JPS63181996A - γ−グルタミルトランスペプチダーゼおよびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 動物組織および微生物において、γ−ダルタミルトラン
スベゾチダーゼ（以下γ−ＧＴＰというンは、アミノ酸
代謝およびクルタブ−オンサイクル上１重要な役割を果
たしている（Ｍｅ　ｔｈ　、Ｅｎｚｙｍｏ　ｌ。

７７．２３７（１９８１）：］。それらはバチルス類に
おけるポリグルタミン酸形成のためおよびグルタチオン
（γ−グルタミルーシステイニルーグリシン）の分解の
ため、γ−グルタミル誘導体の形の各種アミノ酸の輸送
を担っている。

驚くべきことに、一部の微生物が、前述の反応のほかに
、アジピニル−またはグルタリル−モノアミノ化合物を
加水分解できるγ−ＧＴＰを合成でとることを今般見出
した。

すなわち、本発明は、 １　細菌の発酵により得ることかでさそして更に次の諸
特徴すなわち、 −２０，０００〜６０，０００の分子量、−ｐ）１５．
０〜６，５の等電点。

−Ｌ−グルタミルｐ−ニトロアニリドを基質とするとき
６５〜１０の至適田。

一一８において９〜３６　ｎＭのＫｍｌという特徴を有
するγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ
）、 ２、細菌を栄養培地中で酵素が蓄積されるまで培養する
ことより成る１で定義されたγ−ＧＴＰの製造方法、 ３．１．で定義されたγ−ＧＴＰの、アジピニル−また
はグルタリル−モノアミノ化合物の酵素分解のための使
用。

に関する。

本発明、特（＝その好ましい態様を以下に詳述する。本
発明はまた特許請求の範囲においても定義されている。

本発明によるγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ
−Ｃ）ＴＰ）は、グルタリル−またはアジピニル−モノ
アミノ化合物、例えば Ｒ’　−（ＣＨ２）　３−Ｃ−ＮＨ−Ｒ２（式中、Ｒ１
はカルボキシル、カルボキシカルボニル（−６−ｃｏｏ
Ｈ）またはカルボキシメチル基であり、セしてＲ２はア
ミノ酸、ジＲプチド、セフェム、セファムまたはそれら
の誘導体の残基を表わす） で示されるものの加水分解に触媒として働いて相当する
酸３よびモノアミノ化合物を与える。

基質として用いるのに好ましいのは７−アミノセフアロ
スポラン酸誘導体、特にα−ケト−アジピニル−または
グルタリル−７−アミノセフアロスポラン酸である。

酵素生成物は、微生物のベリプラスミッタ空間に存在し
、そして２０．０００〜６０，０００、好ましくは２３
，０００〜４０，０００．特：二３０．０００〜３５．
０００の分子量、およびＩ詣３０〜６．５．好ましくは
ｐＨ５，７〜６１にある等電点により特徴付けることが
できる。酵素調製物の至適ｐｌｉはＬ−γ−グルタミル
／ミラニトロアニリドを基質としだ場合６．５〜１０の
一１範囲にある。同じ基質についての本発明のトランス
はブチダーゼのＫｒｎは、ｐＨｌ’３において、好まし
くは１５〜２０　ｔｔＭ、特に８１μＭである。

本発明のγ−Ｃ）ＴＰは、アザセリンまたはヨードアセ
トアミドの存在下に不可逆的に阻害される。

この酵素は、銅、水銀、およびセリンとボレートとの混
合物の存在下、および７−アミノセフアロスポラン酸の
存在下に可逆的に阻害されることが認められる。

製造は、微生物を用いて行われる。スゲリーニングによ
り、プソイドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｒｈｏｎａｓ）、プ
ロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）　、アルトロバクター（Ａ
ｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）およびバチルス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ）属が本発明のγ−ＧＴＰを良好な収率で与える
ことがわかった。適切かつ好適な例としては次のものが
挙げられるニブソイトモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏ−
ｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）ＡＴＣＣ１７３９０，プソ
イドモナス・エルギノザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａ
ｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＮＣＴＣ１０７０１、プロテウス
・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）ｇ
Ｃ９６３４、アルトロバクター・ノミラフイネウス（Ａ
ｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｐａｒａｆｉｎｅｕｓ）ＡＴ
ＣＣ３１９１７、およびプソイドモナスーフラギ（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｒａｇｉ）ＤＳＭ　３８８１お
よびバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）ＩＦＯ３０２５゜酵素はプソイドモナス・フ
ラギＩ’）ＳＭ　３８８１から得るのが特に好ましい。

前記微生物の突然変異株（ｍｕｔａｎｔ）および変異株
（ｖａｒｉａｎｔ）も適している。

微生物は、場合により酸素または空気を導入し、振盪フ
ラスコまたは発酵槽中で振盪または攪拌しながら例えば
深部培養により、個別的にあるいは混合培養物として好
気的（二培養する。

発酵は約２０〜５７℃、好ましくは約２５〜６０℃、特
に２８〜３０℃の温度範囲で行うことができる。

発酵は５〜８−５．好ましくは５５〜８０の肯範囲で行
われる。これらの条件下では、培養液中の酵素の検出可
能な蓄積は、１〜３日後に一般的に認められる。７−Ｇ
ＴＰの合成は対数期後期に始まり、そして増殖静止期に
最大となる。Ｑ　リプラスミンク酵素の産生はＨｒ’Ｌ
Ｃ分析または光度測定による活性アッセイによって追跡
することができる。

γ−Ｃ）ＴＰ産生に用いられる栄養溶液は、０．２〜５
チ、好ましくは０．５〜２％の有機窒素化合物、および
無機塩を含有する。適切な有機窒素化合物は１次のとお
りであるニアミノ酸、ズブトン、そのほか肉エキス、種
子粉砕物、例えばコーン、小麦、ビーンズ、大豆、また
はフトンプラント、アルコール生産からの蒸留残渣、肉
ミールまたは酵母エキスなど。栄養溶液が含有できる無
機塩としては、例えばアルカリ金属またはアルカリ土類
金属、鉄、亜鉛およびマンガンの塩化物、炭酸塩、硫酸
塩または燐酸塩およびアンモニウム塩および硝酸塩など
が挙げられる。

資化可能な炭水化物を添加すると生物量の収量が増加す
る。炭水化物も前述の濃度で添加される。栄養溶液に添
加することのできる好ましい炭素源としては例えば、糖
類、例えばグルコースまたはスクロースおよび炭水化物
含有天然物例えば麦芽エキスなどが挙げられる。

至適発酵条件は、各微生物毎に異なるが、それらはすで
に当業者に知られており、また簡単な予備テストで確立
することができる。

Ｎ製はリソチーム消化、硫酸アンモニウム沈殿およびイ
オン交換およびゲル透過グロマトグラフイなど（＝よる
古典的方法によって行うことができる。酵素は常法によ
り結合させることができる（ＣＯｌｏｗｉｃｋおよびＫ
ａｐｌａｎ　＊　Ｍｅ　ｔｂ　、ＥｎＺｙｍＯＸ　−＊
ｖｏ　ｌ　−Ｘ　Ｌへ′）。

酵素反応には、遊離のまたは固定化された形の全細胞を
β−ラクタマーゼ失活剤例えばクラプラン酸またはチェ
ナマイシンなどの添加下に用いることができるだけでな
く、（同じく担体結合されていてもよい）酵素単離物を
用いることもできる。全細胞の固定化に適した材料とし
ては、例えばキト−サン、アルギネート、χ−カラケ゛
ナン、ポリアクリロヒドラジドおよびその他、文献公知
の方法により得られる公知の物質などが挙げられる（Ｋ
、Ｖｅｎｋａｔｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ。

Ｉｍｍｏｂ、Ｃｅ１１ｓ（１９７９）、−ＡＣ８Ｓｙｒ
ｎｐｏｓｉｕｍＳｅｒｉｅＳ、ｐ。

１０６）。

本発明によるγ−Ｃ）ＴＰは、殊に酵母すなわちトリゴ
ノプシス・パリアビリス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓｖａ
ｒｉａｂｉｌｉｓ）の開示（西独特許出願公開第２．２
１９．４５４号明細方参照）によりセファロスポリンＣ
から高収率でグルタリル−７−アミノセファロスポラン
酸を生産できることから、特にセファロスフバリンＣか
らの７−アミノセファロスポラン酸の取得に工業的（二
重壁である。本発明により、この化合物をＴ−グルタミ
ルトランスにプチダーセで加水分解して好収率で７−ア
ミノセファロスポラン酸とすることができる。

これによってセファロスポリンＣから７−アミノセファ
ロスポラン酸への酵素分解におけるギャップが埋まるが
、このことは半合成セファロスポリンにとって工業的に
重要である。

本発明を更に次の実施例で説明する。特に断らない限り
１以上の記述におけると同様、チデータは重量に基づく
ものである。

実施例　１ γ−ＬｒＴＰ生産微生物株を以下の組成を有する寒天斜
面培地に維持するニ ゲルコース　　　　　　　１　　係 カゼイン−にプトン　　　０４　幅 内エキス　　　　　　　０４　も 酵母エキス　　　　　　　０．（１５鴫肝エキス　　　
　　　　０．０５φ ＮａＣ／　　　　　　　　　　０．２５％ｐ）１７．２ それら斜面培地を２８℃で２日間インキュベートする。

次に菌体を１０ｄの生理学的食塩水で洗浄し、セして１
ｆｎｌのこの懸濁液を用いて。

６０〇−容エルレンマイヤーフラスコ中の以下の組成を
有する５　０　ｍｌの予備培養液に接種する：ペプトン
　　　　　１条 麦芽エキス　　　　０．５％ ｐ）Ｉ　７．０ このフラスコをロータリ一式シェーカ（１９０ｒｐｍ　
）において３０℃で２４時間インキュベートする。２．
５　ｍｅのこの培養液を用いて３０　ｍｌの主培養液に
接種する： Ａ）ダラム陰性細菌 ペプトン　　　　　　　１　　係 肉エキス　　　　　　　０．５％ ＮａＣぎ　　　　　　　　　０．５　　％ＫＨ２ＰＯ４
０，１チ に２ＨＰＯ４０，１俤 ＭｑＳ○４×７Ｈ２００，０５チ ｐＨＺＱ ８）バチルス ペプトン　　　　　　　Ｄ、１２　チ 酵母エキス　　　　　　０．１２　　％グルコース　　
　　　　０．２５　％ Ｎａラクテート（６０％）　　　　５．６　　　ｍｔＮ
Ｈ４Ｃ１０，１２％ に２ＨＰＯ４０，１２％ ＫＨ２Ｐ○４　　　　　　　　　　　　　０．０！Ｊ４
％Ｍｇ５Ｑ４　　Ｘ　　７Ｈ２００，０２５％ＮａＣ１
Ｏ，５％ ＫＣＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　［Ｊ、　５
　　　　係ＣａＣＡ！２　Ｘ　２Ｈ２００，ＯＤ　Ｉ　
５％ＭｎＣｌ２　　Ｘ　４Ｈ２００，０００７％Ｆｅ（
ＮＨ４）’／）　Ｖ−ト　　　　　　０．０００１５％
その培養液を１９　Ｏｒｐｍで振盪しながら２８℃で２
４時間インキュベートし、次いで遠心分離により集菌す
る。

いくつかの菌株にっ、いてのγ−ＧＴＰ活性を下記の表
に列挙するニ プソイドモナス・プチダＡＴＣＣ１７！１９０　　　　
　１５プソイドモナス・エルギノザＮＣＴＣ”　　　　
　　１１プロテウス・ブルガリスＡＴＣＣ９６３４２６
プソイドモナス・フライＤＳＭ３８８１　　　　　　５
７バチルス・ズブチリスＩＦＯ３０２５３１実施例　２ プソイドモナス・フライＤＳＭ　３８８１の予備培養液
を実施例１と同様にして培養する。３０ｍのこの培養液
を用いて５１発酵槽中の２１の主培養液に接種する。こ
の菌株を２８℃で７０チの酸素分圧下に培養する。γ−
ＧＴＰ産生な光度測定により追跡し、そして酵素力価が
最高となったところで培養液から集菌する。前記条件下
（二３０ｍＵ／＋ｎｌのγ−Ｃ）ＴＰ力価を有する培養
液が得られる。

実施例　６ 実施例２で得られた１１の菌株を以下の組成の２−の消
化用緩衝液と混合する： ２　０　　ｍＭ　　ＴＲｌ５ １０　ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ７，６ １２ｍＭ　ＭｇＳＯ４Ｘ　７Ｈ２０ 懸濁液を調製後、以下のものを加える：リソチーム：　
０．８Ｊ＋Ｉｉｌ／１ｄＤＮＡｓｅ（デオキシリボヌク
レアーゼ）＝１ｏべＱ　／　ｍｅ、懸濁液１−にこれを
３０μ１０ その混合物を室温で１５分間インキュベートする。溶菌
した菌体な３０，０ＯＯＸ？で遠心分離する。２％強度
硫酸プロタミン溶液を、２ｏ容ｉ［の量で、上清と混合
する。沈殿を遠心分離して捨てる。上清を硫酸アンモニ
ウム（３０〜８０チ飽和）による分別沈殿にかける。ｋ
レットを再びもとの容量の１／２０で０．１Ｍクエン酸
塩緩衝液（ｐ！−１５，０）にとる。次に熱処理（１時
間、３７℃）を行った後、遠心分離し、２０ｍＭクエン
酸塩緩衝液（ｐｉ４５．０）に対し透析する。残留物を
カルボキシメチルセルロースカラムにかける。６ｒｎｔ
のＷｈａｔｍａｎ社ＣＭ−セルロース５２を各１ｒｎ／
、の酵素溶液について用いる。使用溶出液は２０ｍＭク
エン酸塩緩衝液（開５．　Ｏ）であり、塩化ナトリウム
直線勾配（０〜０５Ｍ）を用いる。

活性画分（ＨＰＬＣアッセイ）を１０　ｍＭ　ＴＲｌ５
緩衝液（ｐＨ８，０）に対し透析し、そして更（二ＤＥ
ＡＦセルｏ　−スカ５　ｂ　（ＤＥ５２　、　Ｗｈａｔ
ｍａｎ）で精製する。

使用溶出液は２０鮨ＴＲｌ５緩衝液（ｕ（８，０）であ
り、ＮａＣｌ直線勾配（０〜０．３Ｍ）を用いる。

最高の活性（光度測定アッセイ）を有する両分を以後の
試＠：二用いる。

実施例　４ 実施例１の如く調製された酵素調製物１ｒｎｌを５：１
に濃縮し、そして架橋アガロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（
商標名）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）カラムにかける。

使用移動相は、Ｃ１５Ｍ　ＮａＣ１含有３０ｍＭ燐酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７０）である。給送速度は０．３−
７分である。γ−グルタミルトランスペプチダーゼを１
５．４　ｍｌの緩膏液で溶出する。それはＬ−γ−グル
タミルｌ）　−ＮＯ２−アニリド、およびグルタリル−
７−アミノセフアロセフアロスポラン酸から７−アミノ
セファロスポラン酸への分裂を用いて検出することがで
きる。γ−ＧＴＰの分子量範囲は３０，０００−５５．
０００に相当する。

実施例　５ 実施例２の如く調製されたバイオマスを加熱処理まで（
加熱処理も含めて）実施例６と同様（二して後処理する
。カルボキシメチルセルロース（Ｗｈａｔｍａｎ社ＣＭ
　５２　）を残留液に上清がラクタマーゼ不含となるま
で添加する。１０　ｍＭ　ＴＲｌ５、ｐｉ（８，０に対
して透析後、その容量の４倍のＤＥＡＥ−セルロースカ
ラム（ＩＪ　５２、Ｗｌｌ、ａｔｍａｎ社）でのクロマ
トグラフィにかける。使用溶出液は２０ｍＭ　ＴＲｌ５
緩衝液、ｐＨｓ、　Ｏ（ｏ、　Ｉ　Ｍ　ＮａＣｌの直線
勾配使用）である。活性画分は光度測定アッセイを用い
て見出し、次いで酵素を８０’ｌ硫酸アンモニウムで沈
殿させる。ベレットを３０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）および０．１５Ｍ　ＮａＣｌにとる（２５：
１！縮）。

実施例　６ グルタリル〜７−アミノセファロスポラン酸の調製反応
のために次の混合物を選択する：実施例３の如く調製さ
れた１００μｌの酵素濃縮液および２０ｍＭ燐酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解された１００μｊの４０
　ｍＭグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸を３
３℃の温度でインキュベートしたもの。

１時間毎にアリコートを採取しそしてＨＰＬＣにより７
−アミノセファロスポラン酸の産生を調べる。その混合
物の５２％が約２．５時間後に反応した。ｐＩＩを７．
０に段階的に増大させると全部で８時間後に７０％の最
高反応率となる。

実施例　７ γ−０ＴＰ活性の測定 ａ）　　）ＴＰＬＣアッセイ ３０　ｔｔｌの８０　ｍＭグルタリル−７−アミノセフ
ァロスポラン酸を１００〜１４０μｌの２３０ｍＭ燐酸
カリウム緩衝液（ｐＩＩ５．０）および１０〜５ｏμｌ
の酵素溶液と混合し、そしてその混合物を３３℃でイン
キュベートし、１０５＋毎に２０μｌサンプルを採取す
る。反応を２０μｌのメタノールを用いて止める。遠心
分離しそして水で１：１０に希釈する。１０μ！サンプ
ルを１（ＰＬＯにより７−アミノセファロスポラン酸含
量について調べる。

静止相：Ｃ−１８−シリカゲル 移動相：　ＫＨ２ＰＯ４（Ｅ（２０、ＭｅＯＨ（８０：
　２０　）中３０　ｍＭ）＋０．００１％硫酸テトラブ
チルアンモニウムｂ）光度測定アッセイ ６００μｌのＬ−７−グルタミルｐ−ニトロアニリド（
１６６ｔｔＭ）、３ｏｏμａの３０　ｍＭ燐醒カリウム
緩衝液（ｐＬＩ５．７）および１００μｌの培養液を一
緒に混合しそして５７℃でインキユベートスる。

特許出願人　　ヘキスト・アクテエンゲセルシャフト外
２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）細菌の発酵により得ることができ、そして更に次の
   諸特徴、すなわち、 −２０，０００〜６０，０００の分子量範囲、−ｐＨ５
   ．０〜６．５の等電点、 −Ｌ−γ−グルタミルパラニトロアニリドを基質とした
   場合に６．５〜１０の至適ｐＨ、 −ｐＨ８において９〜３６μＭのＫ＿ｍ、 の特徴を有するγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（
   γ−ＧＴＰ）。 ２）プソイドモナスおよび／またはプロテウスおよび／
   またはアルトロバクターおよび／またはバチルス属の細
   菌の発酵により得ることができる請求項１記載のγ−Ｇ
   ＴＰ。 ３）プソイドモナス・プチダＡＴＣＣ１７３９０および
   ／またはプソイドモナス・エルギノザＮＣＴＣ１０７０
   １および／またはプロテウス・ブルガリスＡＴＣＣ９６
   ３４および／またはアルトロバクター・パラフイネウス
   ＡＴＣＣ３１０１７および／またはプソイドモナス・フ
   ラギＤＳＭ３８８１および／またはバチルス・ズブチリ
   スＩＦＯ３０２５の発酵により得ることのできる請求項
   １または２記載のγ−ＧＴＰ。 ４）細菌を栄養培地中で酵素が蓄積するまで培養するこ
   とより成る請求項１記載のγ−ＧＴＰの製造方法。 ５）プソイドモナスおよび／またはプロテウスおよび／
   またはアルトロバクターおよび／またはバチルス属の細
   菌を培養する請求項４記載の方法。 ６）プソイドモナス・プチダＡＴＣＣ１７３９０および
   ／またはプソイドモナス・エルギノザＮＣＴＣ１０７０
   １および／またはプロテウス／ブルガリスＡＴＣＣ９６
   ３４および／またはアルトロバクター・パラフイネウス
   ＡＴＣＣ３１０１７および／またはプソイドモナス・フ
   ラギＤＳＭ３８８１および／またはバチルス・ズブチリ
   スＩＦＯ３０２５を培養する請求項４または５記載の方
   法。 ７）培養が２０〜３７℃の温度範囲で行われる請求項４
   〜６のいずれかに記載の方法。 ８）培養が２５〜３０℃の温度範囲で行われる請求項７
   記載の方法。 ９）培養が５〜８．５のｐＨで行われる請求項４〜８の
   いずれかに記載の方法。 １０）請求項１〜３のいずれかに記載のγ−ＧＴＰのア
   ジピニル−またはグルタリル−モノアミノ化合物の酵素
   加水分解への使用。 １１）請求項１〜３のいずれかに記載のγ−ＧＴＰのα
   −ケト−アジピニル−またはグルタリル−７−アミノセ
   フアロスポラン酸の酵素加水分解への使用。 １２）プソイドモナス・プチダＡＴＣＣ１７３９０、プ
   ソイドモナス・エルギノザＮＣＴＣ１０７０１、プロテ
   ウス・ブルガリスＡＴＣＣ９６３４、アルトロバクター
   ・パラフイネウスＡＴＣＣ３１９１７、プソイドモナス
   ・フラギＤＳＭ３８８１、およびバチルス・ズブチリス
   ＩＦＯ３０２５、ならびに請求項１に記載のγ−ＧＴＰ
   を生産するそれらの変異株（ｖａｒｉａｎｔ）および突
   然変異株（ｍａｔａｎｔ）。