PL181614B1

PL181614B1 - Method of obtaining l-lysine by a fermentation process

Info

Publication number: PL181614B1
Application number: PL94314852A
Authority: PL
Inventors: Hiroyuki Kojima; Yuri Ogawa; Kazue Kawamura; Konosuke Sano
Original assignee: Ajinomoto Kk
Priority date: 1993-12-08
Filing date: 1994-11-28
Publication date: 2001-08-31
Also published as: RU2204605C2; EP0733710A4; AU690168B2; HUT74961A; EP0733710A1; SK280629B6; SK71396A3; BR9408288A; EP2017348A1; AU1077095A; DE69435191D1; ES2235169T3; JPH11285381A; KR100345592B1; KR960706562A; ATE423206T1; EP1477565B1; ATE287961T1; PL314852A1; JP3132497B2

Abstract

1 . DNA kodujacy syntaze dihydropikolinianow a pochodzaca z bakterii nalezacej do rodzaju Escherichia zawierajacy mutacje, po której syntaza nie jest hamowana na zasadzie sprzezenia zwrotnego przez L-lizyne, znam ienny tym , ze zaw ie- ra mutacje wybrana sposród grupy skladajacej sie z: - mutacji zastepujacej reszte alaniny w pozycji 81 reszta waliny, - mutacji zastepujacej reszte histydyny w pozycji 118 reszta tyrozyny, - mutacji zastepujacej reszte alaniny w pozycji 81 reszta waliny i reszte histydyny w pozycji 118 reszta tyrozyny, liczac od konca N sekwencji aminokwasowej syntazy dihydropikolinianowej zdefiniowanej w sekwencji nr 4 w Liscie Sekwencji oraz - mutacji zastepujacej reszte aminokwasowa odpowiadajaca reszcie alaniny w pozycji 81 reszta waliny, - mutacji zastepujacej reszte aminokwasowa odpowiadajaca reszcie histydyny w pozycji 118 reszta tyrozyny, oraz - mutacji zastepujacej reszte aminokwasowa odpowiadajaca reszcie alaniny w pozycji 81 reszta w aliny i reszte am inok- w asowa odpow iadajaca reszcie histydyny w pozycji 118 reszta tyrozyny. 3. Bakteria nalezaca do rodzaju Escherichia zawierajaca DNA kodujacy syntaze dihydropikolinianowa pochodzacy z bakterii nalezacej do rodzaju Escherichia, przy czym DNA zawiera mutacje, po której syntaza nie jest hamowana na zasadzie sprzezenia zwrotnego przez L-lizyne, znamienna tym, ze zawiera DNA z m utacja wybrana sposrod grupy skladajacej sie z: - mutacji zastepujacej reszte alaniny w pozycji 81 reszta waliny, - mutacji zastepujacej reszte histydyny w pozycji 118 reszta tyrozyny, - mutacji zastepujacej reszte alaniny w pozycji 81 reszta waliny i reszte histydyny w pozycji 118 reszta tyrozyny, liczac od konca N sekwencji aminokwasowej syntazy dihydropikolinianowej zdefiniowanej w sekwencji nr 4 w Liscie Sekwencji oraz - mutacji zastepujacej reszte aminokwasowa odpowiadajaca reszcie alaniny w pozycji 81 reszta waliny, - mutacji zastepujacej reszte aminokwasowa odpowiadajaca reszcie histydyny w pozycji 118 reszta tyrozyny, oraz - mutacji zastepujacej reszte aminokwasowa odpowiadajaca reszcie alaniny w pozycji 81 reszta w aliny i reszte am inok- wasowa odpow iadajaca reszcie histydyny w pozycji 118 reszta tyrozyny. PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest DNA kodujący syntazę dihydropikolinianową, bakteria zawierająca DNA kodujący syntazę dihydropikolinianową oraz sposób wytwarzania L-lizyny. DNA kodujący syntazę dihydropikolinianowązawiera mutację, po której syntaza nie jest hamowana na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę.

We wcześniejszych badaniach, przy wytwarzaniu L-lizyny metodą fermentacji, do poprawy wydajności wytwarzania stosowano szczep mikroorganizmu wyizolowany ze środowiska naturalnego lub sztuczny zmutowany szczep otrzymany z takiego szczepu mikroorganizmu. Znana jest duża liczba sztucznych zmutowanych szczepów wytwarzających L-lizynę. Większość nich jest zmutowanymi szczepami odpornymi na S-2-aminoetylocysteinę (AEC), i należą one do rodzajów Brevibacterium, Corynebacterium, Bacillus lub Escherichia. Ponadto, ujawniono różne techniki zwiększania wytwarzania aminokwasów, na przykład przez wykorzystanie transformacji z zastosowaniem zrekombinowanego DNA (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 278 756).

W odniesieniu do szczepów należących do rodzaju Escherichia, na przykład japońskie wyłożeniowe zgłoszenie patentowe numer 56-18596, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 346 170 oraz Applied Microbiology andBiotechnology, 15,227-231 (1982) opisują sposoby wytwarzania L-lizyny przy użyciu szczepu bakteryjnego, w którym wzmocniona jest syntaza dihydrodipikolinianowa (dalej w niniejszym opisie niekiedy określana skrótem „DDPS”). Jednakże, DDPS stosowana w tych przypadkach jest enzymem typu dzikiego, który podlega hamowaniu na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę. Nie uzyskano dostatecznie satysfakcjonującej wydajności wytwarzania L-lizyny. Nawiasem mówiąc, wspomniane powyżej AppliedMicrobiology andBiotechnology, 15,227-231 (1982) opisuje wytwarzanie 3 g/litr chlorowodorku L-lizyny z 75 g/litr glukozy, gdzie współczynnik zużycia (liczbę g L-lizyny wytwarzanej z 1 g cukru, lub jego postać procentową) obliczono na 0,04, lub 4%.

Z drugiej strony, publikacja koreańskiego opisu patentowego numer 92-8382 opisuje sposób wytwarzania L-lizyny z zastosowaniem bakterii należącej do Escherichia, do której wprowadza się DDPS podchodzącą z bakterii należącej do rodzaju Corynebacterium, o której wiadomo,

181 614 że nie podlega hamowaniu na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę (współczynnik zużycia: 17%). Jednakże, górna granica temperatury dla wzrostu bakterii należących do rodzaju Corynebacterium jest niższa o około 10 stopni niż górna granica temperatury dla wzrostu bakterii należących do rodzaju Escherichia. Wydaje się zatem, że hodowle należy prowadzić w obniżonej temperaturze, jeśli DNA kodujący DDPS pochodzącąz bakterii należącej do rodzaju Corynebacterium wprowadza się do bakterii należącej do rodzaju Escherichia w celu jej wykorzystania do wytwarzania L-lizyny. Dlatego też, przypuszcza się, że trudno jest wykazać zalety posiadane przez bakterię należącą do rodzaju Escherichia, takie jak wysoka temperatura wzrostu, wysoka szybkość wzrostu, jak również wysoka szybkość wytwarzania L-lizyny. Ogólnie rzecz biorąc, gdy ekspresji ulega gen pochodzący z organizmu heterologicznego, czasami następuje rozkład produktu ekspresji przez proteazę lub tworzenie nierozpuszczalnego ciała inkluzyjnego; w porównaniu z przypadkiem ekspresji genu homologicznego przewiduje się pod tym względem więcej trudności. Ponadto, gdy DNA kodujący DDPS pochodzącą z bakterii należącej do rodzaju Corynebacterium wprowadza się do bakterii należącej do rodzaju Escherichia w celu przemysłowego wytwarzania L-lizyny, konieczna jest bardziej ścisła regulacja w porównaniu do przypadku stosowania rekombinanta, do którego wprowadza się gen homologiczny, zgodnie z wytycznymi dotyczącymi rekombinowanego DNA.

Nawiasem mówiąc, syntaza dihydrodoipikolinianowa (DDPS) jest enzymem do dehydratacji i kondensacji semialdehydu asparaginowego i kwasu pirogronowego, prowadzącym do zsyntezowania kwasu dihydrodipikolinowego. Reakcja ta rozpoczyna szlak biosyntezy L-lizyny w biosyntezie aminokwasów z rodziny kwasu asparaginowego. Wiadomo, że enzym ten pełni rolę ważnego miejsca regulacji, tak jak kinaza asparaginianowa w bakteriach należących do rodzaju Escherichia.

W E. coli (Escherichia coli) DDPS koduje gen nazwany dapA. dapA sklonowano, i określono również jego sekwencję nukleotydową (Richaud, F. i in., J. Bacteriol., 297 (1986).

Z drugiej strony, kinaza asparaginianowa (dalej w niniejszym opisie niekiedy określana skrótem „AK”) jest enzymem katalizującym reakcję przekształcania kwasu asparaginowego w kwas β-fosfoasparaginowy, który służy jako główny enzym regulujący w układzie aminokwasów z rodziny kwasu asparaginowego. AK z E. coli występuje w postaci trzech typów (AKI, AKII i AKIII), z których dwa są enzymami tworzącymi kompleks z dehydrogenazą homoserynową(dalej w niniejszym opisie niekiedy określaną skrótem „HD”). Jednym ze złożonych enzymów jest AJI-HDI kodowany przez gen thrA, a AKII-HDII kodowany przez gen metLM. AKI podlega zgodnej supresji przez treoninę i izoleucynę i hamowaniu przez treoninę, podczas gdy AKII podlega supresji przez metioninę.

W przeciwieństwie, wiadomo, że tylko AKIII jest prosto działającym enzymem, będącym produktem genu oznaczonego lysC, i podlega supresji i hamowaniu na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę. Stosunek ich aktywności wewnątrzkomórkowych wynosi AKI: AKII: AKIII = około 5:1:4.

Jak opisano powyżej, DDPS pochodząca z bakterii należących do rodzaju Corynebacterium nie podlega hamowaniu na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę. Jednakże, gdy wprowadza się ją do bakterii należącej do rodzaju Escherichia dla wykorzystania do wytwarzania L-lizyny, wyłania się problem z temperaturą hodowli. Oczekuje się, że L-lizyna może być wydajnie wytwarzana przez fermentację przy użyciu bakterii należącej do rodzaju Escherichia, jeśli można otrzymać zmutowany enzym DDPS lub AKIII pochodzący z bakterii należącej do rodzaju Escherichia, który nie podlega hamowaniu na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę. Jednakże, brak jest wcześniej literatury opisującej taki zmutowany enzym DDPS, a chociaż istnieje jedno doniesienie o zmutowanym enzymie AKIII (Boy, E. i in., J. Bacteriol., 112, 84 (1972), nieznane są żadne przykłady, które sugerują, że taki zmutowany enzym może poprawić wydajność wytwarzania L-lizyny.

Istota wynalazku

Niniejszego wynalazku, którego celem jest otrzymanie DDPS i AKIII pochodzących z bakterii należących do rodzaju Escherichia z wystarczająco zniesioną wrażliwością na hamo181 614 wame na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę i dostarczenie sposobu wytwarzania L-lizyny przez fermentację, bardziej ulepszonego niż sposoby uprzednie, dokonano biorąc pod uwagę wyżej wspomniane punkty widzenia.

W wyniku pracochłonnych i powtarzanych badań dla zrealizowania opisanego powyżej celu, autorom niniejszego wynalazku udało się otrzymać DNA kodujący DDPS pochodzącą z bakterii należącej do rodzaju Escherichia, której wrażliwość na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę jest wystarczająco zniesiona. DNA kodujący DDPS pochodzącą z E. coli, której wrażliwość na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę jest wystarczająco zniesiona, określa się niekiedy w niniejszym opisie jako zmutowany dapA lub dapA*.

Ponadto, autorzy wynalazku utworzyli bakterię należącą do rodzaju Escherichia, zawierającą zmutowany dapA i kinazę asparaginianową, która posiada zniesioną wrażliwość na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę. DNA kodujący kinazę asparaginianową pochodzącą z E. coli, której wrażliwość na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego jest wystarczająco zniesiona, określa się niekiedy w niniejszym opisie jako lysC lub lusC*.

Autorzy wynalazku utworzyli ponadto bakterię należącą do rodzaju Escherichia, zawierającą zmutowany dapA i zmutowany lysC. Stwierdzono również, że przez prowadzenie hodowli wyżej wspomnianej bakterii należącej do rodzaju Escherichia w korzystnym podłożu można wytwarzać i akumulować w hodowli znaczące ilości L-lizyny.

Autorzy wynalazku stwierdzili ponadto, że wydajność wytwarzania L-lizyny można dalej poprawić przez wzmocnienie innych genów układu biosyntezy L-lizyny bakterii należącej do rodzaju Escherichia, zawierającej zmutowany dapA i zmutowany lysC.

A zatem, niniejszy wynalazek opiera się na DNA kodującym syntazę dihydrodipikolonianową pochodzącą z bakterii należącej do rodzaju Escherichia, posiadającą mutację znoszącą wrażliwość na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę. Przykładem mutacji mającej na celu zniesienie wrażliwości na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę jest mutacja wybrana z grupy składającej z mutacji prowadzącej do zastąpienia reszty alaniny w pozycji 81 resztą waliny, mutacj i prowadzącej do zastąpienia reszty histydyny w pozycji 118 resztą tyrozyny i mutacji prowadzącej do zastąpienia reszty alaniny w pozycji 81 resztą waliny oraz zastąpienia reszty histydyny w pozycji 118 resztą tyrozyny, licząc od końca N sekwencji aminokwasowej syntazy dihydrodipikolinianowej zdefiniowanej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 w Liście Sekwencji.

Dalej, niniejszy wynalazek opiera się na bakterii należącej do rodzaju Escherichia, stransformowanej przez wprowadzenie do komórek DNA kodującego syntazę dihydrodipikolinianową pochodzącą z bakterii należącej do rodzaju Escherichia, posiadającą mutację prowadzącą do zniesienia wrażliwości na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę. Przykładem mutacji mającej na celu zniesienie wrażliwości na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę jest mutacjapro wadząca do zastąpienia reszty alaniny w pozycji 81 resztą waliny, mutacja prowadząca do zastąpienia reszty histydyny w pozycj i 118 resztą tyrozyny i mutacja prowadząca do zastąpienia reszty alaniny w pozycji 81 resztą waliny oraz zastąpienia reszty histydyny w pozycji 118 resztą tyrozyny, licząc od końca N sekwencji aminokwasowej syntazy dihydrodipikolinianowej zdefiniowanej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 w Liście Sekwencji.

Niniejszy wynalazek opiera się ponadto na wyżej wspomnianej bakterii należącej do rodzaju Escherichia, zawierającej kinazę asparaginianową, która również ma zniesioną wrażliwość na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę. Przykładem sposobu zapewnienia bakterii należącej o rodzaju Escherichia zawierającej kinazę asparaginianową, która ma zniesioną wrażliwości na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę jest sposób wprowadzania do komórek DNA kodującego kinazę asparaginianową III, pochodzącą z bakterii należącej do rodzaju Escherichia, posiadającą mutację prowadzącą do zniesienia wrażliwości na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę.

181 614

Przykładem mutacji kinazy asparaginianowej III mającej na celu zniesienie wrażliwości na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę jest mutacja prowadząca do zastąpienia reszty glicyny w pozycji 323 resztą kwasu asparaginowego, mutacja prowadząca do zastąpienia reszty glicyny w pozycji 323 resztą kwasu asparaginowego oraz zastąpienia reszty glicyny w pozycji 408 resztą kwasu asparaginowego, mutacja prowadząca do zastąpienia reszty argininy w pozycji 34 resztą cysteiny oraz zastąpienia reszty glicyny w pozycji 323 resztą kwasu asparaginowego, mutacja prowadząca do zastąpienia reszty leucyny w pozycji 325 resztąfenyloalaniny, mutacja prowadząca do zastąpienia reszty metioniny w pozycji 318 resztą izoleucyny, mutacja prowadząca do zastąpienia reszty metioniny w pozycji 318 resztą izoleucyny oraz zastąpienia reszty waliny w pozycji 349 resztą metioniny, mutacja prowadząca do zastąpienia reszty seryny w pozycji 345 resztąleucyny, mutacja prowadząca do zastąpienia reszty waliny w pozycji 347 resztą metioniny, mutacja prowadząca do zastąpienia reszty treoniny w pozycji 352 resztąizoleucyny, mutacja prowadząca do zastąpienia reszty treoniny w pozycji 352 resztą izoleucyny i zastąpienia reszty seryny w pozycji 369 resztą fenyloalaniny, mutacja prowadząca do zastąpienia reszty kwasu glutaminowego w pozycji 164 resztą lizyny oraz mutacja prowadząca do zastąpienia reszty metioniny w pozycji 417 resztą izoleucyny i zastąpienia reszty cysteiny w pozycji 419 resztą tyrozyny, licząc od końca N sekwencji aminokwasowej kinazy asparaginianowej III zdefiniowanej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 8 w Liście Sekwencji.

DNA kodujący syntazę dihydrodipikolinianowąpochodzącą z bakterii należącej do rodzaju Escherichia, posiadającą mutację prowadzącą do zniesienia wrażliwości na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę, i DNA kodujący kinazę asparaginianową III, posiadającą mutację prowadzącą do zniesienia wrażliwości na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę, mogą być zawarte kolejno w chromosomie bakterii należącej do rodzaju Escherichia, lub mogą być zawarte w komórkach w tym samym plazmidzie lub plazmidach oddzielnych. Ponadto, dopuszczalne jest również, aby jeden z poszczególnych DNA był zawarty w chromosomie, a drugi DNA był zawarty w plazmidzie.

Jeszcze dalej, niniejszy wynalazek opiera się na wyżej wspomnianej bakterii należącej do rodzaju Escherichia, w której wzmocniono gen reduktazy dihydrodipikolinianowej. Wzmocnienie genu reduktazy dihydrodipikollinianowej można uzyskać przez transformację zrekombinowanym DNA, skonstruowanym przez zligowanie genu reduktazy dihydrodipikolinianowej z wektorem ulegającym autonomicznej replikacji w komórkach bakterii należących do rodzaju Escherichia.

Niniejszy wynalazek opiera się dalej na wyżej wspomnianej bakterii należącej do rodzaju Escherichia, do której wprowadzono wzmocniony gen dehydrogenazy diaminopimelinianowej pochodzącej z maczugowca, takiego jak Brevibacterium lactofermentum. Wprowadzenie wzmocnionego genu dehydrogenazy diaminopimelinianowej pochodzącej z maczugowca można uzyskać przez transformację zrekombinowanym DNA skonstruowanym przez zligowanie genu z wektorem ulegającym autonomicznej replikacji w komórkach bakterii należących do rodzaju Escherichia. Jako przykłady maczugowców można podać wytwarzające kwas glutaminowy szczepy typu dzikiego i ich zmutowane szczepy wytwarzające inne aminokwasy, należące do rodzaju Corynebacterium lub rodzaju Brevibacterium. Konkretniej, przykładami maczugowców stosowanych dla celów niniejszego wynalazku s^Brevibacteriumflavum, Brevibacterium divaricatum, Corynebacterium glutamicum i Corynebacterium lilium, jak również Brevibacterium lactofermentum.

Niniejszy wynalazek opiera się ponadto bakterii należącej do rodzaj u Escherichia, w której zamiast wyżej wspomnianego genu dehydrogenazy diaminodipimelinianowej wzmocniono gen sukcynylazy tetrahydropikolinianowej i gen deacylazy sukcynylodiaminopimelinianowej.

Wzmocnienie tych genów można uzyskać przez transformacj ę poj edynczym zrekombinowanym

DNA lub dwoma DNA, skonstruowanymi przez zligowanie tych genów z tym samym wektorem lub różnymi wektorami, ulegającymi autonomicznej replikacji w komórkach bakterii należących do rodzaju Escherichia.

181 614

Niniejszy wynalazek dostarcza ponadto sposób wytwarzania L-lizyny obejmujący etapy hodowania w odpowiednim podłożu którejkolwiek z opisanych powyżej bakterii należących do rodzaju Escherichia, wytwarzanie i akumulowanie L-lizyny w jej hodowli i zbieranie L-lizyny z hodowli.

W tym opisie DNA kodujący DDPS lub AKIII, bądź DNA zawierający dodatkowo poza nimi promotor, niekiedy jest określany jako :gen DDPS” lub „gen ΑΚ1Π”. Ponadto, zmutowany enzym, który wykazuje zniesioną wrażliwość na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę i kodujący go DNA lub DNA zawierający poza nim promotor, niekiedy określa się po prostu jako odpowiednio „zmutowany enzym” i „zmutowany gen”. Ponadto, zwrot „wrażliwość na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę jest zniesiona” oznacza, że zniesienie wrażliwości jest wystarczaj ące, a całkowite zniesienie wrażliwości nie jest konieczne.

Niniejszy wynalazek zostanie szczegółowo wyjaśniony poniżej.

< 1 >DNA kodujący zmutowanąsyntazę dihydropikolinianową(DDPS) według niniejszego wynalazku

DNA kodujący zmutowaną DDPS według niniejszego wynalazku posiada mutację prowadzącą do zniesienia wrażliwości na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę DDPS kodowanej w DNA kodującym DDPS typu dzikiego. Przykładami DDPS są te pochodzące z bakterii należących do rodzaju Escherichia, a zwłaszcza DDPS pochodzące z E. coli. Przykłady mutacji DDPS prowadzących do zniesienia wrażliwości na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę są:

(1) mutacja prowadząca do zastąpienia reszty alaniny w pozycji 81 resztą waliny;

(2) mutacja prowadząca do zastąpienia reszty histy dyny w pozycji 118resztą tyrozyny; i (3) mutacja prowadząca do zastąpienia reszty alaniny w pozycji 81 resztą waliny i zastąpienia reszty histydyny w pozycji 118 resztą tyrozyny;

licząc od końcaN sekwencji aminokwasowej DDPS zdefiniowanej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 w Liście Sekwencji.

DNA koduj ący DDPS typu dzikiego nie podlega szczególnym ograniczeniom, z zastrzeżeniem, że koduje on DDPS pochodzącąz bakterii należącej do rodzaju Escherichia·, jego konkretnym przykładem jest DNA kodujący sekwencję aminokwasową zdefiniowaną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4, jego dalszym konkretnym przykładem jest sekwencja przedstawiona przez zasady o numerach 272-1147 w sekwencji zasad zdefiniowanej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 3. W sekwencjach tych, te posiadające mutację w sekwencji nukleotydowej powodującą opisane powyżej zastąpienie reszt aminokwasowych, są DNA kodującymi zmutowaną DDPS według niniejszego wynalazku. Zastosować można każdy kodon odpowiadający zmienionej reszcie aminokwasowej, niezależnie od jego rodzaju, pod warunkiem, że koduje on identyczną resztę aminokwasową. Ponadto, postuluje się aby posiadana DDPS różniła się nieznacznie sekwencją, w zależności od różnicy w gatunku bakteryjnym i szczepie bakteryjnym, jednakże, te posiadające zastąpienia, delecje i insercje reszt (y) aminokwasowych w pozycjach niezwiązanych z akty wnością enzymatyczną także są włączone w zmutowany gen DDPS według niniejszego wynalazku.

Sposób otrzymywania takiego zmutowanego genu jest następujący. Po pierwsze, DNA zawierający gen DDPS typu dzikiego lub gen DDPS posiadający innąmutację, poddaje się mutagenezie in vitro, a DNA po mutagenezie liguje się z DNA wektora dostosowanego do gospodarza otrzymując zrekombinowany DNA. Zrekombinowany DNA wprowadza się do mikroorganizmu gospodarza w celu otrzymania transformatorów. Jeśli spośród wyżej wspomnianych mutantów wyselekcjonuje się transformant, w którym zachodzi ekspresja, to znaczy, że zawiera on zmutowany gen. Alternatywnie, DNA zawierający gen DDPS typu dzikiego lub gen DDPS posiadający innąmutację można zligować w DNA wektora dostosowanego do gospodarza w celu otrzymania zrekombinowanego DNA. Zrekombinowany DNA poddaje się następnie mutagenezie in vitro, i zrekombinowany DNA po mutagenezie wprowadza się do mikroorganizmu gospodarza dla otrzymania transformantów. Jeśli spośród wyżej wspomnianych mutantów wyizoluje się transformant, w którym zachodzi ekspresja, to znaczy, że także zawiera on zmutowany gen.

Dopuszczalne jest również, że mikroorganizm, który wytwarza enzym typu dzikiego, poddaje się mutagenezie dla utworzenia zmutowanego szczepu, który wytwarza zmutowany enzym, a następnie ze zmutowanego szczepu otrzymuje się zmutowany gen. Alternatywnie, dla utworzenia zmutowanego szczepu, który wytwarza zmutowany enzym, mutagenezie można poddać transformanta, do którego wprowadzono zrekombinowany DNA zligowany z genem typu dzikiego. Gdy zrekombinowany DNA odzyska się następnie ze zmutowanego szczepu, zmutowany gen utworzony jest w wyżej wspomnianym DNA.

Przykładem czynnika do prowadzenia mutagenezy DNA in vitro jest hydroksyloamina i podobne czynniki. Hydroksyloamina jest chemicznym czynnikiem mutagennym, który powoduje mutację cytozyny do ty miny poprzez zamianę cytozyny w N⁴-hydroksycytozynę. Alternatywnie, gdy mutagenezie poddaje się sam mikroorganizm, mutagenezę prowadzi się przez zastosowanie napromieniowania światłem ultrafioletowym lub czynnika mutującego zazwyczaj stosowanego do sztucznych mutacji, takiego jak N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna lub kwas azotawy.

Nie występują żadne trudności, gdy jako dawcę DNA zawierającego gen DDPS typu dzikiego lub gen DDPS posiadający inną opisaną powyżej mutację stosuje się jakikolwiek mikroorganizm, z zastrzeżeniem, że jest to organizm należący do rodzaju Escherichia. Konkretnie, możliwe jest wykorzystanie tych mikroorganizmów, które opisano w książce napisanej przez Neidhardta i in. (Neidhardt, F.C. i in., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, tabela 1). Na przykład mogą to być szczep JM 109 i szczep MC 1061 E. coli. Gdy jako dawcę DNA zawierającego gen DDPS stosuje się dziki szczep mikroorganizmu, można otrzymać DNA zawierający gen DDPS typu dzikiego.

(1 ) Przygotowywanie genu DDPS typu dzikiego

Przykład przygotowywania DNA zawierającego gen DDPS zostanie opisany poniżej. Po pierwsze, E. coli posiadaj ącądapA typu dzikiego, na przykład szczep MC 1061, namnaża się do otrzymania hodowli. Namnażając opisany powyżej mikroorganizm, hodowlę można prowadzić zgodnie ze zwykłą metodą z wykorzystaniem podłoża stałego, jednak biorąc pod uwagę wydajność podczas zbierania bakterii, korzystne jest prowadzenie hodowli w podłożu płynnym. Można stosować podłoże, do którego dodaje się jedno lub więcej źródeł azotu, takich jak ekstrakt drożdżowy, pepton, ekstrakt mięsny, namok kukurydziany i wyciągu z soli lub pszenicy, z jedną lub więcej soli nieorganicznych, takich jak dwuwodorofosforan potasowy, wodorofosforan dwupotasowy, siarczan magnezowy, chlorek sodowy, chlorek magnezowy, chlorek żelazowy, siarczan żelazowy lub siarczan manganowy, a ponadto ewentualnie i odpowiednio dodane substancje cukrowe, witaminy i podobne. Właściwe jest, aby początkowe pH podłoża doprowadzić do 6-8. Hodowlę prowadzi się w ciągu 4-24 godzin w temperaturze 30-42°C, korzystnie w temperaturze około 37°C wykorzystując techniki głębokiej hodowli z napowietrzaniem i mieszaniem, hodowli z wytrząsaniem lub hodowli i stacjonarnej bądź podobne.

Tak otrzymaną hodowlę wiruje się, na przykład przez 3 000 obrotów na minutę w ciągu 5 minut, dla otrzymania osadu komórkowego szczepu MC 1061 E. coli. Z osadu komórkowego można otrzymać chromosomalny DNA wykorzystując, na przykład, metodę Saito i Miura (Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)) lub metodę K. S. Kirb/ego (Biochem. J. 64, 405 (1956)).

W celu wyizolowania genu DDPS z tak otrzymanego chromosomalnego DBA, przygotowuje się bibliotekę chromosomalnego DNA. Najpierw, chromosomalny DNA trawi się odpowiednim enzymem restrykcyjnym dla otrzymania różnych fragmentów. Można stosować szereg różnorodnych enzymów restrykcyjnych, jeśli stopień trawienia kontroluje się czasem reakcji trawienia i podobnymi parametrami. Na przykład, umożliwia się reagowanie Sau3AT z chromosomalnym DNA dla jego strawienia w temperaturze nie niższej niż 30°C, korzystnie w temperaturze 37°C, przy stężeniu enzymu 1 -10 jednostek/ml w ciągu różnych okresów czasu (1 minuta do 2 godzin).

Następnie otrzymane fragmenty DNA liguje się z DNA wektora ulegającego autonomicznej replikacji w komórkach bakterii należących do rodzaju Escherichia w celu przygotowania zrekombinowanego DNA. Konkretnie, enzymowi restrykcyjnemu, który tworzy terminalną

181 614 sekwencję nukleotydową komplementarną do utworzonej przez enzym restrykcyjny &/μ3ΑΙ użyty do strawienia chromosomalnego DNA, na przykład umożliwia się działanie na DNA wektora w warunkach temperatury nie niższej niż 30°C i stężenia enzymu 1-100 jednostek/ml w ciągu nie mniej niż 1 godziny, korzystnie wciągu 1-3 godzin, dla całkowitego jego strawienia, przecięcia i rozszczepienia. Następnie, w celu otrzymania zrekombinowanego DNA otrzymaną jak opisano powyżej mieszaninę fragmentów chromosomalnego DNA miesza się z rozszczepionym i przeciętym DNA wektora i umożliwia działanie ligazy DNA, korzystnie ligazy DNA T4, w warunkach temperatury 4-16°C przy stężeniu enzymu 1-100 jednostek/ml w ciągu nie mniej niż 1 godziny, korzystnie w ciągu 6-24 godzin.

Otrzymany zrekombinowany DNA stosuje się do transformacji mikroorganizmu należącego do rodzaju Escherichia, na przykład, pozbawionego DDPS zmutowanego szczepu, takiego jak szczep K-12 Escherichia coli, korzystnie szczep JE7627 (ponB704, dacB12, pfv⁺, tonA2, dapA, lysA, str, malA38, metBl, ilvH611, leuA371, proA3, lac-3, tsx-76) w celu przygotowania biblioteki chromosomalnego DNA. Transformację można przeprowadzić, na przykład, metodąD. M. Morrisona (Methods inEnzymology 68, 326 (1979)) lub metoda, w której na bakteryjne komórki biorców działa się chlorkiem wapnia dla zwiększenia przepuszczalności DNA (Mandel, M. i Higa, A., J. Mo. Biol., 53,159 (1970)). Szczep JET7627 dostępny jest w National Institute of Genetics (Mishima-shi, Shizuoka-ken, Japonia).

Szczep bakteryjny posiadający zrekombinowany DNA genu DDPS otrzymuje się ze szczepów posiadających zwiększoną aktywność DDPS lub szczepów otrzymanej biblioteki chromosomalnego DNA, w których auksotrofia wynikająca z braku genu DDPS ulega komplementacji. Na przykład, pozbawiony DDPS zmutowany szczep wymaga kwasu diaminopimelinowego. A zatem, gdy pozbawiony DDPS zmutowany szczep używa się jako gospodarza, fragment DNA zawierający gen DDPS można otrzymać przez wyizolowanie szczepu bakteryjnego, który stał się zdolny do wzrostu na podłożu nie zawierającym kwasu diaminopimelinowego i odzyskaniu zrekombinowanego DNA ze szczepu bakteryjnego.

Potwierdzenie faktu, że potencjalny szczep posiadający zrekombinowany DNA zawierający gen DDPS, aktualnie zawiera zrekombinowany DNA, w którym sklonowany jest gen DDPS, można uzyskać przez przygotowanie ekstraktu komórkowego z potencjalnego szczepu i przygotowanie z niego roztworu nieoczyszczonego enzymu dla potwierdzenia, że aktywność DDPS uległa zwiększeniu. Procedurę pomiaru aktywności enzymatycznej DDPS można przeprowadzić metodą Yugari'ego i in. (Yugari, Y. i Gilvarg, C., J. Biol. Chem., 240, 4710 (1962)).

Zrekombinowany DNA, w którym DNA zawierający gen DDPS wstawiono do DNA wektora, można wyizolować z opisanego powyżej szczepu bakteryjnego wykorzystując, na przykład, metodę P. Guerr/ego i in. (J. Bacteriol., 116,1064 (1973)) lub metodąD. B. Clewella (J. Bacteriol., 110., 667(1972)).

Przygotowanie genu DDPS typu dzikiego można także przeprowadzić przez przygotowanie chromosomalnego DNA ze szczepu posiadającego gen DDPS w chromosomie wykorzystując metodę Saito i Miura lub podobną i zamplifikowanie genu DDPS wykorzystując metodę reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) (patrz White, T. J. i in.; Trends Genet., 5, 185 (1989)). Startery DNA przeznaczone do stosowania w reakcji amplifikacji są komplementarne do obu końców 3' dwuniciowego DNA zawierającego cały lub częściowy region genu DDPS. Gdy amplifikuje się tylko częściowy region genu DDPS, konieczne jest zastosowanie takich fragmentów DNA jako starterów do przeprowadzenia wyszukiwania fragmentu DNA zawierającego cały region z biblioteki chromosomalnego DNA. Gdy zamplifikuje się cały region genu DDPS, roztwór reakcyjny PCR zawierający fragmenty DNA zawierające zamplifikowany gen DDPS poddaje się elektroforezie w żelu agarozowym, a następnie ekstrahuje się zamierzony fragment DNA. W ten sposób można odzyskać fragment DNA zawierający gen DDPS.

Startery DNA można odpowiednio przygotować na podstawie, na przykład, znanej sekwencji w E. coli (Richaud, F. i in., J. Bacteriol., 29Ί (1986)). Konkretnie, korzystne są startery, które mogązamplifikować region obejmujący 1150 zasad kodujących gen DDPS, i odpowiednie są dwa rodzaje starterów zdefiniowane w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1 i sekwen12

181 614 cji o numerze identyfikacyjnym: 2. Syntezę staterów można przeprowadzić stosując zwykłą metodę, takąjak metoda z wykorzystaniem fosforynoamidów (patrz Tetrahedron Letters, 22,1859 (1981)) przy użyciu komercjalnie dostępnego synezatora DNA (na przykład DNA Synthesizer Model 38OB produkowany przez Applied Biosystems Inc.). Ponadto, PCR można przeprowadzić stosując komercjalnie dostępny aparat do PCR ( na przykład DNA Thermal Cycler Model PJ2000 produkowany przez Takara Shuzo Co., Ltd.), stosując polimerazę DNA Tag (dostarczoną przez Takaza Shuzo Co., Ltd.), zgodnie z metodą ustaloną przez dostawcę.

w odniesieniu do genu DDPS zamplifikowanego metodą PCR, gdy jest on zligowany z DNA wektora ulegającego autonomicznej replikacji w komórkach bakterii należących do rodzaju Escherichia i wprowadzony do bakterii należących do rodzaju Escherichia, łatwe stają się takie operacje, jak wprowadzanie mutacji do genu DDPS. DNA wektora przeznaczonego do stosowania, metoda transformacji i metoda potwierdzania obecności genu DDPS, są takie same, jak te w wyżej wspomnianej procedurze.

2) Wprowadzanie mutacji do genu DDPS

Przykładami metod przeprowadzania mutacji, takiej jak zastąpienie, insercja lub delecja reszt aminokwasowych, są metoda PCR zrekombinowanego DNA (Higuchi, R., 61% w PCR Technology (Erlich, H. A., red, Stockton press (1989)) i metoda mutagenezy ukierunkowanej (Kramer, W. i Frits, H. J., Meth. in EnzymoL, 154. 350 (1987); Kunkel, T. A. i in. Meth. inEnzymol., 154, 367 (1987)). Stosując te metody, można powodować zamierzoną mutację w zamierzonym miejscu.

Ponadto, stosując chemiczną syntezę zamierzonego genu, możliwe jest wprowadzenie mutacji lub mutacji losowej w zamierzonym miejscu.

Ponadto, dostępna jest metoda, w której gen DDPS w chromosomie lub plazmidzie traktuje się bezpośrednio hydroksyloaminą (Hashimoto, T. i Sekiguchi, M. J. Bacteriol. 159, 1039 (1984)). Alternatywnie, dopuszczalne jest stosowanie metody, w której bakterię należącą do rodzaju Escherichia, posiadającą gen DDPS, napromieniowuje się światłem ultrafioletowym, lub metoda oparta na działaniu czynnikiem chemicznym, takim jak N-metylo-N'-nitrozoguanidyna lub kwas azotawy. Według tych metod, mutacje można wprowadzać w sposób losowy.

W odniesieniu do metody selekcji zmutowanego genu, zrekombinowany DNA zawierający fragment DNA zawierający gen DDPS i DNA wektora, najpierw bezpośrednio poddaje się mutagenezie hydroksyloaminą lub podobnym czynnikiem, i stosuje się do transformacji na przykład szczepu W3110 E. coli. Następnie stransformowane szczepy hoduje się na podłożu minimalnym, takim jak M9 zawierającym S-2-aminoetylocysteinę (AEC) jako analog L-lizyny. Szczepy niosące zrekombinowany DNA zawierający gen DDPS typu dzikiego nie mogą syntetyzować L-lizyny i kwasu diaminopimelinowego (DAP), a ich wzrost jest hamowany, ponieważ DDPS ulegająca ekspresji ze zrekombinowanego DNA hamowana jest przez AEC. W przeciwieństwie, szczep niosący zrekombinowany DNA zawierający gen DDPS, której wrażliwość na hamowanie przez L-lizynę jest zniesiona, posiada zmutowany enzym, który nie jest hamowany przez AEC, kodowany przez gen DDPS w wyżej wspomnianym zrekombinowanym DNA. Powinien on zatem być zdolny do wzrostu na minimalnym podłożu, do którego dodano AEC. Zjawisko to można wykorzystać do selekcji szczepu, który jest oporny, pod względem wzrostu, na AEC jako analog L-lizyny, to jest szczepu niosącego zrekombinowany DNA zawierający zmutowany gen DDPS, której wrażliwość na hamowanie jest zniesiona.

Tak otrzymany zmutowany gen można wprowadzić w postaci zrekombinowanego DNA do odpowiedniego mikroorganizmu gospodarza, i przeprowadzić jego ekspresję. A zatem, można otrzymać mikroorganizm, który zawiera DDPS o zniesionej wrażliwości na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego. Gospodarzem jest korzystnie mikroorganizm należący do rodzaju Escherichia, którego przykładem jest E. coli.

Alternatywnie, fragment zmutowanego genu DDPS można usunąć ze zrekombinowanego

DNA i wstawić do innego wektora, aby uczynić go użytecznym. DNA wektora, który można użyć w niniejszym wynalazku, jest korzystnie DNA wektora plazmidowego, którego przykładami sąpUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMWl 19,

181 614 pMWl 18, pMW219 i pMW218. Poza tym, można również wykorzystać DNA wektorów fagowych.

Ponadto, w celu przeprowadzenia wydajnej ekspresji zmutowanego genu DDPS, przed sekwencją DNA kodującą zmutowaną DDPS można zligować inny promotor, który działa w mikroorganizmach, taki jak lac, trp i PL, albo można użyć promotora zawartego w genie DDPS jako takiego, bądź po jego amplifikacji.

Ponadto, jak opisano powyżej, zmutowany gen można wstawić do DNA wektora ulegającego autonomicznej replikacji, który wprowadza się do gospodarza, i umożliwić jego posiadanie przez gospodarza w postaci DNA pozachromosomalnego, takiego jak plazmid. Alternatywnie, zmutowany gen można zintegrować z chromosomem mikroorganizmu gospodarza metodą wykorzystującą transdukcję, transpozon (Berg, D.E. i Berg, C. M., Bio/Technol., 1,417 (1983)), fag Mu (japoński wyłożeniowy opis patentowy numer 2-109985) lub rekombinację homologiczną (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972).

<2 >DNA kodujący zmutowanąkinazę asparaginianowąlll (AKIII) stosowaną dla celów niniejszego wynalazku

DNA kodujący zmutowaną AKIII stosowaną dla celów niniejszego wynalazku posiada mutację prowadzącą do zniesienia wrażliwości na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego kodowanej AKIII przez L-lizynę w DNA kodującym AKIII typu dzikiego. Przykładami mutacji prowadzącej do zniesienia wrażliwości na hamowanie AKIII na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę są:

(a) mutacja prowadząca do zastąpienia reszty glicyny w pozycji 323 resztą kwasu asparaginowego;

(b) mutacja prowadząca do zastąpienia reszty glicyny wpozycji 323 resztą kwasu asparaginowego oraz zastąpienia reszty glicyny w pozycji 408 resztą kwasu asparaginowego;

(c) mutacja prowadząca do zastąpienia reszty argininy w pozycji 34 resztą cysteiny oraz zastąpienia reszty glicyny w pozycji 323 resztą kwasu asparaginowego;

(d) mutacja prowadząca do zastąpienia reszty leucyny w pozycji 325 resztą feny loalaniny;

(e) mutacja prowadząca do zastąpienia reszty metioniny wpozycji 318 resztą izoleucyny;

(f) mutacja prowadząca do zastąpienia reszty metioniny w pozycji 318 resztą izoleucyny oraz zastąpienia reszty waliny w pozycji 349 resztą metioniny;

(g) mutacja prowadząca do zastąpienia reszty seryny w pozycji 345 resztą leucyny;

(h) mutacja prowadząca do zastąpienia reszty waliny w pozycji 347 resztą metioniny;

(i) mutacja prowadząca do zastąpienia reszty treoniny w pozycji 352 resztą izoleucyny;

(j) mutacja prowadząca do zastąpienia reszty treoniny w pozycji 352 resztą izoleucyny i zastąpienia reszty seryny w pozycji 369 resztą fenyloalaniny;

(k) mutacja prowadząca do zastąpienia reszty kwasu glutaminowego w pozycji 164 resztą lizyny; oraz (1) mutacja prowadząca do zastąpienia reszty metioniny w pozycji 417 resztą izoleucyny i zastąpienia reszty cysteiny w pozycji 419 resztą tyrozyny licząc od końca N sekwencji aminokwasowej AKIII w sekwencji aminokwasowej AKIII zdefiniowanej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 8 w Liście Sekwencji.

DNA kodujący AKIII typu dzikiego nie podlega szczególnym ograniczeniom; jego przykładem jest DNA kodujący AKIII pochodzącą z bakterii należącej do rodzaju Escherichia, takiej jak E. coli. Konkretnie, jego przykładami są DNA kodujący sekwencję aminokwasową zdefiniowaną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 8 oraz sekwencja przedstawiona przez zasady o numerach 584-1930 w sekwencji zasad zdefiniowanej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 7. Nawiasem mówiąc, AKIII E. coli koduje gen lysC.

Wśród tych sekwencji, tymi posiadającymi mutację w sekwencji zasad powodującą opisane powyżej zastąpienia reszt aminokwasowych, są DNA kodujące zmutowaną AKIII według niniejszego wynalazku. Zastosować można każdy kodon odpowiadający zmienionej reszcie aminokwasowej, niezależnie od jego rodzaju, pod warunkiem, że koduje on identyczną resztę aminokwasową. Ponadto, są nimi te, w których sekwencje aminokwasowe kodowanej AKIII

181 614 typu dzikiego różnią się nieznacznie sekwencją, w zależności od różnicy w gatunku bakteryjnym i szczepie bakteryjnym. Te posiadające zastąpienia, delecje i insercje reszt (y) aminokwasowych w pozycji(jach) niezwiązanych z akty wnością enzymatyczną także są włączone w zmutowany gen AKIII według niniejszego wynalazku. Na przykład, sekwencja zasad genu lysC typu dzikiego, otrzymana jak opisano poniżej w przykładzie 2 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 7) różni się od już opublikowanej sekwencji lysC szczepu K-12 JC411 E. coli w 6 miejscach (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G. N. i Patte, J. C., J. Biol. Chem., 261 1052 (1986)). Kodowane reszty aminokwasowe różnią się w ich 2 miejscach (w lysC szczepu JC411 reszta glicyny w pozycji 58 jest zastąpiona resztą cysteiny, a reszta glicyny w pozycji 401 jest zastąpiona resztą alaniny, licząc od końcaN w sekwencji aminokwasowej lysC zdefiniowanej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 8). Oczekuje się nawet w przypadku lysC posiadającego taką samą sekwencję, jak ta lysC szczepu K-12 JC411, że uzyska się lysC posiadający mutację znoszącą wrażliwość na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę, jeśli wprowadzi się którąkolwiek z wyżej wspomnianych mutacji od (a) do (1).

Sposób otrzymywania DNA kodującego zmutowaną AKIII, w której zniesiona jest wrażliwość na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę jest następujący. Po pierwsze, DNA zawierający gen AKIII typu dzikiego lub gen AKIII posiadający inną mutację, poddaje się mutagenezie in vitro, a DNA po mutagenezie liguje się z DNA wektora dostosowanego do gospodarza otrzymując zrekombinowany DNA. Zrekombinowany DNA wprowadza się do mikroorganizmu gospodarza w celu otrzymania transformantów. Jeśli spośród wyżej wspomnianych mutantów wyselekcjonuje się transformant, w którym zachodzi eksprescja AKIII, to znaczy, że zawiera on zmutowany gen. Alternatywnie, DNA zawierający gen AKIII typu dzikiego lub gen AKIII posiadający inną mutację można zligować z DNA wektora dostosowanego do gospodarza w celu otrzymania zrekombinowanego DNA. Zrekombinowany DNA poddaje się następnie mutagenezie in vitro, i zrekombinowany DNA po mutagenezie wprowadza się do mikroorganizmu gospodarza dla otrzymania transformantów. Jeśli spośród wyżej wspomnianych mutantów wyizoluje się transformant, w którym zachodzi ekspresja AKIII, to znaczy, że także zawiera on zmutowany gen.

Alternatywnie, dopuszczalne jest również, że mikroorganizm, który wytwarza enzym typu dzikiego, poddaje się mutagenezie dla utworzenia zmutowanego szczepu, który wytwarza zmutowany enzym, a następnie ze zmutowanego szczepu otrzymuje się zmutowany gen. Przykładem czynnika do prowadzenia bezpośredniej mutagenezy DNA in vitro jest hydroksyloamina i podobne czynniki. Hydroksyloamina jest chemicznym czynnikiem mutagennym, który powoduje mutację cytozyny do tyminy poprzez zamianę cytozyny w N⁴-hydroksycytozynę. Alternatywnie, gdy mutagenezie poddaje się sam mikroorganizm, mutagenezę prowadzi się przez zastosowanie napromieniowania światłem ultrafioletowym lub czynnika mutującego zazwyczaj stosowanego do sztucznych mutacj i, takiego j ak N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna (NTG).

Jak dawcę DNA zawierającego gen AKIII typu dzikiego lub gen AKIII posiadający inną opisaną powyżej mutację stosuje się jakikolwiek mikroorganizm, z zastrzeżeniem, że jest to organizm należący do rodzaju Escherichia. Konkretnie, możliwe jest wykorzystanie tych mikroorganizmów, które opisano w książce napisanej przez Neidhardta i in. (Neidhardt, F.C. i in., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D,C., 1208, tablica 1). Na przykład mogąto być szczep JM 109 i szczep MC 1061 E. coli. Gdy ztych szczepów otrzyma się gen AKIII, przygotowywanie chromosomalnego DNA, przygotowywanie biblioteki chromosomalnego DNA i podobnych prowadzi się w taki sam sposób, jak opisane powyżej przygotowywanie genu DDPS. Korzystne jest zastosowanie jako gospodarza do przygotowywania biblioteki szczepu całkowicie pozbawionego AKI, AKII i AKIII, takiego jak szczep GT3 E. coli (dostępny w E. coli Genetic Stock Center (Connecticut, Stany Zjednoczone)).

Z otrzymanej biblioteki chromosomalnego DNA otrzymuje się szczep posiadający zrekombinowany DNA genu AKIII, jako szczep w którym aktywność AKIII jest podwyższona lub szczep którego auksotrofia jest skomplementowana. Z potencjalnych szczepów przygotowuje się ekstrakty komórkowe i z nich przygotowuje się roztwory nieoczyszczonego enzymu dla po181 614 twierdzenia aktywności AKIII. Procedurę pomiaru aktywności enzymatycznej AKIII można przeprowadzić zgodnie z metodą Stadtmana i in. (Stadtman, E. R., Cohen, G. N., LeBras., G. i Robichon-Schulmajster, H., J. Biol. Chem., 236,2033 (1961)).

Na przykład, gdy jako gospodarza stosuje się zmutowany szczep całkowicie pozbawiony AK, fragmenty DNA zawierający gen AKIII można otrzymać przez wyizolowanie stransformowanego szczepu, który stał się zdolny do wzrostu na podłożu nie zawierającym L-lizyny, L-treoniny, L-metioniny i kwasu diaminopimelinowego, lub na podłożu nie zawierającym homoseryny i kwasu diaminopimelinowego, oraz odzyskanie ze szczepu bakteryjnego zrekombinowanego DNA.

Jeśli gen AKIII amplifikuje się z chromosomalnego DNA wykorzystując metodę PCR, startery DNA przeznaczone do stosowania w reakcji PCR można odpowiednio przygotować na podstawie na przykład sekwencji znanej dla E. coli. (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G. N. i Patte, J. C., J. Biol. Chem., 261,1052 (1986)). Jednakże, odpowiednie są startery, które mogą zamplifikować region obejmujący 1347 zasad kodujących gen lysC, i na przykład odpowiednie są dwa startery posiadające sekwencje zdefiniowane w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 5 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 6.

Przykładem sposobu przeprowadzania mutacji, takiej jak zastąpienie, insercja lub delecja reszty lub reszt aminokwasowych genu AKIII otrzymanego jak opisano powyżej, jest metoda PCR zrekombinowanego DNA, metoda ukierunkowanej mutagenezy i podobne, tak samo jak opisane powyżej sposoby mutagenezy genu DDPS.

Ponadto, przy stosowaniu chemicznej syntezy zamierzonego genu, możliwe jest wprowadzenie mutacji lub mutacji losowej w zamierzonym miejscu.

Ponadto, dostępna jest metoda, w której gen AKIII w chromosomie lub pozachromosomalnym zrekombinowanym DNA traktuje się bezpośrednio hydroksyloaminą(Hashimoto, T. i Sekiguchi, M. J. Bacteriol. 159,1039 (1984)). Alternatywnie, dopuszczalne jest stosowane metody, w której bakterię należącą do rodzaju Escherichia, posiadającą gen AKIII w chromosomie lub pozachromosomalnym zrekombinowanym DNA, napromieniowuje się światłem ultrafioletowym, lub metody mutagenezy czynnikiem chemicznym, takim jak N-metylo-N'-nitrozoguanidyna lub kwas azotawy.

W odniesieniu do metody selekcji zmutowanego genu AKIII, szczep całkowicie pozbawiony AK, na przykład szczep GT3 E. coli, najpierw transformuje się zrekombinowanym DNA zawierającym gen AKIII poddany mutagenezie. Następnie stransformowane szczepy hoduje się na podłożu minimalnym, takim jak M9 zawierającym znaczącą ilość L-lizyny. Szczepy niosące zrekombinowany DNA zawierający gen AKIII typu dzikiego nie mogą syntetyzować L-treoniny, L-izoleucyny, L-metioniny i kwasu diaminopimelinowego (DAP), a ich wzrost jest hamowany, ponieważ ich jedyna AK jest hamowana przez L-lizynę. W przeciwieństwie, szczep niosący zrekombinowany DNA zawierający zmutowany gen AKIII, której wrażliwość na hamowanie przez L-lizynę jest zniesiona, powinien być zdolny do wzrostu na minimalnym podłożu, do którego dodano znaczącąilość L-lizyny. Zjawisko to można wykorzystać do selekcji szczepu, który jest oporny, pod względem wzrostu, na L-lizynę lub AEC jako analog L-lizyny, to jest szczepu niosącego zrekombinowany DNA zawierający zmutowany gen AKIII, której wrażliwość na hamowanie jest zniesiona.

Tak otrzymany zmutowany gen można wprowadzić w postaci zrekombinowanego DNA do odpowiedniego mikroorganizmu (gospodarza) i przeprowadzić jego ekspresję. A zatem, można otrzymać mikroorganizm, który zawiera AKIII o zniesionej wrażliwości na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego. Gospodarzem jest korzystnie mikroorganizm należący do rodzaju Escherichia, którego przykładem jest E. coli.

Alternatywnie, fragment zmutowanego genu AKIII można usunąć ze zrekombinowanego

DNA i wstawić do innego wektora, aby uczynić go użytecznym. DNA wektora, który można użyć w niniejszym wynalazku, jest korzystnie DNA wektora plazmidowego, którego przykładami są pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119,

181 614 pMW 118, pMW219 i pMW218. Poza tym, można również wykorzystać DNA wektorów fagowych.

Ponadto, w celu przeprowadzenia wydajnej ekspresji zmutowanego genu AKIII, przed sekwencją DNA kodującą zmutowaną AKIII można zligować inny promotor, który działa w mikroorganizmach, taki jak lac, trp i PL, albo można użyć promotora zawartego w genie AKIII jako takiego, bądź po jego amplifikacji.

Ponadto, jak opisano powyżej, zmutowany gen można wstawić do DNA wektora ulegającego autonomicznej replikacji, wprowadzić do gospodarza, i umożliwić jego posiadanie przez gospodarza w postaci DNA pozachromosomalnego, takiego jak plazmid. Alternatywnie, zmutowany gen można zintegrować z chromosomem mikroorganizmu gospodarza metodą wykorzystującątransdukcję, transpozon (Berg, D. E. i Berg, C. M., Bio/Technol., /, 417 (1983)), fag Mu (japoński wyłożeniowy opis patentowy numer 2-109985) lub rekombinację homologiczną (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972).

< 3 > Wytwarzanie L-lizyny według niniejszego wynalazku

L-lizynę można wydajnie wytwarzać przez hodowanie, w korzystnym podłożu, bakterii stransformowanej przez wprowadzenie otrzymanego jak opisano powyżej zmutowanego genu DDPS i zapewnienie posiadania AK, której wrażliwość na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę jest zniesiona, wytwarzanie i akumulację L-lizyny w jej hodowli i zbieranie L-lizyny z hodowli. Mianowicie, L-lizynę można wydajnie wytwarzać przez zapewnienie bakterii należącej do rodzaju Escherichia posiadania zarówno zmutowanej DDPS, jak i zmutowanej AKIII.

Przykładami bakterii należących do rodzaju Escherichia posiadających AK, której wrażliwość na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę jest zniesiona, są bakterie należące do rodzaju Escherichia, stransformowane przez integrację z chromosomalnym DNA kodującego AKIII posiadające mutację prowadzącą do zniesienia wrażliwości na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizyne, bądź bakterie należące do rodzaju Escherichia, stransformowane przez wprowadzenie do komórek zrekombinowanego DNA skonstruowanego przez ligację DNA z DNA wektora ulegającego autonomicznej replikacji w komórkach bakterii należących do rodzaju Escherichia. Ponadto, AK, której wrażliwość na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę jest zniesiona, może być AK typu dzikiego, która nie podlega hamowaniu na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę, lub taką, do której taki gen AK typu dzikiego wprowadza się w taki sam sposób do bakterii należącej do rodzaju Escherichia. Ponadto, dopuszczalny jest również zmutowany szczep bakterii należącej do rodzaju Escherichia, który zaczął wytwarzać zmutowaną AKIII w wyniku mutagenezy komórek bakterii należącej do rodzaju Escherichia.

Z drugiej strony, w celu uzyskania transformacji przez wprowadzenie zmutowanego genu DDPS do bakterii należącej do rodzaju Escherichia, zmutowany gen DDPS można zintegrować z chromosomalnym DNA lub transformację można uzyskać przez wprowadzenie do komórek zrekombinowanego DNA skonstruowanego przez zligowanie zmutowanego genu DDPS z DNA wektora ulegaj ącego autonomicznej replikacji w komórkach bakterii należących do rodzaju Escherichia.

Gdy zarówno zmutowany gen DDPS, jak i zmutowany gen AKIII zostaną wprowadzone do bakterii należącej do rodzaju Escherichia, oba zmutowane geny można zintegrować z, i zawrzeć w chromosomalnym DNA bakterii należącej do rodzaju Escherichia, lub mogą one być zawarte w tym samym plazmidzie, lub oddzielnych plazmidach w komórkach w postaci pozachromosomalnego DNA. Gdy stosuje się oddzielne plazmidy, korzystne jest używanie plazmidów posiadających mechanizm stabilnego rozdziału dla umożliwienia, aby każdy z nich był zgodnie zawarty w komórce. Ponadto, jeden ze zmutowanych genów może być zintegrowany z, i zawarty w chromosomalnym DNA, a drugi zmutowany gen może być zawarty w plazmidzie w komórkach w postaci pozochromosomalnego DNA. Gdy do bakterii należącej do rodzaju Escherichia wprowadza się zmutowany gen DDPS i zmutowany gen AKIII, dopuszczalna jest każda kolejność wprowadzania obu genów.

181 614

Wydajność wytwarzania L-lizyny można ponadto poprawić przez wzmocnienie genu reduktazy dihydropikolinianowej bakterii należącej do rodzaju Escherichia, do której wprowadzono zmutowany gen DDPS i zmutowany gen AKIII. Wydajność wytwarzania L-lizyny można dalej poprawić przez wprowadzenie genu dehydrogenazy diaminopimelinianowej pochodzącego z maczugowca do bakterii należącej do rodzaju Escherichia, w której wzmocniono gen reduktazy dihydropikolinianowej. Ten gen dehydrogenazy diaminopimelinianowej powinien być wzmocniony. Alternatywnie, wydajność wytwarzania L-lizyny można również poprawić w podobnym stopniu przez wzmocnienie genu sukcynylazy tetrahydropikolinianowej i genu deacylazy sukcynylodiaminopimelinianowej, zamiast wprowadzania genu dehydrogenazy diaminopimelinianowej.

W niniejszym opisie wzmocnienie genu odnosi się do wzmocnienia aktywności enzymatycznej enzymu jako produktu ekspresji genu w przeliczeniu na komórkę. Konkretnie, można podać przykłady zwiększenia liczby kopii genu w komórce, zwiększenia ilości produktu ulegającego ekspresji na gen przez użycie promotora posiadającego wyższą wydajność ekspresji oraz wprowadzenie do genu mutacji prowadzącej do wzmocnienia aktywności enzymatycznej. W celu zwiększenia liczby kopii genu w komórce, gen wstawia się do wektora ulegającego autonomicznej replikacji w bakteriach należących do rodzaju Escherichia, i bakterię należącą do rodzaju Escherichia można stransformować tym wektorem. Wektorem tym jest korzystnie plazmid typu występującego w dużej liczbie kopii. Alternatywnie, liczbę kopii można zwiększyć przez zamplifikowanie DNA zinegrowanego z DNA chromosomalnym, stosując faga Mu lub podobne. W odniesieniu do stosowania plazmidu, gdy do wprowadzania zmutowanego genu DDPS i zmutowanego genu AKIII stosuje się plazmidy, korzystnie stosuje się takie plazmidy posiadające mechanizm stabilnego rozdziału, dzięki któremu plazmidy te w stabilny sposób zawarte są razem w komórce. Dopuszczalna jest każda kolejność wprowadzania genów.

Poniżej zostanie wyjaśniony mechanizm, w wyniku którego wydajność wytwarzania L-lizyny można poprawić w stopniowy sposób przez kolejne wzmacnianie genów układu biosyntezy L-lizyny, jak opisano powyżej. Układ biosyntezy, obejmujący wiele reakcji, można porównać z cieczą przepływającą przez wiele rur, posiadających różne grubości, połączonych w szereg. Każda rura odpowiada tutaj pojedynczemu enzymowi, a szerokość kanału odpowiada szybkości reakcji enzymatycznej. W celu zwiększenia ilości cieczy przepływającej przez rury, skuteczne jest pogrubienie najcieńszej rury. Nie należy oczekiwać żadnego efektu jeśli nawet dalej poszerzy się szeroki kanał. W celu dalszego zwiększenia ilości przepływającej cieczy można poszerzyć drugi z kolei najcieńszy kanał. Z takiego punktu widzenia, autorzy niniejszego wynalazku próbowali wzmocnić układ biosyntezy L-lizyny. W tym celu, jak przedstawiono w opisanym poniżej przykładzie 6, kolejność etapów ograniczających szybkość układu biosyntezy L-lizyny oceniano przez wprowadzanie w stopniowy sposób do E. coli genów układu biosyntezy L-lizyny pochodzących z E. coli. W ocenie tej cztery geny, dapC (gen transaminazy sukcynylodiaminopimelinianowej), dapD (gen sukcynylazy tetrahydropikolinianowej), dapE (gen deacylazy sukcynylodiaminopimelinianowej) i dapF (gen epimerazy diaminopimelinianowej) zlokalizowane w dolnej części szlaku biosyntezy zastąpiono genem DDH, kodującym DDH (dehydrogenazę diaminopimelinianową) Brevibacterium lactofermentum, samą zdolną do katalizowania reakcji, w których uczestniczą produkty tych genów. Mianowicie, wprowadzone geny enzymów układu biosyntezy L-lizyny i kodowane przez nie enzymy są następujące:

ppc: karboksylaza fosfoenolopirogronianowa aspC: aminotransferaza asparaginianowa lysC: kinaza asparaginianowa III lysC*: kinaza asparaginianowa III o zniesionej wrażliwości na hamowanie asd: dehydrogenaza semialdehydu asparaginianowego dapA: syntaza dihydrodipikolinianowa dapA*: synteza dihydropikolinianowa o zniesionej wrażliwości na hamowanie dapB: reduktaza dihydrodipikolinianowa

181 614

DDH: dehydrogenaza diaminopimelinianowa (pochodząca z Brevibacterium lactofermentum) lysaA: dekarboksylaza diaminopimelinianowa

W wyniku pojedynczego wprowadzania każdego z genów do E. coli, stwierdzono wytwarzanie L-lizyny w szczepach, do których wprowadzono lysC*, dapA lub dapA*, a najwyższą wydajność wytwarzania L-lizyny wykazuje szczep z wprowadzonym dapA*. Zgodnie z wynikiem, stwierdzono, że reakcja katalizowana przez dapA była pierwszym etapem ograniczającym szybkość. Następnie, gdy każdy z genów układu biosyntezy L-lilzyny wprowadzono do szczepu z wprowadzonym dapA*, największy wpływ na poprawę wydajności wytwarzania L-lizyny miał lysC*. Stwierdzono zatem, że reakcja katalizowana przez lysC była drugim etapem ograniczającym szybkość. W ten sam sposób stwierdzono, że reakcja katalizowana przez dapB była trzecim etapem ograniczającym szybkość, a reakcja katalizowana przez DDH była czwartym etapem ograniczającym szybkość. Ponadto, w wyniku badań etapów ogram czających szybkość wśród reakcji katalizowanych przez dapC, dapD, dapE i dapF zastąpionych przez DDH stwierdzono, że dapD i dapE przyczyniały się do ograniczania szybkości.

Poniżej zostanie podany przykład otrzymywania genów układu biosyntezy L-lizyny E. coli i genu DDH Brevibacterium lactofermentum.

Gen ppc można otrzymać z plazmidu pS2 (Sabę, H. i in., Gene, 31,279 (1984)) lub pT2 posiadających ten gen. Fragment DNA zawierający gen ppc otrzymuje się przez strawienie pS2 AatlPiAflll. Fragment DNA zawierający gen ppc otrzymuje się także przez strawienie pT2 Smal i Scal. Szczep F15 E. coli (AJ12873) zawierający pT2 zdeponowano w międzynarodowym depozycie w National Institute of Bioscience and Humań Technology of Agency of Industrial Science and Technology (kod pocztowy: 305,1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia) pod numerem depozytowym FERM BP-4732 na warunkach Porozumienia Budapesztańskiego.

Gen aspC otrzymuje się z zawierającego ten gen plazmidu pLF4 (Inokuchi, K. i in., Nucleic Acids Res., 10, 6957 (1982)). Fragment DNA posiadający gen aspC otrzymuje się przez strawienie pLF4 PvuII i Stul.

Gen asd otrzymuje się z zawierającego ten gen plazmidu pAD20 (Haziza, C. i in., EMBO, 1,379 (1982)). Fragment DNA zawierający ten gen otrzymuje się przez strawienie pAD20J5e/ i Ciał.

Gen dapB otrzymuje się przez amplikację chromosomalnego DNA E. coli metodą PCR przez wykorzystanie dwóch rodzajów starterów oligonukleotydowych (na przykład, sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 9 i o numerze identyfikacyjnym: 10), przygotowanych na podstawie sekwencji nukleotydowej znanego genu dapB (Bouvier, J. i in., J. Biol. Chem., 259, 14829(1984)).

Gen DDH otrzymuje się przez amplifikację chromosomalnego DNA Brevibacterium lactofermentum metodą PCR przez użycie dwóch rodzajów starterów oligonukleotydowych (na przykład, sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 11 i o numerze identyfikacyjnym: 12), przygotowanych na podstawie znanej sekwencji nukleotydowej genu DDH Corynebacterium glutamicum (Ishino, S. i in., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)).

Gen lysA otrzymuje się przez amplifikację chromosomalnego DNA E. coli metodą PCR przez użycie dwóch rodzajów starterów oligonukleotydowych (na przykład, sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 13 i o numerze identyfikacyjnym: 14), przygotowanych na podstawie sekwencji nukleotydowej znanego genu lysA (Stragier, P. i in., J. Mol. Biol., 168, 321 (1983)).

Gen dapD otrzymuje się przez amplifikację chromosomalnego DNA szczepu W3110 E. coli metodą PCR przez użycie dwóch rodzajów starterów oligonukleotydowych (na przykład, sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 15 i o numerze identyfikacyjnym: 16), przygotowanych na podstawie sekwencji nukleotydowej znanego genu dapD (Richaud, C. i in., J. Biol. Chem., 259,

14824(1984)).

Gen dapE otrzymuje się przez amplifikację DNA E. coli metodą PCR przez użycie dwóch rodzajów starterów oligonukleotydowych (sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 17 i o nume181614 rze identyfikacyjnym: 18), przygotowanych na podstawie sekwencji nukleotydowej znanego genu dapE (Bouvier, J. i in., J. Bacteriol., 174, 5265 (1992)).

Gen dapF otrzymuje się przez amplifikację chromosomalnego DNA E. coli metodą PCR przez użycie dwóch rodzajów starterów oligonukleotydowych (na przykład, sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 19 i o numerze identyfikacyjnym: 20), przygotowanych na podstawie sekwencji nukleotydowej znanego genu dapF (Richaud, C. i in., Nucleic Acids Res., 16, 10367 (1988)).

W niniejszym wynalazku jako gospodarza można stosować każdą bakterie należącą do rodzaju Escherichia, pod warunkiem, że promotor zmutowanego genu DDPS, zmutowanego genu AJIII lub innego genu układu biosyntezy L-lizyny, bądź inny promotor do ekspresji tych genów, działają w jej komórkach, oraz miejsce początku replikacji DNA wektora przeznaczonego do wprowadzania działa w jej komórkach będąc zdolnym do replikacji, gdy do plazmidu, jako pozochromosomalnego DNA, wprowadzi się zmutowany gen DDPS, zmutowany gen AKIII lub inny gen układu biosyntezy L-lizyny.

Jako przykład, można podać E. coli wytwarzającąL-lizynę, konkretnie zmutowany szczep posiadający oporność na analogi L-lizyny. Analogiem lizyny jest taki związek, który hamuje proliferację bakterii należących do rodzaju Escherichia, ale wrażliwość na supresję jest całkowicie lub częściowo zniesiona, jeśli L-lizyna współwy stępuje w podłożu. Na przykład, są to oksalizyna, hydroksanian lizyny, AEC, γ-metylolizyna, α-chlorokaprolaktam i podobne. Zmutowane szczepy wykazujące oporność te analogi lizyny otrzymuje się przez zastosowanie zwykłej procedury mutagenezy wobec mikroorganizmów należących do rodzaju Escherichia. Konkretnym przykładem szczepu bakteryjnego przeznaczonego do stosowania do wytwarzania L-lizyny jest Escherichia coli AJ11442 (zdeponowany pod numerami FERM BP-1543 i NRRL B-12185; patrz japońskie wyłożeniowe zgłoszenie patentowe numer 56-18596 lub opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 346 170). Wrażliwość kinazy asparaginianowej opisanych powyżej mikroorganizmów na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę jest zniesiona.

Oprócz tego, przykładem mogą być mikroorganizmy wytwarzające L-treoninę, ponieważ ogólnie rzecz biorąc wrażliwość ich kinazy asparaginianowej na hamowanie przez L-lizynę jest zniesiona także w mikroorganizmach wytwarzających L-treoninę. Z wytwarzających L-treoninę bakterii należących do E. coli, najwyższą znaną obecnie wydajność wytwarzania ma szczep B-3996. Szczep B-3996 zdeponowano w Research Institute for Genetics and Industrial Microorganism Breeding pod numerem rejestracyjnym RIA 1867.

Podłoże przeznaczone do stosowania do hodowli transformanta zawierającego zmutowany gen według niniejszego wynalazku jest zwykłym podłożem zawierającym źródło węgla, źródło azotu, jony organiczne i ewentualnie inne składniki organiczne.

Jako źródło węgla można stosować cukry, takie jak glukoza, laktoza, galaktoza, fruktoza lub hydrolizat skrobiowy; alkohole, takie jak glicerol lub sorbitol; lub kwasy organiczne, takie jak kwas fumarowy, kwas cytrynowy lub kwas bursztynowy.

Jako źródła azotu można stosować nieorganiczne sole amonowe, takie jak siarczan amonowy, chlorek amonowy lub fosforan amonowy; azot organiczny, taki jak hydrolizat sojowy; gazowy amoniak lub wodny roztwór amoniaku.

Pożądane jest umożliwienie, aby zawarte były w odpowiednich ilościach wymagane substancje jako organiczne śladowe składniki odżywcze, takie jak witamina B] i L-izoleucyna lub ekstrakt drożdżowy. Poza powyższymi, jeśli jest to konieczne, w małych ilościach dodaje się fosforan potasowy, siarczan magnezowy, jon żelazowy, jon manganowy i podobne.

Hodowlę korzystnie prowadzi się w warunkach tlenowych w ciągu 16-72 godzin. Temperaturę hodowli utrzymuje się od 25°C do 45°C, a pH podczas hodowli utrzymuje się w granicach

5-8. Do doprowadzania pH można stosować substancje nieorganiczne lub organiczne, kwaśne lub zasadowe, jak również gazowy amoniak i podobne.

Zbieranie L-lizyny z płynu fermentacyj nego zazwyczaj przeprowadza się przez połączenie metody wykorzystującej żywicę jonowymienną metody precypitacji lub innych znanych metod.

181 614

Krótki opis rysunków

Figura 1 przedstawia etapy przygotowywania pdapAl i pdapA2.

Figura 2 przedstawia hamowanie DDPS typu dzikiego i zmutowanej przez L-lizynę.

Figura 3 przedstawia etapy przygotowywania plazmidu pdapAS824 posiadającego gen dapA typu z podwójną mutacją.

Figura 4 przedstawia etapy przygotowywania pLYSCl i pLYSC2.

Figura 5 przedstawia proporcję występowania i proporcję mutacji transformantów po traktowaniu hydroksyloaminą.

Figura 6 przedstawia hamowanie AKIII typu dzikiego i zmutowanej przez L-lizynę.

Figura 7 przedstawia etapy przygotowywania plazmidu RSF24P pochodzącego z RSF1010 posiadającego dapA*24.

Figura 8 przedstawia etapy przygotowywania plazmidu pLLC*80.

Figura 9 przedstawia etapy przygotowywania plazmidu RSFD80 pochodzącego z RSF1010 posiadającego dapA24 i lysC*80.

Figura 10 przedstawia struktury plazmidów pdapA i pdapA* posiadających dapA lub dapA*.

Figura 11 przedstawia struktury plazmidów plysC i plysC* posiadających lysC lub lysC*80.

Figura 12 przedstawia strukturę plazmidu pppc posiadającego pppc.

Figura 13 przedstawia strukturę plazmidu paspC posiadającego aspC.

Figura 14 przedstawia strukturę plazmidu pasd posiadającego asd.

Figura 15 przedstawia strukturę plazmidu pdabB posiadającego dabB.

Figura 16 przedstawia strukturę plazmidu pDDH posiadającego DDH.

Figura 17 przedstawia strukturę plazmidu plysA posiadającego lysA.

Figura 18 przedstawia etapy przygotowywania plazmidu pCAB 1 pochodzącego z RSF 1010 posiadającego dapA*24, lysC*80 i dapB.

Figura 19 przedstawia etapy przygotowywania plazmidu pCABD2 pochodzącego z RSF1010 posiadającego dapA*24, lysC*80, dapB i DDH.

Figura 20 przedstawia strukturę plazmidu pdapD posiadającego dapD.

Figura 21 przedstawia strukturę plazmidu pdapE posiadającego dapE.

Figura 22 przedstawia strukturę plazmidu pdapF posiadającego dapF.

Figura 23 przedstawia etapy przygotowywania plazmidu pMWdapDEl posiadającego dapD i dapE.

Figura 24 przedstawia etapy przygotowywania plazmidu pCABDEl posiadającego dapA*24, lysC*80, dapB, dapD i dapE.

Najlepszy sposób realizacji wynalazku

Niniej szy wynalazek zostanie poniżej wyjaśniony konkretniej w odniesieniu do przykładów.

Przykład 1: Przygotowanie zmutowanego genu DDPS < 1 > Klonowanie genu dapA typu dzikiego

Sekwencję nukleotydowągenu dapA E. coli opisano już uprzednio (Richaud, F. i in., J. Bacteriol., 297 (1986)), i wiadomo, że jego otwarta ramka odczytu (ORF) zawiera 876 par zasad i koduje białko o długości 292 reszt aminokwasowych.

Ponieważ nie wiadomo, jak gen dapA jest regulowany, zamplifikowano przy użyciu metody PCR oraz sklonowane region zawierający tylko sekwencje SD i ORF, z wyłączeniem regionu promotora.

Cały DNA genomowy szczepu K-12 MC 1061 E. coli wyekstrahowano zgodnie z metodą

Saito i Miura (Biochem. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)). Przygotowano dwa rodzaje starterów posiadające sekwencje przedstawione w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1 i w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2, których użyto do przeprowadzenia reakcji PCR zgodnie z metodą Erlicha i in. {PCR Technology, Stockton press (1989)), i zamplifikowano docelowy

DNA.Otrzymany DNA w takim stanie w jakim był, wstawiono do komercjalnie dostępnego wektora klonującego pCRl 000 przeznaczonego dla fragmentów otrzymanych w wyniku PCR

181 614 (zakupionego w Invitrogen, Ltd., (Califomia, Stany Zjednoczone Ameryki)). pCElOOO zawiera promotor lacZ (Płacz) i sprzedawany jest w postaci plazmidu przeciętego w miejscu położonym za promotorem lacZ. Gdy zrekombinowany DNA otrzymany w wyniku ligacji fragmentu PCR pomiędzy obu przeciętymi końcami pCRIOOO wprowadza się do E. coli, fragment PCR ulega transkrypcji pod kontrolą promotora lacZ. Podczas ligacji fragmentu PCR z PCRIOOO otrzymano dwa rodzaje plazmidów, a mianowicie pdapAl jako plazmid zligowany w orientacji normalnej i pdapA2 jako plazmid zligowany w orientacji odwrotnej dla kierunku transkrypcji dapA, w stosunku do kierunku transkrypcji przez promotor lacZ 9 (fig 1).

Gdy wprowadzono te plazmidy do E. coli JE7627, który jest szczepem pozbawionym DDPS, szczepy gospodarza JE7627 z wprowadzonymi plazmidami wykazująkomplementację auksotrofii pod względem kwasu diaminopimelinowego. W ten sposób potwierdzono, że fragmenty DNA wstawione do obu plazmidów zawierają gen dapA kodujący aktywną DDPS.

Stransformowany szczep, otrzymany przez wprowadzenie pdapAl do szczepu typu dzikiego E. coli W3110 (dostępny w National Institute of Genetics (Mishima-shi, Shizuoka-ken, Japan) oznaczono jako W3110/pdapAl, a stransformowany szczep, otrzymany przez wprowadzenie pdap2 do szczepu E.coli W3110 oznaczono, odpowiednio, jako W3110/pdapA2. Te dwa stransformowane szczepy hodowano, odpowiednio, w podłożu minimalnym M9 o poniższym składzie, z dodatkiem AEC jako analogu lizyny. Szczep W3110 bez wprowadzonego plazmidu także hodowano w tym samym podłożu jako kontrolę. Wzrost tych dwóch stransformowanych szczepów i szczepu W3110 nie posiadającego plazmidu, był hamowany przez AEC, jednakże, przez dodanie L-lizyny uzyskiwano zniesienie hamowania ich wzrostu.

(Podłoże minimalne M9)

A: (20 x M9)

Na₂HPO₄ · 12H₂O 303 g/litr

KH₂PO₄ 60 g/litr

NaCl 10 g/litr

Β: IM MgSO₄

C: 50% glukoza

D: 1 g/litr tiaminy

Opisane powyżej A, B, C i D sterylizowano oddzielnie i mieszano w stosunku A:B:C:D:woda = 5:0,1:1:0,1:95.

<2> Przygotowanie zmutowanego genu DDPS (dapA*)

Założono, że szczep posiadający plazmid zawierający dapA*, kodujący DDDPS o zniesionej wrażliwości na hamowanie przez L-lizynę, mógłby rosnąć na podłożu minimalnym M9 z dodatkiem znacznej ilości AEC. Szczep posiadający plazmid zawierający dapA*, wyselekcjonowano na podstawie jego odporności wzrostu na obecność AEC.

W celu efektywnego uzyskania dapA*, mutagenezie poddano dapA w przygotowanych w <1> pdapAl i w pdapA2.

(1 -2-1) Badania warunków selekcji szczepu posiadającego plazmid zawierający dapA*

Szczep W3110/pdapAl i szczep W3110/pdapA2, otrzymane jak opisano powyżej, hodowano na płytkach agarowych z podłożem M9 zawierającym, odpowiednio, różne stężenia AEC. Badano hamujące wzrost stężenia AEC i poszukiwano warunków selekcji szczepu posiadającego plazmid zawierający dapA*

Wzrost transformatorów na podłożu M9 zawierającym AEC w różnych stężeniach przedstawiono w tabeli 1. W tabeli tej + oznacza wzrost transformatora, a - oznacza brak wzrostu.

181 614

Tabela 1

Stężenia AEC (mM)	W3110/pdapAl	W3110/pdapA2 \|
250	-	-
125	-	-
60	-	-
30	-	-
15	+	-
8	+	+
4	+	+
2	-1-	+

Kierunek transkrypcji genu dapA w pdapAl jest zgodny z kierunkiem transkrypcji kierowanej przez promotor lacZ (fig. 1). Stwierdzono zatem, że gen dapA w pdapAl zapewniał oporność na AEC w znacząco wysokich stężeniach, nawet wtedy, gdy dapA pozostawał genem typu dzikiego, ponieważ ilość ulęgającego ekspresji jego produktu ulegała zwielokrotnieniu przez promotor lacZ, podczas gdy gen dapA w pdapA2 wykazywał niższą ilość produktu ulegającego ekspresji i powodował hamowanie wzrostu przez AEC w niższych stężeniach, ponieważ kierunek transkrypcji był odwrotny w stosunku do promotora lacZ, a sam dapA był także pozbawiony promotora (wzrost był hamowany przy dodaniu 30 mM w przypadku szczepu W3110/pdapAl i 15 mM w przypadku szczepu W3110/pdapA2). Potwierdzono, że hamowanie wzrostu było eliminowane przez jednoczesne dodanie L-lizyny.

Dlatego też, pdapA2 użyto jako obiektu do wprowadzenia mutacji. Do selekcji szczepu posiadającego plazmid zawierający dapA* użyto podłoża przygotowanego przez dodanie 60 mM AEC do podłoża minimalnego M9. Podłoże to w przykładzie 1 poniżej określa się jako „podłoże selekcyjne”.

(1-2-2) Mutageneza in vitro pdapA2 hydroksyloaminą

Dla wprowadzenia mutacji do plazmidu pdapA2, zastosowano metodę mutagenezy in vitro, w której na plazmidy działa się bezpośrednio hydroksyloaminą.

pg DNA poddawano, w temperaturze 75°C w ciągu 1-4 godzin, działaniu 0,4 M hydroksyloaminy (0,1 M KH₂PO₄ -1 mM EDTA (pH 6,0): 100 μΐ, 1 M hydroksyloamina -1 mM EDTA (pH 6,0): 80 μΐ, DNA: 2 pg, objętość końcowa: 200 pl po dopełnieniu wodą). Po zakończeniu mutagenezy, DNA oczyszczono za pomocą proszku szklanego, wprowadzono do E. coli W3110 i wysiano na podłoże pełne (L-bulion: 1 % Bacto trypton, 0,5% ekstrakt drożdżowy, 0,5% NaCl, 1,5% agar) i powstały kolonie.

Zreplikowano je na podłoże selekcyjne opisane w części (1-2-1) i wyselekcjonowane te, które tworzyły kolonie na podłożu selekcyjnym. Po dwóch powtórzeniach tego doświadczenia otrzymano w sumie potencjalnie zmutowane plazmidy w 36 szczepach.

W ten sposób uzyskane wszystkie 36 potencjalne szczepy wysiano ponownie na podłoże selekcyjne i potwierdzono oporność na AEC.

(1-2-3) Izolowanie genu dapA* i badanie produktu dapA*

Z 36 opisanych powyżej szczepów odzyskano zmutowane pdapA2. Pozbawiony dapA szczep JET627 stransformowano, odpowiednio, tymi zmutowanymi plazmidami i pdapA2 typu dzikiego. Z każdego ze stransformowanych szczepów przygotowano wolny od komórek ekstrakt i mierzono aktywność enzymatyczną DDPS.

Wolny od komórek ekstrakt (roztwór nieoczyszczonego enzymu) przygotowano w następujący sposób. Stransformowany szczep hodowano w podłożu 2 x TY (1,6% Bacto trypton, 1 % ekstrakt drożdżowy, 0,5% NaCl) i zbierano po osiągnięciu gęstości optycznej około 0,8, mierzonej przy długości fali 660 nm (OD₆₆₀). Osad komórek przemyto 0,85% NaCl w warunkach temperatury 0°C i zawieszono w 20 mM buforze fosforanów potasowych (pH 7,5), zawierającym

400 mM KCL Komórki rozbito stosując sonikację (0°C, 200 W, 10 minut). Roztwór rozbitych komórek wirowano przy 3 3 000 obrotów na minutę w ciągu 1 godziny, w warunkach tempe181614 ratury 0°C, dla otrzymania supematantu, do którego dodano siarczan amonowy do uzyskania 80% nasycenia w celu przechowywania roztworu w temperaturze 0°C przez noc, a następnie odwirowania. Osad rozpuszczono w 20 mM buforze fosforanów potasowych (pH 7,5) -400 mMKCl.

Aktywność enzymatycznąDDPS mierzono zgodnie z metodą Yugari i in. (Yugari, Y i Gilvarg, C.,J. Biol. Chem., 240,4710 (1962)). Mianowicie, absorbancję roztworu reakcyjnego o podanym poniżej składzie, mierzono za pomocą spektrofotometru w czasie w temperaturze 37°C, przy długości fali 270 nm i mierzono ilość wytworzonego dihydrodipikolinianu. Z układu reakcyjnego, który miał służyć jako ślepa próba, usunięto pirogronian sodowy.

(Skład mieszaniny reakcyjnej) mM imidazol-HCl pH 7,4 mM semialdehyd L-asparaginianu mM pirogronian sodowy roztwór enzymu woda (pozostałość) objętość całkowita 1,0 ml

Podczas mierzenia aktywności enzymatycznej DDPS, do roztworu reakcyjnego enzymu dodawano różne stężenia L-lizyny i badano stopień hamowaniaprzez L-lizynę. Jak przedstawiono na fig. 2, DDPS typu dzikiego podlegała hamowaniu w obecności L-lizyny. Zmutowanymi plazmidami pochodzącymi ze stransformowanych szczepów, posiadającymi DDPS trudno ulegające hamowaniu w obecności L-lizyny w porównaniu z typem dzikim, były trzy rodzaje spośród 36 rodzajówpotencjalnychplazmidów. Oznaczonoje, odpowiedniejako pdapAS8, pdapAS9 i pdapAS24. Zgodnie z przeprowadzonym następnie określeniem sekwencji nukleotydowej, ujawniono, że podczas pdapAS8 i pdapAS9 posiadały tę samą mutację.

Stopień zniesienia wrażliwości na hamowanie przez L-lizynę był różny u tych trzech rodzajów zmutowanych DDPS, kodowanych przez pdapAS8, pdapAS9 i pdapAS24, jednakże, wrażliwość na hamowanie L-lizynąbyła zniesiona u wszystkich tych trzech rodzajów. Chociaż na aktywność właściwą enzymu mogły mieć wpływ warunki wzrostu komórek i przygotowywanie prób, stwierdzono, że w każdym przypadku była ona nieco obniżona w porównaniu do typu dzikiego. Uznano jednak, że nie powinny one stwarzać zasadniczego kłopotujako materiał do namnażania.

(1-2-4) Określenie sekwencji nukleotydowej zmutowanego genu dapA

Sekwencje nukleotydowe zmutowanych genów dapA określono zgodnie ze zwykłą metodą przy użyciu sekwenatoraDNA ABI Model 373 A (wyprodukowanego przez Applied Biosystems Inc.). W wyniku tego ujawniono, że C wpozycji 513 byłazamienionanaT wpdapAS8 i pdapAS9, a C w pozycji 623 była zamieniona na T wpdapAS24 w sekwencji genu dapA typu dzikiego przedstawionej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 3. Tak więc, ujawniono, że w sekwencji aminokwasowęj DDPS przedstawionej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 reszta alaniny wpozycji 81 była zmieniona na resztę waliny w DDPS kodowanej przez pdapAS8 i pdapAS9, a reszta histydyny w pozycji 118 była zmieniona na resztę tyrozyny w DDPS kodowanej przez pdapAS24.

(1 -2-5) Przygotowanie dapA posiadającego podwójną mutację

Jak opisano powyżej, otrzymano dwa rodzaje zmutowanych genów dapA. W celu sprawdzenia, czy zniesienie wrażliwości na hamowanie działa addytywnie dla tych mutacji, przygotowano plazmid zawierający zmutowany dapA posiadający obie te mutacje. Procedura przygotowania była taka, jak przedstawiono na fig. 3. Otrzymany plazmid posiadający podwójną mutację oznaczono jako pdapAS824.

Przykład 2: Przygotowanie zmutowanego genu AKIII < 1> Klonowanie genu LysC typu dzikiego

Sekwencję nukleotydowągenu AKIII (lysC)£.co/z podano uprzednio (Cassan, M., Parsot,

C., Cohen, G.N. i Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052 (1986) i wiadomo, żejego otwarta ramka odczytu (ORF) zawiera 1347 par zasad i koduje białko o długości 449 reszt aminokwasowych.

W genie tym obecny jest operator, ij est on podatny na supresje pod wpływem L-lizyny. Tak więc,

181 614 w celu usunięcia regionu operatora, zamplifikowano przy użyciu metody PCR i sklonowane region zawierający tylko sekwencję SD i ORF.

Całkowity DNA genomowy szczepu K-12 MCI 060 E.coli przygotowano zgodnie z metodą Saito i Miura (Biochem. Biophys. Acta., 72 (1963)). Przygotowano dwa rodzaje starterów posiadających sekwencje przedstawione w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 5 i numerze identyfikacyjnym: 6, których użyto do przeprowadzenia reakcji PCR zgodnie z metodąErlicha i in. (PCR Technology, Stockton press (1989)) i zamplifikowano gen lysC. Otrzymany DNA strawiono BamHI i Asel, następnie utworzono tępe końce i wstawiono go do miejsca Smal występującego w dużej liczbie kopii wektora pUCl 8. To miejsce Smal znajduje się za występującym w wektorze promotorem lacZ, i gdy zrekombinowany DNA otrzymany przez wstawienie fragmentu DNA do miejsca Smal w pUC18 wprowadza się do E. coli, wstawiony fragment DNA ulega transkrypcji pod kontroląpromotora lacZ. Po wstawieniu fragmentu PCR do miejsca Smal pUC18, otrzymano dwa rodzaje plazmidów, mianowicie pLYSCl jako plazmid ze wstawką w orientacji odwrotnej i pLYSC2 jako plazmid ze wstawką w normalnej orientacji dla kierunku transkrypcji lysC w stosunku do kierunku transkrypcji pod kontrolą promotor lacZ (fig. 4).

Kiedy użyto tych plazmidów do stransformo wania E. coli GT3 (thrA 1016b, metLM 1005, lysC 1004) jako szczepu całkowicie pozbawionego AKI, II, III, skomplementowano auksotrofię GT3 pod względem homoseryny i kwasu diaminopimelinowego. Tak więc potwierdzono, że fragmenty DNA wstawione do obu plazmidów zawierają gen lysC kodujący aktywną AKIII.

S transformowany szczep otrzymany przez wprowadzenie pLYSCl do szczepu całkowicie pozbawionego AK, E. coli GT3, oznaczono jako GT3/pLYSCl, a szczep stransformowany otrzymany przez wprowadzenie pLYSC2 do E. coli GT3 oznaczono jako GT3/pLYSC2. Do podłoża minimalnego M9 dodano znaczną ilość L-lizyny i hodowano, odpowiednio, szczep GT3/pLYSCl i szczep GT3/pLYSC2. Zarówno szczep GT3/pLYSCl, jak i szczep GT3/pLYSC2 posaidająplazmidy zawierające lysC typu dzikiego, przy czym AKIII kodowana przez lysC w plazmidach jest jedyną AK. AKIII typu dzikiego, występująca jako jedyna AK, ulega hamowaniu przez L-lizynę w obecności znaczących ilości L-lizyny. A zatem, żaden z tych dwóch szczepów nie mógł syntetyzować L-treoniny, L-izoleucyny, L-metioniny i kwasu diaminopimelinowego (DAP) i wzrost obu był hamowany.

<2> Przygotowanie zmutowanego genu AKIII (lysC*)

Założono, że szczep posiadający plazmid zawierający lysC* kodujący AK o zniesionej wrażliwości na hamowanie L-lizyną, mógłby rosnąć w podłożu minimalnym M9 z dodatkiem znacznej ilości L-lizyny. Wyselekcjonowano szczep posiadający plazmid zawierający lysC* poprzez selekcje szczepów na podstawie oporności ich wzrostu na L-lizynę lub AEC jako analog L-lizyny.

W celu efektywnego otrzymania lysC*, mutagenezie poddano lysC w przygotowanych w<l>PLYSCl ipLYSC2.

(2-2-1) Badanie warunków selekcji szczepu posiadającego plazmid zawierający lysC*

Szczep GT3/pLYSCl i szczep GT3/pLYSC2 hodowano na płytkach agarowych z podłożem M9 zawierającym różne stężenia, odpowiednio, L-lizyny lub AEC. Badano hamujące wzrost stężenia L-lizyny lub AEC i badano warunki selekcji szczepu posiadającego plazmid zawierający lysC*.

Wzrost transformatorów na podłożu M9 zawierającym L-lizynę lub AEC w różnych stężeniach przedstawiono w tabeli 2. W tabeli tej + oznacza wzrost transformanta, ± oznacza słaby wzrost, a - oznacza brak wzrostu.

Tabela 2 Wzrost a stężenie L-lizyny

mM	0	0,2	I 0,4	0,8	1,5	3	6	12	25	50	100	200
GT3/pLYSCl	+	-		-	-	-	-	-	-	-	-	- '
GT3/pLYSC2	+		+	+	+	+	+	+	+	4-	±	-

181 614

Wzrost a stężenie AEC

mM	0	0,2	0,4	0,8	1,5	3,6	12	25	50
GT3/pLYSCl	+	-	-	-	-	-	-	-	-
GT3/pLYSC2	+	±	±	±	±	±	-	-	. 1

Kierunek transkrypcji genu lysC w pLYSC2 jest zgodny z kierunkiem transkrypcji pod kontrolą promotora lacZ (fig. 4). Tak więc stwierdzono, że gen lysC w pLYSC2 zapewniał oporność na L-lizynę i AEC w znacząco wysokich stężeniach, nawet wtedy, gdy lysC pozostawał genem typu dzikiego, ponieważ ulęgająca ekspresji ilość jego produktu ulegała zwielokrotnieniu przez promotor lacZ, podczas gdy gen lysC w pLYSCl wykazywał mniejszą ilość produktu ulegającego ekspresji i powodował hamowanie wzrostu przez L-lizynę i AEC w niższych stężeniach, ponieważ kierunek transkrypcji był odwrotny w stosunku do kierunku transkrypcji kierowanej przez promotor lacZ, a sam gen był także pozbawiony promotora (wzrost nie ulegał supresji aż do dodania 100 mM L-lizyny i aż do dodania 3 mM AEC w przypadku szczepu GT3/pLYSC2, podczas gdy w przypadku szczepu GT3/pLYSCl wzrost był całkowicie zahamowany po dodaniu 0,2 mM zarówno L-lizyny, jak i AEC). Potwierdzono, że hamowanie wzrostu eliminowane było przez jednoczesne dodawanie homoseryny i kwasu diaminopimełinowego.

Dlatego też, do doświadczeń wprowadzania mutacji zastosowano pLYSCl. Do selekcji szczepów posiadających plazmid zawierający lysC* stosowano podłoże przygotowane przez dodanie 10 mM L-lizyny lub 0,2 mM AEC do podłoża minimalnego M9. W przykładzie 2 poniżej podłoże to określa się jako „podłoże selekcyjne”.

(2-2-2) Procedura mutacji in vitro pLYSCl hydroksyloaminą

Dla wprowadzenia mutacji do plazmidu pLYSCl zastosowano dwa rodzaje metod, którymi była metoda mutagenezy in vitro, w której plazmidy traktuje się bezpośrednio hydroksyloaminą, i dodatkową metodą mutagenezy in vivo, w której komórkę zawierającą plazmid traktuje się nitrozoguanidyną (NTG), a następnie ekstrahuje się plazmid w celu uzyskania zróżnicowania mutacji, to znaczy oczekując mutacji innych niż mutacja zamiany cytozyny na tyminę pod wpływem hydroksyloaminy.

(Mutageneza hydroksyloaminą in vitro) pg DNA traktowano, w warunkach temperatury 75°C w ciągu 1-4 godzin, 0,4 M hydroksyloaminą^,! MKH₂PO₄- lmMEDTA(pH6,0): 100 μΐ, 1 M Hydroksyloamina -1 mMEDTA (pH 6,0): 80 μΐ, DNA: 2 pg, objętość końcowa: 200 pl po uzupełnieniu wodą). Po mutagenezie lxDNA oczyszczono używając proszku szklanego, wprowadzono do szczepu GT3 E. coli, całkowicie pozbawionego AK, i wysiano na podłoże pełne (L-bulion: 1% Bacto trypton, 0,5% ekstrakt drożdżowy, 0,5% NaCl, 1,5% agar) i otrzymano kolonie. Zreplikowano je na podłoże selekcyjne opisane w (2-2-1) i jako potencjalne szczepy wyselekcjonowano te szczepy, które były zdolne do wzrostu w podłożu selekcyjnym. Stwierdzono, że proporcja występowania transformantów i proporcja mutacji przebiegały jak przedstawiono na fig. 5. Poprzez traktowanie w ciągu 4 godzin otrzymano znacząco wysoką proporcje zmutowanych szczepów wynoszącą 0,5-0,8%.

(Mutageneza NTG in vivo)

Do E. coli MCI 061 wprowadzono pLYSCl i traktowano NTG przeprowadzono na całych komórkach. W celu utrwalenia mutacji, po mutagenezie komórki hodowano przez noc, a następnie wyekstrahowano plazmid i wprowadzono go do E. coli GT3. Mianowicie, transformowany szczep hodowano w podłożu 2 x TY (1,6% Bacto trypton, 1 % ekstrakt drożdżowy, 0,5% NaCl), zebrano po osiągnięciu gęstości optycznej OD₆₆₀ około 0,3, przemyto opisanym poniżej buforem TM, a następnie zawieszono w roztworze NTG (przygotowanym przez rozpuszczenie NTG w stężeniu 0,2 mg/ml w buforze TM) i poddano działaniu roztworu w temperaturze 37°C w ciągu 0-90 minut. Komórki przemyto buforem TM i podłożem 2 x TY, po czym utrwalano mutację przez hodowanie w podłożu 2 x TY przez noc. Następnie wyekstrahowano z komórek DNA plazmidowy i wprowadzono go do szczepu GT3 E. coli. Przeszukiwanie potencjalnych szczepów przeprowadzono w taki sposób jak przy mutacji in vitro i otrzymano mutanty wykazujące oporność na lizynę (Lys^R) i wykazujące oporność na AEC (AEC^R).

181 614 (bufor TM)

Tris 50 mM kwas maleinowy 50 mM (NH₄)₂SO₄ 1 g/litr

MgSO₄ · 7 H₂O 0,1 g/litr

Ca(NO₃)₂ 5 mg/litr

FeSO₄ -7 H₂O 0,25 mg/ltr pH doprowadzono do 6,0 stosując NaOH

W sumie 180 potencjalnych szczepów, otrzymanych jak opisano powyżej (traktowanie hydroksyloaminą: 48 szczepów, traktowanie NTG: 132 szczepy), ponownie przeszczepiono na podłoże selekcyjne i dla 153 szczepów potwierdzono uzyskanie oporności na AEC i L-lizynę. Biorąc pod uwagę różnicę w obrazie aminokwasów ulęgających akumulacji w podłożu, podzielono te 153 szczepy na 14 grup i mierzono aktywność AK po wyselekcjonowaniu szczepów reprezentatywnych z każdej grupy. Nie stwierdzono dużej różnicy w aktywności AK między szczepami zmutowanymi otrzymanymi przez traktowanie hydroksyloaminą a szczepami zmutowanymi otrzymanymi przez traktowanie NTG. Dlatego następne doświadczenia przeprowadzono bez ich rozróżniania.

(2-2-3) Izolacja genu lysC* i badanie produktu lysC*

Ze wspomnianych wyżej 14 grup, jako szczepy reprezentatywne wybrano te o numerach: 24,43, 48, 60, 80, 117, 126, 149, 150, 156,158, 167, 19 i 172. Z każdego z nich uzyskano zmutowane plazmidy pochodzące od pLYS Cl, oznaczone odpowiednio jako; pLYSCl*24, pLYSCl *48, pLYSC 1*60, pLYSC 1*80, pLYSC 1 * 117, pLYSC 1 * 126, pLYSC 1*149, pLYSCl * 150, pLYSCl * 156, pLYSC 1*158, pLYSC* 167, pLYSC 1 * 169 i pLYSC 1*172. Szczep GT3 całkowicie pozbawiony AK stransformowano tymi plazmidami i pLYSCl typu dzikiego. Przygotowano wolny od komórek ekstrakt z każdego ze stransformowanych szczepów i mierzono aktywność enzymatyczną AKIII.

Wolny od komórek ekstrakt (roztwór nieoczyszczonego enzymu) przygotowano w następujący sposób. Stransformowany szczep hodowano w podłożu 2 x TY i zbierano po osiągnięciu gęstości optycznej OD₆₆₀ około 0,8. Komórki przepłukano 0,02 M KH₂PO₄ (pH 6,75) - 0,03 M β-merkaptoetanolem w warunkach temperatury 0°C i rozbito przez sonifikację (0°C, 100 W, 30 minut x 4). Roztwór rozbitych komórek odwirowano przy 33 000 obrotów na minutę w ciągu 1 godziny, w warunkach temperatury 0°C, dla otrzymania supematantu, do którego dodano siarczan amonowy do uzyskania 80% nasycenia. Po wirowaniu rozpuszczono osad w 0,02 M KH₂PO₄ (pH 6,75) - 0,03 M β-merkaptoetanolu i przechowywano w temperaturze 0°C przez noc.

Aktywność enzymatyczną AKIII mierzono zgodnie z metodą Stadtmana i in. (Stadtman, E. R., Cohen, G. N., LeBras, G. i Robichon-Szulmajster, H, J. Biol.Chetn., 236,2033 (1961)). Mianowicie, roztwór reakcyj ny o podanym poniżej składzie inkubowano w temperaturze 27°Ć w ciągu 45 minut i dodawano roztwór FeCl₃ (0,4 ml 2,8 N HC1+0,4 ml 12% TCA TCA+0,7 ml 5% FeCl₃ · 6 Η₂Θ/0,1 N HC1) dla uzyskania barwy, żwirowano, a następnie zmierzono absorbancję aupematantu przy długości fali 540 nm. Aktwyność oznaczano przez ilość kwasu hydroksamowego tworzonego na minutę (1U = 1 pmol/min). Molowy współczynnik absorbancji wynosił 600. Roztwór reakcyjny, który miał służyć jako próba odniesienia, nie zawierał asparaginianu potasowego.

(Skład roztworu reakcyjnego) mieszanina reakcyjna * 1 0,3 ml roztwór hydroksyloaminy * 2 0,2 ml

0,1 M asparaginian potasowy (pH 7,0) 0,1 ml roztwór enzymu woda (pozostałość) objętość końcowa 1,0 ml * 1: 9 ml l M Tris-HCl (pH 8,1) + 0,5 ml 0,3 M MgSO₄ + 5 ml 0,2 M ATP (pH 7,0) *2: 8 M roztwór hydroksyloaminy zobojętniono KOH bezpośrednio przed użyciem.

W celu zmierzenia aktywności enzymatycznej AK, do roztworu reakcji enzymatycznej dodawano różne stężenia L-lizyny i badano stopień hamowania pod wpływem L-lizyny. Wyniki

181 614 przedstawiono na fig. 6 i w tabeli 3. Wyniki dla enzymu typu dzikiego i o numerach: 24,43,48, 60,80,117i 126 przedstawiono na fig. 6A. Wyniki dla enzymów o numerach: 149,150,156,158, 167, 169 i 172 przedstawiono na fig. 6B.

Jak wskazują te wyniki, AKIII typu dzikiego, która była hamowana w 50% w obecności około 0,45 M L-lizyny i hamowana w około 100% w obecności 5 mM, ulegała silnemu hamowaniu przez L-lizynę. W przeciwieństwie, otrzymane tym razem zmutowane AKIII, miały w różnym stopniu zniesioną wrażliwość, jednak wrażliwość na hamowanie przez L-lizynę była zniesiona u wszystkich 14 rodzajów. Szczególnie w przypadku enzymów o numerach 24, 80, 117,169 i 172 obserwowano tylko nieznaczne hamowanie nawet w obecności 100 mM L-lizyny, i wykazywały one stężenia hamujące w 50%, które były nie mniej niż 200-krotne w porównaniu ze stężeniami hamującymi w 50% dla typu dzikiego. Aktywność właściwa w przeliczeniu na białko całkowite, na która mogłyby mieć wpływ warunki wzrostu komórek i przygotowanie prób, była równa lub wyższa od aktywności właściwej w przeliczeniu na białko całkowite dla typu dzikiego w prawie wszystkich przypadkach, w których wystąpił niewielki problem spadku aktywności w wyniku wprowadzenia mutacji (tabela 3). W związku z tym faktem, postulowano, że centrum aktywne AKIII było niezależne i miejsce regulacji przez L-lizyny były niezależne od siebie. W tabeli 3 stopień zniesienia wrażliwości na hamowanie (%) odnosi się do aktywności AK w obecności 100 mM L-lizyny, w stosunku do aktywności AK w nieobecności L-lizyny w roztworze reakcyjnym. Stabilność termiczna (%) odnosi się do proporcji utrzymania aktywności po traktowaniu temperaturą 5 5 °C w ciągu 1,5 godziny.

Tabela 3

	Aktywność właściwa (U/mg białka)	Stopień zniesienia wrażliwości na hamowanie (%) ¹	Stabilność termiczna (%)‘²
Typ dziki	0,0247	0	18
Nr 117	0,0069	120	0
Nr 24	0,0218	100	30
Nr 80	0,0244	99	36 '
Nr 172	0,0189	97	» i
Nr 169	0,0128	96	2
Nr 150	0,0062	77	²⁵
Nr 126	0,0250	61	39 I
Nr 149	0,0256	59	9
Nr 167	0,0083	43	45
Nr 48	0,0228	38	42
Nr 60	0,0144	35	9
Nr 158	0,0224	22	42 i
Nr 156	0,0101	18	2 j
Nr 43	0,0212	17	⁰

* 1: aktywność AK (%) w obecności 100 mM L-lizyny w stosunku do aktwyności AK w nieobecności L-lizyny *2: proporcja utrzymania aktywności (%) po traktowaniu temperaturą 55°C w ciągu 1,5 godziny

Następnie badano stabilność termiczną zmutowanych enzymów. Kiedy zamierza się ulepszyć enzym dla zwiększenia jego aktywności, ważne jest, aby utworzony enzym utrzymywał stabilność w komórkach. Pomiar in vitro nastręcza pewne trudności z powodu różnic w akty wnościach wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych proteaz oraz wpływu buforów używanych do przechowywania enzymów in vitro. Jednakże, dla ułatwienia, stabilność termiczną zmutownaych AKIII badano jako jeden parametr in vitro.

Na podstawie wyników badań temperatury inaktywacji AKIII w różnych warunkach, mierzono proporcję utrzymania aktywności po traktowaniu temperaturą 55°C w ciągu 90 minut.

181 614

Jak przedstawiono w tabeli 3, połowa enzymów była raczej bardziej doskonała niż enzym typu dzikiego. Na ogół zmutowany enzym jest często niestabilny w porównaniu z enzymem typu dzikiego. Jednakże, niektóre z otrzymanych tym razem zmutowanych AKIII przewyższały enzym typu dzikiego pod względem stabilności i wiele z nich wydawało się dość użytecznymi dla zastosowania praktycznego do wytwarzania L-lizyny.

(2-2-4) Określenie sekwencji zasad lysC typu dzikiego i zmutowanego lysC

Sekwencję nukleotydową otrzymanego tu genu lysC typu dzikiego określono zgodnie ze zwykłą metodą przy użyciu sekwenatora DNA ABI Model 373A (wyprodukowanego przez Applied Biosystems Inc.) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 7). W wyniku tego stwierdzono różnice w sześciu miejscach (dwa miejsca na poziomie aminokwasowym) w porównaniu z opublikowaną wcześniej sekwencjąlysC szczepu K-12 JC411 E. coli (Cassan, M., Rarsot, C., Cohen, G. Ν. I Patte, J. C., J. Biol. Chem., 261 1052 (1986)). Uważa się, że różnica w sześciu miejscach wynika z różnicy w użytym szczepie bakteryjnym.

W ten sam sposób określono sekwencje zasad dla każdego z lysC* występujących w 14 rodzajach zmutowanych pLYSCl i wyjaśniono miejsca mutacji. Wyniki przedstawiono w tabeli 4. W tabeli tej, dane w nawiasach pokazują mutacje reszt aminokwasowych na podstawie mutacji nukleotydów. wystąpiło 12 rodzajów mutacji, ponieważ dwa zestawy (numer 4 i numer 167, numer 24 i numer 80) posiadały dokładnie te same typy mutacji wśród 14 rodzajów. Pod względem typów mutacji, numery 149, 150,156,158,167, 169 i 172 otrzymano przez traktowanie hydroksyloaminą, anumery 24,43,48,60,80,117 i 126 otrzymano przez traktowanie NTG. Jednakże, każda z nich polegała na mutacji zamiany cytozyny na tyminę lub mutacji zamiany guaniny na adeninę w nici kodującej w wyniku mutacji zamiany cytozyny na tymine w nici niekodującej.

Tabela 4

Określenie miejsc mutacji lysC*

Typ mutacji lysC*	Czynnik mutagenny	Miejsce mutacji (zmiana aminokwasu)
Numer 126	N	GGT -> GA*T (³²³Gly - > Asp)
Numer 43	N	GGT -> GAT (³²³Gly - > Asp) GGC->GAC (⁴⁰⁸Gly ->Asp)
Numer 149	H	CGT - > T* GT (³⁴Arg - > Cys) GGT - > GA* T (³²³Gly - > Asp)
Numer 48/167	N/H	CTC - > T*TC (³²⁵Leu - > Phe)
Numer 150	H	ATG->ATA* (³¹⁸Met->lle)
Numer 172	H	⁷⁷⁵c - > T (milcząca) ATG->ATA* (³¹⁸Met->Ile) GTG - > A*TG (³⁴⁹Val - > Met)
Numer 117	N	TCA - > TT*A (³⁴⁵Ser - > Leu)
Numer 158	H	GTG - > A*TG (³⁴⁷Val - > Met)
Numer 24/80	N/N	ACC ->AT*C (³⁵²Thr - > Ile)
Numer 169	H	⁹²³C - > T (milcząca) ACC - > ATC (³⁵²Thr - > Ile) TCT->TTT(³⁶⁹Ser->Phe)
Numer 60	N	⁸⁵⁹G-> A (milcząca) 1 GAA - > A*AA (¹⁶⁴G1u - >Lys)
Numer 156	H	ATG->ATA* (^4l7Met->Ile) । TGT - > TA*T (⁴'⁹Cys - >Tyr) : ^20l4C ->T (milcząca) i

*: H; traktowanie hydroksyloaminą, N; traktowanie NTG

181 614

Przykład 3: Fermentacyjne wytwarzanie L-lizyny za pomocą szczepu z wprowadzonym dapA*

Przy wytwarzaniu L-lizyny przy użyciu E. coli, w sposób wskazany w japońskim wyłożeniowym zgłoszeniu patentowym numer 56-18596, w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 346 170 i AppliedMicrobiology andBiotechnology, 15,227-231 (1982), uważa się za istotne, aby gospodarz dla wzmocnienia DDPS posiadał kinazę asparaginianową zmienioną w taki sposób, aby nie ulegała hamowaniu przez L-lizynę. Przykładem takiego szczepu mogąbyć bakterie wytwarzające L-treoninę. Spośród znanych obecnie wytwarzających treoninę szczepów E. coli, najwyższą wydajność wytwarzania wykazuje szczep B-3996. A zatem, do oceny dapA* zastosowano jako gospodarza szczep B-3996. Szczep B-3996 zawiera pozachromosomalnie pVIC40 jako jedyny plazmid. Szczegóły opisano w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 3501682 (PCT). Mikroorganizm ten zdeponowano w Research Institute for Genetics and Indistrial Microorganism Breeding pod numerem rejestracyjnym RIA 1867.

Z drugiej strony, opierając się na stopniu zniesienia wrażliwości na hamowanie i aktywności właściwej enzymu, jako dapA* do wprowadzenia do E. coli wyselekcjonowano dapA* zawarty w pdapAS24 (w którym resztę histydyny w pozycji 118 zastąpiona jest resztą tyrozyny). Po pierwsze, w celu zwiększenia ilości ulęgającego ekspresji produktu dapA* i zwiększenia stabilności plazmidu, zmutowany dapA* występujący w pdapAS24 (w dalszym ciągu niniejszego opisu określany jako „dapA*24”) zligowano za promotorem genu oporności na tetracyklinę pVIC40 i otrzymano RSF24P, jak przedstawiono na fig. 7. Szczep otrzymany przez wprowadzenie plazmidu RSF24P do szczepu JM109 E. coli oznaczono jako AJ 12395 i zdeponowano w National Institute of Bioscence and Humań Technology of Agency of Industrial Science and Technology 28 października 1993 roku pod numerem dostępu FERM P-13 93 5, przeniesiono z pierwotnego depozytu do międzynarodowego depozytu na warunkach Porozumienia Budapeszteńskiego 1 listopada 1994 roku i zdeponowano pod numerem dostępu FERM BP-4858. Szczepów zawierających pdapAS8 i pdapAS9 nie zdeponowano. Jednakże, wszystkie z miejsc mutacji dapA* w każdym z plazmidów wyjaśniono jak opisano powyżej. Tak więc, dla specjalistów w tej dziedzinie oczywiste jest, że plazmid uzyskuje się ze wspomnianej powyżej zdeponowanej bakterii przy zastosowaniu metody Maniatisa i in. (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1,21 (1989)), a docelowy gen otrzymuje się przy użyciu metody mutagenezy ukierunkowanej (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 15, 63 (1989)).

pVIC40 usunięto ze szczepu B-3996 zgodnie ze zwykłąmetodąi otrzymano szczep B-399 jako szczep nie posiadający plazmidu. Plazmid RSF24P wprowadzono do szczepu B-399 zgodnie ze zwykłą metoda i otrzymano B-399/RSF24P. Oceniono wydajność wytwarzania L-lizyny przez B-399/RSF24P.

Z drugiej strony, jako plazmid kontrolny skonstruowano RSFP. Mianowicie, wyselekcjonowano duży fragment z produktów trawienia pVIC40, strawionego podwójnie BanHI i Dral j ak przedstawiono na fig. 7, i utworzono tępe końce za pomocą fragmentu Klenowa polimerazy DNA. Duży fragment z tępymi końcami poddano samoligacji dla otrzymania plazmidu RSFP. RSFP wprowadzono do szczepu B-399 zgodnie ze zwykłąmetodąi otrzymano B-399/RSFP. Oceniono także wydajność wytwarzania L-lizyny przez B-399/RSFP.

Hodowlę prowadzono z wytrząsaniem przy 114-116 obrotów na minutę w warunkach okresu hodowli trwającego 48 godzin i temperatury 37°C, przy użyciu podłoża o poniżej podanym składzie. Wyniki przedstawiono w tabeli 5.

(podłoże do wytwarzania L-lizyny) ekstrakt drożdżowy (Difco) 2 g/litr

A: (NH₄)₂SO₄ 16 g/litr

KH₂PO₄ 1 g/litr

MgSO₄ · 7H₂O 1 g/litr

H₂O 0,01 g/litr

MnSO₄-5H₂O 0,01 g/litr

181 614

L-metionina 0,5 g/litr

L-treonina 0,1 g/litr

L-izoleucyna 0,05 g/litr pH doprowadza się do 7,0 za pomocą KOH, autoklawować w temperaturze 115°C w ciągu 10 minut. (16/20 objętości)

B: 20% glukoza (autoklawowana w temperaturze 115°C w ciągu 10 minut) (4/20 objętości)

C: CaCO₃ wg norm Farmakopei (sterylizowany termicznie w stanie suchym w temperaturze 180°C w ciągu 2 dni) (30 g/litr)

A i B miesza się w stosunku A:B = 4:1, do 1 litra roztworu dodaje się i rozpuszcza 30 g C, po czym dodaje się antybiotyki (streptomycyna: 100 pg/ml, kanamycyna: 5 pg/ml).

Tabela 5

Szczep bakteryjny	Ilość wytwarzanego chlorowodorku L-lizyny
B-399/RSF24P B-399/RSFP	4,1 g/litr 0 g/litr

Przykład 4: Fermentacyjne wytwarzanie L-lizyny za pomocą szczepu z wprowadzonymi dapA* i lysC* (I)

Wpływ zmutowanej DDPS na wytwarzanie L-lizyny przedstawiono w przykładzie 3. W celu uzyskania dalszej poprawy umożliwiono współwystępowanie otrzymanego w przykładzie 2 zmutowanego genu AKIII ze zmutowanym genem DDPS. Na zmutowany gen AKIII przeznaczony dla współwystępowania ze zmutowanym genem DDPS wybrano ten pochodzący ze szczepu numer 80 (lysC*80) na podstawie aktywności enzymatycznej, stabilności termicznej i podobnych.

lysC*80 użyto po wycięciu z plazmidu pLLC80 (fig. 8), przygotowanego przez altematywnąligację lysC* obecnego w pLYS Cl *80 (w dalszym ciągu określony jako lysC*80) za promotorem lacZ wektora pHSG399 (produkowanego przez Takara Shuzo Co., Ltd), posiadającego miejsce do wstawiania w odwróconej orientacji w porównaniu do pUC18 w celu zwiększenia ekspresji lysC*. pLLC* 80 jest plazmidem przygotowanym dla ustawienia lysC* 80 w celu umożliwienia normalnego kierunku transkrypcji względem promotora lacZ dla poprawy wydajności wytwarzania L-lizyny, ponieważ transkrypcja lysC*80 miała odwróconą orientacje w stosunku do promotora lacZ.

Plazmid RSFD80 zawierający dapA* i lys*C przygotowano z otrzymanych w przykładzie 3 pLLC*80 i RSF24P, jak przedstawiono na fig 9. RSFD80 zawiera dapA*24 i lysC*80 ułożone w tej kolejności, co umożliwia normalną orientację kierunku transkrypcji względem tetP za promotoren (tetP) genu oporności na tetracyklinę.

Plazmid RSFD80 wprowadzono do szczepu JM109 E. coli, który oznaczono jako AJ12396. AJ12396 zdeponowano w National Institute of Bioscience and Humań Technology of Agency of Industrial Science and Technology 28 października 1993 r. pod numerem dostępu FERM P-13936 i 1 listopada 1994 r. przeniesiono z pierwszegop depozytu do międzynarodowego depozytu na warunkach Porozumeinia Budapeszteńskiego pod numerem dostępu FERM BP-4859. Szczepów zawierających pLYSCl*24, pLYSCl*43, pLYSCl*48, pLYSCl*60, pLYSCl*117, pLYSCl*126, pLYSCl*149, pLYSCl*150, pLYSCl*156, pLYSCl*158, pLYSC*167, pLYSCl*169 i pLYSCl*172 nie zdeponowano. Jednakże, wszystkie z miejsc mutacji lysC* 80 w każdym z plazmidów wyjaśniono jak opisano powyżej. A zatem, dla specjalistów w tej dziedzinie jest zrozumiałe, że plazmid odzyskuje się z wyżej wymienionej zdeponowanej bakterii stosując metodę Maniatisa i in. (Sambrook, J., Fritsch, E. E, Maniatis, T, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1,21 (1989)), a gen docelowy otrzymuje się me181 614 todąmutagenezy ukierunkowanej (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 15,63 (1989)). RSFD80 wprowadzono do szczepu B-399 zgodnie ze zwykłą metodą i otrzymano B-399/RSFD80. Oceniano wydajność wytwarzania L-lizyny przez B-399/RSFD80. Oceniano także wydajność wytwarzania L-lizyny przez B-399/RSFP jako kontrolę.

Hodowle prowadzono w ciągu 48 godzin z wytrząsaniem przy 114-116 obrotów na minutę w temperaturze 37°C, stosując to samo podłoże do wytwarzania L-lizyny jak w przykładzie 3. Wyniki przedstawiono w tabeli 6.

T a b e l a 6

Szczep bakteryjny	Ilość wytworzonego chlorowodorku L-lizyny
B-399/RSFD B-399/RSFP	9,2 g/litr 0 g/litr

Przykład 5: Fermentacyjne wytwarzanie L-lizyny za pomocą szczepu z wprowadzonymi dapA* i lysC* (II)

W przykładzie 4 potwierdzono, że wydajność wytwarzania L-lizyny można poprawić przez umożliwienie bakterii z rodzaju

Escherichia posiadania zmutowanego genu dapA i zmutowanego genu lysC. Przeprowadzono doświadczenia w celu potwierdzenia, czy ten wpływ jest zachowywany przy zmianie gospodarza. Jako gospodarza użyto szczepu W3110 (tyraA) E. coli. Szczep W3110 (tyraA) opisano szczegółowo w publikacji europejskiego opisu patentowego numer 488424/92. Sposób jego przygotowania zostanie krótko opisany poniżej. Szczep W3110. E. coli otrzymano z National Institute of Genetics (Mishima-shi, Shizuoka-ken, Japonia). Szczep ten wysiano na płytkę z podłożem LB zawierającym streptomycynę, a oporny na streptomycynę szczep otrzymano przez selekcję szczepów tworzących kolonie. Wyselekcjonowany szczep oporny na streptomycynę zmieszano ze szczepem K-12 ME8424 i hodowano stacjonarnie na pełnym podłożu (L-bulion: 1% Bacto trypton, 0,5% ekstrakt drożdżowy, 0,5% NaCl) w temperaturze 37°C w ciągu 15 min dla indukacji konjugacji. Szczepy K-12 ME8424 E. coli, dostępny w National Institute of Genetics, posiada następujące cechy genetyczne (HfrPO45, thi, relAl, tyraA: Tnl0„ ung-1, nadB).

Hodowle wysiano następnie na pełne podłoże (L-bulion: 1 % Bacto trypton, 0,5% ekstrakt drożdżowy, 0,5% NaCl, 1,5% agar), zawierające streptomycynę, tetracyklinę i L-tyrozynę i wyselekcjonowano szczep tworzący kolonie. Szczep ten oznaczono E. coli W3110(tyrA).

Nawiasem mówiąc, publikacja europejskiego opisu patentowego numer 488424/92 opisuje wiele szczepów utworzonych przez wprowadzenie plazmidu do szczepu W3110(tyrA). Na przykład, szczep otrzymany przez wprowadzenie plazmidu pHATerem oznaczono E. coli W3110 (tyrA)/pHATerm, i zdeponowano w National Institute of Bioscience and Humań Technology of Agency of Industrail Science and Technology pod numerem rejestracyjnym FERM BP-3653. Szczep W3110 także można przygotować przez usuniecie plazmidu pHATerm ze szczepu W3110(tyrA)/pHATerm E. coli.. Usunięcie plazmidu można przeprowadzić zgodnie ze zwykłym sposobem.

Przygotowany w przykładzie 4 plazmid RSFD80, zawierający zarówno dapA*, jak i lysC*, wprowadzono do W3110(tyrA) otrzymanego jak opisano powyżej i otrzymano W3110(tyrA)/RSFD80. Dla W3110(tyrA)/RSFD80 oceniano wydajność wytwarzania L-lizyny. Jako kontrolę, RSFP wprowadzono do szczepu W3110(tyrA) zgodnie ze zwykłą metodą i otrzymano W3110(tyrA)/RSFP. Wydajność wytwarzania L-lizyny oceniono dla W3110(tyrA)/RSFP jako kontroli.

Hodowlę prowadzono w ciągu 48 godzin z wytrząsaniem przy 114-116 obrotów na minutę w temperaturze 37°C, stosując wymienione powyżej podłoże do wytwarzania L-lizyny.

Wyniki przedstawiono w tabeli 7.

181 614

Tabela 7

Przykładó: Analiza etapów układu biosyntezy L-lizyny ograniczających szybkość i wzrost wydajności wytwarzania L-lizyny przez bakterie wytwarzające L-lizynę, należące do rodzaju Escherichia

Próbowano zwiększyć wydajność wytwarzania L-lizyny poprzez analizę etapów układu biosyntezy L-lizyny ograniczających szybkość u E. coli i wzmocnienie genów enzymów katalizujących te etapy.

< 1 > Identyfikacja pierwszych etapów ograniczających szybkość (6-1-1). Przygotowanie genów układu biosyntezy L-lizyny

Etap ograniczający szybkość zidentyfikowano przez wyizolowanie różnych genów układu biosyntezy L-lizyny, wprowadzenie tych genów do E. coli i zbadanie wpływu każdego z tych genów na wydajność wytwarzania L-lizyny. Wprowadzone geny enzymów układu biosyntezy L-lizyny i enzymy kodowane przez nie są następujące:

ppc: karboksylaza fosfoenolopirogronianowa aspC: aminotransferaza asparaginianowa lysC: kinaza asparaginianowa III lysC*80: kinaza asparaginianowa III o zniesionej wrażliwości na hamowanie asd: dehydrogenaza semialdehydu asparaginianowego dapA: syntaza dihydropikolinianową dapA*24: syntaza dihydropikolinianową o zniesionej wrażliwości na hamowanie dapB: reduktaza dihydropikolinianową

DDH: dehydrogenaza diaminopimelinianowa (pochodząca z Brevibacterium lactofermentum lysA: dekarboksylaza diaminopimelinianowa

Opisane powyżej geny dokładnie pokrywają się z układem biosyntezy L-lizyny od kwasu fosfoenolopirpogronowego do L-lizyny. Spośród genów układu biosyntezy L-lizyny pierwotnie posiadanych przez E. coli, geny dapC, dapD, dapE, i dapF zastąpiono genem DDH kodującym DDH (dehydrogenazę diaminopimelinianową) z Brevibacterium lactofermentum, która może sama katalizować reakcje dotyczące produktów tych genów. Jako gospodarza do wprowadzenia tych genów użyto szczepu W3110 (tyraA) serii E. coli K-12.

Geny dapA i dapA*24 otrzymano przez wycięcie z, odpowiednio, pdapA2 i pdapAS24 (zobacz przykład 1) za pomocą EcoRI i Kpnl (figura 10). Geny te zligowano z pM W118, który strawiono za pomocą£coRI i Kpnl dla otrzymaniapdapA o pdapA*. Geny lysC i LysC*80 otrzymano przez wycięcie z, odpowiednio, pLYSCl i pLLC*80 (patrz przykład 2) za pomocą £coRI i Sphl. Geny te zligowano z pMWl 19, który strawiono za pomocą£coRI i Sphl dla otrzymania plysC i plysC* (fig. 11).

Gen ppc otrzymano z plazmidu pT2 zawierającego ten gen. pT2 strawiono Smal i Scal i utworzono tępe końce, a następnie wstawiono do miejsca Smal pMWl 18 w celu otrzymania plazmidu pppc (fig. 12). E. coli FI 5 (AJ12873) zawierający pT2 zdeponowano w National Institute of Bioscience and Humań Technology of Agency of Industrial Science and Technology pod numerem dostępu FERM BP-4732.

Gen aspC otrzymano z plazmidu pLF4 (Inokuchi, K. i in., Nucleic Acids Res., 10, 6957 (1982)) zawierającego ten gen (fig. 13). pLF4 strawiono PvuII o Stul i utworzono tępe końce, a następnie wstawiono do miejsca Smal pMWl 19 w celu otrzymania plazmidu paspC.

181 614

Gen osad otrzymano z plazmidu pAD20 (Haziza, C. i in., EMBO, 1 379 (1982)) zawierającego ten gen. pAD20 strawiono Asel i Ciał, utworzono tępe końce, a następnie wstawiono do miejsca Smal pMWl 18 w celu otrzymania plazmidu pasd (fig. 14).

Gen dapB otrzymano przez zamplikowanie genu dapB z chromosomalnego DNA szczepu W3110 E. coli, stosując metodę PCR przy użyciu dwóch rodzajów starterów oligonukleotydowych (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 9 i numerze identyfikacyjnym: 10) przygotowanych na podstawie sekwencji nukleotydowej znanego genu dapB (Bouvier, J. i in., J. Biol. Chem., 259, 14829 (1984)) (fig. 15). Otrzymany zamplifikowany fragment DNA strawiono Asel i Dral i otworzono tępe końce, a następnie wstawiono do miejsca Smal pMW 119 w celu otrzymania plazmidu pdapB.

Gen DDH otrzymano przez zamplifikowanie genu DDH z chromosomalnego DNA Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, stosując metodę PCR przy użyciu dwóch rodzajów starterów oligonukleotydowych (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 11 i numerze identyfikacyjnym: 12) przygotowanych na podstawie znanej sekwencji nukleotydowej genu DDH z Corynebacterium glutamicum (Ishido, S. i in., Nucleic Acid Res.,15,3917 (1987)). Otrzymany zamplifikowany fragment DNA strawiono EcoT221 i Aval, utworzono tępe końce, a następnie wstawiono do miejsca Smal pMWl 19 w celu otrzymania plazmidu pDDH (fig.16).

Gen lysA otrzymano przez zamplifikowanie genu lysA z chromosomalnego DNA szczepu W3110 E. coli, stosując metodę PCR przy użyciu dwóch rodzajów starterów oligonukleotydowych (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 13 i numerze identyfikacyjnym: 14) przygotowanych na podstawie sekwencji nukleotydowej znanego genu lysA (Stragier, P. i in., J Mol. Biol., 168,321 (1983)). Otrzymany zamplifikowany fragment DNA strawiono Spll i Bell iutworzono tępe końce, a następnie wstawiono do miej sca Smal pM W118 w celu otrzymania plazmidu plysA (fig. 17).

Potwierdzenie faktu, że każdy ze wspomnianych wyżej genów sklonowano, przeprowadzono przez strawienie ich za pomocą enzymów restrykcyjnych przedstawionych na figurach. Wektory pMW118 i pMW 119 (wyprodukowane przez Nippon Gene) użyte do sklonowania tych genów, wybrano ze względu na ich zdolność do współwystępowania w komórkach E. coli razem z RSF1010 jako wektorem użytym do przygotowania opisanych poniżej plazmidów do wytwarzania lizyny, a także stabilnego mechanizmu rozdziału.

(6-1 -2) Wydajność wytwarzania L-lizyny przez E. coli z wprowadzonymi genami układu biosyntezy L-lizyny.

W3110 (tyrA) E. coli stransformowano każdym z plazmidów zawierających opisane powyżej geny układu biosyntezy L-lizyny, a otrzymane transformanty hodowano dla przeprowadzenia wytwarzania L-lizyny. Hodowlę prowadzono w ciągu 30 godzin w warunkach temperatury hodowli 37°C i wytrząsaniu przy 114-116 obrotów na minutę, stosując podłoże o poniżej podanym składzie. Wyniki przedstawiono w tabeli 8.

(Skład podłoża)

glukoza	40 g/litr
MgSO₄7H₂O	1 g/litr
(NH₄)₂SO₄	16 g/litr
kh₂po₄	1 g/litr
FeSO₄ -7 H₂O	0,01 mg/ltr
MnSO₄ · 5 H₂O	0,01 g/litr
ekstrakt drożdżowy (Difco)	2 g/litr
L-tyrozyna	0,1 g/litr

pH doprowadzono do 7,0 stosując KOH, a następnie autoklawowano w temperaturze

115°C w ciągu 10 minut (glukozę i MgSO₄ · 7 H₂O sterylizowano oddzielnie).

CaCO₃ wg norm Farmakopei 25 g/litr (sterylizowany termicznie w stanie suchym, w temperaturze 180°C w ciągu 2 dni)

Antybiotyki (streptomycyna 20 mg/litr lub ampicylina 50 mg/litr w zależności od rodzaju wprowadzanego plazmidu)

181 614

Tabela 8

Szczep bakteryjny	Ilość wytwarzanego chlorowodorku L-lizyny (g/litr)	Wydajność wobec cukru (%)
W3110 (tyr A)	0,08	0,2
W3110 (tyr A)/pppc	0,08	0,2
W3110(tyr A)/paspC	0,12	°,3
W3110 (tyr A)/plysC	0,08	0,2
W3110(tyr A)/plysC*	2,27	5,57
W3110 (tyr A)/pasd	0,12	0,3
W3110 (tyr A)/pdapA	2,32	5,70
W3110(tyrA)pdapA*	3,63	8,90
W3110(tyr A)pdapB	0,08	0,2
W3110(tyr A)pDDH	0,08	0,2
W3110 (tyr A)plysA	0,12	0,3 !

E. coli W3110 (tyrA) rozpoczyna wytwarzać L-lizynę dzięki wprowadzeniu plysC*, pdapA lub pdapA*. Ponieważ zarówno produkt lysC, jak i produkt dapA ulegają hamowaniu przez L-lizynę na zasadzie sprzężenia zwrotnego, można przypuszczać, że enzymy te są głównymi punktami regulacyjnymi w biosyntezie L-lizyny. Reakcja katalizowana przez produkt dapA występuje w pozycji rozgałęzienia na układ biosyntezy L-treoniny, L-metioniny i L-izoleucyny i układu biosyntezy L-lizyny i jest pierwszym etapem układu biosyntezy wyłącznie L-lizyny. Donoszono uprzednio, że E. coli rozpoczyna także wytwarzać L-lizynę dzięki zamplifikowaniu dapA typu dzikiego (Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 15 227 (1982)), co potwierdzają również wyniki opisane powyżej. Z drugiej strony, wyniki z przykładu 3 ponownie potwierdzono tym, że wydajność L-lizyny ulega dalszemu zwiększeniu, gdy wprowadza się do E. coli dapA*, jako typ genu o zniesionej wrażliwości na hamowanie.

Roztwory nieoczyszczonych enzymów przygotowano z W3110(tyrA), W3110(tyrA)/pdapA i W3110(tyrA)/pdapA* w taki sam sposób jak w przykładzie 1, mierzono aktywność DDPS (syntezy dihydrodipikolinianowej) i badano stopień hamowania aktywności DDPS przez L-lizynę. Wyniki przedstawiono w tabeli 9.

Tabela 9

Szczep bakteryjny	Aktywność właściwa*¹	Stopień zniesienia wrażliwości 1 na hamowanie *2 i
W3110(tyrA)	.0,0423	50
W3110(tyrA)/pdapA	0,2754	22,9
W3110(tyrA/pdapA*	0,1440	76,5

, 1: pmole/min/mg białka

2: proporcja utrzymania aktywności (%) w obecności 5 MM L-lizyny

Produkt dapA* o zniesionej wrażliwości na hamowanie ma prawdopodobnie duży wpływ na wytwarzanie L-lizyny, ponieważ posiada on wysoki stopień zniesienia wrażliwości na hamowanie, chociaż ma niższą aktywność właściwą niz. enzym typu dzikiego (około 1/2). Wykazano konieczność zniesienia wrażliwości na hamowanie produktu dapA dla wytwarzania L-lizyny. Ponadto, fakt, że lysC* ma wpływ na wytwarzanie L-lizyny można rozpatrywać następująco. Pierwszym etapem ograniczającym szybkość jest etap, w którym HD (dehydrogenaza homoserynowa: produkt thrA lub metLM) współzawodniczy z DDPS (produkt dapA) o ASA (β-semialdehyd asparaginianowy) jako substrat służący obu odgałęzieniom układu biosyntezy, gdy wzmacnia się dapA jak opisano powyżej, reakcja przebiega w kierunku biosyntezy L-lizyny.

181 614

Z drugiej strony uważa się, że gdy ilość dostarczanego ASA podnosi się przez wzmocnienie lysC, który uczestniczy w reakcji leżącej dalej przed dapA, ułatwiona jest także każda z reakcji istotnych dla HD i DDPS ułatwiona, tak więc Ilość wytwarzanej L-lizyny zostaje również podwyższona. Jednak efekt ten trudno otrzymać przez tylko wzmocnienie lysC typu dzikiego. Dzieje się tak prawdopodobnie dlatego, że hamowanie AKIII typu dzikiego (produkt lysC) przez L-lizynę jest silniejsze niż hamowanie przez L-lizynę DDPS typu dzikiego (AKIII i DDPS hamowane są, odpowiednio, w około 100% i 80% w obecności 5 mM L-lizyny).

Zgodnie z faktami opisanymi powyżej ustalono, że pierwszym etapem ograniczającym szybkość była reakcja katalizowana przez DDPS, mająca większy wpływ na wytwarzanie lizyny i postulowano, że drugim etapem ograniczającym szybkość była reakcja katalizowana przez AKIII.

< 2> Identyfikacja drugiego etapu ograniczającego szybkość

Drugi etap ograniczający szybkość zidentyfikowano poprzez wzmacnianie różnych genów układu biosyntezy L-lizyny u szczepów z wprowadzonym dapA*, Aby inne plazmidy były stabilne po wprowadzono ich do E. coli posiadającej plazmid zawierający dapA*, przeniesiono dapA* z pdapA do RSF1010 i otrzymano RSF24P (fig. 7). E. coli W3110 (tyrA) stransformowano plazmidem RSF24P zawierającym dapA*.

Plazmidy posiadające geny układu biosyntezy L-lizyny wprowadzono do W3110 (tyrA)/RSF24P. W każdym z otrzymanych transformantów współwy stępo wały dwa rodzaje plazmidów, mianowicie RSF24P i plazmid zawierający inny gen układu biosyntezy L-lizyny. Wydajność wytwarzania L-lizyny dla tych szczepów badano w taki sam sposób, jak w (6-1-2). Wyniki przedstawiono w tabeli 10.

Tabela 10

Szczep bakteryjny	Ilość wytwarzanego chlorowodorku L-lizyny (g/litr)	Wydajność wobec cukru (%)
W3110 (tyrA)RSF24P	3,63	8,9 !
W3110 (tyrA)RSF24P+pppc	3,67	9,0
W3110 (tyrA)RSF24P+pasC	3,59	8,8
W3110 (tyrA)RSF24P+plysC	3,42	8,4 \|
W3110 (tyrA)RSF24P+plysC*	9,17	22,5
W3110 (tyrA)RSF24P+pasd	3,75	9,2
W3110 (tyrA)RSF24P+pdapA	3,55	8,7
W3110 (tyrA)RSF24P+pdapA*	3,46	8,5
W3110 (tyrA)RSF24P+pdapB	4,08	10,0 l
W3110 (tyrA)RSF24P+pDDH	3,67	9,0 !
W3110 (tyrA)RSF24P+plysA	3,55	8,7 I

W wyniku stwierdzono, znaczny wzmacniający wpływ na wydajność wytwarzania tylko w przypadku lysC*. LysC typu dzikiego nie wywiera żadnego wpływu. Jest to prawdopodobnie spowodowane silnym hamowaniem, przez L-lizynę, jak opisano powyżej. Potwierdzono zatem, że reakcja za którą odpowiedzialny jest lysC* była drugim ograniczającym szybkość etapem.

LysC* zintegrowano z RSF24P i otrzymano RSFD (fig. 9). W taki sam sposób lysC zintegrowano z RSF24P i otrzymany plazmid oznaczono RSFD1. Plazmidy te wprowadzono do E. coli W3110 (tyrA), przygotowano roztwory nieoczyszczonych enzymów i aktywność AK oraz stopień hamowania aktywności AK przez L-lizynę zbadano w taki sam sposób, jak w (6-1-2).

Wyniki przedstawiono w tabeli 11.

181 614

Tabela 11

Szczep bakteryjny do oznaczania aktywności AK	Aktywność właściwa*¹	Stopień zniesienia wrażliwości 1 na hamowanie *2 :
W3110(tyrA)/RSF24P	0,94	42,9
W3110(tyrA)/RSFDl	18,55	7,2
W3110(tyrA/RSFD80	33,36	98,8

_e 1: nmole/min/mg białka

2: proporcja utrzymywania aktywności (%) w obecności 5 mM L-lizyny

Aktywności właściwe AK szczepów zawierających plazmidy ulegały 20-30-krotnemu zwiększeniu pod wpływem integracji lysC i lysC* z RSF24P. E. coli posiada trzy rodzaje AK, i spośród nich lysC koduje AKIII. Jednakże, w opisanym powyżej doświadczeniu mierzono całkowitą akty wność trzech rodzajów AK. Przypuszcza się, że hamowanie przez L-lizynę również stanie się silne w szczepie zawierającym RSFD1 ze wstawionym lys typu dzikiego, ponieważ w porównaniu z kontrolą (W3110 (tyrA)/RSF24P) AKIII ma większy udział niż AKI i AKIII, czego wynikiem jest brak wskazań na wpływ na wzmocnienie wydajności wytwarzania L-lizyny. Z drugiej strony ujawniono, że w szczepie zawierającym RSFD 80 wrażliwość na hamowanie AKIII była zniesiona w około 100%, i ten fakt przyczynił się do poprawy wytwarzania L-lizyny.

< 3 > Identyfikacja trzeciego etapu ograniczającego szybkość

Następnie, różne plazmidy układu biosyntezy L-lizyny wprowadzono do E. coli W3110 (tyrA)/RSFD80 i prowadzono hodowlę w celu wytwarzania L-lizyny. Wyniki hodowli przedstawiono w tabeli 12.

Tabela 12

Szczep bakteryjny	Ilość wytwarzanego chlorowodorku L-lizyny (g/litr)	Wydajność wobec cukru (%)
W3110 (tyrA)RSFD80	9,17	22,5
W3110 (tyrA)RSFD80+pppc	8,97	22,0
W3110 (tyrA)RSFD80+paspC	9,05	22,2 i
W3110 (tyrA)RSFD80+plysC	8,56	21,0
W3110 (tyrA)RSFD80+plysC*	8,15	20,0
W3110 (tyrA)RSFD80+pasd	8,35	20,5
W3110 (tyrA)RSFD80+pdapA	8,56	21,0 i
W3110 (tyrA)RSFD80+pdapA*	8,15	20,0
W3110 (tyrA)RSFD80+pdapB	10,80	26,5
W3110 (tyrA)RSFD80+pDDH	8,56	21,0
W3110 (tyrA)RSFD80+plysA	8,48	20,8

Wzmacniający wpływ na wydajność wytwarzania L-lizyny obserwowano tylko w przypadku dapB i stwierdzono, że reakcja za którą odpowiedzialny jest dapB była trzecim etapem ograniczającym szybkość. A zatem, dapB wstawiono do RSFD80, i otrzymano pCAB 1 (fig. 18). Plazmid ten wprowadzono do E. coli W3110 (tyrA), przygotowano roztwór nieoczyszczonego enzymu i aktywność enzymatyczną DDPR (reduktazy dihydrodipikolinianowej) zmierzono zgodnie z metodą opisaną przez Tamira, H. i Gilvarga, C., J. Biol. Chem., 249, 3034 (1974). W ten sam sposób przygotowano roztwory nieoczyszczonych enzymów ze szczepu zawierającego tylko RSFD80 i szczepu zawierającego zarówno RSFD80, jak i pdapB, i zmierzono aktywność DDPR. Wyniki przedstawiono w tabeli 13.

181 614

Tabela 13

Szczep bakteryjny	Aktywność właściwa (pmole/min/mg białka) i
W3110(tyrA)RSFD80	0,027 I
W3110(tyrA)/RSFD80 + pdapB	0,092 i
W3110(tyrAZpCABl	__________________________0,178__________________________1

Aktywność DDPR uległa, w porównaniu z kontrolą (szczepem zawierającym tylko RSFD80) zwiększeniu około 3-krotnie w szczepie zawierającym RSFD80 i pdapB, a w szczepie zawierającym pCABl, w którym dapB wstawiono do RSFD80, uległa ona około 6,5-krotnemu zawieszeniu. W oparciu o fakt, że zarówno W3110 (tyrA)/RSFD80 + pdapB, jak i W3110 (tyrA)/pCAB 1 powodowały równoważną akumulację L-lizyny wynoszącą 10,8 g/litr, uważa się, że dapB dostarczono w wystarczającej ilości do wytwarzania L-lizyny, a etap ograniczający szybkość ulega przesunięciu do innej reakcji.

< 4 > Identyfikacja czwartego etapu ograniczającego szybkość

Następny, czwarty etap ograniczający szybkość zidentyfikowano przez użycie plazmidu pCAB 1 zawierającego lysC*, dapA* i dapB. Różne plazmidy układu biosyntezy L-lizyny wprowadzono do E. coli W3110 (tyrA)/pCABl i prowadzono hodowlę w celu wytwarzania L-lizyny. Wyniki hodowli przedstawiono w tabeli 14.

Tabela 14

Szczep bakteryjny	Ilość wytwarzanego chlorowodorku L-lizyny (g/litr)	Wydajność wobec cukru i (%) i
W3110 (tyrA)ZpCAB 1	10,80	26,5
W3110 (tyrA)ZpCABl + pppc	11,00	27,0
W3110 (tyrA)/pC AB 1 + paspC	10,88	26,7
W3110 (tyrA)ZpCABl + plysC	10,60	26,0
W3110 (tyrA)ZpCAB 1 + plysC*	10,39	25,5
W3110 (tyrA)/pCABl + pasd	10,19	25,0 i
W3110 (tyrA)/pC AB 1 + pdapA	10,72	26,3 i
W3110 (tyrA)ZpCABl -t- pdapA*	10,80	26,5
W3110 (tyrA)/pCABl + pdapB	10,92	26,8
W3110 (tyrA)ZpCAB 1 + pDDH	12,23	30,0
W3110 (tyrA)ZpCAB 1 + plysA	10,60	26,0

Wzmacniający wpływ na wydajność wytwarzania L-lizyny obserwowano tylko w przypadku DDH, i stwierdzono, że reakcja katalizowana przez dapB była czwartym etapem ograniczającym szybkość. Ponadto, SDAP (kwas N-sukcynylo-L,L-a,e-diaminopimelinowy) wykryty w brzeczce hodowlanej szczepu bez wprowadzonego DDH nie został wykryty w brzeczce hodowlanej szczepu z wprowadzonym DDH. Detekcje SDAP prowadzono stosując technikę TLC (skład rozpuszczalnika rozwijającego; metanol: woda:10 N HCkpirydyna = 80:17,5:2,5:10) Bouvier, J., Richaud. C., Higgins, W., Bogler, O i Stragier, P., J. Bacteriol., 174, 5265 (1992). Ponadto, w przypadku szczepu bez wprowadzonego DDH barwa brzeczki była brązowa, ale ulegała zmianie do żółtej w przypadku szczepu z wprowadzonym DDH. Z zatem, DDH zintegrowano z pC AB 1 w celu przygotowania plazmidu pC ABD2 (fig. 19) i zmierzono aktywność DDH E. coli W3110 (tyrA) stransformowanej tym plazmidem. Aktywność enzymatyczną DDH mierzono zgodnie z danymi literaturowymi (Azizono, Haruno, Fermentation and Industry, 45, 964 (1987)). Wyniki przedstawiono w tabeli 15.

181 614

Tabela 15

1 ---- Szczep bakteryjny	Aktywność właściwa (pmole/min/mg białka)
W3110(tyrA)RSFD80	0,000
W3110(tyrA)/RSFD80 + pdapB	0,799
W3110(tyrA/pCABl	2,214

Aktywności DDH nie wykryto w kontroli (W3110 (tyrA)/pCAB 1), ponieważ DDH nie był pierwotnie obecny w E. coli. Aktywność właściwa DDH szczepu zawierającego pCABD2 (W3110 (tyrA)/pCABD2) była około 2,5-krotnie większa niż szczepu zawierającego DDH (W3110 (tyrA)/pCABl + pDDH), jednakże oba szczepy wykazywały równoważną ilość zakumulowanej L-lizyny (12,23 g/litr). A zatem, uważa się że ilość ulegającego ekspresji produktu DDH pCABD2 była ilością dostateczną.

< 5> Analiza etapów ograniczających szybkość spośród etapów, za które odpowiedzialne są dapC, dapD, dapE i dapF

Następnie, w celu zbadania kolejności ograniczania szybkości przez dapC, dapD, dapE, i dapF zastąpione przez DDH w opisanej powyżej analizie, najpierw sklonowano te geny. dapC nie sklonowano, ponieważ brak jest doniesień o jego sekwencji zasad, jednakże pozostałe trzy rodzaje genów sklonowano zgodnie z metodą PCR.

Gen dapD otrzymano przez amplifikację genu dapD z chromosomalnego DNA szczepu W3110 E. coli, stosując metodę PCR, przy użyciu dwóch rodzajów starterów oligonukleotydowych (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 15 i numerze identyfikacyjnym: 16), przygotowanych na podstawie sekwencji nukleotydowej znanego genu dapD (Richaud, C. i in., J. Biol. Chem., 259, 14824 (1984)). Otrzymany zamplifikowany fragment DNA strawiono £co0109I i Sad i utworzono tępe końce, a następnie wstawiono do miejsca Smal pMW 119 w celu otrzymania plazmidu pdapD (fig. 20).

Gen dapE otrzymano przez amplifikację genu dapE z chromosomalnego DNA szczepu W3110 E. coli, stosując metodę PCR przy użyciu dwóch rodzajów starterów oligonukleotydowych (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 17 i numerze identyfikacyjnym: 18), przygotowanych na podstawie sekwencji nukleotydowej znanego genu dapE (Bouvier, J. i in., J. Bacterial., 174, 5265 (1992)). Otrzymany zamplifikowany fragment strawiono Munl i Bglll i utworzono tępe końce, a następnie wstawiono go do miejsca Smal pMWl 18 w celu otrzymania plazmidu pdapE (fig. 21).

Gen dapF otrzymano przez amplifikację genu dapF z chromosomalnego DNA szczepu W3110 E. coli, stosując metodę PCR, przy użyciu dwóch rodzajów starterów oligonukleotydowych (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 19 i numerze identyfikacyjnym: 20), przygotowanych na podstawie sekwencji nukleotydowej znanego genu dapF (Richaud, C. i in., Nucleic Acids Rea., 16, 10367 (1988)). Otrzymany zamplifikowany fragment DNA strawiono Pstl i utworzono tępe końce, a następnie wstawiono do miejsca Smal pMW118 w celu otrzymania plazmidu pdapF (fig. 22).

Każdy z plazmidów otrzymanych w opisany powyżej sposób wprowadzono do W3110 (tyrA)/pCABl i prowadzono hodowlę w celu wytwarzania L-lizyny. W poprzednim doświadczeniu obserwowano zmiany zabarwienia brzeczki oraz obecności lub nieobecności akumulacji półproduktu (SDAP), poza zmianami ilości wytwarzanej L-lizyny, przed i po wprowadzeniu DDH. Analizę etapu ograniczającego szybkość przeprowadzono również wykorzystując te zmiany wskaźniki. Wyniki przedstawiono w tabeli 16.

Tabela 16

Szczep bakteryjny	Ilość wytwarzanego chlorowodorku L-lizyny (g/litr)	Wydajność wobec cukru (%)	Barwa brzeczki	Akumulacja SDAP
W3110 (tyrA)/pCABl	10,80	26,5	brązowa	+
W3110 (tyrA)/pCAB 1 + pdapD	11,87	27,2	żółta
W3110 (tyrA)/pCAB 1 + pdapE	11,12	27,3	brązowa	-
W3110 (tyrA)/pCAB 1 + pdapF	10,96	26,9	brązowa
W3110 (tyrA)/pCAB2	12,23	30,0	żółta	-

Wzmocnienie dapD lub dapE nieznacznie zwiększyło ilość wytworzonej L-lizyny, ale nie powodowało przekroczenia poziomu przy DDH. Ponadto, stwierdzono, że zmiana barwy brzeczki i akumulacji SDAP jako półproduktu obserwowane po wprowadzeniu DDH były zjawiskami niezależnymi od siebie, zmiana barwy brzeczki występowała w wyniku wprowadzenia dapD, a zanikanie SDAP w wyniku wprowadzenia dapE. Na podstawie szlaku biosyntezy. L-lizyny można postulować zależność pomiędzy dapE i SDAP. Wzmocnienie dapF nie ma żadnego wpływu na poprawę wydajności wytwarzania L-lizyny.

dapE wycięto z pdapE i wstawiono go do pdapD w celu przygotowania plazmidu pMWdapDEl, zawierającego zarówno dapE,jak i dapD (fig. 23). Ponadto, fragment zawierający dapE i dapD wycięto z pMWdapDEl i wstawiono do pCABl w celu przygotowania pCABDEl (fig. 24). Przygotowano szczepy zawierające pCABl, pCABDEl lub pCABD2 i szczep zawierający zarówno pCABDEl Jak i pdapF prowadzono hodowle w celu wytwarzania L-lizyny z wykorzystaniem tych szczepów. Wyniki przedstawiono na fig. 17.

Tabela 17

Szczep bakteryjny	Ilość wytworzonego chlorowodorku L-lizyny (g/litr)	Wydajność wobec cukru (%)	Barwa brzeczki	Akumulacja SDAP
W3110 (tyrA)pCABl	10,80	26,5	brązowa	+
W3110 (tyrA)pCABDEl	12,23	30,0	żółta	-
W3110 (tyrA)pCABDEl + pdapE	11,82	29,0	żółta	-
W3110 (tyrA)pCABD2	12,23	30,0	żółta	-

Stwierdzono, że ilość wytworzonej L-lizyny, barwa brzeczki i występowanie lub nie akumulacji SDAP stały się równoważne do tych w przypadku wytwarzania z DDH przez wzmocnienie łącznie dapD i dapE. Ponadto stwierdzono, że dalsze wzmocnienie dapF nie wywiera żadnego wpływu na poprawę wydajności wytwarzania L-lizyny i reakcja, za którą odpowiedzialny jest dapF nie stanowi ograniczenia szybkości. Opisane powyżej wyniki można zinterpretować w następujący sposób.

Po wprowadzeniu pCABl, na dwóch etapach ulegają akumulacji półprodukty SKĄP (kwas N-sukcynylo-c-keto-L-a-aminopimelinowy) i SDAP. Spośród tych półproduktów w brzeczce pozakomórkowej wykryto SDAP. Chociaż nie wykryto SKĄP, przypuszcza się, że ulega on akumulacji w komórkach bakteryjnych. Przyczyna takiego przypuszczenia tkwi w barwie brzeczki. W przypadku szczepu typu dzikiego (W3110(tyrA)) lub podobnych szczepów wytwarzających L-lizynę barwa brzeczki była żółta. Jednakże, brzeczka przybierała barwę brązową prawdopodobnie na skutek bakteriolizy lub podobnego zjawiska, przy obciążeniu wzrostu. Przypuszcza się, że SDAP stanowi niewielkie obciążenie dla wzrostu, ponieważ jest on usuwany na zewnątrz komórek, a zatem brzeczka zmienia barwę na żółtą chociaż ilość zakumulowanego SDAP wzrasta, gdy SKĄP jest metabolizowany dzięki wzmocnieniu tylko dapA. Jednakże, nawet jeśli wzmac

181 614 nia się dap, ilość zakumulowanej L-lizyny nie wzrasta, o ile nie zniesie się wrażliwości etapu ograniczającego szybkość przez dapE w dalszej części szlaku.

<6> Wniosek

Zgodnie z opisanymi powyżej wynikami, stwierdzono, że wydajność wytwarzania L-lizyny ulega poprawie w stopniowy sposób przez przeprowadzenie: (1) wprowadzenia dap*, (2) wprowadzenie lysC*, (3) wzmocnienie dapB i (4) wzmocnienie DDH lub dapD i dapE w bakteriach należących do rodzaju Escherichia. Ponadto, otrzymano E. coli, w której wydajność wytwarzania L-lizyny ulega poprawie w stopniowy sposób.

< 7> Analiza etapu ograniczającego szybkość układu biosyntezy

L-lizyny szczepu C E. coli

W celu zbadania, czy uzyskany powyżej wniosek może dotyczyć szczepów innych niż serii K-12 E. coli, w taki sam sposób jak opisano powyżej analizowano etapy ograniczające szybkość układu biosyntezy L-lizyny szczepu C E. coli (IFO13891). Warunki hodowli były takie same jak dla W3110(tyrA), jednakże do podłoża nie dodawano L-tyrozyny.

(1) Identyfikacja pierwszego etapu ograniczającego szybkość

Szczep C E. coli (IFO 13891) stransformowany plazmidami zawierającymi geny układu biosyntezy L-lizyny hodowano w podłożu w celu wytwarzania L-lizyny i mierzono ilość wytworzonego chlorowodorku L-lizyny. Wyniki przedstawiono w tabeli 18.

Tabela 18

Szczep bakteryjny	Ilość wytwarzanego chlorowodorku L-lizyny (g/litr)	Wydajność wobec cukru (%) )
C	0,08	0,2
C/pppc	0,08	0,2
C/paspC	0,12	0,3
C/plysC	0,08	0,2
C/plysC*	0,12	0,3
C/pasd	0,08	0,2
C/pdapA	0,32	0,8
C/pdapA*	0,71	1,75
C/pdapB	0,12	0,3
C/pDDH	0,08	0,2
C/plysA	0,08	0,2 i ’ 1

W taki sam sposób, jak w przypadku W3110 (tyrA), L-lizyna była również akumulowana w podłożu przez szczep C dzięki wprowadzeniu dapA typu dzikiego, a większym stopniu dapA* o zniesionej wrażliwości na hamowanie. LysC* nie wywierał żadnego wpływu na wydajność wytwarzania L-lizyny.

(2) Identyfikacja drugiego etapu ograniczającego szybkość

Plazmid RSF24P, zawierający dapA*, wprowadzono do szczepu C E. coli, a ponadto wprowadzano plazmidy zawierające geny układu biosyntezy L-lizyny. Otrzymane transformanty hodowano w podłożu w celu wytwarzania L-lizyny i mierzono ilość wytworzonego chlorowodorku L-lizyny. Wyniki przedstawiono w tabeli 19.

181 614

Tabela 19

Szczep bakteryjny	Ilość wytworzonego chlorowodorku L-lizyny (g/litr)	Wydajność wobec cukru (%)
C/RSF24P	0,71	1,75
C/RSF24P + pppc	0,71	1,74
C/RSF24P + paspC	0,69	1,70
C/RSF24P + plysC	0,65	1,60
C/RSF24P + plysC*	1,82	4,50
C/RSF24P + pasd	0,70	1,73
C/RSF24P + pdapA	0,71	1,75
C/RSF24P + pdapA*	0,69	1,70
C/RSF24P + pdapB	0,99	2,45
C/RSF24P + pDDH	0,73	1,80
C/RSF24P + plysA	0,69	1,70

Stwierdzono, że iysC* wywierał wpływ na poprawę wydajności wytwarzania L-lizyny, nawet w przypadku szczepu C stransformowanego dapA* i reakcj a, za która odpowiedzialny jest lysC* była drugim etapem ograniczającym szybkość.

(3) Identyfikacja trzeciego etapu ograniczającego szybkość

Plazmid RSFD80, zawierający dapA* i lysC*, wprowadzono do szczepu C E. coli i dalej wprowadzono plazmidy zawierające geny układu biosyntezy L-lizyny. Otrzymane transformanty hodowano w podłożu w celu wytwarzania L-lizyny i mierzono ilość wytworzonego chlorowodorku L-lizyny. Wyniki przedstawiono w tabeli 20.

Tabela 20

Szczep bakteryjny	Ilość wytworzonego chlorowodorku L-lizyny (g/litr)	Wydajność wobec cukru (%)
C/RSFD80	1,82	4,5
C/RSFD80 + pppc	1,74	4,3
C/RSFD80 + paspC	1,82	4,5
C/RSFD80 + plysC	1,91	4,7
C/RSFD80 + plysC*	1,74	4,3
C/RSFD80 + pasd	1,82	4,5
C/RSFD80 + pdapA	1,95	4,8
C/RSFD80 + pdapA*	1,91	4,7
C/RSFD80 + pdapB	2,31	5,7 \|
C/RSFD80 + pDDH	2,15	5,3 \|
C/RSFD80 + plysA	1,95	4,8 j

Tak samo, jak w szczepie W3110, tylko dapB wywierał wpływ na poprawę wydajności wytwarzania L-lizyny i stwierdzono, że odpowiada on za trzeci etap ograniczający szybkość.

(4) Identyfikacja czwartego etapu ograniczającego szybkość

Plazmid pCABl, zawierający dapA* i lysC* i dapB, wprowadzono do szczepu C E. coli i dalej wprowadzano plazmidy zawierające geny układu biosyntezy L-lizyny. Otrzymane transformanty hodowano w podłożu w celu wytwarzania L-lizyny i mierzono ilość wytworzonego chlorowodorku L-lizyny. Wyniki przedstawiono w tabeli 21.

181 614

Tabela 21

Szczep bakteryjny	Ilość wytworzonego chlorowodorku L-lizyny (g/litr)	Wydajność wobec cukru (%)
C/pCABl	2,31	^5,7
C/pCABl + pppc	2,23	⁵’⁵ I
C/ pCAB 1 + paspC	2,35	5,8 ί
C/ pCABl + plysC	2,27	5,6
C/ pCABl + plysC*	2,19	5,4
C/ pCABl + pasd	2,23	5,5,
C/ pCAB 1 + pdapA	2,31	5,7
C/ pCABl + pdapA*	2,27	5,6
C/ pCABl + pdapB	2,23	5,5
C/ pCABl + pDDH	2,59	6,4
C/ pCABl + plysA	2,19	5,4

Tak samo, jak w przypadku szczepu W3110, tylko DDH wywierał wpływ na poprawę wydajności wytwarzania L-lizyny i stwierdzono, że odpowiada on za czwarty etap ograniczający szybkość.

<5> Analiza etapów ograniczających szybkość spośród etapów, za które odpowiedzialne są dapC, dapD, dapE i dapF

Plazmidy zawierające geny dapD, dapE, lub dapF wprowadzono w miejsce DDH, do szczepu C E. coli zawierającego pCABl i prowadzono hodowlę w celu wytwarzania L-lizyny. Wyniki przedstawiono w tabeli 22.

Tabela 22

Szczep bakteryjny	Ilość wytworzonego chlorowodorku L-lizyny (g/litr)	Wydajność wobec cukru (%)	Barwa brzeczki	ł Akumulacja SDAP
C/pCABl	2,31	5,7	brązowa	+
C/pCABl + pdapD	2,43	6,0	żółta	+
C/pC AB 1 + pdapE	2,35	5,8	brązowa	-
C/pCABl + pdapF	2,23	5,5	brązowa	+
C/pCABDEl	2,59	6,4	żółta	-
C/pCABDEl + pdapF	2,43	6,0	żółta	-
C/pCABD2	2,59	6,4	żółta	-

Stwierdzono, że dwa etapy, za które odpowiedzialne są dapD i dapE również stanowią ograniczenie szybkości w szczepie C w tak samo, jak w szczepie W3110.

Jak opisano powyżej, w szczepach K-12 i C, należących do różnych serii, kolejność etapów ograniczających szybkość jest taka sama. Uważa się zatem, że całego gatunku E. coli dotyczy koncepcja, że wydajność wytwarzania L-lizyny można poprawić w stopniowy sposób przez przeprowadzenie, w tej kolejności, wprowadzania dapA* i lysC* oraz wzmocnienie dapB i DDH (bądź dapD i dapE).

Możliwości zastosowania przemysłowego

Według niniejszego wynalazku, otrzymano zmutowany gen DDPS pochodzący z bakterii należącej do rodzaju Escherichia, której wrażliwość na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę jest dostatecznie zniesiona. Przez wprowadzenie do bakterii należącej

181614 43 do rodzaju Escherichia genu zawierającego kinazę asparaginianową której wrażliwość na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego jest zniesiona można otrzymać bardziej ulepszoną niż uprzednio, wytwarzającą L-lizynę bakterię.

Ponadto, wydajność wytwarzania L-lizyny można poprawić w stopniowy sposób przez wzmocnienie, w tej kolejności, dapB i DDH (bądź dapD i dapE) wyżej wspomnianej bakterii wytwarzającej L-lizynę.

181 614

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA:

(i) ZGłASZAJĄCY: Ajinomoto Co., Inc.

(ii) TYTUł WYNALAZKU: Sposób wytwarzania L-lizyny poprzez fermentację (iii) LICZBA SEKWENCJI: 20 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

(A) ADRESAT:

(B) ULICA:

(C) MIASTO:

(D) STAN:

(E) KRAJ:

(F) KOD POCZTOWY (ZIP) :

(v) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:

(A) TYP NOŚNIKA: elastyczna dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny do IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln (vi) DANE DOTYCZĄCE AKTUALNEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA ZGŁOSZENIA:

(vii) DANE DOTYCZĄCE UPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: · (B) DATA ZGŁOSZENIA:

(viii) INFORMACJA O PEŁNOMOCNIKU/PRZEDSTAWICIELU:

(A) NAZWISKO:

(B) NUMER REJESTRACYJNY:

(C) NUMER, NA KTÓRY NALEŻY SIĘ POWOŁYWAĆ / NUMER W REJESTRZE:

(ix) INFORMACJE TELEKOMUNIKACYJNE:

(A) TELEFON:

(B) TELEFAX:

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inne..syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 1:

CCGCAACTAC TGACATGACG 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inne..syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 2: AGTAAGCCAT CAAATCTCCC 20

181 614 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1197 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: genomowy DNA (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Escherichia coli (B) SZCZEP: MC1061 (ix) CECHA:

NAZWA/KLUCZ: transkrypt otrzymywany po użyciu startera

LOKACJA: 248

SPOSÓB IDENTYFIKACJI: E (ix) CECHA:

NAZWA/KLUCZ: CDS (sekwencja kodująca)

LOKACJA: 272.. 1150

SPOSÓB IDENTYFIKACJI: E (ix) CECHA:

NAZWA/KLUCZ: miejsce wiązania startera

LOKACJA: 27.. 46

SPOSÓB IDENTYFIKACJI: E (ix) CECHA:

NAZWA/KLUCZ: miejsce wiązania startera

LOKACJA: 1156.. 1175

SPOSÓB IDENTYFIKACJI: E (ix) CECHA:

NAZWA/KLUCZ: RBS (miejsce wiązania rybosomu)

LOKACJA: 261.. 265

SPOSÓB IDENTYFIKACJI: S (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 3:

CCAGGCGACT GTCTTCAATA TTACAGCCGC AACTACTGAC ATGACGGGTG ATGGTGTTCA60

CAATTCCACG GCGATCGGCA CCCAACGCAG TGATCACCAG ATAATGTGTT GCGATGACAG120

TGTCAAACTG GTTATTCCTT TAAGGGGTGA GTTGTTCTTA AGGAAAGCAT AAAAAAAACA180

TGCATACAAC AATCAGAACG GTTCTGTCTG CTTGCTTTTA ATGCCATACC AAACGTACCA240

TTGAGACACT TGTTTGCACA GAGGATGGCC C ATG TTC ACG GGA AGT ATT GTC292

Met Phe Thr Gly Ser Ile Val

GCG ATT GTT ACT CCG ATG GAT GAA AAA GGT AAT GTC TGT CGG GCT AGC 340

Ala Ile Val Thr Pro Met Asp Glu Lys Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser 10 1520

TTG AAA AAA CTG ATT GAT TAT CAT GTC GCC AGC GGT ACT TCG GCG ATC388

Leu Lys Lys Leu Ile Asp Tyr His Val Ala Ser Gly Thr Ser AlaIle

3035

GTT TCT GTT GGC ACC ACT GGC GAG TCC GCT ACC TTA AAT CAT GAC GAA436

Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser Ala Thr Leu Asn His AspGlu

45 5055

CAT GCT GAT GTG GTG ATG ATG ACG CTG GAT CTG GCT GAT GGG CGC ATT484

His Ala Asp Val Val Met Met Thr Leu Asp Leu Ala Asp Gly ArgIle

6570

CCG GTA ATT GCC GGG ACC GGC GCT AAC GCT ACT GCG GAA GCC ATT AGC532

Pro Val Ile Ala Gly Thr Gly Ala Asn Ala Thr Ala Glu Ala IleSer

8085

181 614

CTG ACG CAG CGC TTC AAT GAC AGT GGT ATC GTC GGC TGC CTG ACG GTA	580
Leu Thr Gin Arg Phe Asn Asp Ser Gly Ile Val Gly Cys Leu Thr Val 90 95 100
ACC CCT TAC TAC AAT CGT CCG TCG CAA GAA GGT TTG TAT CAG CAT TTC	628
Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gin Glu Gly Leu Tyr Gin His Phe 105 110 115
AAA GCC ATC GCT GAG CAT ACT GAC CTG CCG CAA ATT CTG TAT AAT GTG	676
Lys Ala ile Ala Glu His Thr Asp Leu Pro Gin Ile Leu Tyr Asn Val 120 125 130 135
CCG TCC CGT ACT GGC TGC GAT CTG CTC CCG GAA ACG GTG GGC CGT CTG	724
Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu 140 145 150
GCG AAA GTA AAA AAT ATT ATC GGA ATC AAA GAG GCA ACA GGG AAC TTA	772
Ala Lys Val Lys Asn Ile Ile Gly Ile Lys Glu Ala Thr Gly Asn Leu 155 160 165
ACG CGT GTA AAC CAG ATC AAA GAG CTG GTT TCA GAT GAT TTT GTT CTG	820
Thr Arg Val Asn Gin Ile Lys Glu Leu Val Ser Asp Asp Phe Val Leu 170 175 180
CTG AGC GGC GAT GAT GCG AGC GCG CTG GAC TTC ATG CAA TTG GGC GGT	868
Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu Asp Phe Met Gin Leu Gly Gly 185 190 195
CAT GGG GTT ATT TCC GTT ACG ACT AAC GTC GCA GCG CGT GAT ATG GCC	916
His Gly Val Ile Ser Val Thr Thr Asn Val Ala Ala Arg Asp Met Ala 200 205 210 215
CAG ATG TGC AAA CTG GCA GCA GAA GAA CAT TTT GCC GAG GCA CGC GTT	964
Gin Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Glu His Phe Ala Glu Ala Arg Val 220 225 230
ATT AAT CAG CGT CTG ATG CCA TTA CAC AAC AAA CTA TTT GTC GAA CCC	1012
Ile Asn Gin Arg Leu Met Pro Leu His Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro 235 240 245
AAT CCA ATC CCG GTG AAA TGG GCA TGT AAG GAA CTG GGT CTT GTG GCG	1060
Asn Pro Ile Pro Val Lys Trp Ala Cys Lys Glu Leu Gly Leu Val Ala 250 255 260
ACC GAT ACG CTG CGC CTG CCA ATG ACA CCA ATC ACC GAC AGT GGT CGT	1108
Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr Pro Ile Thr Asp Ser Gly Arg 265 270 275
GAG ACG GTC AGA GCG GCG CTT AAG CAT GCC GGT TTG CTG T AAAGTTTAGG Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His Ala Gly Leu Leu 280 285 290	1158

GAGATTTGAT GGCTTACTCT GTTCAAAAGT CGCGCCTGG 1197 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 292 (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 4:

Met Phe Thr Gly Ser Ile Val Ala Ile Val Thr Pro Met Asp Glu Lys

10 15

Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser Leu Lys Lys Leu Ile Asp Tyr His Val

25 30

Ala Ser Gly Thr Ser Ala Ile Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser

181 614

40 45

Ala Thr Leu Asn

His

Asp Glu His Ala Asp Val Val

Met

Thr

Leu

50

55

60

Asp

Leu

Ala

Asp

Gly

Arg

Ile

Pro

Val

Ile

Ala

Gly

Thr

Gly

Ala

Asn

65 Ala

Thr

Ala

Glu

Ala

70 Ile

Ser

Leu

Thr

Gin

75 Arg

Phe

Asn

Asp

Ser

80 Gly

Ile

Val

Gly

Cys

85 Leu

Thr

Val

Thr

Pro

90 Tyr

Tyr

Asn

Arg

Pro

95 Ser

Gin

Glu

Gly

Leu

100 Tyr

Gin

His

Phe

Lys

105 Ala

Ile

Ala

Glu

His

110 Thr

Asp

Leu

Pro

Gin

115 Ile

Leu

Tyr

Asn

Val

120 Pro

Ser

Arg

Thr

Gly

125 Cys

Asp

Leu

Pro

130 Glu

Thr

Val

Gly

Arg

135 Leu

Ala

Lys

Val

Lys

140 Asn

Ile

Gly

Ile

145 Lys

Glu

Ala

Thr

Gly

150 Asn

Leu

Thr

Arg

Val

155 Asn

Gin

Ile

Lys

Glu

160 Leu

Val

Ser

Asp

165 Phe

Val

Leu

Ser

170 Gly

Asp

Ala

Ser

175 Ala

Leu

Asp

Phe

Met

180 Gin

Leu

Gly

His

185 Gly

Val

Ile

Ser

Val

190 Thr

Thr

Asn

Val

Ala

195 Ala

Arg

Asp

Met

Ala

200 Gin

Met

Cys

Lys

Leu

205 Ala

Ala

Glu

His

210 Phe

Ala

Glu

Ala

Arg

215 Val

Ile

Asn

Gin

Arg

220 Leu

Met

Pro

Leu

His

225 Asn

Lys

Leu

Phe

Val

230 Glu

Pro

Asn

Pro

Ile

235 Pro

Val

Lys

Trp

Ala

240 Cys

Lys

Glu

Leu

Gly

245 Leu

Val

Ala

Thr

Asp

250 Thr

Leu

Arg

Leu

Pro

255 Met

Thr

Pro

Ile

Thr

260 Asp

Ser

Gly

Arg

Glu

265 Thr

Val

Arg

Ala

270 Leu

Lys

His

Ala (2)

275 Gly Leu Leu 290 INFORMACJA

280 O SEKWENCJI O

285 NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM

5 :

(i) (ii) (xi)

CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 20 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa RODZAJ CZĄSTECZKI: inne..syntetyczny DNA OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 5

CTTCCCTTGT GCCAAGGCTG 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inne..syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 6:

GAATTCCTTT GCGAGCAG 18

181 614 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 2147 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: genomowy DNA (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Escherichia coli (B) SZCZEP: MC1061 (ix) CECHA:

NAZWA/KLUCZ: sekwencja sygnałowa o pozycji nukleotydu -35

LOKACJA: 242.. 249

SPOSÓB IDENTYFIKACJI: S (ΪΧ) CECHA:

NAZWA/KLUCZ: sekwencja sygnałowa o pozycji nukleotydu -10

LOKACJA: 265.. 273

SPOSÓB IDENTYFIKACJI: S (ix) CECHA:

NAZWA/KLUCZ: miejsce wiązania startera

LOKACJA: 536.. 555

SPOSÓB IDENTYFIKACJI: E (ΪΧ) CECHA:

NAZWA/KLUCZ: miejsce wiązania startera

LOKACJA: 2128.. 2147

SPOSÓB IDENTYFIKACJI: E (ix) CECHA:

NAZWA/KLUCZ: RBS (miejsce wiązania rybosomu)

LOKACJA: 575.. 578

SPOSÓB IDENTYFIKACJI: S (ix) CECHA:

NAZWA/KLUCZ: CDS (sekwencja kodująca)

LOKACJA: 584.. 1933

SPOSÓB IDENTYFIKACJI: S (ix) CECHA:

NAZWA/KLUCZ: sekwencja terminująca

LOKACJA: 1941.. 1968

SPOSÓB IDENTYFIKACJI: S (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 7:

TCGAAGTGTT TCTGTAGTGC CTGCCAGGCA GCGGTCTGCG TTGGATTGAT GTTTTTCATT60

AGCAATACTC TTCTGATTTT GAGAATTGTG ACTTTGGAAG ATTGTAGCGC CAGTCACAGA120

AAAATGTGAT GGTTTTAGTG CCGTTAGCGT AATGTTGAGT GTAAACCCTT AGCGCAGTGA180

AGCATTTATT AGCTGAACTA CTGACCGCCA GGAGTGGATG AAAAATCCGC ATGACCCCAT240

CGTTGACAAC CGCCCCGCTC ACCCTTTATT TATAAATGTA CTACCTGCGC TAGCGCAGGC300

CAGAAGAGGC GCGTTGCCCA AGTAACGGTG TTGGAGGAGC CAGTCCTGTG ATAACACCTG360

AGGGGGTGCA TCGCCGAGGT GATTGAACGG CTGGCCACGT TCATCATCGG CTAAGGGGGC420

TGAATCCCCT GGGTTGTCAC CAGAAGCGTT CGCAGTCGGG CGTTTCGCAA GTGGTGGAGC480

ACTTCTGGGT GAAAATAGTA GCGAAGTATC GCTCTGCGCC CACCCGTCTT CCGCTCTTCC540

CTTGTGCCAA GGCTGAAAAT GGATCCCCTG ACACGAGGTA GTT ATG TCT GAA ATT 595

Met Ser Glu Ile

GTT GTC TCC AAA TTT GGC GGT ACC AGC GTA GCT GAT TTT GAC GCC ATG 643

Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp Phe Asp Ala Met

181 614

5	10	15	20
AAC CGC	AGC GCT GAT ATT GTG CTT TCT	GAT GCC AAC GTG	CGT TTA GTT 691
Asn Arg	Ser Ala Asp Ile Val Leu Ser	Asp Ala Asn Val	Arg Leu Val
GTC CTC	25 TCG GCT TCT GCT GGT ATC ACT	30 AAT CTG CTG GTC	35 GCT TTA GCT 739
Val Leu	Ser Ala Ser Ala Gly Ile Thr	Asn Leu Leu Val	Ala Leu Ala
GAA GGA	40 45 CTG GAA CCT GGC GAG CGA TTC	GAA AAA CTC GAC	50 GCT ATC CGC 787
Glu Gly	Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe	Glu Lys Leu Asp	Ala Ile Arg
AAC ATC	55 60 CAG TTT GCC ATT CTG GAA CGT	65 CTG CGT TAC CCG	AAC GTT ATC 835
Asn Ile	Gin Phe Ala Ile Leu Glu Arg	Leu Arg Tyr Pro	Asn Val Ile
70 CGT GAA	75 GAG ATT GAA CGT CTG CTG GAG	80 AAC ATT ACT GTT	CTG GCA GAA 883
Arg Glu	Glu Ile Glu Arg Leu Leu Glu	Asn Ile Thr Val	Leu Ala Glu
85 GCG GCG	90 GCG CTG GCA ACG TCT CCG GCG	95 CTG ACA GAT GAG	100 CTG GTC AGC 931
Ala Ala	Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala	Leu Thr Asp Glu	Leu Val Ser
CAC GGC	105 GAG CTG ATG TCG ACC CTG CTG	110 TTT GTT GAG ATC	115 CTG CGC GAA 979
His Gly	Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu	Phe Val Glu Ile	Leu Arg Glu
CGC GAT	120 125 GTT CAG GCA CAG TGG TTT GAT	GTA CGT AAA GTG	130 ATG CGT ACC 1027
Arg Asp	Val Gin Ala Gin Trp Phe Asp	Val Arg Lys Val	Met Arg Thr
AAC GAC	135 140 CGA TTT GGT CGT GCA GAG CCA	145 GAT ATA GCC GCG	CTG GCG GAA 1075
Asn Asp	Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro	Asp Ile Ala Ala	Leu Ala Glu
150 CTG GCC	155 GCG CTG CAG CTG CTC CCA CGT	160 CTC AAT GAA GGC	TTA GTG ATC 1123
Leu Ala	Ala Leu Gin Leu Leu Pro Arg	Leu Asn Glu Gly	Leu Val Ile
165 ACC CAG	170 GGA TTT ATC GGT AGC GAA AAT	175 AAA GGT CGT ACA	180 ACG ACG CTT 1171
Thr Gin	Gly Phe Ile Gly Ser Glu Asn	Lys Gly Arg Thr	Thr Thr Leu
GGC CGT	185 GGA GGC AGC GAT TAT ACG GCA	190 GCC TTG CTG GCG	195 GAG GCT TTA 1219
Gly Arg	Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala	Ala Leu Leu Ala	Glu Ala Leu
CAC GCA	200 205 TCT CGT GTT GAT ATC TGG ACC	GAC GTC CCG GGC	210 ATC TAC ACC 1267
His Ala	Ser Arg Val Asp Ile Trp Thr	Asp Val Pro Gly	Ile Tyr Thr
ACC GAT	215 220 CCA CGC GTA GTT TCC GCA GCA	225 AAA CGC ATT GAT	GAA ATC GCG 1315
Thr Asp	Pro Arg Val Val Ser Ala Ala	Lys Arg Ile Asp	Glu Ile Ala
230 TTT GCC	235 GAA GCG GCA GAG ATG GCA ACT	240 TTT GGT GCA AAA	GTA CTG CAT 1363
Phe Ala	Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr	Phe Gly Ala Lys	Val Leu His
245 CCG GCA	250 ACG TTG CTA CCC GCA GTA CGC	255 AGC GAT ATC CCG	260 GTC TTT GTC 1411
Pro Ala	Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg	Ser Asp He Pro	Val Phe Val
GGC TCC	265 AGC AAA GAC CCA CGC GCA GGT	270 GGT ACG CTG GTG	275 TGC AAT AAA 1459
Gly Ser	Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly	Gly Thr Leu Val	Cys Asn Lys
ACT GAA	280 285 AAT CCG CCG CTG TTC CGC GCT	CTG GCG CTT CGT	290 CGC AAT CAG 1507

181 614

Thr	Glu	Asn 295	Pro	Pro	Leu Phe	Arg Ala Leu Ala Leu Arg	Arg	Asn	Gin
300	305
ACT	CTG	CTC	ACT	TTG	CAC AGC	CTG	AAT ATG CTG CAT TCT	CGC	GGT	TTC 1555
Thr	Leu 310	Leu	Thr	Leu	His Ser 315	Leu	Asn Met Leu His Ser 320	Arg	Gly	Phe
CTC	GCG	GAA	GTT	TTC	GGC ATC	CTC	GCG CGG CAT AAT ATT	TCG	GTA	GAC 1603
Leu 325	Ala	Glu	Val	Phe	Gly Ile 330	Leu	Ala Arg His Asn Ile 335	Ser	Val	Asp 340
TTA	ATC	ACC	ACG	TCA	GAA GTG	AGC	GTG GCA TTA ACC CTT	GAT	ACC	ACC 1651
Leu	Ile	Thr	Thr	Ser 345	Glu Val	Ser	Val Ala Leu Thr Leu 350	Asp	Thr 355	Thr
GGT	TCA	ACC	TCC	ACT	GGC GAT	ACG	TTG CTG ACG CAA TCT	CTG	CTG	ATG 1699
Gly	Ser 160	Thr	Ser	Thr	Gly Asp 365	Thr	Leu Leu Thr Gin Ser 370	Leu	Leu	Met
GAG	CTT	TCC	GCA	CTG	TGT CGG	GTG	GAG GTG GAA GAA GGT	CTG	GCG	CTG 1747
Glu	Leu	Ser 375	Ala	Leu	Cys Arg	Val 380	Glu Val Glu Glu Gly 385	Leu	Ala	Leu
GTC	GCG	TTG	ATT	GGC	AAT GAC	CTG	TCA AAA GCC TGC GGC	GTT	GGC	AAA 1795
Val	Ala 390	Leu	Ile	Gly	Asn Asp 395	Leu	Ser Lys Ala Cys Gly 400	Val	Gly	Lys
GAG	GTA	TTC	GGC	GTA	CTG GAA	CCG	TTC AAC ATT CGC ATG	ATT	TGT	TAT 1843
Glu 405	Val	Phe	Gly	Val	Leu Glu 410	Pro	Phe Asn Ile Arg Met 415	Ile	Cys	Tyr 420
GGC	GCA	TCC	AGC	CAT	AAC CTG	TGC	TTC CTG GTG CCC GGC	GAA	GAT	GCC 1891
Gly	Ala	Ser	Ser	His 425	Asn Leu	Cys	Phe Leu Val Pro Gly 430	Glu	Asp 435	Ala
GAG Glu	CAG Gin	GTG Val	GTG Val 440	CAA Gin	AAA CTG Lys Leu	CAT His	AGT AAT TTG TTT GAG Ser Asn Leu Phe Glu 445	TAAATACTGT 1940

ATGGCCTGGA AGCTATATTT CGGGCCGTAT TGATTTTCTT GTCACTATGC TCATCAATAA2000

ACGAGCCTGT ACTCTGTTAA CCAGCGTCTT TATCGGAGAA TAATTGCCTT TAATTTTTTT2060

ATCTGCATCT CTAATTAATT ATCGAAAGAG ATAAATAGTT AAGAGAAGGC AAAATGAATA2120

TTATCAGTTC TGCTCGCAAA GGAATTC2147 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 449 (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd

1	(xi)	OPIS	SEKWENCJI:	SEKWENCJA	O NUMERZE	IDENTYFIKACYJNYM 8
Met	Ser	Glu Ile	Val Val Ser	Lys Phe Gly	Gly Thr Ser	Val Ala Asp
1			5	10		15
Phe	Asp	Ala Met	Asn Arg Ser	Ala Asp Ile	Val Leu Ser	Asp Ala Asn
		20		25		30
Val	Arg	Leu Val	Val Leu Ser	Ala Ser Ala	Gly Ile Thr	Asn Leu Leu

181 614

40 45

Val Ala Leu Ala Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu

Asp Ala Ile Arg Asn 65

Pro Asn Val Ile Arg 85

Val Leu Ala Glu Ala

100

Glu Leu Val Ser His

115

Ile Leu Arg Glu Arg 130

Val Met Arg Thr Asn 145

Ala Leu Ala Glu Leu

165

Gly Leu Val Ile Thr 180

Thr Thr Thr Leu Gly 195

Ala Glu Ala Leu His

210

Gly Ile Tyr Thr Thr 225

Asp Glu Ile Ala Phe

245

Lys Val Leu His Pro 260

Pro Val Phe Val Gly 275

Val Cys Asn Lys Thr 290

Arg Arg Asn Gin Thr 305

Ser Arg Gly Phe Leu

325

Ile Ser Val Asp Leu 340

Leu Asp Thr Thr Gly 355

Ser Leu Leu Met Glu 370

Gly Leu Ala Leu Val 385

Gly Val Gly Lys Glu

405

Met Ile Cys Tyr Gly 420

Gly Glu Asp Ala Glu 435

Glu

Ile Gin Phe Ala Ile Leu 70 75

Glu Glu Ile Glu Arg Leu 90

Ala Ala Leu Ala Thr Ser 105

Gly Glu Leu Met Ser Thr 120

Asp Val Gin Ala Gin Trp 135

Asp Arg Phe Gly Arg Ala 150 155

Ala Ala Leu Gin Leu Leu 170

Gin Gly Phe Ile Gly Ser 185

Arg Gly Gly Ser Asp Tyr 200

Ala Ser Arg Val Asp Ile 215

Asp Pro Arg Val Val Ser 230 235

Ala Glu Ala Ala Glu Met 250

Ala Thr Leu Leu Pro Ala 265

Ser Ser Lys Asp Pro Arg 280

Glu Asn Pro Pro Leu Phe 295

Leu Leu Thr Leu His Ser 310 315

Ala Glu Val Phe Gly Ile 330

Ile Thr Thr Ser Glu Val 345

Ser Thr Ser Thr Gly Asp 360

Leu Ser Ala Leu Cys Arg 375

Ala Leu Ile Gly Asn Asp 390 395

Val Phe Gly Val Leu Glu 410

Ala Ser Ser His Asn Leu 425

Gin Val Val Gin Lys Leu 440

Glu Arg Leu Arg Tyr 80

Leu Glu Asn Ile Thr 95

Pro Ala Leu Thr Asp

110

Leu Leu Phe Val Glu

125

Phe Asp Val Arg Lys 140

Glu Pro Asp Ile Ala 160

Pro Arg Leu Asn Glu 175

Glu Asn Lys Gly Arg

190

Thr Ala Ala Leu Leu

205

Trp Thr Asp Val Pro 220

Ala Ala Lys Arg Ile

240

Ala Thr Phe Gly Ala 255

Val Arg Ser Asp Ile

270

Ala Gly Gly Thr Leu

285

Arg Ala Leu Ala Leu 300

Leu Asn Met Leu His

320

Leu Ala Arg His Asn 335

Ser Val Ala Leu Thr 350

Thr Leu Leu Thr Gin

365

Val Glu Val Glu Glu

380

Leu Ser Lys Ala Cys 400

Pro Phe Asn Ile Arg

415

Cys Phe Leu Val Pro

430

His Ser Asn Leu Phe.

445

181 614 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inne..syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 9:

CTTTCACTGA TATCCCTCCC 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inne..syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 10:

AAAAAGTGGA CCAAATGGTC 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inne..syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 11:

CATCTAAGTA TGCATCTCGG 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inne..syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 12:

TGCCCCTCGA GCTAAATTAG 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inne..syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 13:

TGCACGGTAG GATGTAATCG 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 14:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa

181 614 (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inne..syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA 0 NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 14: TTAATGAAAC AAATGCCCGG 2 0 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 15:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inne..syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 15: TTTATTCATA ATTGCCACCG 2 0 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inne..syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 16: CACGGTAATA CATATAACCG 2 0 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 17:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inne..syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 17: CCTGCAATTG TCAAACGTCC 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 18:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inne..syntetyczny DNA (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 18: GTCGACGCGC TTGAGATCTT 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 19:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inne..syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 19: TCATAAAGAG TCGCTAAACG 20

181 614 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 20:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) (B) (C) (D) (ii) RODZAJ

DŁUGOŚĆ: 20 TYP: kwas nukleinowy ILOŚĆ NICI: jedna TOPOLOGIA: liniowa CZĄSTECZKI: inne..syntetyczny DNA

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 20:

CAACCGCCCG GTCATCAAGC 20

181 614

CHROMOSOMALNY DNA z PCR STARTERY PCR GEN dapA : — Y dapA /HacZ pdapA!

PlacZ ligacja —^^^^dapA / PlacZ pdapA2

Fig. 1

181 614

Ν Q

LU Ν O NI GO

O o LU

C4 bn

Ll.

VNQ^0ZAA p$ONMAl>IV

181 614

DUŻY FRAGMENT UZYSKANY PRZEZ PODWÓJNE TRAWIENIE Eco0651 I EcoRI

MAŁY FRAGMENT UZYSKANY PRZEZ PODWÓJNE TRAWIENIE Eco0651 I EcoRI

F i g. 3

181 614

Pst I Sma 11 Ase I

Sma I / Bam HI

F i g. 4

181 614

WPROWADZENIE MUTACJI ZA POMOCĄ HYDROKSYLOAMINY

PROPORCJA WYSTĘPOWANIA TRANSFORMANTÓW (%)

UZYSKANY STOSUNEK TRANSFORMANTÓW *--STOSUNEK MUTACJI (AEC^R)

---□--STOSUNEK MUTACJI (Lys^R)

CZAS TRAKTOWANIA HYDROKSYLOAMINĄ (^hr)

Fig. 5

181 614

AKTYWNOŚĆ WłAŚCIWA (%) AKTYWNOŚĆ WŁAŚCIWA (%)

LIZYNA (mM)

Fig. 6

181 614

Hindlll

CIĘCIE BamHI I Dral CIĘCIE EcoRI I Kpnl

DZIAŁANIE POLIMERAZĄ T4 DZIAŁANIE POLIMERAZĄ T4

Eco RJ

Fig. 7

181 614

EcoRI

MAŁY FRAGMENT UZYSKANY PRZEZ PODWÓJNE TRAWIENIE EcoRI I Sphi

DUŻY FRAGMENT UZYSKANY PRZEZ PODWÓJNE TRAWIENIE EcoRI I SPHI

Fig. 8

181 614

Notl

A cci

EcoRI (BamHL/EcoRI)

tetp

Acci (DraUKpnI)

Sapl

RSF24P

9.7kb mob

IvsC*80

(Smal/Asel)

Sad (Smal/BamHl)

Dral pLLC*80

3.7kb

CIECIE Pstl

DZIAŁANIE POLIMERAZĄ T4

CIĘCIE Dra! I Sacl

DZIAŁANIE POLIMERAZĄ

T4

LIGACJA

Fig. 9

181 614

EcoRI

Fig. 10

ΡνυΙ

ad /ub

I

ΡνυΙ pdapA pdapA*

MW118

KpnI

Pwl

181 614

Fig. 12

181 614

(SmaI/EcoT22I)

lać^ / £ pDDH Fig. 16

' '(SmaUAval)

(SmaUSpF)

Psi

Pstl

(SmaVBcIl)

Psi

Fig. 17

MWU8

181 614

CIĘCIE Puull

CIĘCIE EcoRI

Fig. 18

181 614

CIĘCIE Sap\

DZIAŁANIE POLIMERAZĄ T4

CIĘCIE ΡνΜ

LIGACJA

Fig. 19

181 614

Fig. 2 0

Fig. 21 dapE

Fig. 2 2

181 614

DZIAŁANIE POLIMERAZĄ T4 cięcie pwi

Fig. 23

181 614

CIĘCIE Sapl

DZIAŁANIE POLIMERAZĄ T4

CIĘCIE Pvu\\

Fig. 24

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1 . DNA kodujący syntazę dihydropikolinianowąpochodzącą z bakterii należącej do rodzaj u Escherichia zawieraj ący mutacj ę, po której syntaza nie j est hamowana na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę, znamienny tym, że zawiera mutację wybraną spośród grupy składającej się z:

- mutacji zastępującej resztę alaniny w pozycji 81 resztą waliny,

- mutacji zastępującej resztę histydyny w pozycji 118 resztą tyrozyny,

- mutacji zastępującej resztę alaniny w pozycji 81 resztą waliny i resztę histydyny w pozycji 118 resztą tyrozyny, licząc od końca N sekwencji aminokwasowej syntazy dihydropikolinianowej zdefiniowanej w sekwencji nr 4 w Liście Sekwencji oraz

- mutacji zastępującej resztę aminokwasową odpowiadającą reszcie alaniny w pozycji 81 resztą waliny,

- mutacji zastępującej resztę aminokwasową odpowiadającą reszcie histydyny w pozycji 118 resztą tyrozyny, oraz

- mutacji zastępującej resztę aminokwasową odpowiadającą reszcie alaniny w pozycji 81 resztą waliny i resztę aminokwasową odpowiadającą reszcie histydyny w pozycji 118 resztą tyrozyny.
2 . DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera mutację wybraną spośród grupy składającej się z:

- mutacji zastępującej resztę alaniny w pozycji 81 resztą waliny,

- mutacji zastępującej resztę histydyny w pozycji 118 resztą tyrozyny,

- mutacji zastępującej resztę alaniny w pozycji 81 resztą waliny i resztę histydyny w pozycji 118 resztą tyrozyny, licząc od końca N sekwencji aminokwasowej syntazy dihydropikolinianowej zdefiniowanej w sekwencji nr 4 w Liście Sekwencji.
3 . Bakteria należąca do rodzaju Escherichia zawierająca DNA kodujący syntazę dihydropikolinianową pochodzący z bakterii należącej do rodzaju Escherichia, przy czym DNA zawiera mutację, po której syntaza nie jest hamowana na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę, znamienna tym, że zawiera DNA z mutacją wy braną spośrod grupy składającej się z:

- mutacji zastępującej resztę alaniny w pozycji 81 resztą waliny,

- mutacji zastępującej resztę histydyny w pozycji 118 resztą tyrozyny,

- mutacji zastępującej resztę alaniny w pozycji 81 resztą waliny i resztę histydyny w pozycji 118 resztą tyrozyny, licząc od końca N sekwencji aminokwasowej syntazy dihydropikolinianowej zdefiniowanej w sekwencji nr 4 w Liście Sekwencji oraz

- mutacji zastępującej resztę aminokwasową odpowiadającą reszcie alaniny w pozycji 81 resztą waliny,

- mutacji zastępującej resztę aminokwasową odpowiadającą reszcie histydyny w pozycji 118 resztą tyrozyny, oraz

- mutacji zastępującej resztę aminokwasowąodpowiadającą reszcie alaniny w pozycji 81 resztą waliny i resztę aminokwasową odpowiadającą reszcie histydyny w pozycji 118 resztą tyrozyny.
4 . Bakteria według zastrz. 3, znamienna tym, że zawiera DNA z mutacją wybraną spośród grupy składającej się z:

- mutacji zastępującej resztę alaniny w pozycji 81 resztą waliny,

- mutacji zastępującej resztę histydyny w pozycji 118 resztą tyrozyny,

181 614

- mutacji zastępującej resztę alaniny w pozycji 81 resztą waliny i resztę histydyny w pozycji 118 resztą tyrozyny, licząc od końca N sekwencji aminokwasowej syntazy dihydropikolinianowej zdefiniowanej w sekwencji nr 4 w Liście Sekwencji.
5 . Bakteria należąca do rodzaju Escherichia, znamienna tym, że zawiera DNA kodujący syntazę dihydropikolinianową pochodzący z bakterii należącej do rodzaju Escherichia, zawierający mutację, po której syntaza nie jest hamowana na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę, oraz zawiera kinazę asparaginianową, która nie jest hamowana na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę.
6 . Bakteria według zastrz. 5, znamienna tym, że zawiera DNA kodujący kinazę asparaginianową III, pochodzący z bakterii należącej do rodzaju Escherichia.

Ί . Bakteria według zastrz. 6, znamienna tym, że zawiera DNA zawierający mutację wybraną z grupy składającej się z:

- mutacji zastępującej resztę glicyny w pozycji 323 resztą kwasu asparaginowego,

- mutacji zastępującej resztę glicyny w pozycji 323 resztą kwasu asparaginowego i resztę glicyny w pozycji 408 resztą kwasu asparaginowego,

- mutacji zastępującej resztę argininy w pozycji 34 resztą cysteiny i resztę glicyny w pozycji 323 resztą kwasu asparaginowego,

- mutacji zastępującej resztę leucyny w pozycji 325 resztą fenyloalaniny,

- mutacji zastępującej resztę metioniny w pozycji 318 resztą izoleucyny,

- mutacji zastępującej resztę metioniny w pozycji 318 resztą izoleucyny i resztę waliny w pozycji 349 resztą metioniny,

- mutacji zastępującej resztę seryny w pozycji 345 resztą leucyny,

- mutacji zastępującej resztę waliny w pozycji 347 resztą metioniny,

- mutacji zastępującej resztę treoniny w pozycji 352 resztą izoleucyny,

- mutacji zastępującej resztę treoniny w pozycji 352 resztą izoleucyny i zastępującej resztę seryny w pozycji 369 resztą fenyloalaniny,

- mutacji zastępującej resztę kwasu glutaminowego w pozycji 164 resztą lizyny, oraz

- mutacji zastępującej resztę metioniny w pozycji 417 resztą izoleucyny i zastępującej resztę cysteiny w pozycji 419 resztą tyrozyny, licząc od końca N sekwencji aminokwasowej kinazy asparaginianowej III zdefiniowanej sekwencją o numerze 8 w Liście Sekwencji.
8. Bakteria według zastrz. 5, znamienna tym, że dodatkowo zawiera zamplifikowany gen reduktazy dihydropikolinianowej.
9. Bakteria według zastrz. 8, znamienna tym, że zawiera zrekombinowany DNA obejmujący gen reduktazy dihydropikolinianowej zligowany z wektorem ulegającym autonomicznej replikacji w komórkach bakterii należących do rodzaju Escherichia.
10. Bakteria według zastrz. 8, znamienna tym, że dodatkowo zawiera zamplifikowany gen dehydrogenazy diaminopimelinianowej pochodzący z bakterii typu maczugowiec.
11. Bakteria według zastrz. 10, znamienna tym, że zawiera zrekombinowany DNA obejmujący gen dehydrogenazy diaminopimelinianowej pochodzący z bakterii typu maczugowiec zligowany z wektorem ulegającym autonomicznej replikacji w komórkach bakterii należących do rodzaju Escherichia.
12. Bakteria według zastrz. 8, znamienna tym, że dodatkowo zawiera zamplikowane geny sukcynylazy tetrahydropikolinianowej i deacylazy sukcynylodiaminopimelinianowej.
13. Bakteria według zastrz. 12, znamienna tym, że zawiera jeden zrekombinowany fragment DNA lub dwa zrekombinowane fragmenty DNA obejmujące gen sukcynylazy tetrahydropikolinianowej i/lub gen deacylazy sukcynylodiaminopimelinianowej zligowany z takim samym wektorem lub z różnymi wektorami ulegającymi autonomicznej replikacji w komórkach bakterii należących do rodzaju Escherichia.
14. Sposób wytwarzania L-lizyny obejmujący etapy, w których transformuje się bakterię należącą do rodzaju Escherichia, następnie hoduje się tę bakterię, po czym wyodrębnia się

L-lizynę z hodowli, znamienny tym, że transformuje się bakterię przez wprowadzenie do jej

181 614 komórek DNA kodującego syntazę dihydropikolinianowąpochodzącąz bakterii należącej do rodzaju Escherichia, zawierającego mutację, po której syntaza nie jest hamowana na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę, wybraną z grupy składającej się z:

- mutacji zastępującej resztę alaniny w pozycji 81 resztą waliny,

- mutacji zastępującej resztę histydyny w pozycji 118 resztą tyrozyny,

- mutacji zastępującej resztę alaniny w pozycji 81 resztą waliny i resztę histydyny w pozycji 118 resztą tyrozyny, licząc od końca N sekwencji aminokwasowej syntazy dihydropikolinianowej zdefiniowanej w sekwencji nr 4 w Liście Sekwencji oraz

- mutacji zastępującej resztę aminokwasową odpowiadającą reszcie alaniny w pozycji 81 resztą waliny,

- mutacji zastępującej resztę aminokwasową odpowiadającą reszcie histydyny w pozycji 118 resztą tyrozyny, oraz

- mutacji zastępującej resztę aminokwasową odpowiadającą reszcie alaniny w pozycji 81 resztą waliny i resztę aminokwasową odpowiadającą reszcie histydyny w pozycji 118 resztą tyrozyny.
15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że transformuje się bakterię przez wprowadzenie do jej komórek DNA zawierający mutację wybraną z grupy składającej się z:

- mutacji zastępującej resztę alaniny w pozycji 81 resztą waliny,

- mutacji zastępującej resztę histydyny w pozycji 118 resztą tyrozyny,

- mutacji zastępującej resztę alaniny w pozycji 81 resztą waliny i resztę histydyny w pozycji 118 resztą tyrozyny, licząc od końca N sekwencji aminokwasowej syntazy dihydropikolinianowej zdefiniowanej w sekwencji nr 4 w Liście Sekwencji.
16. Sposób wytwarzania L-lizyny obejmujący etapy, w których transformuje się bakterię należącą do rodzaju Escherichia, następnie hoduje się tę bakterię, po czym wyodrębnia się L-lizynę z hodowli, znamienny tym, że transformuje się bakterię zawierającą kinazę asparaginianową, która nie jest hamowana na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę, przez wprowadzenie do jej komórki DNA kodującego syntazę dihydropikolinianową pochodzącego z bakterii należącej do rodzaju Escherichia, zawierającego mutację, po której syntaza nie jest hamowana na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez L-lizynę.
17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że transformuje się bakterię zawierającą DNA kodujący kinazę asparaginianowąlll, pochodzący z bakterii należącej do rodzaju Escherichia.
18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że transformuje się bakterię zawierającą DNA z mutacją wy braną z grupy składającej się z:

- mutacji zastępującej resztę glicyny w pozycji 323 resztą kwasu asparaginowego,

- mutacji zastępującej resztę glicyny w pozycji 323 resztą kwasu asparaginowego i resztę glicyny w pozycji 408 resztą kwasu asparaginowego,

- mutacji zastępującej resztę argininy w pozycji 34 resztą cysteiny i zastępującej resztę glicyny w pozycji 323 resztą kwasu asparaginowego,

- mutacji zastępującej resztę leucyny w pozycji 325 resztą fenyloalaniny,

- mutacji zastępującej resztę metioniny w pozycji 318 resztą izoleucyny,

- mutacji zastępującej resztę mationiny w pozycji 318 resztą izoleucyny i zastępującej resztę waliny w pozycji 349 resztą metioniny,

- mutacji zastępującej resztę seryny w pozycji 345 resztą leucyny,

- mutacji zastępującej resztę waliny w pozycji 347 resztą metioniny,

- mutacji zastępującej resztę treoniny w pozycji 352 resztą izoleucyny,

- mutacji zastępującej resztę treoniny w pozycji 352 resztąizoleucyny i zastępującej resztę seryny w pozycji 369 resztą fenyloalaniny,

- mutacji zastępującej resztę kwasu glutaminowego w pozycji 164 resztą lizyny,

- mutacji zastępującej resztę metioniny w pozycji 417 resztą izoleucyny i zastępującej resztę cysteiny w pozycji 419 resztą tyrozyny,

181 614 licząc od końca N sekwencji aminokwasowej kinazy asparaginianowej III zdefiniowanej sekwencją o numerze 8 w Liście Sekwencji.
19. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że transformuje się bakterię dodatkowo zawierającą zamplifikowany gen reduktazy dihydropikolinianowej.
20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że transformuje się bakterię zawierającą zrekombinowany DNA obejmujący gen reduktazy dihydropikolinianowej zligowany z wektorem ulegającym autonomicznej replikacji w komórkach bakterii należących do rodzaju Escherichia.
21. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że transformuje się bakterię dodatkowo zawierającązamplifikowany gen dehydrogenazy diaminopimelinianowej pochodzący z bakterii typu maczugowiec.
22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że transformuje się bakterię zawierającą zrekombinowany DNA obejmujący gen dehydrogenazy diaminopimelinianowej pochodzący z bakterii typu maczugowiec zligowany z wektorem ulegającym autonomicznej replikacji w komórkach bakterii należących do rodzaju Escherichia.
23. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że transformuje się bakterię dodatkowo zawierającą zamplifikowane geny sukcynylazy tetrahydropikolinianowej i deacylazy sukcynylodiaminopimelinianowej.
24. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że transformuje się bakterię zawierającąjeden zrekombinowany fragment DNA lub dwa zrekombinowane fragmenty DNA obejmujące gen sukcynylazy tetrahydropikolinianowej i/lub gen deacylazy sukcynylodiaminopimelinianowej zligowany z takim samym wektorem lub z różnymi wektorami ulegającymi autonomicznej replikacji w komórkach bakterii należących do rodzaju Escherichia.

* * *