KR20200029531A - 비천연 뉴클레오티드의 도입 및 그의 방법 - Google Patents

비천연 뉴클레오티드의 도입 및 그의 방법 Download PDF

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Abstract

돌연변이 tRNA를 사용하는, 비천연 아미노산을 포함하는 단백질의 합성을 위한 방법, 조성물 및 키트가 본원에 개시된다.

Description

비천연 뉴클레오티드의 도입 및 그의 방법
상호 참조
본 출원은 2017년 7월 11일에 제출된 미국 가특허 출원 제62/531,325호를 우선권으로 주장하며, 상기 가특허 출원은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
발명의 배경
올리고뉴클레오티드 및 그들의 적용은 생물공학에 혁명을 가져왔다. 그러나, DNA 및 RNA 둘 다를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 각각 단지 DNA에 대해 아데노신(A), 구아노신(G), 시토신(C), 티민(T)의 4개의 천연 뉴클레오티드, 및 RNA에 대해 아데노신(A), 구아노신(G), 시토신(C) 및 우리딘(U)의 4개의 뉴클레오티드를 포함하며, 이는 올리고뉴클레오티드의 잠재적 기능 및 적용을 상당히 제한한다.
폴리머라제로, 예컨대 PCR 또는 등온 증폭 시스템(예컨대, T7 RNA 폴리머라제로의 전사)에 의해 올리고뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)를 서열-특이적으로 합성/증폭시키는 능력은 생물공학에 혁명을 가져왔다. 나노기술의 모든 잠재적 적용에 더하여, 이는 RNA 및 DNA 압타머 및 효소의 SELEX(지수적 농축에 의한 리간드의 체계적 진화)를 통한 시험관내 진화와 같은 다양한 새로운 기술을 가능하게 하였다. 예컨대, 문헌[Oliphant AR, Brandl CJ & Struhl K (1989), Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 proteins, Mol. Cell Biol., 9:2944-2949; Tuerk C & Gold L (1990), Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase, Science, 249:505-510; Ellington AD & Szostak JW (1990), In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands, Nature, 346:818-822]을 참조한다.
일부 측면에서, 이들 적용은 천연 유전자 알파벳(DNA에서 4개의 천연 뉴클레오티드 A, C, G 및 T, 및 RNA에서 4개의 천연 뉴클레오티드 A, C, G 및 U)에 존재하는 제한된 화학적/물리적 다양성에 의해 제한된다. 확장된 유전자 알파벳을 함유하는 핵산을 생성하는 추가 방법이 본원에 개시된다.
특정 실시양태에서, 본원에는 비천연 아미노산을 함유하는 단백질을 생성하는 방법이 개시되며, 상기 방법은 표 1 또는 2로부터 선택되는 돌연변이 안티코돈 서열을 포함하는 돌연변이 tRNA를 제조하는 단계; 표 1 또는 2로부터 선택되는 돌연변이 코돈 서열을 포함하는 돌연변이 mRNA를 제조하는 단계; 및 돌연변이 tRNA 및 돌연변이 mRNA를 사용하여 비천연 아미노산을 함유하는 단백질을 합성하는 단계를 포함한다. 일부 예에서, 단백질은 무세포 번역 시스템에서 합성된다. 일부 예에서, 단백질은 세포(반합성 유기체 또는 SSO)에서 합성된다. 일부 예에서, 반합성 유기체는 미생물을 포함한다. 일부 예에서, 반합성 유기체는 세균을 포함한다. 일부 예에서, 반합성 유기체는 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli)를 포함한다. 일부 예에서, 돌연변이 tRNA의 돌연변이 안티코돈은 표 1-3으로부터 선택되는 돌연변이 코돈과 쌍을 이룬다. 일부 예에서, 비천연 아미노산은 적어도 하나의 비천연 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 예에서, 비천연 뉴클레오티드는 비천연 핵염기를 포함한다. 일부 예에서, 비천연 뉴클레오티드의 비천연 염기는 2-아미노아데닌-9-일, 2-아미노아데닌, 2-F-아데닌, 2-티오우라실, 2-티오-티민, 2-티오시토신, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 알킬 유도체, 2-아미노-아데닌, 2-아미노-프로필-아데닌, 2-아미노피리딘, 2-피리돈, 2'-데옥시우리딘, 2-아미노-2'-데옥시아데노신, 3-데아자구아닌, 3-데아자아데닌, 4-티오-우라실, 4-티오-티민, 우라실-5-일, 히포크산틴-9-일(I), 5-메틸-시토신, 5-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 히포크산틴, 5-브로모, 및 5-트리플루오로메틸 우라실 및 시토신; 5-할로우라실, 5-할로시토신, 5-프로피닐-우라실, 5-프로피닐 시토신, 5-우라실, 5-치환된, 5-할로, 5-치환된 피리미딘, 5-히드록시시토신, 5-브로모시토신, 5-브로모우라실, 5-클로로시토신, 클로르화된 시토신, 사이클로시토신, 시토신 아라비노시드, 5-플루오로시토신, 플루오로피리미딘, 플루오로우라실, 5,6-디히드로시토신, 5-요오도시토신, 히드록시우레아, 요오도우라실, 5-니트로시토신, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-플루오로우라실, 및 5-요오도우라실, 아데닌 및 구아닌의 6-알킬 유도체, 6-아자피리미딘, 6-아조-우라실, 6-아조 시토신, 아자시토신, 6-아조-티민, 6-티오-구아닌, 7-메틸구아닌, 7-메틸아데닌, 7-데아자구아닌, 7-데아자구아노신, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-8-아자구아닌, 8-아자구아닌, 8-아자아데닌, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 및 8-히드록실 치환된 아데닌 및 구아닌; N4-에틸시토신, N-2 치환된 퓨린, N-6 치환된 퓨린, O-6 치환된 퓨린, 듀플렉스 형성의 안정성을 증가시키는 것, 범용 핵산, 소수성 핵산, 무차별 핵산(promiscuous nucleic acid), 크기 확장된 핵산, 플루오르화된 핵산, 트리사이클릭 피리미딘, 페녹사진 시티딘([5,4-b][l,4]벤족사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘(1H-피리미도[5,4-b][l,4]벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프, 페녹사진 시티딘(9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-b][l,4]벤족사진-2(3H)-온), 카르바졸 시티딘(2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘(H-피리도 [3',2':4,5]피롤로 [2,3-d]피리미딘-2-온), 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 히포크산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시히드록실메틸) 우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 베타-D-갈락토실케오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실케오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5옥시아세트산, 위부톡소신(wybutoxosine), 슈도우라실, 케오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥스아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥스아세트산, 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필) 우라실, (acp3)w, 및 2,6-디아미노퓨린, 및 퓨린 또는 피리미딘 염기가 헤테로사이클로 대체된 것으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 예에서, 비천연 뉴클레오티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다(명확성을 위해 핵염기 부분만 나타내고 리보스 및 포스페이트 골격은 생략함):
Figure pct00001
.
일부 예에서, 비천연 뉴클레오티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다(명확성을 위해 핵염기 부분만 나타내고 리보스 및 포스페이트 골격은 생략함):
Figure pct00002
.
일부 예에서, 비천연 뉴클레오티드는 비천연 당 모이어티를 더 포함한다. 일부 예에서, 비천연 뉴클레오티드의 비천연 당 모이어티는 2' 위치에서의 변형: OH; 치환된 저급 알킬, 알카릴, 아르알킬, O-알카릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2 CH3, ONO2, NO2, N3, NH2F; O-알킬, S-알킬, N-알킬; O-알케닐, S-알케닐, N-알케닐; O-알키닐, S-알키닐, N-알키닐; O-알킬-O-알킬, 2'-F, 2'-OCH3, 2'-O(CH2)2OCH3; 및/또는 5' 위치에서의 변형: 5'-비닐, 5'-메틸(R 또는 S), 4' 위치에서의 변형, 4'-S, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단 기, 리포터 기, 인터칼레이터, 올리고뉴클레오티드의 약동학적 특성을 개선하기 위한 기, 또는 올리고뉴클레오티드의 약력학적 특성을 개선하기 위한 기, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 비치환된 C1-C10 알킬, C2-C10 알케닐, C2-C10 알키닐, -O[(CH2)nO]mCH3, -O(CH2)nOCH3, -O(CH2)nNH2, -O(CH2)nCH3, -O(CH2)n-ONH2, 및 -O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2일 수 있고, n 및 m은 1 내지 약 10이다. 일부 예에서, 돌연변이 안티코돈 또는 돌연변이 코돈은 비천연 골격을 더 포함한다. 일부 예에서, 돌연변이 안티코돈 및 돌연변이 코돈은 비천연 골격을 더 포함한다. 일부 예에서, 비천연 뉴클레오티드는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제 또는 역전사효소에 의해 인식된다. 일부 예에서, 비천연 뉴클레오티드는 전사 동안 RNA 폴리머라제에 의해 mRNA로 도입되어 돌연변이 코돈을 함유하는 돌연변이 mRNA를 생성한다. 일부 예에서, 비천연 뉴클레오티드는 전사 동안 RNA 폴리머라제에 의해 tRNA로 도입되어 돌연변이 안티코돈을 함유하는 돌연변이 tRNA를 생성한다. 일부 예에서, 비천연 뉴클레오티드는 전사 동안 RNA 폴리머라제에 의해 mRNA로 도입되어 돌연변이 mRNA를 생성한다. 일부 예에서, 비천연 뉴클레오티드는 전사 동안 RNA 폴리머라제에 의해 tRNA로 도입되어 돌연변이 tRNA를 생성한다. 일부 예에서, 돌연변이 tRNA는 비천연 아미노산 잔기로 충전된다. 일부 예에서, 비천연 아미노산을 함유하는 단백질은 번역 동안 돌연변이 tRNA 및 돌연변이 mRNA를 사용하여 생성된다.
본 개시의 다양한 측면이 첨부된 청구범위에서 구체적으로 설명되어 있다. 본 개시의 특징 및 이점에 대한 더 나은 이해는 본 개시의 원리가 사용되는 예시적인 실시양태를 설명하는 하기의 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조하여 달성될 것이다.
도 1a는 dNaM-dTPT3 UBP 및 천연 dA-dT 염기쌍의 화학 구조를 도시한다.
도 1b는 sfGFP(AXC)151 및 tRNA(GYT)Ser를 발현하는 데 사용되는 유전자 카세트를 도시한다. PT7 및 TT7은 각각 T7 RNAP 프로모터 및 터미네이터를 나타낸다. sfGFP가 serT의 부재 하에서 발현되는 대조군에서, sfGFP T7 터미네이터 이후의 서열은 존재하지 않는다.
도 1c는 각각 지시된 위치 151-코돈 및 안티코돈으로 sfGFP 및 tRNASer를 발현하는 세포의 형광 그래프를 도시한다. 마이너스 기호는 발현 카세트에서 serT의 부재를 나타낸다. t = 0은 T7 RNAP 및 tRNASer(존재하는 경우)의 발현을 유도하기 위한 IPTG의 첨가에 해당한다; aTc는 sfGFP의 발현을 유도하기 위해 t = 0.5 h에 첨가되었다. AGT, 천연 Ser 코돈; TAG, 앰버 정지 코돈; CTA 앰버 서프레서 안티코돈. 데이터는 평균±s.d.로 나타냄, n = 4개의 배양물, 각각 개별 콜로니로부터 증식됨.
도 1d는 각각 지시된 위치 151-코돈 및 안티코돈으로 sfGFP 및 tRNASer를 발현하는 세포의 성장 그래프를 도시한다. 마이너스 기호는 발현 카세트에서 serT의 부재를 나타낸다. t = 0은 T7 RNAP 및 tRNASer(존재하는 경우)의 발현을 유도하기 위한 IPTG의 첨가에 해당한다; aTc는 sfGFP의 발현을 유도하기 위해 t = 0.5 h에 첨가되었다. AGT, 천연 Ser 코돈; TAG, 앰버 정지 코돈; CTA 앰버 서프레서 안티코돈. 데이터는 평균±s.d.로 나타냄, n = 4개의 배양물, 각각 개별 콜로니로부터 증식됨.
도 1e는, α-GFP 항체(N-말단 에피토프)로 탐침된, 도 1c 및 도 1d에 도시된 마지막 시점에서 수집된 세포로부터의 용해물의 웨스턴 블롯(OD600에 의해 정규화됨)을 도시한다.
도 1f는, LC-MS/MS 및 전구체 이온 세기 기준 정량화((두 코돈 모두에 대해 평균적으로) <0.1%에서 검출된 아미노산은 표시되지 않음; 자세한 내용은 방법을 참조하고 검출된 아미노산의 전체 목록은 표 4를 참조)로 결정된, sfGFP(AGT)151 또는 sfGFP(AXC)151 및 tRNASer(GYT)를 발현하는 세포로부터 정제된 sfGFP의 위치 151에서 검출된 아미노산(도 범례에서 그들의 단일 문자 코드로 나타냄)의 상대적 존재비 그래프를 도시한다. 데이터는 개별 데이터 포인트의 평균으로 나타냄, n = 4개의 정제된 sfGFP 샘플, 각각은 개별 콜로니로부터 증식되고 도 1c 및 도 1d에 도시된 마지막 시점에서 수집된 배양물로부터의 것임.
도 2a는, 배지 중 동족 안티코돈을 갖는 tRNAPyl, PylRS, 또는 20 mM PrK(N 6-[(2-프로피닐옥시)카르보닐]-l-리신)의 존재(+) 또는 부재(-) 하에, 지시된 위치 151-코돈으로 sfGFP를 발현하는 세포의 형광 그래프를 도시한다. 형광은 도 2b에 도시된 마지막 시점에서 결정되었다. 별표는 sfGFP(TAC)151를 발현하는 세포에서 tRNAPyl의 부재를 나타낸다. TAC, 천연 Tyr 코돈; TAG, 앰버 정지 코돈; n.d., 결정되지 않음. 데이터는 개별 데이터 포인트의 평균으로 나타내고, 각각은 개별 콜로니로부터 증식됨.
도 2b는 도 2a에 도시된 데이터의 서브세트의 시간경과 분석을 도시한다. 플러스 및 마이너스 기호는 각각 배지 중 20 mM PrK의 존재 또는 부재를 나타낸다. t = 0은 PylRS, T7 RNAP, 및 tRNAPyl의 발현을 유도하기 위한 IPTG의 첨가에 해당한다; aTc는 sfGFP의 발현을 유도하기 위해 t = 1 h에 첨가되었다. 데이터는 평균±s.d.로 나타냄, n = 4개의 배양물, 각각 개별 콜로니로부터 증식됨.
도 2c는, TAMRA의 클릭 접합 및/또는 배지에 20 mM PrK의 첨가와 함께 또는 없이, 각각 지시된 위치-151 코돈 및 안티코돈으로 sfGFP 및 tRNAPyl를 발현하는 세포로부터 정제된 sfGFP의 웨스턴 블롯을 도시한다. tRNAPyl는 sfGFP(TAC)151를 발현하는 세포에 존재하지 않는다(-). sfGFP는 도 2b에 도시된 마지막 시점에서 수집된 배양물로부터 정제되었다. 웨스턴 블롯은 α-GFP 항체로 탐침되었으며, sfGFP 및 접합된 TAMRA 둘 다를 검출하도록 이미지화되었다.
도 2d는, LC-MS/MS 및 전구체 이온 세기 기준 정량화(<0.1%에서 검출된 아미노산(평균적으로, 모든 코돈에 대해)은 표시되지 않음; 자세한 내용은 방법을 참조하고 검출된 아미노산의 전체 목록은 표 4를 참조)로 결정된, 각각 지시된 위치-151 코돈 및 동족 안티코돈으로 sfGFP(TAC)151 또는 sfGFP 및 tRNAPyl를 발현하는 세포(도 2b에 도시된 마지막 시점에 수집됨)로부터 정제된 sfGFP의 위치 151에서 아미노산(도 범례에서 그들의 단일 문자 코드로 나타냄)의 상대적 존재비 그래프를 도시한다. 데이터는 개별 데이터 포인트의 평균으로 나타냄, n = 4개의 정제된 sfGFP 샘플, 각각은 개별 콜로니로부터 증식된 배양물로부터의 것임.
도 3a는, 배지 중 5 mM pAzF의 존재(+) 또는 부재(-) 하에, 각각 지시된 위치-151 코돈 및 동족 안티코돈으로 sfGFP(TAC)151 또는 sfGFP 및 tRNA p AzF를 발현하는 세포의 형광 그래프를 도시한다. t = 0은 pAzFRS, T7 RNAP, 및 tRNA p AzF의 발현을 유도하기 위한 IPTG의 첨가에 해당한다; aTc는 sfGFP의 발현을 유도하기 위해 t = 0.5 h에 첨가되었다. TAC, 천연 Tyr 코돈; TAG, 앰버 정지 코돈. 데이터는 평균±s.d.로 나타냄, n = 4개의 배양물, 각각 개별 콜로니로부터 증식됨. pAzF의 부재 하에 sfGFP(AXC)151로 관찰된 형광은 천연 아미노산(가능하게는 Tyr)으로 tRNApAzF(GYT)를 충전한 결과이다.
도 3b는, TAMRA의 클릭 접합 및/또는 배지에 5 mM pAzF의 첨가와 함께 또는 없이, 각각 지시된 위치-151 코돈 및 안티코돈으로 sfGFP 및 tRNA p AzF를 발현하는 세포로부터 정제된 sfGFP의 웨스턴 블롯을 도시한다. 지시되는 경우, 마이너스 기호는 sfGFP(TAC)151를 발현하는 세포에서 tRNA p AzF의 부재를 나타낸다. sfGFP는 도 3a에 도시된 마지막 시점에서 수집된 배양물로부터 정제되었다. 웨스턴 블롯은 α-GFP 항체로 탐침되었으며, sfGFP 및 접합된 TAMRA 둘 다를 검출하도록 이미지화되었다.
도 4는 위치 151에서 다양한 코돈으로 sfGFP를 발현하는 세포의 형광을 도시한다. 지시된 위치-151 코돈을 갖는 sfGFP 플라스미드를 보유하는 세포를 OD600 ∼0.5로 성장시키고 IPTG 및 aTc로 유도하였다. 유도 3 h 후 형광 측정을 수행하였다. 데이터는 개별 데이터 포인트의 평균으로 나타냄, n = 3개의 배양물, 단일 콜로니로부터 분할되고 동시에 성장됨.
도 5a는, 지시된 안티코돈을 갖는 tRNASer와 함께 또는 없이 sfGFP(AXC)151를 발현하는 세포의 형광 그래프를 사용하여, 천연 근접-동족 안티코돈으로 AXC 코돈을 디코딩(decoding)하는 것을 도시한다. 세포는 도 1c 및 도 1d에서 기재된 바와 같이 유도되었으며, 형광 측정은 도 1c에 도시된 마지막 시점에 해당한다. GYT 안티코돈 및 tRNASer의 부재(-tRNA)에 대한 값은 도 1c 및 도 1d에서의 동일한 값에 상응한다. 데이터는 평균±s.d.로 나타냄, n = 4개의 배양물, 각각 개별 콜로니로부터 증식됨.
도 5b는, 지시된 안티코돈을 갖는 tRNASer와 함께 또는 없이 sfGFP(AXC)151를 발현하는 세포의 성장 그래프를 사용하여, 천연 근접-동족 안티코돈으로 AXC 코돈을 디코딩하는 것을 도시한다. 세포는 도 1c 및 도 1d에서 기재된 바와 같이 유도되었으며, 형광 측정은 도 1c에 도시된 마지막 시점에 해당한다. GYT 안티코돈 및 tRNASer의 부재(-tRNA)에 대한 값은 도 1c 및 도 1d에서의 동일한 값에 상응한다. 데이터는 평균±s.d.로 나타냄, n = 4개의 배양물, 각각 개별 콜로니로부터 증식됨.
도 6a는 tRNAPyl로 AXC 및 GXC 코돈을 디코딩하는 세포의 웨스턴 블롯 및 성장을 도시한다. 배지 중 동족 안티코돈을 갖는 tRNAPyl, PylRS, 또는 20 mM PrK의 존재(+) 또는 부재(-) 하에서, 지시된 위치 151-코돈으로 sfGFP를 발현하는 세포로부터의 용해물의 웨스턴 블롯(OD600으로 정규화됨). 블롯은 α-GFP 항체(N-말단 에피토프)로 탐침되었다. 세포는 도 2b에 기재된 것과 동일한 시점에서 유도되고 수집되었다.
도 6b는 도 6a에서 분석된 배양물의 성장을 도시한다. sfGFP의 유도(t = 1 h)와 최종 시점 사이의 OD600의 배수 변화는 tRNAPyl의 아미노아실화에 필요한 모든 성분이 존재할 때 가장 크다. OD600의 절대 값의 변화는 T7 RNAP (및 존재하는 경우tRNAPyl) 유도의 시작 시(t = 0) 세포 밀도의 작은 변화로 인한 것이다. 데이터는 평균±s.d.로 나타냄, n = 4개의 배양물, 각각 개별 콜로니로부터 증식됨.
도 7a는 첨가된 비천연 리보트리포스페이트의 함수로서 tRNAPyl로의 AXC 및 GXC 코돈의 디코딩 및 세포 성장을 도시한다. 배지 중 각각의 비천연 리보트리포스페이트의 존재(+) 또는 부재(-) 하에, 20 mM PrK와 함께 또는 없이, 지시된 위치 151-코돈/안티코돈으로 sfGFP 및 tRNAPyl를 발현하는 세포로부터 정제된 sfGFP의 형광(하단 패널). 세포는 도 2b에 기재된 바와 같이 유도되었으며, TAMRA의 클릭 접합 및 웨스턴 블롯팅을 위해 세포를 수집하고 sfGFP 단백질을 정제하기 전에, 유도 종료 시(∼3.5 h) 형광 측정을 수행하였다.
도 7b는 첨가된 비천연 리보트리포스페이트의 함수로서 tRNAPyl로 AXC 및 GXC 코돈을 디코딩하는 것에 대한 겔을 도시한다. 웨스턴 블롯은 α-GFP 항체로 탐침되었으며, sfGFP 및 접합된 TAMRA 둘 다를 검출하도록 이미지화되었다; 모든 레인은 첨가된 PrK로 성장된 세포로부터 정제된 sfGFP에 해당한다. 데이터는 개별 데이터 포인트의 평균으로 나타냄, n = 3개의 배양물, 각각은 개별 콜로니로부터 증식됨; n.d., 결정되지 않음.
도 7c는 비천연 데옥시리보트리포스페이트 및 각각의 비천연 리보트리포스페이트 둘 다의 존재(+) 또는 부재(-) 하에 sfGFP(TAC)151를 발현하는 세포의 형광 및 성장 그래프를 도시한다. t = 0은 T7 RNAP의 발현을 유도하기 위한 IPTG의 첨가에 해당한다; aTc는 sfGFP의 발현을 유도하기 위해 t = 1 h에 첨가되었다. 데이터는 평균±s.d.로 나타냄, n = 3개의 배양물, 각각은 개별 콜로니로부터 증식됨. 사용된 농도에서(방법 참조), dNaMTP 및 dTPT3TP는 세포 성장을 억제하지 않으나, 두 비천연 리보트리포스페이트, 특히 TPT3TP는 성장을 다소 억제한다.
도 7d는 형광이 도 2b에 도시된 PrK(20 mM)가 첨가된 배양물에 상응하는 세포 성장의 그래프를 도시한다. 천연 코돈으로 sfGFP를 발현으로 세포는 임의의 비천연 트리포스페이트 없이 성장하였으나, 비천연 코돈으로 sfGFP를 발현하는 세포는 비천연 데옥시- 및 리보트리포스페이트 둘 다로 성장하였다. 데이터는 평균±s.d.로 나타냄, n = 4개의 배양물, 각각 개별 콜로니로부터 증식됨.
도 8a는 배지 중 PrK 농도의 함수로서 tRNAPyl로 AXC 및 GXC 코돈을 디코딩하는 것에 대한 겔을 도시한다. TAMRA의 클릭 접합 및 배지 중 지시된 농도로 PrK의 첨가와 함께, 지시된 위치-151 코돈/안티코돈으로 sfGFP 및 tRNAPyl를 발현하는 세포로부터 정제된 sfGFP의 웨스턴 블롯. sfGFP는 도 2b에 기재된 바와 같이 유도되었으며 수집된 세포로부터 정제되었다. 웨스턴 블롯은 α-GFP 항체로 탐침되었으며, sfGFP 및 접합된 TAMRA 둘 다를 검출하도록 이미지화되었다.
도 8b는 배지 중 PrK 농도의 함수로서 tRNAPyl로 AXC 및 GXC 코돈을 디코딩하는 것에 대한 그래프를 도시한다. 배지 중 PrK 농도의 함수로서 각각 지시된 위치-151 코돈 및 안티코돈으로 sfGFP 및 tRNAPyl를 발현하는 세포의 형광(c에 도시된 마지막 시점에서 측정됨). 0 및 20 mM PrK에 대한 형광 값은 각각 도 2b에 도시된 (-) 및 (+) PrK 값과 동일하다. 데이터는 평균±s.d.로 나타냄, n = 4개의 배양물, 각각 개별 콜로니로부터 증식됨.
도 8c는 형광의 시간경과 분석을 도시한다. 명확성을 위해, 각각의 코돈/안티코돈 쌍 및 PrK 농도에 대해 하나의 대표적인 배양물만 도시된다. 이론에 구애됨이 없이, 본 발명자들은 PrK의 부재 하에서 생성된 낮은 수준의 sfGFP는 내인성 tRNA에 의한 디코딩 및 sfGFP에서 UBP 보유의 손실에 기인한다고 생각한다(표 5). 그러나, PrK를 함유하는 sfGFP의 상대량(도 8a) 및 발현된 sfGFP의 절대량(도 8b 및 도 8c)은 배지 중 PrK가 증가함에 따라 용량-의존적 방식으로 증가하여, 궁극적으로 PrK의 거의 완전한 도입을 초래하였으며, 이는 AXC 및 GXC 코돈의 내인성 판독이 충분한 농도의 충전된 PrK-tRNAPyl(GYT) 또는 PrK-tRNAPyl(GYC)로 효율적으로 억제될 수 있다는 것을 제시한다.
도 8d는 도 8c에 나타낸 실험에 대해 다양한 농도의 PrK에서의 세포 성장의 시간경과 분석을 도시한다.
도 9는 형광이 도 3a에 도시된 배양물의 세포 성장을 도시한다. 데이터는 평균±s.d.로 나타냄, n = 4개의 배양물, 각각 개별 콜로니로부터 증식됨.
표 4 | 도 1f 및 도 2d에 기재된 실험에 대해 sfGFP의 위치 151에서 아미노산의 상대적 존재비. tRNA와 함께 또는 없이 각각 지시된 위치-151 코돈 및 안티코돈으로 sfGFP를 발현하는 세포로부터 정제된 sfGFP를 LC-MS/MS에 의해 분석하였다. 리포터 펩티드 LEYNFNSHNVX151ITADK(X = PrK 또는 K 또는 R 이외의 임의의 확인된 천연 아미노산) 및 LEYNFNSHNVX151(X = K 또는 R인 경우)에 대한 추출된 MS1 이온 세기는 모든 관찰가능한 리포터 펩티드에 대한 이온 세기의 합에 대한 퍼센트로서 표현된다. 값에 대한 표는 sfGFP의 위치 151에서 검출되는 모든 아미노산의 평균 상대적 존재비 및 95% CI에 해당한다(n = 4개의 정제된 sfGFP 샘플, 각각은 개별 콜로니로부터 증식된 배양물로부터의 것임). (각각의 도에 나타낸 코돈에 대해 평균적으로) 값 <0.1%은 도 1f 및 도 2d에 제시된 데이터에서 제외된다.
표 5 | UBP 보유. sfGFP의 지시된 위치-151 코돈 및 지시된 tRNA의 안티코돈을 갖는 플라스미드에서 UBP(들)의 보유는, 방법에서 기재되는 바와 같이, sfGFP 유도 전 및 유도 종료 시점에 대해 결정되었다. 보고된 값은 유도 과정 동안의 평균 UBP 보유이다(이들 두 시점에서의 보유로부터 계산됨)±95% CI, n = 4개의 배양물, 각각은 개별 콜로니로부터 증식됨, 별표로 나타낸 값을 제외함, 이 경우 n = 3. n/a, 해당 없음(관련 서열이 천연이거나 부재하기 때문). 모든 플라스미드는 20 mM PrK 또는 5 mM pAzF(Ser 디코딩 실험에 대해서는 예외)의 존재 하에서 성장된 배양물로부터 단리되었다. SerRS는 내인성 이. 콜라이 신테타제로의 충전을 나타낸다. 마이너스 기호는 tRNAPyl를 갖는 세포에서 PylRS의 부재 또는 이소성으로(ectopically) 발현된 tRNA의 부재를 나타낸다. §로 나타낸 줄에서 보유는 sfGFP가 또한 정제되고 LC-MS/MS 및/또는 TAMRA-접합된 sfGFP의 웨스턴 블롯에 의해 분석된 배양물에 해당하며(도 1f(Ser), 도 2d(PrK), 및 도 3b(pAzF) 참조); 별표를 갖는 줄은 도 7a-d에서 분석된 배양물에 해당한다. 모든 4개의 비천연 트리포스페이트가 동일한 수송자를 통해 세포로 진입하므로 서로의 유입을 경쟁적으로 억제한다는 사실에도 불구하고, 배지 중 NaMTP 및/또는 TPT3TP의 존재(+) 또는 부재(-)에서 UBP 보유의 차이는 관찰되지 않았다. 이들 데이터, 및 높은 충실도의 PkK 도입을 갖는 높은 수준의 sfGFP 발현을 위한 두 비천연 리보트리포스페이트의 요구(도 7a-d)는, YZ3에서 PtNTT2 수송자의 발현 수준이 UBP 복제 및 전사를 유지하는데 필요한 비천연 트리포스페이트의 필요 수준을 유입한다는 것을 종합적으로 입증한다.
표 6 | Ser, Prk 및 p AzF 도입 실험에서 발현된 sfGFP 단백질의 수율. 수율을 정제된 단백질의 총량 및 정제에 사용된 배양물의 부피로부터 계산하였다(방법 참조). 데이터는 평균±s.d.이고(n = 4개의 sfGFP 샘플, 각각 개별 콜로니로부터 증식된 배양물로부터 정제됨), 도 1f(SerRS의 경우) 및 도 2d(PylRS의 경우)에서 분석된 동일한 배양물 및 도 3a(pAzFRS의 경우)의 (+) pAzF 샘플에 상응하는 배양물로부터 결정되었다. 정제된 sfGFP의 수율은 그들이 정제된 배양물의 평균 총 형광(OD600으로 정규화되지 않음)과 유사하다. 형광 값은 sfGFP 정제를 위해 세포가 수집된 시점에 해당한다; 도 1c(Ser), 도 2b(PrK), 및 도 3a(pAzF)를 참조한다.
특정 용어
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는, 청구된 주제가 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상기 일반적 설명 및 하기 상세한 설명은 단지 예시적이로 설명적인 것이며, 청구된 임의의 주제를 제한하는 것이 아님을 이해해야 한다. 본 출원에서, 단수형의 사용은 달리 구체적으로 언급되지 않는 한 복수형을 포함한다. 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 지시되지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다는 것에 주목해야 한다. 본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 또한, 용어 "포함하는" 및 다른 형태, 예컨대 "포함하다" 및 "포함된"의 사용은 제한적이지 않다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 범위 및 양은 "약" 특정 값 또는 범위로 표현될 수 있다. 약은 또한 정확한 양을 포함한다. 따라서, "약 5 μL"는 "약 5 μL" 및 또한 "5 μL"를 포함한다. 일반적으로, 용어 "약"은 실험 오차 내에 있는 것으로 예상되는 양을 포함한다.
본원에서 사용된 섹션 제목은 단지 조직화 목적을 위한 것이며, 기재된 주제를 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다.
개요
생명체의 정보는 4-문자 유전자 알파벳에 의해 코딩되며, 이는 2개의 염기쌍: (d)G-(d)C 및 (d)A-dT/U의 선택적 형성에 의해 가능해진다. 2개의 합성 뉴클레오티드 사이에 형성되는 제3의 비천연 염기쌍(UBP)은 이 시스템을 확장시킴으로써 정보 저장에 대한 잠재력을 증가시키며, 지대한 학문적 및 실제적 영향을 갖는다. 보고된 다양한 합성 뉴클레오티드 유사체 중에서, 몇몇은 다른 천연 DNA 듀플렉스 내에서 서로 안정적으로 쌍을 이루나 폴리머라제에 의해 인식되지 않으며, 이는 듀플렉스 DNA에서 안정한 쌍 형성을 지배하는 힘이 폴리머라제-매개된 복제를 지배하는 힘과 동일하지 않다는 것을 나타낸다. 그 결과, 복제가능한 UBP, 예컨대 천연 뉴클레오티드에 의해 사용되지 않는 상보적 수소 결합(H-결합) 패턴을 통해 상호작용하도록 설계된 UBP를 개발하기 위한 상이한 접근법이 수행되었다. 천연 염기쌍은 H-결합을 통해 형성되지만, H-결합이 유전자 정보의 저장 (또는 재생(retrival))의 기초가 되기에 충분한 유일한 힘이라고 선험적으로 추정할 이유는 없다. 예컨대, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편(Kf)은 dA를, 디플루오로톨루엔 핵염기가 충분한 H-결합이 불가능한 티민의 형상 모방체인, 비천연 뉴클레오티드 dF와 쌍을 이룬다는 것이 입증되었다. 이는 DNA 복제의 "기하학적 선택" 메커니즘을 지지하며, H-결합 이외의 힘이 또한 복제에 기여함을 제시한다.
시험관내에서 복제, 전사 및 단백질로 번역되는 UBP의 개발은 천연 정보의 저장 및 재생의 기초가 되는 힘에 대한 통찰력을 제공하며, 또한 화학 및 합성 생물학에서 광범위한 적용을 가능하게 한다. 그러나, UBP를 개발하려는 많은 노력의 궁극적인 목표는 반합성 유기체(SSO) - 증가된 (비천연 또는 합성적, 사람이 만든 것을 의미) 정보를 안정하게 저장하고 재생하는 유기체 - 의 기초로서 그들을 생체내에서 사용하는 것이다. 또한, 이러한 SSO는 인간 건강을 포함하여 혁신적인 실제 적용을 갖는다. 가장 주목할 만하게는, SSO는 단백질 치료법의 성장하는 분야를 혁신시킨다. 그러나, 종래의 소분자 치료법과 비교하여, 단백질 치료법은 20개의 천연 아미노산으로 이용가능한 유한한 화학적 다양성으로 인해 그들의 분자 특성이 심각하게 제한된다.
본 발명자들은 최근에 패오닥틸룸 트리코르누툼(Phaeodactylum tricornutum)으로부터의 뉴클레오시드 트리포스페이트 수송자(PtNTT2)에 의해 배지로부터 필수의 비천연 트리포스테이트를 유입하고 이어서 그들을 사용하여 UBP dNaM-dTPT3을 함유하는 플라스미드를 복제하는 이. 콜라이 SSO의 생성을 보고하였다. 이후, 본 발명자들은 UBP를 함유하는 DNA가 T7 RNA 폴리머라제에 의해 SSO에서 전사될 수 있으며, 비천연 뉴클레오티드가 mRNA의 코돈으로 도입되는 경우, ncAA로 충전되고 그들의 안티코돈에 동족(cognate) 비천연 뉴클레오티드를 함유하는 상이한 tRNA가 비천연 코돈을 효율적이고 선택적으로 디코딩할 수 있다는 것을 밝혀내었다. UBP는 상이한 코돈의 상이한 위치에서 조합될 수 있으므로, 이는 UBP가 다수의 상이한 ncAA를 갖는 단백질을 코딩하는 데 사용될 수 있음을 제시한다.
특정 실시양태에서, 본원에는 돌연변이 tRNA를 사용하는, 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 합성하기 위한 방법, 조성물 및 키트가 개시된다. 일부 예에서, 단백질은 무세포 번역 시스템에서 합성된다. 일부 예에서, 단백질은 세포 또는 반합성 유기체(SSO)에서 합성된다. 일부 예에서, 반합성 유기체는 미생물을 포함한다. 일부 예에서, 반합성 유기체는 세균을 포함한다. 일부 예에서, 반합성 유기체는 에쉐리키아 콜라이를 포함한다. 일부 예에서, 돌연변이 tRNA는 돌연변이 안티코돈 서열을 함유한다. 일부 예에서, 돌연변이 안티코돈 서열은 표 1에서 예시되는 안티코돈 서열이다. 일부 예에서, 돌연변이 안티코돈 서열은 표 2에서 예시되는 안티코돈 서열이다. 일부 예에서, 돌연변이 안티코돈 서열은 표 3에서 예시되는 안티코돈 서열이다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
일부 예에서, 돌연변이 tRNA의 돌연변이 안티코돈은 돌연변이 코돈과 쌍을 이룬다. 일부 실시양태에서, 돌연변이 코돈은 표 1에서 예시되는 돌연변이 코돈이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이 코돈은 표 2에서 예시되는 돌연변이 코돈이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이 코돈은 표 3에서 예시되는 돌연변이 코돈이다.
일부 실시양태에서, 표 1, 표 2 및 표 3에서 예시되는 Y 및 X는 비천연 뉴클레오티드의 비천연 염기를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 비천연 염기는 2-아미노아데닌-9-일, 2-아미노아데닌, 2-F-아데닌, 2-티오우라실, 2-티오-티민, 2-티오시토신, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 알킬 유도체, 2-아미노-아데닌, 2-아미노-프로필-아데닌, 2-아미노피리딘, 2-피리돈, 2'-데옥시우리딘, 2-아미노-2'-데옥시아데노신, 3-데아자구아닌, 3-데아자아데닌, 4-티오-우라실, 4-티오-티민, 우라실-5-일, 히포크산틴-9-일(I), 5-메틸-시토신, 5-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 히포크산틴, 5-브로모, 및 5-트리플루오로메틸 우라실 및 시토신; 5-할로우라실, 5-할로시토신, 5-프로피닐-우라실, 5-프로피닐 시토신, 5-우라실, 5-치환된, 5-할로, 5-치환된 피리미딘, 5-히드록시시토신, 5-브로모시토신, 5-브로모우라실, 5-클로로시토신, 클로르화된 시토신, 사이클로시토신, 시토신 아라비노시드, 5-플루오로시토신, 플루오로피리미딘, 플루오로우라실, 5,6-디히드로시토신, 5-요오도시토신, 히드록시우레아, 요오도우라실, 5-니트로시토신, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-플루오로우라실, 및 5-요오도우라실, 아데닌 및 구아닌의 6-알킬 유도체, 6-아자피리미딘, 6-아조-우라실, 6-아조 시토신, 아자시토신, 6-아조-티민, 6-티오-구아닌, 7-메틸구아닌, 7-메틸아데닌, 7-데아자구아닌, 7-데아자구아노신, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-8-아자구아닌, 8-아자구아닌, 8-아자아데닌, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 및 8-히드록실 치환된 아데닌 및 구아닌; N4-에틸시토신, N-2 치환된 퓨린, N-6 치환된 퓨린, O-6 치환된 퓨린, 듀플렉스 형성의 안정성을 증가시키는 것, 범용 핵산, 소수성 핵산, 무차별 핵산, 크기 확장된 핵산, 플루오르화된 핵산, 트리사이클릭 피리미딘, 페녹사진 시티딘([5,4-b][l,4]벤족사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘(1H-피리미도[5,4-b][l,4]벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프, 페녹사진 시티딘(9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-b][l,4]벤족사진-2(3H)-온), 카르바졸 시티딘(2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘(H-피리도 [3',2':4,5]피롤로 [2,3-d]피리미딘-2-온), 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 히포크산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시히드록실메틸) 우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 베타-D-갈락토실케오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실케오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5옥시아세트산, 위부톡소신, 슈도우라실, 케오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥스아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥스아세트산, 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필) 우라실, (acp3)w, 및 2,6-디아미노퓨린, 및 퓨린 또는 피리미딘 염기가 헤테로사이클로 대체된 것으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 예에서, 비천연 뉴클레오티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다(명확성을 위해 핵염기 부분만 나타내고 리보스 및 포스페이트 골격은 생략함):
Figure pct00006
.
일부 예에서, 비천연 뉴클레오티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다(명확성을 위해 핵염기 부분만 나타내고 리보스 및 포스페이트 골격은 생략함):
Figure pct00007
.
일부 예에서, 비천연 뉴클레오티드는 추가로 비천연 당 모이어티를 포함한다. 일부 예에서, 비천연 당 모이어티는 2' 위치에서의 변형: OH; 치환된 저급 알킬, 알카릴, 아르알킬, O-알카릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2 CH3, ONO2, NO2, N3, NH2F; O-알킬, S-알킬, N-알킬; O-알케닐, S-알케닐, N-알케닐; O-알키닐, S-알키닐, N-알키닐; O-알킬-O-알킬, 2'-F, 2'-OCH3, 2'-O(CH2)2OCH3(여기서, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 비치환된 C1-C10 알킬, C2-C10 알케닐, C2-C10 알키닐, -O[(CH2)nO]mCH3, -O(CH2)nOCH3, -O(CH2)nNH2, -O(CH2)nCH3, -O(CH2)n-ONH2, 및 -O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2일 수 있고, 여기서 n 및 m은 1 내지 약 10이다); 및/또는 5' 위치에서의 변형: 5'-비닐, 5'-메틸(R 또는 S), 4' 위치에서의 변형, 4'-S, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단 기, 리포터 기, 인터칼레이터, 올리고뉴클레오티드의 약동학적 특성을 개선하기 위한 기, 또는 올리고뉴클레오티드의 약력학적 특성을 개선하기 위한 기, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 예에서, 돌연변이 안티코돈 또는 돌연변이 코돈은 추가로 비천연 골격을 포함한다. 일부 예에서, 돌연변이 안티코돈은 추가로 비천연 골격을 포함한다. 일부 예에서, 돌연변이 코돈은 추가로 비천연 골격을 포함한다. 일부 예에서, 비천연 골격은 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, C1-C10 포스포네이트, 3'-알킬렌포스포네이트, 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포르아미데이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트, 아미노알킬포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 보라노포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 예에서, 비천연 뉴클레오티드는 폴리머라제에 의해 인식된다. 일부 예에서, 폴리머라제는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제 또는 역전사효소이다. 일부 예에서, 폴리머라제는 Φ29, B103, GA-1, PZA, Φ15, BS32, M2Y, Nf, G1, Cp-1, PRD1, PZE, SF5, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722, L17, ThermoSequenase®, 9°NmTM, TherminatorTM DNA 폴리머라제, Tne, Tma, TfI, Tth, TIi, 스토펠(Stoffel) 단편, VentTM 및 Deep VentTM DNA 폴리머라제, KOD DNA 폴리머라제, Tgo, JDF-3, Pfu, Taq, T7 DNA 폴리머라제, T7 RNA 폴리머라제, PGB-D, UlTma DNA 폴리머라제, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 III, 고세균 DP1I/DP2 DNA 폴리머라제 II, 9°N DNA 폴리머라제, Taq DNA 폴리머라제, Phusion® DNA 폴리머라제, Pfu DNA 폴리머라제, SP6 RNA 폴리머라제, RB69 DNA 폴리머라제, 조류 골수아세포증 바이러스(AMV) 역전사효소, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV) 역전사효소, SuperScript® II 역전사효소, 및 SuperScript® III 역전사효소를 포함한다.
일부 예에서, 폴리머라제는 DNA 폴리머라제 1-클레노우 단편, Vent 폴리머라제, Phusion® DNA 폴리머라제, KOD DNA 폴리머라제, Taq 폴리머라제, T7 DNA 폴리머라제, T7 RNA 폴리머라제, TherminatorTM DNA 폴리머라제, POLB 폴리머라제, SP6 RNA 폴리머라제, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 III, 조류 골수아세포증 바이러스(AMV) 역전사효소, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV) 역전사효소, SuperScript® II 역전사효소, 또는 SuperScript® III 역전사효소이다.
일부 예에서, 비천연 뉴클레오티드는 전사 동안 폴리머라제에 의해 mRNA로 도입되어 돌연변이 코돈을 함유하는 돌연변이 mRNA를 생성한다. 일부 예에서, 비천연 뉴클레오티드는 전사 동안 폴리머라제에 의해 mRNA로 도입되어 돌연변이 mRNA를 생성한다.
일부 예에서, 비천연 뉴클레오티드는 전사 동안 폴리머라제에 의해 tRNA로 도입되어 돌연변이 안티코돈을 함유하는 돌연변이 tRNA를 생성한다. 일부 예에서, 비천연 뉴클레오티드는 전사 동안 폴리머라제에 의해 tRNA로 도입되어 돌연변이 tRNA를 생성한다.
일부 예에서, 돌연변이 tRNA는 비천연 아미노산 잔기를 나타낸다. 일부 예에서, 비천연 아미노산 잔기는 비천연 아미노산, 예컨대 문헌[Liu C.C., Schultz, P.G. Annu. Rev. Biochem. 2010, 79, 413]에 기재된 것이다.
일부 예에서, 비천연 아미노산을 함유하는 단백질은 돌연변이 tRNA 및 돌연변이 mRNA를 사용하여 번역 동안 생성된다. 일부 예에서, 비천연 아미노산을 함유하는 단백질은 무세포 번역 시스템 하에서 생성된다. 일부 예에서, 단백질은 세포 또는 반합성 유기체(SSO)에서 합성된다. 일부 예에서, 반합성 유기체는 미생물을 포함한다. 일부 예에서, 반합성 유기체는 세균을 포함한다. 일부 예에서, 반합성 유기체는 에쉐리키아 콜라이를 포함한다.
핵산
핵산(예컨대, 본원에서 표적 핵산, 표적 뉴클레오티드 서열, 관심의 핵산 서열 또는 관심의 핵산 영역으로도 지칭됨)은 임의의 공급원 또는 조성물로부터의 것, 예컨대 DNA, cDNA, gDNA(게놈 DNA), RNA, siRNA(짧은 억제성 RNA), RNAi, tRNA 또는 mRNA일 수 있으며, 임의의 형태(예컨대, 선형, 환형, 슈퍼코일, 단일 가닥, 이중 가닥 등)일 수 있다. 핵산은 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 핵산은 천연 및 비천연 핵산을 포함할 수 있다. 핵산은 또한 비천연 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA 유사체(예컨대, 염기 유사체, 당 유사체 및/또는 비천연 골격 등을 함유)를 포함할 수 있다. 용어 "핵산"은 특정 길이의 폴리뉴클레오티드 쇄를 지칭하거나 추론하지 않으므로 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드가 또한 정의에 포함되는 것으로 이해된다. 예시적인 천연 뉴클레오티드는, 제한 없이, ATP, UTP, CTP, GTP, ADP, UDP, CDP, GDP, AMP, UMP, CMP, GMP, dATP, dTTP, dCTP, dGTP, dADP, dTDP, dCDP, dGDP, dAMP, dTMP, dCMP 및 dGMP를 포함한다. 예시적인 천연 데옥시리보뉴클레오티드는 dATP, dTTP, dCTP, dGTP, dADP, dTDP, dCDP, dGDP, dAMP, dTMP, dCMP 및 dGMP를 포함한다. 예시적인 천연 리보뉴클레오티드는 ATP, UTP, CTP, GTP, ADP, UDP, CDP, GDP, AMP, UMP, CMP 및 GMP를 포함한다. RNA에 대해, 우라실 염기는 우리딘이다. 핵산은 때때로 벡터, 플라스미드, 파아지, 자율 복제 서열(ARS), 센트로미어, 인공 염색체, 효모 인공 염색체(예컨대, YAC) 또는 복제하거나 복제될 수 있는 다른 핵산이다. 비천연 핵산은 핵산 유사체일 수 있다.
비천연 핵산
뉴클레오티드 유사체 또는 비천연 뉴클레오티드는 염기, 당 또는 포스페이트 모이어티에 대해 임의의 유형의 변형을 함유하는 뉴클레오티드를 포함한다. 변형은 화학적 변형을 포함할 수 있다. 변형은, 예컨대 골격, 당 성분 또는 뉴클레오티드 염기의 3'OH 또는 5'OH 기의 것일 수 있다. 변형은 비천연 발생 링커 분자 및/또는 가닥간 또는 가닥내 가교 결합의 첨가를 포함할 수 있다. 일 측면에서, 변형된 핵산은 3'OH 또는 5'OH 기, 골격, 당 성분, 또는 뉴클레오티드 염기 중 하나 이상의 변형, 및/또는 비천연 발생 링커 분자의 첨가를 포함한다. 일 측면에서, 변형된 골격은 포스포디에스테르 골격 이외의 골격을 포함한다. 일 측면에서, 변형된 당은 (변형된 DNA에서) 데옥시리보스 이외의 당 또는 (변형된 RNA에서) 리보스 이외의 당을 포함한다. 일 측면에서, 변형된 염기는 (변형된 DNA에서) 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 티민 이외의 염기 또는 (변형된 RNA에서) 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 우라실 이외의 염기를 포함한다.
핵산은 적어도 하나의 변형된 염기를 포함할 수 있다. 염기 모이어티에 대한 변형은 A, C, G, 및 T/U의 천연적 및 합성적 변형 뿐만 아니라 상이한 퓨린 또는 피리미딘 염기를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 변형은 (변형된 DNA에서) 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 티민의 변형된 형태 또는 (변형된 RNA에서) 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 우라실의 변형된 형태에 대한 것이다.
비천연 핵산의 변형된 염기는 우라실-5-일, 히포크산틴-9-일(I), 2-아미노아데닌-9-일, 5-메틸시토신(5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 히포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 특정 비천연 핵산, 예컨대 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2 치환된 퓨린, N-6 치환된 퓨린, O-6 치환된 퓨린, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실, 5-프로피닐시토신, 5-메틸시토신, 듀플렉스 형성의 안정성을 증가시키는 것, 범용 핵산, 소수성 핵산, 무차별 핵산, 크기 확장된 핵산, 플루오르화된 핵산, 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 2-아미노프로필아데닌을 포함하는 N-2, N-6 및 0-6 치환된 퓨린, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신, 5-메틸시토신(5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 히포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸, 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실, 5-할로시토신, 5-프로피닐(-C≡C-CI¼)우라실, 5-프로피닐 시토신, 피리미딘 핵산의 기타 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 6-아조 시토신, 6-아조 티민, 5-우라실 슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸, 기타 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌, 7-메틸아데닐, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌, 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌, 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌, 3-데아자아데닌, 트리사이클릭 피리미딘, 페녹사진 시티딘([5,4-b][l,4]벤족사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘(1H-피리미도[5,4-b][l,4]벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프, 페녹사진 시티딘(예컨대, 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-b][l,4]벤족사진-2(3H)-온), 카르바졸 시티딘(2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘(H-피리도 [3',2':4,5]피롤로 [2,3-d]피리미딘-2-온), 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로사이클로 대체된 것, 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘, 2-피리돈, 아자시토신, 5-브로모시토신, 브로모우라실, 5-클로로시토신, 클로르화된 시토신, 사이클로시토신, 시토신 아라비노시드, 5-플루오로시토신, 플루오로피리미딘, 플루오로우라실, 5,6-디히드로시토신, 5-요오도시토신, 히드록시우레아, 요오도우라실, 5-니트로시토신, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-플루오로우라실, 및 5-요오도우라실, 2-아미노-아데닌, 6-티오-구아닌, 2-티오-티민, 4-티오-티민, 5-프로피닐-우라실, 4-티오-우라실, N4-에틸시토신, 7-데아자구아닌, 7-데아자-8-아자구아닌, 5-히드록시시토신, 2'-데옥시우리딘, 2-아미노-2'-데옥시아데노신, 및 문헌[U.S. 특허 번호 3,687,808; 4,845,205; 4,910,300; 4,948,882; 5,093,232; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121; 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,681,941; 5,750,692; 5,763,588; 5,830,653 및 6,005,096; WO 99/62923; Kandimalla et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813; The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, Kroschwitz, J.I., Ed., John Wiley & Sons, 1990, 858-859; Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613; and Sanghvi, Y.S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, Crooke, S.T. and Lebleu, B., Eds., CRC Press, 1993, 273-288]에 기재된 것이 있다. 추가의 염기 변형은, 예컨대 문헌[미국 특허 번호 3,687,808, Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, and Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B. ed., CRC Press, 1993]에서 찾아질 수 있다.
다양한 헤테로사이클릭 염기 및 다양한 당 모이어티 (및 당 유사체)를 포함하는 비천연 핵산은 관련 기술분야에서 이용 가능하며, 핵산은 천연 발생 핵산의 기본 5개의 염기 성분 이외의 하나 또는 수개의 헤테로사이클릭 염기를 포함할 수 있다. 예컨대, 헤테로사이클릭 염기는 우라실-5-일, 시토신-5-일, 아데닌-7-일, 아데닌-8-일, 구아닌-7-일, 구아닌-8-일, 4-아미노피롤로 [2.3-d] 피리미딘-5-일, 2-아미노-4-옥소피롤로 [2,3-d] 피리미딘-5-일, 2-아미노-4-옥소피롤로 [2.3-d] 피리미딘-3-일 기를 포함할 수 있고, 여기서 퓨린은 9-위치를 통해, 피리미딘은 1-위치를 통해, 피롤로피리미딘은 7-위치를 통해, 피라졸로피리미딘은 1-위치를 통해 핵산의 당 모이어티에 부착된다.
뉴클레오티드 유사체는 또한 포스페이트 모이어티에서 변형될 수 있다. 변형된 포스페이트 모이어티는 2개의 뉴클레오티드 사이의 연결이 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'-알킬렌포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 보라노포스페이트를 함유하도록 변형될 수 있다. 2개의 뉴클레오티드 사이의 이들 포스페이트 또는 변형된 포스페이트 연결은 3'-5' 연결 또는 2'-5' 연결을 통해 이루어질 수 있으며, 연결은 3'-5'에서 5'-3'로 또는 2'-5'에서 5'-2'로와 같은 역 극성(inverted polarity)을 함유할 수 있다. 다양한 염, 혼합 염 및 유리산 형태가 또한 포함된다. 다수의 미국 특허가 변형된 포스페이트를 함유하는 뉴클레오티드를 제조 및 사용하는 방법을 교시하며, 미국 특허 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 및 5,625,050(각각 참조로 본원에 포함됨)을 포함하나 이로 제한되지 않는다.
비천연 핵산은 2',3'-디데옥시-2',3'-디데히드로-뉴클레오시드(PCT/US2002/006460), 5'-치환된 DNA 및 RNA 유도체(PCT/US2011/033961; Saha et al, J. Org Chem., 1995, 60, 788-789; Wang et al, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 1999, 9, 885-890; and Mikhailov et al, Nucleosides & Nucleotides, 1991, 10(1-3), 339-343; Leonid et al, 1995, 14(3-5), 901-905; and Eppacher et al, Helvetica Chimica Acta, 2004, 87, 3004-3020; PCT/JP2000/004720; PCT/JP2003/002342; PCT/JP2004/013216; PCT/JP2005/020435; PCT/JP2006/315479; PCT/JP2006/324484; PCT/JP2009/056718; PCT/JP2010/067560), 또는 변형된 염기를 갖는 모노포스페이트로 제조된 5'-치환된 단량체(Wang et al, Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids, 2004, 23 (1 & 2), 317-337)를 포함할 수 있다.
비천연 핵산은 당 고리의 5'-위치 및 2'-위치에서 변형, 예컨대 5'-CH2 치환된 2'-O-보호된 뉴클레오시드를 포함할 수 있다(Wu et al., Helvetica Chimica Acta, 2000, 83, 1127-1143 and Wu et al. Bioconjugate Chem. 1999, 10, 921-924). 비천연 핵산은 올리고뉴클레오티드로의 도입을 위해 제조되었던 아미드 연결된 뉴클레오시드 이량체를 포함할 수 있으며, 여기서 이량체(5'에서 3'로)에서 3' 연결된 뉴클레오시드는 2'-OCH3 및 5'-(S)-CH3를 포함한다(Mesmaeker et al, Synlett, 1997, 1287-1290). 비천연 핵산은 비천연 핵산은 2'-치환된 5'-CH2 (또는 O) 변형된 뉴클레오시드를 포함할 수 있다(PCT/US92/01020). 비천연 핵산은 5'메틸렌포스포네이트 DNA 및 RNA 단량체, 및 이량체를 포함할 수 있다(Bohringer et al, Tet. Lett., 1993, 34, 2723-2726; Collingwood et al, Synlett, 1995, 7, 703-705; and Hutter et al, Helvetica Chimica Acta, 2002, 85, 2777-2806). 비천연 핵산은 2'-치환을 갖는 5'-포스포네이트 단량체(US 2006/0074035) 및 다른 변형된 5'-포스포네이트 단량체(WO 97/35869)를 포함할 수 있다. 비천연 핵산은 5'-변형된 메틸렌포스포네이트 단량체를 포함할 수 있다(EP614907 및 EP629633). 비천연 핵산은 5' 및/또는 6' 위치에 히드록실 기를 포함하는 5' 또는 6'-포스포네이트 리보뉴클레오시드의 유사체를 포함할 수 있다(Chen et al, Phosphorus, Sulfur and Silicon, 2002, 777, 1783-1786; Jung et al, Bioorg. Med. Chem., 2000, 8, 2501-2509, Gallier et al, Eur. J. Org. Chem., 2007, 925-933 and Hampton et al, J. Med. Chem., 1976, 19(8), 1029-1033). 비천연 핵산은 5'-포스페이트 기를 갖는 5'-포스포네이트 데옥시리보뉴클레오시드 단량체 및 이량체를 포함할 수 있다(Nawrot et al, Oligonucleotides, 2006, 16(1), 68-82). 비천연 핵산은 6'-포스포네이트 기를 갖는 뉴클레오시드를 포함할 수 있으며, 여기서 5' 또는/및 6'-위치는 비치환되거나 티오-tert-부틸 기(SC(CH3)3) (및 이의 유사체); 메틸렌아미노 기(CH2NH2) (및 이의 유사체) 또는 시아노 기(CN) (및 이의 유사체)로 치환된다(Fairhurst et al, Synlett, 2001, 4, 467-472; Kappler et al, J. Med. Chem., 1986, 29, 1030-1038 and J. Med. Chem., 1982, 25, 1179-1184; Vrudhula et al, J. Med. Chem., 1987, 30, 888-894; Hampton et al, J. Med. Chem., 1976, 19, 1371-1377; Geze et al, J. Am. Chem. Soc, 1983, 105(26), 7638-7640 and Hampton et al, J. Am. Chem. Soc, 1973, 95(13), 4404-4414)
비천연 핵산은 또한 당 모이어티의 변형을 포함할 수 있다. 본 발명의 핵산은 임의적으로 당 기가 변형된 하나 이상의 뉴클레오시드를 함유할 수 있다. 이러한 당 변형된 뉴클레오시드는 증진된 뉴클레아제 안정성, 증가된 결합 친화성, 또는 일부 다른 유익한 생물학적 특성을 부여할 수 있다. 특정 실시양태에서, 핵산은 화학적으로 변형된 리보푸라노스 고리 모이어티를 포함한다. 화학적으로 변형된 리보푸라노스 고리의 예는, 제한 없이, 치환 기(5' 및/또는 2' 치환 기 포함)의 첨가; 비사이클릭 핵산(BNA)을 형성하기 위한 2개의 고리 원자의 브릿징; 리보실 고리 산소 원자의 S, N(R) 또는 C(R1)(R2)(R = H, C1-C12 알킬 또는 보호 기)로의 대체; 및 이들의 조합을 포함한다. 화학적으로 변형된 당의 예는 WO 2008/101157, US 2005/0130923 및 WO 2007/134181에서 찾아질 수 있다.
변형된 핵산은 변형된 당 또는 당 유사체를 포함할 수 있다. 따라서, 리보스 및 데옥시리보스 이외에, 당 모이어티는 펜토스, 데옥시펜토스, 헥소스, 데옥시헥소스, 글루코스, 아라비노스, 크실로스, 릭소스 및 당 "유사체" 사이클로펜틸 기일 수 있다. 당는 피라노실 또는 푸라노실 형태로 존재할 수 있다. 당 모이어티는 리보스, 데옥시리보스, 아라비노스 또는 2'-O-알킬리보스의 푸라노시드일 수 있으며, 당는 각각의 헤테로사이클릭 염기에 [알파] 또는 [베타] 아노머 배치로 부착될 수 있다. 당 변형은 2'-알콕시-RNA 유사체, 2'-아미노-RNA 유사체, 2'-플루오로-DNA, 및 2'-알콕시- 또는 아미노-RNA/DNA 키메라를 포함하나 이로 제한되지 않는다. 예컨대, 당 변형은 2'-O-메틸-우리딘 및 2'-O-메틸-시티딘을 포함할 수 있다. 당 변형은 2'-O-알킬-치환된 데옥시리보뉴클레오시드 및 2'-O-에틸렌글리콜 유사 리보뉴클레오시드를 포함한다. 이들 당 또는 당 유사체 및 이러한 당 또는 유사체가 헤테로사이클릭 염기(핵산 염기)에 부착된 각각의 "뉴클레오시드"의 제조는 공지되어 있다. 당 변형은 또한 다른 변형과 함께 제조 및 조합될 수 있다.
당 모이어티에 대한 변형은 리보스 및 데옥시 리보스의 천연 변형 뿐만 아니라 비천연 변형을 포함한다. 당 변형은 2' 위치에서의 하기 변형: OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬을 포함하나 이로 제한되지 않고, 여기서 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 비치환된 C1 내지 C10, 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있다. 2' 당 변형은 또한 -O[(CH2)nO]mCH3, -O(CH2)nOCH3, -O(CH2)nNH2, -O(CH2)nCH3, -O(CH2)n-ONH2, 및 -O(CH2)nON[(CH2)nCH3)J2를 포함하나 이로 제한되지 않으며, 여기서 n 및 m은 1 내지 약 10이다.
2' 위치에서의 다른 변형은 C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알카릴, 아르알킬, O-알카릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2 CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단 기, 리포터 기, 인터칼레이터, 올리고뉴클레오티드의 약동학적 특성을 개선하기 위한 기, 또는 올리고뉴클레오티드의 약력학적 특성을 개선하기 위한 기, 및 유사한 특성을 갖는 다른 치환체를 포함하나 이로 제한되지 않는다. 유사한 변형이 또한 당 상의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 상 또는 2'-5' 연결된 올리고뉴클레오티드 내의 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 이루어질 수 있다. 변형된 당는 또한 브릿징 고리 산소에서 변형, 예컨대 CH2 및 S을 함유하는 것을 포함할 것이다. 뉴클레오티드 당 유사체는 또한 펜토푸라노실 당 대신에 당 모방체, 예컨대 사이클로부틸 모이어티를 가질 수 있다. 이러한 변형된 당 구조의 제조를 교시하는 다수의 미국 특허, 예컨대 미국 특허 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,71 1; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,681,941; 및 5,700,920이 있으며, 각각은 전부 본원에 참조로 포함되고, 다양한 염기 변형을 자세히 설명하고 기재한다. 이들 특허 각각은 본원에 참조로 포함된다.
변형된 당 모이어티를 갖는 핵산의 예는, 제한 없이, 5'-비닐, 5'-메틸(R 또는 S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3, 및 2'-O(CH2)2OCH3 치환기를 포함하는 핵산을 포함한다. 2' 위치에서의 치환은 또한 알릴, 아미노, 아지도, 티오, O-알릴, O-C C1O 알킬, OCF3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), 및 O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn)로부터 선택될 수 있고, 여기서 Rm 및 Rn은 각각 독립적으로 H 또는 치환되거나 비치환된 C1-C10 알킬이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 하나 이상의 비사이클릭 핵산을 포함한다. 특정한 이러한 실시양태에서, 비사이클릭 핵산은 4' 및 2' 리보실 고리 원자 사이에 브릿지를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 핵산은 하나 이상의 비사이클릭 핵산을 포함하며, 여기서 브릿지는 4'에서 2'로의 비사이클릭 핵산을 포함한다. 이러한 4'에서 2'로의 비사이클릭 핵산의 예는 화학식: 4'-(CH2)-O-2'(LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2'(ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' 및 4'-CH(CH2OCH3)-0-2' 및 이의 유사체(미국 특허 7,399,845(2008년 7월 15일 허여)를 참조); 4'-C(CH3)(CH3)-0-2' 및 이의 유사체(WO2009/006478, WO2008/150729, US2004/0171570, 미국 특허 7,427,672, 문헌[Chattopadhyaya, et al, J. Org. Chem.,2 09, 74, 118-134), 및 WO 2008/154401(2008년 12월 8일 공개)를 참조]를 포함하나 이로 제한되지 않는다. 또한, 예컨대 문헌(Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al, Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al, J. Am. Chem. Soc, 129(26) 8362-8379 (Jul. 4, 2007); Elayadi et al, Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al, Chem. Biol, 2001, 8, 1-7; Oram et al, Curr. Opinion Mol Ther., 2001, 3, 239-243); 미국 특허 번호 7,053,207, 6,268,490, 6,770,748, 6,794,499, 7,034,133, 6,525,191, 6,670,461, 및 7,399,845; 국제 출원 WO 2004/106356, WO 1994/14226, WO 2005/021570, 및 WO 2007/134181; 미국 특허 공개 번호 US2004/0171570, US2007/0287831, 및 US2008/0039618; 미국 특허 일련 번호 12/129,154, 60/989,574, 61/026,995, 61/026,998, 61/056,564, 61/086,231, 61/097,787, 및 61/099,844; 및 PCT 국제 출원 번호 PCT/US2008/064591, PCT US2008/066154, 및 PCT US2008/068922, PCT/DK98/00393; 및 미국 특허 번호 4,849,513; 5,015,733; 5,118,800; 및 5,118,802를 참조한다.
특정 실시양태에서, 핵산은 연결된 핵산을 포함할 수 있다. 핵산은 임의의 핵산간 연결을 이용하여 함께 연결될 수 있다. 핵산간 연결 기의 2개의 주요 부류는 인 원자의 존재 또는 부재에 의해 정의된다. 대표적인 인 함유 핵산간 연결은 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트, 및 포스포로티오에이트(P=S)를 포함하나 이로 제한되지 않는다. 대표적인 비-인 함유 핵산간 연결 기는 메틸렌메틸이미노(-CH2-N(CH3)-O-CH2-), 티오디에스테르(-O-C(O)-S-), 티오노카르바메이트(-O-C(O)(NH)-S-); 실록산(-O-Si(H)2-O-); 및 N,N*-디메틸히드라진(-CH2-N(CH3)-N(CH3)-)을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 키랄 원자를 갖는 핵산간 연결은 별도의 거울상이성질체, 예컨대 알킬포스포네이트 및 포스포로티오에이트로서 라세미체 혼합물을 제조할 수 있다. 비천연 핵산은 단일 변형을 함유할 수 있다. 비천연 핵산은 하나의 모이어티 내에서 또는 상이한 모이어티들 사이에서 다수의 변형을 함유할 수 있다.
핵산에 대한 골격 포스페이트 변형은 메틸 포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트(브릿징 또는 비-브릿징), 포스포트리에스테르, 포스포로디티오에이트, 포스포디티오에이트, 및 보라노포스페이트를 포함하나 이로 제한되지 않으며, 임의의 조합으로 사용될 수 있다. 다른 비-포스페이트 연결도 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 골격 변형(예컨대, 메틸포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포로아미데이트 및 포스포로디티오에이트 뉴클레오티드간 연결)은 변형된 핵산에 면역조절 활성을 부여하고/하거나 생체내에서 그들의 안정성을 증진시킬 수 있다.
인 유도체 (또는 변형된 포스페이트 기)는 당 또는 당 유사체 모이어티에 부착될 수 있으며, 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 알킬포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트 등일 수 있다. 변형된 포스페이트 연결 또는 비-포스페이트 연결을 함유하는 예시적인 폴리뉴클레오티드는 문헌(Peyrottes et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 1841-1848; Chaturvedi et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:2318-2323; and Schultz et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:2966-2973; Matteucci (1997) "Oligonucleotide Analogs: an Overview" in Oligonucleotides as Therapeutic Agents, (DJ. Chadwick and G. Cardew, ed.) John Wiley and Sons, New York, NY; (Zon (1993) "Oligonucleoside Phosphorothioates" in Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal, ed.) Humana Press, pp. 165-190); (Miller et al. (1971) JACS 93:6657-6665)　; (Jager et al. (1988) Biochem. 27:7247-7246), (Nelson et al. (1997) JOC 62:7278-7287) (U.S. Patent No. 5,453,496); Micklefield, J. 2001, Current Medicinal Chemistry 8: 1157-1179)에서 찾을 수 있다.
골격 변형은 포스포디에스테르 연결을 대안적 모이어티, 예컨대 음이온성, 중성 또는 양이온성 기로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 변형의 예는 음이온성 뉴클레오시드간 연결; N3'에서 P5'로의 포스포르아미데이트 변형; 보라노포스페이트 DNA; 프로올리고뉴클레오티드; 중성 뉴클레오시드간 연결, 예컨대 메틸포스포네이트; 아미드 연결된 DNA; 메틸렌(메틸이미노) 연결; 포름아세탈 및 티오포름아세탈 연결; 술포닐 기를 함유하는 골격; 모르폴리노 올리고; 펩티드 핵산(PNA); 및 양으로 하전된 데옥시리보핵산 구아니딘(DNG) 올리고를 포함한다(Micklefield, J. 2001, Current Medicinal Chemistry 8: 1157-1179). 변형된 핵산은 하나 이상의 변형, 예컨대 포스페이트 연결의 조합, 예컨대 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 연결의 조합을 포함하는 키메라 또는 혼합 골격을 포함할 수 있다.
포스페이트에 대한 치환체는, 예컨대 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 뉴클레오시드간 연결일 있다. 이들은 모르폴리노 연결(뉴클레오시드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성됨); 실록산 골격; 술파이드, 술폭사이드 및 술폰 골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 술파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 골격; 술포네이트 및 술폰아미드 골격; 아미드 골격; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 갖는 다른 것들을 갖는 것들을 포함한다. 다수의 미국 특허가 이들 유형의 포스페이트 대체물을 제조 및 사용하는 방법을 개시하며, 미국 특허 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 및 5,677,439(각각은 본원에 참조로 포함됨)를 포함하나 이로 제한되지 않는다. 또한, 뉴클레오티드 치환체에서 뉴클레오티드의 당 및 포스페이트 모이어티 둘 다가, 예컨대 아미드 유형 연결(아미노에틸글리신)(PNA)에 의해 대체될 수 있는 것으로 이해된다. 미국 특허 5,539,082; 5,714,331; 및 5,719,262는 PNA 분자를 제조 및 사용하는 방법을 교시하며, 각각은 본원에 참조로 포함된다. (또한, 문헌(ielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500)을 참조한다). 접합체가 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체에 화학적으로 연결될 수 있다. 이러한 접합체는 지질 모이어티, 예컨대 콜레스테롤 모이어티(Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), 콜산(Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), 티오에테르, 예컨대 헥실-S-트리틸티올(Manoharan et al., Ann. KY. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), 트리콜레스테롤(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), 지방족 쇄, 예컨대 도데칸디올 또는 운데실 잔기(Saison-Behmoaras et al., EM5OJ, 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al, FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), 인지질, 예컨대 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1-디-O-헥사데실-rac-글리세로-S-H-포스포네이트(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), 또는 아다만탄 아세트산(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), 팔미틸 모이어티(Mishra et al., Biochem. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 모이어티(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937)를 포함하나 이로 제한되지 않는다. 다수의 미국 특허가 이러한 접합체의 제조를 교시하며, 미국 특허 번호 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 및 5,688,941(각각은 본원에 참조로 포함됨)을 포함하나 이로 제한되지 않는다.
폴리머라제
폴리머라제의 특히 유용한 기능은 주형으로서 기존의 핵산을 사용하여 핵산 가닥의 중합화를 촉매하는 것이다. 유용한 다른 기능은 본원의 다른 곳에 기재된다. 유용한 폴리머라제의 예는 DNA 폴리머라제 및 RNA 폴리머라제를 포함한다.
비천연 핵산에 대한 폴리머라제의 특이성, 가공성 또는 다른 특징을 개선하기 능력은, 예컨대 증폭, 서열분석, 표지화, 검출, 클로닝 등을 포함하는 비천연 핵산 도입이 요구되는 경우 다양한 상황에서 매우 바람직할 것이다. 본 발명은 비천연 핵산에 대해 변형된 특성을 갖는 폴리머라제, 이러한 폴리머라제를 제조하는 방법, 이러한 폴리머라제를 사용하는 방법, 및 하기의 완전한 검토로부터 분명해질 많은 다른 특징을 제공한다.
일부 예에서, 본원에 개시된 것은, 예컨대 DNA 증폭 동안 비천연 핵산을 성장하는 주형 카피로 도입시키는 폴리머라제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 폴리머라제의 활성 부위가 변형되어 비천연 핵산의 활성 부위로의 입체적 진입 억제가 감소되도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 비천연 핵산의 하나 이상의 비천연 특징과 상보성을 제공하도록 변형될 수 있다. 따라서, 본 발명은 이종성 또는 재조합 폴리머라제를 포함하는 조성물 및 이의 사용 방법을 포함한다.
폴리머라제는 단백질 조작과 관련된 방법을 이용하여 변형될 수 있다. 예컨대, 분자 모델링이 결정 구조에 기초하여 수행되어 표적 활성을 변형시키기 위해 돌연변이가 이루어질 수 있는 폴리머라제의 위치를 확인할 수 있다. 대체를 위한 표적으로 확인된 잔기는, 문헌(Bordo, et al. J Mol Biol 217: 721-729 (1991) and Hayes, et al. Proc Natl Acad Sci, USA 99: 15926- 15931 (2002))에 기재된 것과 같이, 에너지 최소화 모델링, 상동성 모델링 및/또는 보존적 아미노산 치환을 이용하여 선택된 잔기로 대체될 수 있다.
예컨대, 생물학적 시스템으로부터 단리된 단백질-기반 효소 및 이의 기능적 변이체를 포함하는 임의의 다양한 폴리머라제가 본원에 설명된 방법 또는 조성물에 사용될 수 있다. 특정 폴리머라제, 예컨대 하기에 예시되는 것에 대한 참조는 달리 지시되지 않는 한 이의 기능적 변이체를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 야생형 폴리머라제이다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 변형된 또는 돌연변이 폴리머라제이다.
비천연 핵산의 활성 부위 영역으로의 진입을 개선하고 활성 부위 영역에서 비천연 뉴클레오티드와 조화를 이루기 위한 특징을 갖는 폴리머라제가 또한 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 변형된 뉴클레오티드 결합 부위를 갖는다.
일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 비천연 핵산에 대한 야생형 폴리머라제의 특이성의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.99%인 비천연 핵산에 대한 특이성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 또는 야생형 폴리머라제는 천연 핵산 및/또는 변형된 당가 없는 비천연 핵산에 대한 야생형 폴리머라제의 특이성의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.99%인 변형된 당를 포함하는 비천연 핵산에 대한 특이성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 또는 야생형 폴리머라제는 천연 핵산 및/또는 변형된 염기가 없는 비천연 핵산에 대한 야생형 폴리머라제의 특이성의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.99%인 변형된 염기를 포함하는 비천연 핵산에 대한 특이성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 또는 야생형 폴리머라제는 트리포스페이트를 포함하는 핵산 및/또는 트리포스페이트가 없는 비천연 핵산에 대한 야생형 폴리머라제의 특이성의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.99%인 트리포스페이트를 포함하는 비천연 핵산에 대한 특이성을 갖는다. 예컨대, 변형된 또는 야생형 폴리머라제는 디포스페이트 또는 모노포스페이트를 갖는 비천연 핵산 또는 포스페이트가 없는 비천연 핵산 또는 이들의 조합에 대한 야생형 폴리머라제의 특이성의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.99%인 트리포스페이트를 포함하는 비천연 핵산에 대한 특이성을 가질 수 잇다.
일부 실시양태에서, 변형된 또는 야생형 폴리머라제는 비천연 핵산에 대해 완화된 특이성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 또는 야생형 폴리머라제는 천연 핵산에 대한 야생형 폴리머라제의 특이성의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.99%인 비천연 핵산에 대한 특이성 및 천연 핵산에 대한 특이성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 또는 야생형 폴리머라제는 천연 핵산에 대한 야생형 폴리머라제의 특이성의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.99%인 변형된 당를 포함하는 비천연 핵산에 대한 특이성 및 천연 핵산에 대한 특이성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 또는 야생형 폴리머라제는 천연 핵산에 대한 야생형 폴리머라제의 특이성의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.99%인 변형된 염기를 포함하는 비천연 핵산에 대한 특이성 및 천연 핵산에 대한 특이성을 갖는다.
엑소뉴클레아제 활성의 부재는 야생형 특징 또는 변이체 또는 조작된 폴리머라제에 의해 부여되는 특징일 수 있다. 예컨대, 엑소를 뺀 클레노우 단편은 3'에서 5'로의 교정 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 클레노우 단편의 돌연변이된 버젼이다.
본 발명의 방법은 내재적 3'에서 5'로의 엑소뉴클레아제 교정 활성이 결여되거나 3'에서 5'로의 엑소뉴클레아제 교정 활성이, 예컨대 돌연변이를 통해 불능된 임의의 DNA 폴리머라제의 기질 범위를 확장하는데 이용될 수 있다. DNA 폴리머라제의 예는 polA, polB(예컨대 문헌(Parrel & Loeb, Nature Struc Biol 2001) 참조) polC, polD, polY, polX 및 역전사효소(RT)를 포함하나, 바람직하게는 연작용성의 고충실도 폴리머라제(PCT/GB2004/004643)이다. 일부 실시양태에서, 변형된 또는 야생형 폴리머라제는 3'에서 5'로의 교정 엑소뉴클레아제 활성이 실질적으로 결여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 또는 야생형 폴리머라제는 비천연 핵산에 대해 3'에서 5'로의 교정 엑소뉴클레아제 활성이 실질적으로 결여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 또는 야생형 폴리머라제는 3'에서 5'로의 교정 엑소뉴클레아제 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 또는 야생형 폴리머라제는 천연 핵산에 대해 3'에서 5'로의 교정 엑소뉴클레아제 활성을 갖고 비천연 핵산에 대해 3'에서 5'로의 교정 엑소뉴클레아제 활성이 실질적으로 결여된다.
일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 야생형 폴리머라제의 교정 엑소뉴클레아제 활성의 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.99%인 3'에서 5'로의 교정 엑소뉴클레아제 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 천연 핵산에 대한 야생형 폴리머라제의 교정 엑소뉴클레아제 활성의 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.99%인 비천연 핵산에 대한 3'에서 5'로의 교정 엑소뉴클레아제 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 천연 핵산에 대한 야생형 폴리머라제의 교정 엑소뉴클레아제 활성의 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.99%인 비천연 핵산에 대한 3'에서 5'로의 교정 엑소뉴클레아제 활성 및 천연 핵산에 대한 3'에서 5'로의 교정 엑소뉴클레아제 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 천연 핵산에 대한 야생형 폴리머라제의 교정 엑소뉴클레아제 활성의 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.99%인 천연 핵산에 대한 3'에서 5'로의 교정 엑소뉴클레아제 활성을 갖는다.
관련된 측면에서, 본 발명은 모체(parental) 폴리머라제, 예컨대 DNA 폴리머라제를 구조적으로 모델링하는 단계, 활성 부위에서의 복합체 안정성 또는 뉴클레오티드 접근 또는 결합에 영향을 주는 하나 이상의 복합체 안정성 또는 뉴클레오티드 상호작용 특성 또는 활성 부위에서 뉴클레오티드 유사체에 대한 상보적 특성을 확인하는 단계, 및 이들 특징을 포함 또는 제거하도록 모체 폴리머라제를 돌연변이시키는 단계를 포함하는 변형된 폴리머라제를 제조하는 방법을 제공한다. 예컨대, 폴리머라제는 비천연 뉴클레오티드의 활성 부위로의 입체적 접근을 개선하거나 비천연 뉴클레오티드와 폴리머라제 사이의 하전-하전 또는 소수성 상호작용을 개선하도록 돌연변이될 수 있다. 상기 방법은 또한 생성된 변형된 폴리머라제가 모체 폴리머라제와 비교하여 성장하는 핵산 카피로 뉴클레오티드 또는 비천연 뉴클레오티드의 증가된 도입을 나타내는지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
폴리머라제는 핵산으로부터 그들의 해리 속도에 따라 특징지어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 하나 이상의 천연 및 비천연 핵산에 대해 비교적 낮은 해리 속도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 하나 이상의 천연 및 비천연 핵산에 대해 비교적 높은 해리 속도를 갖는다. 해리 속도는 본원에 설명된 방법에서 반응 속도를 조절하도록 조정될 수 있는 폴리머라제의 활성이다.
폴리머라제는 특정 천연 및/또는 비천연 핵산 또는 천연 및/또는 비천연 핵산의 수집물과 함께 사용되는 경우 그들의 충실도에 따라 특징지어질 수 있다. 충실도는 일반적으로 핵산 주형의 카피를 만들 때 폴리머라제가 정확한 핵산을 성장하는 핵산 쇄로 도입시키는 정확도를 지칭한다. DNA 폴리머라제 충실도는, 천연 및 비천연 핵산이, 예컨대 동일한 농도로 존재하여 폴리머라제-가닥-주형 핵산 이원 복합체의 동일한 부위에서 가닥 합성에 대해 경쟁할 때, 정확한 천연 및 비천연 핵산 도입 대 부정확한 천연 및 비천연 핵산 도입의 비율로서 측정될 수 있다. DNA 폴리머라제 충실도는 천연 및 비천연 핵산에 대한 (kcat/Km) 및 부정확한 천연 및 비천연 핵산에 대한 (kcat/Km)의 비율로서 계산될 수 있으며; 여기서 kcat 및 Km은 정상 상태 효소 동역학에서 미카앨리스-멘텐(Michaelis-Menten) 파라미터이다(Fersht, A. R. (1985) Enzyme Structure and Mechanism, 2nd ed., p 350, W. H. Freeman & Co., New York, 본원에 참조로 포함됨). 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 교정 활성과 함께 또는 없이 적어도 약 100, 1000, 10,000, 100,000, 또는 1x106의 충실도 값을 갖는다.
천연 공급원으로부터의 폴리머라제 또는 이의 변이체는 특정 구조를 갖는 비천연 핵산의 도입을 검출하는 검정을 이용하여 스크리닝될 수 있다. 하나의 예에서, 폴리머라제는 비천연 핵산 또는 UBP, 예컨대 d5SICSTP, dNaMTP, 또는 d5SICSTP- dNaMTP UBP를 도입시키는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 폴리머라제, 예컨대 야생형 폴리머라제와 비교하여 비천연 핵산에 대해 변형된 특성을 나타내는 이종성 폴리머라제가 사용될 수 있다. 예컨대, 변형된 특성은, 예컨대 Km, kcat, Vmax, 비천연 핵산 (또는 천연 발생 뉴클레오티드)의 존재 하에 폴리머라제 가공성, 비천연 핵산의 존재 하에 폴리머라제에 의한 평균 주형 판독 길이, 비천연 핵산에 대한 폴리머라제의 특이성, 비천연 핵산의 결합 속도, 생성물(피로포스페이트, 트리포스페이트 등) 방출 속도, 분지화 속도, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 일 실시양태에서, 변형된 특성은 비천연 핵산에 대한 감소된 Km 및/또는 비천연 핵산에 대한 증가된 kcat/Km 또는 Vmax/Km이다. 유사하게, 폴리머라제는 임의적으로 야생형 폴리머라제와 비교하여 비천연 핵산의 결합 속도 증가, 생성물 방출 속도 증가, 및/또는 분지화 속도 감소를 갖는다.
동시에, 폴리머라제는 천연 핵산, 예컨대 A, C, G 및 T를 성장하는 핵산 카피로 도입시킬 수 있다. 예컨대, 폴리머라제는 임의적으로 천연 핵산에 대해 상응하는 야생형 폴리머라제보다 적어도 약 5% 높은 (예컨대, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100% 이상) 특이적 활성, 및 천연 핵산의 존재 하에서의 야생형 폴리머라제보다 적어도 약 5% 높은 (예컨대, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100% 이상) 주형 존재 하에서 천연 핵산과의 가공성을 나타낸다. 임의적으로, 폴리머라제는 천연 발생 뉴클레오티드에 대해 야생형 폴리머라제보다 적어도 약 5% 높은 (예컨대, 약 5%, 10%, 25%, 50%, 75% 또는 100% 이상) kcat/Km 또는 Vmax/Km을 나타낸다.
특정 구조의 비천연 핵산을 도입시키기 능력을 가질 수 있는 본원에서 사용되는 폴리머라제는 또한 지시된 진화 접근법을 이용하여 생성될 수 있다. 핵산 합성 검정을 이용하여 임의의 다양한 비천연 핵산에 대해 특이성을 갖는 폴리머라제 변이체를 스크리닝할 수 있다. 예컨대, 폴리머라제 변이체는 비천연 핵산 또는 UBP, 예컨대 dTPT3, dNaM 유사체 또는 dTPT3- dNaM UBP를 핵산으로 도입시키는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 검정은, 예컨대 재조합 폴리머라제 변이체를 사용하는 시험관내 검정이다. 이러한 지시된 진화 기술을 이용하여 본원에서 설명되는 임의의 비천연 핵산에 대한 활성에 대해 임의의 적합한 폴리머라제의 변이체를 스크리닝할 수 있다.
기재된 조성물의 변형된 폴리머라제는 임의적으로 변형된 및/또는 재조합 φ29-유형 DNA 폴리머라제일 수 있다. 임의적으로, 폴리머라제는 변형된 및/또는 재조합 φ29, B103, GA-1, PZA, φ15, BS32, M2Y, Nf, G1, Cp-1, PRD1, PZE, SF5, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722, 또는 L17 폴리머라제일 수 있다.
본 발명에 일반적으로 유용한 핵산 폴리머라제는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 역전사효소, 및 이들의 돌연변이 또는 변형된 형태를 포함한다. DNA 폴리머라제 및 그들의 특성은 특히 문헌(DNA Replication 2nd edition, Kornberg and Baker, W. H. Freeman, New York, N. Y. (1991))에 상세히 기재되어 있다. 본 발명에 유용한 공지된 통상의 DNA 폴리머라제는 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)(Pfu) DNA 폴리머라제(Lundberg et al., 1991, Gene, 108: 1, Stratagene), 피로코쿠스 워우세이(Pyrococcus woesei)(Pwo) DNA 폴리머라제(Hinnisdaels et al., 1996, Biotechniques, 20:186-8, Boehringer Mannheim), 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus)(Tth) DNA 폴리머라제(Myers and Gelfand 1991, Biochemistry 30:7661), 바실루스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus) DNA 폴리머라제(Stenesh and McGowan, 1977, Biochim Biophys Acta 475:32), 써모코쿠스 리토랄리스(Thermococcus litoralis)(TIi) DNA 폴리머라제(또한 VentTM DNA 폴리머라제로 지칭됨, Cariello et al, 1991, Polynucleotides Res, 19: 4193, New England Biolabs), 9°NmTM DNA 폴리머라제(New England Biolabs), 스토펠 단편, Thermo Sequenase®(Amersham Pharmacia Biotech UK), TherminatorTM(New England Biolabs), 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima)(Tma) DNA 폴리머라제(Diaz and Sabino, 1998 Braz J Med. Res, 31 :1239), 써무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)(Taq) DNA 폴리머라제(Chien et al, 1976, J. Bacteoriol, 127: 1550), DNA 폴리머라제, 피로코쿠스 코다카라엔시스(Pyrococcus kodakaraensis) KOD DNA 폴리머라제(Takagi et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63:4504), JDF-3 DNA 폴리머라제(써모코쿠스 종 JDF-3으로부터의 것, 특허 출원 WO 0132887), 피로코쿠스(Pyrococcus) GB-D(PGB-D) DNA 폴리머라제(또한 Deep VentTM DNA 폴리머라제로 지칭됨, Juncosa-Ginesta et al., 1994, Biotechniques, 16:820, New England Biolabs), UlTma DNA 폴리머라제(호열성 써모토가 마리티마로부터의 것; Diaz and Sabino, 1998 Braz J. Med. Res, 31 :1239; PE Applied Biosystems), Tgo DNA 폴리머라제(써모코쿠스 고르고나리우스(thermococcus gorgonarius)로부터의 것, Roche Molecular Biochemicals), 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I(Lecomte and Doubleday, 1983, Polynucleotides Res. 11 :7505), T7 DNA 폴리머라제(Nordstrom et al, 1981, J Biol. Chem. 256:3112), 및 고세균 DP1I/DP2 DNA 폴리머라제 II(Cann et al, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14250)를 포함하나 이로 제한되지 않는다. 중온성 폴리머라제 및 호열성 폴리머라제 둘 다 고려된다. 호열성 DNA 폴리머라제는 ThermoSequenase®, 9°NmTM, TherminatorTM, Taq, Tne, Tma, Pfu, TfI, Tth, TIi, 스토펠 단편, VentTM 및 Deep VentTM DNA 폴리머라제, KOD DNA 폴리머라제, Tgo, JDF-3, 및 이들의 돌연변이체, 변이체 및 유도체를 포함하나 이로 제한되지 않는다. 3' 엑소뉴클레아제 결핍 돌연변이체인 폴리머라제가 또한 고려된다. 본 발명에서 유용한 역전사효소는 HIV, HTLV-I, HTLV-II, FeLV, FIV, SIV, AMV, MMTV, MoMuLV 및 기타 레트로바이러스로부터의 역전사효소를 포함하나 이로 제한되지 않는다(문헌(Levin, Cell 88:5-8 (1997); Verma, Biochim Biophys Acta. 473:1-38 (1977); Wu et al, CRC Crit Rev Biochem. 3:289- 347(1975)) 참조). 폴리머라제의 추가의 예는 9°N DNA 폴리머라제, Taq DNA 폴리머라제, Phusion® DNA 폴리머라제, Pfu DNA 폴리머라제, RB69 DNA 폴리머라제, KOD DNA 폴리머라제, 및 VentR® DNA 폴리머라제를 포함하나 이로 제한되지 않는다(Gardner et al. (2004) "Comparative Kinetics of Nucleotide Analog Incorporation by Vent DNA Polymerase (J. Biol. Chem., 279(12), 11834-11842; Gardner and Jack "Determinants of nucleotide sugar recognition in an archaeon DNA polymerase" Nucleic Acids Research, 27(12) 2545-2553). 비호열성 유기체로부터 단리되는 폴리머라제는 열 불활성화될 수 있다. 예는 파아지로부터의 DNA 폴리머라제이다. 임의의 다양한 공급원으로부터의 폴리머라제가 고온 조건에 대한 그들의 내성을 증가 또는 감소시키기 위해 변형될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 호열성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 호열성 폴리머라제는 열 불활성화될 수 있다. 호열성 폴리머라제는 전형적으로 고온 조건 또는 열순환 조건, 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기술에 대해 사용되는 것에 대해 유용하다.
일부 실시양태에서, 폴리머라제는 Φ29, B103, GA-1, PZA, Φ15, BS32, M2Y, Nf, G1, Cp-1, PRD1, PZE, SF5, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722, L17, ThermoSequenase®, 9°NmTM, TherminatorTM DNA 폴리머라제, Tne, Tma, TfI, Tth, TIi, 스토펠 단편, VentTM 및 Deep VentTM DNA 폴리머라제, KOD DNA 폴리머라제, Tgo, JDF-3, Pfu, Taq, T7 DNA 폴리머라제, T7 RNA 폴리머라제, PGB-D, UlTma DNA 폴리머라제, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 III, 고세균 DP1I/DP2 DNA 폴리머라제 II, 9°N DNA 폴리머라제, Taq DNA 폴리머라제, Phusion® DNA 폴리머라제, Pfu DNA 폴리머라제, SP6 RNA 폴리머라제, RB69 DNA 폴리머라제, 조류 골수아세포증 바이러스(AMV) 역전사효소, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV) 역전사효소, SuperScript® II 역전사효소, 및 SuperScript® III 역전사효소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리머라제는 DNA 폴리머라제 1-클레노우 단편, Vent 폴리머라제, Phusion® DNA 폴리머라제, KOD DNA 폴리머라제, Taq 폴리머라제, T7 DNA 폴리머라제, T7 RNA 폴리머라제, TherminatorTM DNA 폴리머라제, POLB 폴리머라제, SP6 RNA 폴리머라제, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 III, 조류 골수아세포증 바이러스(AMV) 역전사효소, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV) 역전사효소, SuperScript® II 역전사효소, 또는 SuperScript® III 역전사효소이다.
추가로, 이러한 폴리머라제는, 예컨대 폴리머라제에 의한 비천연 핵산 잔기의 DNA로의 도입을 포함하는 증폭 또는 서열분석과 관련하여, 실시간 적용을 포함하는 DNA 증폭 및/또는 서열분석 적용에 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 도입되는 비천연 핵산은, 예컨대 비천연 핵산의 라벨 또는 다른 모이어티가 도입 동안 폴리머라제의 작용에 의해 제거되는 경우, 천연 잔기와 동일할 수 있거나, 비천연 핵산은 이를 천연 핵산과 구별하는 하나 이상의 특징을 가질 수 있다.
지구 상의 모든 생명체의 적어도 마지막 공통 조상 이래로, 유전자 정보는 2개의 염기쌍의 형성에 의해 확대 및 재생되는 4-문자 알파벳에 저장되었다. 합성 생물학의 중심 목표는 새로운 생명 형태 및 기능을 생성하는 것이며, 이러한 목표에 대한 가장 일반적인 경로는 DNA가 제3의 비천연 염기쌍(UBP)를 형성하는 2개의 추가의 문자를 갖는 반합성 유기체(SSO)의 생성이다. 이전에, 이러한 SSO를 생성하려는 본 발명자들의 노력은 패오닥틸룸 트리코르누툼으로부터의 뉴클레오시드 트리포스페이트 수송자(PtNTT2)에 의해 배지로부터 필수의 비천연 트리포스테이트를 유입하고 이어서 그들을 사용하여 UBP dNaM-dTPT3을 함유하는 플라스미드를 복제하는 에쉐리키아 콜라이 균주의 생성으로 끝났다(도 1a). SSO는 증가된 정보를 저장하나, 이는 이를 재생하지는 못했으며, 이는 UBP의 mRNA 및 tRNA로의 생체내 전사, tRNA의 비천연 아미노산으로의 아미노아실화, 및 마지막으로 리보솜에서의 디코딩에서 UBP의 효율적인 참여를 요구한다. 여기서, 본 발명자들은 2개의 상이한 비천연 코돈 및 동족 비천연 안티코돈을 갖는 tRNA로 dNaM 및 dTPT3을 함유하는 DNA의 mRNA로의 생체내 전사, 및 천연 또는 비-정규 아미노산(ncAA)의 슈퍼폴더 녹색 형광 단백질(sfGFP)로의 부위-특이적 도입을 지시하기 위한 리보솜에서의 그들의 효율적인 디코딩을 보고한다. 그 결과로, 수소 결합 이외의 상호작용이 정보 저장 및 재생의 모든 단계에 기여할 수 있음을 입증한다. 생성된 SSO는 모두 증가된 정보를 코딩하고 재생하며, 새로운 생명 형태 및 기능을 생성하기 위한 플랫폼으로 역할을 할 것이다.
녹색 형광 단백질 및 변이체, 예컨대 sfGFP는, 다양한 천연 및 ncAA를 받아들이는 것으로 밝혀진 위치 Y151을 포함하여, 앰버 억제 시스템을 사용하여 ncAA 도입을 연구하기 위한 모델 시스템의 역할을 하였다(도 4). 비천연 코돈의 디코딩을 탐색하기 위해, 본 발명자들은 먼저 sfGFP의 위치 151에서 Ser의 도입에 초점을 맞추었으며, 이는 이. 콜라이 세린 아미노아실-tRNA 신테타제(SerRS)가 tRNA 아미노아실화를 위한 안티코돈 인식에 의존하지 않아 비효율적인 충전의 잠재적 복잡함을 제거하기 때문이다. SSO 균주 YZ3을 sfGFP 및 이. 콜라이 tRNASer 유전자(serT)를 코딩하는 플라스미드로 형질전환시켰으며, sfGFP 코돈 151(TAC)은 비천연 코돈 AXC으로 대체되고(sfGFP(AXC)151; X = NaM), serT의 안티코돈은 비천연 안티코돈 GYT로 대체되었다(tRNASer(GYT); Y = TPT3)(도 1b). 형질전환체를 dNaMTP 및 dTPT3TP로 보충되고 이어 NaMTP 및 TPT3TP 뿐만 아니라 T7 RNA 폴리머라제(T7 RNAP) 및 tRNASer(GYT)의 발현을 유도하기 위한 이소프로필-β-D-티오갈락토시드(IPTG)로 추가로 보충된 배지에서 성장시켰다. tRNA 유도의 짧은 기간 후, 안히드로테트라사이클린(aTc)을 첨가하여 sfGFP(AXC)151의 발현을 유도하였다.
유도 후, sfGFP(AXC)151는 코딩하나 tRNASer(GYT)는 결여된 대조군 플라스미드로 형질전환된 세포는, 위치 151에서 천연 Ser 코돈을 갖는 sfGFP(sfGFP(AGT)151; 도 1c)를 코딩하는 플라스미드로 형질전환된 세포와 비교하여, 현저하게 감소된 형광을 나타내었다. 또한, 세포 성장이, 아마도 리보솜의 지체 및 봉쇄에 기인하여, sfGFP(AXC)151 유도 시 정체되기 시작하였다(도 1d). 이들 세포의 용해물을 항-GFP 항체로 웨스턴 블롯팅하였으며, sfGFP 발현의 상당한 감소 및 비천연 코돈의 위치에서 절단된 sfGFP의 존재를 나타내었다(도 1e). 대조적으로, sfGFP(AXC)151 및 tRNASer(GYT) 둘 다를 코딩하는 플라스미드로 형질전환된 세포는 sfGFP(AGT)151를 발현하는 대조군 세포의 것과 거의 동일하였으며(도 1c), 세포 성장은 sfGFP(AXC)151의 유도 시 정체되지 않았으며(도 1d), 이들 세포로부터의 용해물의 웨스턴 블롯은 전장의 sfGFP 단백질을 나타내었다(도 1e). 또한, 본 발명자들은 AXC 코돈을 디코딩하기 위해 동일한 방식으로 발현되는 4개의 모든 천연 근접-동족 tRNA(tRNASer(GNT); N=G, C, A, 또는 T)의 능력을 평가하였다. 각각의 경우에, 형광은 거의 관찰되지 않았으며, 성장 결함이 여전히 남아 있었다(도 5a 및 5b). 이들 데이터는 PtNTT2가 두 비천연 뉴클레오티드의 데옥시- 및 리보트리포스페이트 둘 다를 유입할 수 있고, T7 RNA 폴리머라제가 생체내에서 비천연 뉴클레오티드를 함유하는 mRNA 및 tRNA를 전사할 수 있으며, 리보솜은 단지 비천연 코돈을 비천연 안티코돈으로만 효율적으로 디코딩할 수 있다는 것을 입증한다.
디코딩의 충실도를 평가하기 위해, 본 발명자들은 sfGFP(AXC)151 및 tRNASer(GYT) 둘 다를 발현하는 세포로부터 정제된 단백질을 LC/MS-MS 및 피크 세기를 통한 상대적 정량화를 통해 분석하였으며, 이는 위치 151에서 Ser의 98.5±0.7%(95% CI, n = 4)의 도입을 나타내었으며, Ile/Leu가 주요 오염물이었다(도 1f, 표 4). sfGFP(AXC)151 유전자에서 UBP의 보유율은 98±2%(95% CI, n = 4)이었으며(표 5) X->T가 일반적으로 복제 동안 주요 돌연변이인 점을 감안하여(AXC의 경우 Ile 코돈 ATC가 초래될 것임), 본 발명자들은 위치 151에서 Ser을 함유하지 않는 단백질 대부분이 복제 동안 USP의 손실에 기인한다고 생각하며, 비천연 코돈으로의 번역의 충실도가 높다는 결론을 내린다.
Figure pct00008
Figure pct00009
UBP로의 ncAA의 코딩을 입증하기 위해, 본 발명자들은 상기에서 사용된 것과 유사한 플라스미드를 구축하였으나, tRNASer 유전자는 메타노사르시나 마제이(Methanosarcina mazei) tRNAPyl(GYT)로 대체되었다. tRNAPyl는 메타노사르시나 바르케리(Methanosarcina barkeri) 피롤리신 아미노아실 tRNA 신테타제(PylRS)에 의해 ncAA N 6-[(2-프로피닐옥시)카르보닐]-l-리신(PrK)으로 선택적으로 충전될 수 있다. 코돈 AXC 외에, 본 발명자들은 또한 코돈 GXC 및 상응하는 tRNAPyl(GYC)를 분석하였다. IPTG-유도성 PylRS를 코딩하는 별도의 플라스미드를 보유하는 SSO를 필요한 플라스미드로 형질전환시키고, 첨가된 PrK와 함께 또는 없이 성장시켰다. PylRS, 동족 비천연 tRNAPyl, 또는 PrK의 부재 하에 sfGFP(AXC)151 또는 sfGFP(GXC)151를 발현하는 세포를 사용하는 대조군 실험에서, 본 발명자들은 단지 낮은 세포 형광(도 2a), sfGFP의 절단(도 6a 및 6b) 및 세포 성장의 정체(도 6b)를 관찰하였다. 대조적으로, 동족 비천연 tRNA를 갖는 비천연 mRNA에 대해, PylRS가 존재하고 PrK가 첨가되었을 때, 본 발명자들은 높은 형광(AXC 및 GXC에 대해 각각 64% 및 69%의 sfGFP(TAC)151)(도 2a 및 2b), 전장 sfGFP의 강력한 생산(도 6a) 및 정상적인 성장(도 6b)을 관찰하였다.
PrK의 도입을 입증하기 위해, sfGFP를 C-말단 Strep-태그 II를 사용하여 세포 용해물로부터 친화성 정제하고, 구리-촉매된 클릭 화학을 수행하여 카르복시테트라메틸로다민(TAMRA) 염료(TAMRA-PEG4-N3)를 부착하였으며, 이는 SDS-PAGE 동안 sfGFP의 전기영동 이동성을 이동시키는 것으로 밝혀졌으며, 따라서 웨스턴 블롯팅에 의해 PrK 도입의 충실도를 평가할 수 있게 하였다(도 2c). 본 발명자들은 강력한 TAMRA 신호, 및 PrK로 보충된 배지에서 배양된 sfGFP(AXC)151 및 tRNAPyl(GYT) 또는 sfGFP(GXC)151 및 tRNAPyl(GYC)를 발현하는 세포로부터 정제될 때, 실질적으로 모든 sfGFP가 이동되었다는 것을 관찰하였다(도 2c). 대조적으로, NaMTP, TPT3TP, 또는 둘 다가 부재하는 경우, TAMRA 신호 또는 이동된 sfGFP가 거의 내지 전혀 관찰되지 않았다(도 7a 및 7b). 마지막으로, 비천연 tRNA를 사용하여 sfGFP(TAC)151를 발현하는 세포로부터 정제된 단백질에서는 어떠한 TAMRA 신호 또는 이동된 sfGFP도 관찰되지 않았다(도 2c). 이 데이터는 PrK가 비천연 안티코돈을 갖는 tRNA에 의한 비천연 코돈의 디코딩을 통해 sfGFP에 특이적으로 도입된다는 것을 입증한다.
최적 PrK 농도를 이용하여(도 8a-8d), 본 발명자들은 AXC 및 GXC 코돈에 대해 각각 54±4 및 55±6 ㎍/mL의 sfGFP(s.d., n = 4, sfGFP(TAC)151 대조군의 ∼40%)(표 6)를 정제하였다. 또한, 질량 분광측정 분석에 기준하여, PrK를 갖는 sfGFP의 순도는 AXC 코돈에 대해서는 96.2±0.3%(95% CI, n = 4)이고 GXC 코돈에 대해서는 97.5±0.7%(95% CI, n = 4)였다(도 2d). 정제된 sfGFP 단백질의 수율이 비천연 리보트리포스페이트 첨가에 의한 중간 정도의 성장 감소에 기인하여 앰버 억제(87±6 ㎍/mL, s.d., n = 4(표 6))보다 약간 낮았지만, 두 비천연 코돈의 디코딩은 세포 밀도에 대해 정규화 시 앰버 억제보다 높은 형광을 초래하였으며(도 2a 및 2b), 이는 비천연 코돈으로의 디코딩이 앰버 억제보다 효율적임을 암시한다.
UBP로의 다른 ncAA의 코딩을 탐색하기 위해, 본 발명자들은 AXC 코돈 및 진화된 메타노코쿠스 잔나쉬(Methanococcus jannaschii) TyrRS/tRNATyr 쌍(pAzFRS/tRNA p AzF)으로 p-아지도-페닐알라닌(pAzF)의 코딩을 조사하였다. 신테타제의 유도 및 성장 배지에 pAzF의 첨가로, 본 발명자들은 천연 sfGFP(TAC)151를 발현하는 세포의 것과 동등한 강력한 형광 및 sfGFP(AXC)151 및 tRNA p AzF(GYT)로의 정상적인 성장을 관찰하였다(도 3a, 도 9). 전장 sfGFP를 정제하고(86±6 ㎍/mL, s.d., n = 4; sfGFP(TAC)151 대조군의 68%, 표 6), 디벤조사이클로옥틸(DBCO) 기를 사용하여 구리 무함유 클릭 화학을 수행하여 TAMRA(TAMRA-PEG4-DBCO)를 부착하였다. 본 발명자들은 sfGFP(AXC)151 및 tRNA p AzF(GYT)를 발현하고 pAzF의 존재 하에서 배양된 세포로부터 단리된 sfGFP에 대한 강력한 접합을 관찰하였다(도 3b). 본 발명자들은 아지도 모이어티의 분해로 인해 pAzF 도입의 충실도를 정확하게 평가할 수 없었으나, sfGFP 단백질의 ∼93%가 이동되었으며, 이는 앰버 억제를 통해 생성된 ∼95%의 이동된 sfGFP와 양호하게 비교된다(도 3b).
Figure pct00010
지구 상의 모든 생명체의 적어도 마지막 공통 조상 이래로, 단백질은 오로지 4-뉴클레오티드 유전자 알파벳으로만 작성된 코돈의 디코딩을 통해 생성되었다. 이제 본 발명자들은 확장된 유전자 알파벳으로 작성된 2개의 새로운 코돈의 디코딩을 입증하였으며 새로운 코돈을 사용하여 ncAA를 단백질로 부위-특이적으로 도입하였다. 본 발명자들은, 정보 저장 및 재생의 모든 단계에 대해, 천연 염기쌍에 대해 매우 명백히 중심적인 수소 결합이 상보적인 패킹 및 소수성 힘으로 적어도 부분적으로 대체될 수 있다는 것을 발견하였다. 그들의 새로운 디코딩 메커니즘에도 불구하고, 비천연 코돈은 그들의 완전한 천연 상대 만큼 효율적으로 디코딩될 수 있다. 본 발명자들은 단지 2개의 비천연 코돈의 디코딩을 조사하였으나, UBP는 이들에 제한되지 않을 것이며, UBP 보유를 강화하는 최근에 보고된 Cas9 편집 시스템과 조합하는 경우, 이는 지금까지 이용 가능한 것보다 더 많은 코돈을 이용할 수 있게 할 것이다. 따라서, 보고된 SSO는 천연 유기체로는 이용 가능하지 않은 광범위한 형태 및 기능에 접근할 수 있는 새로운 형태의 반합성 생명체 중 첫 번째일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 제시되고 설명되었지만, 이러한 실시양태는 단지 예시로 제공되는 것임이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 이제 다수의 변형, 변경 및 치환이 본 발명을 벗어나지 않으면서 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 떠오를 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 하기의 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하며 이들 청구범위의 범위 내의 방법 및 구조물 및 그들의 등가물이 이에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (23)

  1. 비천연 아미노산을 함유하는 단백질을 생성하는 방법으로서,
    ㆍ표 1 또는 2로부터 선택되는 돌연변이 안티코돈 서열을 포함하는 돌연변이 tRNA를 제조하는 단계;
    ㆍ표 1 또는 2로부터 선택되는 돌연변이 코돈 서열을 포함하는 돌연변이 mRNA를 제조하는 단계; 및
    ㆍ돌연변이 tRNA 및 돌연변이 mRNA를 사용하여 비천연 아미노산을 함유하는 단백질을 합성하는 단계
    를 포함하는, 비천연 아미노산을 함유하는 단백질을 생성하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단백질은 무세포 번역 시스템에서 합성되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단백질은 세포(반합성 유기체 또는 SSO)에서 합성되는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 반합성 유기체는 미생물을 포함하는 것인 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 반합성 유기체는 세균을 포함하는 것인 방법.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 반합성 유기체는 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli)를 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이 tRNA의 돌연변이 안티코돈은 표 1-3으로부터 선택되는 돌연변이 코돈과 쌍을 이루는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 비천연 아미노산은 적어도 하나의 비천연 뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 비천연 뉴클레오티드는 비천연 핵염기를 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 비천연 뉴클레오티드의 비천연 염기가 2-아미노아데닌-9-일, 2-아미노아데닌, 2-F-아데닌, 2-티오우라실, 2-티오-티민, 2-티오시토신, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 알킬 유도체, 2-아미노-아데닌, 2-아미노-프로필-아데닌, 2-아미노피리딘, 2-피리돈, 2'-데옥시우리딘, 2-아미노-2'-데옥시아데노신, 3-데아자구아닌, 3-데아자아데닌, 4-티오-우라실, 4-티오-티민, 우라실-5-일, 히포크산틴-9-일(I), 5-메틸-시토신, 5-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 히포크산틴, 5-브로모, 및 5-트리플루오로메틸 우라실 및 시토신; 5-할로우라실, 5-할로시토신, 5-프로피닐-우라실, 5-프로피닐 시토신, 5-우라실, 5-치환된, 5-할로, 5-치환된 피리미딘, 5-히드록시시토신, 5-브로모시토신, 5-브로모우라실, 5-클로로시토신, 클로르화된 시토신, 사이클로시토신, 시토신 아라비노시드, 5-플루오로시토신, 플루오로피리미딘, 플루오로우라실, 5,6-디히드로시토신, 5-요오도시토신, 히드록시우레아, 요오도우라실, 5-니트로시토신, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-플루오로우라실, 및 5-요오도우라실, 아데닌 및 구아닌의 6-알킬 유도체, 6-아자피리미딘, 6-아조-우라실, 6-아조 시토신, 아자시토신, 6-아조-티민, 6-티오-구아닌, 7-메틸구아닌, 7-메틸아데닌, 7-데아자구아닌, 7-데아자구아노신, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-8-아자구아닌, 8-아자구아닌, 8-아자아데닌, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 및 8-히드록실 치환된 아데닌 및 구아닌; N4-에틸시토신, N-2 치환된 퓨린, N-6 치환된 퓨린, O-6 치환된 퓨린, 듀플렉스 형성의 안정성을 증가시키는 것, 범용 핵산, 소수성 핵산, 무차별 핵산(promiscuous nucleic acid), 크기 확장된 핵산, 플루오르화된 핵산, 트리사이클릭 피리미딘, 페녹사진 시티딘([5,4-b][l,4]벤족사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘(1H-피리미도[5,4-b][l,4]벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프, 페녹사진 시티딘(9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-b][l,4]벤족사진-2(3H)-온), 카르바졸 시티딘(2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘(H-피리도 [3',2':4,5]피롤로 [2,3-d]피리미딘-2-온), 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 히포크산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시히드록실메틸) 우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 베타-D-갈락토실케오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실케오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5옥시아세트산, 위부톡소신, 슈도우라실, 케오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥스아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥스아세트산, 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필) 우라실, (acp3)w, 및 2,6-디아미노퓨린, 및 퓨린 또는 피리미딘 염기가 헤테로사이클로 대체된 것으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 비천연 뉴클레오티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법(명확성을 위해 핵염기 부분만 나타내고 리보스 및 포스페이트 골격은 생략함):
    Figure pct00011
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 비천연 뉴클레오티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법(명확성을 위해 핵염기 부분만 나타내고 리보스 및 포스페이트 골격은 생략함):
    Figure pct00012
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 비천연 뉴클레오티드는 비천연 당 모이어티를 더 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 비천연 뉴클레오티드의 비천연 당 모이어티는 2' 위치에서의 변형: OH; 치환된 저급 알킬, 알카릴, 아르알킬, O-알카릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2 CH3, ONO2, NO2, N3, NH2F; O-알킬, S-알킬, N-알킬; O-알케닐, S-알케닐, N-알케닐; O-알키닐, S-알키닐, N-알키닐; O-알킬-O-알킬, 2'-F, 2'-OCH3, 2'-O(CH2)2OCH3; 및/또는 5' 위치에서의 변형: 5'-비닐, 5'-메틸(R 또는 S), 4' 위치에서의 변형, 4'-S, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단 기, 리포터 기, 인터칼레이터, 올리고뉴클레오티드의 약동학적 특성을 개선하기 위한 기, 또는 올리고뉴클레오티드의 약력학적 특성을 개선하기 위한 기, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 비치환된 C1-C10 알킬, C2-C10 알케닐, C2-C10 알키닐, -O[(CH2)nO]mCH3, -O(CH2)nOCH3, -O(CH2)nNH2, -O(CH2)nCH3, -O(CH2)n-ONH2, 및 -O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2일 수 있고, n 및 m은 1 내지 약 10인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이 안티코돈 또는 돌연변이 코돈은 비천연 골격을 더 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이 안티코돈 및 돌연변이 코돈은 비천연 골격을 더 포함하는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 비천연 뉴클레오티드는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제 또는 역전사효소에 의해 인식되는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 비천연 뉴클레오티드는 전사 동안 RNA 폴리머라제에 의해 mRNA로 도입되어 돌연변이 코돈을 함유하는 돌연변이 mRNA를 생성하는 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 비천연 뉴클레오티드는 전사 동안 RNA 폴리머라제에 의해 tRNA로 도입되어 돌연변이 안티코돈을 함유하는 돌연변이 tRNA를 생성하는 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 비천연 뉴클레오티드는 전사 동안 RNA 폴리머라제에 의해 mRNA로 도입되어 돌연변이 mRNA를 생성하는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 비천연 뉴클레오티드는 전사 동안 RNA 폴리머라제에 의해 tRNA로 도입되어 돌연변이 tRNA를 생성하는 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이 tRNA는 비천연 아미노산 잔기로 충전되는 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 비천연 아미노산을 함유하는 단백질은 번역 동안 돌연변이 tRNA 및 돌연변이 mRNA를 사용하여 생성되는 것인 방법.
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