LU87235A1

LU87235A1 - Nouveaux aminoacylates d'acetal du glycerol,un procede pour leur preparation et compositions therapeutiques en contenant

Info

Publication number: LU87235A1
Application number: LU87235A
Authority: LU
Inventors: Pierre Braquet; Colette Broquet
Original assignee: Scras
Priority date: 1987-06-12
Filing date: 1988-06-09
Publication date: 1988-12-13
Also published as: DZ1215A1; NL192521B; BE1000700A4; AT396236B; IT8820940A0; HK77191A; FR2616326A1; NO170632C; SG73191G; OA08879A; NO882564D0; ATA152988A; FI90421B; IE881752L; KR960005153B1; MY103577A; FR2616432A1; ZA884024B; SE466450B; ES2009283A6

Description

* - I ~ Ö "7 Ο X te GRAND-DUCHÉ DEXUXEMBOURG . Brevet N°.....H....../.........Z O V , ......

* w * $€ψ$!ή!ι Monsieur le Ministre du ....?. .ÎL?iL?...................... ', de l'Économie et des Classes Moyennes .... . BSæ Service de la Propriété Intellectuelle _Z_ ^9 ‘ LUXEMBOURG '

Demande de Brevet d’invention ---------------------...------------------------------------------- ( 1) .

I. Requête

Société de Conseils de Recherches et d1 Applications Scientifiques______________ ( 2) (S.C.R.A.S.) / 51/53 rue du Docteur Blanche, F-75016 Paris, représentée par Mbnsieur Jean Waxweiler, 55 rue des Bruyères, 'Hoïiiaid, agissant en quâTiti ! ......................................................~ ......................... ...........................—................·»»’»«· μι.»™«..»»,,-.-.«-,--.--»»-»...-- de-mandataire-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------..................... ( 3) dépose(nt) ce ..neuf__g.uin._mil_.ueni......c.enfc..-.q.ua.tr..e.=iri2ig±.-huit_____________________________________________ ( 4) à 15..jr. 0 0...________heures, au Ministère de l’Économie et des Classes Moyennes, à Luxembourg: 1. la présente requête pour l’obtention d’un brevet d’invention concernant: .

Nouveaux......am.inoacy.la.tes......d,!. ace.t al....-du......g.lycero.l..,...-un......procédê—pour ( 5) leai:.....p,r,ép,;Lafc,iffia.,..e,:!L^^......contenant____ 2. la description en langue .....française_____________________________________________de l’invention en trois exemplaires; 3..............1_____________________________________________planches de dessin, en trois exemplaires;- 4. la quittance des taxes versées au Bureau de l’Enregistrement à Luxembourg, le____.0^9,06.1988______.

5. la délégation de pouvoir, datée de..........................?..§.?.i.§.„____________________________ le______10._ί..?..§._;...1.?..§..§___; 6. le document d’ayant cause (autorisation); déclare(nt) en assumant la responsabilité de cette déclaration, que l’(es) inventeurs) est (sont): ( 6)

Colette......B ROQUET.,........240bis,Bd Jean.....Jaurès,,... F-9.210 0 Boulogne__

Pierre BRAQUET, 8 rue des Suisses. F-92380 Garches___ revendique(nt) pour la susdite demande de brevet la priorité d’une (des) demande(s) de ( 7) _______brevet----------------------déposée(s) en (8) -.Gr.ande-Br.et,ag.ne_________ le (9) -„..12..4uia....l9JI__________________________ sous le N° (10) JLZiJ.7__________________________________________ au nom de (11) Société de Conseils de Recherches et d1 Applications Scientifiques élit(élisent) domicile pour lut (elle) et, si désigné, pour son mandataire, à Luxembourg---- 5.5.....ru.e..jle.s..^^__:______:_______(12) sollicitent) la délivrance d’un brevet d’invention pour l’objet décrit et représenté dans les annexes susmentionnées, avec ajournement de cette délivrance à -...La____/... û______________________mois. (13) - Le déposant/mandataire:_____1;________________________________:_________ (14) Π. Procès-verbal de Dépôt .

La susdite demande de brevet d’invention a été "déposée au Ministère de l’Économie et des Classes Moyennes, Service de la Propriété InteUe*rtnlHlff^4jixembourg, en date du: 09.06.1988 - /X' ,+V\ / · Pr. le Ministre de l’Économie et des Classes Moyennes, à 15...,...0.0.— heures/ * 4.) |ΡΛ*- W, \ Le chef du servic^^Kprppriété^ellectuelle, A6800T-_-- " ~ ~ / X_;_

Aav/„ explications relatives au FORMULSIKEBE-DË'fÔT. / I

f fj A. f\ (1) s’il y a lieu "Demande de certificat d’addition au brevet principal, à la demande de brevet principal Na..... Λ. -yéu... 1.......”-(2) inscrire les nom, prénom, profession, ^Λ/ f IJ 8dn*we fin demandeur, lorsque celui-ci est un nartimîiernn les dénominarinn spefote, forme juridique, adresse du $i&ge jal^praljii» jedemnnrieurcst une personne morale-(3) inscrire ' — — ^ les nom, prénom* adresse du mandataire agrée, conseil en propriété industrielle, muni d’un pouvoir spécial, s'il y a lieut^représente par.......... .Tassant en qualité-de mandataire*" - (4) date de-dépôt en toutes lettres - (5) titre de l'invention - (6) inscrire les noms, prénoms, adresses des inventeurs ou l'indication "(voir) désignation séparée (suivra)**, lorsque la désl· i > * . gnationsefait OU se fera dans un document séparé.Slieneore l'indication ”ne pas mentionner”, lorsque l'inventeur signe ou signera un document de non-mention àjotndreà une désignation — REVENDICATION DE PRIORITÉ bsa Dépôt de lo demande de brevet £d Grande-Bretagne jy 12 juin 1987 SOUS le numéro 8713745

MEMOIRE DESCRIPTIF DEPOSE A L'APPUI D'UNE DEMANDE DE BREVET D'INVENTION AU GRAND-DUCHE DE LUXEMBOURG

pcir; Société de Conseils de Recherches et d'Applications Scientifiques (S.C.R.A.S.) 51/53 rue du Docteur Blanche F-75016 Paris pour; Nouveaux aminoacylates d'acetal du glycerol, un procédé pour leur préparation et compositions thérapeutiques en contenant.

λ > Nouveaux aminoacylates d'acétal du glycérol, un procédé pour leur préparation et compositions thérapeutiques en contenant.

La présente invention concerne de nouveaux aminoacylates d'acétal du glycérol, un procédé pour leur préparation ainsi que des compositions thérapeutiques en contenant.

5 La présente invention concerne les aminoacylates d'acétal du glycérol de formule générale I : CH,-O R_ I \/

I / \ I

CH » 0 R2 I Θ CH_0 C0(CHo)_N^) X Δ * p dans laquelle R]_ représente un groupement phényle substitué ou un groupe de 10 formule CmH2m + ±, m étant un entier de 9 à 25, R2 représente un atome d'hydrogène, un groupement phényle ou un groupe de formule CnH2n + ]_, n étant un entier de 1 à 10, p est un entier de 3 à 10, représente un groupement hétérocyclique contenant un 15 atome d'azote tel que le pyridinium, le thiazolinium-3, le quinolinium, l'isoquinolinium, l'imidazolium et le pyrazinium, et Θ X représente l'anxon pharmaceutiquement acceptable d'un acide minéral ou organique, un ion halogène tel que le chlore, le 20 brome, l'iode ou les anions des acides benzoïque, acétique, méthanesulionique, ou tartrique, sous la forme de leurs diastéréoisomères isolés ou de tout mélange de ceux-ci.

- 2 -

Les composés selon 11 invention sont intéressants en , tant qu'agents anti-PAF (PAF signifie Facteur d'Agrégation

Plaquettaire), avec l'activité correspondante comme anti-anaphylactiques, anti-thrombotiques, anti-coagulants, 5 anti-bronconstricteurs, anti-ischémiques, normotenseurs, immunodépresseurs et ils agissent contre l'altération des reins, contre différents chocs, contre les allergies de la peau et les ulcères intestinaux provoqués, par exemple, par 1'endotoxine.

10 L'invention concerne, également, un procédé pour la préparation des composés de formule I, tels que définis plus haut, ce procédé consistant à faire réagir un léger excès, par rapport aux proportions stoechiométriques, d'un aldéhyde ou d'une cétone de formule R;lcor2/ dans laquelle R^ et R2 sont 15 tels que définis plus haut, sur le glycérol, dans un solvant non polaire, en présence d'acide p-toluènesulfonique et dans des conditions de reflux, puis à faire réagir, à température ambiante, le dérivé hydroxyméthyle-4 dioxolane-1,3 ainsi obtenu sur un chlorure de ω-haloalcane de formule ClCO(CH2)pX/ dans 20 laquelle p et X sont tels que définis précédemment, en présence d'une base organique telle que la triéthylamine et, enfin, à faire réagir, entre 50a et SO’C, sous circulation d’azote, le composé résultant, de formule EO R.

X 1

0 R2 OCO(CH2)p-X

25 sur un composé hétérocyclique contenant un atome d'azote de formule

O

Les composés selon 1'invention sont obtenus sous forme d'un mélange non-séparé de leurs diastéréoisomères, mais ils 30 peuvent être séparés par les méthodes habituelles.

4 - 3 -

Ce procédé de préparation peut être illustré par la séquence de réactions suivante ;

Etapes

EO

X 1 0 R2 - .

2 EO R,

X

0 r2 b

OCO(CH2)p X

3

EO

x OR. ^ Ç

OCO(CH2)p~ X I

L’invention concerne également une composition thérapeutique comprenant un composé de formule générale I tel que défini plus haut, associé à un excipient pharmaceutiquement 10 acceptable.

L'invention sera mieux comprise grâce à la description des exemples qui suivent. L'exemple I est décrit en détail ; dans les exemples suivants, seules sont données les caractéristiques des substituants et des composés obtenus (la 15 chromatographie en couche mince est réalisée sur plaques au gel de silice, sauf indication contraire).

- 4 - EXEMPLE 1

Chlorure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-41 butyryl-oxyméthylel-4 dioxolane-1, 3 R1 = c17h35 # R2 = ch3 / = Pyridinium, X = Cl, p = 3.

5 Etape a : Préparation de l'heptadécyle-2 méthyle-2 hydroxy- méthyle-4 dioxolane-1,3. a

Dans un réacteur approprié, on verse 11,1 g (40 mmole) de nonadécanone-2, 6g de glycérol bidistillé - ce qui représente un léger excès par rapport aux proportions 10 stoechiométriques - et 0,6 g d’acide p-toluènesulfonique dissous dans 120 ml de toluène sec. Le mélange réactionnel est porté au reflux sous agitation pendant 12 heures et l'eau obtenue est éliminée au moyen d'un appareil Dean Stark. Après refroidissement, la phase organique est lavée avec 30 ml, à 15 5 % en poids, d'une solution aqueuse de potasse, puis à nouveau trois fois avec la quantité minimale d'eau. Après séchage sur sulfate de soude anhydre, le solvant est éliminé sous pression réduite. Le résidu est ensuite purifié par chromatographie sur colonne au gel de silice. On sépare la fraction de cétone qui 20 n'a pas réagi (éther de pétrole : éther éthylique, 95 : 5 en volumes), et enfin le dioxolane a (éther de pétrole : éther éthylique, 85 : 15 en volumes) . Le dioxolane est un produit visqueux, partiellement cristallisé.

Rendement : 11 g (78 %) 25 rf : 0,18 (éther de pétrole : éther éthylique, 70 : 30 en volumes).

IR : 3500 cm"1 (OH) 1100 - 1060 cm“1 (C-0-).

t > - 5 - »

Etape b : Heptadécyle-2 méthyle-2 (chlorobutyryloxy- méthyle-41)-4 dioxolane-l,3. b

Un mélange de 6,4 g (18 initiale) d'heptadécyle-2 méthyle-2 hydroxyméthyle-4 dioxolane-l,3, préparé comme décrit 5 à l'étape (a) ci-dessus, et de 6 ml (45 mmole) de triéthylamine dans 15 ml de chloroforme sec est ajouté goutte à goutte à une solution de 6,25 g (22 mmole) de chlorure de chlorobutyryle-4 dans 10 ml de chloroforme sec à 0e C. Le mélange est agité pendant 12 heures à température ambiante. Après avoir ajouté 10 20 ml de chloroforme, le mélange est lavé avec une solution aqueuse de soude IN, puis avec de l'eau jusqu'à neutralité. L'élimination du solvant donne un résidu que l'on chromatographie sur colonne de gel de silice avec, comme éluant, des mélanges éther de pétrole : éther éthylique 15 successivement 95 : 5, 90 : 10 et finalement 80 : 20 en volumes. On obtient ainsi 7,6 g (rendement : 82 %) d'un produit huileux qui cristallise ; point de fusion : 39-40° C. Ce produit est un mélange de deux isomères cis et trans, difficilement séparables.

20 rf : 0,45 at 0,37 (éther de pétrole : éther éthylique, 80 : 20 en volumes).

IR : 1740 cm-1 (C=0) 1180 - 1160 cm-1 (C-o-C éther et ester) RMN : 60 MHZ, CDC13, (TMS.) 25 δ : 0,9 (triplet, 3H, CH3 de la chaîne) 1,3 (mult., 35H, 32H + CH3) 2.1 (mult., 2H, co-ch2-çh2) 2.5 (triplet, 2H, C0-ÇH2) 3.6 (mult., 4H, CH2-0 et CH2C1) 4.2 (mult., 3H, CH2OCO et CH-O).

- 6 -

Etape c : Chlorure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(pyridinium-N)-4' butyryloxyméthyle]-4 dioxolane-1,3. I

5 g du composé obtenu à 1'étape (b) précédente sont dissous dans 30 ml de pyridine, le mélange est agité à 80° C, 5 sous circulation d'azote, pendant 24 heures. L'excès de pyridine est ensuite éliminé sous pression réduite et le résidu est purifié par chromatographie sur gel de silice, on élue avec du chloroforme (pour recueillir le matériau de départ qui n'a pas réagi), puis avec des mélanges chloroforme : méthanol, tout 10 d'abord à 90 : 10, puis à 80 : 20 en volumes ; on obtient 3,80 g du composé recherché. Ce produit est un mélange des deux isomères cis et trans difficilement séparables.

Rendement : 40 % sur l'ensemble de l'exemple (65 % pour cette étape).

15 Point de fusion : 84-85° C.

rf : 0,28 (CHCI3 : MeOH, 70 : 30 en volumes) IR (nujol) : 1740 cm"1 1630 cm"1 (pyridine) 1200, 1180 cm"1 (C-O-C).

20 RMN : 250MHZ, CDCI3.

δ i 0,9 (triplet, 3H, CH3) 1,2 (sing, large 30H)

-O

y 1,4 (doublet, 3H, -0<^ch3) (les deux CH3 des deux diastéréoisomères) -° OÎJ- 25 1,55 (mult. , 2H, -0^ ) 2,35 (mult., 2H, CO CH2-ÇH2) 2,6 (triplet, 2H, CO CH2) 3.9 (mult., 1H, CH-O) 4 (mult., 2H, CH20 CO) 30 4,2-3,6 (2 mult., 2H, CH20) (des deux diastéréoisomères) Θ 5.10 (mult., 2H, CH2N) - 7 - 18 (mult., 2H, H^) 8,4 (mult., 1H, H7) 9,6 (doublet, 23Ha)

Spectre de masse : 5 M - Cl m/z : 504 /n\® VJ N_ (CH2)3 — C02H : 166.

EXEMPLE 2

Chlorure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [ (quinolinium-N) -4 * butyryl-oxyméthylel-4 dioxolane-1,3.

10 Etape c : 5 g du composé obtenu dans l'exemple 1 (étape b) sont dissous dans un mélange de 20 ml de quinoléine et de 20 ml de DMSO, puis chauffé à 80° C sous circulation d'azote, pendant 4 jours. La quinoléine et le DMSO sont distillés sous pression réduite et le résidu est chromatographié sur colonne de gel de 15 silice (Eluants successifs : CHC13, puis CHC13 : MeOH, 95 : 5 en volumes). On obtient 2,5 g du produit recherché sous forme d'un mélange de ses deux diastéréoisomères.

rf : 0,58 (CHC13 î MeOH, 70 : 30 en volumes) IR v quinoléine 1650, 1630 et 1600 cm"1 20 Spectre de masse : M - Cl m/z î 554 / r\ Θ N— (CH2)3 —C02H : 216.

, r - 8 - RMN : quinolinium au lieu de pyridinium. δ ppm : 7,90-8,10 (4H), 8,70 (1H), 8,90 (1H), 5 10,90 (ΙΗα) .

EXEMPLE 3

Chlorure d,heptadécyle-2 méthyle-2 Γ(N-thiazolinium)-41 butyryl oxyméthyle1-4 dioxolane-1,3.

Etape c : 850 g du produit obtenu dans l'exemple 1 (étape b) 10 mélangés avec 4 ml de thiazole et 6 ml de DMSO sont chauffés à 80e C pendant 24 heures. Le mélange réactionnel est évaporé sous vide et le résidu est chromatographié sur colonne de gel de silice, éluant : CHCI3 : MeOH, 50 : 50 en volumes. On obtient un produit visqueux.

15 rf : 0,34 (CHCI3 : MeOH, 70 : 30 en volumes).

RMN : thiazolinium au lieu pyridinium. δ ppm : 8,19 (d : 1H), 8,4 (d : 1H, 10,90 (sing. 1H).

20 Spectre de masse : M - Cl : 510 m/z.

EXEMPLE 4

Chlorure d'heptadécyle-2 f(N-pyridinium)-4' butyryloxy-méthylel-4 dioxolane-1,3.

Rl = 017Η35 , r2 = H, = pyridinium, X = Cl, p = 3.

25 2 b rf : 0,17 (éther de pétrole : éther éthylique, 30 : 70 en volumes) 3 b rf : 0,37 (éther de pétrole : éther éthylique, 70 : 3 0 en volumes) X]3 rf :0,16 (chloroforme : méthanol, 70 : 30 en volumes) r - 9 --Ο

Ib RMN au lieu de CH3 à 1,4 (-0^CH3) -0 y 2 multiplets centrés sur 4,9 ppm (-O^^jj) Spectre de masse : M-Cl : 490 m/z.

EXEMPLE 5 5 Chlorure d'heptadécyle-2 [(N-quinolinium)-41 butyryloxy-méthyle]-4 dioxolane-1,3♦ R1 = c17h35 / r2 = -N\^/ = X = C^/ P ~ 3 · rf : 0,48 (chloroforme : méthanol, 70 : 30 en volumes).

EXEMPLE 6 10 Chlorure d'heptadécyle-2 (n-propyle)-2 [(N-pyridinium)-4' butyryloxyméthyle]-4 dioxolane-1,3.

R1 = C17H35' r2 = n-propyl, = pyndimum, X = Cl, p = 3.

2c rf : 0,23 (éther de pétrole : éther éthylique, 70 : 30 en volumes) 3 c rf : 0,38 (éther de pétrole : éther éthylique, 80 : 20 en volumes) 15 Ic rf : 0,20 (chloroforme : méthanol, 73 : 30 en volumes) *c RMN au lieu de CH3 à 1,4 -0 CH2- y 1,55 (mult. 4H -Ολοη2- ) 1,2 (32H) 0,9 (triplet, 6H, 2CH3) 20 Spectre de masse : M - Cl : 532 m/z.

EXEMPLE 7

Chlorure d’heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-5 * pentanoyloxyméthylel-4 dioxolane-1,3.

- 10 - . .

R1 “ c17h35/ r2 " ch3r “N^J = Pyndimum, X = Cl, p = 4.

5 rf : 0,23 (chloroforme : méthanol, 70 : 30 en volumes).

EXEMPLE 8

Chlorure de (triméthoxyphényle - 3,4,5) - 2 méthyle-2 ΓN-pyridinium)-4 * butyryloxyméthylel-4 dioxolane-l,3.

v0CH3 ® R1 = "C O S“0CH3 a r2 = ch3/ PYridinium' X = Cl, p = 3 och3 10 2 d rf : 0,32 (chloroforme : méthanol, 98 : 2 en volumes) 2 d rf : 0,61 (chloroforme : méthanol, 98 : 2 en volumes) 1^ rf : 0,34 (chloroforme : méthanol, 60 : 40 en volumes) IR 1735 (C=0) 1610 (pyridine) 15 1590 (benzène) 2740 (0CH3) l£ RMN au lieu de la chaîne Ri -o y 1,5 ppm (m, 3H, -0*^0113) pour R2 3,7 (sing., 9H, OCH3) 20 6,8 (2H arom.)

Spectre de masse : M - Cl : 432 m/z.

EXEMPLE 9

Bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-6' hexanoyl- . oxyméthylel-4 dioxolane-1,3.

- 11 -

Rl = C17H35, R2 = CH3, = pyridinium, X = Br, p = 5.

5 Etape b : Bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 (bromohexanoyloxy-méthyle-61)-4 dioxolane-1,3.

En suivant le procédé décrit dans l’exemple 1 et en utilisant du chlorure de bromohexanoyl-6, on obtient le produit recherché sous forme de produit visqueux (rendement : 82 %).

10 rf : 0,57 (éther de pétrole ; éther, 80 : 20).

Etape c : Suivant le procédé décrit dans l'exemple 1, le produit recherché est obtenu sous forme d'un produit visqueux (rendement : 70 %).

rf : 0,36 (CHCI3 : MeOH), 70 : 30) 15 IR : 3450 cm"··*· (eau résiduelle) vCo 1740, vq-o-C 1180 / ypyridine 1640 c®”1 RMN 500 MHZ CDCI3, δ (TMS) 0,85 (triplet, 3H, CH3) ; 1,25 (sing, large 30H) ?

-O

1,35 (d 3H, -0^Ch3, Z + E) ; 1,45 (mult., 2H, CH2S) ; 20 2,1 (mult., 2H, COCH2ÇH2) ! 2,35 (mult., 2H, C0CH2) ; 2,70 et 4,35 (mult., 2H, CH20, Z + E) ; 4 (mult. 3H, CH2OCO et Θ H-C-0) ; 5,05 (triplet, 2H, CH2N).

pyridinium 8,1 (triplet, 2H, Hg) ; 8,6 (triplet, 1H, H7) ; 9,5 (d : 2H, Ha) .

25 Ü.V. (Ethanol) loge 3,65 λ 258,8 nm.

Spectre de masse : M - Br m/z : 532 O — (CH2)3— C02H : 194.

EXEMPLE 10

Bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 Γ (N-quinolinium) -61 hexanoyl- oxyméthyle]-4 dioxolane-1,3, - 12 - rf : 0,60 (CHCI3 : MeOH, 70 : 30 en volumes) 5 IR Quinolinium 1650, 1630, 1600 cm"1 U.V. (Ethanol) loge 4,53 λ 235,4 nm 2,18 λ 316,5 nm RMN quinolinium au lieu de pyridinium.

Θ S : 5,5 (2H, CH2N), 7,90 - 8,40 (5H), 9,10 (1H), 10,70 (1H, Ha) Spectre de masse : 10 M - Br m/z : 582 / \ LJ N_ (CH2)3 — C02H : 244.

EXEMPLE 11

Bromure d'heptadécyle^ méthyle-2 Γ (N-isoguinolinium) -61 hexanoyloxyméthylel-4 dioxolane-1,3.

15 Etape c : On utilise de 1'isoquinoléine au lieu de la quinoléine.

rf : 0,55 (CHCI3 : MeOH, 70 : 30 en volumes) IR isoquinoléine 1650, 1610, 1590 cm"1.

RMN isoquinolinium au lieu de quinolinium.

Spectre de masse : M - Br : 582 m/z.

- 13 - EXEMPLE 12

Bromure d,heptadécyle-2 méthyle-2 f(N-pyridinium)-111 undéca-noyloxyméthyle]-4 dioxolane-1,3.

R1 = c17h35/ r2 = ch3/ = pyridmium, X = Br, p = 10.

5 Etape b : Heptadécyle-2 méthyle-2 (bromo-undécanoyloxy- méthyle-111)-4 dioxolane-1,3.

En suivant le procédé décrit dans l’exemple 1 et en utilisant du chlorure de bromo-ll undécanoyle, on obtient le produit recherché.

10 Point de fusion : 52e C (rendement 60 %) rf : 0,26 (éther de pétrole : éther éthylique, 85 : 15).

Etape c

Point de fusion : 92° C

rf : 0,45 (CHCL3 : MeOH, 70 : 30 en volumes) 15 Spectre de masse : M - Br : 602 m/z.

EXEMPLE 13

Bromure d1heptadécyle-2 (n-propyle)-2 f(N-pyridinium)-6' hexanoylméthylel-4 dioxolane-1,3.

R1 = c17h35' r2 = n-propyle, -N” J = pyridinium, X = Br, 20 p = 5. ^ rf : 0,44 (CHCI3 : MeOH, 70 : 30 en volumes)

Point de fusion : 76° C

Spectre de masse : M - Br : 560 m/z.

- 14 - EXEMPLE 14

Bromure de nonyle-2 méthyle-2 [ (N-pyridinium) -61 hexanoyloxy-méthyle]-4 dioxolane-1,3.

Rl = C9H19, R2 = CH3 , = pyridinium, X = Br, p = 5.

5 Etape b rf : 0,50 (éther de pétrole : éther éthylique, 80 : 20 en volumes)

Etape c rf : 0,30 (CHCI3 : MeOH, 70 : 30 en volumes) 10 Spectre de masse : M - Br : 420 m/z.

- 15 -

TOXICOLOGIE

Les composés selon l’invention ont été administrés à la souris pour déterminer la valeur de la DL50· Pour tous les composés selon l'invention, la DL50 a été supérieure à 300 5 mg/kg (IP ou SC) et à 600 mg/kg (PO).

PHARMACOLOGIE

L'intérêt pharmaceutique des composés de l'invention a été mis en évidence par 1'expérimentation pharmaceutique suivante.

10 1°) - Inhibition de l'agrégation plaquettaire sur le lapin de

Nouvelle-Zélande.

L'expérimentation a été conduite sur des plaquettes, à partir de plasma de lapin de Nouvelle-Zélande. Les échantillons de sang ont été prélevés par l'artère 15 auriculaire et mis dans une solution de tampon citrate (3,8 % ; pH 7,4) ; le sang a ensuite été centrifugé pendant 15 mn à 1200 t/mn. L'échantillon testé a été préparé dans le DMSO, puis versé sur des plaquettes riches en plasma avec lesquelles il a été laissé en 20 contact pendant 1 mn, et une dose de 2,5 nM de PAF a été aj outée.

La détermination est faite sur un appareil Cronolog Coultronics qui détermine le pourcentage de transmission correspondant à la valeur maximale du pic avant la 25 désagrégation. Le pourcentage de variation de l'inhibition, en ce qui concerne le pourcentage de transmission, est calculé (témoin : DMSO pur) .

Cette méthode est décrite en détail dans LABORATORY INVESTIGATIONS, Vol. 41, No. 3, p. 275, 1979, JEAN-PIERRE

- 16 - CAZENAVE, Dr. MED., JACQUES BENVENISTE, Dr. MED., et J. FRASER MUSTARD, M. D., "Aggregation of Rabbits Platelets by Platelet-Activating Factor is independent of the Release Reaction and the Arachidonate Pathway and 5 inhibited by Membrane-Active drugs".

Les résultats démontrent que les composés inhibent l'agrégation induite par 2,5 nM de PAF. Cinq tests, effectués sur des lots de chacun cinq lapins, ont permis de calculer la CI50 des divers composés en utilisant la méthode de régression 10 linéaire.

Pour les composés des différents exemples, les valeurs suivantes de CI50 ont été trouvées :

Exemple No. CI50 PRP (M)

No. 1........................ 2,2 . 10”6 15 NO. 2........................ 1,2 . 10"6

No. 3........................ 2,15 . 10“5

No. 4........................ 7 . 10"e NO. 5........................ 3,1 . 10~6

No. 6.^....................... 3,04 . 10“6 20 NO. 7/....................... 5 . 10"6

No. 8........................ 1,13 . 10-5

No. 9........................ 4,04 . 10“7

No. 10........................ 3,03 . 10“7 NO. 12........................ 3,12 . ΙΟ”5 25 NO. 13........................ 1,73 . io_6

No. 14........................ 1,46 . 10“6 - 17 -

2 - BINDING

MATERIEL ET METHODE

Le PAF - [3H] synthétique tritié utilisé est une solution éthanolique présentant une activité spécifique de 59,5 ci/xnmols. Le PAF non marqué et le PAF-lyso sont en solution dans l'éthanol et stockés à -80°C. Les composés testés sont en solution dans le DMSO.

Préparations des plaquettes de membrane

On prélève du sang complet de lapin (6 volumes) par l'artère principale de l'oreille et on le verse dans 1 volume d'une solution d'ACD (1,4 g d'acide citrique, 2,5 g citrate de sodium, 2 g de dextrose pour 100 ml de H20) et on le centrifuge à 150 g pendant 15 minutes. Les plaquettes riches en plasma (PRP) sont retirées avec précaution et centrifugées pendant 15 minutes à 1000 g. L'amas plaquettaire est ensuite lavé 3 fois : deux fois à l'aide de lOmM- d'un tampon Tris-HCl, pH 7,4 contenant 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 2 mM d'EDTA et une dernière fois par le même tampon mais sans chlorure de sodium.

L'amas plaquettaire est remis en suspension dans ce dernier tampon, congelé rapidement dans l'azote liquide et décongelé lentement à température ambiante au moins 3 fois comme cela a été décrit par T. Y. Shen et al.. Les plaquettes lysées sont centrifugées à 100 000 g pendant 30 minutes dans une ultra centrifugeuse L8 55 modèle BECKMAN (Rotor 50,2 Ti). Les plaquettes homogénéisées sont stockées à -80°C et utilisées sous deux semaines sans changements notables dans les caractéristiques du binding du PAF acéther.

Le contenu en protéines est déterminé par la méthode Lowry utilisant de la serumalbumine bovine comme étalon.

- 18 -

Dosage du binding

On ajoute 60 à 100 /*g de protéines de la membrane sous un volume final d'un ml dans des tubes plastiques contenant 1 nM PAF [3H] dans lOnM d'un tampon de Tris-HCl de pH7 contenant 0,025 % serumalbumine bovine et incubé avec ou sans PAF non marqué ou d'antagonistes du PAF. L'incubation s'effectue pendant 1 h 30 à 0eC. Le PAF - [3H] lié s'est séparé du PAF - [3H] par filtration immédiate sous vide sur filtres en fibre de verre GF/C (système Brandel). Le réacteur et les filtres sont lavés 3 fois à l'aide d'une solution de 5 ml de tampon glacé.Les filtres sont ensuite placés dans des flacons en polyéthylène remplis de 10 ml de fluide de scintillation liquide et on mesure la radioactivité avec un compteur LKB ß dont le rendement est de 45 %.

On détermine le binding non spécifique en présence de “6 10 M de PAF non marqué. On calcule le binding spécifique en soustrayant le binding non spécifique du binding total. On détermine l'inhibition provoquée par les composés sur le binding PAF - [3H] spécifique en pourcentage d'inhibition par la formule suivante : (3H-EAF lié totalement - lié ® Présence ]

..... I des composés testés J

% inhibition = ____ x 10o PAF-3H lié spécifiquement

Les valeurs trouvées pour les corps des différents exemples sont les suivantes :

Exemple No. IC

so

No. 1.............. 4,5 . 10~7 NO. 9.............. 3,5 . 10-8

No. 10.............. 3,5 . 10~8

No. 14.............. 6,1 . ÎO-7 - 19 - 3 - BRONCHOCONSTRICTION, LEUCOPENIE ET THROMBOCYTOPENIE INDUITES PAR PAF CHEZ LE COCHON D'INDE.

MATERIAUX ET METHODES

On anesthésie des cochons d’Inde mâles (400 à 500 g) 5 avec de l'uréthane (1,5 g/kg, IP) avant de leur faire subir une trachéotomie et d'introduire une pompe respiratoire (UGO BASILE) (70 à 80 inspirations par minute, 1 ml d'air / 100 g / inspiration), pour supprimer toute respiration spontanée, on effectue un pneumothorax. La résistance à 1'insuflation est 10 mesurée avec un transducteur de pression (UGO BASILE) par rapport à une pression initiale de 10 cm H2O selon Konzett et Rossler. Les animaux sont répartis dans plusieurs groupes qui sont traités ou non avec les composés de l'invention (0,05 ; 0,1 ; 0,5 ; 1 et 5 mg/kg). Les produits sont administrés par 15 intra-veineuse 1 heure avant le PAF.

Les animaux sont testés avec différentes doses de PAF (30 à 100 n/kg) administrées par intra-veineuse ; on enregistre les variations de la résistance à 1'insuflation.

Des échantillons de sang sont prélévés avant 20 administration du PAF puis 1,5 et 10 minutes après administration. Quarante μΐ de sang sont dilués dans 10 ml d'isoton (Coultronics, FRANCE) ; les érythrocytes sont dilués dans de la zapoglobine avant de compter les leucocytes avec un compteur Coulter. Pour déterminer le nombre de plaquettes, 25 40 μΐ de sang sont dilués dans 2 ml d'isoton puis centrifugés à 100 tours/minute pendant 30 secondes, on prélève 100 μΐ de la couche de surface et on les dilue dans 10 ml d'isoton avant de compter les plaquettes avec un compteur Coulter.

4 - 20 -

Tableau η* 1 : Effets du bromure d'heptadécyle - 2 méthyle - 2 ‘ [ (N - pyridinium) - 6' hexanoyloxyméthyle] - 4 dioxolane - 1,3 sur la bronchoconstriction induite par PAF.

5 Doses Pourcentage de Pourcentage

mg/kg n Bronchoconstriction de Variation IV

Témoin - 8 79,8 +/” 3,22 5 3 3,5 +/" 1/53 - 95,6 ***

Composé 1 4 19,1 +/“ 10,51 - 7,61 *** de 0.5 6 23,6 +/“ 7,15 - 70,4 *** l'exemple 10 0.1 6 43,8 +/“ 14,77 - 45,1 **

No. 9---:--

0.05 3 79,0 +/- 9/27 - 1,0 NS

LEGENDE DE TOUS LES TABLEAUX î NS : Non significatif * : p < 0,05 I5 ** : P < 0,01 *** : p < 0,001 - 21 -

Tableau No.2 : Effets du bromure d'heptadécyle - 2 méthyle - 2 [(N - pyridinium) - 6' hexanoyloxyméthyle] - 4 dioxolane - 1,3 sur la leucopénie induite par PAF.

5 Pourcentage de

Doses n Temps diminution .du Pourcentage mg/kg (mn) nombre de de Variation IV leucocytes 8 1 40,8 +/“ 7,18 Témoin - 8 5 29,2 +/- 10,89 8 10 33,5 +/- 5,04 3 1 16,5 +/- 2,42 - 59,6 *

10 535 15,9 +/- 0,99 - 45,5 NS

composé 3 10 18,7 +/- 5,08 - 44,2 NS

4 1 3,5 +/- 12,60 - 91,4 ** de 145 2,9 +/- 10,51 - 90,1 * 4 10 1,0 +/- 22,62 - 97,0 **

15 l'exemple 6 1 34,6 +/- 6,35 - 15,2 NS

0/5 6 5 19,0 +/- 6,42 - 34,9 NS

6 10 14,6 +/- 5,36 - 56,4 NS

No. 9-----

6 1 41,8 +/- 6,50 + 2,5 NS

0,1 6 5 31,9 +/“ 4,88 - 9,2 NS

20 6 10 33,5 +/- 4,65 0,0 NS

3 1 45,3 +/- 5,70 +11,0 NS

0,05 3 5 21,6 +/- 3,42 - 26,0 NS

3 10 14,2 +/- 17,30 - 57,6 NS

- 22 -

Tableau No. 3 : Effets du bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N - pyridinium) - 6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane - 1,3 sur la thrombocytopénie induite par PAF.

5 Pourcentage de Pourcentage

Doses Temps diminution du de mg/kg n (mn) nombre de Variation IV leucocytes 8 1 68,6 +/- 6,79 Témoin _ 8 5 42,4 +/” 2,71 8 10 42,5 +/“ 3,14 3 1 4,2 +/“ 2,35 - 93,9 *** 10 535 5,6 +/” 1/84 - 86,8 ***

Composé ---- 3 10 1,1 +/- 1/15 - 97,4 *** 4 1 11,5 +/“ 6,21 - 83,2 *** 1 4 5 22,5 +/" 3,27 - 46,9 * de---- 4 10 21,0 +/- 3,87 - 50,6 * 15 61 19,3 +/- 10,19 - 71,9 *** 0,5 6 5 9,6 +/- 12,15 - 77,4 *** 1'exemple ---- 6 10 10,9 +/- 9/94 - 74,4 *** 6 1 30,1 +/“ 13,72 - 56,1 **

0,1 6 5 34,7 +/" 3,60 - 18,2 NS

No. 9----

20 6 10 42,3 H-/- 4,79 - 0,5 NS

3 1 45,2 +/“ 1/20 - 34,1 NS

0,05 3 5 43,0 +/“ 4,80 + 1,4 NS

3 10 36,1 +/- 2,41 - 15,1 NS

- 23 -

Tableau No.4 : Effets du bromure d'heptadécyle - 2 méthyle - 2 [(N - quinolinium) - 6'hexanoyloxyméthyle] - 4 dioloxane - 1,3 sur la bronchoconstriction induite par PAF.

5 Doses Pourcentage de Pourcentage mg/kg IV n Broncho- de constriction Variation Témoin - 6 90,8 +/- 0,95

Composé 1 5 8,1 +/- 2,91 - 91,1 *** de---- 0,5 5 25,1 +/" 6,53 - 72,4 *** l'exemple

10 NO. 10 0,1 5 80,4 +/- 13,78 - 11,5 NS

- 24 -

Tableau No.5 : Effets du bromure d'heptadécyle - 2 méthyle - 2 [(N - quinolinium) - 6' hexanoyloxyméthyle] - 4 dioloxane - 1,3 sur la leucopénie induite par PAF.

5 Pourcentage de

Doses Temps diminution du Pourcentage mg/kg n (mn) nombre de de IV leucocytes Variation 6 1 41,4 +/“ 8,0 Témoin 6 5 28,7 +/“ 6,9 _ 6 10 26,9 +/’ 10,1

5 1 24,1 +/" 6,8 - 41,0 NS

10 155 9,3 +/“ 9/4 - 67,6 **

Composé ---- 5 10 8,9 +/" 13,2 - 66,9 ** de 5 1 17,0 +/“ 12,9 - 58,9 * 0,5 5 5 9,0 +/~ 11,8 - 68,6 ** 1'exemple---:--

5 10 - 7,6 +/" 17,5 + 128,3 NS

15-----

No. 10 51 38,8 +/” 6,3 + 6,3 NS

0,1 5 5 38,9 +/- 5,7 + 35,5 NS

5 10 41,2 +/- 6,5 + 53,2 NS

- 25 -

Tableau No.6 : Effets du bromure d'heptadécyle - 2 méthyle - 2 [(N - quinolinium) - 6' hexanoyloxyméthyle] - 4 dioloxane - 1,3 sur la thrombocytopénie induite par PAF.

5 Pourcentage de

Doses Temps diminution du Pourcentage mg/kg n (mn) nombre de de IV leucocytes Variation 6 1 65,3 +/“ 8,5 Témoin - 6 5 49,1 +/- 4,8 6 10 48,5 +/- 0,5 5 1 19,3 +/“ 1/4 “ 58,3 *** 10 1 5 5 22,1 +/- 2,5 - 55,0 **

Composé ---- 5 10 19,4 +/“ 3,6 - 60,0 ** de 5 1 26,2 +/- 6,3 - 59,9 ** 0,5 5 5 29,8 +/“ 1/7 - 39,3 * l'exemple ---- 5 10 32,1 +/“ 5,8 - 33,8 *

15 No. 10 51 51,1 +/“ 12,1 - 21,7 NS

0,1 5 5 49,1 +/- 8,8 0 NS

5 10 45,0 +/" 9,7 - 7,2 NS

- 26 -

RESULTATS

>

Le bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-1,3 (0,5 ; 1 et 5 mg/kg, IV) et le bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-quinolinium)-61 5 hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-1,3 (0,5 et 1 mg/kg, IV) inhibent la bronchoconstriction et la thrombocytopénie induites par PAF chez le cochon d'Inde.

4 - BRONCHOCONSTRICTION, LEUCOPENIE ET THROMBOCYTOPENIE INDUITES PAR ANTIGENE CHEZ LE COCHON D'INDE PASSIVEMENT 10 SENSIBILISE PAR SERUM HETEROLOGUE.

Une injection intra-veineuse d'ovalbumine à des cochons d'Inde passivement sensibilisés avec un sérum anti-ovalbumine de lapin induit une bronchoconstriction associée à une leucopénie et à une thrombocytopénie. Cette réaction 15 anaphylactique semble être dûe à la libération d'histamine et à la génération de métabolites d'acide arachidonique (prostaglandines, thromboxane A2 et leucotriènes) . Chez le cochon d'Inde, la libération d'autacoîdes est en principe déclenchée via les immunoglubulines de la classe IgG.

20 METHODE

- Animaux : . Cochons d'Inde mâles, Charles River (450 à 500 g) - Procédé d'immunisation : . Injection intra-veineuse, 18 heures avant le test avec 25 l'antigène, de 0,5 ml/kg d'une dilution à 1/2 d'antisérum d'anti-ovalbumine de lapin.

- 27 - i - Le test est composé de : . Ovalbumine, 0,75 g/kg, . Injection intra-veineuse de l'antigène en dosage final de 1 ml/kg, 5 . Agent vecteur : 0,15 M de NaCl.

- Les composés sont administrés par voie orale, dosés à 1,5 ml/kg, 1 heure avant le test avec l'antigène, après anesthésie par injection intrapéritonéale de carbamate d'éthyle (1,5 g/kg) dosé à 10 ml/kg.

10 Paramètres contrôlés et expression des données : a - Bronchoconstriction : . bronchoconstriction induite par antigène en mm (A), . bronchoconstriction maximale en mm (B).

Le pourcentage de bronchoconstriction est calculé comme 15 suit :

A x 100 B

Le comptage des neutrophiles et des plaquettes est réalisé 1 minute avant le test puis 1,5 et 10 minutes après le test. Les écarts sont exprimés en pourcentages calculés par 20 rapport aux valeurs obtenues une minute avant le test.

i - 28 - L'équipement suivant a été utilisé : - Ugo Basile, Comerio ITALIE, . Respirateur Rodent réf. 7025 . Transducteur Bronchospasme réf. 7020 5 . Enregistreur Deux-Pistes "GEMINI" réf. 7070 - Coultronics, FRANCE,

. Compteur Coulters Z B I

Tableau No.7 : Effets du bromure d'heptadécyle - 2 méthyle - 2 [(N - pyridinium) - 6 ' 10 hexanoyloxyméthyle] - 4 dioloxane - 1,3 sur la bronchoconstriction induite par antigène.

Pourcentage

Dose de Broncho- Pourcentage mg/kg IV n constriction de

Variation Témoin - 6 71,9 +/- 14,2 15 Composé de

l'exemple 5 8 51,3 +/- 14,2 - 28,7 NS

No. 9 - 29 -

Tableau No.8 : Effets du bromure d'heptadécyle - 2 méthyle - 2 [(N - pyridinium) - 6' hexanoyloxyméthyle] - 4 dioloxane - 1,3 sur la leucopénie induite par antigène.

5 Pourcentage de

Dose Temps diminution du Pourcentage mg/kg n (mn) nombre de d'inhibition IV leucocytes 6 1 - 11,8 +/- 5,1 Témoin - 6 5 - 39,6 +/- 9,5 6 10 - 53,9 +/- 7,1

Composé 8 1 - 15,6 +/- 6,6 + 32,0 NS

de---- 10 l'exemple 5 8 5 - 8,7 +/- 10,7 - 78,0 *

No. 9---- 8 10 - 12,3 +/- 14,1 - 77,2 *

Tableau No.9 : Effets du bromure d'heptadécyle - 2 méthyle - 2 [(N - pyridinium) - 6' hexanoyloxyméthyle] - 4 dioloxane - 1,3 sur la thrombocytopénie induite 15 par antigène.

Pourcentage de

Dose Temps diminution du Pourcentage mg/kg n (mn) nombre de d'inhibition IV leucocytes 6 1 -6,8 +/- 2,7 Témoin “ 6 5 - 39,7 +/- 12,5 6 10 - 26,1 +/~ 8,1

20 Composé 8 1 +0,3 +/— 7,9 - 104,4 NS

de---- l'exemple 5 8 5 - 3,5 +/- 3,1 - 91,2 **

No. 9----

8 10 - 15,7 +/- 6,2 - 39,8 NS

- 30 -

RESULTATS

Le bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-1,3 (5 mg/kg, IV) neutralise la leucopénie et la thrombocytopénie induites par l'antigène, sans réduire notablement la bronchoconstriction induite par 1 ' antigène.

5 - ACTION SUR L' HYPOTENSION INDUITE PAR LE PAF CHEZ LE RAT ANESTHESIE.

MATERIAUX ET METHODES :

Des rats Sprague Dawley mâles (Charles River) (250 à 3 00 g) sont anesthésiés (IP) au carbamate d'éthyle dosé à 1,2 g/kg.

Une injection intra-veineuse de PAF provoque une hypotension dose-dépendante. On recherche les effets du bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-6' hexanoyloxy-méthyle]-4 dioxolane-1,3 et du bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [ (N-quinolinium) -6 ' hexanoyloxyméthyle] -4 dioxolane-1,3 sur l'hypotension induite par le PAF, dans les traitements curatifs. L'hypotension est provoquée par une seule dose de PAF (1 /*g/kg) , 0,1 ml/100 g en volume, injectée IV, directement dans la veine du pénis. On administre les composés quand le point d'hypotension maximum est atteint, c'est-à-dire 3 minutes après l'injection de PAF.

- Paramètres mesurés et expression des résultats :

On mesure les pressions systolique et diastolique (mm Hg) . Les valeurs sont exprimées, sous la forme de leur moyenne +/" SEM, sur les courbes des figures 1 et 2 annexées.

- Appareils de mesures : . Transducteur Gould P50 pour mesurer la pression artérielle, . Perfuseur Braun, . Enregistreur polygraphique Gould 8000 S.

-Βίε - ANTAGONISME DE L'AGREGATION DE LEUCOCYTES POLYMORPHO-NUCLEAIRES INDUITE PAR LE P AF.

On obtient des leucocytes polymorphonucléaires (PMNs) selon la méthode décrite par A. W. Ford-Hutchinson & al. (Br -5 J. Pharmacol. 76, 367 - 371, 1982). Des suspensions cellulaires (< 90 % de PMNs) sont préparées à partir d'exsudats péritonéaux obtenus après avoir injecté, IP, 5 ml de caseinate de sodium à 12 % à des rats Wistar mâles, pesant 300 g.

Après centrifugation, les cellules sont lavées à 10 la solution de Hanks et remises en suspension dans du MEM/Hepes à 30mM en moyenne (PM = 7,4), la concentration étant de 107 cellules par ml. Dix minutes avant le début de l’agrégation, on ajoute de la cytochalasine B (5 μ/ml) de façon à augmenter l’agrégation des PMNs. La transmission lumineuse à travers la 15 suspension cellulaire (400 μΐ) est mesurée sous agitation magnétique à 900 T/mn, à l’aide d’un agrégomètre à double faisceau (Chronolog Corp. Coultronics).

Le bac témoin contient la suspension cellulaire diluée à 20 % du nombre de cellules avec le MEM et la différence 20 représente 100 % de transmission. La variation de la transmission, lorsqu'on ajoute du PAF, est enregistrée en continu.

4 μΐ des composés dissous dans le MEM/Hepes sont ajoutés à la suspension de PMNs, avant l'addition de PAF.

25 RESULTATS

Le PAF, dosé à 10“8 M, induit une agrégation de 55 à 70 % dans cette suspension de PMNs.

Le bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-1,3 et le bromure 30 d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-quinolinium)-6' hexanoyloxy- méthyle]-4 dioxolane-1,3 inhibent, en fonction de leur dose, t _ 32 _ cette agrégation avec les valeurs respectives de Cl50s suivantes : . bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-1,3 : 5 x 10“7 M, 5 . bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-guinolinium)-61 hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-1,3 : ΙΟ"6 M.

7 - INHIBITION DE IA MOBILISATION INTRACYTOSOLIQUE LIBRE DE CALCIUM INDUITE PAR LE PAF DANS DES PLAQUETTES DE IAPIN LAVEES.

10 On prélève du sang dans l'artère auriculaire du lapin, puis on le mélange avec de l'acide citrique, du citrate de sodium, de la dextrose et un anti-coagulant ; les plaquettes sont préparées selon Adlie & al., Brit. J. Pharmacology, 19, 7-17, 1970. Elles sont incubées avec 100 μΜ de sel 15 acétylsalicique pendant 30 minutes pour éviter une agrégation induite par le thromboxane. Ces plaquettes sont ensuite chargées avec un colorant quin 2, indicateur de calcium fluorescent, par incubation avec 1'acéto-méthylester de quin 2 (15 μΜ dans le DMSO pendant 20 minutes, à température 20 ambiante), le colorant pénètre dans la membrane de la cellule et, après hydrolyse, est piégé dans la plaquette. Les composés sont pré-incubés avec les plaquettes pendant 15 minutes en même temps qu'un mélange de CP/CPK qui détruit 1'ADP sécrétée.

Après avoir ajouté le PAF à la suspension plaquettaire, 25 on effectue les mesures de fluorescence (excitation : λ = 339 nm, émission : λ = 492 nm) . L'intensité de la fluorescence est proportionnelle au niveau cytosolique libre de calcium [Ca2+]i qui peut être quantifié suivant la méthode de Tsien & al., J. Cell Biol., 9£, 325 - 334, 1982.

-33 -

RESULTATS

La stimulation plaquettaire induite par le PAF dosé à 2 x ίο-9 M augmente le niveau de [Ca2+]i qui passe d'environ 150 nM (au repos) à 400 - 600 nM.

5 Le bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-1,3 et le bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-quinolinium)-6' hexanoyloxy- méthyle]-4 dioxolane-1,3 dosés à 5 x 10“7 M inhibent totalement la mobilisation de [Ca2+]i induite par le PAF. A 5 x 10"8 M, 10 l'inhibition de l'effet du PAF est, respectivement, de 44 % pour le bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-1,3 et de 75 % pour le bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-quinolinium)-6' hexanoyloxy- méthyle]-4 dioxolane-1,3.

15 POSOLOGIE

Chez l'homme, en administration orale, les doses quotidiennes vont de 0,1 à 0,5 mg en comprimés ou capsules à enrobage entérique ; pour l'administration intra-veineuse, les doses quotidiennes correspondantes sont de 0,01 à 0,05 mg.

20 La durée du traitement est de 2 à 6 semaines.

Claims

5 R]_ représente un groupement phényle substitué ou un groupe de formule CmH2m + χ, m étant un entier de 9 à 25, R2 représente un atome d'hydrogène, un groupement phényle ou un groupe de formule CnH2n + i, n étant un entier de 1 à 10, p est un entier de 3 à 10, 10 rePresente un groupement hétérocyclique contenant un atome d'azote tel que le pyridinium, le thiazolinium-3, le quinolinium, l'isoquinolinium, l'imidazolium et le pyrazinium, et Θ X représente l'anion pharmaceutiquement acceptable d'un acide 15 minéral ou organique, un ion halogène tel que le chlore, le brome, l'iode ou les anions des acides benzoïque, acétique, méthanesulfonique, ou tartrique, sous la forme de leurs diastéréoisomères isolés ou de tout mélange de ceux-ci. - 35 - 2e) - Un procédé de préparation des composés selon la revendication 1 consistant à faire réagir un léger excès, par rapport aux proportions stoechiométriques, d'un aldéhyde ou d'une cétone de formule , dans laquelle ^ et R2 sont 5 tels que définis plus haut, sur le glycérol, dans un solvant non polaire, en présence d'acide p-toluènesulfonique et dans des conditions de reflux, puis à faire réagir, à température ambiante, le dérivé hydroxyméthyle-4 dioxolane-1,3 ainsi obtenu sur un chlorure de ω-haloalcane de formule ClC0(CH2)pX, dans 10 laquelle p et X sont tels que définis précédemment, en présence d'une base organique telle que la triéthylamine et, enfin, à faire réagir, entre 50° et 80°c, sous circulation d'azote, le composé résultant, de formule E° R1 X 1
0 R2 0CO(CH2) -X 15 sur un composé hétérocyclique contenant un atome d'azote de formule 0 3°) - Une composition thérapeutique comprenant, à titre de principe actif, une quantité effective d'au moins l'un des 20 composés selon la revendication 1, associé avec un excipient approprié.