沈殿物の制癌作用を有する画
分を、蛋白質分解酵素による酵素処理に付して得
られたものである特許請求の範囲第１項記載の制
癌性物質TF―340及びその塩。 ３ フソバクテリウム属に属する制癌性物質TF
―340生産菌を培養して得た上清液に親水性有機
溶媒を加えて生ずる沈殿物をPHにより分割してPH
４付近からPH２付近において生ずる制癌作用を有
する沈殿物を蛋白質分解酵素による酵素処理に付
し、ついで制癌性物質TF―340の画分を採取して
得られる特許請求の範囲第１項又は第２項記載の
制癌性物質TF―340及びその塩。 ４ 蛋白質分解酵素による酵素処理が、プロナー
ゼ又はトリプシン処理である特許請求の範囲第１
〜３項いずれかの項記載の制癌性物質TF―340及
びその塩。 ５ フソバクテリウム属に属する制癌性物質TF
―340生産菌が、フソバクテリウム・ヌクレアタ
ムである特許請求の範囲第１〜４項いずれかの項
記載の制癌性物質TF―340及びその塩。 ６ フソバクテリウム属に属する制癌性物質TF
―340生産菌を培養して得た上清液に親水性有機
溶媒を加えて生ずる沈殿物の制癌作用を有する画
分を、蛋白質分解酵素による酵素処理に付すこと
を特徴とする制癌性物質TF―340及びその塩の製
造法。 ７ フソバクテリウム属に属する制癌性物質TF
―340生産菌を培養して得た上清液に親水性有機
溶媒を加えて生ずる沈殿物をPHにより分割して、
PH４付近からPH２付近において生ずる制癌作用を
有する沈殿物を蛋白質分解酵素による酵素処理に
付し、ついで制癌性物質TF―340の画分を採取す
ることを特徴とする特許請求の範囲第６項記載の
制癌性物質TF―340及びその塩の製造法。 ８ 酵素処理後、制癌性物質TF―340の画分を採
取する操作がPHによる分割法、親水性有機溶媒に
よる沈殿分別法又はイオン交換体による分割法の
１種以上を組み合わせて処理し、制癌性物質TF
―340の画分を採取する操作である特許請求の範
囲第７項記載の制癌性物質TF―340及びその塩の
製造法。 ９ 酵素処理後制癌性物質TF―340の画分を採取
する操作が蛋白質分解酵素による酵素処理後の水
可溶部をPHにより分割し、PH2.5以下に調整して
得られる水可溶部の画分に親水性有機溶媒を加
え、得られる沈殿物をイオン交換体により分割
し、その非吸着画分を採取する操作である特許請
求の範囲第７項又は第８項記載の制癌性物質TF
―340及びその塩の製造法。 １０ 上清液に親水性有機溶媒を加える操作が上
清液をPH２付近に調整した後親水性有機溶媒を加
える操作である特許請求の範囲第６〜９項いずれ
かの項記載の制癌性物質TF―340及びその塩の製
造法。 １１ 上清液に加える親水性有機溶媒がアルコー
ルである特許請求の範囲第６〜１０項いずれかの
項記載の制癌性物質TF―340及びその塩の製造
法。 １２ 親水性有機溶媒をその濃度が30％〜80％
（容量比）になるように上清液に加えることを特
徴とする特許請求の範囲第６〜１１項いずれかの
項記載の制癌性物質TF―340及びその塩の製造
法。 １３ 蛋白質分解酵素による酵素処理が、プロナ
ーゼ又はトリプシン処理である特許請求の範囲第
６〜１２項いずれかの項記載の制癌性物質TF―
340及びその塩の製造法。 １４ フソバクテリウム属に属する制癌性物質
TF―340生産菌を培養し、その培養液から得られ
る制癌作用を有する画分を蛋白質分解酵素による
酵素処理に付して得られる次の性状を有する制癌
性物質TF―340又はその塩を含有することを特徴
とする制癌剤。 (イ) 白灰色ないし淡褐色の粉末。 (ロ) マウスのエールリツヒ腹水型癌の増殖を阻止
し、免疫賦活作用を有する。 (ハ) 水に溶解し、メタノール、エタノール、アセ
トン、ベンゼン、クロロホルム、酢酸エチル、
ジエチルエーテルに不溶。 (ニ) 明確な融点を示さず、約140℃より分解を始
め、200℃以上で著しく分解する。 (ホ) KBr錠剤法による赤外線吸収スペクトルは、
3500〜3300、2920，2850、1660〜1640、1580〜
1520、1460〜1440、1410〜1340、1250〜1220、
1120〜1030、970および835cm-1の近傍に吸収帯
を有する。 (ヘ) PH７の水溶液の紫外線吸収スペクトルは吸収
末端に強い吸収があり、また250〜265nmの近
傍に吸収を示す。 (ト) TSK―GEL G3000SW（東洋曹達株式会社の
商品名、カラム：7.5mmφ×600mm×２）による
高速液体クロマトグラム（溶出液：PH７の0.1
モルリン酸緩衝液、流速0.8ml／分、室温）は
220nmの紫外線吸光度測定においては、溶媒先
端部分、36〜62分付近にかけて吸収を有し、
260nmの紫外線吸光度測定においては、溶媒先
端部分、34〜62分付近にかけて吸収を有する。 (チ) モーリツシユ反応、フエノール硫酸反応、ア
ンスロン硫酸反応、インドール塩酸反応、ロウ
リー・フオリン反応は陽性、ニンヒドリン反応
は陰性 (リ) 元素分析値 Ｃ：32％〜34％ Ｈ：４％〜６％ Ｎ：３％〜５％ （ヌ） フエノール硫酸法による糖の含有率は約
20％〜50％（グルコース換算）、およびロウリ
ー・フオリン法による蛋白質の含有率は約10％
以下（牛血清アルブミン換算）である。
Priority Applications (22)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56022276A JPS57139088A (en) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | Carcinostatic substance tf-340, its preparation and carcinostatic agent containing the same |
| US06/347,871 US4477437A (en) | 1981-02-19 | 1982-02-11 | Substances having carcinostatic and immunostimulating activity |
| GB8204093A GB2093347B (en) | 1981-02-19 | 1982-02-12 | Immunostimulant material tf-2 from fusobacterium sp |
| DE19823205074 DE3205074A1 (de) | 1981-02-19 | 1982-02-12 | Neue carcinostatische und immunostimulierende substanzen, verfahren zur herstellung derselben und carcinostatische mittel mit einem gehalt derselben |
| DK069282A DK151640C (da) | 1981-02-19 | 1982-02-17 | Fremgangsmaade til fremstilling af forbindelser med carcinostatisk og immunostimulerende virkning |
| FR8202601A FR2499855B1 (fr) | 1981-02-19 | 1982-02-17 | Nouvelles substances a action carcinostatique et immuno-stimulante, procede pour les preparer a partir de bacteries du genre fusobacterium, et agent carcinostatique contenant de telles substances |
| FI820527A FI69096C (fi) | 1981-02-19 | 1982-02-17 | Foerfarande foer framstaellning av en karcinostatisk och immunostimulerande tf-2-substans |
| CH979/82A CH651052A5 (de) | 1981-02-19 | 1982-02-17 | Verfahren zur herstellung einer karzinostatischen substanz und karzinostatische substanz. |
| IT47817/82A IT1189224B (it) | 1981-02-19 | 1982-02-17 | Sostanze carcinostatiche ed immunostimolanti tf-2,procedimento per prepararle ed agente carcinostatico che le contiene |
| DD82237480A DD202891A5 (de) | 1981-02-19 | 1982-02-17 | Neue carcinostatische und immunostimulierende substanzen,verfahren zu ihrer herstellung und carcinostatische mittel mit einem gehalt derselben |
| CA000396425A CA1184864A (en) | 1981-02-19 | 1982-02-17 | Substances having carcinostatic and immunostimulating activity, process for preparing the same and carcinostatic agent containing the same |
| SE8201016A SE457000B (sv) | 1981-02-19 | 1982-02-18 | Foerfarande foer framstaellning av en carcinostatisk och immunostimulerande tf-2-substans, carcinostatisk tf-2-substans samt carcinostatiskt medel. |
| NZ199771A NZ199771A (en) | 1981-02-19 | 1982-02-18 | Carcinostatic and immunostimulating substances produced by fusobacterium nucleatum |
| KR8200714A KR890002256B1 (ko) | 1981-02-19 | 1982-02-18 | 항암 물질 tf-2 제조 방법 |
| NO820509A NO157426C (no) | 1981-02-19 | 1982-02-18 | Fremgangsmaate for fremstilling av terapeutisk aktive forbindelser ved dyrking av mikroorganismer. |
| NL8200640A NL8200640A (nl) | 1981-02-19 | 1982-02-18 | Nieuwe, carcinostatische stoffen, preparaten die ze bevatten, en werkwijze voor de bereiding daarvan. |
| PT74455A PT74455B (en) | 1981-02-19 | 1982-02-18 | Process for preparing novel substances having carcinostatic and immunostimulating activity and of a carcinostatic agent containing same |
| ES509774A ES8308926A1 (es) | 1981-02-19 | 1982-02-19 | "un procedimiento para la preparacion de una sustancia carcinostatica tf-2". |
| AT0064682A AT381722B (de) | 1981-02-19 | 1982-02-19 | Verfahren zur herstellung einer neuen carcinostatischen substanz |
| BE0/207355A BE892204A (fr) | 1981-02-19 | 1982-02-19 | Nouvelles substances a action carcinostatique et immunq-stimulante, procede pour les preparer a partir de bacteries du genre fusobacterium, et agent carcinostatique contenat de telles substances |
| US06/619,895 US4591558A (en) | 1981-02-19 | 1984-08-06 | Novel substances having antitumor and immunostimulating activity, process for preparing the same and antitumor agent containing the same |
| DK251186A DK165641C (da) | 1981-02-19 | 1986-05-29 | Fremgangsmaade til fremstilling af tf-220, tf-230 og tf-240 forbindelser og de tilsvarende proteinfrie forbindelser |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56022276A JPS57139088A (en) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | Carcinostatic substance tf-340, its preparation and carcinostatic agent containing the same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57139088A JPS57139088A (en) | 1982-08-27 |
| JPH021156B2 true JPH021156B2 (ja) | 1990-01-10 |
Family
ID=12078229
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56022276A Granted JPS57139088A (en) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | Carcinostatic substance tf-340, its preparation and carcinostatic agent containing the same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS57139088A (ja) |
-
1981
- 1981-02-19 JP JP56022276A patent/JPS57139088A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS57139088A (en) | 1982-08-27 |
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