PL168354B1 - Sposób wytwarzania statystycznej biblioteki biooligomerów PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania statystycznej biblioteki biooligomerów na drodze syntezy chemi- cznej, w której oligomery syntetyzuje sie przez sukcesywne sprzeganie róznych rodzajów merów z oligomerami zwiazanymi ze stalym nosnikiem, znamienny tym, ze (a) dostarcza sie co najmniej tyle próbek stalofazowego nosnika, ile róznych merów biooli- gomerów ma byc dodanych, lecz co najmniej dwie, (b) oddzielnie do próbek stalofazowego nosnika wprowadza sie zestaw merów, tak ze do kazdej próbki wprowadzany jest jeden mer, (c) sprzega sie calkowicie mery z zasadniczo wszystkimi centrami stalofazowego nosnika, (d) stwierdza sie kompletnosc sprzegania wytworzonej kombinacji stalofazowy nosnik/nowy mer oraz, w razie potrzeby, wymusza sie kompletnosc reakcji, (e) dokladnie miesza sie próbki kombinacji stalofazowy nosnik/nowy mer, i powtarza sie powyzsze etapy (a) - (e) wymagana ilosc razy, po czym usuwa sie grupy blokujace, pozostawiajac kazdy biooligomer przylaczony do stalofazowego nosnika. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania statystycznej biblioteki biooligomerów. Biooligomerem w rozumieniu sposobu według wynalazku może być peptyd, oligonukleotyd lub chimeryczny konstrukt peptydowo-oligonukleotydowy.

Rozpoznawanie i wiązanie ligandów reguluje prawie wszystkie procesy biologiczne takie jak rozpoznawanie odporności, sygnalizowanie i komunikacja w komórkach, transkrypcja i translacja, sygnalizowanie wewnątrzkomórkowe oraz katalizę, np. reakcje enzymatyczne. Od dawna istnieje zainteresowanie identyfikacją cząsteczki, które działają jako agonisty lub które mogą agonizować lub antagonizować aktywność ligandów takich jak hormony, czynniki wzrostu i neurotransmitery; które indukują odporność komórki B (z pośredniczeniem przeciwciała) lub

168 354 3 komórki T (z pośredniczeniem komórki); które mogą katalizować reakcje chemiczne; lub które mogą regulować ekspresję genu na poziomie transkrypcji lub translacji.

Szczególnie interesujące są ligandy proteinowe lub peptydowe. Należy do nich większość hormonów, czynników wzrostu, cząsteczek neuroaktywnych oraz epitopów odporności. Ponadto, jak to przedstawiono poniżej, najwięcej prób w tworzeniu antagonistów lub agonistów biologicznej aktywności z udziałem receptorów, a także epitopów antyciał lub komórek T, zogniskowano na peptydach. Jednakże rozwój środków farmaceutycznych dostosowanych do centrów wiązania receptorów jest znacznie zahamowany z uwagi na trudności w ustaleniu sekwencji ligandów peptydowych. Olbrzymia liczba i znaczna różnorodność takich sekwencji peptydowych spowodowała, że jest to cel niemożliwy do osiągnięcia żadnymi środkami z wyjątkiem żmudnego wydzielania określonego kompleksu, identyfikacji położenia epitopu oraz sekwencjonowania tego epitopu. Problem jest dodatkowo skomplikowany w związku tym, że często epitop zawiera reszty aminokwasów, które nie sąsiadują w sekwencji pierwotnej.

Usiłowano obejść ten czasochłonny proces ustalając sekwencję aminokwasów w białku na podstawie sekwencji nukleotydów w jego komplemencie. Białka są wielkimi peptydami złożonymi z aminokwasów; każdy aminokwas jest kodowany przez jeden lub więcej kodonów złożonych z trzech reszt kwasów nukleinowych. Tak np. peptyd A zawierający aminokwas glutaminę powinien być kodowany przez kodon z trzech reszt kwasów nukleinowych: cytozyny, adeniny i guaniny. Komplementem do tego kodonu powinna być guanina (która wiąże się z cytozyną), tymina (która wiąże się z adeniną) oraz cytozyna, przy czym będzie on kodował aminokwas w peptydzie B. Zgodnie z teorią komplementarności peptyd B powinien wiązać się z peptydem A. W szczególności Bost i Blalock (1989, Methods in Enzymology 168: 16 - 28) zasugerowali, że dowolny dany peptyd będzie wiązać się z innym peptydem kodowanym przez komplementarną sekwencję reszt kwasów nukleinowych oraz, na podstawie tej informacji, przewidzieli sekwencję aminokwasów w peptydzie komplementarnym. Użyli oni sekwencję do zsyntetyzowania peptydu i zbadania jego zdolności do wiązania.

Jednakże podejście to nie zapewniło rozwiązania problemu gdyż powinowactwo wiązania między komplementarnymi peptydami było zasadniczo bardzo małe i wymagało stosowania komplementarnych peptydów zawierających ponad 15 reszt. Ponadto podejście takie wymagało znajomości sekwencji aminokwasów lub sekwencji kwasów nukleinowych w wiążącym partnerze białka będącego przedmiotem zainteresowania. Podejście takie nie daje również rezultatów również w przypadku epitopów zawierające reszty aminokwasów nie sąsiadujące w sekwencji podstawowej.

Ostatnio pojawiło się szereg doniesień dotyczących wytwarzania bibliotek peptydów i ich zastosowania w identyfikacji ligandów peptydowych, które mogą wiązać się z akceptorami. Jeden z wariantów dotyczy stosowania zrekombinowanego bakteriofaga do wytwarzania wielkich bibliotek. Wykorzystując „metodę fagową“ (Scott i Smith, 1990, Science 249: 386 - 390; Swirla i inni, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 6378 - 6382; Devlin i inni, 1990, Science, 249: 404 - 406) konstruować można bardzo duże biblioteki (10 - 10 indywiduów chemicznych), z tym że kod genetyczny i układ biologiczny narzuca surowe wewnętrzne ograniczenia na uniwersalność i różnorodność układu. W drugim wariancie wykorzystuje się podstawowe metody chemiczne, których przykład stanowi metoda Geysena (Geysen i inni, 1986, Molecular Immunology 23: 709 -715; Geysen i inni, 1987, J. Immunologie Method 102: 259 - 274) oraz nowa metoda Fodora i innych (1991, Science 251, 767 - 773). Metodologia Geysona i innych umożliwia syntetyzowanie ograniczonej ilości peptydów (10³ - 10⁴) na szpilkach polietylenowych w ciągu kilku dni. Metoda Fedora i innych wykorzystuje technikę „sterowanej światłem, przestrzenie kierowanej równoległej syntezy chemicznej¹¹. Technika ta wykazuje ograniczenie spowodowane względnym brakiem rozwoju fotochemicznych metod syntezy peptydów.

Opracowano również techniki równoległe zgodnej syntezy peptydów w dużej skali. Houhton doniósł o równoczesnej syntezie setek analogicznych peptydów w pakietach z siatki polipropylenowej (metoda torebek herbaty) (Houghton, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci USA 82: 5131 - 5135).

„Metodę torebek herbaty“ opisano szerzej w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4 631211. Polega ona na umieszczeniu stałofazowych nośników w porowatych oznaczonych pojemnikach tak, że w tym samym naczyniu można prowadzić procesy chemiczne wspólne dla

168 354 kilku różnych syntez. Po zakończeniu wspólnych procedur indywidualnie oznakowane pojemniki można rozdzielić i poddawać dalszej obróbce indywidualnie aby zakończyć syntezę i usunąć peptyd z nośnika. Ujawnienie to dotyczy jednak syntezy zestawu peptydów, a nie mieszanin peptydów.

Przykładowe ujawnienie w tym opisie dotyczy konstruowania zestawu peptydów, opartego na wcześniej założonej sekwencji („sekwencja probanta). Każdy człon zestawu różni się od tej wcześniej założonej sekwencji w jednej i tylko jednej pozycji („pozycja wariantowa). Tak więc, dla każdego rodzaju peptydu w zestawie identyfikacja pozycji wariantowej natychmiast określa tożsamość reszty peptydu we wszystkich innych pozycjach, a tym samym sekwencję probanta. Ponadto każdy rodzaj peptydu w zestawie otrzymanym jak opisano we wspomnianym opisie patentowym różni się od każdego innego rodzaju w jednej lub dwóch pozycjach sekwencji probanta, składającej się z 13 pozycji. Tak więc w opisie tym nie ujawniono sposobu wytwarzania biblioteki przypadkowych peptydów, jak to ma miejsce w sposobie według wynalazku.

(Berg i inni (1989, J. Am. Chem. Soc. 111: 8024 - 8026) donieśli o nowej polietylenowej folii szczepionej polistyrenem, jako nośniku nadającym się do syntezy peptydów techniką równoległą. W obydwu metodach wykorzystuje się standardową żywicę Boc-aminokwasową i standardową procedurę odblokowywania, zobojętniania, sprzęgania i przemywania podaną w oryginalnej metodzie syntezy w fazie stałej Merrifielda (1963, J. Am. Chem. Sci. 85: 2149 - 2154).

Furka i inni (1988, 14th International Congress of Biochemistry, Vol. 5, Abstract FR: 013) opisali sposób wytwarzania mieszaniny peptydów oddzielnego sprzęgania każdego z trzech różnych aminokwasów, a następnie wymieszania wszystkich żywic.

Furka i inni stwierdzają, że korzystnie, stosując ten sposób, można wytworzyć wielką ilość peptydów, oszczędzając wiele czasu i pracy. Sugeruje się w tej pubikacji, że mieszaninę peptydów można poddać frakcjonowaniu w poszukiwaniu peptydów czynnych biologicznie, stwierdza jednak, że dotychczas nie przeprowadzono żadnych testów biologicznych na mieszaninie peptydów.

W celu zilustrowania opisywanego w tej publikacji sposobu, przedstawiono następujący przykład syntezy mieszaniny 9 tetrapeptydów. Mieszaninę 9 tetrapeptydów wytworzono, wychodząc z 3 równych próbek Ala(A)-żywica, które acylowano, odpowiednio, pochodnymi Glu(E), Phe(F) i Lys(K) z odpowiednio zabezpieczonymi grupami Boc łańcuchami bocznymi. Otrzymane pochodne trzech żywic mieszano, następnie dzielono ponownie na 3 równe części, które ponownie sprzęgano, odpowiednio, z Glu, Phe lub Lys, i następnie mieszano. Następnie mieszaninę sprzęgano z Glu. Syntetyzowano dziewięć rodzajów żywicy, z których każdy zawierał peptyd o postaci E(E/F/K) (E/F/K)A, gdzie (E/F/K) oznacza Glu, Phe lub Lys.

Następnie z peptydów jednocześnie usuwano grupy zabezpieczające i odszczepiono peptydy od żywic.

Procedura opisana przez Furkę i innych nie zapewnia jednak zadawalającej metody wydzielania peptydu będącego przedmiotem zainteresowania spośród szeregu wytworzonych peptydów.

Jakkolwiek użyteczne z praktycznego punktu widzenia, chemiczne metody Geysena, Fodora, Houghtona, Berga oraz Furki i współpracowników umożliwiają jednorazowo syntezę i zbadanie jedynie od setek do kilku tysięcy peptydów. Techniki te są zdecydowanie ograniczone w świetle milionów możliwych sekwencji peptydowych, z których jedna lub dwie mogą odpowiadać centrom wiązania między indywiduami będącymi przedmiotem zainteresowania. W przypadku 20 znanych aminokwasów dla sekwencji 5 aminokwasów istnieje 20⁵ czyli około 3,2 X 10⁶ możliwych kombinacji aminokwasów. Żadna z tych procedur nie umożliwia równoczesnej syntezy tak wielu peptydów. Dalsze zwielokrotnienie wystąpi przy zmienianiu długości łańcucha peptydu. Również konwencjonalne syntezy peptydów, takie jak opisane przez Stewarda i Younga (1984, Solid Phase Synthesis, Second Edition, Pierce Chemical Co., Rockford, IL) nie dostarczają sposobu równoczesnej syntezy tysięcy do milionów peptydów.

Na dodatek żadna z innych konwencjonalnych metod syntezy peptydów nie umożliwia syntezy rzeczywiście statystycznej biblioteki peptydów związanych ze stałofazowym nośnikiem. Rzeczywistą statystyczną bibliotekę peptydów stanowi taka biblioteka, w której występuje dobry statystyczny rozkład wszystkich składników cząsteczkowych, tak że w bibliotece występują w przybliżeniu równomolowe stosunki wszystkich indywidualnych rodzajów peptydów.

Syntezy rzeczywiście statystycznego peptydu zazwyczaj nie można przeprowadzić dodając równocześnie różne aminokwasy do jednego reaktora, gdyż szybkości sprzęgania różnych ami168 354 nokwasów w syntezie peptydów w fazie stałej (SPPS) różnią się znacznie (Ragnarsson i inni, 1971, Acta Chem., Scand. 25: 1487 - 1489; Ragnarsson i inni, 1974. J. Org. Chem. 39: 3837 - 3842). Tak np. szybkość sprzęgania Fmocglicyny z rosnącym peptydem jest o wiele większa niż szybkość Fmoc-waliny, prawdopodobnie na skutek zawady przestrzennej, którą stanowi duży boczny łańcuch waliny. Gdyby wymieszało się wszystkie 20 aktywowanych eukariotycznych L-aminokwasów z żywicą w każdym cyklu sprzęgania, najszybciej reagujące aminokwasy byłyby wybiórczo wprowadzane do peptydu i nie uzyskanoby równomolowych stosunków dla wszystkich rodzajów peptydów. Ponadto każdy z możliwych nukleofili będzie wykazywać różne reaktywności.

Na dodatek żadna ze znanych metod syntezy nie umożliwia wytwarzania biblioteki ponad 105 peptydów, w której każdy rodzaj peptydu przyłączony jest do jednego stałofazowego nośnika. Występowanie jednego tylko rodzaju peptydu na nośniku znacznie usprawniałoby obecne techniki wydzielania peptydów.

W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na bibliotekę rzeczywiście statystycznych sekwencji peptydów oraz sekwencji oligonukletydów, to znaczy sekwencji biooligomerów, w której pojedynczy rodzaj biooligomeru można będzie łatwo i szybko oddzielić od reszty biblioteki. Istnieje również zapotrzebowanie na sposób szybkiego i niezbyt drogiego syntetyzowania tysięcy lub milionów takich rzeczywiście statystycznych sekwencji biooligomerów.

Sposób wytwarzania statystycznej biblioteki biooligomerów na drodze syntezy chemicznej, w której oligomery syntetyzuje się przez sukcesywne sprzęganie różnych rodzajów merów z oligomerami związanymi ze stałym nośnikiem, według wynalazku polega na tym, że (a) dostarcza się co najmniej tyle próbek stałofazowego nośnika, ile różnych merów biooligomerów ma być dodanych, lecz co najmniej dwie, (b) oddzielnie do próbek stałofazowego nośnika wprowadza się zestaw merów, tak że do każdej próbki wprowadzany jest jeden mer, (c) sprzęga się całkowicie mery z zasadniczo wszystkimi centrami stałofazowego nośnika, (d) stwierdza się kompletność sprzęgania wytworzonej kombinacji stałofazowy nośnik/nowy mer oraz, w razie potrzeby, wymusza się kompletność reakcji, (e) dokładnie miesza się próbki kombinacji stałofazowy nośnik/nowy mer, i powtarza się powyższe etapy (a) - (e) wymaganą ilość razy, po czym usuwa się grupy blokujące, pozostawiając każdy biooligomer przyłączony do stałofazowego nośnika.

Biblioteka oligomerów, wytworzona sposobem według wynalazku pozwala na ustalenie sekwencji ligandu biooligomeru dla cząsteczki akceptorowej, obejmującego etapy generowania statystycznej biblioteki biooligomerów przyłączonych do stałofazowych nośników, przy czym każdy stałofazowy nośnik jest połączony z pojedynczym rodzajem biooligomeru, a wszystkie możliwe kombinacje merów, z których złożone są biooligomery, występują w kolekcji; wprowadzenia do statystycznej biblioteki cząsteczki akceptorowej lub cząsteczki-substratu, będącej przedmiotem zainteresowania, tak że wymieniona cząsteczka akceptorowa będzie rozpoznawać i wiązać jeden lub więcej rodzajów kombinacji stałofazowy nośnik/biooligomer w bibliotece, albo też wymieniona cząsteczka - substrat będzie ulegać reakcji chemicznej katalizowanej przez jeden lub więcej rodzajów kombinacji stałofazowy nośnik/biooligomer w bibliotece; wydzielenia kombinacji stałofazowy nośnik/biooligomer wykazującej pożądane właściwości; oraz sekwencjonowania biooligomeru w wydzielonej kombinacji stałofazowy nośnik/biooligomer.

W innym wariancie tego sposobu część biooligomeru uwalnia się in situ z kombinacji stałofazowy nośnik/biooligomer i aktywność biologiczną składnika będącego przedmiotem zainteresowania wykrywa się in situ. W jednym z rozwiązań biooligomer stanowi peptyd. W innym rozwiązaniu biooligomer stanowi oligonukleotyd, a zwłaszcza DNA lub RNA. W jeszcze innym wariancie biooligomer stanowi chimeryczny peptyd/oligonukleotyd.

Wynalazek bliżej wyjaśniono na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia schemat syntezy statystycznego peptydu z wykorzystaniem metody syntezy z odszczepianiem dla statystycznego trójpeptydu z dodanym na końcu tryptofanem: X-X-X-W (gdzie X = S, A lub V; istnieje 3³ czyli 27 możliwości), fig. 2 przedstawia schematyczne przedstawienie cyklicznych peptydów, n = 0, 1, 2, 3,..., a m = 1,2, 3,...; n oraz m mogą, lecz nie muszą być takie same. Linie stałe oznaczają wiązania liniowego peptydu; linie przerywane oznaczają usieciowania. Pary specyficznie sieciujących merów oznaczano jako A i B. A sieciuje tylko z A, a B sieciuje tylko z B. (a) Motyw „koszykowy; (b)

168 354 motyw „drabinkowy (c) motyw „lassowy, fig. 3 przedstawia chromatogramy (Cis HPLC (wysokosprawna chromatografia cieczowa z odwróceniem faz, Vydac) statystycznych tetrapeptydów (X-X-X-W, gdzie X = S, A lub V) zsyntetyzowanych (A) nowym sposobem (patrz tekst) oraz (B) w wyniku standarowej syntezy peptydów w fazie stałej. Chromatogram uzyskano eluując kolumnę acetonitrylem z liniowym gradientem. Rozpuszczalnik A: 0,1% kwasu trifluorooctowego i 5% acetonitrylu: rozpuszczalnik B: 0,1% kwasu trifluorooctowego i 10% acetonitrylu, fig. 4 przedstawia fotografię peptydu „długi v-mos“/ziarna, znaczonego przeciwciałem przeciw-v-mos i przewciałem drugorzędowym, fig. 5 przedstawia fotografię mieszaniny ziaren „długi v-mos“ i ziaren „krótki v-mos“, znaczonych przeciwciałem przeciw-v-mos i przeciwciałem drugorzędowym, fig. 6 przedstawia fotografię mieszaniny ziaren „długi v-mos“ i ziaren „krótki v-mos“, znaczonych przeciwciałem przeciw-v-mos i przeciwciałem drugorzędowym, fig. 7 przedstawia mikrofotografię screeningu typowej biblioteki ligandu peptydowego, na której dodatnie (ciemno błękitne) ziarno można łatwo zidentyfikować w tle wielu tysięcy negatywnych (bezbarwnych) ziaren, fig. 8 przedstawia mikrofotografię przedstawiającą uzależnione od stężenia inhibitujące działanie biotyny na barwienie ziaren mimotopu LHPQF-żywica przez streptawidynę-fosfatazę alkaliczną. A: 100 nM; B: 10 nM; C: 1 nM; D: 0,1 nM biotyny. Ziarna stanowiące ślepą próbę (β-Ala-kwas minokapronowy-żywica) wymieszano w stosunku 1:1 z LHPQF-żywicą przed inkubowaniem streptawidyną-fosfatazą alkaliczną, tak aby służyły jako negatywny wzorzec wewnętrzny.

W użytym znaczeniu określenie „biblioteka oznacza kolekcję zasadniczo statystycznych biooligomerów. W użytym znaczeniu określenie „biooligomer dotyczy polimeru z mniej niż około 100 merów. Biooligomer może stanowić peptyd, zawierający mery aminokwasów, oligonukleotyd zawierający mery nukleotydów lub chimera peptydowo-oligonukleotydowa.

Sposoby generowania biblioteki statystycznych biooligomerów.

Jak to zaznaczono powyżej wynalazek niniejszy dotyczy sposobu generowania biblioteki biooligomerów na drodze syntezy biooligomerów o statystycznych sekwencjach merów. W użytym znaczeniu określenie „statystyczne sekwencje merów dotyczy sekwencji, w których dowolny mer może występować przed lub za innym merem.

W jednym wykonaniu mer może stanowić aminokwas, analog aminokwasu lub peptydomimetyk. W użytym znaczeniu „peptydomimetyk oznacza cząsteczkę, która strukturalnie i chemicznie przypomina peptyd dwóch lub więcej aminokwasów. W innym wykonaniu mer może stanowić nukleozyd; nukleozyd może stanowić kwas rybonukleinowy, albo też może to być kwas dezoksyrybonukleinowy. W jeszcze innym wykonaniu mery mogą stanowić aminokwasy i nukleozydy. Biooligomer może stanowić peptyd (zawierający aminokwasy), oligonbukleotyd RNA (zawierający rybonukleozydy), oligonukleotyd DNA (zawierający dezoksyrybonukleozydy), chimeryczny oligonukleotyd DNA-RNA lub chimera peptyd-oligonukleotyd. Bibliotekę zawierającą peptydy, oligonukleotydy lub chimery peptyd-oligonukleotyd generować można sposobem obejmującym powtarzanie następujących etapów:

(i) dostarczanie co najmniej dwóch próbek stałofazowego nośnika dla statystycznych sekwencji merów;

(ii) oddzielne wprowadzenie zestawu merów do próbek stałofazowego nośnika;

(iii) kompletne sprzęganie merów z zasadniczo wszystkimi centrami stałofazowego nośnika z wytworzeniem kombinacji stałofazowy nośnik/nowy mer;

(iv) stwierdzenie kompletności sprzęgania oraz, w razie potrzeby, wymuszenia kompletności reakcji;

(v) dokładne wymieszanie próbek kombinacji stałofazowy nośnik/nowy mer; oraz, po powtórzeniu powyższych etapów (i) - (v) wymaganą ilość razy, ostateczny etap (vi) usunięcia grup blokujących tak że biooligomer pozostaje przyłączony do stałofazowego nośnika. W kolejnym wykonaniu wytworzyć można tak bibliotekę statystycznych biooligomerów, że co najmniej w jednym etapie ten sam mer sprzęga się w przypadku wszystkich stałofazowych nośników oraz w co najmniej jednym innym etapie co najmniej dwa mery sprzęga się ze stałofazowym nośnikiem. Bibliotekę statystycznych biooligomerów generować można powtarzając raz powyższe etapy (i)-(v); w innym wykonaniu bibliotekę statystycznych biooligomerów generować można wykonując

168 354 7 więcej niż jedną powtórkę powyższych etapów (i)-(v). Zastosować można stałofazowy nośnik, z którym sprzęgnięto już jeden lub więcej merów.

Biblioteka biooligomerów może być złożona z ustalonej, ograniczonej liczby merów. W innym wykonaniu biblioteka statystycznych biooligomerów może zawierać wszystkie dostępne mery.

W kolejnym wykonaniu biooligomer będący przedmiotem zainteresowania zidentyfikować można w sekwencyjnym procesie wytwarzając najpierw bibliotekę, a następnie identyfikując sekwencję biooligomeru wykazującą interesujące właściwości. Wytwarza się w ten sposób stałofazowy nośnik zawierający zidentyfikowaną sekwencję biooligomeru. Do uprzednio zidentyfikowanej sekwencji dodaje się nowy segment sekwencji merów i identyfikuje się tą nową sekwencję zawierającą znaną sekwencję oraz statystyczną sekwencję, która wykazuje interesujące właściwości. Taka sekwencyjna strategia optymalizacji-randomizacji umożliwia szybką identfikację biooligomeru będącego przedmiotem zainteresowania.

Biooligomery z biblioteki wytworzonej sposobem według wynalazku mogą, lecz nie muszą występować w bibliotece w zasadniczo równomolowych ilościach. Jak to jest zrozumiałe dla specjalisty, jednostka molowa oznacza takie stężenie, gdy jedną jednostkę ciężaru cząsteczkowego wyrażonego w gramach (1 ml) substancji rozpuszcza się w takiej ilości rozpuszczalnika, aby uzyskać 1 litr roztworu. W użytym znaczeniu „zasadniczo równomolowe ilości“ biooligomerów dotyczą rodzajów merów, których stężenia są w przybliżeniu takie same. Oznacza to, że jeśli w zbiorze 150 000 biooligomerów stężenie biooligomeru A wynosi 200 pmoli/litr, to stężenie każdego z pozostałych 150000 rodzajów biooligomerów będzie wynosić również około 200 pmoli/litr. Jednakże w użytym znaczeniu uważa się, zasadniczo równomolowa ilość uwzględnia heterogeniczność wielkości stałofazowego nośnika. Na skutek heterogeniczności stałofazowego nośnika występują wahania w ilości biooligomeru, który może być przyłączony do danego nośnika.

Zgodnie ze sposobem według wynalazku stosuje się co najmniej dwie próbki stałofazowego nośnika, przy czym liczba stałofazowych nośników w próbkach korzystnie odpowiada co najmniej liczbie biooligomerów, które mają być zsyntetyzowane. Umożliwia to utworzenie biblioteki, w której każdy stałofazowy nośnik zawiera pojedynczy rodzaj biooligomeru, czyli jedno ziarno na jeden biooligomer. W użytym znaczeniu „próbka“ dotyczy części, która stanowi określony ułamek całej ilości stałofazowych nośników.

Biblioteki statystycznych peptydów.

Biblioteka statystycznych biooligomerów wytworzona sposobem według wynalazku może zawierać peptydy. Określenie „peptyd“ używane jest w najszerszym znaczeniu i dotyczy związku dwóch lub więcej merów aminokwasów, analogów aminokwasów lub peptydomimetyków. Mery mogą być połączone wiązaniami peptydowymi. W innym wariancie mer może być połączony innymi wiązaniami, np. estrowymi, eterowymi itp. W użytym znaczeniu określenie „aminokwas“ dotyczy naturalnych i/lub nienaturalnych albo syntetycznych aminokwasów, w tym glicyny oraz izomerów optycznych D lub L, a także analogów aminokwasów oraz peptydomimetyków. Peptyd z trzech lub więcej aminokwasów jest powszechnie określany jako oligopeptyd, jeśli łańcuch peptydu jest krótki. Jeśli łańcuch peptydu jest długi, peptyd jest powszechnie określany jako polipeptyd lub białko.

Sposób według wynalazku oparty jest na chemii syntetycznych peptydów i nie dotyczy zastosowania jakiegokolwiek układu żyjącego do amplifikacji lub selekcjonowania. Biblioteki peptydów mogą zawierać nienautralne aminokwasy. I tak peptydy w blibliotece wytworzonej sposobem według wynalazku mogą zawierać D-aminokwasy, kombinacje D- i L-aminokwasów oraz różne „zaprojektowane¹¹ aminokwasy (np. β-metylo-aminokwasy, C-a-metylo-aminokwasy, N-a-metylo-aminokwasy itp.) w celu nadania specjalnych właściwości peptydom w bibliotece. Ponadto stosując określone aminokwasy w określonych etapach sprzęgania generować można biblioteki peptydów z a-heliksami, β-skrętami, β-paskami (β-sheets), γ-skrętami oraz peptydy cykliczne.

Biblioteka peptydów wytwarzana sposobem według wynalazku zawiera wszystkie możliwe kombinacje aminokwasów, z których składają się peptydy. Używając jako przykładu dipeptydu wytworzonego z dwóch aminokwasów, glicyny i proliny, istnieją cztery możliwe kombinacje: glicyna-glicyna, glicyna-prolina, prolina-glicyna i prolina-prolina, a statystyczna biblioteka będzie zawierać wszystkie cztery kombinacje.

168 354

Zestaw pierwszych aminokwasów oddzielnie wprowadza się do każdej z próbek. Zasadniczo aminokwasami stosowanymi w syntezie peptydów są wrażliwe na zasady N O -amino blokowane 9-fluorenylometoksykarbonylem (Fmoc) aminokwasy opisane po raz pierwszy przez Caprino i Hana (1972, J. Org. Chem. 37: 3403 - 3409). Zgodnie ze sposobem według wynalazku stosować można również Boc-aminokwasy (NO*-amino blokowane N O -tertbutoksykarbonylem). Zarówno Fmoc jak i Boc NX -amino-blokowane aminokwasy otrzymać można z Fluka, Bachem, Advanced Chemtech, Sigma, Cambridge Research Biochemical, Bachem z Peninsula Labs, albo od innych producentów chemicznych, znanych specjalistom. Dodatkowo zgodnie ze sposobem według wynalazku stosować można inne grupy N« blokujące, znane specjalistom.

Kontynuując przykład dipeptydu opisany powyżej pierwszy zestaw wprowadzonych aminokwasów powinien obejmować glicynę i prolinę; do każdej próbki dodaje się N«-Fmoc-glicynę lub NO -Fmoc-prolinę.

Po dodaniu zestaw pierwszych aminokwasów kompletnie sprzęga się z zasadniczo wszystkimi centrami stałofazowych nośników. W użytym znaczeniu kompletne sprzęganie oznacza, że reakcję sprzęgania doprowadza się do końca bez względu na różnice w szybkościach sprzęgania poszczególnych aminokwasów. Na dodatek aminokwasy sprzęga się z zasadniczo wszystkimi dostępnymi centrami sprzęgania na stałofazowym nośniku, tak że stałofazowy nośnik będzie zawierać zasadniczo tylko jeden rodzaj peptydu. W wyniku kompletnego sprzęgania uzyskuje się kombinacje stałofazowy nośnik/pierwszy aminokwas. Używając jako przykładu opisanego powyżej dipeptydu, w wyniku kompletnego sprzęgania uzyska się kompozycję ziarno-glicyna i kombinację ziarno-prolina.

Sprzęganie aminokwasów przeprowadzić można technikami znanymi specjalistom, opisanymi np. w pracy Stewarda i Younga, 1984, Solid Phase Synthesis, Second Edition, Pierce Chemical Co., Rockford, IL. Jak to jest wiadome specjalistom, sposób syntezy peptydów obejmuje konstruowanie peptydu od końca karboksylowego lub C, zgodnie z którym C-końcowy aminokwas z zablokowaną grupą α-aminową przyłącza się do stałego polimeru. Grupę blokującą odszczepia się następnie i następny aminokwas, również zablokowany, sprzęga się poprzez wiązanie peptydowe z grupą α-aminową aminokwasu przyłączonego do stałofazowego nośnika. Cykl odblokowania poprzedniego aminokwasu i sprzęgania dodatkowego aminokwasu powtarza się aż do zakończenia peptydu. Jakiekolwiek reaktywne boczne łańcuchy w aminokwasach blokuje się grupami chemicznymi, które wytrzymują procedurę sprzęgania i N«-odblokowania, ale mogą być usunięte pod koniec syntezy.

W celu sprzęgania aminokwasu z rosnącym syntetycznym łańcuchem grupa karboksylowa zablokowanego aminokwasu musi być uaktywniona. W realizacji sposoby według wynalazku stosować można wiele sposobów aktywacji obejmujących np. wstępne wytwarzanie symetrycznych bezwodników (PSA), wstępne wytwarzanie mieszanych bezwodników (PMA), chlorki kwasowe, aktywne estry, a także aktywowanie kwasu karboksylowego in situ, jak to opisali Fields i Noble, 1990, „Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino acids“, Int. J. Pept. Protein Res. 33:161-214.

Zastosowanie Fmoc aminokwasów stanowi podstawową strategię w syntezie peptydów. Strategię z Boc (tert-butoksykarbonylo-zablokowaną grupą aminową) można również wykorzystać do wytwarzania biblioteki peptydów związanych ze stałofazowym nośnikiem (np. Geysen i inni, 1987, J. Immunol. Methods 102: 259-274).

i Należy ocenić kompletność sprzęgania. Specjaliści powinni znać powszchnie wykorzystywane ilościowe wizualne próby takie jak próba ninhydrynowa (próba cesarska), próba z kwasem pikrynowym, kwasem 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowym (TNBS), fluoreskaminą i chloranilem, oparte na reakcji reagentu z wolnymi grupami aminowymi z wytworzeniem związku chromoforowego. Przy stosowaniu iminokwasów (np. Pro lub Hyp), korzystną metodę stanowi monitorowanie izatynowe, patrz Fileds i Noble, powyżej. Kompletność reakcji można śledzić ilościowo w czasie przebiegu reakcji, jak to np. opisał Salisbury i inni (międzynarodowa publikacja patentowa nr WO91/03485).

W przypadku syntezy Fmoc korzystnie stosuje się próbę cesarską. W próbie cesarskiej próbkę z każdej probówki można badać za pomocą odczynnika ninhydrynowego dostępnego z Pierce Chemical, sposobem opisanym przez Sarina i innych (1981, Anal. Biochem. 117:147-157).

168 354

Jeśli reakcja sprzęgania jest niekompletna, na co wskazuje test, kompletność reakcji można wymusić różnymi sposobami znanymi specjalistom, obejmującymi (a) drugie sprzęganie z wykorzystaniem 1-5-krotnego nadmiaru zablokowanego aminokwasu, (b) dodatkowe sprzęganie z wykorzystaniem różnych lub dodatkowych rozpuszczalników (np. trifluoroetanu) lub (c) dodatek soli chaotropowych, np. NaCJCh lub LiBr (Klis i Steward, 1990, Peptides: Chemistry, Structure and Bioligy“, Rivier and Marshall, Eds., ESCOM Publ., str. 904-906).

Po doprowadzeniu do końca reakcji sprzęgania próbki kombinacji stałofazowy nośnik/pierwszy aminokwas dokładnie miesza się. Dokładne wymieszanie uzyskuje się, gdy powstanie jednorodna mieszanina próbek, korzystnie w wyniku wymieszania próbek w jednym reaktorze. Jakkolwiek dowolny sposób dokładnego mieszania objęty jest zakresem niniejszego wynalazku, a specjalistom znane są różne sposoby, to korzystny sposób obejmuje np. miksowanie lub wytrząsanie w dowolnym dostępnym w handlu mechanicznym urządzeniu do wytrząsania, albo też barbotowanie gazu obojętnego, np. azotu lub argonu.

Uzyskaną mieszaninę dzieli się na co najmniej dwie części, próbki. Objętość tych próbek jest taka sama, a jeśli mieszanie zostało przeprowadzone wystarczająco dokładne, to próbki powinny zawierać zasadniczo takie same ilości kombinacji stałofazowy nośnik/pierwszy aminokwas. Używając dipeptydu jako przykładu, każda z próbek będzie zawierać zasadniczo takie same ilości kombinacji ziarno-glicyna i kombinacji ziarno-prolina.

Do każdej próbki wprowadza się oddzielnie drugi zestaw aminokwasów. Ten drugi zestaw może zawierać (a) te same aminokwasy, które dodano w pierwszym zestawie, np. glicynę lub prolinę; (b) inny zestaw aminokwasów, np. tryptofan lub leucynę; (c) tylko jeden rodzaj aminokwasu, np. izoleucynę.

Podobnie jak w przypadku pierwszego zestawu aminokwasów drugi zestaw aminokwasów indywidualnie sprzęga się kompletnie z kombinacją stałofazowy nośnik/pierwszy aminokwas w każdej próbce, uzyskując peptydy zawierające pierwszy aminokwas i drugi aminokwas. Podobnie jak przy pierwszym sprzęganiu, sprzęganie przeprowadzić można dowolną techniką wykorzystywaną w takich reakcjach. Używając przykładowego dipeptydu opisanego powyżej: (a) przy dodawaniu takiego samego zestawu aminokwasów uzyskany peptyd stanowi glicyna-glicyna, glicynaprolina, prolina-glicyna lub prolina-prolina; (b) w przypadku innego zestawu aminokwasów uzyskany peptyd stanowi Gly-Trp, Gly-Leu, Pro-Trp lub Pro-Leu; (c) w przypadku jednego rodzaju aminokwasu uzyskany peptyd stanowi Gly-Ile lun Pro-Ile.

Sposób ten powtarzać można tyle razy, ile jest aminokwasów do dodania. Jeśli interesującym peptydem jest tetrapeptyd X-X-X-Trp, gdzie X oznacza np. walinę, serynę lub alaninę, sposób można powtórzyć 3 razy w celu uzyskania tetrapeptydu X-X-X-Trp. W pierwszym, drugim i trzecim wbudowywaniu aminokwasów dodaje się do próbek stałofazowego nośnika N tC-Fmocwalinę, Nt -Fmoc-serynę(O-Bu') lub N^-Fmoc-alaninę, uzyskując 27 różnych peptydów w zasadniczo równomolowych ilościach (fig. 1). Jeśli pożądany jest heksapeptyd, proces powtarza się 6 razy. Jeśli heksapeptyd ma zawierać 5 różnych aminowkasów, zgodnie ze sposobem powinno się użyć 5 próbek, z których każda zawiera inny aminokwas, w każdym etapie sprzęgania. Jeśli natomiast heksapeptyd ma zawierać dowolne z podstawowego zestawu 20 aminokwasów, sposób powinien obejmować stosowanie 20 próbek w każdym etapie.

Zgodnie ze sposobem syntezy peptydów według wynalazku wykorzystać moża stałofazowe nośniki, do których aminowkas jest, lub jeszcze nie został przyłączony. Dodatkowo wykorzystać można łącznik, który już został przyłączony do stałofazowego nośnika. Jednym z powszechnie stosowanych nośników zawierających już związany aminokwas jest żywica β-alanino-PAM (dostępna z Bachem Biochemical). Żywice takie są dostępne z wielu źródeł lub mogą być wytworzone w laboratorium przez specjalistów w dziedzinie syntezy peptydów.

Jeśli jako wyjściowy reagent stosuje się kombinację stałofazowy nośnik/aminokwas lub łącznik stała faza/nośnik, dzieli się go na co najmniej dwie próbki, do każdej z których dodaje się aminokwas z pierwszego zestawu aminokwasów. Jak to opisano powyżej, pierwszy zestaw aminokwasów całkowicie sprzęga się z zasadniczo wszystkimi centrami wiązania na kombinacji stałofazowy nośnik/aminokwas lub na łączniku stała faza/nośnik, po czym próbki zawierające te nowo dodane aminokwasy dokładnie miesza się ze sobą. Jak to opisano powyżej na co najmniej

168 354 dwie próbki, po czym do każdej z próbek dodaje się aminokwas z drugiego zestawu aminokwasów i reakcję sprzęgania powtarza się z wytworzeniem rosnącego peptydu. Jak to opisano powyżej, proces ten można powtarzać tyle razy, ile potrzeba do wytworzenia peptydu będącego przedmiotem zainteresowań.

Metodę tą wykorzystać można do syntezy peptydów statystycznych a także do syntezy biblioteki peptydów zawierającej wstępnie ustalone sekwencje. Synteza ustalonych sekwencji obejmuje stosowanie określonych Nα -Boc-, N α-Fmoc lub w inny sposób odpowiednio zablokowanych aminokwasów w konkretnych etapach sprzęgania. Tak np. można dobrać aminokwasy w konkretnych etapach sprzęgania, aby uzyskane peptydy wykazywały prawdopodobieństwo lub preferencję konkretnej struktury drugorzędowej, np. β-paska, α-heliksu, β-skręt itp. I tak α-heliks będzie preferowana jeśli jako kotrzystne aminokwasy zastosuje się Glu, Ala, Leu, His i Trp; z drugiej strony β -paski będą preferowane jeśli zastosuje się Val, Ile, Tyr i Met. Alternatywnie, jeśli zastosuje się Gly, Asn, Pro i Asp, preferowana będzie struktura β-skrętu. Rozważyć można inne ewentualności, takie jak kwaśne aminokwasy w sąsiedztwie końca N i zasadowe aminokwasy w sąsiedztwie końca C, które stabilizują α-spiralę. D-aminokwasy mogą stabilizować pewne skręty, a ponadto wprowadzać można różne inne strukturalne motywy. Można wytwarzać nawet biblioteki peptydów cyklicznych z disiarczkowymi, laktamowymi, laktonowymi lub innymi grupami zamykającymi pierścień.

Należy podkreślić, że sposób według wynalazku umożliwia syntezę peptydów tak, że stałofazowy nośnik taki jak ziarno żywicy będzie zawierać jedynie rodzaj peptydu. Sposób zapewnia, że każde ziarno żywicy kontaktuje się jedynie z jednym aminokwasem podczas każdego cyklu sprzęgania oraz, że sprzęganie doprowadza się do końca. Synteza typu jedno ziarno - jeden peptyd zapewnia zwiększoną selektywność i wydajność wydzielania peptydu specyficznego dla indywiduum, z którym wiąże się.

Sposób można łatwo zaadaptować tak, aby umożliwić syntezę statystycznego zbioru peptydów zawierającego 105 - 107 różnych rodzajów peptydów.

W jednym z wariantów według wynalazku peptydy z biblioteki mogą zawierać specjalny aminokwas na końcu C, zawierający boczny łańcuch CO 2H lub CONH2, co imituje grupę glicynową lub glicyno-amidową. Inny wariant takiego specjalnego podstawnika może stanowić analog D- lub L-aminokwasu z bocznym łańcuchem zawierającym łącznik lub wiązanie z ziarnem. W jednym z wariantów pseudoswobodny C-końcowy podstawnik może wykazywać konfigurację optyczną D lub L; w innym wariancie stosować można racemiczną mieszaninę izomerów D i L.

W dodatkowym wariancie piroglutaminian można zastosować jako N-końcową resztę peptydów z biblioteki. Jakkolwiek piroglutaminian nie jest podatny na sekwencjonowanie na drodze degradacji Edmana, to ograniczając podstawienie N-końcowym piroglutaminianem jedynie do 50% peptydów na danym ziarnie pozostanie do sekwencjonowania wystarczająca ilość peptydu nie-piroglutaminianowego. Specjalista będzie mógł łatwo stwierdzić, że technika taka może być stosowana do sekwencjonowania dowolnego peptydu, który zawiera podstawnik odporny na degradację Edmana na końcu N. Inne sposoby charakteryzowania poszczególnych peptydów wykazujących pożądaną aktywność są opisane poniżej. Aktywność właściwą peptydu zawierającego zablokowaną grupę N-końcową, np. piroglutaminian, gdy konkretna grupa N-końcowa występuje w 50% peptydów, można łatwo zademonstrować porównując aktywności całkowicie (w 100%) blokowanego peptydu i nieblokowanego w (0%) peptydu.

W kolejnym wariancie wybiera się mery peptydów nadające użyteczne właściwości chemiczne i strukturalne. Tak np. peptydy zawierające D-aminokwasy będą odporne na proteazy specyficzne dla L-aminokwasów in vivo. Dodatkowo wynalazek niniejszy obejmuje wytwarzanie bibliotek peptydów o lepiej zdefiniowanych właściwościach strukturalnych oraz zastosowanie peptydomimetyków i wiązań peptydomimetycznych takich jak wiązania estrowe, do wytwarzania bibliotek o nowych właściwościach. W innym wariancie generować można biblioteki peptydów, które zawierają zredukowane wiązanie peptydowe, to znaczy R1-CH2-NH-R2, gdzie R1 i R2 oznaczają reszty lub sekwencje aminokwasów. Zredukowane wiązanie peptydowe można wprowadzić jako mer dipeptydowy. Taka cząsteczka byłaby odporna na hydrolizę wiązania peptydowego, np. przez aktywną proteazę. Takie biblioteki zapewniałyby ligandy o unikatowym działaniu i aktywności, np. wydłużony okres półtrwania in vivo z powodu odporności na rozkład metaboliczny lub działanie proteazy.

168 354

Wiadomo również, że w pewnych układach peptydy o nieswobodnej konformacji wykazują zwiększoną aktywność funkcyjną (Hruby, 1982, Life Sciences 31: 189-199; Hruby i inni, 1990, Biochem. J. 268:249-262); wynalazek niniejszy dostarcza sposobu wytwarzania peptydów o nieswobodnej konformacji, zawierających statystyczne sekwencje we wszystkich innych pozycjach.

Peptydy o nieswobodnej konformacji i peptydy cykliczne.

Peptyd o nieswobodnej konformacji, cykliczny lub usztywniony peptyd wytworzyć można sposobem opisanym powyżej, pod warunkiem, że co najmniej w dwóch pozycjach w sekwencjach wszystkich peptydów z biblioteki wstawi się aminokwas lub analog aminokwasu zawierający grupę funkcyjną zdolną do sieciowania, tak aby spowodować nieswobodną konformację, cyklizację lub usztywnienie peptydu po obróbce w celu wytworzenia usieciowania. Cyklizacja będzie przeważała, gdy wprowadzi się aminokwas indukujący skręt. Do przykładowych aminokwasów zdolnych do sieciowania peptydu należy cysteina tworząca disiarczki, kwas asparaginowy tworzący lakton lub laktam oraz chelator taki jak kwas /'-karboksyglutaminowy (Gla) (Bachem) chelatujący metale przejściowe z wytworzeniem usieciowania. Zablokowany kwas γ-karboksyglutaminowy wytworzyć można modyfikując syntezę opisaną przez Zee-Chenga i Olsona (1980, Biophys. Biochem. Res. Commun. 94: 1128 - 1132). Biblioteka peptydów, w której sekwencje peptydowe zawierają co najmniej dwa aminokwasy zdolne do sieciowania, poddać można obróbce, np. poprzez utlenianie reszt cysteiny z wytworzeniem disiarczku lub dodaniu jonu metalu w celu wytworzenia chelatu, tak aby usieciować peptyd i wytworzyć peptyd o nieswobodnej konformacji, cykliczny lub usztywniony.

Sposób według wynalazku dostarcza zestawu ogólnych sztywnych motywów do stosowania przy wytwarzaniu bibliotek według niniejszego wynalazku. W jednym wariancie przedstawionym na fig. 2a, wprowadza się dwie pary reszt sieciujących w celu wytworzenia „koszyka. Taki motyw „koszykowy może znaleźć konkretne zastosowanie jako kieszeń katalityczna, oprócz nowych właściwości wiążących wynikających z jego nieswobodnej konformacji. W innym wariancie przy dwóch parach reszt sieciujących zaprojektować można motyw „drabinkowy, przedstawiony na fig. 2b. Stosując na przemian D- i L-aminokwasy w motywie „drabinkowym wytworzyć można peptyd, w którym wszystkie łańcuchy boczne będą zorientowane na jednej powierzchni, analogicznie do struktury β-baryłki występującej w gramicydynie. Taka powierzchnia może potencjalnie stanowić unikatowe centrum katalityczne. W jeszcze innym wariancie wytworzyć można prosty motyw „lassa, zgodnie z którym dwie reszty tworzą usieciowanie, jak to przedstawiono na fig. 2c. Oprócz tworzenia pętli peptydowej krótszy motyw „lassa będzie powodować powstanie konformacyjnej nieswobodności liniowego peptydu, co stabilizuje strukturę drugorzędową, np. α-heliks.

Oczywiste jest również, że tworzyć można usieciowania międzypeptydowe, uzyksując w ten sposób sztywną matrycę peptydową.

Opisany sposób dostarcza strategii systematycznego wytwarzania usieciowań. Tak np. jeśli 4 reszty cysteiny wprowadza się do sekwencji peptydu, zastosować można różne grupy blokujące (Hiskey, 1981, w The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 3, Gross i Meienhofer, Eds., Academic Press: New York, str, 137 - 167; Ponsanti i inni 1990, Tetrahedron 46: 8255 - 8266). Pierwszą parę cystein można odblokować i utlenić, po czym drugą parę cystein można odblokować i utlenić. W ten sposób uzyskać można określony zestaw usieciowań disiarczkowych. Alterantywnie wbudować można parę cystein i parę chelatujących analogów aminokwasów, tak że uzyska się usieciowania o różnej naturze chemicznej.

Nieklasyczne aminokwasy indukujące nieswobodną konformację.

Następujące nieklasyczne aminokwasy wbudować można do biblioteki statystycznych peptydów w celu zaindukowania określonych motywów konformacyjnych: 1,2,3,4-tetrahydroizochinolino-3-karboksylan (Kazmierski i inni, 1991, J. Am. Chem. Soc 113: 2275-2283); (2S,3S)metylofenyloalanina, (2S,3R)-metylofenyloalanina, (2R,3S)^:m^1;y^<^]^<^i^;y^o^l^nina oraz (2R,3R)metylofenyloalanina (Kazmierski i Hruby, 1991, Tetrahedron Lett.); kwas 2-aminotetrahydronaftaleno-2-karboksylowy (Landis, 1989, Ph. D. Thesis, University of Arizona); hydroksy-1,2,3,4tetrahydroizochinolino-3-karboksylan (Miyake i inni, 1989, J. Takeda Res. Labs. 43: 53-76); β-karbolina (D i L) (Kazmierski, 1988, Ph. D. Thesis, University of Arizona); HIC (kwas histydyno-izochinolinokarboksylowy) (Zechel i inni, 1991, Int. J. Pep. Protein Res. 43); oraz HIC (histydynomicznik cykliczny) (Dharanipragada).

168 354

Następujące analogi aminokwasów oraz peptydomimetyki można wprowadzić do wybranej biblioteki w celu zaindukowania lub faworyzowania określonych struktur drugorzędowych; LLAcp (kwas LL-3-amino-2-propenidono-6-karboksylowy), analog dipeptydu indukujący β-skręt (Kemp i inni, 1985, J. Org. Chem. 50. 5834-5838) analogi indukujące β-pasek (Kemp i inni, 1988, Tetrahedron Lett. 29: 5081-5082); analogi indukujące β-skręt (Kemp i inni, 1988, Tetrahedron Lett. 29: 5057-5060); analogi indukujące α-heliks (Kemp i inni, 1988, Tetrahedron Lett. 29: 4935-4938); analogi indukujące skręt γ (Kemp i inni, 1989, J. Org. Chem. 54: 109-115); oraz analogi opisane w następujących pozycjach literaturowych: Nagi i Sato, 1985, Tetrahedron Lett. 26:647-650; DiMaio i inni, 1989, J. Chem. Soc. Perkin Trans. str. 1687; a także analogi skrętu Gly-Ala (Kahn i inni, 1989, Tetrahedron Lett. 30: 2317); izoster wiązania amidowego (Jones i inni, 1988, Tetrahedron Lett. 29: 3853-3856); tetrazol (Zabrocki i inni, 1988, J. Am. Chem. Soc. 110: 5875-5800); DTC (Samanen i inni, 1990, Int. J. Protein Pep. Res. 35: 501-509); oraz analogi podane przez Olsena i innych, 1990, J. Am. Chem. Soc. 112: 323-333 i Garvey'a i innych, 1990, J. Org. Chem. 56:436.

Jakkolwiek powyższe nieklasyczne peptydy i peptydomimetyki nie poddają się analizie sekwencyjnej metodą klasycznej degradacji Edmana, kombinację wyjściowej degradacji Edmana, a następnie analizy aminokwasów w pozostałym łańcuchu wykorzystać można do określenia struktury peptydu o pożądanej aktywności. Alternatywnie wykorzystać można spektralną analizę masową.

Peptydy derywatyzowane i modyfikowane.

Wynalazek niniejszy dotyczy również modyfikacji lub derywatyzowacji peptydów w bibliotece. Modyfikacje są dobrze znane specjalistom i obejmują fosforylowanie, karboksymetylowanie oraz acylowanie. Modyfikacje przeprowadzić można metodami chemicznymi lub enzymatycznymi.

W kolejnym wariancie wytwarzać można glikozylowane lub tłuszczowo-acylowane pochodne peptydów. Wytwarzanie glikozylowanych lub tłuszczowo-acylowanych peptydów jest dobrze znane, czego przykład stanowią następujące pozycje literaturo we:

1. Berg i Jeanloz, 1985, w Advences in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Vol. 43, Academic Press.

2. Kunz, 1987, w Ang. Chem. Int. Ed. English 26:294-308.

3. Horvat i inni, 1988, Int. J. Pept. Protein res. 31: 499-507.

4. Bardaji i inni, 1990, Ang. Chem. Int. Ed. English 23:231.

5. Toth i inni, 1990, w Peptides: Chemistry, Structure and Biology, Rivier i Marshall, Eds., ESCOM Publ., Leiden, str. 1078-1079.

6. Torres i inni, 1989, Experientia 45: 574-576.

7. Torres i inni, 1989, EMBO J. 8: 2925-2932.

8. Hordever i Musiol, 1990, w Peptides: Chemistry, Structure and Biology, loc. cit., str. 811-812.

9. Zee-Cheng i Olson, 1989, Biochem. Biphys. Res. Commun. 94: 1128-1132.

10. Marki i inni, 1977, Helv. Chim. Acta., 60:807.

11. Fuju i inni, 1987, J. Chem. Soc. Chem. Commun., str. 163-164.

12. Ponsati i inni, 1990, Peptides 1990, Giralt i Andreau, Eds., ESCOM Publ., str. 238-240.

13. Fujiiinni, 1987,1988, Peptides: Chemistry, Structure and Biology, Rivier i Marshall, Eds., ESCOm Publ., Leiden, str. 217-219.

Znane są dwie podstawowe klasy wiązań peptydowo-węglowodanowych. Pierwsze wiązanie, eterowe łączy grupę hydroksylową seryny lub treoniny z grupą hydroksylową cukru. Drugie wiązanie, amidowe łączy karboksylanowe grupy glutaminianu lub asparaginianu z grupą aminową cukru. W szczególności pozycje 1 i 2 powyżej przedstawiają sposoby wytwarzania peptydowęglowodanowych eterów i amidów. Węglowodan z peptydem mogą również łączyć wiązania acetylowe i ketalowe.

Wytwarzać można także tłuszczowo-acylowe pochodne peptydów. Przykładowo, ale nie na zasadzie ograniczeń wolną grupę aminową (N-końcową lub lizylową) można acylować, np. mirystyloilować. W innym wariancie do peptydów w bibliotece wprowadzać można aminokwas zawierający boczny łańcuch alifatyczny o wzorze (CH2)nCH3. Takie i inne koniugaty peptydów z kwasami tłuszczowymi nadające się do wykorzystania zgodnie z niniejszym wynalazkiem, ujaw168 354 13 nione są w opisie patentowym brytyjskim GB 8809162.4, międzynarodowe zgłoszenie patentowe PCT/AU89/-00166, oraz w podanej wyżej pozycji literaturowej 5.

Biblioteki statystycznych oligonukleotydów.

Jako sposób syntezy wybranej biblioteki złożonej z kwasów nukleinowych zaadoptować można syntezę DNA w fazie stałej metodą fosforamidanową zaproponowaną po raz pierwszy przez Caruthersa(1985, Science 230:281; Caruthers i inni, 1987, Methods of Enzymology 154:287-313).

Zarówno oparty na krzemionce nierozpuszczalny nośnik polimeryczny jak i zablokowane dezoksynukleozydy są dostępne w handlu (np. Peninsula Laboratories, Inc. California, Applied Biosystems, Inc.). Do przykładowych zablokowanych dezoksynukleozydów należy 5'-0-dimetoksytrietylodezoksytymidyna, 5'-0-dimetoksytrietylo-N-benzoilodezoksycytozyna oraz 5'-0-dimetoksytrietylo-N-izobutylodezoksyguanozyna. Inne specyficzne grupy blokujące wykorzystywać można w zależności od zastosowania. Odpowiednie 3'-fosforoamidany dezoksynukleozydów syntetyzować można, a następnie sprzęgać ze stałofazowym nośnikiem metodą Cruthersa i innych, (patrz wyżej). Pierwszy dezoksynukleozyd powinien być związany np. jako dezoksyadenozyna. Po odtritylowaniu i przemyciu dichlorometanem, a następnie acetonitrylem stałofazowy nośnik dzieli się na 4 takie same próbki i przenosi do czterech różnych reaktorów. Do czterech oddzielnych reaktorów dodaje się następnie po jednym z czterech 3'-fosforoamidanów dezoksynukleozydów. Po zakończeniu sprzęgania stałofazowe nośniki z czterech reaktorów dokładnie miesza się ze sobą, dokładnie przemywa się i poddaje utlenianiu mieszaniną J2/H2O/lutydvna/THF. Po utlenianiu stałofazowy nośnik dokładnie przemywa się acetonitrylem i powyższy cykl powtarza się. Po zakończeniu syntezy statystycznych łańcuchów polidezoksynukleotydowych (np. po 11 etapach sprzęgania) grupy estrów metylowych rozszczepia się tiofenem, a grupy DMT rozszczepia się kwasem trichlorooctowym. Odblokowane łańcuchy polinukleotydowe zachować można w postaci kowalencyjnie połączonej ze stałofazowym nośnikiem (przy doborze odpowiednich łączników), gotowe do wykorzystania w wybranej metodologii selekcjonowania, jak to przedstawiono poniżej.

Wynalazek niniejszy dotyczy stosowania oligonukleotydów z wiązaniami innymi niż fosforodiestrowe. Tak np. oligonukleotyd może zawierać połączenie fosforotionianowe. Znane są inne modyfikowane wiązania fosfodiestrowe lub analogi wiązań. Wiadomo, że takie modyfikowane wiązania są odporne na działanie egzonukleaz i endonukleaz.

W związku z tym, że w każdym etapie sprzęgania stosuje się jedynie cztery nukleozydy DNA lub RNA, w bibliotece z 12 zasad nukleozydowych będzie 4¹2 możliwych sekwencji polinukleotydów, czyli łącznie 1,68 X 10⁷ możliwości. Oligonukleotyd można również syntetyzować stosując zarówno nukleozydy DNA jak i RNA. Specjaliści zrozumieją również, że oprócz podstawowych nukleozydów można także stosować nukleozydy niezwyczajne i modyfikowane. Do niezwyczajnych i modyfikowanych nukleozydów należy inozyna, metylowane nukleozydy purynowe, pochodne urydyny oraz 2'-0-metyloryboza, która może występować w dowolnym rybonukleozydzie.

Stałofazowe nośniki i łączniki do stosowania w bibliotece statystycznych biooligomerów.

Stałofazowe nośniki do stosowania w sposobie według wynalazku są obojętne w warunkach reakcji przy syntezie biooligomerów, to znaczy przy syntezie peptydów i/lub syntezie oligonukleotydów. Stałofazowy nośnik do stosowania w sposobie według wynalazku musi zawierać grupy reaktywne umożliwiające przyłączenie meru, albo przyłączenie łącznika lub umocowania, które może służyć jako wyjściowy punkt wiązania meru. W jednym wariancie stałofazowy nośnik może nadawać się do stosowania in vivo, to znaczy służyć jako nośnik lub podłoże przy bezpośrednich zastosowaniach biblioteki biooligomerów (np. Tentagel, Rapp Polymere, Tubingen, Niemcy; patrz sekcja 5.8, poniżej). W konkretnym wariancie stałofazowy nośnik może być przyjemny w smaku i nadawać sią do spożycia. W innym wariancie stałofazowy nośnik może stanowić użyteczny nośnik chromatograficzny.

W użytym znaczeniu określenie stałofazowy nośnik nie ogranicza się do określonego typu nośników. Dostępna jest raczej i znana specjalistom duża liczba nośników. Do stałofazowych nośników należą żele krzemionkowe, żywice, folie z tworzyw sztucznych z grupami funkcyjnymi, ziarna szklane, bawełna, ziarna z tworzyw sztucznych, żele tlenku glinu. Odpowiedni stałofazowy nośnik może być wybrany w oparciu o pożądane ostateczne zastosowanie i przydatność w różnych procesach syntezy. Tak np. w przypadku syntezy peptydów stałofazowy nośnik może stanowić

168 354 żywica taka jak polistyren (np. żywica PAM dostępna z Bachem Inc., Peninsula Laboratories itp.), żywica POLYHIPE® (dostępna z Aminotech, Kanada), żywica poliamidowa (dostępna z Peninsula Laboratories), żywica polistyrenowa szczepiona glikolem polietylenowym (TentaGel®, Rapp Polymere, Tubingen, Niemcy) lub żywica polidimetyloakryloamidowa (dostępna z Milligen/Bioserch, Kalifornia). W korzystnym wariancie dotyczącym syntezy peptydu stałofazowy nośnik stanowi żywica polidimetyloakryloamidowa.

Stałofazowe nośniki stosowane w sposobie według wynalazku mogą również zawierać łącznik. W użytym znaczeniu łącznik oznacza dowolną cząsteczkę, która stanowi odstęp między nośnikiem i syntetyzowanym peptydem. Łączniki mogą być kowalencyjnie przyłączone do stałofazowego nośnika przed sprzęganiem z N -Boc- lub N -Fmoc lub w inny odpowiedni sposób blokowanymi aminokwasami. Różne łączniki zastosować można w celu przyłączenia oligomeru do stałofazowego nośnika. Do przykładowych łączników należy kwas aminomasłowy, kwas aminokapronowy, kwas 7-aminoheptanowy oraz kwas 8-aminokaprylowy. Kwas Fmoc-aminokapronowy jest dostępny w handlu z Bachem Biochem i stanowi korzystny wariant. W innym wykonaniu łączniki mogą zawierać dodatkowo jedną lub więcej β-alanin jako „przekładki. Na dodatek stały nośnik może być modyfikowany tak, aby spełnić określone wymagania w konkretnym celu przy biooznaczeniach lub detekcji. Modyfikację stałofazowego nośnika wykonać można wprowadzając odpowiedni łącznik. Tak np. modyfikowany stałofazowy 'nośnik może być wrażliwy na kwas, wrażliwy na zasadę, nukleofilowo-wrażliwy, elektrofilowo-wrażliwy, fotoczuły, wrażliwy na utlenianie lub wrażliwy na redukcję.

Oprócz łączników opisanych powyżej stosować można selektywnie rozszczepiane łączniki. Zastosowanie łącznika wrażliwego na promieniowanie nadfioletowe, ONb, przedstawione jest poniżej (patrz Barany i Albericio, 1985, J. Am. Chem. Soc. 107: 4936-4942). Inne rozszczepialne łączniki wymagają hydrogenolizy lub fotoliozy. Przykłady fotoczułych (fotorozszczepialnych) łączników podaje Wang (1976, J. Org. Chem. 41:32-58), Hammer i inni (1990, Int. J. Pept. Protein Res. 36:31045) oraz Kreib-Cordonier i inni (1990, w Peptides-Chemistry, Structure and Biology, Rivier i Marshall, Eds., str. 895-897). Landen (1977, Methods Enzym. 47:145-1490) zastosował uwodniony kwas mrówkowy do rozszczepienia wiązań Asp-Pro; takie rozwiązanie zastosowano do charakteryzowania determinant komórek T, w połączeniu z metodą syntezy szpilkowej Geysena (Van der Zee i inni, 1989, Eur. J. Immunol. 119: 43-47).

Do innych potencjalnych grup łączących rozszczepialnych w warunkach zasadowych należą łączniki oparte na kwasie p-(hydroksymetylo)benzoesowym (Atherton i inni, J. Chem. Soc. Perkin 1:538-546) oraz kwasie hydroksyoctowym (Baleaux i inni, 1986, Int. J. Pept. Protein Res. 28:22-28). Geysen i inni (1990, J. Immunol. Methods 134: 23-33) donosi o rozszczepianiu peptydu według mechanizmu diketopiperazynowego. Enzym może specyficznie rozszczepić łącznik, zawierający sekwencję, która jest wrażliwa lub stanowi substrat dla enzymu; dotyczy to proteazowego rozszczepiania peptydu lub endonukleazynowego rozszczepiania oligonukleotydu. W pewnych przypadkach można deratyzować 10-50% żywicy, stosując podsta wienie rozszczepialnym łącznikiem, a pozostałe 50-90% podstawia nierozpuszczalnym łącznikiem tak aby po przeprowadzeniu rozszczepienia łącznika zapewnić pozostanie odpowiedniej ilości peptydu w celu dokonania sekwencjonowania. Zastosować można również kombinacje łączników tak, aby umożliwić kolejne rozszczepianie od jednego ziarna.

Stałofazowy nośnik stosowany w sposobie według wynalazku może zawierać ponadto biooligomer, stanowiący przedmiot zainteresowania, do którego dodać można statystyczną sekwencję merów. Wstępnie przyłączony biooligomer wyselekcjonować można opisanymi metodami, albo też może on zawierać sekwencję, odnośnie której wiadomo, że wykazuje pożądane właściwości.

W syntezie oligonukleotydów korzystnie można zastosować stałofazowy nośnik oparty na krzemionce. Jak to podano powyżej, stałofazowe nośniki oparte na krzemionce są dostępne w handlu (np. z Peninsula Laboratories, Inc.; oraz z Applied Biosystems, Inc.).

Metody detekcji i identyfikacji biooligomerów będących przedmiotem zainteresowania.

Biblioteki wytwarzane sposobem według wynalazku można poddać selekcjonowaniu w celu zidentyfikowania tych biooligomerów z biblioteki, które wykazują aktywność biologiczną będącą przedmiotem zainteresowania, taką jak wiązanie, stymulowanie, inhibitowanie, toksyczność, smak itp. Sposobami opisanymi poniżej można również poddawać selekcjonowaniu inne biblioteki

168 354 15 biooligomerów pod względem aktywności enzymatycznej, aktywności w inhibitowaniu enzymów oraz właściowości chemicznych i fizycznych będących przedmiotem zainteresowania.

Biooligomery będące przedmiotem.zainteresowania, wykryte we wstępnym selekcjonowaniu nie muszą być ostatecznie ligandami. W rzeczywistości korzystne jest zsyntetyzowanie drugiej biblioteki opartej na wspólnych sekwencjach ligandów wybranych podczas pierwszego selekcjonowania. W ten sposób będzie można zidentyfikować ligandy o nawet jeszcze wyższej aktywności, pod warunkiem że drugie selekcjonowanie wykonuje się w o wiele ostrzejszych warunkach.

Próby wiązania.

Biblioteki oligomerów, wytworzone sposobem według wynalazku umożliwiają identyfikację ligandów biooligomerów wiążących cząsteczki akceptorowe. W użytym znaczeniu określenie „cząsteczka akceptorowa dotyczy dowolnej substancji, która wiąże się z ligandem biooligomerycznym. Cząsteczki akceptorowe mogą być makrocząsteczkami biologicznymi, takimi jak np., ale nie wyłącznie przeciwciała, receptory lub wirusy. Na dodatek cząsteczkami akceptorowymi mogą być związki chemiczne takie jak np., ale nie wyłącznie białka, węglowodany, kwasy nukleinowe, lipidy, leki, metale lub małe cząsteczki.

Biblioteka biooligomerów wytwarzana sposobem według wynalazku może potencjalnie oddziaływać z wieloma różnymi cząsteczkami akceptorowymi. Identyfikując konkretne rodzaje biooligomeru, z którymi wiąże się określona cząsteczka akceptorowa, można na drodze fizycznej wydzielić rodzaje biooligomeru będące przedmiotem zainteresowania.

W związku z tym, że niewielka ilość ziaren będzie usuwana w czasie każdego etapu selekcjj/detekcji/wydzielania, większość ziaren pozostanie w zbiorze. Dlatego też bibliotekę statystycznych biooligomerów można ponownie wykorzystać szereg razy. Jeśli różne zabarwienie lub schematy identyfikacji wykorzystuje się w przypadku różnych cząsteczek akceptorowych (np. akceptorów znaczonych związkami powodującymi fluorescencję), takimi jak fluorescina (zielona barwa), czerwień teksaska (czerwona) lub DAPI (błęktna) oraz zastosuje się odpowiednie filtry wzbudzające w mikroskopie fluorescencyjnym lub w detektorze fluorescencji, do biblioteki peptydów można będzie dodać różne akceptory (receptory) i dokonywać oceny równocześnie, co ułatwia szybkie selekcjonowanie w odniesieniu do konkretnego ligandu. Takie strategie nie tylko zmniejszają koszty, ale również zwiększają liczbę cząsteczek akceptorowych, które można wyselekcjonować.

Cząsteczkę akceptorową będącą przedmiotem zainteresowania wprowadza się do bliblioteki biooligomerów, gdzie rozpoznaje ona i wiąże jeden lub więcej rodzajów biooligomeru w bibliotece. Każdy rodzaj biooligomeru, z którym wiąże się cząsteczka akceptorowa, można będzie znaleźć na pojedynczym stałofazowym nośniku, tak że nośnik ten, a więc i biooligomer, można będzie łatwo zidentyfikować i wydzielić.

Biooligomer wydzielić można dowolnymi sposobami znanymi specjalistom. Tak np., ale nie wyłączenie, można wydzielić na drodze fizycznej taką kombinację stałofazowy nośnik/biooligomer, która wykazuje najsilniejsze oddziaływanie fizykochemiczne z cząsteczką akceptorową. W jednym wariancie, opartym na oddziaływaniu fizykochemicznym, roztwór określonych cząsteczek akceptorowych dodaje się do biblioteki statystycznych peptydów, zawierającej około 10⁵-107 stałofazowych nośników. Cząsteczkę akceptorową inkubuje się z żywicą przez okres czasu niezbędny do zajścia sprzęgania między peptydem i przeciwciałem, np. przez 1 godzinę w 22°C. Następnie wydziela się kombinację biooligomer/stałofazowy nośnik pokryty cząsteczką akceptorową. Dokładniejsze warianty przedstawione są poniżej w metodach, które opisują zastosowanie monoklonalnego przeciwciała jako rozpuszczalnej cząsteczki akceptorowej. Oczywiste stanie się, że metody takie można łatwo zaadaptować do wykrywania wiązania dowolnej cząsteczki akceptorowej. Ponadto, jakkolwiek poniższy opis dotyczy bibliotek peptydów, zrozumiałe jest, że oceniać można także biblioteki oligonukleotydów lub chimer peptyd-oligonukleotyd.

(i) Monoklooaloe przeciweiało znaczy się yąjpierw grupg fluorescencyjną lub „fluorosceiouje się“ technikami dobrze zbabymi specjalistom. Przeciwciało o stężeniu 1 pg/ml wprowadza się następnie do biblioteki peptydów i, po łagodnym wymieszaniu w 22°C przez 1 godzinę, stałofazowe bośbiai przemywa się i kombinacje fluorescencyjnego przeciwciała ze statofazowym ^έ^^ιη/peptydem identyfikuje się i oddziela w sortowniku komórek aktywowanym fluorescencyjnie. Alternatywnie kombinacje fluorescencyjnego przeciwciała ze statofazowym nośnikiem/peptydem

168 354 identyfikuje się i selekcjonuje się na drodze fizycznej pod mikroskopem operacyjnym z przystawką fluorescencyjną, za pomocą mikromanipulatora. Względna intensywność fluorescencji jest zazwyczaj proporcjonalna do powinowactwa peptydu-ligandu do odnośnych monoklonalnych przeciwciał.

(ii) Monoklonalne przeciwciała najpierw koniuguje się na ziarnach ferromagnetycznych, powszechnie stosowanych. Skoniugowane przeciwciała o stężeniu 1 pg/ml inkubuje się następnie z biblioteką przez 1 godzinę w 22°C. Magnetyczne ziarna tworzą rozetę wokół stałofazowego nośnika/peptydu będącego przedmiotem zainteresowania, którą można następnie oddzielić na drodze fizycznej za pomocą silnego magnesu.

(iii) Monoklonalne przeciwciała najpierw koniuguje się z enzymem takim jak fosfataza alkaliczna, znanymi sposobami. Taki koniugat przeciwciało/enzym inkubuje się następnie w bibliotece statystycznych peptydów przez 30 minut - 1 godzinę w 22°C. Po przemyciu całość biblioteki wylewa się na szalki Petriego zawierające substrat dla fosfatazy alkalicznej, np. 5-bromo-4-chloro-3indoilofosforan (BCIP) oraz nitrobłękitne tetrazoleum (NBT). Po inkubowaniu przez kilka minut kombinacja stałofazowy nośnik/peptyd zmienia barwę (staje się błękitna) ze względu na wytrącanie się przekształconego substratu na stałofazowym nośniku, tak że można ją łatwo zidentyfikować i oddzielić na drodze fizycznej pod mikroskopem operacyjnym za pomocą mikromanipulatora. Względna intensywność reakcji barwnej jest zazwyczaj proporcjonalna do powinowactwa peptydu-ligandu do odnośnych monoklonalnych przeciwciał.

(iv) Monoklonalne przeciwciała koniuguje się najpierw z enzymem takim jak peroksydaza chrzanowa znanymi sposobami. Taki koniugat przeciwciało/enzym inkubuje się następnie w bibliotece statystycznych peptydów przez 30 minut - 1 godzinę w 22°C. Po przemyciu całość biblioteki wylewa się na szalki Petriego zawierające substrat dla peroksydazy, np. 3,3',4,4'diaminobenzydynę (DAB); 3,3',5,5'-tetrametylobenzydynę (TMB); lub 4-chloro-1-naftol (4CN). Po inkubowaniu przez kilka minut kombinacja stałofazowy nośnik/peptyd zmienia barwę, tak że można ją łatwo zidentyfikować i oddzielić na drodze fizycznej pod mikroskopem operacyjnym za pomocą mikromanipulatora. Względna intenyswność reakcji barwnej jest zazwyczaj proporcjonalna do powinowactwa peptydu-ligandu do odnośnych monoklonalnych przeciwciał.

(v) Monoklonalne przeciwciała znaczy się najpierw biotyną czyli „biotynyluje się znanymi sposobami, po czym inkubuje się w bibliotece statystycznych peptydów przez 30 minut -1 godzinę w 22°C. Po przemyciu dodaje się kompleks streptawidyny z peroksydazą chrzanową i całość inkubuje się przez 30 minut. Nośnik przemywa się następnie, po czym zabarwienie wywołuje się metodą enzymatyczną, jak to opisano powyżej w metodzie (iii). Kombinację peptyd/stałofazowy nośnik będącą przedmiotem zainteresowania oddziela się na drodze fizycznej, jak to opisano powyżej.

Oprócz stosowania rozpuszczalnych cząsteczek akceptrorowych, w innym wariancie wykrywać można biooligomery wiążące się z powierzchniowymi receptorami komórek z wykorzystaniem komórek dziewiczych. Zastosowanie komórek dziewiczych jest korzystne w przypadku receptorów, które są wielomerowe, nietrwałe, albo w przypadku receptorów, które wymagają funkcjonowania domeny lipidowej w błonie komórkowej. W technice tej można stosować komórki żywe lub unieruchomione. Komórki inkubuje się z biblioteką statystycznych peptydów, tak że wiążą one pewne peptydy z biblioteki tworząc „rozetę między komórkami docelowymi i odnośnym stałofazowym nośnikiem/peptydem. Rozetę można następnie oddzielić na drodze różnicowego wirowania lub wydzielić na drodze fizycznej pod mikroskopem operacyjnym.

Alternatywnie dokonać można selekcji biblioteki z wykorzystaniem techniki „panwiowej stosując linie komórek takie jak (i) „rodzicielska linia komórek, w których na powierzchni komórek nie występują receptory będące przedmiotem zainteresowania oraz (ii) receptorododatnią linię komórek, to znaczy linię komórek uzyskaną w wyniku transfekcji linii rodzicielskiej genem kodującym receptor będący przedmiotem zainteresowania. Można następnie przeprowadzić selekcję biblioteki z wykorzystaniem następującej strategii: (i) najpierw usuwa się z biblioteki niespecyficzne ziarna, które będą wiązać się z komórkami nie zawierającymi receptora, w wyniku wprowadzenia monowarstwy rodzicielskiej linii komórek z wykorzystaniem standardowej „techniki panwiowej, pozostawiając specyficzne względem receptora nie wiążące ziarna, czyli ziarna niezwiązane, (ii) usuwa się ziarna nie wiążące, do których należą zarówno ziarna specyficzne

168 354 względem receptora jak i ziarna nie związane i wprowadza się je na monowarstwę receptorododatniej linii komórek, w wyniku czego ziarna specyficzne względem receptora będą wiązać się z receptoro-dodatnią linią komórkową, (iii) usuwa się pozostałe nie związane i niewiążące ziarna na drodze łagodnego przemywania i dekantacji oraz (iv) usuwa się ziarno (perełkę) specyficzne względem receptora, za pomocą mikromanipulatora.

Jako alternatywę w stosunku do prób z całymi komórkami w odniesieniu do receptorów związanych w błonie lub receptorów wymagających funkcjonowania domeny lipidowej w błonie komórkowej, odtworzyć można cząsteczki receptorowe w lipozomach, do których przyłączyć można grupę raportową lub enzym.

Jakkolwiek powyższe przykłady odnoszą się do ligandów peptydowych, można wykorzystać dowolny z biooligomerów opisanych powyżej. I tak cząsteczki akceptorowe można wiązać z peptydami nieklasycznymi, ukołowionymi, zmodyfikowanymi lub o nieswobodnej konformacji, z oligonukleotydami lub z chimerami peptyd-oligonukleotyd.

W jednym wykonaniu cząsteczka akceptorowa może być bezpośrednio znaczona. W innym wariancie zastosować można znaczony drugorzędowy reagent do wykrywania wiązania cząsteczki akceptorowej ze stałofazowym nośnikiem zawierającym biooligomer będący przedmiotem zainteresowania. Wiązanie można wykryć poprzez wytwarzanie chromoforu in situ przez znacznik enzymatyczny. Do odpowiednich enzymów należy, ale nie wyłącznie, alkaliczna fosfataza i peroksydaza chrzanowa. W innym wariancie przeprowadzić można próbę dwubarwną z wykorzystaniem dwóch chromogenicznych substratów z dwoma znacznikami enzymatycznymi na różnych cząsteczkach akcpetorowych będących przedmiotem zainteresowania. Za pomocą próby dwubarwnej zidentyfikować można ligandy reagujące krzyżowo i reagujące prosto.

Do innych znaczników stosowanych należą barwione ziarna lateksowe, ziarna magnetyczne, znaczniki fluorescencyjne (np. izotiocyjanian fluorescenu (FITC), fikaerytryna (PE), czerwień teksaska (TR), rodamina, swobodne lub chelatowane sole z serii lantanowców, a zwłaszcza Eu3+, aby wymienić kilka fluoroforów), cząsteczki chemiluminescencyjne, radioizotopy lub znaczniki tworzące obraz w rezonansie magnetycznym. Próby dwubarwne przeprowadzić można stosując dwa lub więcej rodzajów barwionych ziaren lateksu lub fluorofory emitujące przy różnych długościach fali. Znaczone ziarna można wydzielić ręcznie lub mechanicznie. Do sposobów mechanicznych należy sortowanie aktywowane fluorescencją, np. analogicznie do FACS oraz usuwanie za pomocą mikromanipulatorów.

W konkretnych przykładach zamieszczonych poniżej zastosowano znaczniki enzymchromogen oraz znaczniki fluorescencyjne (FITC).

Reaktywne ziarna można wydzielać, wymieniając kilka kryteriów, na podstawie intensywności znacznika, np. intensywności barwy, intensywności fluorescencji, mocy magnetycznej. Najintensywniej znaczone ziarna można wybrać i poddać sekwencjonowaniu lub charakteryzować w inny sposób, np. metodą spektralnej analizy masowej. W innym wariancie wybrać można i poddać sekwencjonowaniu statystyczny zbiór ziaren o intensywności znacznika powyżej arbitralnie ustalonej granicy. Ewentualnie można wykorzystać nowoczesną mikroskopię z analizowaniem obrazu do ilościowego ustalania intensywności barwy i na tej podstawie dokładnie ustalić względne powinowactwo ligandu w stosunku do cząsteczki akceptorowej przed dokonaniem analizy sekwencyjnej ziarna. Można także wykorzystać ilościową mikroskopię immunofluorescencyjną, jeśli akceptor znaczony jest znacznikiem fluorescencyjnym. W jeszcze innym wariancie ziarna wykazujące pewną intensywność znacznika wybiera się w celu wykonania analizy składu, to znaczy ustalenia składu aminokwasów. Na podstawie analizy składu wytworzyć można i wyselekcjonować wybraną bibliotekę zawierającą ograniczony zestaw merów zidentyfikowanych jako istotne.

Zgodnie z innym wariantem biooligomer(y) o największym powinowactwie wiązania, to znaczy o stałej wiązania, identyfikować można stopniowo rozcieńczając cząsteczki akceptorowe będące przedmiotem zainteresowania, aż wykryje się wiązanie jedynie kilku stałofazowych nośników z biblioteki. Alternatywnie zwiększyć można moc roztworu wiążącego lub, w przypadku kwasów nukleinowych, hybrydyzację docelowym kwasem nukleinowym czyli cząsteczką akceptorową. Dla specjalistów zrozumiałe jest, ze moc wiązania lub hybrydyzację można zwiększyć (i) zwiększając siłę jonową roztworu: (ii) zwiększając stężenie związków denaturujących takich jak mocznik; (iii) podwyższając lub obniżając pH w stosunku do obojętnego (pH 7); lub (iv), w

168 354 przypadku kwasów nukleinowych, dochodząc do Tm (temperatury topnienia). Inne sposoby zmieniania warunków w roztworze w celu ograniczenia wiązania do oddziaływań o wysokim powinowactwie są powszechnie znane. Duże rozcieńczenie lub wysoką siłę wiązania cząsteczki akceptorowej ze stałofazowym nośnikiem/biooligomerem wykorzystać można do wykrywania ligandu będącego przedmiotem zainteresowania w statysycznej bibliotece obejmującej wszystkie lub prawie wszystkie możliwe mery, albo w ograniczonej, rafinowanej bibliotece.

Zgodnie z jeszcze innym wariantem przedmiotem zainteresowania mogą być biooligomery wykazujące małe powinowactwo wiązania. Można je wyselekcjonować usuwając najpierw wszystkie biooligomery o wysokim powinowactwie wiązania, a następnie wykrywać wiązanie w warunkach mniej drastycznych lub przy mniejszym rozcieńczeniu.

W korzystnym wariancie przeprowadzić można próbę podwójnego znaczenia. Pierwszy znacznik zastosować można w celu wykrycia niespecyficznego wiązania cząsteczki akceptorowej będącej przedmiotem zainteresowania z ziarnami w obecności rozpuszczalnego ligandu. Znaczone ziarna usuwa się następnie z biblioteki, po czym usuwa się rozpuszczalny ligand. Z kolei wykrywa się specyficzną cząsteczkę akceptorową dla pozostałych ziaren. Należy oczekiwać, że biooligomery na takich ziarnach będą wiązać cząsteczkę akceptorową w tym samym miejscu co ligand będący przedmiotem zainteresowania i w związku z tym będą imitować ligand będący przedmiotem zainteresowania. Próba podwójnego znaczenia ma tę zaletę, że cząsteczka akceptorowa będąca przedmiotem zainteresowania nie musi być oczyszczana, gdyż pierwszy etap próby umożliwia usunięcie niespecyficznie dodatnio reagujących ziaren.

Imitacje enzymów/inhibitory enzymów.

Sposobem według wynalazku wytwarza się także biblioteki biooligomerów, które katalizują reakcje, to znaczy biblioteki enzymów, które służą jako koenzymy lub które inhibitują reakcje enzymatyczne. Pozwala to na ocenę aktywności enzymatycznej lub ko-enzymatycznej, albo inhibitowania aktywności enzymatycznej.

Aktywność enzymatyczną zaobserwować można w wyniku powstawania wykrywalnego produktu reakcji. W konkretnym wariancie biooligomer z biblioteki katalizuje reakcję enzymatyczną substratu fosfatazy alkalicznej, fosforanu 5-bromo-4-chloro-3-indolu (BCIP), w której powstaje błękitny, nierozpuszczalny produkt reakcji na stałofazowym nośniku.

W innym wariancie w półstałej matrycy może tworzyć się strefa dającego się zaobserwować produktu, np. zabarwienie lub fluorescencja. Warstwę biblioteki nanosi się na półstałą matrycę, np. na żel agarozowy, po czym dodaje się chromogeniczny lub innego typu indykatorowy substrat. Gdy biooligomer/stalofazowy nośnik wykazuje pożądaną aktywność enzymatyczną, powstanie strefa produktu. Tak np., ale nie wyłącznie, biooligomeryczny analog peroksydazy chrzanowej można zidentyfikować dodając roztwór aminoantypirenu (0,25 mg/ml; Kodak), fenol (8 mg/ml) i H 2O 2 (0,005%) w 0,1 M buforze fosforanowym, pH 7,0. Ziarna wykazujące aktywność enzymatyczną będą tworzyć strefę o zabarwieniu purpurowym. W innym wariancie biooligomery/ziarna wykazujące aktywność proteazową można zidentyfikować dodając dobrze znane kolorymetryczne substraty proteazy.

Aktywność koenzymatyczną zaobserwować można oceniając aktywność enzymu z pośredniczeniem koenzymu, gdy naturalny lub zwykły koenzym nie jest obecny.

Aktywność inhibitowania enzymu można wykryć częściowo uwolnionym biooligomerem. Uwalnianie biooligomerów przedstawiono powyżej. Przykładowo, ale nie wyłącznie, bibliotekę biooligomerów nanieść można w formie warstwy na półstałą matrycę zawierającą enzym. Bibliotekę poddaje się obróbce częściowo uwolnionym biooligomerem. Gdy biooligomer inhibituje aktywność enzymu, zidentyfikować można strefę, w której nie ma produktu. W jednym wariancie substrat enzymu jest chromogeniczny i powstaje barwny produkt. W związku z tym obecność enzymu spowoduje powstanie strefy bez zabarwienia. W innym wariancie inhibitowanie proteolizy hemoglobiny lub indykatorowy enzym taki jak fosfatazę alkaliczną wykryć można na podstawie nieprzezroczystej strefy w półstałej matrycy. Jest to spowodowane tym, że inhibitor proteolizy będzie zapobiegać degradacji hemoglobiny lub enzymu indykatoro wego.

Specjaliści dobrze wiedzą, że biooligomer, który wykazuje aktywność enzymatyczną, aktywność koenzymu lub inhibituje aktywność enzymatyczną, może stanowić peptyd, oligonukleotyd lub chimera peptyd-oligonukleotyd. Szczególnie interesujące są peptydy o meswobodnej konfor168 354 macji lub cykliczne, które mogą tworzyć unikatową katalitycznie wiążącą kieszeń lub powierzchnię, jak opisano wyżej. Można również oczekiwać, że chimera peptyd-oligonukleotyd będzie wykazywać unikatowe właściwości chemiczne, takie jak aktywność enzymatyczna lub koenzymatyczna, z uwagi na wyjątkowe zestawienie odpowiednich grup funkcyjnych. Ponadto przewiduje się, że biooligomer/stałofazowy nośnik może wykazywać aktywność enzymatyczną lub ko-enzymatyczną, gdy wolny biooligomer nie będzie wykazywać aktywności. Jest to spowodowane tym, że nagromadzenie dużej gęstości biooligomeru może nadać unikatowe właściwości chemiczne kombinacji biooligomer/stałofazowy nośnik. Przewiduje się także, że biooligomer może wykazywać aktywność enzymatyczną lub ko-enzymatyczną po uwolnieniu z ziarna. Przewiduje się, że znane koenzymy (koczynniki) można wbudowywać chemicznie do biooligomeru o nieswobodnej konformacji w celu stymulowania prostego lub złożonego enzymu obejmującego np. łańcuch przenoszący elektrony.

Metody charakteryzacji biooligomeru.

Poza wybraniem ziarna zawierającego biooligomer będący przedmiotem zainteresowania dowolnym ze sposobów przedstawionych wyżej można także ustalić budowę i sekwencję biooligomeru.

Gdy biooligomer stanowi peptyd, korzystny sposób sekwencjonowania stanowi degradacja Edmana. Szczególnie korzystną metodę wykorzystuje sekwenator Applied Biosystems 477A Protein Seąuencer. Sekwencję aminokwasów w peptydach można również wyznaczyć metodą spektroskopii masowej z bombardowaniem szybkimi atomami (FAB-MS) lub innymi metodami analitycznymi.

Peptydy można sekwencjonować zarówno wtedy, gdy są połączone ze stałym nośnikiem jak i po odszczepieniu. W celu odszczepienia peptydu wydzielone ziarna z peptydami poddaje się obróbce środkami rozszczepiającymi znanymi specjalistom z tego, że oddzielają polimer od stałofazowych nośników. Rodzaj wybranego środka rozszczepiającego zależy od rodzaju stosowanego nośnika stałofazowego. Tak np. w celu odszczepienia peptydu od żywicy Wang korzystnie stosuje się 50% kwas trifluorooctowy (TFA) w dichlorometanie.

Alternatywnie, w innym wariancie można oddzielić pojedynczy stałofazowy nośnik taki jak ziarno, z przyłączonymi do niego biooligomerami i wprowadzić ziarno do sekwentora bez uprzedniego odszczepienia biooligomerów od ziarna. Tak np. jeśli biooligomer stanowi peptyd, ocenia się, że pojedyncze ziarno żywicy o średnicy 100//m z podstawieniem 0,5 milirównoważnika (mEq)g żywicy, zawiera około 200 pmoli peptydu. Pojednycze ziarno żywicy PAM o średnicy 250 mm przy podstawieniu 0,5 mEq/g żywicy zawiera około 3125 pmoli peptydu. W przypadku nowoczesnych sekwentorów peptydów w celu wykonania prawidłowego sekwencjonowania potrzeba jedynie 5-10pmoli. Z tego względu jeden standardowy nośnik żywicy PAM o średnicy 100/tm zawiera peptyd w ilości większej od wymaganej do sekwencjonowania.

W przypadku gdy peptydy zawierają aminokwasy lub peptydomimetyki, które nie poddają się analizie Edmana, uzyskać można takie ziarno, na którym 10-50% peptydów nie zawiera reszt nie dających się sekwencjonować. Ustalić można resztę sekwencji i na tej podstawie dokonać można ekstrapolacji sekwencji zawierającej resztę nie dającą się sekwencjonować.

Inne podejście w przypadku reszt nie dających się sekwencjonować polega na przejściowym zakończeniu części peptydu przed wprowadzeniem nie ulegającej sekwencjonowaniu reszty w czasie syntezy biblioteki. Podczas prowadzonej potem identyfikacji strukturalnej zastosować można degradację Edmana aż do reszty nie ulegającej sekwencjonowaniu, po czym odblokowuje się tymczasowe zakończenie i odtwarza resztę sekwencji, od końca C do reszty nie ulegającej sekwencjonowaniu.

W przypadku oligonukleotydów sekwencjonowanie przeprowadzić można za pomocą zautomatyzowanego sekwenatora oligonukleotydów (np. Applied Biosystems). Korzystną alternatywę stanowi technika Maxama i Gilberta (1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560-564). Zastosować można również inne znane metody sekwencjonowania oligonukleotydów.

Spektroskopia z bombardowaniem szybkimi atomami stanowi chyba najskuteczniejszą metodę analizy strukturalnej. Dzięki wykrywaniu fragmentów, a także rodzajów biooligomerów zrekonstruować można sekwencję. Dane odnośnie struktury i sekwencji dostarcza również wysokosprawna spektroskopia masowa wysokiej typu „electrospray (Finnigan MAT).

168 354

Po ustaleniu sekwencji wybranego biooligomeru znaczną jego ilość można zsyntetyzować na drodze chemicznej z wykorzystaniem zautomatyzowanego syntetyzatora peptydów lub innymi sposobami syntezy biologicznej lub chemicznej. Na dodatek po zidentyfikowaniu sekwencji biooligomeru stosować można podstawienie analogami merów w celu wzmocnienia aktywności konkretnego biooligomeru.

Przykład I. Synteza biblioteki tetrapeptydów.

Sposób według wynalazku wykorzystano do syntezy rodziny tetrapeptydów o wzorze X-X-XTrp, w którym X oznacza walinę, serynę lub alaninę, a pierwszy aminokwas stanowi zawsze tryptofan. Tryptofan wprowadzano na końcu karboksylowym w celu ułatwienia monitorowania spektrofotometrycznego przy OD280Żywicę Na -Fmoc-tryptofano-alkoksymetylo-polistyrenową opisaną przez Wanga (1973, J. Am. Chem. 95: 1328-1333) otrzymano z Bachem Inc., Torrence, Ca. i umieszczono w standardowym naczyniu do syntezy peptydów w fazie stałej. Dodawanymi aminokwasami były również Fmoc-modyfikowane aminokwasy otrzymane z Bachem Inc. Innymi reagentami były zasadniczo takie same reagenty, które wykorzystuje się rutynowo w syntezie w fazie stałej, opisanej przez Austena (1988, „Peptide Synthesis“ Methods in Molecular Biology, vol. 3, str. 311-331).

Do przeprowadzenia reakcji sprzęgania zastosowano naczynie reakcyjne z korkami z wykładziną z Teflonu™; standardowe naczynie reakcyjne do syntezy białek w fazie stałej wykorzystano jako komorę mieszania, w której mieszano próbki po reakcji sprzęgania.

Około 0,5 g żywicy Fmoc-Trp-alkoksymetylowej spęczniono w 20 ml dichlorometanu (DCM). Żywicę przemyto następnie dwukrotnie DCM, raz mieszaniną 1:1 DCM i dimetyloformamidu (DMF) oraz 3 razy DMF. Z kolei żywicę odblokowano 20% (v/v) piperydyną w DMF. Po dokładnym przemyciu odblokowanej żywicy DMF (3 razy) DCM (3 razy) i mieszaniną (1:1 DCM i DMF (2 razy) żywicę ponownie zawieszono w około 7,5 ml DMF, podzielono na 3 odrębne próbki po około 2,5 ml i wprowadzono do 3 ponumerowanych probówek do sprzęgania.

Dodawaną ilość zablokowanego aminokwasu wyliczono na podstawie ilości moli tryptofanu już przyłączonego do żywicy. W przypadku każdego dodawanego amiokwasu 5-molowy nadmiar aminokwasu dodawano do każdego naczynia reakcyjnego, do którego już dodano próbkę przemytej żywicy. Do każdego naczynia reakcyjnego wprowadzano pięciokrotny nadmiar innego aminokwasu. Każde z naczyń wytrząsano przez 2 minuty i dodawano 5-krotny molowy nadmiar diizopropylokarbodiimidu (DIC) w 3 ml DMF, po czym wytrząsanie kontynuowano przez 1 godzinę.

W celu sprawdzenia kompletności sprzęgania próbkę z każdej probówki zbadano odczynnikiem ninhydrynowym otrzymanym z Pierce Chemical, metodą podaną przez Sarina i innych (1981, Anal. Biochem. 117: 147-157), przytaczaną tu jako źródło literaturowe. Jeśli test ten wykaże, iż reakcja sprzęgania jest niekompletna, kompletność reakcji wymuszano kilkoma sposobami, znanymi specjalistom, obejmującymi (a) drugie sprzęganie z zastosowaniem 1-5-krotnego nadmiaru zablokowanego aminokwasu, (b) dodatkowe sprzęganie z zastosowaniem różnych lub dodatkowych rozpuszczalników (np. trifluoroetanolu) lub (c) dodatek chaotropowych soli, np. NaClO4 lub LiBr (Klis i Steward, 1990, „Peptides: Chemistry, Structure and Biology“, Rivier and Marshall, Eds., ESCOM Publ., str. 904-906).

Po sprzęganiu żywicę z trzech probówek do sprzęgania ostrożnie przenoszono i połączono w jednej komorze mieszania. Żywicę przemyto 2 razy DCM/DMF (1:1), 3 razy DCM i 3 razy DMF, po czym odblokowno 20% (v/v) piperydyną w DMF. Po dokładnym przemyciu DCM i DMF w sposób opisany powyżej mieszaninę podzielono na 3 próbki i rozdzielono do trzech odrębnych naczyń reakcyjnych. Dodano drugi zestaw aminokwasów. Po kompletnym sprzęganiu żywicę najpierw odblokowano 20% pieprydyną, a następnie dokładnie przemyto DCM i DMF, w sposób opisany powyżej. Trzeci zestaw aminokwasów dodano w taki sam sposób.

W celu odszczepienia peptydów do stałofazowych nośników 30 ml 50% (v/v) kwasu trifluorooctowego (TFA) z dodatkiem 5% (v/v) anizolu i 0,9% (v/v) etanoditiolu, w DCM, dodano do żywicy. Mieszaninę wytrząsano przez 4 godziny, po czym zebrano ciecz znad osadu z peptydami. Ciecz znad osadu z peptydami zatężono w wyparce rotacyjnej i peptydy wytrącono eterem. Po dokładnym przemyciu wytrącone peptydy wysuszono i przygotowano do dalszej analizy. Liofilizowany peptyd (w postaci proszku) przechowywano w stanie zamrożonym.

168 354 21

Przykład II. Porównanie metody zastrzeżonej i konwencjonalnej metody syntezy peptydów.

Metody i materiały.

Bibliotekę statystycznych tetrapeptydów wytworzono sposobem opisanym powyżej. Dodatkowo wytworzono bibliotekę tetrapeptydów z wykorzystaniem technik standardowej syntezy peptydów w fazie stałej (poniżej określanej jako „SPPS), opisanych przez Austena, patrz wyżej). Jako kombinację stałofazowy nośnik/aminokwas zastosowano N^-Fmoc-tryptofanoalkoksymetylową żywicę otrzymaną z Bachem, Inc. Równomolowe ilości pięciokrotnego nadmiaru N^ Fmoc-waliny. NZ-Fmoc-seryny (O-tert-Bu) i N α -Fmoc-alaniny dodano do naczynia reakcyjnego w każdym etapie sprzęgania. Po trzech kolejnych etapach sprzęgania tetrapeptyd odszczepiono 50% (v/v) TFA z 5% (v/v) anizolu i 0,9% (v/v) etanoditiolu w DCM, jak to opisał Austen, patrz wyżej.

Wyniki.

Obydwie biblioteki peptydów analizowano w kolumnie chromatograficznej HPLC C-18 z odwróceniem faz (Vydac) w celu ustalenia liczby rodzajów peptydów w bibliotece (liczby pików), względnego stężenia peptydów (powierzchnia pików) oraz względnej hydrofilowości peptydów (wcześniejsze lub późniejsze eluowanie z kolumny). Wyniki przedstawiono na fig. 3. Chromatogram w górnej części przedstawia rozkład uzyskany w przypadku biblioteki peptydów wytworzonej sposobem według wynalazku, a chromatogram w dolnej części przedstawia rozkład uzyskany metodą SPPS.

Obydwa rozkłady zawierają po 21 odrębnych pików wskazujących na obecność co najmniej 21 różnych rodzajów peptydów w każdej z bibliotek. Rozkład SPPS wykazuje jednak znacznie większe piki nr 1,2, 3,4, 5,6 i 7, co oznacza, że biblioteka SPPS zawiera większe stężenie peptydów 1-7 niż peptydów 8-21. Zwiększona ilość peptydów 1-7 świadczy o tym, że peptydy te były syntetyzowane preferencyjnie w porównaniu z resztą spośród 21 peptydów. Na dodatek te dominujące piki były eluowane wcześniej, co oznacza, że peptydy te wykazują krótszy czas retencji w kolumnie, co z kolei świadczy o tym, że były to peptydy o bardziej hydrofllowym charakterze.

Nie są to wyniki zaskakujące w odniesieniu do układu SPPS. Wiadomo, że walina jest hydrofobowym i przestrzennym aminokwasem i wykazuje znacznie mniejszą szybkość sprzęgania (co, jak się uważa, spowodowane jest zawadą przestrzenną), niż alanina lub seryna. Dlatego też w konwencjonalnej syntezie statystycznych peptydów, takiej jak przeprowadzona powyżej, w której walina zasadniczo „konkuruje z alaniną i seryną w dostępie do miejsc sprzęgania, zsyntetyzowane peptydy są zubożone w walinę, a uzyskana biblioteka peptydów nie wykazuje równomolowego rozkładu statystycznych peptydów.

W przeciwieństwie do powyższego rozkładu biblioteki statystycznych peptydów wytworzonych sposobem według wynalazku wykazywał równomolowy rozkład peptydów. Jakkolwiek powierzchnie pików 3,6,12,13 i 18 były w przybliżeniu dwukrotnie większe od powierzchni innych pików, co wskazuje na obecność dwóch peptydów w tych punktach, większość z pozostałych 16 pików miała zasadniczo identyczne wzory. Na dodatek wszystkich 21 pików obejmuje cały zakres czasów retencji, co również świadczy o równomolowym rozkładzie peptydów.

Dalszych dowodów dostarczyło sekwencjonowanie wybranych pików. Mniejsze piki 8,9 i 21 oraz duży pik 6 sekwencjonowano w sekwenatorze Applied Biosystems 477A Protein Sequencer:

nr 8 = Val-Ala-Ser-Trp nr 9 = Val-Ser-Ala-Trp nr 21 = Val-Val-Vla-Trp nr 6 = (Ser-Val)-(Ser-Ala)-(Ser-Ala)-Trp

Te sekwencje zawierające walinę potwierdzają, że sposób według wynalazku zapewnia statystyczną syntezę peptydów, nawet wówczas, gdy zastosuje się znany powoli sprzęgający aminokwas.

Sekwencja dla piku nr 6 nie była miarodajna, zapewne ze względu na obecność więcej niż jednego peptydu pod pikiem. Najprawdopodobniej dwa podstawowe składniki piku to Ser-AlaAla-Trp i Val-Ser-Ser-Trp.

Wniosek.

Wyniki te wskazują, że sposób syntezy statystycznych peptydów według wynalazku umożliwia syntezę biblioteki statystycznych peptydów w zasadniczo równomolowych ilościach, w przeciwień22 168 354 stwie do standardowej techniki SPPS, w której dominuje zestaw peptydów zawierających aminokwasy o większej szybkości sprzęgania.

Przykład III. Ustalanie ligandów dla sterptawidyny i anty-e-endorfiny MAB.

Przykład ten dokładniej ilustruje bardzo różniące się podejście do identyfikacji ligandu peptydowego sposobem według wynalazku. Zamiast opierać się na układzie biologicznym (np. przeprowadzając fuzję włóknistego faga) w celu generowania statystycznej biblioteki, sposoby według wynalazku skutecznie wykorzystują chemiczną syntezę olbrzymiej biblioteki peptydów, w której każdy peptyd znajduje się na odrębnym ziarnie. Poszczególne ziarna zawierające specyficznie wiążące peptydy oddziela się następnie na drodze fizycznej i ustala się sekwencję peptydu.

Podejście takie uzależnione jest od zdolności chemicznego zsyntetyzowania olbrzymiej statystycznej biblioteki peptydów oraz od sprzęgania ich do odpowiedniego układu umożliwiającego wykrywanie, wydzielanie i ustalanie struktury.

Dostarczony przez niniejszy wynalazek sposób rozwiązania tego problemu polega na podzieleniu ziaren żywicy na serie odrębnych równych próbek w każdym cyklu sprzęgania i przeprowadzeniu do końca reakcji każdej próbki żywicy z odrębnym aktywowanym aminokwasem. Po kompletnym sprzęganiu różne próbki żywicy dokładnie miesza się ze sobą, przemywa, odblokowuje, przemywa i ponownie rozdziela na próbki w celu przeprowadzenia nowego cyklu sprzęgania. W związku z tym żadne ziarno żywicy nie styka się w dowolnym cyklu sprzęgania z więcej niż jednym aminokwasem i po zakończeniu szeregu takich etapów każde ziarno będzie zawierać jedną unikatową sekwencję peptydową. Teoretycznie biblioteka peptydów wytworzona takim sposobem powinna być rzeczywiście statystyczna. Na dodatek uzyskuje się równomolowe ilości każdego rodzaju peptydu. Całkowita liczba permutacji, a więc liczba peptydów będzie zależna od liczby próbek i aminokwasów wybranych w każdym etapie sprzęgania, a także od całkowitej ilości etapów sprzęgania w syntezie (długości peptydu).

Nowy sposób równoczesnej syntezy wielkiej liczby peptydów nie tylko zapewnia rzeczywiście randomizowaną i równomolową bibliotekę, ale co jeszcze ważniejsze, zapewnia uzyskanie biblioteki ziaren stałofazowej żywicy z peptydami, w której każde ziarno zawiera tylko jedną unikatową sekwencję peptydową. Ta ostatnia właściwość jest pewna, gdyż w czasie każdego cyklu syntezy peptydów każde ziarno kontaktuje się z jednym tylko odrębnym aminokwasem w tym samym czasie, a każdą reakcję sprzęgania doprowadza się do końca. W rzeczywistości koncepcja¹ jedno ziarno - jeden peptyd ma decydujące znaczenie w powodzeniu ujawnionej metody.

Znając taki sposób syntezy zsyntetyzować można praktycznie dowolną bibliotekę peptydów o dokładnie ustalonym składzie. Tak np. w każdym etapie sprzęgania stosować można do 20 naturalnych L-aminokwasów w poszczególnych próbkach, albo też jeden lub kilka aminokwasów zastosować można w pewnych etapach sprzęgania.

Materiały i metody.

Synteza biblioteki peptydów.

Zsyntetyzowano wielką bibliotekę o strukturze X-X-X-X-e-Ala1-kwas aminokapronowyetylenodiamina-żywica (X= 19 spośród 20 powszechnych aminokwasów z wyjątkiem cysteiny w każdym cyklu sprzęgania). Jako wybrane w syntezie stałofazowe ziarna żywicy wybrano polidimetyloakrylamid (PDA) (Milligen, Inc. USA).

Chemizm i metoda syntezy peptydów z zastosowaniem takiej żywicy oparta była na pracy Athertona i Shepparda (1988, Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Ąpproach, IRL Press). 3 g żywicy (około 2 miliony ziaren) łagodnie mieszano z etylenodiaminą przez noc. Po dokładnym przemyciu z żywicą sprzęgnięto kwas aminokapronowy, a następnie β-alaninę, z blokowaniem Fmoc, ale bez rozszczepialnego łącznika. W następnych 5 etapach przeprowadzano randomizację, przy czym w każdym z etapów sprzęgania stosowano pojedynczo wszystkie 19 Fmoc-aminokwasów-OPfg, z wyjątkiem cysteiny. Po zakończeniu 5 etapów sprzęgania grupy moc usunięto w 20% piperydynie (v/v) w DMF. Grupy chroniące łańcuchy boczne usunięto w mieszaninie 90% (v/v) TFA, 1% (v/v) anizolu i 0,9% (v/v) etanoditiolu. Żywicę zobojętniono 10% diizopropyloaminą (w DMF) i przechowywano w DMF w 4°C.

Łącznik β-alanina-kwas aminokapronowy-etylenodiamina zawiera łącznie 11 atomów C i 4 atomy N, przy maksymalnej długości ramienia 17,6 A. W związku z tym, że w każdym z 5

168 354 23 statystycznych etapów sprzęgania zastosowano 19 różnych aminokwasów, teoretyczna liczba peptydów wynosi 19⁵, czyli 2 476 099 odrębnych pentapeptydów w aminokwasie.

Jak to zaznaczono wcześniej, ogólny schemat postępowania obejmuje syntezę wielkiej biblioteki statystycznych peptydów na pojedynczych ziarnach stałofazowej żywicy, tak że każde ziarno żywicy zawiera jeden rodzaj peptydu. Pojedyncze ziarno żywicy, które oddziaływuje z cząsteczką akceptorową, można następnie zidentyfikować i oddzielić na drodze fizycznej, po czym wyznaczyć można sekwencję aminokwasów w ligandzie peptydowym przeprowadzając degradację Edmana. Pwodzenie takiego sposobu postępowania wymaga w związku z tym dokładnej identyfikacji sekwencji peptydowej na pojedynczym ziarnie. Wykorzystując zautomatyzowany sekwenator białek (Model 477A-01 Pulsed Liquid Automazis Protein/Peptide Sequncer, Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia) z każdego ziarna odzyskiwano rytynowo 50-500 pmoli peptydów. Ponadto wcześniejsza analiza (DiMarch i inni, 1990, „Peptides: Chemistry, Structure and Bilogy, Proceedings of the Eleventh American Peptide Symposium, 9-14 lipca 1988, La Jolla, Ca., ESCOM. Leiden, str. 229-230) wyników sekwencji wykazała, że wydajność sprzęgania w syntezie peptydów w fazie stałej przekracza 98%.

Specyficzna identyfikacja i selekcja ligandów peptydowych z biblioteki.

Identyfikacji i selekcji konkretnych ligandów peptydowych ze statystycznej biblioteki można łatwo dokonać technikami immunologicznymi, takimi jak Enzyme Linked Immunoabsorbant Assay (ELISA), immunofluorescencja lub z wykorzystaniem ziaren immunomagnetycznych. W opisanych eksperymentach w układzie detekcji zastosowano techniki immunohistochemiczne. Jako specyficznie wiążące cząsteczki akceptorowe zastosowano w badaniach (i) streptawidynę, białko wiążące biotynę oraz (ii) anty-e-endorfmowe monoklonalne przeciwciało (MAb), wykorzystując układ biblioteki epitopów fuzyjnego faga włóknistego (Cwirla i inni; Devlin i inni, Sekcja 2 powyżej), ligandy peptydowe z powodzeniem zidentyfikowano z udziałem obydwu wymienionych cząsteczek akceptorowych.

Techniki immunohistochemiczne wykorzystano do wykrywania ziaren wiążących streptawidynę. Statystyczną bibliotekę ziaren z peptydami łagodnie wymieszano z kolejno dwukrotnie zwiększonymi ilościami wody destylowanej w celu rozcieńczenia DMF. Następnie ziarna dokładnie przemyto PBS i dodano żelatynę (0,1% v/v) w celu zablokowania ewentualnego niespecyficznego wiązania. Z kolei do ziaren dodano streptowidynę-fosfatazę alkaliczną (Pierce, Rockford, Illinois) w rozcieńczeniu 1:200000 i całość mieszano łagodnie przez jedną godzinę. Następnie ziarna dokładnie przemyto i dodano standardowy substrat fosforan 5-bromo-4-chloro-3indolilu/nitrobłękit tetrazolilowy (BCIP-NBT). Ziarna wraz z roztworem substratu przeniesiono na 15 polistyrenowych szalek Petriego (100 X 20 mm) i reakcję prowadzono przez okres czasu do 2 godzin. Ziarna ze związaną streptawidyną-fosfatazą alkaliczną zmieniły zabarwienie na ciemno błękitne, podczas gdy większość ziaren w bibliotece pozostała bezbarwna.

Oznaczanie powinowactwa ligandów peptydowych.

Powinowactwo ligandu peptydowego w wiązaniu z monoklonalnym przeciwciałem anty-βendorfiny określano w fazie roztworu. W próbie wiązania anty-e-endorfiny oznaczano inhibitowanie przez ligand peptydowy wiązania 5,0 nM [³H]-[Leu]enkefaliny (aktywność właściwa = 39,0Ci/mmol, New England Nuclear, Boston MA) z 125-200 ng/ml anty-e-endorfiny MAb w buforze 1,0 ml 40 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4, zawierającym 1,0 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej, 0,1% (v/v) Tween 20 i 0,05% (x/v) azydku sodowego. Wiązanie właściwe określano jako różnicę między wiązaniem zmierzonym w obecności i bez udziału 1,0 μΜ nieznaczonej [Leujenkefaliny. Związany radioligand wytrącono dodając 10-krotny nadmiar Protein-6 Sepharose (Pharmacia), a następnie prowadząc inkubację przez noc (23-24°C). Protein-6 Sepharose oddzielono przez odwirowanie (13 000 Xg przez 5 minut), po czym pastylki zdyspergowano w 250 μΐ 5% (v/v) kwasu octowego przed przeniesieniem do fiolek do pomiaru scyntylacji cieczy. Wielkości Kd (n = 3) ustalono na podstawie analizy nasycenia przy 5 stężeniach radioligandu (1,87 -30 nM) dla [³H] [Leu]enkefaliny, w każdym przypadku stosując po dwie próbki całkowicie i niespecyficznie wiążące. Zmierzona średnia wielkość Kd wynosiła 9,79±4,63 mM. Wykreślono krzywe inhibitowania ligandu peptydowego dla 8 stężeń peptydu w zakresie 400-krotnym. Wyniki wiązania w badaniach nasycenia i inhibitowania analizowano metodami ważonej-nieliniowej regresji z wykorzystaniem odpowiednich jednocentrowych modeli podanych przez Knappa i

168 354 innych (1990, J. Pharmacol. Exp. Ther. 255: 1278-1282). Wielkości K, dla stałych inhibitowania wiązania wyliczano metodą podaną przez Chenga i Prusoffa (1973, Biochem. Pharamcol. 22: 3099-3102). Każdą wielkość K, wyliczano z 3-4 niezależnych oznaczeń.

Wyniki.

Dokonano selekcji wielkiej biblioteki syntetycznych statystycznych peptydów (X-X-X-Xżywica, gdzie X oznacza 19 typowych aminokwasów (nie stosowano cysteiny), co odpowiada łącznie 19⁵- 2476099 permutacji). Porcja selekcjonowanej biblioteki zawierała około 2 miliony ziaren. W pierwszym stadium selekcjonowania, z samą streptawidyną-fosfatazą alkaliczną (patrz powyżej) około 75 ziaren zabarwiło się na różne odcienie; ziarna te oddzielono pod mikroskopem operacyjnym za pomocą mikromanipulatora. Każde ziarno przemyto następnie 8M chlorowodorkiem guanidyny w celu usunięcia związanego koniugatu enzymu streptawidyny. Z kolei każde ziarno osobno umieszczono na szklanym filtrze w pojemniku sekwenatora Applied Biosystem Protein Squencer (ABI). Sekwencje 28 spośród 75 ziaren podano w tabeli 1. Wszystkie te ziarna wykazują sekwencję konsensusu HPQ lub HPM. Mikrofotografia na fig. 7 ilustruje jak dodatnie (ciemno błękitne) ziarno można łatwo zidentyfikować w tle wielu tysięcy ujemnych (bezbarwnych) ziaren podczas selekcjonowania biblioteki ligandów peptydowych.

Tabela 1. Sekwencje peptydowe poszczególnych ziaren oddziaływujące ze streptawidyną³

HPQFV (b0,8,c1120)	GHPQG 250)	PLHPQ (2,5, 48)
HPQGP (0,,35, 60)	MTHHPQ	AIHPQ
HPQAG (0,5,	REHPQ 112)	AAHPQ (0,) , 476)
LHPQF (0,47, 286)	IQHPQ 01,^) 192)	dTPHPQ 1^^)
FHPQG (0,23, 72)	GNHPQ {0) 222)	WNHPM (0,5, 59)
GHPQN (0,4, 44)	TVHPQ CO) 96)	WTHPM (014, 2C)2)
THPQN (0,5, 44)	IGHPQ	WHPMA ^,β, 21)
QHPQG (0,3, 60)	WMH-1PQ C’, 7, 7δ 7)	dMNPMA 140)
IHPQG 02,1, 57)	GAHPQ

a - Ligandy te zidentyfikowano selekcjonując bibliotekę 2 467 099 (195) peptydów b - Pierwsza liczba w nawiasach oznacza procent przekłamania dla cyklu 5 degradacji Edmana (to znaczy ilość reszt 5 w cyklu 4/ilość reszt 5 w cyklu 5) c - Druga liczba w nawiasach wskazuje ilość peptydu (w pmolach) odzyskanego podczas sekwencjonowania d - Zidentyfikowano dwie sekwencje TPHPQ i dwie MHPMA; nie stwierdzono innych powtórek.

W celu potwierdzenia, że sekwencje konsensusu HPQ rzeczywiście wiążą się z centrum wiązania biotyny w cząsteczce streptawidyny, zsyntetyzowano LHPQF-£-Ala-kwas aminokapronowy-etylenodiamina-żywica (LHPQF-żywica). LHPQF-żywicę wymieszano następnie ze streptawidyną-fosfatazą alkaliczną w obecności biotyny o różnych stężeniach. Wyniki przedstawiono na fig. 8. Biotyna przy stężeniu 100 nM całkowicie zablokowała barwienie LHPQF-żywicy. Przy stężeniu 10 i 1,0 nM biotyna częściowo inhibituje barwienie, a przy stężeniu 0,1 nM nie wywiera wpływu na barwienie LHPQF-żywicy przez streptawidyną-fosfatazą alkaliczną. Badania

168 354 25 inhibitowania potwierdziły, że sekwencja konsensusu HPQ wiążą się z cetrum wiążącym biotynę w streptawidynie.

Przed wykorzystaniem tej samej biblioteki statystycznych peptydów do selekcjonowania z anty-P-endorifną MAb usunięto wszystkie błękitne ziarna, które zostały zabarwione samą streptawidyną-fosfatazą alkaliczną. Pozostałe ziarna zadano 8m chlorowodorkiem guanidyny w celu usunięcia jakiegokolwiek związanego białka. Taką przebadaną bibliotekę mieszano następnie z biotynylowaną anty-P-endorfiną MAb (anty-P-endorfmę, klon 3-E7, otrzymano jako produkt handlowy z Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) przez 16 godzin. Po dokładnym przemyciu przeprowadzono drugi etap ze streptawidyną-fosfatazą alkaliczną w celu wyzwolenia reakcji barwienia w ELISA. Przy takim selekcjonowaniu zidentyfikowano 6 peptydów z sekwencją konsensusu bardzo zbliżoną do ligandu rodzimego, Leu-enkafalina (YGGFL), a mianowicie YGGMV, YGALQ, YGGLS, YGGFA i YGGFQ. Zsyntetyzowano peptydowe analogi tego ligandu o różnych końcach karbonylowych, po czym ustalono ich powinowactwo (K,) z wykorzystaniem [³H]Leu-enkafaliny (New England Nuclear, Boston, Massachusetts) jako znaczonego ligandu oraz nieznaczonych peptydów jako ligandu konkurującego (próba anty-P-endorfinowa, patrz wyżej). Wyniki tych badań zestawiono w tabeli 2.

Tabela 2. Powinowactwo ligandów peptydowych w stosunku do monoklonalnego przeciwciała anty-p-endorfiny

Ki, nM

Koniec karboksylowy

Peptyd	-OH	-NH2	-PA-OH	-PA-NH2
aYGGFL	17,5 ± 3,2	27, 9± 2,3	17,1 ± 1,8	13,71 1,7
YGGFA	32,9 ± 2,0	72,0 ± 16,4	82,3 ± 8,8	93,6± 34,7
YGGFT	36,9 ± 7,7	65,2 ± 16,8	50,6 ±8,9	43,3±2,3
YGGFQ	15,0 ± 1,7	40,1 ± 6,0	39,4 ± 2,3	45,4111,6
YGGLS	726 ± 134	991 ± 52	916 ± 182	1150±247
YGGLQ	1980 ± 303	2910 ± 695	1470 ± 120	1910±504
YGGMV	8780 ± 1500	14000 ± 1110	5140 ± 885	716911010

a - YGGL oznacza [Leu⁵]enkafalmę, rodzimy ligand dla anty-P-endorfiny MAb.

Możliwość syntezowania pojedynczych peptydów na każdym ziarnie w połączeniu z układem czułej i specyficznej detekcji i selekcji ma decydujące znaczenie w powodzeniu metodologii według wynalazku. Taką nową metodologię określa się jako „selektywny proces. Pojedyncze ziarno wyselekcjonowane z biblioteki i poddane obróbce 8M chlorowodorkiem guanidyny (w celu usunięcia związanego białka) zostało skutecznie oczyszczone przy pozostawieniu peptydu kowalencyjnie związanego z żywicą i nadającego się do sekwencjonowania. Nowoczesne zautomatyzowane sekwentory peptydów umożliwiają sekwencjonowanie peptydów przy stężeniach zaledwie 5lOpmol. Ponadto błękitny barwnik, który nieodwracalnie wiąże się z ziarnem, nie wpływa na sekwencjonowanie. W czasie każdego cyklu sprzęgania z randomizacją usiłowano wszelkimi sposobami zoptymalizować metodologię syntezy, w tym stosując duży nadmiar N«ć -Fmocaminokwasów. Analiza przekłamań wstępnych danych sekwencjonowania wyraźnie wykazała, że wydajność sprzęgania w reakcjach syntezy chemicznej przekracza 98%.

168 354

W związku z tym, że zabarwione ziarna wyróżniają się w tle ziaren bezbarwnych (patrz fig. 7), praktycznie bez problemu można przeprowadzić selekcję 2 milionów ziaren pod mikroskopem operacyjnym na serii 10-15 szalek Petriego i wybrać reaktywne ziarna do sekwencjonowania. Oszacować można również względne powinowactwo różnych ligandów oceniając względną intensywność zabarwienia każdego dodatniego ziarna. Taka właściwość umożliwia wybrać ziarna o określonej intensywności zabarwienia do sekwencjonowania.

Devlin i inni (1990, Science 259: 404-406, sekcja 2, powyżej), donieśli o istotności sekwencji HPQ, HPM i HPN w 20 Ugandach wiążących streptawidynę, wydzielonych techniką fuzyjnego włóknistego faga. Wśród tych 20 izolatów 15 zawierało sekwencje konsensusu HPQ, 4 - sekwencję HPM, a jeden sekwencję HPN. Jest interesujące, że z biblioteki peptydów wydzielono 28 różnych peptydów, z których 23 zawierało sekwencję konsensusu HPQ, a 5 zawierało sekwencję konsensusu HPM (tabela 1). Okazało się, że położenie sekwencji HPQ/HPM w pentapeptydzie nie ma znaczenia w wiązaniu streptawidyny. Spośród wszystkich zidentyfikowanych pentapeptydów z sekwencjami HPQ lub HPM tylko dwie były powtórzone (TPHPQ i MHPMA). Stanowi to wyraźny kontrast w porównaniu z wynikami podanymi przez Devlina i innych, patrz wyżej, w przypadku których w 20 izolatach stwierdzono liczne powtórki, co sugeruje iż w takiej metodzie biosyntezy następuje zakłócenie selekcji.

W składzie anty-e-endorfiny zidentyfikowano 6 peptydów z sekwencjami bardzo zbliżonymi do wykazywanej przez rodzimy ligand YGGFL (tabela 2). Są to wyniki zbliżone do uzyskanych techniką fuzyjnego włóknistego faga, w której wykorzystano to samo monoklonalne przeciwciało (klon 3-E7) (Cwirla i inni, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-6382, patrz wyżej). Jakkolwiek biblioteka peptydów zawierała mniej sekwencji ligandów niż uzyskali ich Cwirla i inni, 50% uzyskanych ligandów wykazywało o wiele większe powinowactwo do przeciwciała niż jakikolwiek ligand wyselekcjonowany techniką fagową.

Przykład IV. Ograniczona bliblioteka peptydów'.

W innej serii doświadczeń wynalazek niniejszy sprawdzono z innym układem przeciwciał, w którym epitop zlokalizowany został raczej w środku łańcucha peptydowego niż na końcu N (jak w przypadku β-endorfiny). Zastosowanym przeciwciałem było monoklonalne przeciwciało peptydowe anty-v-mos (anty-v-mos MAb) (patrz powyżej). Przeciwciało to uzyskano uodporniając myszy peptydem 12 aminokwasów (LGSGGFGSVYKA) odpowiadającym resztom 100-111 produktu onkogenu v-mos. Peptyd skoniugowano z białkiem stanowiącym nośnik przed uodpornianiem. W teście ELISA taki anty-v-mos MAb wykrywa homologiczną sekwencję produktów genów v-mos, MOS, neu/HER-1 i HER-2.

Materiały i metody.

Wykorzystując dostępny w handlu układ wieloszpilkowy (Geysen i inni, 1986, Mol. Immunol. 23: 709-715) zestawu do mapowania epitopu (Cambride Research Biochemical, Boston) w celu syntetyzowania nakładających się peptydów (zestawów tetrapeptydów, pentapeptydów i heksapeptydów), epitop peptydu v-mos o 12 aminokwasach, rozpoznawany przez anty-v-mos MAb, zmapowano z sekwencją pentapeptydową (FGSVY) (to znaczy resztami 6-10 dodekapeptydu v-mos).

W eksperymencie wykorzystano ograniczoną statystyczną bibliotekę, w której celowo pominięto aminokwasy, walinę i serynę, występujące w epitopie v-mos. Kompozycja tej ograniczonej statystycznej biblioteki była następująca: G-X-X-X-X-Xy3-Ala-kwas aminokwapronowy-etylenodiamina-żywica, gdzie X = Glu, Pro, Asn, Phe, His, Thr, Lys, Leu, Gly, Tyr, Ala, Met, Arg, Trp. Wybrano tych 14 aminokwasów, z pominięciem waliny i seryny, przy czym w tym celu, aby obecne były wszystkie boczne grupy funkcyjne, (i) wybrano Asn, a nie Gin, (ii) wybrano Glu a nie Asp; (iii) wybrano Thr a nie Ser; (iv) wybrano Leu a nie lei lub Val; oraz (v) wybrano Met a nie Cys. W związku z tym, że w każdym z 5 etapów statystycznego sprzęgania wybrano 14 aminokwasów, teoretyczna ilość peptydów wynosiła 14⁵, co odpowiadało 537 824 indywidualnym peptydom.

Linię komórek hybrydomy wytwarzającą monoklonalne przeciwciała anty-v-mos otrzymano z Microbiological Associates Inc., Maryland (Hybridoma No. 165-28E7, SCRF 354, partia nr 165-119).

Powinowactwo ligandu peptydowego względem anty-v-mos mAb wyznaczano w próbie wiązania w fazie roztworu z wykorzystaniem peptydu [³H]acetylo-v-mos ([³H]Ac-v-mos) jako radioli168 354 gandu. Radioligand otrzymano w wyniku N-końcowego acetylowania peptydu v-mos przed odblokowaniem łańcuchów bocznych równomolową ilością [³H]octanu sodowego (aktywność właściwa = 2,52 Ci/mol, New England Nuclear, Boston, MA). Produkt [³H]Ac-v-mos, który oddzielono od nieprzereagowanego peptyd v-mos na drodze HPLC z odwróceniem faz, wykazywał aktywność właściwą 2,50 Ci/mol. Powinowactwo wiązania [³H]Ac-v-mos względem anty-v-mos MAb ( = 10 pg/ml) wyznaczano w 1,0 ml buforu PBS-żelatyna (0,05% żelatyny w PBS) w 23-24 °C po inkubacji przez 3 godziny. Wiązanie właściwe zdefiniowano jako różnicę między wiązaniem [³H]Acv-v-mos w obecności (niespecyficzne) lub przy braku (pełne) 100 pM nieznaczonego peptydu v-mos dla każdego stężenia [³H]Ac-v-mos. Związany radioligand oddzielono na drodze wirowania stosując 10-krotny nadmiar (zdolność wiązania względem stosowanej immunoglobuliny) Protein-6 Sepharose (Pharmacia) w celu wytrącenia przeciwciała. Analiza wiązania nasycenia dla 5 oznaczeń w zakresie stężeń 125-5000 nM wykazała, że [³H]Ac-v-mos związał się z anty-v-mos mAb, przy czym stała Kd wynosi 850±160nM. Powinowactwo wiązania ligandów peptydowych wyznaczono w badaniach inhibitowania wiązania przy siedmiu stężeniach ligandu peptydowego konkurującego z 10pg/ml anty-v-mos MAb z 20nM [³H]Ac-v-mos, w warunkach opisanych powyżej. Ponad 50% całkowitego wiązania było specyficzne w badaniach inhibitowania. Stałe nasycenia i inhibitowania wiązania wyznaczano dla jednocentrowego wiązania metodą regresji nieliniowej , jak to opisano uprzednio (Knapp i Yamamura, 1990, Life Sci 46: 1457-1463).

Wyniki.

Około 230 000 ziaren poddano selekcji za pomocą koniugatu anty-v-mos-fosfataza alkaliczna. W związku z tym zbadano mniej niż 43% permutacji. Po inkubacji z substratem około 50 ziaren zabarwiło się na intensywnie niebieski kolor. 24 spośród tych ziaren oddzielono na drodze fizycznej, po czym w 11 z nich ustalono sekwencje aminokwasów. Dodatkowo do sekwencjonowania wybrano przypadkowo 17 bezbarwnych ziaren.

Wyniki sekwencjonowania ligandu anty-v-mos zamieszczono w tabeli 3. W związku z tym, że ta biblioteka peptydów celowo nie zawierała waliny i seryny, nie stanowi zaskoczenia iż żadna z 11 sekwencji ligandów peptydowych nie przypomina rodzimego epitopu (FGSVY). Jakkolwiek Iw 11 ligandach peptydowych nie występowały powtórki, ich sekwencje nie były przypadkowe. W sekwencjach tych często występuje arginina i tyrozyna. Ponadto co najmniej jedna, a czasami dwie argininy występują w pozycji drugiej/trzeciej każdego z ligandów peptydowych. Z drugiej strony ujemne ziarna wybrane przypadkowo nie wykazują żadnego wspólnego wzoru sekwencji aminokwasów. Jakkolwiek wielkość próbki jest ograniczona, zgodność z2 dopasowywania statystycznego sekwencji z ujemnych ziaren nie była znacząca (z2 = 18,27, df = 13, P = 0,15), co wskazuje na brak ewidentnego nierównomiernego rozkładu aminokwasów dla nie zabarwionych ziaren statystycznych peptydów.

168 354

Tabela 3. Sekwencje peptydów z poszczególnych ziaren oddziaływujące z monoklonalnym przeciwciałem anty-v-mos

A.	Ziarna	interaktywne
	GRRGME	GRYMPK
	GRRPYG	GFRHMA
	GRRAYE	GFRYHN
	GRREGP	GHRYFH
	GRYAKH GRKTYY	GWREKE
B.	Ziarna	nie-interaktywne
	GKELAG	GFEKHP
	GPYLMW	GWGAYP
	GTKMNF	GAARPP
	GEKMEF	GLGGME
	GYEEPK	GRLNTL
	GKKPNP	GMTHAY
	GEYAPP	GPYGMA
	GGFMEF GPKFMA	GHYNNL

Pewne z dodatnich Ugandów zsybtetyzowabo i ich powinowactwo względem abty-v-mos wyznaczono w próbach wiązania w fazie roztworu. Wyniki badań zestawiono w tabeli 4.

W tabeli 4 zestawiono powinowactwa wiązania epitopu v-mos (ustalone na podstawie mapowania epitopu) względem monoklonalnego przeciwciała anty-v-mos. Przedstawiono również wpływ zmiany końca karboksylowego. W tabeli 4b zestawiono powinowactwa wiązania mimotopów zidentyfikowanych z biblioteki peptydów nie zawierających szeregu aminokwasów występujących w epitopie v-mos. Pewne badane ligandy zawierały β-alaniboamid, w celu symulowania struktury zidentyfikowanego ligandu, z którym na ziarnie łączy się przeciwciało.

Tabela 4. Powinowactwo wiązania ligandu peptydowego z antyv-mos MAb

Peptyd	Ki, μΜ
A. LGSGGFGSVYKA (peptyd v-mos)	3,2 ± 0,4
GFGSVY-NH2 (epitop v-mos)	246 - 337
GFGSVy-OH	> 1000
GFGSVY-pA-NH2	409 - 442
GFGSVY-PA-OH	529 - 770
B GRRAYE-OH	6,79 ± 2,31
GRRAYE-NH2	24,70 ± 7,00
GRRAYE-PA-OH	15,10 ± 0,50
GRRAYE-PA-NH2	9,02 - 20,40
GRRGME-OH	> 100
GRRGME-PA-NH2	24,00 ± 8,40
GRREGP-PA-NH2	26,90 ± 6,20
GRRPYG-OH	> 1000
GRRPYG-PA-NH2	20,50 ± 4,50

Powinowactwo najlepszego mimotopu anty-v-mos z tabeli 4 jest około 2,5 razy mniejsze niż powinowactwo peptydu rodzimego. Jakkolwiek żaden z ligandów peptydowych nie wykazywał tak niskiej wielkości K, jak rodzimy ligand v-mos, wyniki wyraźnie wskazują, że stosując statystyczną bibliotekę nie zawierającą pewnych aminokwasów występujących w rodzimym epitopie zidentyfikować można szereg strukturalnie różnych mimotopów wykazujących powinowactwo względem cząsteczki akceptorowej, to znaczy anty-v-mos.

Dyskusja.

Anty-v-mos stosowany w tych badaniach wykazywał stosunkowo niskie powinowactwo względem peptydu v-mos (immunogenu). Seryna i walina były obecne w liniowym epitopie v-mos (FGSVY), ale zostały celowo pominięte w stosowanej sekwencjonowanej bibliotece; pomimo to sposób umożliwił określenie liniowego mimotopu o całkowicie odmiennej sekwencji i składzie aminokwasowym, ale o porównywalnym powinowactwie względem przeciwciała. Ilustruje to wyraźnie złożoność, ale również i uniwersalność oddziaływań makrocząsteczkowo-peptydowych.

PrzykładV. Selektywnie rozszczepialny łącznik: ONb.

Wytworzono i zbadano zestaw 4 peptydów zawierających UV-rozszczepialny łącznik ONb (patrz powyżej).

Materiały i metody.

Następujące 4 peptydy wytworzono na dwóch żywicach z wykorzystaniem standardowych technik syntezy w fazie stałej (patrz powyżej):

i) Fmoc-Trp-Tyr(o-tert-b/Bu)-Phe-ONb-eAla-ACA-EDA-PepSyn K ii) TRP-Tyr-Phe-ONb-eAla-ACA-EDA-PepSyn K iii) Fmoc-Typ-Tyr(0-tert-Bu)-Phe-ONb-eAla-ACA-4-MBHA iv) T rp-T yr-Ohe-ONb-β Ala-AC A-4-MBHA

Każdy z peptydów napromieniowano przez 1-3 godziny światłem nadfioletowym (UV) i widzialnym (VIS) w 0,3 ml wody lub mieszaniny 3/7 chloroetanol-dichlorometan. Łącznie przeprowadzono i oceniono 16 doświadczeń.

Po ekspozycji ciecze znad osadu odsączono, liofiliowano i ponownie rozpuszczono w równych ilościach MeOH (0,3 ml). Produkty analizowano metodą HPLC.

Wyniki.

Analiza HPLC wyraźnie wykazała, że żaden tripeptyd nie uwalnia się przy naświetlaniu VIS w wodzie oraz prawie całkowite uwalnianie tripeptydu przy naświetlaniu UV przez 1 godzinę.

W szczególności peptyd (i) w wodzie ulegał rozszczepieniu do pojedynczego produktu. W pewnych przypadkach zaobserwowano eluowanie dwóch produktów z HPLC. Przy dłuższych czasach napromieniowania (UV) co najmniej w kilku przypadkach zaobserwowano wzajemną konwersję dwóch produktów.

Dyskusja.

Łącznik wrażliwy na UV wyraźnie działa uwalniając peptyd w roztworze wodnym. Czas ekspozycji 1 godzina wystarcza do uzyskania niekompletnego uwolnienia peptydu.

Wyniki wskazują ponadto, że żywica poliamidowa jest stabilna i kompatybilna z układami wodnymi.

(X)_m— Ą—(X)

(X)_m /B-(X)_n-A(X)m ! !

\B-(X)_n- A—(X)_n

Fig. 2

Fig. 3

Fig. 5

168 354

Fig. 6

Fig. 7

Fig. 8 w-®

	s * '	V * »	*

AW~® sw-® vw-® (mieszanie, przemywacie, odblokowanie, przemywanie)

AAW“® SAW^-® VAW-0

ASW-0 SSW-® VSW-®

AVW -® SVW -0 VVW -0 (mieszanie, przemywanie, odblokowanie, przemywanie)

A

AAAW-®	SAAW-®	VAA W-®
AASW-®	S ASW-®	VASW~®
AAVW-®	SAVW-®	VAVW-@
ASAW-®	SSAW-0	VSAW-@
ASSW-0	SSSW-®	VSSW-®
ASVW-®	ssvw-®	vsvw-®
AVAW-®	SVAW-®	WAW-®
AVSW”®	s vsw-®	WSW-®
AWW-®	sww-0	vww-®

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,50 zł

Claims (12)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania statystycznej biblioteki biooligomerów na drodze syntezy chemicznej, w której oligomery syntetyzuje się przez sukcesywne sprzęganie różnych rodzajów merów z oligomerami związanymi ze stałym nośnikiem, znamienny tym, że (a) dostarcza się co najmniej tyle próbek stałofazowego nośnika, ile różnych merów biooligomerów ma być dodanych, lecz co najmniej dwie, (b) oddzielnie do próbek stałofazowego nośnika wprowadza się zestaw merów, tak że do każdej próbki wprowadzany jest jeden mer, (c) sprzęga się całkowicie mery z zasadniczo wszystkimi centrami stałofazowego nośnika, (d) stwierdza się kompletność sprzęgania wytworzonej kombinacji stałofazowy nośnik/nowy mer oraz, w razie potrzeby, wymusza się kompletność reakcji, (e) dokładnie miesza się próbki kombinacji stałofazowy nośnik/nowy mer, i powtarza się powyższe etapy (a) - (e) wymaganą ilość razy, po czym usuwa się grupy blokujące, pozostawiając każdy biooligomer przyłączony do stałofazowego nośnika.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się stałofazowy nośnik wybrany z grupy obejmującej żywicę polistyrenową, żywicę polihipe, żywicę poliamidową oraz żywicę polidimetyloakryloamidową.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako stałofazowy nośnik stosuje się polidimetyloakryloamid.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako stałofazowy nośnik stosuje się żywicę polistyrenową szczepioną glikolem polietylenowym.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako stałofazowy nośnik stosuje się krzemionkę.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się stałofazowy nośnik zawierający łącznik.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się łącznik wybrany z grupy obejmującej kwas aminomasłowy, kwas aminokapronowy, kwas 7-aminoheptanowy i kwas 8-aminokaprylowy.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako łącznik stosuje się glikol etylenowy.
9. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako łącznik stosuje się kwas aminokapronowy.
10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że podczas wytwarzania statystycznej biblioteki biooligomerów w co najmniej jednym etapie ten sam mer sprzęga się ze wszystkimi stalofazowymi nośnikami oraz w co najmniej jednym innym etapie co najmniej dwa różne mery oddzielnie sprzęga się z co najmniej dwoma próbkami stałofazowego nośnika.
11. 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etapy (a) - (e) powtarza się jeden raz.
12. 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że powtarza się więcej niż jeden raz etapy (a) - (e).