PL203745B1 - Sposób wytwarzania związku ekteinascydynowego oraz związek pośredni w syntezie związku ekteinascydynowego - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania związku ekteinascydynowego oraz związek pośredni w syntezie związku ekteinascydynowego.

Stan techniki

Europejski opis patentowy 309.477 dotyczy ekteinascydyn 729, 743, 745, 759A, 759B i 770. Wykazano, że związki ekteinascydynowe mają właściwości antybakteryjne oraz inne użyteczne własności. Ekteinascydyna 743 obecnie jest poddawana próbom klinicznym jako środek przeciwnowotworowy.

Ekteinascydyna ma złożoną strukturę tris(tetrahydroizochinolinofenolową) o poniższym wzorze (I):

Obecnie jest otrzymywana drogą izolacji z ekstraktów osłonie morskich Esteinascidin turbinata. Wydajność jest niska i poszukiwane są alternatywne sposoby otrzymywania.

Sposób syntetycznego wytwarzania związków ekteinascydynowych jest ujawniony w opisie patentowym U.S. 5.721.362; patrz również WO 9812198, na który w całości powołujemy się. Zastrzegany sposób jest długotrwały i skomplikowany; przedstawiono 38 przykładów, z których każdy opisuje jeden lub więcej etapów sekwencji syntezy prowadzącej do ekteinascydyny 743.

W znanych sposobach syntezy, mostek 1,4 jest wytwarzany z uż yciem 1-labilnego zwią zku di-6,8-en-5-onowego, z 10-hydroksylem i 18-zabezpieczonym hydroksylem, o skondensowanym układzie pierścieniowym. Jak przedstawiono w przykładzie 33, związek (13) jest przekształcany w zwią zek (14):

Według znanego sposobu syntezy, tą drogą powstaje spirochinolina w mostku 1,4, w etapach z przykładów 34 do 36, a nastę pnie usuwana jest grupa zabezpieczająca 18-MOM, dostarczając ekteinascydynę 770, którą następnie można przekształcić w ekteinascydynę 743.

Zastrz. 25 opisu patentowego USA nr 5.721.362 jest nakierowane na pośredni związek fenolowy o podanym wzorze (11), który cytujemy jako półprodukt 11 lub lnt-11. Ma on strukturę bis(tetrahydroizochinolinofenolową) (II):

PL 203 745 B1

gdzie MOM oznacza podstawnik metoksymetylowy, a TBDPS oznacza podstawnik tert-butylodifenylosililowy.

Z półproduktu 11 możliwe jest zsyntetyzowanie innego interesującego środka przeciwnowotworowego, ftalascydyny, patrz Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 3496-3501, 1999. Ftalascydyna jest pochodną bis(tetrahydroizochinolinofenolową) o wzorze (III):

W ekteinascydynie 743 i 770 mostek 1,4 ma strukturę o wzorze (IV):

Inne znane ekteinascydyny obejmują związki o różnych cyklicznych układach mostkowych, takich jak występujących w ekteinascydynach 722 i 736, w których mostek ma strukturę wzorze (V):

PL 203 745 B1 ekteinascydynach 583 i 597, w których mostek ma strukturę o wzorze (VI)

oraz ekteinascydynach 594 i 596, w których mostek ma strukturę o wzorze (VII):

Pełna struktura tych i pokrewnych związków jest podana w J. Am. Chem. Soc, (1996), 118, 9017-9023. Na tę publikację niniejszym powołujemy się.

Inne pozycje literaturowe dotyczące związków ekteinascydynowych obejmują: Corey, E.J., J. Am. Chem. Soc, 1996, 118 str. 92029203; Rinehart, et al., Journal of National Products, 1990, Bioactive Compounds from Aquatic and Terrestrial Sources, wol. 53, str. 771-792; Rinehart et al., Pure and Appl. Chem., 1990, Biologically active natural products, wol. 62, str. 1277-1280; Rinehart, et al., J. Org. Chem., 1990, Ecteinascidins 729, 743, 745, 759A, 759B, and 770: Potent Antitumour Agents from the Caribbean Tunicate Ecteinascidia turbinata, wol. 55, str. 4512-4515; Wright et al., J. Org. Chem., 1990, Antitumour Tetrahydroisoquinoline Alkaloids from the Colonial Ascidian Ecteinascidia turbinata, wol. 55, str. 4508-4512; Sakai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, Additional antitumour ecteinascidins from a Caribbean tunicate: Crystal structures and activities in vivo, wol. 89, 11456-11460; Science 1994, Chemical Prospectors Scour the Seas for Promising Drugs, wol. 266, str. 1324; Koenig, K.E., Asymmetric Synthesis, ed. Morrison, Academic Press, Inc., Orlando, FL, wol. 5, 1985, str. 71; Barton, et al., J. Chem Soc. Perkin Trans., 1, 1982, Synthesis and Properties of a Series of Sterically Hindered Guanidine Bases, str. 2085; Fukuyama et al., J. Am Chem. Soc, 1982, Stereocontrolled Total Synthesis of (+)-Saframycin B, wol. 104, str. 4957; Fukuyama et al., J. Am Chem Soc, 1990, Total Synthesis of (+)-Saframycin A, wol. 112, str. 3712; Saito, et al., J. Org. Chem., 1989, Synthesis of Saframycins. Preparation of a Key Tricyclic Lactam Intermediate to Saframycin A, wol. 54, 5391; Still, et al., J. Org. Chem., 1978, Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate Resolution, wol. 43, str. 2923; Kofron, W.G.; Baclawski, L.M., J. Org. Chem., 1976, wol. 41, 1879; Guan et al., J. Biomolec. Struć & Dynam., wol. 10, str. 793-817 (1993); Shamma et al., Carbon-13 NMR Shift Assignments of Amines and Alkaloids, str. 206 (1979); Lown et al., Biochemistry, 21, 419-428 (1982); Żmijewski et al., Chem. Biol. Interactions, 52, 361-375 (1985); Ito, CRC Crit. Rev. Anal. Chem., 17, 65-143 (1986); Rinehart et al., Topics in Pharmaceutical Sciences 1989 str. 613-626,

D. D. Breimer, DJ. A. Cromwelin, K.K. Mid-ha, Eds., Amsterdam Medical Press B.V., Noordwijk, Holandia (1989); Rinehart et al., Biological Mass Spectrometry, 233-258 ed. Burlingame et al., Elsevier Amsterdam (1990); Guan et al., Jour. Biomolec. Struct. & Dynam., wol. 10 str. 793-817 (1993); Nakagawa et al., J. Amer. Chem. Soc, III: 2721-2722 (1989); Lichter et al., Food and Drugs from the Sea Proceedings (1972), Marine Technology Society, Washington, D.C. 1973, 117-127; Sakai et al., J. Amer. Chem. Soc. 1996, 118, 9017; Garcia-Rocha et al., Brit. J. Cancer, 1996, 73: 875-883; oraz Pommier et al., Biochemistry, 1996, 35: 13303-13309.

Znane są kolejne związki, które nie posiadają cyklicznego układu mostkowego. Obejmują one bis(tetrahydroizochinolinochinonowe) przeciwnowotworowe-przeciwbakteryjne antybiotyki safracyny i saframycyny oraz naturalne produkty pochodzenia morskiego renieramycyny

PL 203 745 B1 i ksestomycyny wyizolowane z hodowli mikroorganizmów i gą bek. Wszystkie one mają wspólny dimeryczny węglowy szkielet tetrahydroizochinolinowy. Związki te mogą być zaklasyfikowane do czterech typów, typów I do IV, w następstwie uwzględnienia charakteru utlenienia pierścieni aromatycznych.

Typ 1, dimeryczne izochinolinochinony, stanowi układ o wzorze (VIII) najczęściej występujący w tej klasie związków (patrz poniższa tablica 1).

T a b l i c a 1

Struktura antybiotyków saframycynowych typu I

Związek	Podstawniki
R14a	R14b	R21	R25a	R25b	R25c
saframycyna A	H	H	CN	O	O	CH3
saframycyna B	H	H	H	O	O	CH3
saframycyna C	H	OCH3	H	O	O	CH3
saframycyna G	H	OH	CN	O	O	CH3
saframycyna H	H	H	CN	OH	CH2COCH3	CH3
saframycyna S	H	H	OH	O	O	CH3
saframycyna Y3	H	H	CN	NH2	H	CH3
saframycyna Yd1	H	H	CN	NH2	H	C2H5
saframycyna Adi	H	H	CN	O	O	C2H5
saframycyna Yd2	H	H	CN	NH2	H	H
saframycyna Y2b	H	Qb	CN	NH2	H	CH3
saframycyna Y2b-d	H	Qb	CN	NH2	H	C2H5
saframycyna AH2	H	H	CN	Ha	OH a	CH3
saframycyna AH2Ac	H	H	CN	H	OAc	CH3
saframycyna AH1	H	H	CN	OH a	Ha	CH3
saframycyna AH1Ac	H	H	CN	OAc	H	CH3
saframycyna Ar3	H	H	H	H	OH	CH3

^a przypisania mogą być wymienne ^b jeś li grupa Q ma wzór (IX):

PL 203 745 B1

Typ I aromatycznych pierścieni występuje w saframycynie A, B i C; G i H; oraz S wyizolowanych z Streptomyces lavendulae jako zwią zki uboczne. Pochodna cyjanowa saframycyny A, nazwana cyjanochinonoaminą znana jest z japońskiego zgłoszenia patentowego Kokai JP-A2 59/225189 oraz 60/084288. Saframycyny Y3, Yd1, Ad1, i Yd2 są wytwarzane przez S. Iavendulae przez bezpośrednią biosyntezę, z odpowiednim uzupełnianiem środowiska hodowlanego. Dimery saframycyn Y2b i Y2b-d utworzone przez wiązanie azotu na C-25 jednej jednostki z C-14 drugiej, również wytwarzano w uzupełnianym środowisku hodowlanym S. Iavendulae. Saframycynę AR1(=AH2), produkt redukcji mikrobiologicznej saframycyny A na C-25 wytwarzany przez Rhodococcus amidophilus, otrzymano również przez niestereoselektywną chemiczną redukcję saframycyny A borowodorkiem sodu jako mieszaninę epimerów 1:1, a następnie wyizolowano chromatograficznie [pozostały izomer AH1, jest mniej polarny]. W wyniku tej samej mikrobiologicznej konwersji otrzymano produkt dalszej redukcji saframycyny AR3, 21-decyjano-25-dihydrosaframycynę A (=25-dihydrosaframycyna B). Inny sposób mikrobiologicznej konwersji saframycyny A z użyciem gatunku Nocardia dostarczył saframycynę B, a dalsza redukcja za pomo₁ cą gatunku Mycobacterium dała saframycynę AH¹Ac. Otrzymano również drogą chemiczną 25-O-octany saframycyny AH2 i AH1 do badań biologicznych.

Typ I związków o wzorze (X) również wyizolowano z gąbek morskich; patrz tablica II.

T a b l i c a II

Struktury typu I związków z gąbek morskich

Podstawniki
	R14a	R14b	R 21	R
renieramycyna A	OH	H	H	-C(CH3)=CH-CH3
renieramycyna B	OC2H5	H	H	-C(CH3)=CH-CH3
renieramycyna C	OH	O	O	-C(CH3)=CH-CH3
renieramycyna D	OC2H5	O	O	-C(CH3)=CH-CH3
renieramycyna E	H	H	OH	-C(CH3)=CH-CH3
renieramycyna F	OCH3	H	OH	-C(CH3)=CH-CH3
ksestomycyna	OCH3	H	H	-CH3

PL 203 745 B1

Renieramycyny A-D wyizolowano z mikrobiologicznego ekstraktu gąbki gatunku Reniera pozyskanego w Meksyku, obok biogenetycznie pokrewnych monomerycznych renieronowych izochinolin i związków pokrewnych. Struktura renieramycyny A pierwotnie została przypisana z odwrotną stereochemią na C-3, C-11 i C-31. Jednakże, po starannym sprawdzeniu danych ¹H NMR dla nowych pokrewnych renieramycyny E i F, wyizolowanych z tej samej gąbki pozyskanej w Palau, okazało się, że połączenie pierścieni renieramycyn jest identyczne jak w saframycynach.

To doprowadziło do wniosku, że pierwotnie przypisana stereochemia renieramycyn A i D musi być identyczna jak ta w saframycynach.

Ksestomycynę wykryto w gąbce gatunku Xestospongia pozyskanej z wód Sri Lanki.

Związki typu II o wzorze (IX) z zredukowanym pierścieniem hydrochinonowym obejmują saframycyny D i F wyizolowane z S. Iavendulae oraz saframycyny Mx-1 i Mx-2 wyizolowane z Myxococcus xanthus. Patrz tablica III.

T a b l i c a III

Związki typu II och₃

Podstawniki
Związek	R14a	R14b	R21	R25a	R25b	R25c
saframycyna D	O	O	H	O	O	CH3
saframycyna F	O	O	CN	O	O	CH3
saframycyna Mx-1	H	OCH3	OH	H	CH3	NH2
saframycyna Mx-2	H	OCH3	H	H	CH3	NH2

Szkielet typu III wykryto w antybiotykach safracynach A i B wyizolowanych z hodowli Pseudomonas fluorescens. Te antybiotyki o wzorze (XII) złożone są z podjednostki tetrahydroizochinolino-chinonowej oraz podjednostki tetrahydroizochinolinofenolowej,

w którym R²¹ oznacza -H w safracynie A i oznacza -OH w safracynie B.

PL 203 745 B1

Saframycyna R, jedyny związek sklasyfikowany ze szkieletem typu IV, została również wyizolowana S. Iavendulae. Ten związek o wzorze (XIII) złożony z pierścienia hydrochinonowego z estrem glikolowym w łańcuchu bocznym na jednym z tlenów fenolowych, jest potencjalnym prolekiem saframycyny A ze względu na swą umiarkowaną toksyczność.

Wszystkie te znane związki mają skondensowany układ pięciu pierścieni (A) do (E) przedstawiony poniższym wzorem strukturalnym (XIV).

Te pierścienie A i E mają charakter fenolowy w ekteinascydynach i niektórych innych związkach, natomiast w innych związkach, szczególnie saframycynach, pierścienie A i E są chinolowe. W znanych zwią zkach pierś cienie B i D są tetrahydro, natomiast pierś cień C jest perhydro.

Celem wynalazku jest opracowanie alternatywnej drogi syntezy prowadzącej do związków ekteinascydynowych oraz związków pokrewnych, która może zapewnić bardziej ekonomiczne dojścia do znanych środków przeciwnowotworowych, jak również umożliwić otrzymanie nowych związków aktywnych.

Istota wynalazku

Według wynalazku, sposób wytwarzania związku ekteinascydynowego, charakteryzuje się tym, że obejmuje etap odbiezpieczania związku o wzorze A, w którym usuwa się obie grupy zabezpieczające w jednym etapie i wytwarza się α-aminolakton o wzorze 35, według poniższego schematu

bezpieczającą grupę hydroksylową.

NH OH NH

Korzystnie, Prot^NH oznacza t-butyloksykarbonyl, zaś Prot^OH oznacza metoksymetyl, albo Prot^NH oznacza t-butyloksykarbonyl, zaś Prot^OH oznacza metoksyetosymetyl.

Korzystnie, sposób obejmuje ponadto etap utleniania α-amino-laktonu o wzorze 35 do odpowiadającego α-ketolaktonu o wzorze 36 poprzez transaminację:

PL 203 745 B1

Korzystnie, sposób obejmuje ponadto etap stereospecyficznego wytwarzania spirotetrahydroizochinolinowego związku Et770 z α-ketolaktonu o wzorze 36 poprzez reakcję Pictet-Spengler'a:

Korzystnie, sposób obejmuje ponadto etap zastąpienia grupy nitrowej w pozycji C-21 Et770

Według wynalazku, sposób wytwarzania związku ekteinascydynowego, charakteryzuje się również tym, że obejmuje etap, w którym utlenia się α-aminolakton o wzorze 35 do odpowiadającego

PL 203 745 B1

Korzystnie, sposób obejmuje ponadto etap stereospecyficznego wytwarzania spirotetrahydroizochinolinowego związku Et770 z α-ketolaktonu o wzorze 36 poprzez reakcję Pictet-Spengler'a:

Korzystnie, sposób obejmuje ponadto etap zastąpienia grupy nitrowej w pozycji C-21 Et770

Ponadto, sposób wytwarzania związku ekteinascydynowego, według wynalazku charakteryzuje się tym, że obejmuje etap, w którym prowadzi się stereospecyficzne wytwarzanie spirotetrahydroizochinolinowego związku Et770 z α-ketolaktonu o wzorze 36 poprzez reakcję PictetSpengler'a:

Korzystnie, sposób obejmuje ponadto etap zastąpienia grupy nitrowej w pozycji C-21 Et770 przez grupę hydroksy, w celu wytworzenia Et743:

PL 203 745 B1

(Et770)

Według wynalazku, o wzorze 35 (Et743) związek pośredni w syntezie związku ekteinascydynowego stanowi związek

Według wynalazku, związek o wzorze 36 związek pośredni w syntezie związku ekteinascydynowego stanowi również

Dzięki wynalazkowi jest możliwe wytwarzanie produktu ekteinascydynowego o spiroaminowym mostku 1,4, poprzez tworzenie mostku 1,4 z użyciem 1-labilnego związku di-6,8-en-5-onowego, z 10-hydroksylem i 18-zabezpieczonym hydroksylem, o skondensowanym układzie pierścieniowym, który to skondensowany układ pierścieniowy jest przedstawiony wzorem (XIV). Zabezpieczenie C-18 jest usuwane przed wprowadzeniem spiroaminy.

Odpowiednie materiały wyjściowe do nowych sposobów syntezy obejmują związki pokrewne naturalnym alkaloidom bis(tetrahydroizochinolinowym). Takie materiały wyjściowe można otrzymać zarówno z różnych klas antybiotyków saframycynowych i safracynowych dostępnych z rozmaitych bulionów hodowlanych, co ujawniono szczegółowo w WO 0069862, lub innymi sposobami syntetycznymi lub biochemicznymi. W tym względzie, w pełni powołujemy się na opis WO 0069862. Niniejsze zgłoszenie PCT zastrzega pierwszeństwo ze zgłoszenia PCT/GB00/01852, które opublikowano jako WO 0069862. Powołujemy się na wymieniony opis, którego zakres tam ujawniony nie został dołączony do niniejszego opisu.

W szczególności, dzięki wynalazkowi jest możliwe zastosowanie półproduktu 21 w licznych sposobach syntezy dla otrzymania ekteinascydyny 743 i związków pokrewnych,

PL 203 745 B1

Półprodukt 21 zawiera grupę 5-alliloksylową, która to grupa allilowa stanowi zabezpieczenie grupy 5-hydroksylowej. Okaże się, że inne grupy zabezpieczające bez trudu mogą być wykorzystane, oraz że niniejszy wynalazek obejmuje ogólnie zastosowanie innych takich związków z zabezpieczonymi grupami 5-hydroksylowymi.

Wytwarzanie ekteinascydyny 743 i związków pokrewnych

Ogólnie, przekształcenie półproduktu 21 lub związku pokrewnego w produkt ekteinascydynowy obejmuje następujące kluczowe transformacje:

(a) konwersję NH2 do OH w reakcji na przykład z azotynem sodu w kwasie octowym;

(b) zabezpieczenie fenolowego pierścienia E;

(c) estryfikację z zabezpieczeniem pierwszorzędowej funkcji 1-hydroksylowej zabezpieczonym łańcuchem cysternowym;

(d) odbezpieczenie grupy allilowej i utlenienie;

(e) utworzenie pierścienia mostkującego w reakcji cyklizacji;

(f) odbezpieczenie fenolowego pierścienia E i fragmentu cysteinowego;

(g) wprowadzenie chinoliny przez trans-aminowanie i reakcje Pictet-Spengler'a.

Wysoki stopień sfunkcjonalizowania półproduktów wymaga użycia grup zabezpieczających dla fenolowego pierścienia E oraz dla bocznego łańcucha cysteinowego, w celu zapobieżenia niepożądanym reakcjom ubocznym.

Wskutek tego można wytworzyć liczne alternatywne półprodukty z w zależności od konkretnego wyboru grup zabezpieczających.

Możliwe są różne sekwencje łączenia tych transformacji, w zależności przede wszystkim od wybranych grup zabezpieczających dla pierścienia fenolowego i aminy cysteinowego łańcucha bocznego.

Całkowita liczba transformacji syntetycznych jest również funkcją wyboru grup zabezpieczających.

Dla zilustrowania, poniżej podano zastosowanie różnych kombinacji grup zabezpieczających dla sześciu typowych dróg otrzymywania ET-743 z półproduktu 21, niniejszym również oznaczanego jako SF21.

Droga	Zabezpieczenie fenolu	Zabezpieczenie cysteiny	Liczba etapów
1	MOM	Boc	12
2	MEM	Boc	10
3	MEM	Cbz	11
4	MOM	Alloc	13
5	MEM	Alloc	13
6	MOM	Cbz	15

Specjalista w dziedzinie bez trudu może zauważyć, że niniejszym przedstawione schematy reakcji mogą być modyfikowane i/lub łączone rozmaitymi drogami, a alternatywne sekwencje etapów i wytwarzane tam związki stanowią również część niniejszego wynalazku.

Ponadto, wykorzystanie innych strategii zabezpieczania grup, tu nie wyszczególnionych, stanowi również część niniejszego wynalazku.

Szczegóły sposobów dla sześciu typowych dróg syntezy

Pełne schematy reakcji dla każdej drogi są przedstawione na poniższych schematach 1 do 6.

PL 203 745 B1

Schemat 1 - Et-743: alternatywna półsyntetyczna droga 1

Et-770

PL 203 745 B1

Schemat 2 - Et-743: alternatywna półsyntetyczna droga 2

ET-770

PL 203 745 B1

Schemat 3 - Et-743: alternatywna półsyntetyczna droga 3

ΜΕΜΟ

Et-770

PL 203 745 B1

164

PL 203 745 B1

Schemat 5 - Et-743: alternatywna półsyntetyczna droga 5

OMe OMe

El-770

PL 203 745 B1

Schemat 6 - Et-743: alternatywna półsyntetyczna droga 6

PL 203 745 B1

Według etapów 1 i 2, zabezpieczenie cysteinowego łańcucha bocznego za pomocą Boc umożliwia odbezpieczenie grupy fenolowej i cysteinowej nawet w jednym etapie, a nie w dwóch oddzielnych etapach. W przypadku pozostałych dróg wymagany jest dodatkowy etap odbezpieczania.

Według drogi 2 unika się półproduktu 25 dzięki zastosowaniu metodologii estryfikacji bezpośredniej oraz kolejno zabezpieczenia fenolu grupą MEM.

Według dróg 2 i 3 opóźnia się zabezpieczanie pierścienia fenolowego E aż do etapów diazowania i estryfikacji, co pozwala za zabezpieczenie fenolu w jednym etapie, a nie w trzech kolejnych etapach według drogi 1.

W przypadku dróg 1, 2 i 3, bezpośrednie estryfikowanie pierwszorzędowego alkoholu pochodną cysteiny eliminuje nieekonomiczne etapy zabezpieczania/odbezpieczania pierwszorzędowego alkoholu grupą sililową (drogi 4 i 5), co skraca sekwencję o dwa etapy.

Droga 6 uwzględnia tu tylko ostatnie etapy od półproduktu 161, który można łatwo otrzymać z półproduktu 21.

Według dróg 4 i 5, pierwszorzędowy alkohol wytworzony w początkowym etapie diazowania, zabezpiecza się krzemem umożliwiając selektywne odbezpieczenia fenolowego pierścienia E unikając półproduktu 25. W następstwie modyfikacji pierścienia A (odbezpieczenie/utlenianie) grupę krzemową usuwa się, a pierwszorzędowy alkohol estryfikuje pochodną cysteiny.

Zmiany te stanowią bezpośrednią konsekwencję trudności, jakie wystąpiły przy powiększaniu skali według drogi ujawnionej w WO 0069862. W wyniku tych zmian całość drogi 2 skraca się o trzy etapy, a zatem jest bardziej odpowiednia i/lub tańsza dla procesu wytwórczego.

Omówienie sposobu

A zatem, w świetle dróg 1 do 6, sposób otrzymywania produktu ekteinascydynowego z mostkiem spiroaminowym 1,4 obejmuje tworzenie mostka 1,4 z użyciem 1-labilnego związku di-6,8-en-5-onowego, z 10-hydroksylem i 18-zabezpieczonym hydroksylem, o skondensowanym układzie pierścieniowym, w którym zabezpieczenie na C-18 usuwa się przed wprowadzeniem fragmentu spiroaminowego.

W jednej z wersji sposobu, produkt ekteinasycynowy posiada grupę 21-hydroksylową, a sposób obejmuje przekształcenie grupy 21-cyjankowej w grupę 21-hydroksylową.

Zwykle spiroaminą jest spirochinolina, zwłaszcza spirochinolina ekteinascydyny 743.

W korzystnym sposobie grupą zabezpieczającą w pozycji 18 1-labilnego związku di-6,8-en-5-onowego, z 10-hydroksylem i 18-zabezpieczonym hydroksylem, o skondensowanym układzie pierścieniowym, stanowi zabezpieczenie MOM, grupą metoksymetylową; lub MEM, grupą metoksyetoksymetylową.

Odpowiednią grupą 1 -labilną jest N-zabezpieczona grupa cysteinyloksymetylenowa o wzorze -CH2-O-CO-CNHProt¹-CH2-S-H.

₁

W tym wzorze Prot¹ zwykle oznacza: Boc, t-butyloksykarbonyl; Troc, 2,2,2-trichloroetyloksykarbonyl; Cbz, benzyloksykarbonyl; lub Alloc, alliloksylkarbonyl.

W niektórych praktycznych realizacjach sposobu, Prot¹ usuwa się w tym samym etapie co i zabezpieczenie C-18.

Grupa 1-labilna może być wytworzona z 1-podstawnika o wzorze:

-CH2-O-CO-CNHProt¹-CH2-S-Prot².

₂

W tym wzorze Prot² zwykle oznacza Fm, 6-fluorenylometyl.

Podstawnik w pozycji 1, o wzorze:

-CH2-O-CO-CNHProt¹-CH2-S-Prot², może być wytworzony drogą estryfikacji podstawnika -CH2-O-H.

Estryfikację można przeprowadzić przed lub po utworzeniu struktury 10-hydroksy-di-6,8-en-5-onowej.

W jednej wersji sposób syntezy wychodzi z 1-amino-metyleno-7,8-dioksymetyleno-18-hydroksy-21-cyjanozwiazku o układzie skondensowanych pierścieni z zabezpieczoną grupą 5-hydroksylową.

Grupa 1-aminometylenowa może być tymczasowo zabezpieczona aby umożliwić zabezpieczenie grupy 18-hydroksylowej, a następnie tymczasowe zabezpieczenie usuwa się.

Alternatywnie grupa hydroksylowa na C-18 może być zabezpieczona po utworzeniu funkcji 1-estrowej.

W innej modyfikacji, grupę 1-aminometylenową przekształca się w grupę 1-hydroksymetylenową, i grupę 1-hydroksymetylenową tymczasowo zabezpiecza się, aby umożliwić zabezpieczenie grupy 18-hydroksylowej, a następnie tymczasowe zabezpieczenie usuwa się.

Układ pierścieni skondensowanych odpowiada wzorowi:

PL 203 745 B1

w którym zwłaszcza R¹⁵ oznacza H. Jeden lub wię cej pozostałych podstawników może odpowiadać ekteinascydynie 743.

Sposób półsyntetyczny

W procesie wytwarzania związków ekteinascydynowych jest moż liwe wykorzystanie znanego związku, safracyny B, zwanej również chinonoaminą, w syntezie półsyntetycznej.

W procesie półsyntetycznym, wychodząc z naturalnych alkaloidów bis(tetrahydroizochinolinowych) jest możliwe wytwarzania półproduktów, pochodnych ekteinascydyny i struktur pokrewnych, lub innych związków tetrahydroizochinolinofenolowych. Odpowiednie materiały wyjściowe do procesu półsyntetycznego obejmują klasy antybiotyków saframycynowych i safracynowych dostępnych z rozmaitych bulionów hodowlanych, a także klasy związków reineramycynowych i ksestomycynowych dostępnych z gąbek morskich.

Ogólny wzór (XV) związków wyjściowych jest następujący:

w którym:

R¹ oznacza grupę amidometylenową, taką jak -CH₂-NH-CO-CR^25aR^25bR^25c, które to R^25a i R^25b tworzą grupę ketonową lub jedna oznacza -OH, -NH2 lub -OCOCH3, a pozostała oznacza -CH2COCH3, -H, -OH lub -OCOCH3, pod warunkiem, że jeśli R^25a oznacza -OH lub -NH2, to R^25b nie oznacza -OH i R^25c oznacza -H, -CH3 lub -CH2CH3, lub R1 oznacza grupę acyloksymetylenową, taką jak -CH2-O-CO-R, gdzie R oznacza -C(CH3)=CH-CH3 lub -CH3;

R5 i R8 są niezależnie wybrane spośród -H, -OH lub -OCOCH2OH lub oba R5 i R8 oznaczają grupę ketonową i pierścień A oznacza pierścień p-benzochinonowy;

oba R^14a i R^14b oznaczają -H lub jeden oznacza -H, a pozostały oznacza -OH, -OCH3 lub -OCH₂CH₃, lub R^14a i R^14b łącznie tworzą grupę ketonową;

R15 i R18 są niezależnie wybrane spośród -H lub -OH, lub oba R⁵ i R⁸ oznaczają grupę ketonową i pierś cień A oznacza pierś cień p-benzochinonowy; oraz

R²¹ oznacza -OH lub-CN.

Bardziej ogólny wzór tej klasy związków jest przytoczony poniżej:

PL 203 745 B1

w którym każda z grup podstawników zdefiniowanych przez R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7. R8, R9, R10 jest niezależnie wybrana z grupy obejmującej H, OH,OCH3, CN, =O, CH3;

w którym X oznacza różne funkcje amidowe lub estrowe zawarte w wymienionych produktach naturalnych;

w którym każde koło zaznaczone przerywaną linią oznacza jedno, dwa lub trzy ewentualne wiązania podwójne.

Każda z dróg półsyntetycznych obejmuje pewną liczbę etapów transformacji aż do uzyskania żądanego produktu.

Proces wytwarzania związków ekteinascydynowych obejmuje dostarczenie wyjściowego materiału z grupą 21-cyjankową, o ogólnym wzorze (XVI):

w którym R¹, R⁵, R⁸, R^14a, R^14b, R¹⁵ i R¹⁸ są zdefiniowane jak powyżej.

Inne związku o wzorze (XVI) z różnymi podstawnikami w pozycji 21 również mogą stanowić możliwe materiały wyjściowe. Ogólnie, może być stosowana jakakolwiek pochodna możliwa do wytworzenia poprzez podstawienie nukleofilowe grupy 21-hydroksylowej w związkach o wzorze (XV), w którym R²¹ oznacza grupę hydroksylową. Przykłady odpowiednich podstawników 21 obejmują, zwłaszcza:

grupę merkaptanową, grupę alkilotio (przy czym grupa alkilowa ma od 1 do 6 atomów węgla);

grupę arylotio (przy czym grupa arylowa ma od 6 do 10 atomów węgla i jest niepodstawiona lub podstawiona przez do 1 do 5 podstawników wybranych spośród na przykład grupy alkilowej mającej od 1 do 6 atomów węgla, grup alkoksylowych mających od 1 do 6 atomów węgla, atomów halogenów, grup merkaptanowych i grup nitrowych);

grupę aminową;

grupę mono- lub dialkiloaminową (przy czym dana lub każda grupa alkilowa ma od 1 do 6 atomów węgla);

grupę mono- lub diaryloaminową (przy czym dana lub każda grupa arylowa jest zdefiniowana jak powyżej w odniesieniu do grupy arylotio);

grupę α-karbonyloalkilową o wzorze -C(R^a)(R^b)-C(=O)R^c, w którym ab

R^a i R^b są wybrane spośród atomów wodoru, grup alkilowych mających od 1 do 20 atomów węgla, grup arylowych (zdefiniowanych powyżej w odniesieniu do grup arylotio) i grup aralkilowych w których grupa alkilowa mająca od 1 do 4 atomów węgla jest podstawiona przez grupę arylową zdefiniowaną powyżej w odniesieniu do grup arylotio) pod warunkiem, że jeden spośród R^a i R^b oznacza atom wodoru;

R^c jest wybrany spośród atomu wodoru, grupy alkilowej mającej od 1 do 20 atomów węgla, grup arylowych (zdefiniowanych powyżej w odniesieniu do grup arylotio), grupy aralkilowej (w której grupa alkilowa mająca od 1 do 4 atomów węgla jest podstawiona przez grupę arylową zdefiniowaną powyżej

PL 203 745 B1 w odniesieniu do grup arylotio), grupy alkoksylowej mają cej od 1 do 6 atomów węgla, grupy aminowej lub grupy mono- lub dialkiloaminowej zdefiniowanej powyżej.

Zatem, w procesie wytwarzania związków ekteinascydynowych pierwszy etap polega na utworzeniu 21-pochodnej z użyciem reagenta nukleofilowego. Przytaczamy takie związki jako związki 21-Nuc.

Obecność grupy 21-cyjankowej jest wymagana dla pewnych produktów finalnych, w tym ekteinascydyny 770 i ftalascydyny, podczas gdy dla innych produktów finalnych funkcjonuje ona jako grupa zabezpieczająca, która może być łatwo przekształcona w inny podstawnik, taki jak grupa 21-hydroksylowa ekteinascydyny 743 lub 21-hydroksyftalascydyny. Stosowanie 21-cyjanozwiązku jako materiału wyjściowego skutecznie stabilizuje cząsteczkę w trakcie kolejnych etapów syntezy, aż do jej ewentualnego usunięcia. Inne związki 21-Nuc mogą zapewniać takie i inne zalety.

Ponadto, proces wytwarzania związków ekteinascydynowych obejmuje użycie 21-cyjanozwiazku o ogólnym wzorze (XVI) do otrzymywania związków bis- lub tris(tetrahydroizochinolinofenolowych). Produkty, które można wytwarzać, obejmują półprodukty, takie jak półprodukt 11 lub 21, lub ekteinascydyny, jak również związki o strukturze pokrewnej.

14a

Korzystne materiały wyjściowe obejmują te związki o wzorze (XV) lub (XVI), w których oba R^14a i R^14b oznaczają wodór. Korzystne materiały wyjściowe również obejmują związki o wzorze (XV) lub (XVI), w których R¹⁵ oznacza wodór. Ponadto, korzystne materiały wyjściowe obejmują związki o wzorze (XV) lub (XVI), w których pierścień E oznacza pierścień fenolowy. Korzystne materiały wyjściowe ponadto obejmują związki o wzorze (XV) i (XVI), w których co najmniej jeden, korzystniej co najmniej dwa lub trzy spośród R⁵, R⁸, R¹⁵ i R¹⁸ nie oznaczają wodoru.

Przykłady odpowiednich materiałów wyjściowych obejmują saframycynę A, saframycynę B, saframycynę C, saframycynę G, saframycynę H, saframycynę S, saframycynę Y3, saframycynę Yd1 saframycynę Ad1 saframycynę Yd2, saframycynę AH2, saframycynę AH2Ac, saframycynę AH-i, saframycynę AH2Ac, saframycynę AR3, renieramycynę A, renieramycynę B, renieramycynę C, renieramycynę D, renieramycynę E, renieramycynę F, ksestomycynę, saframycynę D, saframycynę F, saframycynę Mx-1, saframycynę Mx-2, safracynę A, safracynę B i safracynę R. Korzystne materiały wyjściowe mają grupę cyjankową w pozycji 21, dla grupy R²¹.

Proces wytwarzania związków ekteinascydynowych obejmuje sposób półsyntetyczny, w którym etapy transformacji są zastosowane względem safracyny B:

Safracyna B cechuje się układem pierścieniowym pokrewnym ekteinascydynom. Związek ten ma tę samą strukturę pentacykliczną i ten sam charakter podstawienia w pierścieniu położonym po prawej stronie, pierścieniu E. A także, safracyna B wykazuje bardzo bliskie podobieństwa do niektórych półproduktów syntetycznych w totalnej syntezie Et-743, zwłaszcza do półproduktów 11 lub 21. Taki półprodukt może być przekształcony w Et-743 z wykorzystaniem ogólnie znanego sposobu. Syntetyczna konwersja safracyny B do półproduktów 11 lub 21 dostarcza zatem półsyntetyczny sposób otrzymywania Et-743.

Bardziej korzystne materiały wyjściowe mają grupę 21-cyjankową. W szczególność, korzystnym związkiem jest związek o wzorze 2. Związek ten jest otrzymywany bezpośrednio z safracyny B i jest uważany za kluczowy półprodukt w sposobie półsyntetycznym.

PL 203 745 B1

Alternatywnie, cyjanosafracyna B może być wytworzona poprzez prowadzenie fermentacji ze szczepem wytwarzającym safracynę B, Pseudomonas fluorescens, i przeróbki bulionu hodowlanego z uż yciem jonu cyjankowego. Korzystnym szczepem Pseudomonas fluorescens jest szczep A2-2, FERM BP-14, który jest wykorzystywany w procedurze według EP 055.299. Odpowiednim źródłem jonu cyjankowego jest cyjanek potasu. W typowej przeróbce, bulion hodowlany sączy się i dodaje nadmiar jonów cyjankowych. Po odpowiednim okresie mieszania, takim jak 1 godzina, pH doprowadza się do alkalicznego, powiedzmy 9,5, i po organicznej ekstrakcji uzyskuje się surowy ekstrakt, który może być dalej oczyszczany dostarczając cyjanosafracynę B.

Związki ekteinascydynowe stanowią zwykle związki o wzorze (XVIIb):

w którym R¹ i R⁴ łącznie tworzą grupę po wzorze (IV), (V), (VI) lub (VII):

R⁵ oznacza -H lub -OH;

R⁷ i R⁸ łącznie tworzą grupę -O-CH2O-;

R^14a i R^14b oba oznaczają -H jeden oznacza -H a pozostały oznacza -OH, -OCH3 lub -OCH 2CH3 lub R^14a i R^14b łącznie tworzą grupę ketonową; oraz

R¹⁵ oznacza -H lub-OH;

R²¹ oznacza -H, -OH lub -CN;

₅ oraz pochodne obejmujące pochodne acylowe, zwłaszcza gdy R⁵ oznacza acetyloksyl lub inną grupę acyloksylową o do 4 atomach węgla.

We wzorze (XVIIb) zwykle R¹ z R⁴ tworzą grupę (IV) lub (V). Grupa R¹⁸ jest zwykle zabezpieczona. Zwykle R²¹ oznacza grupę cyjankową.

PL 203 745 B1

Korzystnie R^14a i R^14b oznaczają wodór. Korzystnie R¹⁵ oznacza wodór. Pochodne O-acylowe są odpowiednio O-acylowymi pochodnymi alifatycznymi, zwłaszcza pochodnymi acylowymi o 1 do 4 atomach węgla, a zwykle grupą O-acetyIową, zwłaszcza w pozycji 5.

Odpowiednie grupy zabezpieczające dla fenoli i grup hydroksylowych obejmują etery i estry, takie jak etery alkilowe, alkoksyalkilowe, aryloksyalkilowe, alkoksyalkoksyalkilowe, alkilosililoalkoksyalkilowe, alkilotioalkilowe, arylotioalkilowe, azydoalkilowe, cyjanoalkilowe, chloroalkilowe, heterocykliczne, aryloacylowe, haloaryloacylowe, cykloalkiloalkilowe, alkenylowe, cykloalkilowe, alkiloaryloalkilowe, alkoksyaryloalkilowe, nitroaryloalkilowe, haloaryloalkilowe, alkiloaminokarbonyloaryloalkilowe, alkilosulfinyloaryloalkilowe, alkilosililowe i inne etery, oraz estry aryloacylowe, węglany aryloalkilu, węglany alifatyczne, węglany alkilosulfinyloaryloalkilowe, węglany alkilu, węglany arylo-haloalkilu, węglany aryloalkenylu, karbaminiany arylu, estry alkilo-fosfinylowe, alkilofosfinotioilowe, arylofosfinotioilowe, sulfoniany arylo-alkilu i inne estry. Grupy takie mogą być podstawione przez grupy, uprzednio wymienione dla R¹.

Odpowiednie grupy zabezpieczające dla amin obejmują karbaminiany, amidy i inne grupy zabezpieczające, takie jak alkil, aryloalkil, sulfo- lub halo-aryloalkil, haloalkil, alkilosililoalkil, aryloalkil, cykloalkiloalkil, alkiloaryloalkil, heterocykloalkil, nitroaryloalkil, acyloaminoalkil, nitroaryloditioaryloalkil, dicykloalkilokarboksyamidoalkil, cykloalkil, alkenyl, aryloalkenyl, nitroaryloalkenyl, heterocykloalkenyl, grupa heterocykliczna, hydroksyheterocykliczna, alkiloditio, alkoksy- lub halo- lub alkilosulfinyloaryloalkil, heterocykloacyl i inne karbaminiany, oraz alkanoil, haloalkanoil, aryloalkanoil, aryloalkanoil, alkenoil, heterocykloacyl, aroil, aryloaroil, haloaroil, nitroaroil i inne amidy, jak również alkil, alkenyl, alkilosililoal-koksyalkil, alkoksyalkil, cyjanoalkil, grupa heterocykliczna, alkoksyaryloalkil, cykloalkil, nitroaryl, aryloalkil, alkoksy- lub hydroksy-aryloalkil i wiele innych grup. Grupy takie ewentualnie mogą być podstawione przez grupy uprzednio wymienione dla R¹.

Przykłady takich grup zabezpieczających są podane w poniższych tablicach: zabezpieczenie grupy -OH etery oznaczenie metyl metoksymetyl MOM benzyloksymetyl BOM metoksyetoksymetyl MEM

2-(trimetylsililo)etoksymetyl SEM metylotiometyl MTM fenylotiometyl PTM azydometyl cyjanometyl

2,2-dichloro-1,1-difluoroetyl 2-chloroetyl 2-bromoetyl tetrahydropiranyl 1-etoksyetyl fenacyl

4-bromofenacyl cyklopropylometyl allil propargil izopropyl cykloheksyl t-butyl benzyl

2,6-dimetylobenzyl

4-metoksybenzyl MPM lub PMB o-nitrobenzyl 2,6-dichlorobenzyl 3,4-dichlorobenzyl 4-(dimetylamino)karbonylobenzyl 4-metylosulfinylobenzyl Msib

THP

EE

PL 203 745 B1

9-antrylometyl
4-pikolil heptafluoro-p-tolil tetrafluoro-4-pirydyl trimetylosilil	TMS
t-butylodimetylosilil	TBDMS
t-butylodifenylosilil	TBDPS
triizopropylosilil	TIPS
estry mrówczan arylu octan arylu lewulinian arylu piwalonian arylu	ArOPv
benzoesan arylu 9-fluorokarboksylan arylu węglan arylo-metylu węglan 1-adamantylu węglan t-butylu	BOC-OAr
węglan 4-metylosulfinylobenzylu	Msz-Oar
węglan 2,4-dimetylopent-3-ylu	Doc-Oar
węglan arylo-2,2,2-trichloroetylu węglan arylo-winylu węglan arylo-benzylu karbaminian arylu dimetylofosfinyl	Dmp-OAr
dimetylofosfinotioil	Mpt-OAr
difenylofosfinotioil	Dpt-Oar
metanosulfonian arylu toluenosulfonian arylu 2-formylobenzenosulfonian arylu zabezpieczenie grupy NH2
karbaminiany	oznaczenie
metyl etyl 9-fluorenylometyl	Fmoc
9-(2-sulfo)fluorenylometyl 9-(2,7-dibromo)fluorenylmetyl 17-tetrabenzo[a,c,g,i]fluorenylometyl	Tbfmoc
2-chloro-3-indenylometyl	Climoc
benz[f]inden-3-ylometyl	Bimoc
2,7-di-t-butylo[9-(10,10-diokso-10,- 10,10,10-tetrahydrotioksantylo)]metyl	DBD-Tmoc
2,2,2-trichloroetyl	Troc
2-trimetylsililoetyl	Troc
2-fenyloetyl	hZ
1-(1-adamantylo)-1-metyloetyl	Adpoc
2-chloroetyl 1.1- dimetylo-2-chloroetyl 1.1- dimetylo-2-bromoetyl 1.1- dimetylo-2,2-dibromoetyl	DB-t-BOC
1,1-dimetylo-2,2,2-trichloroetyl	TCBOC
1-metylo-1-(4-bifenylo)etyl	Bpoc
1-(3,5-di-t-butylofenylo)-1,1-metyloetyl	t-Burmeoc
2-(2'-oraz 4'-pirydylo)etyl	Pyoc

PL 203 745 B1

2,2-bis(4'-nitrofenylo)etyl Bnpeoc
n-(2-piwaloiloamino)-1,1-dimetyloetyl 2-[(2-nitrofenylo)ditio]-1-fenyloetyl	NpSSPeoc
2-(n,n-dicykloheksylokarboksyamido)etyl t-butyl	BOC
1-adamantyl	1-Adoc
2-adamantyl	2-Adoc
winyl	Voc
allil	Aloc lub Alloc
1-izopropyloallil	Ipaoc
cynamyl	Coc
4-nitrocynamyl	Noc
3-(3'-pirydylo)prop-2-enyl	Paloc
8-chinolil n-hydroksypiperydynyl alkiloditio benzyl	Cbz lub Z
p-metoksybenzyl	Moz
p-nitrobenzyl	PNZ
p-bromobenzyl p-chlorobenzyl 2,4-dichlorobenzyl 4-metylosulfinylobenzyl	Msz
9-antrylometyl difenylometyl fenotiazynylo-(10)-karbonyl n'-p-toluenosulfonyloaminokarbonyl n'-fenyloaminotiokarbonyl amidy formamid acetamid chloroacetamid trifluoroacetamid	TFA
fenyloacetamid 3-fenylopropanamid pent-4-enamid pikolinamid 3-pirydylokarboksyamid benzamid p-fenylobenzamid n-ftalimid n-tetrachloroftalimid	TPC
4-nitro-n-ftalimid n-ditiasukcynimid	Dts
n-2,3-difenylomaleimid n-2,5-dimetylopirol n-2,5-bis(triizopropylosiloksylo)pirol	BIPSOP
addukt n-1,1,4,4-tetrametylodisililoazacyklopentanowy	STABASE
1,1,3,3-tetrametylo-1,3-disilaizoindolina	BSB

szczególne grupy zabezpieczające -NH n-metyloamina n-t-butyloamina n-alliloamina n-[2-(trimetylosililo)etoksy]metyloamina

SEM

PL 203 745 B1 n-3-acetoksypropyloamina n-cyjanometyloamina n-(1-izopropylo-4-nitro-2-okso-3-pirolin-3-ylo)-amina n-2,4-dimetoksybenzyloamina Dmb

2-azanorborneny n-2,4-dinitrofenyloamina n-benzyloamina Bn n-4-metoksybenzyloamina MPN n-2,4-dimetoksybenzyloamina DMPN n-2-hydroksybenzyloamina Hbn n-(difenylometylo)amino DPM n-bis(4-metoksyfenylo)metyloamina n-5-dibenzosuberyloamina DBS n-trifenylometyloamina Tr n-[(4-metoksyfenylo)difenylometylo]amino MMTr n-9-fenylofluorenyloamina Pf n-ferrocenylometyloamina Fcm n-2-pikoliloamina, n'-tlenek n-1,1-dimetylotiometylenoamina n-benzylidenoamina n-p-metoksybenzylideneamine n-difenylometylenoamina n-(5,5-dimetylo-3-okso-1-cykloheksenylo)amina n-nitroamina n-nitrozoamina difenylofosfinamid Dpp dimetylotiofosfinamid Mpt difenylotiofosfinamid Ppt fosforamidat dibenzylu

2- nitrobenzenosulfenamid Nps n-1-(2-trifluoro-1,1-difenylo)etylosufenamid TDE

3- nitro-2-pirydynosulfenamid Npys p-toluenosulfonamid Ts benzenosulfonamid

Szczególne produkty ekteinascydynowe obejmują związki o wzorze (XVIII):

w którym R¹ i R⁴ tworzą grupę o wzorze (IV), (V), (VI) lub (VII):

PL 203 745 B1 bardziej korzystnie grupę (IV) lub (V);

R²¹ oznacza -H, -OH lub -CN, zwłaszcza -OH lub -CN;

oraz ich acylowe pochodne, zwłaszcza 5-acylo-pochodne obejmujące pochodne 5-acetylowe.

Ogólnie, konwersja wyjściowego 21-cyjanozwiązku do produktu ekteinascydynowego, na przykład o wzorze (XVIII), obejmuje:

a) przekształcenie jeśli konieczne układu chinonowego pierścienia E, w układ fenolowy;

b) przekształcenie jeśli konieczne układu chinonowego pierścienia A, w układ fenolowy;

c) przekształcenie układu fenolowego pierścienia A w pierścień metylenodioksyfenolowy;

d) utworzenie mostkowego układu spiro o wzorze (IV), (VI) lub (VII) między pozycją 1 i pozycją 4 w pierś cieniu B; oraz

e) przekształcenie w odpowiednią pochodną, np. poprzez acylowanie.

Etap (a), jeśli konieczny, konwersji układu chinonowego pierścienia E w układ fenolowy może być dokonany za pomocą tradycyjnych metod redukcji. Odpowiednim układem reakcyjnym jest wodór i katalizator -pallad na węglu, ale inne układy redukcyjne również mogą być wykorzystywane.

Etap (b), jeśli konieczny, konwersji układu chinonowego pierścienia A do układu fenolowego jest analogiczny do etapu (a) i nie wymaga dalszych szczegółów.

Etap (c) konwersji układu fenolowego pierścienia A do pierścienia metylenodioksyfenolowego może być dokonany kilkoma drogami, nieraz równolegle z etapem (b). Na przykład pierścień chinonowy A może być demetylowany na podstawniku metoksylowym w pozycji 7, zredukowany do dihydrochinonu i wychwycony odpowiednim reagentem elektrofilowym, takim jak CH2Br2, BrCH2CI lub podobnym dwufunkcyjnym reagentem dając wprost układ pierścieniowy metylenodioksy, lub reagentem dwufunkcyjnym takim jak tiokarbonylodiimidazol, który prowadzi do podstawionego układu pierścienia metylenodioksy, który może być przekształcony w żądany pierścień.

Etap (d) jest zwykle dokonywany poprzez właściwe podstawienie w pozycji 1 za pomocą reagenta mostkującego, który może wspomagać tworzenie oczekiwanego mostka, tworząc egzo/endo metylid chinonowy w pozycji 4 i umożliwiając reakcję metylidu z podstawnikiem 1, prowadząc do struktury zmostkowanej. Korzystnymi reagentami mostkującymi są te o wzorze (XIX)

4a 3 w którym Fu oznacza zabezpieczoną grupę funkcyjną, taką jak -NHProt^4a, Prot³ oznacza grupę zabezpieczającą a linia przerywana oznacza ewentualne wiązanie podwójne.

Stosownie metylid tworzy się poprzez uprzednie wprowadzenie grupy hydroksylowej w pozycji 10 na złączu pierścieni A i B dając strukturę według cząstkowego wzoru (XX):

lub bardziej korzystnie strukturę o wzorze cząstkowym (XXI):

PL 203 745 B1 w których R jest dobrane dla żądanych grup o wzorze (IV), (V), (VI) lub (VII). Dla pierwszych dwóch takich grup grupa R zwykle ma postać -CHFu-CH2-SProt³. Grupy zabezpieczające mogą być następnie usunięte i modyfikowane, dostarczając żądany związek.

Typowa procedura dla etapu (d) jest dostarczona w opisie patentowym USA 5.721.362, na który niniejszym powołujemy się. Szczególnie odnosimy się do ustępu w kolumnie 8, etap (1) oraz przykładu 33 opisu patentowego USA i związanych z nim ustępów.

Przekształcenie w pochodną w etapie (e) może obejmować acylowanie, na przykład grupą R^a-CO-, w którym R^a może oznaczać różne grupy, takie jak alkil, alkoksyl, alkilen, aryloalkil, aryloalkilen, acyl aminokwasowy lub rodnik heterocykliczny, każdy ewentualnie podstawiony przez halogen, cyjano, nitro, karboksyalkil, alkoksyl, aryl, aryloksyl, rodnik heterocykliczny, heterocykloksyl, alkil, grupę aminową lub podstawioną aminową Inne reagenty acylujące obejmują izotiocyjaniany, takie jak izotiocyjaniany arylowe, zwłaszcza izotiocyjanian fenylu. Grupy alkilowe, alkoksylowe lub alkilenowe z R^a odpowiednio mają 1 do 6 lub 12 atomów węgla i mogą być liniowe, rozgałęzione lub cykliczne. Grupami arylowymi są zwykle fenyl, bifenyl lub naftyl. Grupy heterocykliczne mogą być aromatyczne lub częściowo albo całkowicie nasycone i odpowiednio mają 4 do 8 atomów w pierścieniu, bardziej korzystnie 5 lub 6 atomów w pierścieniu, z jednym lub większą liczbą heteroatomów wybranych spośród azotu, siarki i tlenu.

Nie wyczerpując zakresu, typowe grupy R^a obejmują alkil, haloalkil, alkoksyalkil, haloalkoksyalkil, aryloalkilen, haloalkiloaryloalkilen, acyl, haloacyl, aryloalkil, alkenyl i aminokwas. Na przykład R^a-CO- może oznaczać acetyl, trifluoroacetyl, 2,2,2-trichloroetoksykarbonyl, izowalerylokarbonyl, trans-3-(trifluorometylo)cynamoilokarbonyl, heptafluorobutyrylokarbonyl, dekanoilokarbonyl, trans-cynamoilokarbonyl, butyrylokarbonyl, 3-chloropropionylokarbonyl, cynamoilokarbonyl, 4-metylocynamoilokarbonyl, hydrocynamoilokarbonyl lub trans-heksenoilokarbonyl, lub alanyl, arginyl, aspartyl, asparaginyl, cystyl, glutamyl, glutaminyl, glicyl, histydyl, hydroksyprolil, izoleucyl, leucyl, lizyl, metionyl, fenyloalanyl, prolil, seryl, treonyl, tyronyl, tryptofil, tyrozyl, walił, jak również inne mniej typowe aminokwasowe grupy acylowe, jak również ftalimidowe i inne cykliczne amidy. Inne przykłady można znaleźć wśród wymienionych grup zabezpieczających.

Związki, w których -CO-R^a pochodzi od aminokwasu i obejmuje grupę aminową mogą same tworzyć pochodne acylowe. Odpowiednie N-acylowe pochodne obejmują dipeptydy, które z kolei mogą tworzyć pochodne N-acylowe.

Tytułem ilustracji, możliwe jest obecnie przekształcenie cyjanosafracyny B, związku o wzorze 2, w ET-743, co prowadzi do krótszej i prostszej drogi wytwarzania ET-743, w porównaniu ze sposobami uprzednio ujawnionymi.

Analiza retrosyntetyczna wytwarzania ET-743 z użyciem związku 29 jest przedstawiona na schemacie.

PL 203 745 B1

Według powyższego schematu I, możliwe jest otrzymanie ET-743 w 21 sekwencyjnych etapach. Sposób ten przekształca cyjanosafracynę B w półprodukt 25 w sekwencji reakcji, które obejmują zasadniczo (1) usunięcie grupy metoksylowej umieszczonej w pierścieniu A, (2) redukcję pierścienia A i tworzenie grupy metylenodioksy w jednej operacji, (3) hydrolizę funkcji amidowej umieszczonej przy węglu 1, (4) przekształcenie uzyskanej grupy aminowej w grupę hydroksylową. Co więcej, sposób pozwala uniknąć zabezpieczania i odbezpieczania funkcji alkoholu pierwszorzędowego w pozycji 1 pierścienia B w związku 25, stosując wprost resztę cysteinową 29 z wytworzeniem półproduktu 27.

Pochodna cysteinowa 29 jest zabezpieczana na grupie aminowej grupą zabezpieczającą (β,β,β-trichloroetoksykarbonylową w tym celu, aby osiągnąć kompatybilność z obecnymi grupami: allilową i MOM. Półprodukt 27 wprost poddaje się utlenianiu i cyklizacji. Te warunki w połączeniu z odmienną strategią odbezpieczania w późniejszych etapach syntezy czynią tą drogę nową i bardziej możliwą do zastosowania przemysłowego niż sposób według opisu USA 5.721.362.

Przekształcenie 2-cyjanozwiązku w półprodukt 25 zwykle obejmuje następujące etapy (patrz schemat II):

tworzenie związku zabezpieczonego o wzorze 14 poprzez poddanie reakcji z bezwodnikiem tert-butoksykarbonylowym;

przekształcenie 14 w dwu-zabezpieczony związek o wzorze 15 poprzez poddanie reakcji z eterem bromometylometylowym i diizopropyloetyloaminą w acetonitrylu;

selektywną eliminację grupy metoksylowej układu chinonowego w 15 w celu otrzymania związku o wzorze 16 poprzez poddanie reakcji z metanolowym roztworem wodorotlenku sodu;

przekształcenie 16 w metylenodioksy-związek o wzorze 18 wykorzystując poniższą korzystną sekwencję: (1) grupę chinonową związku 16 poddaje się redukcji w atmosferze wodoru z 10% Pd/C; (2) półprodukt hydrochinonowy przekształca się w metylenodioksy-związek o wzorze 17 poprzez poddanie reakcji z bromochlorometanem i węglanem cezu w atmosferze wodoru; (3) 17 przekształca się w związek o wzorze 18 poprzez zabezpieczenie wolnej grupy hydroksylowej w postaci grupy OCH2R (reakcję tę prowadzi się z BrCH2R i węglanem cezu, przy czym R może oznaczać aryl, CH=CH2, OR' itd.);

eliminację grup zabezpieczających tert-butoksykarbonylowej i metoksymetylowej z 18 dostarczając związek o wzorze 19 poprzez poddanie reakcji z roztworem HCI w dioksanie; ta reakcja jest również realizowana poprzez zmieszanie 18 z roztworem kwasu trifluorooctowego w dichlorometanie;

tworzenie związku tiomocznikowego o wzorze 20 poddając reakcji 19 z izotiocyjanianem fenylu; przekształcenie związku o wzorze 20 w związek aminowy o wzorze 21 poprzez poddanie reakcji z roztworem chlorowodoru w dioksanie;

przekształcenie związku o wzorze 21 w pochodną N-Troc 22 poddając reakcji z chloromrówczanem trichloroetylu i pirydyną;

utworzenie zabezpieczonego hydroksyzwiązku o wzorze 23 poddając reakcji 22 z eterem bromometylometylowym i diizopropyloaminą;

przekształcenie związku o wzorze 23 w pochodną N-H 24 poddając reakcji z kwasem octowym i cynkiem;

przekształcenie związku o wzorze 24 w hydroksyzwiązek o wzorze 25 poddając reakcji z azotynem sodu w kwasie octowym.

Alternatywnie można zastosować czterotlenek azotu w mieszaninie kwasu octowego i acetonitrylu, a następnie poddając obróbce wodorotlenkiem sodu. Można również zastosować azotyn sodu w mieszaninie bezwodnika octowego-kwasu octowego, a następnie poddając obróbce wodorotlenkiem sodu.

PL 203 745 B1

Schemat II

OMe OMe

PL 203 745 B1

Konwersja półproduktu 25 do ET-743 z użyciem pochodnej cysteiny 29 zwykle obejmuje następujące etapy (patrz schemat III):

PL 203 745 B1

NHTroc

PL 203 745 B1

OHO

PL 203 745 B1 przekształcenie związku o wzorze 24 w pochodną 30 przez zabezpieczenie pierwszorzędowej funkcji hydroksylowej (S)-N-2,2,2-trichloroetoksykarbonylo-S-(9H-fluoren-9-ylometylo)cysteiną 29;

przekształcenie zabezpieczonego związku o wzorze 30 w pochodną fenolową o wzorze 31 przez rozszczepienie grupy allilowej wodorkiem tributylocynowym i dichlorobis(trifenylofosfino) palladem;

przekształcenie związku fenolowego o wzorze 31 w związek o wzorze 32 przez utlenianie bezwodnikiem benzenoseleninowym w niskiej temperaturze;

przekształcenie hydroksyzwiązku o wzorze 32 w lakton 33 według następującej sekwencji: (1) poddanie reakcji związku o wzorze 32 z 2 równoważnikami bezwodnika triflanowego i 5 równoważnikami DMSO, (2) a następnie przez poddanie reakcji z 8 równoważnikami diizopropyloaminy, (3) a następnie przez poddanie reakcji z 4 równoważnikami alkoholu t-butylowego, (4) a następnie przez poddanie reakcji z 7 równoważnikami 2-tert-butylo-1,1,3,3-tetrametyloguanidyny (5) a następnie przez poddanie reakcji z 10 równoważnikami bezwodnika octowego;

przekształcając związek laktonowy 33 w hydroksyzwiązek 34 poprzez usunięcie grupy zabezpieczającej MOM za pomocą TMSI;

rozszczepienie grupy N-trichloroetoksykarbonylowej w związku o wzorze 34 do związku 35 w reakcji z Zn/AcOH;

przekształcenie związku aminowego 35 w odpowiadający związek α-ketolaktonowy 36 poddając reakcji z chlorkiem karboaldehydu N-metylopirydyniowego, a następnie z DBU;

wytwarzanie ET-770 w reakcji związku o wzorze 36 z 3-hydroksy-4-metoksyfenyloetyloaminą; przekształcenie ET-770 w ET-743 w reakcji z azotanem srebra w mieszaninie AcN/H2O. Wytwarzanie półproduktu 11 i pokrewnych półproduktów

Analiza retrosyntetyczna jest przedstawiona według poniższej sekwencji.

Kluczowa klasa półproduktów obejmuje produkt 11 i jest przedstawiona ogólnym wzorem (XXI)

w którym Prot¹ i Prot² oznaczają grupy zabezpieczające hydroksyl, korzystnie różne. Dla samego półproduktu 11, Prot¹ oznacza grupę metoksymetylową, a Prot² oznacza grupę t-butylodifenylosililową.

Konwersja 21-cyjanozwiązku do półproduktu 11 lub półproduktu pokrewnego o wzorze (XXI) zwykle obejmuje następujące etapy:

a) konwersję, jeśli konieczne, układu chinonowego pierścienia E w układ fenolowy;

b) utworzenie grupy -OProt¹ w pozycji 18 pierścienia E;

c) utworzenie grupy -OCH2-OProt² w pozycji 1 pierścienia B; oraz

d) konwersję, jeśli konieczne, układu chinonowego pierścienia A w układ fenolowy;

e) konwersję układu fenolowego pierścienia A do pierścienia metylenodioksyfenolowego.

Etap (b), tworzenie grupy -OProt¹ w pozycji 18 pierścienia E jest typową reakcją zabezpieczania grupy fenolowej i nie wymaga specjalnego omówienia. Właściwe warunki są dobierane w zależności od rodzaju grupy zabezpieczającej. Pozostałe etapy są podobne jak w innych reakcjach.

Etap (b), tworzenie grupy -CH2-OProt² w pozycji 1 pierścienia B jest normalnie przeprowadzany poprzez utworzenie grupy -CH2NH2 w pozycji 1, a następnie przekształcenie funkcji aminowej

PL 203 745 B1 w funkcję hydroksylową i zabezpieczenie. Zatem, jeśli materiał wyjściowy zawiera grupę R¹, którą jest -CH₂-NH-CO-CR^25aR^25bR^25c, to wymagane jest usunięcie grupy N-acylowej. Jeśli materiał wyjściowy zawiera grupę R¹, którą jest -CH2-O-CO-R, to modyfikacje nie są potrzebne w przypadku produktu ekteinascydynowego, w którym podstawnik R¹ jest taki sam. W przypadku innych produktów, wymagane jest usunięcie grupy O-acylowej. Rozmaite procedury są dostępne dla takich deacylowań. W jednej odmianie, deacylowanie i konwersja do funkcji hydroksylowej są przeprowadzane w jednym etapie. Następnie, grupa hydroksylowa może być acylowana lub inaczej przekształcona, dostarczając odpowiednią grupę R¹.

Opis patentowy USA. nr 5.721.362 ujawnia sposoby syntetycznego wytwarzania ET-743 na drodze wieloetapowej syntezy. Jednym z półproduktów w tej syntezie jest półprodukt 11. Stosując cyjanosafracynę B jako materiał wyjściowy możliwe jest uzyskanie półproduktu 11, co zapewnia znacznie krótszą drogę do wytworzenia takiego półproduktu, a zatem i udoskonalenie sposobu wytwarzania ET-743.

Cyjanosafracyna B może być przekształcona do półproduktu 25 sposobami ujawnionymi powyżej. Możliwe jest uzyskanie z półproduktu 25 półproduktu 11 z wykorzystaniem poniższych etapów, patrz schemat VII:

utworzenie zabezpieczonego hydroksyzwiązku o wzorze 26 poddając reakcji 25 z chlorkiem tert-butylodifenylosililu w obecności zasady;

finalne rozszczepienie grupy allilowej wodorkiem tributylocyny i dichloro-bis(trifenylofosfino)palladem w 26, co prowadzi do utworzenia półproduktu 11.

PL 203 745 B1

Jedną z praktycznych realizacji syntetycznego sposobu przekształcania safracyny B do półproduktu 11 jest modyfikacja i ciąg dalszy schematu VIII, co obejmuje następujące etapy:

stereospecyficzne przekształcenie związku, safracyny B, do związku o wzorze 2 poprzez selektywne zastąpienie OH przez CN w reakcji z KCN w środowisku kwaśnym;

utworzenie związku tiomocznikowego o wzorze 3 poddając reakcji związek o wzorze 2 z izotiocyjanianem fenylu;

konwersję związku tiomocznikowego o wzorze 3 w acetamid o wzorze 5 drogą hydrolizy w środowisku kwaśnym, a następnie dodając bezwodnik octowy; pośredni związek aminowy o wzorze 4 może być wydzielony po zakończeniu hydrolizy w środowisku kwaśnym poprzez dodanie kwaśnego węglanu sodu, ale ten półprodukt jest wysoce nietrwały i jest szybko przekształcany w pięcioczłonową iminę cykliczną, konkretnie związek 6;

utworzenie zabezpieczonego związku o wzorze 7 poddając reakcji z eterem bromometylometylowym i diizopropyloetyloaminą w dichlorometanie;

selektywne demetylowanie grupy metoksylowej układu chinonowego w związku o wzorze 7 do związku o wzorze 8 drogą reakcji z metanolowym roztworem wodorotlenku sodu;

przekształcenie związku o wzorze 8 w metylenodioksy-związek o wzorze 9 w następującej korzystnej sekwencji: (1) redukcję grupy chinonowej związku 8 w atmosferze wodoru z 10% Pd/C; (2) przekształcenie pośredniego hydrochinonu w metylenodioksy-związek o wzorze 9 poddające reakcji z bromochlorometanem i węglanem cezu w atmosferze wodoru; (3) przekształcenie związku o wzorze 9 do związku po wzorze 10 poprzez zabezpieczenie wolnej grupy hydroksylowej w postaci grupy OCH2R, w reakcji z BrCH2R i węglanem cezu, przy czym R może oznaczać aryl, CH=CH2, OR' itd.;

przekształcenie grupy acetamidowej związku o wzorze 10 w odpowiednią grupę hydroksylową o wzorze 25 poddając reakcji z cztero-tlenkiem azotu w mieszaninie kwasu octowego i octanu, a następnie działając wodorotlenkiem sodu; alternatywnie może być zastosowany azotyn sodu w mieszaninie bezwodnika octowego i kwasu octowego, a następnie wodorotlenek sodu; alternatywnie grupa acetamidowa związku o wzorze 10 może być przekształcona w pierwszorzędową grupę aminową poprzez poddanie reakcji z hydrazyną lub z Boc2O, DMAP a następnie z hydrazyną; taka pierwszorzędową amina może być przekształcona w odpowiednią grupę hydroksylową (związek o wzorze 25) poprzez oksydatywną konwersję aminy pierwszorzędowej do odpowiedniego aldehydu za pomocą benzenosulfonianu 4-formylo-1-metylopirydyniowego lub innego jonu pirydyniowego, a następnie działaniem DBU lub innej zasady i dalszą hydrolizę, a następnie redukcję aldehydu do odpowiedniej grupy hydroksylowej glinowodorkiem litu lub innym reagentem redukującym;

tworzenie zabezpieczonego związku o wzorze 26 poprzez poddanie reakcji z chlorkiem t-butylodifenylosililowym i dimetyloaminopirydyną w dichlorometanie (schemat VII);

przekształcenie związku sililowanego o wzorze 26 w półprodukt 11 przez odbezpieczenie grupy zabezpieczającej OCH2R, poprzez poddanie reakcji w warunkach redukcyjnych lub kwaśnych. Typowymi sposobami są czerń palladowa w atmosferze wodoru, wodny TFA lub wodorek tributylocyny i dichloro-bis(trifenylofosfino)pallad.

PL 203 745 B1

Schemat VIII

PL 203 745 B1

W jeszcze innej korzystnej modyfikacji, cyjanozwiązek o wzorze 2 może być przekształcony w półprodukt 11 według dalszego ciągu schematu II, obejmującego następujące etapy:

utworzenie zabezpieczonego hydroksyzwiązku o wzorze 26 w reakcji 25 z chlorkiem tertbutylodifenylosililu w obecności zasady;

finalne rozszczepienie grupy allilowej wodorkiem tributylocyny i dichloro-bis(trifenylofosfino)palladem w 26, które prowadzi do utworzenia półproduktu 11.

A zatem, tą i innymi drogami możliwe jest przekształcenie cyjanosafracyny B w liczne półprodukty i pochodne o potencjalnej terapeutycznej czynności przeciwnowotworowej. Te półprodukty mogą być wytworzone wychodząc ze związków już ujawnionych, lub z zastosowaniem alternatywnych dróg.

W procesie wytwarzana związków ekteinascydynoweych mogą być stosowane związki pośrednie o wzorze (XXIla):

albo o wzorze (XXIIb)

w których ₁

R¹ oznacza -CH2NH2 lub -CH2OH, lub zabezpieczoną lub przekształconą w pochodną postać takiej grupy, a R⁴ oznacza -H; lub

R^1a i R⁴ łącznie tworzą grupę o wzorze (IV), (V), (VI) lub (VII):

PL 203 745 B1

R^14a i R^14b, oba oznaczają -H lub jeden oznacza -H, a pozostały oznacza -OH lub zabezpieczoną lub przekształconą w pochodną postać takiej grupy, -OCH3 lub -OCH2CH3, lub R^14a i R^14b łącznie tworzą grupę ketonową;

R¹² oznacza H-, CH3- lub -CH2CH3-;

R¹⁵ oznacza -H, -OH lub zabezpieczoną lub przekształconą w pochodną postać takiej grupy; oraz

R¹⁸ oznacza -OH lub zabezpieczoną lub przekształconą w pochodną postać takiej grupy.

W jednej praktycznej realizacji, korzystnie co najmniej R¹, R⁵, R^14a, R^14b, R¹⁵ lub R¹⁸ oznaczają zabezpieczoną lub przekształconą w pochodną postać grupy.

W jednej z odmian praktycznj realizacji grupa R¹ nie oznacza podstawnika t-butylodifenylosili lowego i/lub grupa R¹⁸ nie oznacza grupy metoksymetylowej.

Korzystnie R¹ oznacza -CH2NH2 lub -CH2OH, lub zabezpieczoną lub przekształconą w pochodną postać takiej grupy, a R⁴ oznacza -H; lub

Korzystnie oba: R^14a i R^14b oznaczają -H.

Jedna z korzystnych klas półproduktów obejmuje związek, który oznaczamy jako związek 25, o wzorze:

Korzystna klasa ma zatem wzór ogólny, w którym grupa MOM jest zastępowana przez jakąkolwiek inną grupę zabezpieczającą.

Inne korzystne półprodukty stanowią związki, które oznaczamy jako związki 45 i 47 (schemat IX).

PL 203 745 B1

Schemat IX

Inne pochodne N-acylowe łatwo mogą być wytworzone ze związku 45. Odpowiednie grupy acylowe obejmują te uprzednio wymienione. Odpowiednie związki 21-hydroksylowe są również użyteczne.

Stwierdzono, że związki pośrednie według wynalazku o wzorach 35 i 36, stosowane w procesie wytwarzania związków ekteinascydynowych, wykazują aktywność w leczeniu raków, takich jak leukemie, rak płuc, rak okrężnicy, rak nerek i czerniak. A zatem, związki te mogą być stosowane do lecze42

PL 203 745 B1 nia dowolnego ssaka, zwłaszcza człowieka, dotkniętego rakiem, poprzez podawanie choremu osobnikowi terapeutycznie skutecznej ilości związku lub kompozycji farmaceutycznej tego związku.

Przykłady kompozycji farmaceutycznych obejmują jakiekolwiek stałe (tabletki, pigułki, kapsułki, granulaty, itd.) lub ciekłe (roztwory, zawiesiny lub emulsje) z odpowiednimi kompozycjami do podawania doustnego, miejscowego lub pozajelitowego, i mogą one zawierać czysty związek lub w połączeniu z jakimkolwiek nośnikiem lub innymi farmakologicznie aktywnymi związkami. Kompozycje te winny być wyjaławiane, jeśli mają być podawane pozajelitowo.

Podawanie związków lub kompozycji może następować dowolnym sposobem, takim jak infuzja dożylna, w preparacie doustnym, poprzez podawanie dootrzewnowe i dożylne. Korzystnie są stosowane infuzje trwające do 24 godzin, bardziej korzystnie 2-12 godzin, przy czym 2-6 godzinne są najbardziej korzystne. Krótkotrwałe infuzje, które umożliwiają prowadzenie leczenia bez całodobowej hospitalizacji są szczególnie korzystne. Jednakże, infuzje mogą być 12 do 24 godzinne lub nawet dłuższe, jeśli konieczne. Infuzja może być przeprowadzana w odpowiednich odstępach, powiedzmy 2 do 4 tygodniowych. Kompozycje farmaceutyczne mogą być dostarczane w liposomach lub kapsułkach nanosferowych, w preparatach o przedłużonym uwalnianiu, lub innymi standardowymi środkami dostarczania.

Właściwe dostarczanie związków może być zróżnicowane zależnie od danego preparatu, sposobu podawania i szczególnego miejsca (situs), pacjenta oraz nowotworu poddawanego leczeniu. Również pod uwagę winny być wzięte inne czynniki, takie jak wiek, waga ciała, płeć, sposób odżywiania, czas podawania, szybkość wydalania, stan pacjenta, zestawienia lekowe, czułość reakcji i powaga choroby. Podawanie może być przeprowadzane w sposób ciągły lub okresowo, w obrębie maksymalnej dopuszczalnej dawki.

Związki i kompozycje mogą być stosowane z innymi lekami zapewniając terapię skojarzoną. Inne leki mogą stanowić część tej samej kompozycji lub być dostarczone w odrębnej kompozycji do podawania w tym samym czasie lub w innym czasie. Rodzaj tego innego leku nie szczególnie ograniczony, a odpowiednimi kandydatami są:

a) leki o działaniu antymitotycznym, zwłaszcza te, które są adresowane do elementów cytoszkieletowych, a tym modulatorów mikrotubuli, takie jak leki taksanowe (takie jak taksol, paklitaksel, taksoter, docetaksel), podofilotoksyny lub alkaloidy barwinka (winkrystyna, winblastyna);

b) leki antymetabolitowe, takie jak 5-fluorouracyl, cytarabina, gemcytabina, analogi purynowe (takie jak pentostatyna, metotreksat);

c) środki alkilujące, takie jak iperyty azotowe (takie jak cyklofosfamid lub ifosfamid);

d) leki adresowane do DNA, takie jak leki antracyklinowe, adriamycyna, doksorubicyna, farmorubicyna lub epirubicyna;

e) leki adresowane do topoizomeraz, takie jak etopozyd;

f) hormony oraz agoniści i antagoniści hormonów, takie jak estrogeny, antyestrogeny (tamoksyfen i związki pokrewne) oraz androgeny, flutamid, leuprorelina, goserelina, cyprotron lub oktreotyd;

g) leki, które są adresowane do transdukcji sygnałowej komórek nowotworowych, a w tym, pochodne przeciwciał, takie jak herceptyna;

h) środki alkilujące, takie jak leki platyny (cis-platyna, karboplatyna, oksaliplatyna, paraplatyna) lub nitrozomoczniki;

i) leki potencjalnie oddziaływujące na przerzuty nowotworowe, takie jak inhibitory metaloproteaz substancji międzykomórkowej;

j) środki terapii genowej i antysensownej; k) terapeutyki z przeciwciałami;

I) inne związki bioaktywne pochodzenia morskiego, zwłaszcza didemniny, takie jak aplidyna;

m) analogi steroidowe, zwłaszcza deksametazon;

n) leki przeciwzapalne, zwłaszcza deksametazon; oraz

o) środki przeciwwymiotne, zwłaszcza deksametazon.

Działanie cytotoksyczne

Hodowle komórkowe. Komórki utrzymywano w logarytmicznej fazie wzrostowej w minimalnym podstawowym środowisku Eagle zrównoważonym solami według Eagle z 2,0 mM L-glutaminy, z endogennymi aminokwasami bez kwaśnego węglanu sodu (EMEM/neaa); uzupełnionym 10% płodową surowicą cielęcą (FCS), 10^-2 M kwaśnego węglanu sodu i 0,1 g/l penicyliny G + siarczanem streptomycyny.

Przeprowadzono prostą procedurę skriningową w celu określenia i porównania aktywności przeciwnowotworowej tych związków, stosując adaptowaną postać metody ujawnionej przez Bergeron, et al., (1984). Wykorzystywano nowotworową linię komórkową P-388 (hodowla zawiesiny nowotworu limfatycznego z myszy DBA/2), A-549 (hodowla mono-warstwowa ludzkiego raka płuc), HT-29 (hodowla monowarstwowa ludzkiego raka okrężnicy) i MEL-28 (hodowla monowarstwowa ludzkiego czerniaka).

PL 203 745 B1

Komórki P-388 posiano w 16 mm studzienkach po 1 x 10⁴ komórek na studzienkę w 1 ml porcjach MEM 5FCS zawierających wskazane stężenie leku. Oddzielny zestaw hodowli bez leku posiano jako próbę kontrolną, aby upewnić się, że komórki pozostają w logarytmicznej fazie wzrostowej. Wszystkie analizy wykonywano dwukrotnie. Po trzech dniach inkubowania w 37°C, 10% CO2 w atmosferze o wilgotności 98%, określono przeciętną IC50 poprzez porównanie wzrostu w studzienkach z lekiem, ze wzrostem w studzienkach kontrolnych.

A-549, HT-29 i MEL-28 posiano w 16 mm studzienkach po 2 x 10⁴ komórek na studzienkę w 1 ml porcjach MEM 5FCS zawierających wskazane stężenie leku. Oddzielny zestaw hodowli bez leku posiano jako próbę kontrolną, aby upewnić się, że komórki pozostają w logarytmicznej fazie wzrostowej. Wszystkie analizy wykonywano dwukrotnie. Po trzech dniach inkubowania w 37°C, 10% CO2 w atmosferze o wilgotności 98%, studzienki wybarwiono 0,1% fioletem krystalicznym. Określono przeciętną IC50 poprzez porównanie wzrostu w studzienkach z lekiem, ze wzrostem w studzienkach kontrolnych.

1. Raymond J. Bergeron, Paul F. Cavanaugh, Jr., Steven J. Kline, Robert G. Hughes, Jr., Gary T. Elliot i Carl W. Porter. Antineoplastic and antiherpetic activity of spermidine catecholamide iron chelators. Biochem. Bioph. Res. Comm., 1984, 121 (3), 848-854.

2. Alan C. Schroeder, Robert G. Hughes, Jr. i Alexander Bloch. Effects of Acyclic Pyrimidine Nucleoside Analoges. J. Med. Chem., 1981, 24, 1078-1083.

Czynność cytotoksyczna

Związek	IC50 (μΜ)
	P-388	A-549	HT-29	MEL-28	CV-1	DU-145
0M« o VjfM* o Γ CN •Ά 2	0,009	0,018	0,018	0,018	0,023
	OM· ΗΟ-Χ,Κι ° XjT
M«v Μ·ΟΧ	bTtw^· '\AV N'·/^ A 14	0,15	>0,15	0,15	>0,15
**·ν MeO”’	1 OM· M. 0 J 4 *SwJ<_xN,lwZJ^ ° \h£n V°-l· A 15	1,44	1,44	1,44	1,44
	I OM· Ο^Ο^Χ.Μ» O Ji Ϊ
Μ«χ HOZ	0 T 16	>1,5	>1,5	>1,5	>1,5

PL 203 745 B1

j OUc OH TT M* yo L· '17	1,4	1,4	1,4	1,4
i 9*^ Μβ O v CN o / r >o-(A*1* \ ' 18	0,01	0,01	0,01	0,01
«%» ?“* ( HO^k,Mr 0λ-° %„« Λ' 19	0,08	0,16	0,01	0,16
\ A“ ° NK^ •iiT^NHCSNHPh \ 20	0,01	0,01	0,01	0,01
?M* U m*. Υτι ti'*** ThI 21	0,019	0,019	0,019	0,019
\o «°-Α^“* °u° (Ao-0^ 22	0,014	0,014	0,014	0,014	0,014	0,014
s ?** ✓ Ο^Ο'γΛγ Μ· ><Γ^Γ η ίΓ ϊϋ(ΙΜβ °V° U Aw* 23	0,13	0,13	0,13	0,13	0,13	0,13
%> ?“· XZC i^jj·1*· °v° M 24	0,18	1,8	1,8	1,8	1,8	1,8
% i ?** Sj °v°V!X“· v° M 25	0,2	0,2	0,2	0,2		0,2

PL 203 745 B1

HjW 1 OM· s JT i ΜκΑΟ·Λ 1 łki N J- Mł °Cj ś, 35	0,008	0,008	0,008	0,008
o « OM* °®y *z/t ho^JL^m· A^O \ s JT T M · ^_xLA-Λ ixi Nd“M* \~o Tm 36	0,01	0,01	0,01	0,01
OM* MOS^S*>“· ort T i Mc -xL_ jTjT T^ O J ĆN K w 28	0,001	0,001	0,001	0,001	0,001	0,001
1 Ϋ*4· 7X0^ yn<m- Λ 42	0,13	0,13	0,13	0,13		0,13
OM* HO^jjL^M· om JT JJ o v Sn NM Λ·' 43	0,008	0,016	0,008	0,008		0,016
OM· OAc J2 J Mt_ As. XZL ’j?'Me i— O V. ĆN NH ^<sL^NHCSNM«i ' 44	0,001	0,001	0,001	0,001		0,001
OM· HOk^L .,Μ» OAe jT J m·* Y η y nJ-m· 45	0,01	0,01	0,01	0,01		0,01
OM· HO-^L^M· ΊΓιΓ/*>Ύ*’Ώ“ **· O Γ ĆN nh PhHNSCHN.^L 1 3	0,015	0,015	0,015	0,015	0,018

PL 203 745 B1

OMe **ΥτΓΥι£ΐ”“* CN	6	2,171	2,171	2,171	2,171	2,171
OMe MLI Mł ΜβΟ'^Υ^ΊΤ'	0,005	0,005	0,005	0,005
0 WN <A	5
) OMe °^OyL·	Me
Me.JL^s. YTYy* μ*°**ιΓίΓ n °		0,22	0,22	0,22	0,22	0,22
	7
| OMe O^O^^<.Me o TM
Mł ΥιΓ^'Ύ^^ hoVyT		>9	>18,1	>18,1	>18,1	>18,1
<A	8
| OMe Οχζ^Χ'*** OH JM
MeT w ίΓ njJ·**· A^k Jr o L CN NH cA	9	>1,77	>1,77	>1,77	>1,77		>1,77
i 9“· °χ^°>^ΛγΜ·
Me^ A >*. θ'-0 A* cA	10	>1,65	>1,65	>1,65	>1,65		>1,65
| OM· θνΟχ_ίΑ-χ** om Th	i
''«A* 0^	46	0,016	0,016	0,016	0,016		0,016
OMe Η^Α,Μ OM JG J ΊΐΥ'^Ι n^p Me ''—O V tw MH (A-	47	0,001	0,001	0,001	0,001		0,001
OM· ΗΟ.Τ,Ι* OM T j o V. £w ^NM , Αλ	1 48	0,0008	0,001	0,0008	0,0008		0,001

PL 203 745 B1

OMe ΗΟ,Χ,Μβ OAc ΊΓ ¥ '—O \ CN NH Λ O^jCMał,	0,007	0,007	0,007	0,007		0,007
OMe ΗοΑκ,Μί OAc jT Jj 'YWy* Οχ-° “^α·50	0,0001	0,0001	0,0001	0,0001		0,0001
OMe HO^l Me OAC j2 ¥ YYt W7Me A-M^ ^o ĆN NH cAf** r i -o--51	0,0001	0,0001	0,0001	0,0001		0,0001
OMe HO^J^Mb OAc T j Me. ΥΎτ NjMt oąjLV> \—O ĆN NH οΛ^Μ« “•^“sa	0,001	0,001	0,001	0,001		0,001
ou$ ho^-L^mb OAC JL ¥ Me riii n7m« Ay/ O K. ĆN NH ‘ΎΥ\, Me 0 53	0,0001	0,0001	0,0001	0,0001		0,0001
% °Me 1. HO-s^s^Me Me υιϊ'γ n-~mb *-Ό Λ. CN οΛ1,ΝΗγΟΡ3 Me ° 54	0,001	0,001	0,001	0,001		0,001
OMe HO^AsyMe OM J ¥ rYr^ N-^Me AV> ^-O V ĆN NH οΑ^ΝΗ,γΛ^ Me 0 55	0,01	0,01	0,01	0,01		0,01

PL 203 745 B1

OM· on jT j °^° ^nhSn /· 56	0,18	0,9	0,18	0,8		0,9
OM· HO-J--.M· °M J^ J Μβ'ΊΓ^Γ*,ντζ^^*“β sjAs^NHCSNKPft ' 57	0,14	0,14	0,14	0,14		0,14
OM· HOsJ. Me OAC ΊΠ J Me. A. χΧΓ’Ιϊ*”* o L 6n MH ^L^NHCSNPh \ - 58	0,001	0,001	0,001	0,001		0,001
OMe HO^Js^Me OAC X J Me oĄ\iY/ ° \ ĆN ^ίχ. Mc O « 60	0,001	0,001	0,0005	0,001		0,0005
OMe ΗΟ^Χτ**· OAC X J Me^JL^^-^ΊΓ ^-o \ ĆN NM 61	0,001	0,001	0,001	0,001		0,001
OMe HO^J^M· OAC X Jj Me Y^Sr^v^5*** O Γ I = ^O \ ĆN ?Π H ____. oA*N-r— «. ’ 62	0,001	0,001	0,0005	0,0005		0,001
OMe HOs^L^M· OAC X Jj ‘U | Bn λο63	r\ r\r\r\4 υ,υυυ I	r\ r\r\r\ a υ,υυυ i	r\ r\r\r\ a υ,υυυ I	r\ r\r\r\ a υ,υυυ I		Λ r\ r\ Λ A υ,υυυ I
OMe HO^X_Ue OAC X 11 Me Γ ιΓτΝ.Μί ο-Μγν^ '-O ĆN nh „ oVv—“ L £ 64	0,001	0,001	0,001	0,001		0,001

PL 203 745 B1

OMe OAc T J Tjt ϊ>“' '(-Ο ( ĆN NH - 65	0,0001	0,0005	0,0001	0,0001		0,0005
OMe ΗζλΧ,Μβ OAc 1ζ T ΧΧΖϊΟ* C ^uO-„ o 06	0,0001	0,0001	0,0001	0,0001		0,0001
OM· OAC TT V-0 V ÓH NH Z/Y Me 0 O/	0,0001	0,0001	0,0001	0,0001		0,0001
OMe MOMO^J^Me OAflyl Y J *γνγφ» θ'ΤϊχΝ*^^ \-O CN /=^ Vs->AJ NHBoc 142		>1	>1
OMe MOMOsJ^-Me O OH T 3 ζχΧο^· '—O \ ĆN v^^vy/ NHBoc A%/ O 144		>1	>1
OMe HOsJ^Me OARyl TjJ rn> 0 \ CN OH •ł Λ Χ-+Ο	0,19	0,19	0,19	0,19
OMe HO^Us^Me OAByl T T MerYvV“ A-O ( ĆN ν^-Ύν NHBOC A*/ O 147		0,0055	0,0055

PL 203 745 B1

PL 203 745 B1

OMe MEMOsJ^Me OAIIyl T jf ĄAtsT '-O CN z=rv ΟΎ^ε-^τΛ_/ NKCbz yke/' O 154		>1	>1
MEMO^J^Mb O OH TJ M e Ti· 2>Me \-O \ ĆN y=< oY'-s'~'1-4? NHCta 156		>1	>1
^.OMe CbzHN O \ \ OMe θ=Τ 'i Me AcO\ s TT Τ&Τ· V-0 CN 157		0,59	0,59
CtaH,N OMe O==Zi HO-J\-Me Aco\ ) Tj '—o 6n 158		0,0013	0,0013
NHAIIOC „. jz OMe oT'j ΗΟ,Τ,Μθ α=ο\ 's TT ti· 9 / = '—O CN 164		0,00015	0,00015
OMe OAJtf JT jf *γτΥ5“· I-o \ CN OTBOMS 165		>1	>1

PL 203 745 B1

OMe OAOy» jT Jj Γ II N—Me «Mr*/ ^-0 \ CN OTBOMS 166		>1	>1
OMe MEM0^xk,Me on 77 jj ^yVy>«' <rvr OTBOMS 167		_ Jt > I	>1
OMe MEMO^jk.Me « OK _jk J η ΤΓ n-tm* JA-sx ^0 \ CN OTBOMS 168		>1	>1
OMe ΜΕΜΟςΑ^Μβ H OH jL J mz ^0 ξ CN OH 169		>1	>1
OMe MEMO^Js. Me O OH JJ J Μί.ΑΙ/κχ<Τ ovx> '-O \ ĆH _ °^ε-γθ NHAftoc 170		>1	>1
^.OMe AtlocHN Q Ί Λ omb Ac9' ,s Y T Μΐ^ίΑΧχγ '—O ĆN 171		0,012	0,012
OMe ΜΟΜΟ^,^Α^Μ· O OH T J ij ^T N— Me ^-° ‘ CH ‘Υ^-'νΟ NHCbz )*s*( O 172		>1	>1
MeO CbiHN / j, ς OMe 0«X 'i O^-k^Me aco\ > ΙΪ Me xxLSyCx<l<. T. Tj_Me '-O ĆN 173		0,062	0,062

PL 203 745 B1

Związki pośrednie, które wykazują aktywność w leczeniu raka zawierają grupę 10-hydroksylową i grupę 1-labilną.

Proces wytwarzania związków ekteinascydynowych obejmuje reakcję:

przy czym R¹ w powyższych związkach oznacza aminometylen.

Inny proces wytwarzania związków ekteinascydynowych obejmuje reakcję:

₁ przy czym R¹ w powyższych związkach oznacza aminometylen.

Ponadto, proces wytwarzania związków ekteinascydynowych obejmuje reakcję, w której grupa ₁

R¹ oznaczająca aminometylen jest przekształcana w grupę hydroksymetylenową.

Inny proces wytwarzania związków ekteinascydynowych obejmuje reakcję, w której związek z grupą oznaczają c ą hydroksymetylen jest poddawany reakcji z reagentem o wzorze (XIX)

₃ w którym Fu oznacza zabezpieczoną grupę funkcyjną, Prot³ oznacza grupę zabezpieczającą, a linia przerywana oznacza ewentualne wiązanie podwójne.

Inny proces wytwarzania związków ekteinascydynowych obejmuje reakcję otrzymywania związ-

w którym R¹, R⁵, R⁸, R^14a, R^14b, R¹⁵ i R¹⁸ mają zdefiniowane znaczenie i R²¹ oznacza grupę hydroksylową, ze źródłem jonu cyjankowego, dostarczając żądany związek 21-cyjanowy.

Ponadto, uwzględniane są sposoby z użyciem innych związków zawierających centra nukleofilowe z wytworzeniem podobnych związków o wzorze (XVI), w których pozycja 21 jest zabezpieczona przez inną grupę nukleofilową 21-Nuc. Na przykład związek 21-Nuc o wzorze (XVI) z podstawnikiem alkiloaminowym w pozycji 21 może być wytworzony poprzez poddanie reakcji związku o wzorze (XV), w którym R²¹ oznacza grupę hydroksylową, z odpowiednią alkiloaminą. Związek 21-Nuc o wzorze (XVI) z podstawnikiem alkilotio w pozycji 21 może być również wytworzony w reakcji zwią zku o wzorze (XV), w którym R²¹ oznacza grupę hydroksylową, z odpowiednim alkanotiolem. Alternatywnie, związek 21Nuc o wzorze (XVI) z podstawnikiem α-karbonyloalkilowym w pozycji 21 może być wytworzony w reakcji związku o wzorze (XV), w którym R²¹ oznacza hydroksyl, z odpowiednim związkiem karbonylowym, zwykle w obecności zasady. Inne drogi syntetyczne są możliwe dla innych związków 21-Nuc.

PL 203 745 B1

Inny proces wytwarzania związków ekteinascydynowych obejmuje przeróbkę produktu 21-cyjankowego według wynalazku z utworzeniem związku 21-hydroksylowego. Związki takie mają interesujące właściwości in vivo.

P r z y k ł a d y

Niniejszy wynalazek jest zilustrowany poniższymi przykładami.

P r z y k ł a d 1

Do roztworu 2 (21,53 g, 39,17 mmol) w etanolu (200 ml) dodano bezwodnik tert-butoksykarbonylowy (7,7 g, 35,25 mmol) i mieszaninę mieszano przez 7 godz. w 23°C. Następnie, reakcję zatężono w próżni, a pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, heksan: octan etylu = 6:4) i otrzymano 14 (20,6 g, 81%) w postaci żółtego ciała stałego.

Rf: 0,52 (octan etylu:CHCl 5:2).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 6,49(s, 1H), 6,32(bs, 1H), 5,26(bs, 1H), 4,60(bs, 1H), 4,14(d, J=2,4 Hz, 1H), 4,05(d, J=2,4 Hz, 1H), 3,94(s, 3H), 3,81(d, J=4,8 Hz, 1H), 3,7(s, 3H), 3,34(br d, J=7,2 Hz,

1H), 3,18-3,00(m, 5H), 2,44(d, J=18,3 Hz, 1H), 2,29(s, 3H), 2,24(s, 3H), 1,82(s, 3H), 1,80-1,65(m, 1H),

1,48(s, 9H), 0,86(d, J= 5,7 Hz, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 185,5, 180,8, 172,7, 155,9, 154,5, 147,3, 143,3, 141,5, 135,3, 130,4, 129,2, 127,5, 120,2, 117,4, 116,9, 80,2, 60,7, 60,3, 58,5, 55,9, 55,8, 54,9, 54,4, 50,0, 41,6,

40,3, 28,0, 25,3, 24,0, 18,1, 15,6, 8,5.

ESI-MS m/z: obliczono dla C34H43N5O8: 649,7, znaleziono (M+H)⁺:650,3.

P r z y k ł a d 2

Do mieszanego roztworu 14 (20,6 g, 31,75 mmol) w CH3CN (159 ml) dodano w 0°C diizopropyloaminę (82,96 ml, 476,2 mmol) i bromek metoksymetylenu (25,9 ml, 317,5 mmol) oraz dimetyloaminopirydynę (155 mg, 1,27 mmol). Mieszaninę mieszano w 23°C przez 24 godz. Reakcję potraktowano w 0°C wodnym 0,1N HCI (750 ml) (pH=5) i ekstrahowano CH2CI2 (2 x 400 ml). Warstwę organiczną wysuszono (siarczan sodu) i zatężono w próżni. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, gradient mieszaniny heksan: octan etylu = 4:1 do heksan: octan etylu = 3:2) i otrzymano 15 (17,6 g, 83%) w postaci żółtego ciała stałego.

Rf: 0,38 (heksan:octan etylu 3:7).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 6,73(s, 1H), 5,35(bs, 1H), 5,13(s, 2H), 4,50(bs, 1H), 4,25(d, J=2,7 Hz, 1H), 4,03(d, J=2,7 Hz, 1H), 3,97(s, 3H), 3,84(bs, 1H), 3,82-3,65(m, 1H), 3,69(s, 3H), 3,56(s, 3H),

PL 203 745 B1

3,39-3,37(m, 1H), 3,20-3,00(m, 5H), 2,46(d, J=18 Hz, 1H), 2,33(s, 3H), 2,23(s, 3H), 1,85(s, 3H), 1,73-1,63(m, 1H), 1,29(s, 9H), 0,93(d, J=5,1 Hz, 3H).

¹³C NMR(75 MHz, CDCI3): δ 185,4, 180,9, 172,4, 155,9, 154,5, 149,0, 148,4, 141,6, 135,1, 131,0, 129,9, 127,6, 124,4, 123,7, 117,3, 99,1, 79,3, 60,7, 59,7, 58,4, 57,5, 56,2, 55,9, 55,0, 54,2, 50,0, 41,5, 39,9, 28,0, 25,2, 24,0, 18,1, 15,6, 8,5.

ESI-MS m/z: obliczono dla C36H47N5O9: 693,8; znaleziono (M+H)⁺:694,3.

P r z y k ł a d 3

Do kolby zawierającej 15 (8 g, 1,5 mmol) w metanolu (1,6 I) dodano w 0°C wodny roztwór 1M wodorotlenku sodu (3,2 I). Reakcję mieszano przez 2 godz. w tej samej temperaturze, po czym zadano 6M HCI do pH=5. Mieszaninę ekstrahowano octanem etylu (3 x 11), połączone ekstrakty organiczne wysuszono nad siarczanem sodu i zatężono w próżni. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, gradient CHCI3 do CHCI3: octan etylu = 2:1) i uzyskano 16 (5,3 mg, 68%).

Rf: 0,48 (CH3CN:H2O 7:3, RP-C18) ¹H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 6,73(s, 1H), 5,43(bs, 1H), 5,16(s, 2H), 4,54(bs, 1H), 4,26(d, J=1,8 Hz, 1H), 4,04(d, J=2,7 Hz 1H), 3,84(bs, 1H), 3,80-3,64(m, 1H), 3,58(s, 3H), 3,41-3,39(m, 1H),

3,22-3,06(m, 5H), 2,49(d, J=18,6 Hz 1H), 2,35(s, 3H), 2,30-2,25(m, 1H), 2,24(s, 3H), 1,87(s, 3H), 1,45-1,33(m, 1 H), 1,19(s, 9H), 1,00(br d, J=6,6 Hz, 3H).

¹³C NMR(75 MHz, CDCI3): δ 184,9, 180,9, 172,6, 154,7, 151,3, 149,1, 148,6, 144,7, 132,9,

131,3, 129,8, 124,5, 123,7, 117,3, 116,8, 99,1, 79,4, 59,8, 58,6, 57,7, 56,2, 55,6, 54,9, 54,5, 50,1,

41,6, 40,1, 28,0, 25,3, 24,4, 18,1, 15,7, 8,0.

ESI-MS m/z: obliczono dla C35H45N5O9: 679,7; znaleziono (M+H)⁺:680,3.

P r z y k ł a d 4

Do odgazowanego roztworu związku 16 (1,8 g, 2,64 mmol) w DMF (221 ml) dodano 10% Pd/C (360 mg) i mieszano pod H2 (ciśnienie atmosferyczne) przez 45 min Reakcję przesączono przez celit pod argonem do kolby zawierającej bezwodny Cs2CO3 (2,58 g, 7,92 mmol). Następnie dodano bromochlorometan (3,40 ml, 52,8 mmol), probówkę zatopiono i mieszano w 100°C przez 2 godz. Reakcję ochłodzono, przesączono przez warstwę celitu i przemyto CH2CI2. Warstwę organiczną zatężono i wysuszono (siarczan sodu) uzyskując 17 w postaci brązowego oleju, który użyto w następnym etapie bez dalszego oczyszczania.

Rf: 0,36 (heksamoctan etylu 1:5, SiO2).

PL 203 745 B1 ¹H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 6,68(s, 1H), 6,05(bs, 1H), 5,90(s, 1H), 5,79(s, 1H), 5,40(bs, 1H), 5,31-5,24(m, 2H), 4,67(d, J=8,1 Hz, 1H), 4,19(d, J=2,7 Hz, 1H), 4,07(bs, 1H), 4,01 (bs, 1H), 3,70(s, 3H), 3,67(s, 3H), 3,64-2,96(m, 5H), 2,65(d, J=18,3 Hz, 1H), 2,33(s, 3H), 2,21(s, 3H), 2,04(s, 3H), 2,01-1,95(m, 1H), 1,28(s, 9H), 0,87(d, J=6,3 Hz, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3): δ 172,1, 162,6, 154,9, 149,1, 145,7, 135,9, 130,8, 130,7, 125,1,

123,1, 117,8, 100,8, 99,8, 76,6, 59,8, 59,2, 57,7, 57,0, 56,7, 55,8, 55,2, 49,5, 41,6, 40,1, 36,5, 31,9,

31,6, 29,7, 28,2, 26,3, 25,0, 22,6, 18,2, 15,8, 14,1, 8,8.

ESI-MS m/z: obliczono dla C36H47N5O9: 693,34; znaleziono (M+H)⁺: 694,3.

Do kolby zawierającej roztwór 17 (1,83 g, 2,65 mmol) w DMF (13 ml), Cs2CO3 (2,6 g, 7,97 mmol) dodano w 0°C bromek allilu (1,15 ml, 13,28 mmol). Otrzymaną mieszaninę mieszano w 23°C przez 1 godz. Reakcję przesączono przez warstwę celitu i przemyto i przemyto CH2CI2. Warstwę organiczną wysuszono i zatężono (siarczan sodu). Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, CHCI3: octan etylu = 1:4) uzyskując 18 (1,08 mg, 56%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,36 (CHCI3: octan etylu 1:3).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 6,70(s, 1H), 6,27-6,02(m, 1H), 5,94(s, 1H), 5,83(s, 1H), 5,37(dd, J1=1,01 Hz, J2=16,8 Hz, 1H), 5,40(bs, 1H), 5,25(dd, J1=1,0 Hz, J2= 10,5 Hz, 1H), 5,10(s, 2H), 4,91(bs, 1H), 4,25-4,22(m, 1H), 4,21 (d, J=2,4 Hz, 1H), 4,14-4,10(m, 1H), 4,08(d, J=2,4 Hz, 1H), 4,00(bs, 1H), 3,70(s, 3H), 3,59(s, 3H), 3,56-3,35(m, 2H), 3,26-3,20(m, 2H), 3,05-2,96(dd, J1=8,1 Hz, J2=18 Hz, 1H), 2,63(d, J=18 Hz, 1H), 2,30(s, 3H), 2,21 (s, 3H), 2,09(s, 3H), 1,91-1,80(m, 1H), 1,24(s, 9H), 0,94(d, J=6,6 Hz, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3): δ 172,0, 154,8, 148,8, 148,6, 148,4, 144,4, 138,8, 133,7, 130,9,

130,3, 125,1, 124,0, 120,9, 117,8, 117,4, 112,8, 112,6, 101,1, 99,2, 73,9, 59,7, 59,3, 57,7, 56,9, 56,8, 56,2, 55,2, 40,1, 34,6, 31,5, 28,1, 26,4, 25,1, 22,6, 18,5, 15,7, 14,0, 9,2.

ESI-MS m/z: obliczono dla C39H51N5O9: 733,4; znaleziono (M+H)⁺:734,4.

PL 203 745 B1

Do roztworu 18 (0,1 g, 0,137 mmol) w dioksanie (2 ml) dodano 4,2M HCI w dioksanie i mieszaninę mieszano przez 1,2 godz. w 23°C. Reakcję potraktowano w 0°C nasyconym wodnym kwaśnym węglanem sodu (60 ml) i ekstrahowano octanem etylu (2 x 70 ml). Warstwę organiczną wysuszono (siarczan sodu) i zatężono w próżni uzyskując 19 (267 mg, 95%) w postaci białego ciała stałego, które użyto w kolejnych reakcjach bez dalszego oczyszczania.

Rf: 0,17 (octan etylu:metanol 10:1, SiO2) ¹H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 6,49(s, 1H), 6,12-6,00(m, 1H), 5,94(s, 1H), 5,86(s, 1H), 5,34(dd, J=1,0 Hz, J=17,4 Hz, 1H), 5,25(dd, J=1,0 Hz, J=10,2 Hz, 1H), 4,18-3,76(m, 5H), 3,74(s, 3H), 3,71-3,59(m, 1H), 3,36-3,20(m, 4H), 3,01-2,90(m, 1H), 2,60(d, J=18,0 Hz, 1H), 2,29(s, 3H), 2,24(s, 3H), 2,11(s, 3H), 1,97-1,86(m, 1H), 0,93(d, J=8,7 Hz, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3): δ 175,5, 148,4, 146,7, 144,4, 142,4, 138,9, 133,7, 131,3, 128,3,

120,8, 117,9, 117,4, 113,8, 112,4, 101,1, 74,2, 60,5, 59,1, 56,5, 56,1, 56,3, 56,0, 55,0, 50,5, 41,6,

39,5, 29,5, 26,4, 24,9, 21,1, 15,5, 9,33.

ESI-MS m/z obliczono dla C32H39N5O6: 589; znaleziono (M+H)⁺:590. P r z y k ł a d 7

Do roztworu 19 (250 mg, 0,42 mmol) w CH2CI2 (1,5 ml) dodano izotiocyjanian fenylu (0,3 ml, 2,51 mmol) i mieszaninę mieszano w 23°C przez 1 godz. Reakcję zatężono w próżni, a pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, gradient heksan do 5:1 heksan : octan etylu) uzyskując 20 (270 mg, 87%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,56 (CHCI3: octan etylu 1:4).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 8,00(bs, 1H), 7,45-6,97(m, 4H), 6,10(s, 1H), 6,08-6,00(m, 1H), 5,92(s, 1H), 5,89(s, 1H), 5,82(s, 1H), 5,40(dd, J=1,5 Hz, J=17,1 Hz, 1H), 3,38(bs,1H), 5,23(dd, J=1,5 Hz, J=10,5 Hz, 1H), 4,42-4,36(m, 1H), 4,19-4,03(m, 5H), 3,71 (s, 3H), 3,68-3,17(m, 4H), 2,90(dd, J=7,8 Hz, J=18,3 Hz, 1H), 2,57(d, J=18,3 Hz, 1H), 2,25(s,3H), 2,12(s, 3H), 2,10(s, 3H), 1,90(dd, J=12,3 Hz, J=16,5 Hz, 1H), 0,81 (d, J=6,9 Hz,3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3): δ 178,4, 171,6, 148,6, 146,8, 144,3, 142,7, 138,7, 136,2, 133,6, 130,7, 129,8, 126,6, 124,2, 124,1, 120,9, 120,5, 117,7, 117,4, 116,7, 112,6, 112,5, 101,0, 74,0, 60,6, 59,0, 57,0, 56,2, 56,1, 55,0, 53,3, 41,4, 39,7, 26,3, 24,8, 18,3, 15,5, 9,2.

ESI-MS m/z: obliczono dla C39H44N6O6S: 724,8; znaleziono (M+H)⁺: 725,3. P r z y k ł a d 8

PL 203 745 B1

Do roztworu 20 (270 mg, 0,37 mmol) w dioksanie (1 ml) dodano 4,2N HCI/dioksan (3,5 ml) i reakcję mieszano w 23°C przez 30 min Następnie dodano octan etylu (20 ml) i H2O (20 ml) i warstwę organiczną zdekantowano. Warstwę wodną zaalkalizowano nasyconym wodnym roztworem kwaśnego węglanu sodu (60 ml) (pH=8) w 0°C, po czym ekstrahowano CH2CI2 (2 x 50 ml). Połączone ekstrakty organiczne wysuszono (siarczan sodu) i zatężono w próżni. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, octan etylu : metanol = 5:1) uzyskując związek 21 (158 mg, 82%) w postaci biał ego ciał a stał ego.

Rf: 0,3 (octan etylu:metanol 1:1).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 6,45(s, 1H), 6,12-6,03(m, 1H), 5,91 (s, 1H), 5,85(s, 1H), 5,38(dd, J1,=12 Hz, J2=17,1 Hz, 1H), 5,24(dd, J1=1,2 Hz, J2=10,5 Hz, 1H), 4,23-4,09(m, 4H), 3,98(d, J=2,1 Hz, 1H), 3,90(bs, 1H), 3,72(s, 3H), 3,36-3,02(m, 5H), 2,72-2,71 (m, 2H), 2,48(d, J=18,0 Hz, 1H), 2,33(s, 3H), 2,22(s, 3H), 2,11(s, 3H), 1,85(dd, J1=11,7 Hz, J2=15,6 Hz, 1H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3): δ 148,4, 146,7, 144,4, 142,8, 138,8, 133,8, 130,5, 128,8, 121,5,

120,8, 118,0, 117,5, 116,9, 113,6, 112,2, 101,1, 74,3, 60,7, 59,9, 58,8, 56,6, 56,5, 55,3, 44,2, 41,8,

29,7, 26,5, 25,7, 15,7, 9,4.

ESI-MS m/z obliczono dla C29H34N4O5: 518,3; znaleziono (M+H)⁺: 519.2. P r z y k ł a d 9

Do roztworu 21 (0,64 g, 1,22 mmol) w CH2CI2 (6,13 ml) dodano w -10°C pirydynę (0,104 ml, 1,28 mmol) i chloromrówczan 2,2,2-trichloroetylu (0,177 ml, 1,28 mmol). Mieszaninę mieszano w tej temperaturze przez 1 godz., po czym reakcję potraktowano dodatkowo 0,1N HCI (10 ml) i ekstrahowano CH2CI2 (2 x 10 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodu i zatężono w próżni. Pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, heksan:octan etylu = 1:2) uzyskując 22 (0,84 g, 98%) w postaci białej piankowatej substancji stałej.

Rf: 0,57 (octan etylu.metanol 5:1).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 6,50(s, 1H), 6,10-6,00(m, 1H), 6,94(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,87(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,73(bs, 1H), 5,37(dq, J1=1,5 Hz, J2=17,1 Hz, 1H), 5,26(dq, J1=1,8 Hz, J2=10,2 Hz, 1H), 4,60(d, J=12Hz, 1H), 4,22-4,10(m, 4H), 4,19(d, J=12 Hz, 1H), 4,02(m, 2H), 3,75(s, 3H), 3,37-3,18(m, 5H), 3,04(dd, J1=8,1 Hz, J2=18 Hz, 1H), 2,63(d, J= 18 Hz, 1H), 2,31(s, 3H), 2,26(s, 3H), 2,11(s, 3H), 1,85(dd, J1=12,3 Hz, J2=15,9 Hz,1H).

13C NMR (75 MHz, CDCI3) δ 154,3, 148,5, 146,7, 144,5, 142,8, 139,0, 133,8, 130,7, 128,7,

121,3, 120,8, 117,8, 117,7, 116,8, 112,7, 101,2, 77,2, 74,3, 60,7, 59,9, 57,0, 56,4, 55,3, 43,3, 41,7,

31,6, 26,4, 25,3, 22,6, 15,9, 14,1, 9,4.

ESI-MS m/z: obliczono dla C32H35CI3N4O7: 694,17; znaleziono (M+H)⁺: 695,2.

P r z y k ł a d 10

PL 203 745 B1

Do roztworu 22 (0,32 g, 0,46 mmol) w CH3CN (2,33 ml) dodano w 0°C diizopropyloetyloaminę (1,62 ml, 9,34 mmol), eter bromometylo-metylowy (0,57 ml, 7,0 ml) i dimetyloaminopirydynę (6 mg, 0,046 mmol). Mieszaninę ogrzewano w 30°C przez 10 godz. Następnie, reakcję rozcieńczono dichlorometanem (30 ml) i wylano do wodnego roztworu HCI o pH=5 (10 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodu, a rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymując pozostałość, którą oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, heksan: octan etylu = 2:1) i uzyskano 23 (0,304 g, 88%) w postaci biał ego piankowatego ciał a stał ego.

Rf: 0,62 (heksan:octan etylu 1:3).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 6,73(s, 1H), 6,10(m, 1H), 5,94(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,88(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,39(dq, J1= 1,5 Hz, J2=17,1 Hz, 1H), 5,26(dq, J1= 1,8 Hz, J2= 10,2 Hz, 1H), 5,12(s, 2H), 4,61 (d, J=12 Hz, 1H), 4,55(t, J=6,6 Hz, 1H), 4,25(d, J= 12Hz, 1H), 4,22-4,11 (m, 4H), 4,03(m, 2H), 3,72(s, 3H), 3,58(s, 3H), 3,38-3,21 (m, 5H), 3,05(dd, J1=8,1 Hz, J2=18 Hz, 1H), 2,65(d, J=18 Hz, 1H), 2,32(s, 3H), 2,23(s, 3H), 2,12(s, 3H), 1,79(dd, J1=12,3 Hz, J2=15,9 Hz, 1H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3) δ 154,3, 148,6, 148,4, 144,5, 139,0, 133,6, 130,6, 130,1, 125,07,

124,7, 124,0, 121,1, 117,7, 112,6, 101,2, 99,2, 77,2, 74,4, 74,1, 59,8, 59,8, 57,7, 57,0, 56,8, 56,68,

55,3, 43,2, 41,5, 26,4, 25,2, 15,9, 9,3.

ESI-MS m/z: obliczono dla C34H39CI3N4O8: 738,20; znaleziono (M+H)⁺: 739,0.

P r z y k ł a d 11

Do zawiesiny 23 (0,304 g, 0,4 mmol) w 90% wodnym kwasie octowym (4 ml) dodano pył cynkowy (0,2 g, 6,17 mmol) i reakcję mieszano przez 7 godz. w 23°C. Mieszaninę przesączono przez warstwę celitu, którą przemyto CH2CI2. Warstwę organiczną przemyto wodnym nasyconym roztworem kwaśnego węglanu sodu (pH=9) (15 ml) i wysuszono nad siarczanem sodu. Usunięto rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymując 24 (0,191 g, 83%) w postaci białego ciała stałego. Rf: 0,3 (octan etylu:metanol 5:1).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 6,68(s, 1H), 6,09(m, 1H), 5,90(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,83(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,39(dq, J1=1,5 Hz, J2=17,1 Hz, 1H), 5,25(dq, J1 =1,5 Hz, J2=10,2 Hz, 1H), 5,10(s, 2H),

4,22-4,09(m, 3H), 3,98(d, J= 2,4 Hz, 1H), 3,89(m, 1H), 3,69(s, 3H), 3,57(s, 3H), 3,37-3,17(m, 3H), 3,07(dd, J1=8,1 Hz, J2=18 Hz, 1H), 2,71(m, 2H), 2,48(d, J=18Hz, 1H), 2,33(s, 3H), 2,19(s, 3H), 2,17(s, 3H), 1,80(dd, J1=12,3 Hz, J2= 15,9 Hz, 1H).

¹³C NMR(75 MHz, CDCI3): δ 148,5, 148,2, 144,3, 138,7, 133,7, 130,7, 129,9, 125,0, 123,9,

121,3, 117,9, 117,5, 113,6, 112,0, 101,0, 99,2, 74,0, 59,8, 59,7, 58,8, 57,6, 57,0, 56,2, 55,2, 44,2, 41,5, 31,5, 26,4, 25,6, 22,5, 16,7,14,0, 9,2.

ESI-MS m/z: obliczono dla C31H38N4O6: 562,66, znaleziono (M+H)⁺: 563,1.

P r z y k ł a d 12

Do roztworu 24 (20 mg, 0,035 mmol) w H2O (0,7 ml) i THF (0,7 ml) dodano w 0°C NaNO2 (12 mg, 0,17 mmol) i 90% wodny AcOH (0,06 ml), i mieszaninę mieszano w 0°C przez 3 godz.

PL 203 745 B1

Po rozcieńczeniu CH2CI2 (5 ml) warstwę organiczną przemyto wodą (1 ml), wysuszono nad siarczanem sodu i zatężono w próżni. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, heksan:octan etylu = 2:1) i uzyskano 25 (9,8 mg, 50%) w postaci białego ciała stałego. Rf: 0,34 (heksan:octan etylu 1:1).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 6,71 (s, 1H), 6,11(m, 1H), 5,92(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,87(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,42(dq, J1=1,5 Hz, J2=17,1 Hz, 1H), 5,28(dq, J1=1,5 Hz, J2=10,2 Hz, 1H), 5,12(s, 2H), 4,26-4,09(m, 3H), 4,05(d, J=2,4 Hz, 1H), 3,97(t, J=3,0 Hz, 1H), 3,70(s, 3H), 3,67-3,32(m, 4H), 3,58(s, 3H), 3,24(dd, J1=2,1 Hz, J2=15,9 Hz, 1H), 3,12(dd, J1=8,1 Hz, J2=18,0 Hz, 1H), 2,51 (d, J=18 Hz, 1H), 2,36(s, 3H), 2,21 (s, 3H), 2,12(s, 3H), 1,83(dd, J1=12,3 Hz, J2=15,9 Hz, 1H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3) δ 148,7, 148,4, 138,9, 133,7, 131,1, 129,4, 125,1, 123,9, 120,7,

117,6, 117,5, 113,2, 112,3, 101,1, 99,2, 74,0, 63,2, 59,8, 59,7, 57,9, 57,7, 57,0, 56,5, 55,2, 41,6, 29,6,

26,1, 25,6, 22,6, 15,7, 9,2.

ESI-MS m/z: obliczono dla C31H37N3O7: 563,64; znaleziono (M+H)⁺: 564,1. P r z y k ł a d 13

Wyjściowy materiał (2,0 g, 5,90 mmol) dodano do zawiesiny wodorku sodu (354 mg, 8,86 mmol) w THF (40 ml) w 23°C. Następnie zawiesinę potraktowano chloromrówczanem allilu (1,135 ml, 8,25 mmol) w 23°C, po czym ogrzewano we wrzeniu przez 3 godziny. Zawiesinę ochłodzono, odsączono, a ciało stałe przemyto octanem etylu (100 ml) i przesącz zatężono. Surowy olej umieszczono w heksanie (100 ml) i trzymano w 4°C przez noc. Po zdekantowaniu rozpuszczalnika, jasno-żółtą zawiesinę potraktowano CH2CI2 (20 ml) i strącono heksanem (100 ml). Po 10 minutach rozpuszczalnik zdekantowano ponownie. Operację powtórzono aż do pojawienia się białego ciała stałego. Białe ciało stałe odsączono i wysuszono uzyskując związek 29 (1,80 g, 65%) w postaci białego ciała stałego.

¹H-NMR (300 MHz, CDCI3): δ 7,74(d, J=7,5 Hz, 2H), 7,62(d, J=6,9 Hz, 2H), 7,33(t, J=7,5 Hz, 2H), 7,30(t, J=6,3 Hz, 2H), 5,71 (d, J=7,8 Hz, 1H), 4,73(d, J=7,8 Hz, 2H), 4,59(m, 1H), 4,11(1, J=6,0 Hz, 1H), 3,17(dd, J=6,0 Hz, J=2,7 Hz, 2H), 3,20(dd, J=5,4 Hz, J=2,1 Hz, 2H).

¹³C-NMR (75 MHz, CDCI3): δ 173,6, 152,7, 144,0, 139,7, 137,8, 126,0, 125,6, 123,4, 118,3,

73,4, 52,4, 45,5, 35,8, 33,7.

ESI-MS m/z: obliczono dla C20H18CI3NO4S: 474,8; znaleziono (M+Na)⁺: 497,8.

P r z y k ł a d 14

Mieszaninę związku 25 (585 mg, 1,03 mmol) i związku 29 (1,47 mg, 3,11 mmol) azeotropowano z bezwodnym toluenem (3 x 10 ml). Do roztworu 25 i 29 w bezwodnym CH2CI2 (40 ml) dodano DMAP (633 mg, 5,18 mmol) i EDC^HCI (994 mg, 5,18 mmol) w 23°C. Mieszaninę reakcyjną mieszano w 23°C przez 3 godziny. Mieszaninę podzielono pomiędzy nasycony wodny roztwór kwaśnego węglanu sodu (50 ml) i warstwy rozdzielono. Warstwę wodną przemyto CH2CI2 (50 ml). Połączone warstwy organiczne wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono. Surowy produkt oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (octan etylu/heksan 1:3) otrzymując 30 (1,00 g, 95%) w postaci jasnokremowo-żółtego ciała stałego.

PL 203 745 B1 ¹H-NMR (300 MHz, CDCI3): δ 7,72 (m, 2H), 7,52 (m, 2H), 7,38 (m, 2H), 7,28(m, 2H), 6,65(s, 1H), 6,03(m, 1H), 5,92(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,79(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,39(m, 1H), 5,29(dq, J=10,3 Hz, J=1,5 Hz, 1H), 5,10(s, 2H), 4,73(d, J=11,9 Hz, 1H), 4,66(d, J= 11,9 Hz, 1H), 4,53(m, 1H), 4,36-3,96(m, 9H), 3,89(t, J=6,4 Hz, 1H), 3,71 (s, 3H), 3,55(s, 3H), 3,33(m, 1H), 3,20(m, 2H), 2,94(m, 3H), 2,59(m, 1H), 2,29(s, 3H), 2,23(s, 3H), 2,02(s, 3H),1,83(dd, J=16,0 Hz, J=11,9 Hz, 1H).

¹³C-NMR (75 MHz, CDCI3): δ 169,7, 154,0, 148,8, 148,4, 145,7, 144,5, 140,9, 139,0, 133,7, 130,9,

130,6, 127,6, 127,0, 124,8, 124,6, 124,1, 120,8, 119,9, 118,2, 117,7, 117,3, 112,7, 112,1, 101,3, 99,2, 74,7, 73,9, 64,4, 59,8, 57,7, 57,0, 56,8, 55,4, 53,3, 46,7, 41,4, 36,5, 34,7, 31,5, 26,4, 24,9, 22,6, 15,7, 14,0, 9,1.

ESI-MS m/z: obliczono dla C51H53Cl3N4O10S: 1020,4; znaleziono (M+H)⁺: 1021,2. P r z y k ł a d 15

Do roztworu 30 (845 mg, 0,82 mmol), kwasu octowego (500 mg, 8,28 mmol) i (PPh3)2PdCI2 (29 mg, 0,04 mmol) w bezwodnym CH2CI2 (20 ml) w 23°C wkroplono Bu3SnH (650 mg, 2,23 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano w tej temperaturze przez 15 min, z bąblowaniem. Surowy produkt potraktowano wodą (50 ml) i ekstrahowano CH2CI2 (3 x 50 ml). Warstwy organiczne wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono. Surowy produkt oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (octan etylu/heksan w gradiencie od 1:5 do 1:3) uzyskując związek 31 (730 mg, 90%) w postaci jasnokremowo-żółtego ciała stałego.

¹H-NMR (300 MHz, CDCI3): δ 7,72(m, 2H), 7,56(m, 2H), 7,37(m, 2H), 7,30(m, 2H), 6,65(s, 1H), 5,89(s, 1H), 5,77(s, 1H), 5,74(s, 1H), 5,36(d, J=5,9 Hz, 1H), 5,32(d, J=5,9 Hz, 1H), 5,20(d, J=9,0, 1H), 4,75(d, J=12,0 Hz, 1H), 4,73(m, 1H), 4,48(d, J=11,9 Hz, 1H), 4,08(m, 4H), 3,89(m, 1H), 3,86(t, J=6,2 Hz, 1H), 3,70(s, 3H), 3,69(s, 3H), 3,38(m, 1H), 3,25(m, 1H), 3,02-2,89(m, 4H), 2,67(s, 1H), 2,61(s, 1H), 2,51(dd, J=14,3 Hz, J=4,5 Hz, 1H), 2,29(s, 3H), 2,23(s, 3H), 1,95(s, 3H), 1,83(m, 1H).

¹³C-NMR (75 MHz, CDCI3): δ 168,2, 152,5, 148,1, 146,2, 144,4, 144,3, 143,3, 139,6, 134,6,

129,7, 129,6, 126,2, 125,6, 123,4, 123,3, 121,6, 118,5, 116,3, 110,7, 110,2, 105,1, 99,4, 98,5, 75,2,

73,3, 61,7, 58,4, 57,9, 56,3, 56,1, 55,1, 54,7, 53,9, 51,9, 45,2, 40,1, 35,6, 33,3, 24,8, 23,3, 14,5, 7,3.

ESI-MS m/z: obliczono dla C48H49CI3N4O10S: 980,3; znaleziono (M+H)⁺: 981,2. P r z y k ł a d 16

PL 203 745 B1

Do roztworu 31 (310 mg, 0,32 mmol) w bezwodnym CH2CI2 (15 ml) w -10°C dodano roztwór bezwodnika benzenoseleninowego 70% (165 mg, 0,32 mmol) w bezwodnym CH2CI2 (7 ml) przez kaniulę, utrzymując temperaturę -10°C. Mieszaninę reakcyjną mieszano w -10°C przez 5 min Dodano nasycony roztwór kwaśnego węglanu sodu (30 ml) w tej temperaturze. Warstwę wodną przemyto dalszymi porcjami CH2CI2 (40 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono. Surowy produkt oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (octan etylu/heksan w gradiencie od 1:5 do 1:1) otrzymując 32 (287 mg, 91%, HPLC: 91,3%) w postaci jasnokremowo-żółtego ciała stałego, jako mieszaninę dwóch izomerów (65:35), które użyto w następnym etapie.

¹H-NMR (300 MHz, CDCI3): δ (mieszanina izomerów) 7,76(m, 4H), 7,65(m, 4H), 7,39(m, 4H), 7,29(m, 4H), 6,62(s, 1H), 6,55(s, 1H), 5,79-5,63(m, 6H), 5,09(s, 1H), 5,02(d, J=6,0 Hz, 1H), 4,99(d, J=6,0 Hz, 1H), 4,80-4,63(m, 6H), 4,60(m, 1H), 4,50(m, 1H), 4,38(d, J=12,8 Hz, J=7,5 Hz, 1H), 4,27(dd, J=12,8 Hz, J=7,5 Hz, 1H), 4,16-3,90(m, 10H), 3,84(s, 3H), 3,62(s, 3H), 3,50(s, 3H), 3,49(s, 3H), 3,33-2,83(m, 14H), 2,45-2,18(m, 2H), 2,21(s, 6H), 2,17(s, 6H), 1,77(s, 6H), 1,67(m, 2H).

¹³C-NMR (75 MHz, CDCI3): δ (mieszanina izomerów) 168,6, 168,4, 158.6, 154,8, 152,8, 152,5,

147,3, 147,2, 146,8, 144,1, 144,0, 140,8, 139,7, 137,1, 129,8, 129,3, 128,4, 128,7, 126,5, 125,5, 123,7,

123,6, 123,5, 123,4, 122,2, 121,3, 118,3, 115,8, 115,5, 110,2, 106,9, 103,5, 103,2, 100,1, 99,6, 97,9, 97,7,

93.8, 73,4, 70,9, 69,2, 64,9, 62,5, 59,3, 58,9, 58,4, 56,7, 56,3, 56,2, 55,4, 55,2, 55,1, 54,9, 54,7, 54,3, 54,1,

53.8, 52,8, 45,5, 40,5, 40,0, 39,8, 35,8, 35,5, 33,9, 33,7, 30,1, 28,8, 24,2, 24,1, 21,2, 14,5, 14,4, 12,7, 6,0, 5,7.

ESI-MS m/z: obliczono dla C48H49Cl3N4O11S: 996,3; znaleziono (M+H)⁺: 997,2.

Kolbę reakcyjną wygrzano dwukrotnie w płomieniu, przedmuchano kilkakrotnie pod próżnią/argonem i trzymano w atmosferze argonu do reakcji. Do roztworu DMSO (39,1 ml, 0,55 mol, 5 równoważników) w bezwodnym CH2CI2 (4,5 ml) dodano wkraplając bezwodnik triflanowy (37,3 ml, 0,22 mol, 2 równoważniki) w -78°C. Mieszaninę reakcyjną mieszano w -78°C przez 20 minut, następnie dodano roztwór 32 (110 mg, 0,11 mmol, HPLC: 91,3%) w bezwodnym CH2CI2 (1 ml podczas dodawania i 0,5 ml do przemycia) w -78°C, przez kaniulę. Podczas dodawania utrzymywano temperaturę w -78°C w obydwu kolbach, a kolor uległ zmianie z żółtego na brązowy. Mieszaninę reakcyjną mieszano w -40°C przez 35 minut. Podczas tego okresu roztwór zmienił się z żółtego na ciemnozielony. W tym czasie dodano wkraplając ⁱPr2NEt (153 ml, 0,88 mol, 5 równoważników) i mieszaninę reakcyjną trzymano w 0°C przez 45 minut, w którym to czasie kolor uległ zmianie na brązowy. Następnie wkroplono t-butanol (41,6 ml, 0,44 mol, 4 równoważników) i 2-^tbutylo-1,1,3,3-tetrametyloguanidynę (132,8 ml, 0,77 mol, 7 równ.) i mieszaninę reakcyjną mieszano w 23°C przez 40 minut. Po tym czasie wkroplono bezwodnik octowy (104,3 ml, 1,10 mol, 10 równoważników) i mieszaninę reakcyjną trzymano w 23°C przez 1 godzinę. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńczono CH2CI2 (20 ml) i przemyto nasyconym wodnym roztworem NH4CI (50 ml), kwaśnym węglanem sodu (50 ml) i chlorkiem sodu (50 ml). Połączone warstwy organiczne wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (eluent: octan etylu/heksan gradient od 1:3 do 1:2) uzyskując związek 33 (54 mg, 58%) w postaci jasnożółtego ciała stałego.

PL 203 745 B1 ¹H-NMR (300 MHz, CDCI3): δ 6,85(s, 1H), 6,09(s, 1H), 5,99(s, 1H), 5,20(d, J=5,8 Hz 1H), 5,14(d, J=5,3 Hz, 1H), 5,03(m, 1H), 4,82(d, J=12,2, 1H), 4,63(d, J=12,0 Hz, 1H), 4,52(m, 1H),

4,35-4,17(m, 4H), 3,76(s, 3H), 3,56(s, 3H), 3,45(m, 2H), 2,91 (m, 2H), 2,32(s, 3H), 2,28(s, 3H), 2,21(s, 3H), 2,12(m, 2H), 2,03(s, 3H).

¹³C-NMR (75 MHz, CDCI3): δ 168,5, 167,2, 152,7, 148,1, 147,1, 144,5, 139,6, 139,1, 130,5, 129,0, 123,7, 123,5, 123,3, 118,8, 116,5, 112,1, 100,6, 97,8, 73,3, 60,5, 59,4, 59,2, 58,3, 57,6, 57,4,

56,1, 53,3, 53,1, 40,6, 40,0, 31,0, 22,2, 18,9, 14,4, 8,1.

ESI-MS m/z: obliczono dla C36H39Cl3N4O11S: 842,1; znaleziono (M+H)⁺: 843,1.

Do roztworu 33 (12 mg, 0,014 mmol) w suchym dichlorometanie (1,2 ml) i acetonitrylu do HPLC (1,2 ml) dodano w 23°C jodek sodu (21 mg, 0,14 mmol) i świeżo przedestylowany (znad wodorku wapnia pod ciśnieniem atmosferycznym) chlorek trimetylosililowy (15,4 mg, 0,14 mmol). Mieszanina reakcyjna zmieniła barwę na pomarańczową. Po 15 minutach roztwór rozcieńczono dichlorometanem (10 ml) i przemyto świeżym nasyconym wodnym roztworem Na2S2O4 (3 x 10 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono. Otrzymano związek 34 (13 mg, ilościowo) w postaci jasnożółtego ciała stałego, które użyto bez dalszego oczyszczania.

¹H-NMR (300 MHz, CDCI3): δ 6,85(s, 1H), 6,09(s, 1H), 5,99(s, 1H), 5,27(d, J=5,8 Hz, 1H), 5,14(d, J=5,3 Hz, 1H), 5,03(d, J=11,9 Hz, 1H), 4,82(d, J= 122, 1H), 4,63(d, J=13,0 Hz, 1H), 4,52(m, 1H), 4,34(m, 1H), 4,27(bs, 1H), 4,18(m, 2H), 3,76(s, 3H), 3,56(s, 3H), 3,44(m, 1H), 3,42(m, 1H), 2,91 (m, 2H), 2,32(s, 3H), 2,28(s, 3H), 2,21 (s, 3H), 2,03(s, 3H).

ESI-MS m/z: obliczono dla C34H35N4O10S: 798,1; znaleziono (M+H)⁺: 799,1.

Do roztworu 34 (13 mg, 0,016 mmol) w mieszaninie kwasu octowego/H2O (90:10; 1 ml) dodano pył cynkowy (5,3 mg, 0,081 mmol) w 23°C. Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w 70°C przez 6 godz. Po tym czasie, ochłodzono do 23°C, rozcieńczono CH2CI2 (20 ml), przemyto wodnym nasyconym roztworem kwaśnego węglanu sodu (15 ml) i wodnym roztworem Et3N (15 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash na żelu krzemionkowym-NH2 (eluent: octan etylu/heksan, gradient od 0:100 do 50:50) i uzyskano związek 35 (6,8 mg, 77% po dwóch etapach) w postaci jasnożółtego ciała stałego.

¹H-NMR (300 MHz, CDCI3): δ 6,51 (s, 1H), 6,03(dd, J=1,3 Hz, J=26,5 Hz, 2H), 5,75(bs, 1H),

5,02(d, J=11,6 Hz, 1H), 4,52(m, 1H), 4,25(m, 2H), 4,18(d, J=2,5 Hz, 1H), 4,12(dd, J=1,9 Hz, J=11,5 Hz,

PL 203 745 B1

1H), 3,77(s, 3H), 3,40(m, 2H), 3,26(t, J=6,4 Hz, 1H), 2,88(m, 2H), 2,30-2,10(m, 2H), 2,30(s, 3H),

2,28(s, 3H), 2,18(s, 3H), 2,02(s, 3H).

¹³C-NMR(75 MHz, CDCI3): δ 174,1, 168,4, 147,8, 145,4, 142,9, 140,8, 140,1, 131,7, 130,2,

129,1, 128,3, 120,4, 118,3, 117,9, 113,8, 111,7, 101,7, 61,2, 59,8, 59,2, 58,9, 54,4, 53,8, 54,4, 41,3,

41,5, 34,1, 23,6, 20,3, 15,5, 9,4.

ESI-MS m/z: obliczono dla C31H34N4O8S: 622,7; znaleziono (M+H)⁺: 623,2.

Roztwór jodku 4-karboaldehydo-N-metylopirydyniowego (378 mg, 1,5 mmol) w bezwodnym DMF (5,8 ml) zadano bezwodnym toluenem (2x10 ml) celem usunięcia wody drogą azeotropowego oddestylowywania toluenu. Do tego pomarańczowego roztworu dodano przez kaniulę, w 23°C, roztwór 35 (134 mg, 0,21 mmol), uprzednio obrabiany bezwodnym toluenem (2x10 ml), w bezwodnym CH2CI2 (destylowanym znad CaH2, 7,2 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 23°C przez 4 godziny. Następnie dodano kroplami DBU (32,2 gl, 0,21 mmol) w 23°C i całość mieszano w 23°C przez 15 minut. Do mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo przygotowany nasycony wodny roztwór kwasu szczawiowego (5,8 ml) i całość mieszano przez 30 minut w 23°C. Następnie mieszaninę reakcyjną ochłodzono do 0°C i porcjami dodawano NaHCO3, po czym dodano wodny nasycony roztwór NaHCO3. Mieszaninę ekstrahowano Et20. Do warstwy wodnej dodano K2CO3 i warstwę ekstrahowano Et2O. Połączone warstwy organiczne wysuszono MgSO4 i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash AcOEt/heksan od 1/3 do 1/1) dostarczając związek 36 (77 mg, 57%) w postaci jasnożółtego ciała stałego.

¹H-NMR (300 MHz, CDCI3): δ 6,48(s, 1H), 6,11(d, J=1,3 Hz, 1H), 6,02(d, J=1,3 Hz, 1H), 5,70(bs, 1H), 5,09(d, J=11,3 Hz, 1H), 4,66(bs, 1H), 4,39(m, 1H), 4,27(d, J=5,6 Hz, 1H), 4,21(d, J=10,5 Hz, 1H), 4,16(d, J=2,6 Hz, 1H), 3,76(s, 3H), 3,54(d, J=5,1 Hz, 1H), 3,42(d, J=8,5 Hz, 1H), 2,88-2,54(m, 3H), 2,32(s, 3H), 2,24(s, 3H), 2,14(s, 3H), 2,04(s, 3H).

¹³C-NMR (75 MHz, CDCI3): δ 186,7, 168,5, 160,5, 147,1, 146,4, 142,9, 141,6, 140,7, 130,4,

129,8, 121,7 (2C), 120,0, 117,8, 117,1, 113,5, 102,2, 61,7, 61,4, 60,3, 59,8, 58,9, 54,6, 41,6, 36,9, 29,7, 24,1, 20,3, 15,8, 14,1, 9,6.

ESI-MS m/z: obliczono dla C31H31N3O9S: 621,7; znaleziono (M+H)⁺: 622,2.

Do roztworu 36 (49 mg, 0,08 mmol) i 2-[3-hydroksy-4-metoksyfenylo]etyloaminy (46,2 mg, 0,27 mmol) w etanolu (2,5 ml) dodano żel krzemionkowy (105 mg) w 23°C. Mieszaninę reakcyjną mieszano w 23°C przez 14 godz. Rozcieńczono heksanem i naniesiono na kolumnę chromatograficzną (octan etylu/heksan z 1/3 do 1/1) uzyskując Et-770 (55 mg, 90%) w postaci jasnożółtego ciała stałego.

PL 203 745 B1 ¹H-NMR (300 MHz, CDCI3): δ 6,60(s, 1H), 6,47(s, 1H), 6,45(s, 1H), 6,05(s, 1H), 5,98(s, 1H), 5,02(d, J=11,4 Hz, 1H), 4,57(bs, 1H), 4,32(bs, 1H), 4,28(d, J=5,3 Hz, 1H), 4,18(d, J=2,5 Hz, 1H), 4,12(dd, J=2,1 Hz, J=11,5 Hz, 1H), 3,78(s, 3H), 3,62(s, 3H), 3,50(d, J=5,0 Hz, 1H), 3,42(m, 1H), 3,10(ddd, J1=4,0 Hz, J2=10,0Hz, J1=11,0 Hz, 1H), 2,94(m, 2H), 2,79(m, 1H), 2,61(m, 1H), 2,47(m, 1H), 2,35(m, 1H), 2,32(s, 3H), 2,27(s, 3H), 2,20(s, 3H), 2,09(m, 1H), 2,04(s, 3H).

ESI-MS m/z: obliczono dla C40H42N4O10S: 770,7; znaleziono (M+H)⁺: 771,2.

P r z y k ł a d 22

Do roztworu 21 (22 mg, 0,042 mmol) w CH2CI2 (0,8 ml) dodano bezwodnik ftalowy (6,44 mg, 0,042 mmol) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 2 godz. w 23°C. Następnie, dodano karbonylodiimidazol (1 mg, 0,006 mmol) i mieszaninę mieszano w 23°C przez 7 godz. Następnie dodano karbonylodiimidazol (5,86 mg, 0,035 mmol) i mieszaninę reakcyjną mieszano w 23°C przez kolejne 17 godz. Roztwór rozcieńczono CH2CI2 (15 ml) i przemyto 0,1 N HCI (15 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono, a rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, heksan:octan etylu 2:1) i uzyskano 27 (26,4 mg, 96%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,58 (octan etylu).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3): 7,73-7,64(m, 4H), 6,40(s, 1H), 6,12-6,01 (m, 1H), 5,63(s, 1H), 5,58(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,37(dd, J1=1,8 Hz, J2=17,4 Hz), 5,23(dd, J1=1,8 Hz, J2=10,5 Hz, 1H), 5,12(d, J=1,5 Hz, 1H), 4,22-4,15(m, 3H), 4,08(d, J=1,8 Hz, 1H), 3,68(s, 3H), 3,59-3,55(m 2H), 3,35(d, J=8,1 Hz, 1H), 3,27-3,16(m, 2H), 3,05(dd, J1=8,1 Hz, J2=18,3 Hz, 1H), 2,64(d, J=18,0 Hz, 1H), 2,30(s, 3H), 2,24(s, 3H), 2,09(s, 3H), 1,80(dd, J1=11,4 Hz, J2=15 Hz, 1H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3): δ 167,7, 148,9, 146,4, 144,2, 142,6, 139,5, 134,0, 133,5, 132,0, 131,0, 128,3, 123,0, 121,3, 120,9, 118,1, 117,5, 116,8, 113,6, 112,4, 100,8, 74,5, 60,6, 60,5, 57,7,

56,6, 55,6, 55,5, 42,3, 41,7, 26,6, 25,5, 15,9, 9,46.

ESI-MS m/z: obliczono dla C37H35N4O7: 648,79; znaleziono (M+H)⁺: 649,3.

P r z y k ł a d 23

Do roztworu 27 (26 mg, 0,041 mmol) w CH2CI2 dodano kwas octowy (11 ml), (PPh3)2PdCI2 (36 mg) i Bu3SnH (28 ml, 0,10 mmol) w 23°C. Po 2 godzinach mieszania w tej temperaturze reakcję naniesiono na kolumnę typu flash (SiO2, gradient: heksan do heksan:octan etylu 2:1) i uzyskano 28 (24,7 mg, 99%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,33 (heksan:octan etylu 2:1).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 7,75-7,70(m, 2H), 7,69-7,65(m, 2H), 6,39(s, 1H), 5,82(bs, 1H), 5,50(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,0(d, J=1,5 Hz, 1H), 4,45(bs, 1H), 4,23-4,19(m, 2H), 4,10-4,09(m, 1H), 3,73(s,

PL 203 745 B1

3H), 3,60-3,48(m, 2H), 3,36-3,33(m, 1H), 3,26-3,20(m, 1H), 3,14-3,08(m, 1H), 3,98(d, J=14,4 Hz, 1H), 2,61(d, J=18,3 Hz, 1H), 2,30(s, 3H), 2,23(s, 3H), 2,06(s, 3H), 1,85(dd, J1=12 Hz, J2=15,3 Hz).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3): δ 167,8, 146,4, 145,1, 143,9, 142,7, 137,1, 133,5, 131,9, 130,8,

128,4, 122,9, 120,8, 118,0, 116,8, 114,0, 113,4, 106,4, 100,4, 60,6, 60,5, 57,8, 56,6, 55,5, 55,2, 42,6, 41,5, 25,6, 25,5, 15,8, 8,9.

ESI-MS m/z: obliczono dla C34H32N4O7: 608,6; znaleziono (M+H)⁺: 609.2.

P r z y k ł a d 24

Do roztworu 28 (357 mg, 0,058 mmol) w CH₂CI₂ (3 ml) dodano w 0°C chlorek acetylu (41,58 μl 0,58 mmol) i pirydynę (47,3 μl 0,58 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godz., po czym roztwór rozcieńczono CH2CI2 (15 ml) i przemyto 0,1N HCI (15 ml). Warstwę organiczna wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono, a rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (RP-18, CH3CN:H2O 60:40) dostarczając ftalascydynę (354 mg, 94%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,37 (CH3CN:H2O 7:3, RP-18).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 7,72-7,68(m, 2H), 7,67-7,63(m, 2H), 6,38(s, 1H), 5,69(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,64(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,30(bs, 1H), 4,25-4,21 (m, 2H), 4,02(d, J=2,1 Hz, 1H), 3,64-3,62(m, 5H), 3,33(d, J=8,4 Hz, 1H), 3,21-3,16(m, 1H), 3,02(dd, J1=8,1 Hz, J2=18 Hz, 1H), 2,76(dd, J1=1,8 Hz, J2=15,6 Hz, 1H), 2,63(d, J=17,7 Hz, 1H), 2,29(s, 3H), 2,28(s, 3H), 2,21(s, 3H), 2,0(s, 3H), 1,73(dd, J1=12,0 Hz, J2=15,3 Hz, 1H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3): δ 168,5, 167,6, 146,2, 144,2, 142,5, 141,0, 140,5, 133,4, 131,8,

130,7, 128,2, 120,9, 120,8, 117,9, 116,4, 113,6, 101,1, 60,4, 60,0, 57,0, 56,3, 55,6, 55,4, 41,6, 41,5, 26,5, 25,2, 20,2, 15,7, 9,4.

ESI-MS m/z: obliczono dla C36H34N4O8: 650; znaleziono (M+H)⁺: 651,2.

P r z y k ł a d 25

Do roztworu 17 (300 mg, 0,432 mmol) w CH₂CI₂ (2 ml) dodano w 0°C chlorek acetylu (30,7 gl, 0,432 mmol) i pirydynę (34,9 gl, 0,432 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 2 godz. w tej temperaturze, po czym roztwór rozcieńczono CH2CI2 (15 ml) i przemyto 0,1 N HCI (15 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono, a rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując 42 (318 mg, 100%) w postaci białego ciała stałego, które użyto w następnej reakcji bez dalszego oczyszczania.

PL 203 745 B1

Rf: 0,5 (octan etylu:metanol 5:1).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3), δ 6,66(s, 1H), 5,93(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,83(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,42(t, J=6,6 Hz, 1H), 5,07(d, J=5,7 Hz, 1H), 4,98(d, J=5,7 Hz, 1H), 4,16(d, J=1,8 Hz, 1H), 4,11(d, J=2,1 Hz, 1H), 3,98(bs, 1H), 3,73-3,61 (m, 2H), 3,64(s, 3H), 3,52-3,48(m, 1H), 3,50(s, 3H), 3,33(d, J=9,6 Hz, 1H), 3,17-3,14(m, 1H), 2,97-2,87(m, 1H), 2,75-2,70(d, J=16,8 Hz, 1H), 2,26(s, 6H), 2,16(s, 3H), 1,96(s, 3H), 1,70(dd, J1 =11,7 Hz, J2 =15,6 Hz,1H), 1,33(s, 9H), 0,59(d, J=6,0 Hz, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3): δ 172,0, 168,3, 162,3, 148,2, 144,4, 140,4, 140,2, 130,9, 130,5,

125.3, 123,4, 120,8, 117,6, 112,7, 111,7, 101,4, 99,1, 79,2, 59,5, 58,8, 57,5, 57,4, 56,4, 55,5, 55,0,

41.3, 39,0, 28,2, 26,4, 24,6, 19,9, 18,4, 15,4, 9,1.

ESI-MS m/z: obliczono dla C38H49N5O10: 735,82; znaleziono (M+H)⁺: 736,3.

Do roztworu 42 (318 mg, 0,432 mmol) w CH2CI2 (2,16 ml), dodano kwas trifluorooctowy (1,33 ml, 17,30 mmol) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 3,5 godz. w 23°C. Reakcję potraktowano w 0°C nasyconym wodnym roztworem kwaśnego węglanu sodu (60 ml) i ekstrahowano CH2CI2 (2 x 70 ml). Połączone warstwy organiczne wysuszono (siarczan sodu) i zatężono w próżni. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, octan etylu:metanol 20:1) i uzyskano 43 (154 mg, 60%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,22 (octan etylu:metanol 5:1).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3). δ 6,47(s, 1H), 6,22(bs, 1H), 5,95(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,88(d, J=1,2 Hz, 1H), 4,08-4,06(m, 2H), 4,01 (bs, 1H), 3,69(s, 3H), 3,49(d, J=3,6 Hz, 1H), 3,33(d, J=8,1 Hz, 1H), 3,263,22(m, 1H), 2,95(dd, J1=8,1 Hz, J2=18 Hz, 1H), 2,80-2,76(m, 2H), 2,58(d, J=18Hz, 1H), 2,29(s, 3H), 2,27(s, 3H), 2,21 (s, 3H), 1,96(s, 3H), 1,77(dd, J1=12,3 Hz, J2=15,6 Hz, 1H), 0,90(d, J=6,9 Hz, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3): δ 174,8, 169,0, 146,8, 144,4, 142,8, 140,5, 140,2, 131,1, 128,8,

120,8, 120,5, 117,1, 112,9, 111,6, 101,5, 60.3, 59,0, 56,5, 56,3, 55,6, 55,1, 50,2, 41,6, 39,5, 26,8,

26,3, 24,9, 20,2, 15,4, 9,2.

ESI-MS m/z: obliczono dla C31H37N5O7: 591,65; znaleziono (M+H)⁺: 592,3.

PL 203 745 B1

Do roztworu 43 (154 mg, 0,26 mmol) w CH₂CI₂ (1,3 ml) dodano izotiocyjanian fenylu (186 μ 1,56 mmol) i mieszaninę mieszano w 23°C przez 2 godz. Reakcję zatężono w próżni, a pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, gradient heksan do heksan:octan etylu 1:1) i uzyskano 44 (120 mg, 63%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,41 (octan etylu:metanol 5:1).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3). δ 8,17(s, 1H), 7,49-7,44(m, 3H), 7,31-7,24(m, 3H), 7,05(d, J=6,9Hz, 1H), 5,98(d, J=1,2Hz, 1H), 5,87(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,52(bs, 1 H), 4,54(t, J=6,6 Hz, 1H), 4,15(d, J=2,1 Hz, 1H), 4,03(d, J=2,7 Hz, 2H), 3,80(bs, 1H), 3,66(s, 3H), 3,40(bs, 1H), 3,32(d, J=7,8 Hz, 1H), 3,16(d, J=11,7 Hz, 1H), 2,82-2,61(m, 3H), 2,29(s, 3H), 2,20(s, 3H), 2,01(s, 3H), 1,99(s, 3H), 1,80(dd, J1=12,0 Hz, J2=15,9 Hz, 1H), 0,62(d, J=6,0 Hz, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3) δ 178,5, 171,9, 168,7, 146,7, 144,5, 142,6, 140,6, 140,3, 136,3, 131,0, 129,9, 128,9, 126,7, 124,4, 120,9, 120,6, 117,7, 116,6, 112,7, 111,9, 101,4, 60,4, 58,7, 57,5,

56,1, 55,7, 55,1, 53,3, 41,4, 38,8, 26,3, 24,4, 20,2, 18,1, 15,3, 9,2.

ESI-MS m/z: obliczono dla C38H42N6O7S: 726,3; znaleziono (M+H)⁺: 727,3.

P r z y k ł a d 28

OMe

Do roztworu 44 (120 mg, 0,165 mmol) w dioksanie (0,9 ml) dodano 5,3N mieszaninę HCI/dioksan (1,8 ml) i reakcję mieszano w 23°C przez 2,5 godz. Następnie, dodano CH2CI2 (10 ml) i H2O (5 ml) i warstwę organiczną zdekantowano. Fazę wodną zaalkalizowano nasyconym wodnym roztworem kwaśnego węglanu sodu (20 ml) (pH=8) w 0°C, po czym ekstrahowano CH2CI2 (2x15 ml). Połączone ekstrakty organiczne wysuszono (siarczan sodu) i zatężono w próżni uzyskując 45 (75 mg, 87%) w postaci białego ciała stałego, które użyto w następnej reakcji bez dalszego oczyszczania.

Rf: 0,23 (octan etylu:metanol 5:1).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 6,43(s, 1H), 5,94(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,87(d, J=1,2 Hz, 1H), 4,10(d, J=2,1 Hz, 1H), 3,98(d, J=2,4 Hz, 1H), 3,91(bs, 1H), 3,69(s, 3H), 3,34-3,25(m, 2H), 3,05(dd, J1=1,8 Hz, J2=8,1 Hz, 1H), 2,80-2,73(m, 3H), 2,46(d, J=18 Hz, 1H), 2,30(s, 3H), 2,28(s, 3H), 2,20(s, 3H), 1,98(s, 3H), 1,79(dd, J1=12,6 Hz, J2=16,2 Hz, 1H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3): δ 168,7, 146,7, 144,4, 142,9, 140,4, 130,4, 128,9, 121,1, 120,8,

117,8, 116,8, 113,6, 111,5, 101,4, 67,6, 60,5, 59,8, 58,4, 56,6, 55,8, 55,3, 43,6, 41,8, 31,3, 25,6, 20,2,

15,6, 9,2.

ESI-MS m/z: obliczono dla C28H32N4O6: 520,58; znaleziono (M+H)⁺: 521,3.

P r z y k ł a d 29

PL 203 745 B1

Do roztworu 45 (10 mg, 0,02 mmol) w CH2CI2 (0,4 ml) dodano bezwodnik ftalowy (2,84 mg, 0,02 mmol) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 2 godz. w 23°C. Następnie dodano karbonylodiimidiazol (0,5 mg, 0,003 mmol) i mieszaninę mieszano w 23°C przez 7 godz. Następnie dodano karbonylodiimidazol (2,61 mg, 0,016 mmol) i mieszaninę reakcyjną mieszano w 23°C przez dodatkowe 17 godz. Roztwór rozcieńczono CH2CI2 (10 ml) i przemyto 0,1 N HCI (5 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono, a rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (RP-18, CH3CN:H2O 60:40) i uzyskano ftalascydynę (11,7 mg, 93%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,37 (CH3CN:H2O 7:3, RP-18).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 7,72-7,68(m, 2H), 7,67-7,63(m, 2H), 6,38(s, 1H), 5,69(d, J=1,2 Hz,

1H), 5,64(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,30(bs, 1H), 4,25-4,21 (m, 2H), 4,02(d, J=2,1 Hz, 1H), 3,64-3,62(m, 5H),

3,33(d, J=8,4 Hz, 1H), 3,21-3,16(m, 1H), 3,02(dd, J1=8,1 Hz, J2=18 Hz, 1H), 2,76(dd, J1=1,8 Hz,

J2=15,6 Hz, 1H), 2,63(d, J=17,7 Hz, 1H), 2,29(s, 3H), 2,28(s, 3H), 2,21(s, 3H), 2,0(s, 3H), 1,73(dd,

J1,= 12,0 Hz, J2=15,3 Hz, 1H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3): δ 168,5, 167,6, 146,2, 144,2, 142,5, 141,0, 140,5, 133,4, 131,8,

130,7, 128,2, 120,9, 120,8, 117,9, 116,4, 113,6, 101,1, 60,4, 60,0, 57,0, 56,3, 55,6, 55,4, 41,6, 26,5,

25,2, 20,2, 15,7,9,4.

ESI-MS m/z: obliczono dla C36H34N4O8: 650; znaleziono (M+H)⁺: 651,2.

P r z y k ł a d 30

Do roztworu 25 (18 mg, 0,032 mmol) w DMF (0,05 ml) dodano w 0°C katalityczną ilość DMAP (0,5 mg, 0,004 mmol), imidazol (5 mg, 0,08 mmol) i chlorek tert-butylodifenylosililowy (12,5 pl, 0,048 mmol), i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 6 godzin w 23°C. Dodano wodę (10 ml) w 0°C i warstwę wodną ekstrahowano mieszaniną heksan:octan etylu 1:10 (2 x 10 ml). Warstwę organiczną wysuszono (siarczan sodu), przesączono, a rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem.

Surowy produkt oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, heksan:octan etylu 3:1) uzyskując 26 (27 mg, 88%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,29 (heksan:octan etylu 3:1).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 7,61-7,58(m, 2H), 7,42-7,28(m, 8H), 6,71 (s, 1H), 6,19-6,02(m, 1H), 5,78(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,64(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,40(dd, J1=1,2 Hz, J2= 17,1 Hz, 1H), 5,27(dd, J1=1,2 Hz, J2=10,2 Hz, 1H), 5,13(s, 2H), 4,45(d, J=2,4 Hz, 1H), 4,24(d, J=2,1 Hz, 1H),

4,17-4,06(m, 3H), 3,75(s, 3H), 3,64(dd, J1=2,4 Hz, J2=9,9 Hz, 1H), 3,59(s, 3H), 3,42-3,21(m, 4H), 3,10(dd, J1=8,1 Hz, J2=17,7 Hz, 1H), 2,70(d, J=17,7 Hz, 1H), 2,33(s, 3H), 2,26(s, 3H), 2,11(s, 3H), 2,08-1,89(m, 1H), 0,87(s, 9H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3): δ 148,5, 148,3, 148,1, 144,0, 139,0, 135,6, 135,4, 133,8, 133,1,

132,6, 130,5, 130,3, 129,6, 129,4, 127,5, 127,4, 125,1, 124,3, 121,6, 118,5, 117,5, 112,9, 111,7,

100,8, 99,2, 74,0, 67,7, 61,5, 59,6, 59,0, 57,7, 57,1, 55,4, 41,6, 29,6, 26,6, 25,5, 18,8, 15,8, 9,2.

ESI-MS m/z: obliczono dla C47H55N3O7Si: 801,3; znaleziono (M+H)⁺: 802,3.

PL 203 745 B1

P r z y k ł a d 31

Do roztworu 26 (7 mg, 0,0087 mmol) w CH₂CI₂ (0,15 ml), dodano kwas octowy (2,5 gl 0,044 mmol)), (PPh₃)₂PdCI₂ (0,5 mg, 6,96 x 10^-4 mmol) i Bu₃SnH (3,5 gl 0,013 mmol) w 23°C. Mieszaninę reakcyjną mieszano w tej temperaturze przez 1 godz. Roztwór rozcieńczono mieszaniną heksan:octan etylu 5:1 (0,5 ml), naniesiono na kolumnę typu flash (SiO2, gradient 5:1 heksamoctan etylu) i uzyskano ET-11 (5 mg, 75%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,36 (heksan:octan etylu 1:5, krzemionka).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 7,56(m, 2H), 7,41-7,25(m, 8H), 6,67(s, 1H), 5,72(d, J=1,0 Hz, 1H), 5,58(d, J=1,0 Hz, 1H), 5,51(s, 1H), 5,38(d, J=5,75 Hz, 1H), 5,16(d, J=5,7 Hz, 1H), 4,57(d, J=2,9 Hz, 1H), 4,21(m, 1H), 4,09(m, 1H), 3,72(s, 3H), 3,71(s, 3H), 3,68(dd, J1=2,1 Hz, J2 =10,4 Hz, 1H), 3,38-3,26(m, 3H), 3,11(dd, J1=2,5 Hz, J2=15,7 Hz, 1H), 3,01(dd, J1=8,9 Hz, J2=17,9 Hz, 1H), 2,70(d, J=17,9 Hz, 1H), 2,31(s, 3H), 2,25(s, 3H), 2,06(s, 3H), 1,89(dd, J1=12,1 Hz, J2=15,7 Hz, 1H), 0,9(s, 9H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3): δ 149,0, 147,4, 145,3, 144,3, 136,3, 135,7, 135,4, 133,2, 130,9,

130,5, 129,6, 129,5, 127,5, 125,0, 118,6, 112,5, 112,1, 105,7, 100,5, 99,8, 68,5, 61,5, 59,7, 58,8, 57,7, 56,9, 56,5, 55,4, 41,7, 26,6, 26,2, 25,5, 18,9, 15,8, 14,2, 8,7.

ESI-MS m/z: obliczono dla C44H51N3O7Si: 761; znaleziono (M+H)⁺:762.

Roztwór 2 (3,0 g, 5,46 mmol) i izotiocyjanian fenylu (3,92 ml, 32,76 mmol) w CH2CI2 (27 ml) mieszano w 23°C przez 1,5 godz. Mieszaninę reakcyjną podzielono pomiędzy CH2CI2 (10 ml) i H2O (5 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, gradient: heksan do 2:3 heksan:octan etylu) i otrzymano 3 (3,29 g, 88%) w postaci żółtego ciała stałego.

Rf: 0,27 (ACN:H2O 3:2, RP-C18).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 7,77(bs, 1H), 7,42-7,11(m, 5H), 6,65(d, 1H), 6,29(s, 1H), 5,6-5,5(m, 1H), 4,19-4,14(m, 2H), 4,08(d, 1H), 3,92(s, 3H), 3,87-3,65(m, 6H), 3,77(s, 3H), 3,37-2,98(m, 8H), 2,50(d, 1H), 2,31(s, 3H), 2,20(s, 3H), 1,96(d, 1H), 1,87(s, 3H), 1,81-1,75(m, 1H), 0,96(d, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3): δ 185,7, 180,9, 178,9, 172,0, 155,7, 147,1, 143,2, 142,4, 136,0,

135,1, 130,5, 129,9, 129,3, 128,5, 126,9, 124,4, 120,2, 117,4, 116,3, 77,1, 60,9, 58,6, 56,2, 55,8, 55,0,

54,6, 53,5, 41,7, 40,3, 25,1, 24,5, 18,4, 15,8, 8,7.

ESI-MS m/z: obliczono dla C36H4ON6O6S: 684,8; znaleziono (M+H)⁺: 685,2.

PL 203 745 B1

Roztwór 3 (0,143 g, 0,208 mmol) w 6,5M mieszaninie HCI/dioksan (150 ml) mieszano w 23°C przez 6 godz. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodano toluen (3 ml) i warstwę organiczną zdekantowano. Pozostałość podzielono pomiędzy nasycony wodny roztwór kwaśnego węglanu sodu (3 ml) i CHCI3 (3x3 ml). Warstwę organiczną wysuszono i zatężono uzyskując tytułowy związek w postaci mieszaniny 4 i 6 (4:6 90:10), która powoli cyklizowała do 6 w trakcie przechowywania.

Rf: 0,4 (octan etylu:metanol 5:1, krzemionka).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 6,45(s, 1H), 4,16(m, 1H), 4,02(d, 1H), 3,96(s, 3H), 3,79(m, 2H), 3,75(s, 3H), 3,35(m, 1H), 3,20-3,00(m, 3H), 2,87(d, 1H), 2,75(d, 1H), 2,43(d, 1H), 2,34(s, 3H), 2,30(s, 3H), 1,93(s, 3H), 1,72-1,5(m, 3H).

ESI-MS m/z: obliczono dla C26H30N4O5: 478,5; znaleziono (M+H)⁺:479,2.

Roztwór 3 (0,143 g, 0,208 mmol) w 6,5 M mieszaninie HCI/dioksan (150 ml) mieszano w 23°C przez 1 godz. Odparowanie rozpuszczalnika dało pozostałość, którą oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (octan etylu/metanol/trietyloamina 100:25:0,1) i otrzymano 6 (80 mg, 83%) w postaci ż ó ł tego ciał a stał ego.

Rf: 0,26 (ACN:H2O 3:2, RP-C18).

¹H NMR (500 MHz, CDCI3): δ 6,46(s, 1H), 5,9(bs, 1H) 4,67(dd, J=18,3 Hz, J=7,8 Hz, 1H), 4,24(d, 1H), 4,16(s, 3H), 3,93(d, J=2,7 Hz, 1H), 3,8(m, 2H), 3,77(s, 3H), 3,45(m, 2H), 3,08(dd, J=17,9 Hz, J=3,6 Hz, 1H), 2,78(m, 1H), 2,55(d, 1H), 2,3(m, 1H), 2,3(s, 3H), 2,28(s, 3H), 1,90(s, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3): δ 186,2, 162,1, 154,9, 146,9, 145,3, 143.0, 130,1, 129,4, 128,1, 125,0, 121,4, 116,4, 116,2, 66,6, 60,7, 60,7, 60,1, 59,6, 58,8, 55,6, 54,9, 41,9, 25,3, 24,7, 15,7, 8,9.

ESI-MS m/z: obliczono dla C26H28N4O4: 460,5; znaleziono (M+H)⁺:461,1.

P r z y k ł a d 35

PL 203 745 B1

Do roztworu 3 (2,38 g, 3,47 mmol) w dioksanie (5 ml) dodano 5,3M HCI w dioksanie (34 ml) i reakcję mieszano w 23°C przez 45 minut. Następnie dodano Ac2O (51 ml, 539,5 mmol) i mieszaninę mieszano przez 4 godz. Reakcję ochłodzono do 0°C i podzielono pomiędzy nasycony wodny Na2CO3 (300 ml) i octan etylu (300 ml) w tej temperaturze. Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, gradient CH2CI2 do CH2CI2:octan etylu 1:2) otrzymując 5 (1,75 g, 97%) w postaci żółtego ciała stałego.

Rf: 0,53 (ACN:H2O 3:2, RP-C18).

¹H NMR (300 MHz,CDCI3): δ 6,51 (s, 1H), 5,98(bs, 1H), 4,84(dd, 1H), 4,17(d, 1H), 4,00(d, 1H), 3,99(s, 3H), 3,85(bs, 1H), 3,81 (m, 1H), 3,74(s, 3H), 3,70(d, 1H), 3,23(m, 1H), 3,11(dd, 1H), 3,09(m, 1H), 2,93(m, 2H), 2,44(d, 1H), 3,67(s, 3H), 2,25(s, 3H), 1,70(s, 3H), 1,60-1,50(m, 2H), 1,29(s, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3): δ 185,9, 180,8, 169,9, 160,2, 156,2, 147,0, 143,1, 140,4, 136,1,

130,6, 129,6, 127,9, 120,4, 117,2, 61,0, 60,7, 58,6, 56,1, 55,7, 55,1, 54,3, 41,8, 41,1, 25,7, 23,9, 22,2,

15,7, 8,7.

ESI-MS m/z: obliczono dla C28H32N4O6: 520,6; znaleziono (M+H)⁺:521.1.

Do roztworu 5 (1,75 g, 3,36 mmol) w CH2CI2 (17 ml) dodano w 0°C diizopropyloetyloaminę (11,7 ml, 67,23 mmol), DMAP (20 mg, 0,17 mmol) i eter bromometylometylowy (4,11 ml, 50,42 mmol). Po 6 godz. w 23°C reakcję podzielono pomiędzy CH2CI2 (50 ml) i wodny nasycony roztwór kwaśnego węglanu sodu (25 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodu i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (RP-18, CH3CN/H2O 1/1) otrzymując 7 (1,32 g, 70%) w postaci żółtego ciała stałego.

Rf: 0,34 (ACN:H2O 2:3, RP-C18).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 6,74(s, 1H), 5,14(s, 2H), 4,82(m, 1H), 4,22(d, 1H), 4,00(s, 3H), 4,0(m, 1H), 3,83(m, 2H), 3,7(s, 3H), 3,58(s, 3H), 3,4(m, 1H), 3,2-2,95(m, 6H), 2,43(d, 1H), 2,37(s, 3H), 2,22(s, 3H), 1,89(s, 3H), 1,5-1,4(m, 2H), 1,31(s, 3H).

¹³C NMR (75 MHz,CDCI3): δ 185,9, 180,7, 169,6, 156,2, 148,9, 148,5, 140,3, 136,2, 131,3,

130,1, 127,7, 124,6, 123,7, 117,3, 99,5, 99,2, 60,9, 59,7, 58,8, 57,7, 56,4, 55,7, 55,0, 54,2, 51,0, 41,6, 41,0, 40,5, 25,5, 23,9, 22,3, 19,3, 15,6, 14,6, 8,6.

ESI-MS m/z: obliczono dla C30H36N4O7: 564,6; znaleziono (M+H)⁺:565,3.

P r z y k ł a d 37

OMe

Do roztworu 7 (0,37 g, 0,65 mmol) w metanolu (74 ml) w 0°C dodano 1M wodorotlenek sodu (130 ml). Reakcję mieszano przez 15 minut, po czym zadano w 0°C 6M HCI do pH=5. Mieszaninę ekstrahowaPL 203 745 B1 no octanem etylu (3 x 50 ml), połączone warstwy organiczne wysuszono nad siarczanem sodu i zatężono w próżni. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (RP-18, CH3CN:H2O 1/1) uzyskując 8 (232 mg, 65%) w postaci żółtego oleju.

Rf: 0,5 (ACN:H2O 3:2, RP-C18).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 6,75(s, 1H), 5,15(s, 2H), 4,86(m, 1H), 4,26(d, 1H), 4,01(d, 1H), 3,88-3,81(m, 2H), 3,70(s, 3H), 3,58(s, 3H), 3,39(m, 1H), 3,27-3,21(m, 1H), 3,18-3,08(m, 2H), 3,03-2,97(m, 1H), 2,47(d, 1H), 2,37(s, 3H), 2,22(s, 3H), 1,90(s, 3H), 1,57-1,46(m, 2H), 1,33(s, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3): δ 185,3, 180,6, 175,9, 170,1, 151,5, 148,9, 148,6, 143,3, 133,7, 131,5, 129,9, 124,7, 123,5, 117,1, 117,0, 99,2, 59,8, 58,7, 57,8, 56,3, 55,3, 54,9, 54,3, 41,5, 40,7,

29,6, 25,5, 24,4, 22,2, 20,7, 15,7, 8,0.

ESI-MS m/z: obliczono dla C29H34N4O7: 550,6; znaleziono (M+H)⁺:551,2.

Do odgazowanego roztworu związku 8 (240 mg, 0,435 mmol) w DMF (30 ml) dodano 10% Pd/C (48 mg) i reakcję mieszano pod H2 (ciśnienie atmosferyczne) przez 1 godz. Reakcję przesączono przez warstwę celitu pod argonem jako bezbarwny roztwór do naczynia Schlenka zawierającego Cs2CO3 (240 mg, 0,739 ml). Następnie dodano bromochlorometan (0,566 ml, 8,71 mmol). Naczynie szczelnie zamknięto i całość mieszano w 90°C przez 3 godz. Reakcję ochłodzono, przesączono przez celit i przemyto CH2CI2. Warstwę organiczną zatężono i wysuszono (siarczan sodu) uzyskując 9 w postaci brązowego oleju, który użyto w następnym etapie bez dalszego oczyszczania.

Rf: 0,36 (SiO2, heksamoctan etylu 1:5).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 6,71(s, 3H), 5,89(d, 1H), 5,81 (d, 1H), 5,63(bs, 1H), 5,33(d, 1H), 5,17(d, 1H), 4,97(m, 1H), 4,20(d, 1H), 4,09(m, 1H), 3,99(m, 1H), 3,68(m, 1H), 3,65(s, 6H), 3,59-3,47(m, 4H), 3,37-3,27(m, 2H), 3,14-2,97(m, 2H), 2,62(d, 1H), 2,32(s, 3H), 2,20(s, 3H), 2,08(s, 3H), 1,72(m, 1H), 1,36(s, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3): δ 169,8, 149,1, 147,4, 145,5, 136,2, 130,9, 130,8, 125,0, 122,9,

117,7, 112,6, 111,8, 106,4, 100,8, 99,8, 59,8, 58,9, 57,7, 56,6, 56,4, 55,5, 55,2, 41,6, 40,1, 29,6, 25,9, 25,0, 22,6, 15,6, 8,8.

ESI-MS m/z: obliczono dla C30H36SiN4O7: 564,6; znaleziono (M+H)⁺: 565,3.

Do kolby zawierającej 9 (245 mg, 0,435 mmol) w DMF (4 ml) dodano w 0°C węglan cezu (425 mg,

1,30 mmol) i bromek allilu (376 μ|, 4,35 mmol), i mieszaninę mieszano w 23°C przez 1 godz. Reakcję przesączono przez warstwę celitu i podzielono pomiędzy CH2CI2 (25 ml) oraz H2O (10 ml). Warstwę organiczną wysuszono (siarczan sodu) i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując pozosta74

PL 203 745 B1 łość, którą oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, CHCI3: octan etylu 1:2) otrzymując 10 w postaci żółtego oleju (113 mg, 43%).

Rf: 0,36 (heksan:octan etylu 1:5).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 6,74(s, 1H), 6,3-6,0(m, 1H), 5,94(d, 1H), 5,87(d, 1H), 5,43-5,36(m, 2H), 5,22(s, 2H), 5,00(m, 1H), 4,22(m, 1H), 4,17-4,01(m, 1H), 3,98(m, 2H), 3,71-3,67(m, 1H), 3,69(s, 3H), 3,62-3,51(m, 3H), 3,58(s, 3H), 3,39-3,37(m, 1H), 3,31-3,26(m, 3H), 3,09(dd, 1H), 2,56(d, 1H), 2,36(s, 3H), 2,21(s, 3H), 2,11(s, 3H), 2,24-2,10(m, 1H), 1,82-1,73(m, 1H), 1,24(bs, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3): δ 169,4, 148,8, 148,3, 139,1, 133,7, 130,9, 130,3, 125,2, 120,2,

117,7, 113,1, 112,6, 101,3, 99,3, 74,1, 59,7, 59,3, 57,8, 57,0, 56,1, 56,1, 55,2, 41,6, 41,0, 40,9, 29,7,

26,3, 22,5, 15,6, 9,3.

ESI-MS m/z: obliczono dla C33H40N4O7: 604,7; znaleziono (M+H)⁺:605,3.

Do roztworu 9 (22 mg, 0,039 mmol) w CH2CI2 (0,2 ml) dodano w 0°C chlorek acetylu (2,79 gl 0,039 mmol) i pirydynę (3,2 gl, 0,039 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godz., po czym roztwór rozcieńczono CH2CI2 (10 ml) i przemyto 0,1 N HCI (5 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono, a rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując 46 (22 mg, 93%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,4 (heksan:octan etylu 1:5).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3), δ 6,74(s, 1H), 5,97(d, J=0,9 Hz, 1H), 5,91 (d, J=0,9 Hz, 1H), 5,12(d, J=5,7 Hz, 2H), 5,04(d, J=5,7 Hz, 1H), 4,90(t, J=6 Hz, 1H), 4,17(d, J=2,7Hz, 1H), 4,05(d, J=2,7 Hz, 1H), 4,01 (bs, 1H), 3,71 (s, 3H), 3,57(s, 3H), 3,50-3,44(m, 2H), 3,38-3,36(m, 1H), 3,30-3,26(m, 1H), 3,00(dd, J1=7,8 Hz, J2=18,0 Hz, 1H), 2,79(d, J=12,9 Hz, 1H), 2,60(d, J=18,0 Hz, 1H), 2,35(s, 3H), 2,32(s, 3H), 2,21(s, 3H), 2,00(s, 3H), 1,68(dd, J1=11,7 Hz, J2=15,6 Hz, 1H).

ESI-MS m/z: obliczono dla C32H38N4O8: 606,67; znaleziono (M+H)⁺: 607,3.

Do roztworu 46 (8 mg, 0,013 mmol) w dioksanie (0,1 ml) dodano 5,3N mieszaninę HCI/dioksan (0,5 ml) i reakcję mieszano w 23°C przez 1 godz. Następnie roztwór rozcieńczono CH2CI2 (5 ml) i przemyto 0,1 N HCI (3 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono, a rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując 47 (5 mg, 70%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,4 (heksamoctan etylu 1:5).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3), δ 6,51(s, 1H), 5,97(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,91 (d, J=1,2 Hz, 1H), 4,97(bs, 1H), 4,11(bs, 1H), 4,04-4,02(m, 2H), 3,75(s, 3H), 3,65(d, J=2,1 Hz, 2H), 3,56-3,30(m, 2H),

PL 203 745 B1

3,04(dd, J1 =7,5 Hz, J2 =18 Hz, 1H), 2,80(d, J=14,4 Hz, 1H), 2,59(d, J=18,3 Hz, 1H), 2,33(s, 3H), 2,24(s, 3H), 2,00(s, 3H), 1,76(dd, J1=12,0 Hz, J2=15,9 Hz, 1H), 1,33(s, 3H), 1,25(s, 3H).

ESI-MS m/z: obliczono dla C30H34N4O7: 562,61; znaleziono (M+H)⁺: 563,3.

P r z y k ł a d 42

Do roztworu 45 (10 mg, 0,0192 mmol) w CH2CI2 (0,3 ml) dodano w 0°C chlorek izowalerylu (2,34 gl, 0,0192 mmol) i pirydynę (1,55 gl, 0,0192 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godz., po czym roztwór rozcieńczono CH2CI2 (5 ml) i przemyto 0,1 N HCI (3 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono, a rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, heksan:octan etylu 1:2) uzyskując 48 (11 mg, 95%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,12 (heksan: octan etylu 1:2).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 6,50(s, 1H), 5,98(d, J=1,5Hz, 1H), 5,91 (d, J=1,5 Hz, 1H), 5,75(s, 1H), 5,02(t, J=5,4 Hz, 1H), 4,10(d, J=1,5 Hz, 1H), 4,06(d, J=2,7 Hz, 1H), 4,02(d, J=2,7 Hz, 1H), 3,77(s, 3H), 3,76-3,71(m, 1H), 3,86-3,28(m, 3H), 3,04(dd, J1=8,1 Hz, J2=18,3Hz, 1H), 2,78(d, J=15,9 Hz, 1H), 2,55(d, J=18 Hz, 1H), 2,32(s, 6H), 2,26(s, 3H), 1,98(s, 3H), 1,84-1,68(m, 2H), 1,36(d, J=7,2 Hz, 2H), 0,69(d, J=6,6 Hz, 3H), 0,62(d, J=6,6 Hz, 3H).

ESI-MS m/z: obliczono dla C33H40N4O7: 604,69; znaleziono (M+H)⁺: 605,3.

P r z y k ł a d 43

Do roztworu 45 (10 mg, 0,0192 mmol) w CH2CI2 (0,3 ml) dodano w 0°C chlorek izowalerylu (3,98 gl 0,0192 mmol) i pirydynę (1,55 gl, 0,0192 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godz., po czym roztwór rozcieńczono CH2CI2 (5 ml) i przemyto 0,1N HCI (3 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono, a rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, heksan:octan etylu 1:2) uzyskując 49 (12,4 mg, 96%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,7 (octan etylu:metanol 10:1).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 6,50(s, 1H), 5,98(d, J=1,5Hz, 1H), 5,91(d, J=1,5Hz, 1H), 5,73(s, 1H), 5,08(t, J=5,4 Hz, 1H), 4,10(d, J=1,5 Hz, 1H), 4,05(m, 1H), 4,01(m, 1H), 3,76(s, 3H), 3,65-3,61(m, 1H), 3,40-3,27(m, 3H), 3,03(dd, J1=8,1 Hz, J2=18,6 Hz, 1H), 2,78(d, J=13,2 Hz, 1H), 2,57(d, J=8,3 Hz, 1H), 2,32(s, 3H), 2,31(s, 3H), 2,25(s, 3H), 1,99(s, 3H), 1,79(dd, J1=12,0 Hz, J2=16,5 Hz, 1H), 1,73-1,42(m, 4H), 1,33-1,18(m, 10H), 1,03(m, 2H), 0,87(t, J=6,6 Hz, 3H).

ESI-MS m/z: obliczono dla C38H50N4O7: 674,83; znaleziono (M+H)⁺: 675,5.

PL 203 745 B1

P r z y k ł a d 44

Do roztworu 45 (14,5 mg, 0,0278 mmol) w CH2CI2 (0,3 ml) dodano w 0°C chlorek trans-3-trifluorometylocynamoilu (4,76 pl, 0,0278 mmol) i pirydynę (2,25 pl, 0,0278 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godz., po czym roztwór rozcieńczono CH2CI2 (5 ml) i przemyto 0,1 N HCI (3 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono, a rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, heksan:octan etylu 1:1) uzyskując 50 (18,7 mg, 94%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,64 (octan etylu:metanol 5:1).

¹H NMR (300 MHz, CH3OD), δ 7,74-7,55(m, 4H), 7,23(d, J=16,0 Hz, 1H), 6,34(s, 1H), 6,12(d, J=16,0 Hz, 1H), 6,07(d, J=0,9 Hz, 1H), 5,96(d, J=0,9 Hz, 1H), 4,39(d, J=2,4Hz, 1H), 4,07-4,05(m, 1 H), 3,81 (bs, 1H), 3,46-3,51(m, 3H), 3,42(s, 3H), 3,09(br d, J=12,0 Hz, 1H), 2,94-2,85(m, 2H), 2,74(d, J=18,3 Hz, 1H), 2,38(s, 3H), 2,23(s, 3H), 2,02(s, 3H), 1,80(s, 3H), 1,84-1,75(m, 1H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3): δ 168,7, 165,3, 146,5, 144,7, 142,6, 140,6, 138,0, 135,9, 131,0,

130,9, 129,1, 128,6, 125,8, 125,7, 124,5, 124,4, 122,7, 121,2, 117,8, 116,5, 113,0, 112,0, 101,7, 60,4,

59,1, 56,5, 56,4, 55,6, 55,3, 41,8, 40,3, 26,6, 25,1, 20,3, 15,4, 9,3.

ESI-MS m/z: obliczono dla C38H37F3N4O7: 718,72; znaleziono (M+H)⁺: 719,3. P r z y k ł a d 45

Do roztworu 43 (33 mg, 0,0557 mmol) w CH2CI2 (0,4 ml) dodano w 0°C chlorek izowalerylu (6,79 pl, 0,0557 mmol) i pirydynę (4,5 pl, 0,0557 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godz., po czym roztwór rozcieńczono CH2CI2 (5 ml) i przemyto 0,1 N HCI (3 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono, a rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, heksan:octan etylu 1:2) uzyskując 51 (34 mg, 91%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,09 (heksan: octan etylu 1:2).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 6,46(s, 1H), 6,10(bs, 1H), 5,99(d, J=0,9Hz, 1H), 5,90(d, J=0,9 Hz, 1H), 5,30(t, J=6,0 Hz, 1H), 4,10-4,05(m, 3H), 3,81 (bs, 1H), 3,74(s, 3H), 3,54(bs, 1H), 3,38-3,36(m, 1H), 3,29-3,21(m, 1H), 3,00(dd, J,= 8,0 Hz, J2=18,0 Hz, 1H), 2,25(s, 3H), 2,20(s, 3H), 2,00(s, 3H), 1,95-1,90(m, 3H), 0,87(d, J=6,6 Hz, 6H), 0,76(d, J=6,0 Hz, 3H).

ESI-MS m/z: obliczono dla C36H45N5O8: 675,77; znaleziono (M+H)⁺: 676,3.

PL 203 745 B1

P r z y k ł a d 46

OMe

Do roztworu 43 (33 mg, 0,0557 mmol) w CH2CI2 (0,4 ml) dodano w 0°C chlorek trans-3-trifluorometylocynamoilu (9,52 μ!, 0,0557 mola) i pirydynę (4,5 gl, 0,0557 mola). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godz., po czym roztwór rozcieńczono CH2CI2 (5 ml) i przemyto 0,1 N HCI (3 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono, a rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, heksan:octan etylu 1:2) uzyskując 52 (40 mg, 92%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,21 (heksan:octan etylu 1:2).

¹H NMR (300 MHz, CD3OD), δ 7,74-7,47(m, 4H), 6,49(s, 1H), 6,40(d, J=15,6 Hz, 1H), 6,00(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,90(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,47(t, J=6Hz, 1H), 4,12-4,09(m, 3H), 3,93(bs, 1H), 3,71 (s, 3H), 3,59-3,58(m, 1H), 3,38(d, J=7,8 Hz, 1H), 3,29(d, J=12,0 Hz, 1H), 3,00(dd, J1=8,1 Hz, J2=18,3Hz, 1H), 2,79-2,78(m, 1H), 2,65(d, J=18,3 Hz, 1H) 2,29(s, 6H), 2,28(s, 3H), 2,22(s, 3H), 1,84-1,80(m, 1H), 0,85-0,84(m, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3) δ 171,9, 168,8, 164,4, 146,9, 144,6, 143.0, 140,5, 140,5, 139,3,

135,7, 131,1, 131,0, 129,4, 129,1, 126,0, 124.1, 124,0, 122,4, 121,1, 120,7, 120,6, 117,7, 116,9, 112,8, 112,0, 101,6, 60,6, 59,3, 57,1, 56,3, 55,9, 55,2, 49,0, 41,7, 49,9, 26,5, 25,1, 20,2, 18,4, 15,7, 9,3.

ESI-MS m/z: obliczono dla C41H42F5N5O8: 789,8; znaleziono (M+H)⁺: 790,3.

P r z y k ł a d 47

Do roztworu 43 (10 mg, 0,0169 mmol) w CH2CI2 (0,2 ml) dodano w 23°C bezwodnik trifluorooctowy (2,38 gl, 0,0169 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 5 godzin, po czym roztwór rozcieńczono CH2CI2 (5 ml) i przemyto 0,1 N HCI (3 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono, a rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, heksan:octan etylu 3:2) uzyskując 53 (10,7 mg, 93%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,57 (octan etylu:metanol 5:1).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 6,45(s, 1H), 6,00(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,90(d, J=12 Hz, 1H), 5,87(bs, 1H), 5,32(bs, 1H), 4,12(d, J=2,1 Hz, 1H), 4,08(d, J=1,8 Hz, 1H), 3,78-3,56(m, 3H), 3,72(s, 3H), 3,40(d, J=8,1 Hz, 1H), 3,25(d, J=9,3 Hz, 1H), 3,00(dd, J1=8,4 Hz, J2=18,0 Hz, 1H), 2,77(dd, J1=2,1 Hz, J2=15,9 Hz, 1H), 2,68(d, J=18,6 Hz, 1H), 2,30(s, 3H), 2,28(s, 3H), 2,22(s, 3H), 2,00(s, 3H), 1,75(dd, J1=11,4 Hz, J2=15,9 Hz, 1H), 0,69(d, J=6,3 Hz, 3H).

PL 203 745 B1 ¹³C NMR (75 MHz, CDCI3) δ 170,1, 168,6, 156,0, 147,0, 144,6, 143.0, 140,6, 140,4, 131,0,

129.4, 120,9, 120,7, 117,6, 116,8, 112,4, 112.1, 101,6, 60,5, 59,0, 57,1, 56,3, 55,6, 55,2, 48,7, 41,6,

39.4, 26,5, 24,9, 20,2, 17,8, 15,4, 9,2.

ESI-MS m/z obliczono dla C33H36F3N5O8: 687,63; znaleziono (M+H)⁺: 688,66.

P r z y k ł a d 48

54

Do roztworu 19 (11 mg, 0,0169 mmol) w CH2CI2 (0,2 ml) dodano w 23°C bezwodnik trifluorooctowy (2,38 μl 0,0169 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 5 godzin, po czym roztwór rozcieńczono CH2CI2 (5 ml) i przemyto 0,1 N HCI (3 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono, a rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2) heksan:octan etylu 3:2) uzyskując 54 (10,7 mg, 93%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,6 (octan etylu:metanol 5:1).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 7,33(d, J=6,3 Hz, 1H), 6,45(s, 1H), 6,04(m, 1H), 5,95(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,84(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,32(m, 2H), 5,21(m, 1H), 4,11(m, 4H), 3,73(s, 3H), 3,64(m, 2H), 3,51(m, 1H), 3,37(d, J=7,8 Hz, 1H), 3,22(m, 2H), 3,03(dd, 1H, J1=8,1 Hz, J2=18,3 Hz, 1H), 2,60(d, J=18,3 Hz, 1H), 2,29(s, 3H), 2,24(s, 3H), 2,08(s, 3H), 1,86(dd, J1=12 Hz, J2=16,2 Hz, 1H), 0,82(d, J=7,2 Hz, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3) δ 170,0, 156,0, 148,4, 147,1, 144,3, 143,0, 138,7, 133,8, 130,5,

129,4, 120,6, 120,4, 117,6, 117,5, 117,0, 113,5, 112,5, 112,4, 101,1, 74,1, 66,8, 60,4, 59,3, 56,9, 56,6, 56,3, 55,4, 48,7, 41,6, 40,1, 26,2, 25,0, 17,6, 15,4, 9,1.

ESI-MS m/z: obliczono dla C35H39F3N5O7: 685,69; znaleziono (M+H)⁺: 686,3.

P r z y k ł a d 49

Me O Me O

55

Do roztworu 54 (100 mg, 0,415 mmol) w CH₂CI₂ (4 ml), dodano kwas octowy (40 gl) (PPh₃)₂PdCI₂ (8,4 mg, 0,012 mmol) i Bu₃SnH (157 gl, 0,56 mmol) w 23°C. Mieszaninę reakcyjną mieszano w tej temperaturze przez 2 godziny, po czym reakcję naniesiono na kolumnę typu flash (SiO2, gradient heksan do 2:1 heksan:octan) i uzyskano 55 (90 mg, 96%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,6 (heksan:octan etylu 1:2).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 7,55(d, J=7,2 Hz, 1H), 6,45(s, 1H), 5,90(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,82(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,37(t, J=6,0 Hz, 1H), 4,15(d, J=2,1 Hz, 1H), 4,04(d, J=1,8 Hz, 1H), 3,70(s, 3H), 3,66-3,53(m, 2H), 3,37-3,31(m, 2H), 3,19-3,15(d, J=11,7 Hz, 1H), 3,08-3,00(m, 2H), 2,56(d, J=18,3 Hz, 1H), 2,30(s, 3H), 2,24(s, 3H), 2,04(s, 3H), 1,91(dd, J1=12,0 Hz, J2 =15,6 Hz, 1H), 0,84(d, J=6,9 Hz, 3H).

PL 203 745 B1 ¹³C NMR (75 MHz, CDCI3) δ 170,1, 156,3, 147,3, 144,9, 144,4, 143,3, 136,7, 130,7, 129,3, 120,6, 117,6, 117,4, 114,4, 112,1, 107,7, 101,0, 85,8, 60,5, 59,3, 56,5, 56,4, 56,2, 55,2, 48,9, 41,6,

40,9, 25,7, 25,3, 18,0, 15,6, 8,7.

ESI-MS m/z: obliczono dla C32H35F3N5O7: 645,63; znaleziono (M+H)⁺: 646,2.

Do roztworu 17 (200 mg, 0,288 mmol) w CH2CI2 (1,44 ml) dodano w 23°C kwas trifluorooctowy (888 μ|, 11,53 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 4 godziny w 23°C. Reakcję potraktowano w 0°C nasyconym wodnym kwaśnym węglanem sodu (60 ml) i ekstrahowano octanem etylu (2 x 70 ml). Połączone warstwy organiczne wysuszono nad siarczanem sodu i zatężono w próżni uzyskując 56 (147 mg, 93%) w postaci białego ciała stałego, które użyto w następnej reakcji bez da|szego oczyszczania.

Rf: 0,19 (octan ety|u:metano| 5:1).

¹H NMR (300 MHz, CD3OD), δ 6,48(s, 1H), 5,88(d, J=0,9 Hz, 1H), 5,81(d, J=0,9 Hz, 1H), 4,35(d, J=2,4 Hz, 1H), 4,15(d, J=1,8 Hz, 1H), 3,99-3,98(m, 1H), 3,70(s, 3H), 3,52-2,96(m, 7H), 2,68(d, J=18,3 Hz, 1H), 2,24(s, 3H), 2,23(s, 3H), 2,06(s, 3H), 1,85(dd, J1=11,7 Hz, J2=15,6 Hz, 1H), 0,91(d, J=6,6 Hz, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CD3OD): δ 173,2, 149,1, 145,6, 144,9, 138,0, 132,2, 130,6, 121,4, 119,6,

117,4, 114,3, 109,2, 102,5, 82,3, 60,4, 58,4, 58,3, 57,8, 56,6, 50,1, 42,3, 41,6, 27,8, 26,2, 19,5, 15,5, 9,8.

ESI-MS m/z: ob|iczono d|a C29H35N5O6: 549,62; zna|eziono (M+H)⁺: 550,3.

P r z y k ł a d 51
OH	OMe HO.Y Me Xj	OH	OMe HCkJ\^Me J ¥
Me-^^L i ii	/ΖΥτ N-Me	C6H5NCS, CH2C12 \ li	^Tr^N-jMe
AJ		1,5h, 23 °C θ'Υ
o T	A -	\-0	* CN
o	CN NH oA^nh2 Me 56	NH ęzsk^NHCSNHPh Me 57

Do roztworu 56 (10 mg, 0,018 mmo|) w CH2CI2 dodano izotiocyjanian feny|u (13 μ| 0,109 mmo|) i mieszano w 23°C przez 1,5 godz. Mieszaninę reakcyjną zatężono w próżni, a pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii ko|umnowej typu f|ash (SiO2, gradient heksan do 1:1 heksan:octan ety|u) i otrzymano 57 (8 mg, 65%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,57 (octan ety|u:metano| 10:1).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 7,88(bs, 1H), 7,41-7,36(m, 2H), 7,27-7,22(m, 1H), 7,02-7,00(d, J=7,8 Hz, 2H), 6,71 (d, J=7,2 Hz, 1H), 6,31(s, 1H), 6,17(bs, 1H), 5,93(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,83(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,55(bs, 1H), 5,20-5,17(m, 1H), 4,16(d, J=1,8 Hz, 1H), 4,05(bs, 1H), 4,02(d, J=2,4 Hz, 1H), 3,79(s, 3H), 3,75-3,71 (m, 1H), 3,35(d, J=7,8 Hz, 1H), 3,28-3,19(m, 2H), 3,12-2,97(m, 2H), 2,50(d,

PL 203 745 B1

J=18,3 Hz, 1H), 2,32(s, 3H), 2,21(s, 3H), 2,15-2,09(dd, J1=11,4 Hz, J2=15,9 Hz, 1H), 1,95(s, 3H), 0,88(d, J=6,9 Hz, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3): δ 178,5, 171,7, 147,2, 145,0, 144,3, 143,3, 137,0, 135,7, 130,6,

130,4, 129,6, 127,5, 124,3, 120,6, 117,7, 117,2, 115,3, 112,1, 108,3, 100,9, 60,9, 59,5, 56,7, 56,5,

56,2, 55,2, 54,1, 41,7, 41,1, 26,3, 25,4, 18,5, 15,8, 9,0.

ESI-MS m/z: obliczono dla C36H40N6O6S: 684,81; znaleziono (M+H)⁺: 685,3.

P r z y k ł a d 52

Do roztworu 57 (45 mg, 0,065 mmol) w CH2CI2 (0,5 ml) dodano w 0°C chlorek acetylu (4,67 pl 0,065 mmol) i pirydynę (5,3 pl, 0,065 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 3 godz., po czym roztwór rozcieńczono CH2CI2 (10 ml) i przemyto 0,1 N HCI (5 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono, a rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (RP-18, CH3CN:H2O 40:60) uzyskując 58 (14 mg, 28%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,34 (CH3CN:H2O 7:15).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3). δ 11,90(d, J=6,6 Hz, 1H), 7,45-7,40(m, 3H), 7,18-7,15(m, 2H), 6,58(s, 1H), 6,00(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,89(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,70(s, 1H), 5,37(t, J=4,8Hz, 1H), 4,48(m, 1H), 4,23(bs, 1H), 4,07(bs, 2H), 3,85-3,75(m, 1H), 3,70(s, 3H), 3,46-3,41 (m, 2H), 3,24-3,20(m, 1H), 3,00-2,95(m, 1H), 2,87-2,75(m, 1H), 2,31 (s, 3H), 2,28(s, 3H), 2,24(s, 3H), 2,00(s, 3H), 1,85(dd, J1=11,4 Hz, J2=15,6 Hz, 1H), 1,66(s, 3H), 0,82(d, J=6,0 Hz, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3): δ 182,6, 174,3, 171,0, 146,6, 144,6, 142,7, 142,3, 140,7, 140,2, 131,3, 129,8, 129,3, 128,9, 128,8, 121,5, 120,4, 117,3, 116,6, 112,8, 112,0, 111,3, 101,5, 60,5, 59,0, 57,6, 56,2, 55,9, 55,3, 55,1, 41,6, 39,4, 27,8, 26,5, 24,8, 20,2, 17,1, 15,5, 9,3.

ESI-MS m/z: obliczono dla C40H44N6O8S: 768,88; znaleziono (M+H)⁺: 769.2.

P r z y k ł a d 53

Do roztworu 57 (130 mg, 0,189 mmol) w dioksanie (1 ml) dodano 5,3N HCI w dioksanie (1,87 ml) i reakcję mieszano w 23°C przez 4 godziny. Następnie do roztworu dodano CH2CI2 (15 ml) i H2O (10 ml), a warstwę organiczną zdekantowano. Warstwę wodną zaalkalizowano nasyconym wodnym roztworem kwaśnego węglanu sodu (60 ml) (pH=8) w 0°C, po czym ekstrahowano octanem etylu (2 x 50 ml). Połączone ekstrakty organiczne wysuszono (siarczan sodu) i zatężono w próżni uzyskując 59 (63 mg, 70%) w postaci białego ciała stałego.

PL 203 745 B1

Rf: 0,15 (octan etylu:metanol 5:1).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3), δ 6,67(s, 1H), 5,99(d, J=0,9 Hz, 1H), 5,91(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,10(bs, 1H), 4,32(d, J=7,2 Hz, 1H), 4,25(dd, J1=3,6 Hz, J2=9,3 Hz, 1H), 3,7(s, 3H), 3,71-3,64(m, 2H), 3,50(dd, J1=2,4 Hz, J2=15,9 Hz, 1H), 3,42-3,37(m, 2H), 3,16(dd, J1=3,6 Hz, J2=12,9 Hz, 1H), 2,57(dd, J1=9,3 Hz, J2=12,9 Hz, 1H), 2,27(s, 3H), 2,11(s, 3H), 1,91(dd, J1=12,0 Hz, J2=15,9 Hz, 1H).

ESI-MS m/z: obliczono dla C26H3ON4O5: 478,5; znaleziono (M+H)⁺:

P r z y k ł a d 54

Do roztworu 43 (20 mg, 0,0338 mmol) w CH2CI2 (0,3 ml) dodano w 0°C chlorek cynamoilu (5,63 gl, 0,0338 mmol) i pirydynę (2,73 gl, 0,0338 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godz., po czym roztwór rozcieńczono CH2CI2 (10 ml) i przemyto 0,1 N HCI (5 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono, a rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, EtOAc:MeOH 20:1) uzyskując 60 (22 mg, 90%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,56 (EtOAc:MeOH 5:1).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 7,51 (s, 1H), 7,50-7,47(m, 2H), 7,36-7,35(m, 2H), 6,43(s, 1H), 6,36(brd, J=15,9 Hz, 2H), 6,01(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,90(brd, J=1,5 Hz, 2H), 5,42(t, J=6,0 Hz 1H), 4,12-4,07(m, 3H), 3,96-3,95(m, 1H), 3,73(bs, 3H), 3,58(bs, 2H), 3,39(d, J=8,7 Hz, 1H), 3,25(d, J=11,7 Hz, 1 H), 3,0(dd, J1= 7,5 Hz, J2=17,7 Hz, 1H), 2,78(d, J=15,9Hz, 1H), 2,67(d, J=16,5 Hz, 1H), 2,29(s, 6H), 2,23(s, 3H), 1,99(s, 3H), 1,82(dd, J1=11,4 Hz, J2=15,6 Hz, 1H), 0,83(d, J=6,0 Hz, 3H).

¹³C NMR (75MHz, CDCI3): δ 172,0, 165,0, 146,9, 144,6, 143,1, 141,0, 140,5, 134,8, 131,0,

129,7, 129,1, 128,8, 127,8, 125,5, 123,8, 123,0, 121,1, 120,5, 117,7, 116,9, 112,8, 112,0, 101,9, 60,6,

59,2, 57,1, 56,4, 55,9, 55,3, 48,8, 41,7, 40,0, 26,5, 25,1, 20,3, 18,5, 15,7, 9,3.

ESI-MS m/z: obliczono dla C40H43N5O8: 721,8; znaleziono (M+H)⁺:722,3.

P r z y k ł a d 55

Do roztworu 45 (19 mg, 0,0364 mmol) w CH2CI2 (0,3 ml) dodano w 0°C chlorek heptafluorobutyrylu (5,44 gl, 0,0364 mmol) i pirydynę (2,95 gl, 0,0364 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godz., po czym roztwór rozcieńczono CH2CI2 (10 ml) i przemyto 0,1 N HCI (5 ml).

Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono, a rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, EtOAc:MeOH 20:1) uzyskując 61 (11,7 mg, 45%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,76 (EtOAc:MeOH 5:1).

PL 203 745 B1 ¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 6,46(s, 1H), 6,12(bs, 1 H), 5,98(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,93(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,72(bs, 1H), 4,13-4,11(m, 2H), 4,0(d, J=2,4 Hz, 1H), 3,98-3,96(m, 1H), 3,73(s, 3H), 3,39(d, J=7,5 Hz, 1H), 3,39-3,28(m, 2H), 3,09(dd, J1=8,1 Hz, J2=18,0 Hz, 1H), 2,80(d, J=16,2 Hz, 1H), 2,46(d, J=18,3 Hz, 1H), 2,32(s, 6H), 2,21(s, 3H), 1,99(s, 3H), 1,80(dd, J1=12,0 Hz, J2=16,2 Hz, 1H).

ESI-MS m/z: obliczono dla C32H31F7N5O7: 716,6; znaleziono (M+H)⁺: 717,2.

P r z y k ł a d 56

Do roztworu 43 (24 mg, 0,04 mmol) w CH2CI2 (0,3 ml) dodano w 0°C chlorek butyrylu (4,15 gl, 0,04 mmol) i pirydynę (3,28 0,04 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godz., po czym roztwór rozcieńczono CH2CI2 (10 ml) i przemyto 0,1 N HCI (5 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono, a rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, EtOAc:MeOH 20:1) uzyskując 62 (24 mg, 90%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,35 (EtOAc:MeOH 5:1).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 6,47(s, 1H), 6,10(d, J=6,5 Hz, 1H), 6,0(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,91(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,86(bs, 1H), 5,31(d, J=6,9 Hz, 1H), 4,11-4,06(m, 3H), 3,85-3,81(m, 1H), 3,75(s, 3H), 3,59-3,53(m, 2H), 3,38(d, J= 7,5 Hz, 1H), 3,27-3,22(m, 1H), 3,0(dd, J1= 7,8 Hz, J2=17,4 Hz, 1H), 2,79(6, J=15,3 Hz, 1H), 2,63(d, J=17,1 Hz, 1H), 2,31(s, 3H), 2,0(s, 3H), 1,80(dd, J1=12,0 Hz, J2=15,9 Hz, 1H), 1,58(q, J=7,2 Hz, 2H), 0,89(t, J=7,2 Hz, 3H), 0,76(d, J=6,6 Hz, 3H).

ESI-MS m/z: obliczono dla C35H43N5O8: 661,64; znaleziono (M+H)⁺: 662,3.

P r z y k ł a d 57

OMe

Do roztworu 43 (19 mg, 0,0364 mmol) w CH2CI2 (0,3 ml) dodano w 0°C chlorek cynamoilu (6,06 mg, 0,0364 mmol) i pirydynę (2,95 gl, 0,0364 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godz., po czym roztwór rozcieńczono CH2CI2 (10 ml) i przemyto 0,1 N HCI (5 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono, a rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, EtOAc:MeOH 20:1) uzyskując 63 (20,1 mg, 85%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,65 (EtOAc:MeOH 5:1).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 7,39-7,29(m, 5H), 6,42,(s, 1H), 6,01 (d, J=1,5 Hz, 1H), 5,92(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,73(bs, 1H), 5,24(t, J=6,8 Hz, 1H), 4,12-4,08(m, 3H), 3,66-3,64(m, 2H), 3,58(bs, 3H), 3,36(d, J=8,7 Hz, 1H), 3,29(d, J=12,0 Hz, 1H), 2,98(dd, J1=8,1 Hz, J2=18 Hz, 1H), 2,33(s, 6H), 2,29(s, 3H), 2,01 (s, 3H), 1,84(dd, J1=12,0 Hz, J2=15,9 Hz, 1H).

ESI-MS m/z: obliczono dla C37H38N4O7: 650,72; znaleziono (M+H)⁺: 651,2.

PL 203 745 B1

P r z y k ł a d 58

Do roztworu 43 (20 mg, 0,0338 mmol) w CH2CI2 (0,3 ml) dodano w 0°C chlorek 3-chloropropionylu (3,22 gl, 0,0338 mmol) i pirydynę (2,73 g|, 0,0338 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godzinę, po czym roztwór rozcieńczono CH2CI2 (10 ml) i przemyto 0,1 N HCI (5 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono, a rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, EtOAc:MeOH 20:1) uzyskując 64 (20,5 mg, 89%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,32 (EtOAc:heksan 5:1).

¹H NMR (300 MHz, CDC|3) 6,48(s, 3H), 6,28(m, 1H), 5,99(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,91 (d, J=1,2 Hz, 1H), 5,86(bs, 1H), 5,31 (m, 1H), 4,08-4,07(m, 3H), 3,75(S, 3H), 3,72-3,53(m, 5H), 3,39(d, J=8,1 Hz, 1H), 3,24(d, J=12,0 Hz, 1H), 3,00(dd, J1= 8,1 Hz, J2=18,0 Hz, 1H), 2,79(d, J=13,5 Hz, 1H), 2,50(t, J=6,3 Hz, 2H), 2,32(s, 3H), 2,28(s, 3H), 2,25(s, 3H), 2,0(s, 3H), 1,79(dd, J1=12,3 Hz, J2=14,8 Hz, 1H), 0,81 (d, J=6,3 Hz, 3H).

P r z y k ł a d 59

Do roztworu 43 (19 mg, 0,0364 mmol) w CH₂CI₂ (0,3 ml) dodano w 0°C chlorek butyrylu (3,78 gl, 0,0364 mmol) i pirydynę (2,95 gl, 0,0364 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godz., po czym roztwór rozcieńczono CH2C|2 (10 ml) i przemyto 0,1 N HC| (5 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono, a rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, EtOAc:MeOH 20:1) uzyskując 64 (19 mg, 87%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,6 (EtOAc:MeOH 5:1).

¹H NMR (300 MHz, CDC|3), 5,01(t, J=6,4 Hz, 1H), 4,10-4,09(171, 1H), 4,06(d, J=2,1 Hz, 1H), 4,03-4,02(m, 1H), 3,76(s, 3H), 3,67-3,60(m, 1H), 3,42-3,35(m, 2H), 3,29(d, J=12,0 Hz, 1H), 3,02(dd, J1=7,8 Hz, J2=17,7 Hz, 1H), 2,79(d, J=14,1 Hz,) 6,50(s, 1H), 5,98(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,91(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,75(s, 1H), 2,56(d, J=18,3 Hz, 1H), 2,32(s, 3H), 2,31(s, 3H), 2,25(s, 3H), 1,78(dd, J1=12,0 Hz, J2=15,9 Hz, 1H), 1,63(s, 3H), 1,53-1,46(171, 2H), 1,28-1,16(m, 2H), 0,68(t, J=7,2 Hz, 3H).

ES|-MS m/z: obliczono dla C32H38N4O7: 590,67; znaleziono (M+H)⁺: 591,2.

PL 203 745 B1

P r z y k ł a d 60

Do roztworu 50 (31,7 mg, 0,044 mmola) w CH3CN/H2O (1,5 ml/0,5 ml) dodano AgNO3 (225 mg, 1,32 mmola) i reakcję mieszano w 23°C przez 17 godzin. Następnie dodano w 0°C solankę (10 ml) i wodny nasycony NaHCO3 (10 ml), i mieszaninę mieszano przez 15 minut, przesączono przez warstwę celitu i przemyto CH2CI2 (20 ml). Roztwór zdekantowano, a warstwę organiczną wysuszono i zatężono w próżni. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, EtOAc:MeOH 5:1) uzyskując 66 (16 mg, 51%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,26 (EtOAc:MeOH 5:1).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 7,66-7,42(m, 4H), 7,20(bs, 1H), 6,44(s, 1H), 5,97(b, J=1,2 Hz, 1H), 5,90(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,76(bs, 1H), 5,28(bs, 1H), 4,54(bs, 1H), 4,43(bs, 1H), 4,00(bs, 1H), 3,683,57(m, 4H), 3,47(d, J=3,3 Hz, 1H), 3,40(d, J=11,7 Hz, 1H), 3,17(d, J=6,9 Hz, 1H), 2,92(dd, J1=8,1 Hz, J2=17,7 Hz, 1H), 2,74(d, J=17,1 Hz, 1H), 2,48(d, J=18,6 Hz, 1H), 2,32(s, 6H), 2,28(s, 3H), 1,99(s, 3H), 1,76(dd, J1=12,0 Hz, J2=16,2 Hz, 1H).

ESI-MS m/z: obliczono dla C37H38F3N3O8: 709; znaleziono (M-17)⁺:

P r z y k ł a d 61

Do roztworu 53 (57 mg, 0,0828 mmola) w CH3CN/H2O (1,5 ml/0,5 ml) dodano AgNO3 (650 mg, 3,81 mmola) i reakcję mieszano w 23°C przez 24 godziny. Następnie dodano w 0°C solankę (10 ml) i wodny nasycony NaHCO3 (10 ml), mieszaninę mieszano przez 15 minut, przesączono przez warstwę celitu i przemyto CH2CI2 (20 ml). Roztwór zdekantowano, a warstwę organiczną wysuszono i zatężono w próżni. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, EtOAc:MeOH 5:1) uzyskując 67 (28 mg, 50%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,28 (EtOAc:MeOH 10:1).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 6,47(s, 1H), 5,97(s, 1H), 5,88(s, 1H), 5,35(bs, 1H), 4,51(bs, 1H), 4,41(bs, 1H), 4,12-4,05(m, 1H), 4,00(d, J=2,7 Hz, 1H), 3,77(s, 3H), 3,64(bs, 1H), 3,46(d, J=3,3 Hz, 1H), 3,34(d, J=11,4 Hz, 1H), 3,18(d, J=1,5 Hz, 1H), 2,95(dd, J1=8,4 Hz, J2=18,3 Hz, 1H), 2,70(d, J=15,6 Hz, 1H), 2,48(d, J=17,7 Hz, 1H), 2,28(s, 3H), 2,27(s, 3H), 2,26(s, 3H), 1,98(s, 3H), 1,68(dd, J1=12 Hz, J2=15,6 Hz, 1H), 0,86(d, J=6,3 Hz, 3H).

ESI-MS m/z: obliczono dla C32H37F3N4O9: 678,66; znaleziono (M⁺-17): 661,2.

PL 203 745 B1

P r z y k ł a d 62

OMe OMe

Do roztworu 48 (32 mg, 0,0529 mmola) w CH3CN/H2O (1,5 ml/0,5 ml) dodano AgNO3 (270 mg, 1,58 mmola) i reakcję mieszano w 23°C przez 24 godz. Następnie dodano w 0°C solankę (10 ml) i wodny nasycony NaHCO3 (10 ml), mieszaninę mieszano przez 15 minut, przesączono przez warstwę celitu i przemyto CH2CI2 (20 ml). Roztwór zdekantowano, a warstwę organiczną wysuszono i zatężono w próżni. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, EtOAc:MeOH 5:1) uzyskując 68 (18 mg, 56%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,40 (EtOAc:MeOH 5:1).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 6,50(s, 1H), 5,95(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,88(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,23(d, J=6,9 Hz, 1H), 4,45(d, J=3,3 Hz, 1H), 4,38(s, 1H), 4,01 (d, J=2,4 Hz, 1H), 3,78(m, 1H), 3,77(s, 3H), 3,41-3,37(m, 1H), 3,17-3,15(m, 1H), 2,96(dd, J1=7,8 Hz, J2=18,0 Hz, 1H), 2,70(d, J=15,3 Hz, 1H), 2,40(d, J=18,0 Hz, 1H), 2,30(s, 6H), 2,27(s, 3H), 1,76-1,65(m, 1H), 1,35-1,25(m, 2H), 0,89-0,82(m, 1H), 0,69(d, J=6,6 Hz, 3H), 0,58(d, J=6,6 Hz, 3H).

P r z y k ł a d 63

OMe OMe

Do roztworu 51 (27 mg, 0,04 mmola) w CH3CN/H2O (1,5 ml/0,5 ml) dodano AgNO3 (204 mg, 1,19 mmola) i reakcję mieszano w 23°C przez 24 godz. Następnie dodano w 0°C solankę (10 ml) i wodny nasycony NaHCO3 (10 ml), mieszaninę mieszano przez 15 minut, przesączono przez warstwę celitu i przemyto CH2CI2 (20 ml). Roztwór zdekantowano, a warstwę organiczną wysuszono i zatężono w próżni. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, EtOAc:MeOH 5:1) uzyskując 69 (10 mg, 38%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,38 (EtOAc:MeOH 5:1).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 6,48(s, 1H), 6,16(bs, 1H), 5,98(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,89(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,33(t, J=6,0 Hz, 1H), 4,50(m, 1H), 4,40(m, 1H), 4,11-4,09(m, 1H), 4,00(d, J=2,6 Hz, 1H), 3,78(s, 3H), 3,41-3,32(m, 3H), 3,18(d, J=8,4 Hz, 1H), 2,94(dd, J1=8,4 Hz, J2=18,3 Hz, 1H), 2,70(d, J=14,4 Hz, 1H), 4,45(d, J=18,3 Hz, 1H), 2,31(s, 3H), 2,28(s, 3H), 2,27(s, 3H), 2,04(s, 3H), 2,00-1,86(m, 3H), 1,73(m, 1H), 0,87(d, J=6,3 Hz, 6H).

PL 203 745 B1

P r z y k ł a d 64

Do roztworu 63 (15 mg, 0,023 mmola) w CH3CN/H2O (1,5 ml/0,5 ml) dodano AgNO3 (118 mg, 0,691 mmola) i reakcję mieszano w 23°C przez 24 godziny. Następnie dodano w 0°C solankę (10 ml) i wodny nasycony NaHCO3 (10 ml), mieszaninę mieszano przez 15 minut, przesączono przez warstwę celitu i przemyto CH2CI2 (20 ml). Roztwór zdekantowano, a warstwę organiczną wysuszono i zatężono w próżni. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, EtOAc:MeOH 5:1) uzyskując 70 (20,1 mg, 85%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,43 (EtOAc:MeOH 5:1).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 7,38-7,28(m, 5H), 6,48(s, 1H), 5,98(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,91 (d, J=1,5 Hz, 1H), 5,75(bs, 1H), 5,38(brd, 1H), 5,30(bs, 1H), 4,53(m, 1H), 4,42(m, 1H), 4,02(d, J=2,1 Hz, 1H), 3,78-3,65(m, 5H), 3,46-3,40(m, 2H), 3,17(d, J=7,8 Hz, 1H), 2,94(dd, J1=7,8 Hz, J2=17,7 Hz, 1H), 2,73(d, J=16,8 Hz, 1H), 2,45(d, J=18,0 Hz, 1H), 2,31(s, 6H), 2,28(s, 3H), 1,97(s, 3H), 1,77(dd, J1=12,0 Hz, J2=15,3 Hz, 1H).

P r z y k ł a d 65

Do roztworu 65 (25 mg, 0,042 mmola) w CH3CN/H2O (1,5 ml/0,5 ml) dodano AgNO3 (215,56 mg, 1,269 mmola) i reakcję mieszano w 23°C przez 17 godzin. Następnie dodano w 0°C solankę (10 ml) i wodny nasycony NaHCO3 (10 ml), mieszaninę mieszano przez 15 minut, przesączono przez warstwę celitu i przemyto CH2CI2 (20 ml). Roztwór zdekantowano, a warstwę organiczną wysuszono i zatężono w próżni. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, EtOAc:MeOH 5:2) uzyskując 71 (16 mg, 65%) w postaci białego ciała stałego.

Rf: 0,0,5 (EtOAc:MeOH 5:2).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 6,50(s, 1H), 5,95(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,78(s, 1H), 5,19(bs, 1H), 4,45(d, J=3,3 Hz, 1H), 4,37(bs, 1H), 4,11(brd, J=4,8 Hz, 1H), 4,01(d, J=2,1 Hz, 1H), 3,76(s, 1H), 3,71-3,69(m, 1H), 3,49-3,35(m, 1H), 3,24(d, J=13,5 Hz, 1H), 3,15(d, J=9,3 Hz, 1H), 2,95(dd, J1=8,1 Hz, J2=17,7 Hz, 1H), 2,70(d, J=15,6 Hz, 1H), 2,40(d, J=18,0 Hz, 1H), 2,31(s, 3H), 2,29(s, 3H), 2,26(s, 3H), 1,96(s, 3H), 1,75-1,66(m, 1H), 1,52-1,17(m, 2H), 0,66(t, J=7,2 Hz, 3H).

Procedury fermentacyjne

P r z y k ł a d A

Środowisko posiewowe YMP3 zawierające 1% glukozy, 0,25% ekstraktu bydlęcego, 0,5% bakto-peptonu, 0,25% NaCI, 0,8% CaCO3 zaszczepiono 0,1% zamrożonym, wegetatywnym szczepem muzealnym mikroorganizmu A2-2 Pseudomonas fluorescens i inkubowano na wytrząsarce rotacyjnej

PL 203 745 B1 (250 obr./min) w 27°C. Po 30 godzinach inkubowania hodowlę posiewową dodano do fermentora z mieszadłem ze środowiskiem hodowlanym złożonym z 2% dekstrozy, 4% mannitolu, 2% suszonych drożdży piwnych (Vitalevor® Biolux, Belgia), 1% (NH4)2SO4, 0,04% K2HPO4; 0,8 KCI; 0,001% FeCI3, 0,1% L-tyr, 0,8% CaCO3, 0,05% PPG-2000, 0,2% silikonu przeciw pienieniu się (ASSAF-100, RHODIA UK). Sterylizację prowadzono w 122°C przez 30 minut. Objętość zaszczepiona stanowiła 2% (obj./obj.). Temperatura wynosiła 27°C (0 do 16 godz.) i 24°C od 16-tej godziny do końca procesu (41 godz.). Ciśnienie rozpuszczonego tlenu przekraczało 25%. pH utrzymywano przy 6,0 za pomocą rozcieńczonego kwasu siarkowego od 28 godziny do końca procesu. Nadciśnienie wynosiło 0,5 bara. 1% mannitolu lub sorbitolu dodawano od 16 godz. do końca procesu (przez dwa dni kolejne) i 2% przez trzy dni procesu fermentacyjnego.

Po 41 lub 64 godz. bulion fermentacyjny musi zostać wyekstrahowany aby wyizolować safracynę B, lub sklarowany bulion musi być poddany obróbce KCN w celu wyizolowania cyjanosafracyny B.

P r z y k ł a d B

Otrzymywanie cyjanosfracyny B z surowego ekstraktu.

Klarowanie lub filtracja bulionu fermentacyjnego przy pH 6 usuwa ciała stałe. Sklarowany bulion jest korygowany do pH 9,5 za pomocą rozcieńczonego wodorotlenku sodu i ekstrahowany dwukrotnie 2:1 (obj./obj.) octanem etylu, chlorkiem metylenu lub octanem butylu. Ekstrakcje przeprowadza się w naczyniu z mieszaniem w trakcie 20 min, utrzymując temperaturę mieszaniny w 8 do 10°C. Dwie fazy rozdzielono za pomocą wirówki ciecz-ciecz. Fazę organiczną wysuszono bezwodnym siarczanem sodu lub zamrażając i odfiltrowując lód. Fazę organiczną (warstwę octanu etylu) odparowano otrzymując oleisty surowy ekstrakt.

P r z y k ł a d C

Otrzymywanie cyjanosafracyny B z klarowanego bulionu

Klarowanie lub filtracja bulionu fermentacyjnego o pH 6 usuwa ciała stałe. Sklarowany bulion skorygowano do pH 3,9 za pomocą stężonego kwasu octowego. Dodano 0,5 grama KCN na litr sklarowanego bulionu i inkubowano w 20°C przez 1 godzinę, mieszając. Następnie temperaturę obniżono do 15°C, pH skorygowano do 9,5 za pomocą rozcieńczonego wodorotlenku sodu i ekstrahowano 2:1,5 (obj./obj.) octanem etylu. Ekstrakcję prowadzono w naczyniu z mieszadłem przez 20 minut, utrzymując temperaturę mieszaniny w 8 do 10°C. Dwie fazy rozdzielono za pomocą wirówki ciecz-ciecz. Fazę organiczną wysuszono bezwodnym siarczanem sodu. Fazę tę (warstwę octanu etylu) odparowano uzyskując oleisty surowy ekstrakt. Ekstrakt ten oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, gradient 20:1 do 10: do 5:1 octan etylu:metanol) uzyskując ilościowo związek 2 w postaci jasnożółtego ciała stałego.

Rf: 0,55 (octan etylu:metanol 5:1); tR=19,9 min [HPLC, Delta Pack C4, 5 gm, 300 A, 150x3 mm, X=215 nm, przepływ 0,7 ml/min, temp. = 50°C, gradient: CH3CN-aq, NaOAc (10mM) 85%-70% (20')];

¹H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 6,54(dd, J1=4,4 Hz, J2=8,4 Hz, 1H), 6,44(s, 1H), 4,12(d, J=2,4 Hz, 1H), 4,04(d, J=2,4 Hz, 1H), 4,00(s, 3H), 3,87(bs, 1H), 3,65(ddd, J1=1,5 Hz, J2=8,7 Hz, J3=9,9 Hz, 1H), 3,35(br d, J=8,4 Hz, 1H), 3,15-2,96(m, 4H), 2,92(q, J=7,2 Hz, 1H), 2,47(d, J=18,3 Hz, 1H), 2,29(s, 3H), 2,18(s, 3H) 1,83(s, 3H), 1,64(ddd, J1=2,7 Hz, J2=11,1 Hz, J3=14,1 Hz, 1H), 0,79(d, J=7,2 Hz, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3): δ 186,0 (q), 175,9 (q), 156,2 (q), 146,8 (q), 142,8 (q), 140,7 (q), 136,6 (q), 130,5 (q), 128,8 (q), 127,0 (q), 120,5 (s), 117,4 (q), 116,5 (q), 60,8 (t), 60,4 (s), 58,7(t), 56,2 (s) , 55,7 (s), 54,8 (s), 54,8 (s), 54,4 (s), 50,0 (s), 41,6 (t), 39,8 (d), 25,2 (d), 24,4 (d), 21,2 (t), 15,5 (t) ,8,4 (t).

ESI-MS m/z: obliczono dla C29H35N5O6: 549,6; znaleziono (M+Na)⁺: 572,3.

P r z y k ł a d D

Środowisko (50 I) złożone z dekstrozy (2%), mannitolu (4%), suchych drożdży piwnych (2%), siarczanu amonu (1%), fosforanu dipotasowego (0,04%), chlorku potasu (0,8%), heksahydratu chlorku żelaza(lll) (0,001%), L-tyrozyny (0,1%), węglanu wapnia (0,8%), glikolu polipropylenowego 2000 (0,05%) i środka przeciwpieniącego ASSAF 1000 (0,2%) umieszczono w naczyniu fermentacyjnym o pojemności 75 I i po sterylizacji zaszczepiono hodowlą posiewową (2%) szczepu A2-2 (FERM BP-14), i hodowano z napowietrzaniem, mieszając, w 27°C do 24°C przez 64 godziny (napowietrzanie 75 I na minutę i mieszanie od 350 do 500 obr./min). pH kontrolowano poprzez automatyczne dodawanie rozcieńczonego kwasu siarkowego od 27 godziny do końca procesu. 2% mannitolu dodawano od 16 godziny do końca procesu. Uzyskane środowisko hodowlane (45 I), po usunięciu komórek drogą wirowania, skorygowano do pH 9,5 rozcieńczonym wodorotlenkiem sodu, ekstrahowano dwukrotnie 25 litrami octanu etylu. Mieszaninę przeniesiono do naczynia z mieszaniem na 20 minut w 8°C. Dwie fazy rozdzielono za pomocą wirówki ciecz-ciecz. Fazy organiczne zamrożono w -20°C i przesączono w celu usunięcia

PL 203 745 B1 lodu, a następnie odparowano uzyskując 40 g ciemnego oleistego surowego ekstraktu. Po wprowadzeniu grupy cyjankowej i oczyszczeniu, otrzymano 3,0 g cyjanosafracyny B.

P r z y k ł a d E

Środowisko (50 |) złożone z dekstrozy (2%), mannitolu (4%), suchych drożdży piwnych (2%), siarczanu amonu (1%), fosforanu dipotasowego (0,02%), chlorku potasu (0,2%), heksahydratu chlorku żelaza(lll) (0,001%), L-tyrozyny (0,1%), węglanu wapnia (0,8%), glikolu polipropylenowego 2000 (0,05%) i środka przeciwpieniącego ASSAF 1000 (0,2%) umieszczono w naczyniu fermentacyjnym o pojemności 75 | i po sterylizacji zaszczepiono hodowlą posiewową (2%) szczepu A2-2 (FERM BP-14), i hodowano z napowietrzaniem, mieszając, w 27°C do 24°C przez 41 godzin (napowietrzanie 75 | na minutę i mieszanie od 350 do 500 obr./min). pH kontrolowano poprzez automatyczne dodawanie rozcieńczonego kwasu siarkowego od 28 godziny do końca procesu. 1% mannitolu dodawano od 16 godziny do końca procesu. Uzyskane środowisko hodowlane (45 |), po usunięciu komórek drogą wirowania, skorygowano do pH 3,9 za pomocą 200 ml stężonego kwasu octowego. Dodano 25 gramów 97% cyjanku potasu i po 1 godzinie mieszania w 20°C pH skorygowano do 9,5 za pomocą 1500 ml 10% wodorotlenku sodu. Następnie ekstrahowano 35 litrami octanu etylu. Mieszaninę przeniesiono do naczynia z mieszaniem na 20 minut w 8°C. Dwie fazy rozdzielono za pomocą wirówki ciecz-ciecz. Fazę organiczną wysuszono bezwodnym siarczanem sodu i odparowano uzyskując 60 g ciemnego oleistego surowego ekstraktu.

Po chromatografii otrzymano 4,9 g cyjanosafracyny B.

Do mieszanego roztworu 25 (7,83 g, 0,0139 mola) i handlowo dostępnej Boc-Cys-(Fm)-pochodnej (Bachem) (8,33 g, 35,04 mmola) w dichlorometanie (535 ml) w atmosferze argonu, dodano w 23°C dimetyloaminopirydynę (4,28 g, 35,04 mmola) i chlorowodorek 1-[3-(dimetyloamino)propylo]-3-etylokarbodiimidu (6,66 g, 35,04 mmola). Mieszaninę mieszano w 23°C przez 2,5 godz. Reakcję zakończono przez dodanie nasyconego wodnego roztworu kwaśnego węglanu sodu (500 ml), warstwę organiczną oddzielono, a warstwę wodną ponownie ekstrahowano dichlorometanem (250 ml). Połączone warstwy organiczne wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono i odparowano do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash eluując mieszaniną octanu etylu i heksanu, w gradiencie od 1:4 do 2:1, i uzyskano 142 (12,21 g, 93%) w postaci jasnożółtego ciała stałego.

Rf= 0,35 heksan:EtOAc 1:1.

¹H-NMR (300 MHz, CDC|3): δ 7,72(d, J=7,3, 2,7 Hz, 2H), 7,55(dd, J1 =14,6, J2 =7,6 2H), 7,40-7,34(m, 2H), 7,30-7,24(m, 2H), 6,63(s, 1H), 6,08-5,99(m, 1H), 5,91 (d, J=1,5 Hz, 1H), 5,80(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,39(dd, J1=17,3, J2=1,7 Hz 1H), 5,24(dd, J1=10,5, J2=1,7 Hz, 1H), 5,09(AB, J=4,48 Hz, 2H), 5,07(t, J=7,8 Hz, 1H), 4,34-4,29(m, 2H), 4,17(d, J=1,9 Hz, 1H), 4,16-4,04(m, 4H), 4,02-3,96(m, 2H), 3,93(t, J=5,3 Hz, 1H), 3,70(s, 3H), 3,56(s, 3H), 3,32(d, J=8,0, 1H), 3,23-3,17(m, 2H), 3,0-2,89(m, 3H), 2,65-2,57(m, 2H), 2,29(s, 3H), 2,20(s, 3H), 2,03(s, 3H), 1,76(dd, J1=16,3, J2=12,7 Hz, 1H), 1,45, 1,44(s, 9H).

¹³C-NMR (75 MHz, CDC|3): δ 170,9, 155,3, 148,9, 148,6, 146,1, 146,0, 144,7, 141,2, 141,1,

139,4, 134,0, 131,0, 130,1, 127,8, 127,2, 125,2, 125,0, 124,3, 121,3, 121,2, 120,1, 118,1, 117,6,

PL 203 745 B1

112,9, 101,4, 99,5, 80,3, 74,2, 65,6, 60,4, 60,1, 57,9, 57,4, 57,2, 57,1, 56,9, 55,6, 53,2, 47,0, 41,8,

41,7, 36,7, 35,3, 28,5, 26,6, 25,3, 15,9, 9,4.

ESI-MS m/z: obliczono dla C53H60N4O10S: 945,13; znaleziono (M+1)⁺: 946,3.

Do mieszanego roztworu 142 (12,01 g, 0,0127 mola) w dichlorometanie (318 ml) dodano w atmosferze argonu w 23°C, dichloro-bis(trifenylofosfino)pallad (II) (0,71 g, 1,015 mmola) i kwas octowy (3,6 ml, 0,176 mola). Następnie dodano wkraplajac wodorek tributylocyny (10,27 ml, 0,037 mola). Mieszaninę mieszano w 23°C przez 10 minut. Następnie reakcję przesączono przez kolumnę z żelem krzemionkowym ubitą w heksanie. Otrzymano 143 (10,89 g, 95%) w postaci żółtego ciała stałego kolejnym po kolejnym eluowaniu mieszaniną octanu etylu i heksanu w gradiencie od 1:4, 1:1 do 7:3.

Rf=0,25 heksan:EtOAc 2:1.

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 7,72(d, J=7,6 Hz, 2H), 7,61(d, J=6,6 Hz, 1H), 7,52(d, J=7,3 Hz, 1H), 7,37(t, J=7,8 Hz, 2H), 7,28(m, 2H), 6,63(s, 1H), 5,87(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,76(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,58(bs, 1H), 5,31(d, J=5,8 Hz, 1H), 5,17(d, J=5,6 Hz, 1H), 4,91(d, J=8,3 Hz, 1H), 4,17-4,06(m, 4-6H), 3,85(t, J=5,7 Hz, 1H), 3,70(s, 3H), 3,68(s, 3H), 3,34 (brd, J=6,6 Hz, 1H), 3,23(brd, J=11,2 Hz, 1H), 3,06(brd, J=12,9 Hz, 1H), 3,04-2,86(m, 3H), 2,65-2,54(m, 2H), 2,28(s, 3H), 2,21 (s, 3H), 1,94(s, 3H), 1,80(dd, J1=11,5 Hz, J2=15,8 Hz, 1H), 1,45(s, 9H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3) δ 175,3, 170,5, 154,9, 149,1, 147,6, 145,9, 145,8, 145,7, 144,5,

140.9, 140,8, 136,1, 130,9, 127,4, 126,9, 124,3, 124,7, 122,9, 119,7, 117,6, 112,3, 111,4, 106,6,

100,7, 99,7, 80,0, 64,2, 60,3, 59,8, 57,6, 57,0, 56,5, 56,4, 55,2, 52,7, 46,7, 46,5, 41,4, 41,3, 36,9, 36,6,

34.9, 28,2, 26,0, 24,9, 20,9, 20,7, 15,7, 14,1, 8,5.

ESI-MS m/z: obliczono dla C50H56N4O10S: 905,5; znaleziono (M+1)⁺: 906,3.

P r z y k ł a d 68

143 144

Do roztworu 143 (10 g, 0,011 mola) w bezwodnym dichlorometanie (185 ml) w -10°C (temperatura łaźni -15°C), dodano roztwór bezwodnika kwasu benzenoseleninowego (5,7 g, 0,011 mola) w bezwodnym dichlorometanie (185 ml), odrzucając jakiekolwiek białe ciało stałe obecne w roztworze. Mieszaninę mieszano przez 10 minut w tej samej temperaturze. Reakcję rozcieńczono dichlorometa90

PL 203 745 B1 nem (200 ml) i dodano w -10°C nasycony wodny roztwór kwaśnego węglanu sodu (500 ml). Warstwę organiczna oddzielono, wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash, eluując mieszaniną octan etylu i heksan w gradiencie od 1:1, 3:2, 7:3 do 4:1, i otrzymano 144 (9,34 g, 92%) w postaci żółtego ciała stałego. Oczyszczone ciało stałe za pomocą chromatografii rozpuszczono w dichlorometanie (250 ml), dodano węgla aktywnego (3,3 g) i zawiesinę mieszano w 23°C przez 1 godzinę. Mieszaninę przesączono przez celit, a celit przemyto dichlorometanem (80 ml). Odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem utrzymując temperaturę 25-30°C i uzyskano 144 (8,96 g, 88%) w postaci żółtego ciała stałego.

Rf=0,30 i 0,25 (mieszanina izomerów) heksan:EtOAc 1:1.

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) (mieszanina izomerów) δ 7,73-7,61 (m, 4H), 7,37-7,30(m, 4H), 6,62(s, 1H), 6,59(s, 1H), 6,53(s, 1H), 5,72(s, 1H), 5,70(s, 1H), 5,61 (s, 1H), 5,55(bs, 1H), 5,34(m, 2H), 5,08(układ AB, JAB=6,7 Hz, 1H), 5,00(układ AB, JAB=5,9 Hz, 1H), 4,67(m, 1H), 4,50(m, 1H), 4,38(dd, J1=4,9 Hz, J2=12,9 Hz, 1H), 4,21(dd, J1=6,3 Hz, J2=12,9 Hz, 1H), 4,11(t, J=5,9 Hz, 1H), 4,02(m, 3H), 3,87(m, 1H), 3,83(s, 3H), 3,72(m, 1H), 3,61(s, 3H), 3,49(s, 3H), 3,27 (m, 1H), 3,15(dd, J1=1,8 Hz, J2=6,2 Hz, 2H), 3,07(d, J=6,3 Hz, 1H), 2,94(m, 4H), 2,86(m, 2H), 2,42(m, 2H), 2,25(s, 3H), 2,20(s, 3H), 2,15(s, 3H), 2,08(dd, J1=2,4 Hz, J2=13,9 Hz, 1H), 1,77(s, 3H), 1,76(s, 3H), 1,43(s, 9H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3) (mieszanina izomerów) δ 200,6, 171,2, 160,4, 155,6, 148,9, 148,8,

148,3, 145,9, 145,8, 141,3, 141,2, 138,7, 130,9, 127,9, 127,4, 127,3, 127,3, 125,3, 125,1, 124,2,

120,1, 117,1, 111,9, 108,5, 105,0, 104,7, 101,7, 101,3, 99,5, 99,4, 80,5, 72,5, 70,8, 60,5, 60,1, 58,4, 58,0, 57,9, 56,9, 56,8, 56,3, 55,9, 55,5, 55,4, 53,8, 53,7, 47,1, 42,0, 41,8, 41,5, 37,4, 37,3, 35,6, 35,5, 28,5, 25,8, 25,7, 16,1, 16,0, 7,7,7,3.

ESI-MS m/z: obliczono dla C50H56N4O11S: 921,3; znaleziono (M+1)⁺: 922,3.

P r z y k ł a d 69 Me

144

Do roztworu DMSO (3,44 ml) w bezwodnym dichlorometanie (396 ml) dodano w atmosferze argonu w -78°C bezwodnik triflatowy (3,27 ml, 19,45 mmola) i mieszaninę mieszano w tejże temperaturze przez 20 minut. Następnie dodano w -78°C roztwór 144 (8,92 g, 9,6 mmola) w bezwodnym dichlorometanie (124 ml) i mieszaninę mieszano w atmosferze argonu w -40°C przez 35 minut. Dodano diizopropyloaminę (13,5 ml, 73,43 mmola) i mieszaninę mieszano w atmosferze argonu przez 45 minut w 0°C. Dodano tert-butanol (3,65 ml, 38,6 mmola) i tert-butylotetrametyloguanidynę (11,6 ml, 67,46 mmola), i mieszaninę mieszano w atmosferze argonu przez 40 minut w 23°C. Następnie dodano kwas octowy (9,15 ml, 96,78 mmola) i reakcję mieszano przez dalszą 1 godzinę w 23°C. Reakcję rozcieńczono dichlorometanem (250 ml) i dodano nasycony wodny roztwór chlorku amonu (500 ml). Warstwę organiczną oddzielono, wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem, utrzymując temperaturę 25-30°C. Następnie surowe ciało stałe oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash, eluując gradientem mieszaniny octanu etylu i heksanu od 1:4 do 2:3, i otrzymano 145 (4,99 g, 68%) w postaci żółtego ciała stałego.

Rf=0,44 heksan:EtOAc 3:2.

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) (mieszanina izomerów) δ 6,79(s, 1H), 6,09(s, 1H), 6,00(s, 1H), 5,20(d, J=5,4 Hz, 1H), 5,14(d, J=5,6 Hz, 1H), 5,02(d, J=11,7 Hz, 1H), 4,63(d, J=9,0 Hz, 1H), 4,50(m, 1H), 4,33(d, J=5,4 Hz, 1H), 4,30(m, 1H), 4,25(bs, 1H), 4,18(d, J=2,4Hz, 1H), 4,17(dd, J1=1,3 Hz,

PL 203 745 B1

J2=11,7 Hz, 1H), 3,78(s, 3H), 3,57(s, 3H), 3,42(m, 2H), 2,93(m, 2H), 2,35(m, 1H), 2,31(s, 3H), 2,29(s, 3H), 2,22(s, 3H), 2,09(m, 1H), 2,05(s, 3H), 1,45(s, 9H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3) δ 207,3, 170,9, 168,8, 155,4, 149,8, 148,6, 146,0, 141,1, 140,7,

131.7, 130,6, 125,1, 120,6, 118,3, 113,7, 102,2, 99,4, 80,0, 61,6, 60,4, 59,8, 59,4, 59,2, 57,7, 55,0,

54.7, 54,0, 41,9, 41,6, 33,1, 31,8, 28,7, 23,9, 20,6, 16,1, 14,3, 9,8.

ESI-MS m/z: obliczono dla C38H46N4O11S: 766,86; znaleziono (M+1)⁺: 767,3.

Do roztworu 145 (1,0 g, 1,3 mmola) w acetonitrylu (50 ml) i dichlorometanie (25 ml) dodano w 23°C jodek sodu (1,52 g, 10,01 mmola). Następnie mieszaninę ochłodzono do 0°C i dodano w porcjach trichlorek glinu (1,33 g, 10,01 mmola), utrzymując temperaturę w 0°C. Następnie mieszaninę mieszano przez 2,5 godz. w 0°C. Reakcję rozcieńczono dichlorometanem (25 ml) i dodano nasycony wodny roztwór winianu sodowo-potasowego (100 ml). Warstwę wodną oddzielono i ekstrahowano dichlorometanem (2 x 75 ml). Następnie dodano do warstwy wodnej nasycony wodny roztwór kwaśnego węglanu sodu (50 ml), którą dalej ekstrahowano dichlorometanem (2 x 50 ml). Połączone ekstrakty organiczne wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono i odparowano do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem, utrzymując temperaturę poniżej 25°C. Następnie surowe ciało stałe oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash na żelu amino-krzemionkowym i eluowano mieszaniną octanu etylu i heksanu w gradiencie. Otrzymano 35 (487 mg, 60%) w postaci żółtego ciała stałego. Dane diagnostyczne związku 35 zostały uprzednio ujawnione w PCT/GB00/01852.

Otrzymano następujące związki 36, ET-770 i ET-743 według tych samych procedur, uprzednio ujawnionych w PCT/GB00/01852.

Droga 2

Roztwór 21 (9,84 g, 18,97 mmola) w THF (569 ml) i H2O (285 ml) ochłodzono do 0°C na łaźni z lodem. Następnie dodano w 0°C NaNO2 (1,96 g, 28,45 mmola) i 90% wodny AcOH (18,97 ml, 0,33 mola), i mieszaninę mieszano w 23°C przez 18 godz. Po ochłodzeniu reakcji do 0°C dodano nasycony wodny roztwór kwaśnego węglanu sodu (300 ml, zasadowe pH) i dichlorometan (500 ml). Po ekstrakcji, warstwę wodną dalej ekstrahowano dichlorometanem (2 x 300 ml). Połączone ekstrakty organiczne wysuszono nad siarczanem sodu i odparowano do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. Następnie surowe ciało stałe rozpuszczono w MeOH (379 ml) i dodano w 0°C 1M NaOH (38 ml). Mieszaninę mieszano w 23°C przez 4 godz. Po rozcieńczeniu EtOAc (600 ml) w 0°C, warstwę organiczną przemyto mieszaniną wody (400 ml) i nasyconego wodnego roztworu kwaśnego węglanu sodu (100 ml, zasadowe pH). Po ekstrakcji, warstwę wodną dalej ekstrahowano EtOAc (3 x 300 ml). Połączone eks92

PL 203 745 B1 trakty organiczne wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono w próżni. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, heksan:EtOAc gradient od 3:1 do 2:1) i uzyskano 146 (4,55 g, 46%) w postaci białego ciała stałego.

Rf=0,33 (heksan:EtOAc 1:1).

¹H NMR (300 MHz, CDC|3) δ 6,48(s, 1H), 6,15-6,02(m, 1H), 5,92(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,86(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,77(s, 1H), 5,39(dd, J1=1,5 Hz, J2=17,1 Hz, 1H), 5,26(dd, J1=1,5 Hz, J2 =10,5 Hz, 1H), 4,24-4,15(m, 3H), 4,04(d, J=2,4 Hz, 1H), 3,97(t, J=3,3 Hz, 1H), 3,74(s, 3H), 3,64(dt, J1=3,3 Hz, J2=11,1 Hz, 1H), 3,43(dd, J1 =3,3 Hz, J2 =10,5 Hz, 1H), 3,38-3,34(m, 2H), 3,31(t, J=2,7 Hz, 1H), 3,22(dd, J1=2,4 Hz, J2=15,6 Hz, 1H), 3,10(dd, J1=8,1 Hz, J2=18,3 Hz, 1H), 2,49(d, J=18,3 Hz, 1H), 2,34(s, 3H), 2,24(s, 3H), 2,11(s, 3H), 1,88(dd, J1=12 Hz, J2=15,9 Hz, 1H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC|3) δ 148,6, 146,7, 144,4, 143,0, 138,9, 133,9, 130,2, 129,1, 121,1,

120,9, 117,7, 117,4, 116,8, 113,3, 112,3, 101,1, 74,3, 63,7, 60,6, 60,1, 58,1, 56,9, 56,7, 55,4, 41,7, 26,2, 25,7, 15,7,9,3.

ES|-MS m/z: obliczono dla C29H33N3O6: 519,59; znaleziono (M+1)⁺:520,5.

P r z y k ł a d 72

Me.

147

Do mieszanego roztworu 146 (47,35 g, 0,091 mola) i handlowo dostępnej pochodnej Boc-Cys (Fm) (54,6 g, 0,137 mola) w dichlorometanie (2,8 |.) w atmosferze argonu, dodano, wkraplając w trakcie 1,5 godz. w 23°C, dimetyloaminopirydynę (5,6 g, 0,046 mola) i chlorowodorek 1-[3-(dimetyloamino)propylo]-3-etylokarbodiimidu (43,6 g, 0,227 mola). Następnie mieszaninę mieszano w 23°C przez 1 godz. Reakcję zakończono dodając nasycony wodny roztwór kwaśnego węglanu sodu (1 |) i warstwę organiczną oddzielono. Warstwę wodną ponownie ekstrahowano dichlorometanem (2 x 500 ml). Połączone ekstrakty organiczne wysuszono nad siarczanem sodu i odparowano do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszczano za pomocą chromatografii typu flash eluując mieszaniną octanu etylu i heksanu, w gradiencie od 1:4 do 3:1, i uzyskano 147 (74,3 g, 93%) w postaci białego ciała stałego.

Rf=0,5 heksan:EtOAc 1:1.

¹H NMR (300 MHz, CDC|3) δ 7,73(d, J=7,8 Hz, 2H), 7,63-7,55(m, 2H), 7,39-7,35(m, 2H), 7,297,25(m, 2H), 6,41 (s, 1H), 6,07-5,97(m, 1H), 5,92(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,80(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,67(s, 1H), 5,34(dd, J1=1,8 Hz, J2=17,4 Hz, 1H), 5,23(dd, J1=1,8 Hz, J2=10,5 Hz, 1H), 5,04(d, J=9,3 Hz, 1H), 4,32-4,29(m, 1H), 4,13-3,91(m, 9H), 3,72(s, 3H), 3,31 (d, J=7,2 Hz, 1H), 3,26-3,17(m, 2H), 2,962,87(m, 3H), 2,68-2,54(m, 2H), 2,27(s, 3H), 2,24(s, 3H), 2,05(s, 3H), 1,83(dd, J1=12,6 Hz, J2=15,9 Hz, 1H), 1,45(s, 9H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC|3) δ 170,9, 155,4, 149,0, 147,1, 146,2, 146,0, 144,7, 143,0, 141,1,

139.4, 134,1, 131,5, 129,1, 127,8, 127,2, 125,0, 121,3, 120,9, 120,1, 118,2, 117,6, 117,2, 112,9,

112.4, 101,4, 80,3, 76,6, 74,4, 65,3, 61,0, 60,4, 57,4, 56,9, 56,7, 55,6, 53,0, 46,9, 41,8, 36,7, 35,3,

31,8, 28,5, 26,6, 25,2, 22,9, 16,0, 14,4, 9,5.

ES|-MS m/z: obliczono dla C51H56N4O9S: 900,3; znaleziono (M+1)⁺: 901,3.

PL 203 745 B1

Do roztworu 147 (0,562 g, 0,642 mola) w CH3CN (3,12 ml) dodano w 0°C MEMCI (1,07 ml, 9,36 mmola), DIPEA (2,17 ml, 12,48 mmola) i DMAP (0,0076 g, 0,06 mmola). Mieszaninę mieszano przez 5,5 godz. w 23°C. Reakcję rozcieńczono CH2CI2 (50 ml) i ekstrahowano 0,1 N HCI (50 ml). Warstwę wodną ekstrahowano ponownie CH2CI2 (50 ml). Połączone warstwy organiczne wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono w próżni otrzymując pozostałość, którą oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (CH2CI2 :EtOAc 10:1, 5:1) otrzymując 148 (539 mg, 87%) w postaci białego ciała stałego.

Rf=0,50; CH2CI2 : AcOEt6:1.

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 7,73-7,71 (m, 2H), 7,57(dd, J1=7,2 Hz, J2=15,3 Hz, 2H), 7,40-7,34(m, 2H), 7,29-7,26(m, 2H), 6,62(s, 1H), 6,08-5,99(m, 1H), 5,91 (d, J=1,2 Hz, 1H), 5,79(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,35(dd, J1=1,2 Hz, J2=17,1 Hz, 1H), 5,23(d, J=6,3 Hz, 1H), 5,21 (bs, 1H), 5,13(d, J=6,3 Hz, 1H), 5,04(brd, J=9 Hz, 1H), 4,33-4,29(m, 2H), 4,16-3,90(m, 8H), 3,85-3,78(m, 1H), 3,69(s, 3H), 3,60-3,55(m, 2H), 3,38(s, 3H), 3,31(brd, J=8,1 Hz, 1H), 3,21-3,17(m, 2H), 2,98-2,88(m, 3H), 2,64-2,56(m, 2H), 2,29(s, 3H), 2,20(s, 3H), 2,02(s, 3H), 1,75(dd, J1 =11,7 Hz, J2 =15,6 Hz, 1H), 1,47(s, 9H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3) δ 170,5, 155,0, 148,6, 148,5, 148,2, 145,77, 145,6, 144,4, 140,8,

140.7, 139,0, 133,6, 130,7, 130,5, 127,4, 126,9, 124,8, 124,6, 123,8, 120,8, 119,7, 117,8, 117,2,

122,5, 111,9, 101,0, 98,1, 80,0, 77,4, 77,0, 76,6, 73,8, 71,6, 69,2, 65,0, 60,2, 60,0, 59,8, 59,0, 56,8,

56.7, 56,6, 55,2, 52,7, 46,6, 41,3, 36,2, 34,9, 29,6, 28,2, 26,3, 24,9, 15,6, 14,1, 9,0.

ESI-MS m/z: obliczono dla O55H64N4O11S: 988,4; znaleziono (M+1)⁺: 989,3.

P r z y k ł a d 74

Do mieszanego roztworu 148 (38,32 g, 0,039 mola) w dichlorometanie (1 I) dodano w atmosferze argonu w 23°C dichlorobis(trifenylofosfino)pallad (II) (2,17 g, 0,0031 mola) i kwas octowy (11,1 ml, 0,195 mola). Następnie dodano, wkraplając, wodorek tributylocyny (36,5 ml, 0,136 mola). Mieszaninę mieszano w 23°C przez 15 minut. Następnie reakcję przesączono przez kolumnę z żelem krzemionkowym, ubitą w heksanie. Otrzymano 149 (35,07 g, 95%) w postaci białego ciała stałego, eluując kolejno mieszaniną octanu etylu i heksanu, w gradiencie od 0:100, 1:4, 1:3, 2:5, 2:3, 1:1, 2:1, 3:1 do 100:0.

Rf=0,25 heksan:EtOAc 2:1.

PL 203 745 B1 ¹H NMR (300 MHz, CDC|3) δ 7,74(d, J=7,2 Hz, 2H), 7,63-7,53(m, 2H), 7,39-7,34(m, 2H), 7,30-7,27(m, 2H), 6,62(s, 1H), 5,87(m, 1H), 5,75(s, 1H), 5,69(bs, 1H), 5,37(d, J=6 Hz, 1H), 5,23(d, J=5,7 Hz, 1H), 4,96(d, J=8,1 Hz, 1H), 4,44(brd, J=8,7 Hz, 1H), 4,18-3,70(m, 11H), 3,69(s, 3H), 3,38(s, 3H), 3,34-3,18(m, 3H), 2,99-2,88(m, 3H), 2,63-2,58(m, 2H), 2,28(s, 3H), 2,21(s, 3H), 2,05(s, 3H), 1,78(dd, J1=12,9 Hz, J2=15,6,3 Hz, 1H), 1,41(s, 9H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC|3) δ 170,8, 155,2, 149,0, 148,0, 146,2, 146,0, 144,8, 141,1, 136,4,

131.3, 131,2, 127,8, 127,2, 125,1, 125,0, 123,2, 120,0, 118,1, 112,6, 111,6, 107,2, 101,0, 98,9, 98,8,

80.3, 71,8, 69,8, 64,9, 60,6, 60,2, 59,2, 57,1, 56,9, 55,5, 53,0, 47,0, 46,9, 41,8, 37,0, 35,3, 28,5, 26,2, 25,2, 21,9, 21,3, 16,1, 14,4, 9,0.

ES|-MS m/z: obliczono dla C52H60 N4O11S: 948,4; znaleziono (M+1)⁺: 949,3.

P r z y k ł a d 75

Do roztworu 149 (15 g, 0,0158 mola) w bezwodnym dichlorometanie (265 ml) w -10°C (temperatura łaźni -15°C) dodano, wkraplając w trakcie 30 minut, roztwór bezwodnika kwasu benzenoseleninowego (7,4 g, 0,0143 mola) w bezwodnym dichlorometanie (265 ml), usuwając przy tym jakiekolwiek białe ciało stałe obecne w roztworze. Mieszaninę mieszano przez dalsze 10 minut w tej samej temperaturze. Reakcję rozcieńczono dichlorometanem (200 ml) i dodano w -10°C nasycony wodny roztwór kwaśnego węglanu sodu (500 ml). Warstwę organiczną oddzielono, wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash eluując mieszaniną octanu etylu i heksanu, w gradiencie od 1:2 do 100:0, i otrzymano 150 (14,20 g, 89%) w postaci żółtego ciała stałego. Oczyszczone ciało stałe po chromatografii rozpuszczono w dichlorometanie (250 ml) i dodano węgiel aktywny (4,95 g). Następnie zawiesinę mieszano w 23°C przez 1 godzinę. Mieszaninę przesączono przez warstwę celitu, a celit przemyto dichlorometanem (80 ml). Odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymując 150 (13,72 g, 86%) w postaci białego ciała stałego.

Rf=0,37 heksan:EtOAc 1:2.

¹H NMR (300 MHz, CDC|3) (mieszanina izomerów) δ 7,73(t, J=6,7 Hz, 4H), 7,63(m, 2H), 7,54(d, J=7,6 Hz, 2H), 7,40-7,34(m, 4H), 7,31-7,27(m, 4H), 6,62(s, 2H), 5,86(s, 1H), 5,81 (s, 1H), 5,75(s, 1H), 5,72(s, 1H), 5,70(s, 1H), 5,35(d, J=5,9 Hz, 1H), 5,30(d, J=8,4 Hz, 1H), 5,23(d, J=5,9 Hz, 1H), 5,22(d, J=5,9 Hz, 1H), 5,13(d, J=5,9 Hz, 1H), 4,97(d, J=8,8 Hz, 1H), 4,43(m, 2H), 4,20-4,01(m, 8H), 3,97-3,86(m, 4H), 3,82(s, 3H), 3,80-3,74(m, 1H), 3,69(s, 3H), 3,66-3,64(m, 4H), 3,54(m, 2H), 3,38(s, 3H), 3,35(s, 3H), 3,34-2,90(m, 8H), 2,60-2,31(m, 4H), 2,27(s, 3H), 2,25(s, 3H), 2,21 (s, 3H), 1,97(s, 3H), 1,94-1,81 (m, 2H), 1,77(s, 3H), 1,43(s, 9H), 1,41(s, 9H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC|3) (mieszanina izomerów) δ 200,2, 198,3, 170.7, 170,5, 160,0, 155,2,

154.9, 148,5, 148,4, 145,5, 142,1, 140,9, 138,3, 130,9, 130,5, 130,0, 129,8, 127,5, 126,9, 125,0,

124.9, 124,7, 123,8, 122,5, 119,8, 117,2, 116,7, 111,5, 108,1, 104,6, 104,3, 101,3, 100,9, 98,0, 80,1,

72,1, 71,5, 70,5, 69,2, 69,0, 66,4, 63,5, 60,7, 60,1, 59,6, 58,9, 58,8, 58,0, 56,7, 56,4, 56,2, 55,9, 55,5, 55,0, 53,5, 46,7, 41,7, 41,3, 41,1, 36,9, 35,2, 35,1, 31,4, 28,1, 25,4, 25,3, 22,5, 15,7, 15,6, 14,0, 7,2.

ES|-MS m/z: obliczono dla C52H60N4O12S: 964,4; znaleziono: 965,3 (M+1)⁺, 987,3 (M+23)⁺.

PL 203 745 B1

Kolbę reakcyjną wygrzano dwukrotnie nad płomieniem przedmuchując pod próżnią/argonem kilka razy i utrzymywano pod argonem w czasie reakcji. Do roztworu DMSO (385,0 gl) w bezwodnym CH2CI2 (42 ml) dodano, wkraplając, bezwodnik kwasu triflatowego (366,5 gl 2,16 mmola) w -78°C. Mieszaninę reakcyjną mieszano w -78°C przez 20 minut. Następnie dodano przez kaniulę (dodatkowy czas: 5 min) w -78°C roztwór 150 (1 g, 1,03 mmola) w bezwodnym CH2CI2 (10 ml przy dodawaniu i 5 ml do przemycia). Podczas dodawania utrzymywano temperaturę -78°C w kolbie reakcyjnej, a kolor uległ zmianie z żółtego na brązowy. Mieszaninę reakcyjną mieszano w -40°C przez 35 minut. Podczas tego okresu kolor roztworu uległ zmianie z żółtego na ciemnozielony. Po tym okresie czasu dodano, wkraplając, i-Pr2Net (1,51 ml, 9,55 mmola) i mieszaninę reakcyjną utrzymywano w 0°C przez 45 minut; kolor roztworu zmienił się na brązowy podczas tego okresu. Następnie dodano wkraplając tBuOH (409,5 gl, 4,33 mmol) i tert-butylotetrametyloguanidynę (1,31 ml, 7,61 mmola), i mieszaninę reakcyjną mieszano w 23°C przez 40 minut. Po tym okresie czasu, dodano wkraplając bezwodnik octowy (1,03 ml, 10,89 mmola) i mieszaninę reakcyjną trzymano w 23°C przez 1 godzinę. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńczono CH2CI2 (25 ml) i przemyto wodnym nasyconym roztworem NH4CI (50 ml), NaHCO3 (50 ml) i NaCI (50 ml). Połączone warstwy organiczne wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (średnica wewnętrzna 2.0 cm, wysokość warstwy żelu krzemionkowego: 9 cm; eluent: octan etylu/heksan, gradient od 20:80, 30:70 do 40:60) i uzyskano 151 (832,6 mg, 99%) w postaci białego ciała stałego.

Rf=0,48 heksan:EtOAc 3:2.

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 6,78(s, 1H), 6,09(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,99(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,32(d, J=5,8 Hz, 1H), 5,19(d, J=5,6 Hz, 1H), 5.01 (d, J=11,7 Hz, 1H), 4,62(d, J=9,8 Hz, 1H), 4,50(bs, 1H), 4,34(d, J=5,1 Hz, 1H), 4,28(dd, J1 =2,4 Hz, J2 =6,8 Hz, 1H), 4,24(s, 1H), 4,17(m, 2H), 3,90(m, 2H), 3,76(s, 3H), 3,58(t, J=4,8 Hz, 2H), 3,42-3,37(m, 2H), 3,37(s, 3H), 2,91(m, 2H), 2,36-2,08(m, 2H), 2,30(s, 3H), 2,28(s, 3H), 2,21 (s, 3H), 2,04(s, 3H), 1,44(s, 9H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3) δ 170,9, 168,9, 168,0, 155,4, 149,8, 148,6, 146,0, 141,1, 140,6,

131,6, 131,1, 130,6, 129,0, 125,1, 120,6, 118,3, 102,2, 98,4, 79,9, 71,9, 69,4, 61,6, 60,4, 59,8, 59,4,

59,2, 54,9, 54,7, 54,0, 41,6, 30,6, 29,1, 28,7, 23,9, 23,2, 20,6, 16,1, 14,2, 11,2, 9,8.

ESI-MS m/z: obliczono dla C40H50N4O12S: 810,91; znaleziono (M+1)⁺: 811,3.

PL 203 745 B1

Do roztworu 151 (2,9 g, 3,57 mmola) w CH2CI2 (120 ml) dodano w 23°C MeSO3H (1,4 ml, 21,46 mmola). Po 30 minutowym mieszaniu reakcji w 23°C, dodano w 0°C nasycony wodny roztwór kwaśnego węglanu sodu (200 ml). Oddzielono warstwę organiczna, wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash, eluując mieszaniną octanu etylu i heksanu w gradiencie od 0:1 do 1:0 i otrzymano 35 (1,43 g, 64%) w postaci jasnożółtego ciała stałego. Dane diagnostyczne związku 35 zostały uprzednio ujawnione w PCT/GB00/01852.

Otrzymano następujące związki 36, ET-770 i ET-743 według tych samych procedur, które uprzednio ujawniono w PCT/GB00/01852.

Droga 3

Pierwszy etap tej drogi (transformacja 21 w 146) opisano powyżej w przykładzie 71.

P r z y k ł a d 78

Do roztworu handlowo dostępnego HO.Cys(Fm)-H.HCI (Bachem) (40 g, 0,119 mola) w acetonie (500 ml) i wodzie (500 ml) dodano w 0°C 1M roztwór Na2CO3 (238 ml) i BnCO2CI (18,7 ml, 0,131 mola). Po 30 minutowym mieszaniu w 60°C mieszaninę reakcyjną potraktowano 1N HCI (pH 0-1) i ekstrahowano eterem (3 x 400 ml). Warstwę organiczną oddzielono, wysuszono nad siarczanem magnezu, przesączono i zatężono do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowe ciało stałe rozpuszczono w mieszaninie EtOAc/CH2CI2 1:1, strącono osad heksanem i pozostawiono w 4°C na noc. Następnie zawiesinę przesączono, ciało stałe przemyto heksanem (200 ml), a przesącz wysuszono w próżni uzyskując 152 (50,16 g, 97%) w postaci białego ciała stałego.

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 10,66(bs, 1H), 7,74(d, J=7,5 Hz, 2H), 7,69-7,64(m, 2H), 7,62-7,29 (m, 9H), 5,67(d, J=7,5 Hz, 1H), 5,14(bs, 2H), 4,70-4,64(m, 1H), 4,09-4,05(m, 1H), 3,12-3,09(m, 2H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3) δ 175,2, 155,9, 145,5, 141,0, 135,8, 128,5, 128,2, 128,1, 127,5, 127,0, 124,7, 119,8, 84,8, 67,3,46,8, 37,0.

ESI-MS m/z: obliczono dla C25H23NO4S: 433,52; znaleziono (M+1)⁺: 434,4. P r z y k ł a d 79

Do mieszanego roztworu 146 (10 g, 19,2 mmola) i 152 (12,5 g, 28,8 mmola) w dichlorometanie (800 ml) w atmosferze argonu dodano, wkraplając w trakcie 1 godziny w 0°C, dimetyloaminopirydynę (705 mg, 5,77 mmola), chlorowodorek 1-[3-(dimetyloamino)propylo]-3-etylokarbodiimidu (9,2 g, 48,1 mmola) i diizopropyloetyloaminę (7,4 ml, 42,3 mmola). Następnie mieszaninę mieszano w 23°C przez 1,5 godz. Reakcję zakończono dodając nasycony wodny roztwór kwaśnego węglanu sodu (600 ml). Warstwę organiczną oddzielono i przemyto ponownie nasyconym wodnym roztworem chlorku amonu (500 ml). Organiczny ekstrakt wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono i odparowano do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (RP18, CH3CN : H2O 4:1) uzyskując 153 (13,89 g, 77%) w postaci jasnożółtego ciała stałego.

PL 203 745 B1 ¹H NMR (300 MHz, CDC|3) δ 7,74-7,72(m, 2H), 7,61-7,53(m, 2H), 7,37-7,24(m, 9H), 6,39(s, 1H), 6,09-5,96(m, 1H), 5,90(s, 1H), 5,84(s, 1H), 5,78(s, 1H), 5,34(dd, J1 =1,5 Hz, J2 =17,4 Hz, 1H), 5,32(bs, 1H), 5,24(dd, J1=1,5 Hz, J2=10,2 Hz, 1H), 5,17-5,07(m, 2H), 4,40(dd, J1=3,6 Hz, J2=10,8 Hz, 1H), 4,30(m, 1H), 4,18-4,01(m, 6H), 3,92(brt, J=6,3 Hz, 1H), 3,71 (s, 3H), 3,30-3,19(m, 3H), 2,99-2,85(m, 3H), 2,65(dd, J1=4,5 Hz, J2=14,4 Hz, 1H), 2,55(d, J=18,3 Hz, 1H), 2,26(s, 3H), 2,21(s, 3H), 2,06(s, 3H), 1,86(dd, J1=11,7 Hz, J2=15,9 Hz, 1H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC|3) δ 170,2, 155,6, 148,6, 146,8, 145,7, 145,6, 144,3, 142,6, 140,7, 139,0, 133,7, 131,1, 128,8, 128,4, 128,1, 128,0, 127,4, 126,9, 124,7, 124,6, 121,0, 120,5, 119,7,

117,8, 117,3, 116,8, 112,5, 112,0, 101,0, 74,1, 67,0, 64,7, 60,7, 59,9, 57,0, 56,6, 56,3, 55,2, 53,1, 46,5, 41,4, 36,4, 34,8, 26,2, 24,8, 15,6, 9,2.

ES|-MS m/z: obliczono dla C54H54N4O9S: 934,36; znaleziono (M+1)⁺: 935,4.

P r z y k ł a d 80

Do roztworu 153 (13,89 g, 14,85 mmola) w CH3CN (74,3 ml) dodano w 0°C MEMC| (25,4 ml, 223 mmola), D|PEA (52 ml, 297 mmola) i DMAP (0,181 g, 0,15 mmola). Mieszaninę mieszano przez 5 godz. w 23°C. Reakcję rozcień czono CH2C|2 (400 ml) i ekstrahowano 0,1 N HC| (300 ml) i 3N HC| (pH=3). Warstwę wodną ekstrahowano ponownie CH2C|2 (2 x 50 ml). Połączone warstwy organiczne wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono w próżni uzyskując pozostałość, którą oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, CH2C|2 :EtOAc 10:1, 5:1) i otrzymano 154 (13,47 g, 88%) w postaci białego ciał a stał ego.

Rf=0,27 CH2C|2: AcOEt 6:1.

¹H NMR (300 MHz, CDC|3) δ 7,73-7,70(m, 2H), 7,58-7,50(m, 2H), 7,38-7,22(m, 9H), 6,59(s, 1H), 6,08-5,98(m, 1H), 5,89(s, 1H), 5,77(s, 1H), 5,35(d, J=17,1 Hz, 1H), 5,31-5,28(m, 1H), 5,23(d, J=6,9 Hz, 1H), 5,13(d, J=6,9 Hz, 1H), 5,12-5,05(m, 2H), 4,37-4,29(m, 2H), 4,15-3,77(m, 9H), 3,68(s, 3H), 3,58-3,55(m, 2H), 3,37(s, 3H), 3,30-3,27(m, 1H), 3,21-3,16(m, 2H), 2,96-2,84(m, 4H), 2,64-2,58(m, 1H), 2,55(d, J=18 Hz, 1H), 2,27(s, 3H), 2,16(s, 3H), 2,02(s, 3H), 1,75(dd, J1=12,3 Hz, J2=16,2 Hz, 1H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC|3) δ 171,9, 170,2, 155,5, 148,7, 148,6, 148,3, 145,8, 145,7, 144,5,

142,1, 140,9, 139,1, 136,1, 133,8, 130,8, 130,5, 128,5, 128,3, 128,1, 127,6, 127,0, 124,9, 124,7,

123,9, 122,2, 120,9, 119,8, 117,8, 117,3, 112,6, 112,0, 101,1, 98,2, 74,0, 71,7, 69,3, 67,1, 65,1, 60,1, 59,8, 59,0, 56,9, 56,8, 56,7, 55,3, 53,3, 46,7, 41,4, 36,5, 35,0, 31,6, 29,7, 26,4, 25,0, 22,6, 15,7, 14,1, 9,2.

ES|-MS m/z: obliczono dla C58H62N4O11S: 1023,2; znaleziono (M+23)⁺: 1046,3.

P r z y k ł a d 81

PL 203 745 B1

Do mieszanego roztworu 154 (20,84 g, 0,02 mola) w dichlorometanie (530 ml) dodano w atmosferze argonu w 23°C dichlorobis(trifenylofosfino)pallad (II) (1,14 g, 1,63 mmola) i kwas octowy (11,64 ml, 0,2 mola). Następnie dodano wkraplając wodorek tributylocyny (27,44 ml, 0,2 mola). Mieszaninę mieszano w 23°C przez 15 minut. Następnie reakcję przesączono przez kolumnę z żelem krzemionkowym, ubijanym w heksanie. Otrzymano 155 (18,78 g, 94%) w postaci jasnożółtego ciała stałego przez kolejne eluowanie mieszaniną octanu etylu i heksanu, w gradiencie od 1:4, 1:1, 3:2 do 7:3.

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 7,71(d, J=7,2 Hz, 2H), 7,59(d, J=7,5 Hz, 1H), 7,53(d, J=7,5 Hz, 1H), 7,41-7,23(m, 9H), 6,60(s, 1H), 5,87(bs, 2H), 5,74(s, 1H), 5,40(d, J=6,3 Hz, 1H), 5,33(d, J=5,8 Hz, 1H), 5,18(d, J=9 Hz, 1H), 5,09(d, J=12 Hz, 1H), 4,97(d, J=12 Hz, 1H), 4,56(dd, J1 =3 Hz, J2 =11,1 Hz, 1H) 4,19(d, J=2,1 Hz, 1H), 4,16-3,87(m, 9H), 3,66(s, 3H), 3,38(s, 3H), 3,32-3,20(m, 3H), 2,96-2,87(m, 3H), 2,62-2,54(m, 2H), 2,28(s, 3H), 2,19(s, 3H), 1,97(s, 3H), 1,82(dd, J1 =13,2 Hz, J2 =15,6 Hz, 1H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3) δ 170,0, 155,4, 149,0, 147,5, 145,7, 145,6, 144,4, 140,8, 135,9,

130.9, 128,4, 128,1, 128,0, 127,4, 126,9, 124.7, 124,6, 122,7, 119,7, 117,7, 112,4, 111,4, 100,6, 98,7, 71,5, 69,4, 67,0, 64,9, 63,9, 59,7, 59,6, 58,8, 57,0, 56,5, 56,4, 55,1, 54,9, 53,1, 52,5, 46,5, 41,4, 36,8,

34.9, 25,8, 24,7, 15,7, 8,7.

P r z y k ł a d 82

Do roztworu 155 (18,5 g, 18,82 mmola) w bezwodnym dichlorometanie (530 ml) w -10°C (temperatura łaźni -15°C) dodano wkraplając roztwór bezwodnika kwasu benzenoseleninowego (9,68 g, 18,82 mmola) w bezwodnym dichlorometanie (290 ml), usuwając jakiekolwiek białe ciało stałe obecne w roztworze. Mieszaninę mieszano przez 10 minut w tej samej temperaturze. Reakcję zakończono przez dodanie nasyconego wodnego roztworu kwaśnego węglanu sodu (600 ml). Warstwę organiczną oddzielono, a warstwę wodną ekstrahowano CH2CI2 (2 x 300 ml). Połączone ekstrakty organiczne wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej eluując mieszaniną octanu etylu i heksanu w gradiencie od 1:1, 3:2, 7:3 do 4:1 i otrzymano 156 (17,62 g, 88%) w postaci jasnożółtego ciała stałego.

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) (mieszanina izomerów) δ 7,73(d, J=7,5 Hz, 2H), 7,63(d, J=7,5 Hz, 2H), 7,40-7,29(m, 9H), 6,59(s, 1H), 6,52(s, 1H), 5,68(s, 1H), 5,66(s, 1H), 5,58(s, 1H), 5,56(s, 1H), 5,23(d, J=6 Hz, 1H), 5,15-5,05(m, 4H), 4,76-4,68(m, 1H), 4,64-4,55(m, 1H), 4,40-4,37(m, 1H), 4,15-3,68(m, 8H), 3,60(s, 3H), 3,57(s, 3H), 3,39(s, 3H), 3,36(s, 3H), 3,25-2,78(m, 7H), 2,38-2,24(m, 2H), 2,20(s, 3H), 2,18(s, 3H), 2,15(s, 3H), 2,09(m, 1H), 2,04(s, 3H), 1,77(s, 3H), 1,58(s, 3H).

ESI-MS m/z: obliczono dla C55H58N4O12S: 999,13; znaleziono (M+1)⁺: 1000,0.

PL 203 745 B1

P r z y k ł a d 83

156 157

Kolbę reakcyjną dwukrotnie wygrzano nad płomieniem przedmuchując próżnią/argonem kilka razy i utrzymywano pod argonem w czasie reakcji. Do roztworu DMSO (178 gl) w bezwodnym CH₂CI₂ (20 ml) dodano, wkraplając, bezwodnik kwasu triflatowego (169 gl 1 mmola) w -78°C. Mieszaninę reakcyjną mieszano w -78°C przez 20 minut. Następnie dodano w -78°C (czas dodawania 5 min) przez kaniulę roztwór 156 (0,5 g, 0,5 mmola) w bezwodnym CH2CI2 (4 ml przy dodawaniu i 1,5 ml do przemycia). Podczas dodawania utrzymywano temperaturę -78°C w obu kolbach, a kolor uległ zmianie z żółtego na brązowy. Mieszaninę reakcyjną mieszano w 40°C przez 35 minut. Podczas tego okresu czasu kolor roztworu uległ zmianie z żółtego na ciemnozielony. Po tym okresie czasu dodano wkraplając i-Pr2Net (0,7 ml, 4,42 mmola) i mieszaninę reakcyjną trzymano w 0°C przez 45 minut, podczas gdy kolor roztworu zmienił się na brązowy. Następnie dodano wkraplając t-BuOH (189 gl, 2 mmola) i tert-butylotetrametyloguanidynę (0,6 ml, 3,49 mmola), i mieszaninę reakcyjną mieszano w 23°C przez 40 minut. Po tym okresie czasu dodano wkraplając bezwodnik octowy (0,47 ml, 4,97 mmola) i mieszaninę reakcyjną trzymano w 23°C przez 1 godzinę. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńczono CH2CI2 (15 ml) i przemyto wodnym nasyconym roztworem NH4CI (25 ml), NaHCO3 (25 ml) i NaCI (25 ml). Połączone warstwy organiczne wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (średnica wewnętrzna 2,0 cm, wysokość warstwy żelu krzemionkowego: 9 cm; eluent: octan etylu/heksan, gradient od 1:4, 1:3, 1:2 do 1:1) i uzyskano 157 (128 mg, 30%) w postaci jasnożółtego ciała stałego.

Rf=0,37 heksan:EtOAc 3:2.

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 7,37(bs, 5H), 6,66(s, 1H), 6,09(s, 1H), 5,99(s, 1H), 5,30(d, J=5,4 Hz, 1H), 5,17(d, J=6 Hz, 1H), 5,06(d, J=7,8 Hz, 1H), 5,00(s, 1H), 4,83(d, J=9,3 Hz, 1H), 4,50(s, 1H), 4,34-4,17(m, 7H), 3,90-3,87(m, 2H), 3,66(s, 3H), 3,65-3,56(m, 2H), 3,37 (s, 3H), 2,89-2,90(m, 2H), 2,28(s, 3H), 2,18(s, 3H), 2,15-2,04(m, 2H), 2,03(s, 3H), 1,99(s, 3H).

ESI-MS m/z: obliczono dla C43H48N4O12S: 844,93; znaleziono (M+1)+: 845,8.

P r z y k ł a d 84

156 157

Do roztworu 157 (100 mg, 0,118 mmola) w CH2CI2 (2 ml) i CH3CN (2 ml) dodano w 0°C Nal (71 mg, 0,472 mmola) i TMSCI (60 gl, 0,472 mmola). Po 50 minutowym mieszaniu w 23°C mieszaninę potraktowano wodą (30 ml) i ekstrahowano CH2CI2 (2 x 20 ml). Połączone warstwy organiczne przemyto kolejno nasyconym wodnym roztworem NaCI (20 ml) i nasyconym roztworem ditioninu sodu (20 ml), wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono w próżni. Pozostałość oczyszczano za po100

PL 203 745 B1 mocą chromatografii kolumnowej typu flash (eluent: octan etylu/heksan gradient 1:4, 1:2 do 1:1) i uzyskano 158 (62 mg, 70%) w postaci białego ciała stałego.

Rf=0,21 heksan: EtOAc 1:1.

¹H NMR (300 MHz, CDC|3) δ 7,36(bs, 5H), 6,44(s, 1H), 6,07(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,97(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,81 (bs, 1H), 5,10-5,00(m, 3H), 4,82(d, J=9,3 Hz, 1H), 4,49(bs, 1H), 4,35-4,30(m, 1H), 4,21-4,17(m, 2H), 4,16-4,14(m, 2H), 3,65(s, 3H), 3,41-3,36(m, 2H), 2,88-2,85(m, 2H), 2,28(s, 3H), 2,24-2,03(m, 2H), 2,17(s, 3H), 2,02(s, 3H), 2,00(s, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC|3) δ 170,5, 168,8, 155,9, 148,3, 146,0, 143,1, 141,2, 140,6, 136,6, 130,6, 130,0, 128,8, 128,7, 128,5, 121,0, 120,3, 118,3, 118,2, 113,7, 113,6, 102,2, 67,2, 61,5, 60,8,

60,3, 59,6, 59,5, 54,8, 54,7, 54,1, 41,9, 41,6, 32,9, 23,9, 20,8, 15,5, 9,8.

ES|-MS m/z: obliczono dla C39H48N4O10S: 756,82; znaleziono (M+1)⁺: 757,3.

Do roztworu 158 (100 mg, 0,132 mmola) w MeOH (6,8 ml) dodano w 23°C HCO2H (360 gl) i 10% Pd/C (140 mg, 0,132 mmola), i mieszaninę mieszano przez 15 minut. Następnie dodano toluen (7 ml), a rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Destylacja azeotropowa toluenem została powtórzona trzykrotnie. Następnie pozostałość rozcieńczono dichlorometanem (15 ml) i dodano nasycony wodny roztwór kwaśnego węglanu sodu (15 ml). Warstwę wodną oddzielono i ekstrahowano dichlorometanem (2x10 ml). Połączone ekstrakty organiczne wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono i odparowano do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash na żelu amino-krzemionkowym eluując mieszaniną octanu etylu i heksanu, w gradiencie od 1:2, 1:1 do 2:1, i otrzymano 35 (57 mg, 70%) w postaci żółtego ciała stałego. Dane związku 35 zostały uprzednio ujawnione w PCT/GB00/01852.

Otrzymano następujące związki 36, ET-770 i ET-743, zgodnie z tymi samymi procedurami, które zostały uprzednio ujawnione wPCT/GBOO/01852.

Droga 4

Pierwszy etap tej drogi (przekształcenie 21 w 146) został opisany w powyższym przykładzie 71.

Do roztworu 146 (18 mg, 0,032 mmola), kat. DMAP i imidazolu (5 mg, 0,08 mmola) w DMF (0,05 ml), dodano w 0°C chlorek tert-butylodifenylosililowy (12,5 gl, 0,048 mmola) i reakcję mieszano przez 4 godziny w 23°C. Następnie dodano w 0°C wodę (30 ml) i mieszaninę ekstrahowano mieszaniną heksan:EtOAc 1:10 (2 x 40 ml). Połączone warstwy - nieorganiczne wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono, a rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, heksan:EtOAc 3:1) i uzyskano 159 (27 mg, 88%) w postaci białego ciała stałego.

PL 203 745 B1

101

Rf=0,29 heksan:EtOAc 3:1.

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 7,72-7,41 (m, 2H), 7,40-7,20(m, 8H), 6,46(s, 1H), 6,16-6,00(m, 1H), 5,77(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,71 (s, 1H), 5,63(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,24(dd, J1 =1,2 Hz, J2 =17,1 Hz, 1H), 5,23(dd, J1=1,2 Hz, J2=10,2 Hz, 1H), 4,18(d, J=2,4 Hz, 1H), 4,13-4,00(m, 4H), 3,77(s, 3H), 3,63(dd, J1=2,4 Hz, J2=7,5 Hz, 1H), 3,39-3,19(m, 4H), 2,99(dd, J1=8,1 Hz, J2=18,0 Hz, 1H), 2,68(d, J=17,7 Hz, 1H), 2,30(s, 3H), 2,28(s, 3H), 2,08(s, 3H), 1,99(dd, J1=12,6 Hz, J2=16,3 Hz, 1H), 0,89(s, 9H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3) δ 148,3, 146,6, 144,0, 142,5, 139,0, 135,7, 135,4, 133,9, 133,6,

132,2, 131,2, 129,5, 129,4, 128,3, 127,5, 127,4, 121,8, 120,9, 118,7, 117,3, 117,2, 112,9, 111,7,

100,8, 74,2, 68,0, 61,6, 60,6, 60,3, 59,0, 57,4, 56,7, 55,4, 41,7, 29,6, 26,6, 26,5, 25,5, 18,9, 15,8, 9,3.

ESI-MS m/z: ob|iczono d|a C45H51N3O6Si: 757,9; zna|eziono (M+1)⁺: 758,4.

Do roztworu 159 (2,4 g, 3,17 mmo|a) w CH3CN (16 m|) dodano w 0°C MOMBr (2,6 m|, 31,75 mmo|a), DIPEA (8,3 m|, 47,6 mmo|a) i DMAP (16 mg, 0,127 mmo|a). Mieszaninę mieszano przez 6 godz. w 23°C. Reakcję rozcieńczono CH2CI2 (50 m|) i ekstrahowano 0,1 N HCI (50 m|). Warstwę wodną ekstrahowano ponownie CH2CI2 (50 m|). Połączone warstwy organiczne wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono w próżni otrzymując pozostałość, którą oczyszczano za pomocą chromatografii ko|umnowej typu f|ash (SiO2, CH2CI2 :EtOAc 15:1, 5:1) i uzyskano 26 (1,78 g, 70%) w postaci białego ciała stałego. Dane związku 26 uprzednio ujawniono w PCT/GB00/01852.

Procedury otrzymywania półproduktów int. 11, 160, 161, 162 i 163 uprzednio ujawniono w opisie patentowym USA. nr 5.721.362.

Do roztworu 163 (15,8 g, 0,02 mo|a) w bezwodnym CH2CI2 (250 m|) i acetonitry|u (300 m|) dodano w 23°C w atmosferze argonu Na| (31,5 g, 0,21 mo|a) i TMSCI (świeżo przedesty|owany znad CaH2, 26,7 m|, 0,21 mo|a). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 40 minut. Następnie reakcję podzie|ono pomiędzy CH2CI2 (200 m|) i wodę (300 m|). Warstwę organiczną przemyto nasyconym wodnym roztworem NaCI (2 x 300 m|). Warstwę organiczną wysuszono nad Na2SO4, przesączono, a rozpuszcza|nik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszczano za pomocą chromatografii ko|umnowej typu f|ash, stosując jako e|uent mieszaninę octan ety|u/heksan 2:3, i uzyskano 164 (10,74 g, 76%) w postaci jasnożółtego ciała stałego.

Rf=0,25 heksan:EtOAc 3:2.

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 6,57(s,1H), 6,08(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,98(d, J=1,5 Hz, 1H), 5,96-5,85(m, 1H), 5,76(bs, 1H), 5,30(dd, J1 =1,5, J2 =17,3 Hz, 1H), 5,23(dd, J1 =1,5, J2 =10,2 Hz, 1H), 5,00(d, J=12,1 Hz, 1H), 4,81 (d, J=9,8 Hz, 1H), 4,58-4,45(m, 3H), 4,34-4,28(m, 1H), 4,23(m, 2H),

102

PL 203 745 B1

4,17-4,00(m, 2H), 3,76(s, 3H), 3,40-3,38(m, 2H), 2,91-2,85(m, 2H), 2,30(s, 3H), 2,29(s, 3H), 2,24-2,23 (m, 2H), 2,19(s, 3H), 2,02(s, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3) δ 170,1, 168,4, 155,2, 148,0, 145,5, 142.8, 140,7, 140,1, 132,7,

130.2, 129,6, 120,7, 119,9, 117,8, 113,3, 101,9, 65,6, 61,0, 60,4, 59,9, 59,2, 59,0, 54,3, 53,6, 41,5,

41.2, 32,6, 29,5, 23,5, 20,4, 15,6, 9,4.

ESI-MS m/z: obliczono dla C35H38N4O10S: 706,76; znaleziono (M+1)⁺: 707,2.

Do mieszanego roztworu 164 (2 g, 2,85 mmola) w dichlorometanie (142 ml) dodano w 23°C w atmosferze argonu dichlorobis(trifenylofosfino)pallad(ll) (0,2 g, 0,28 mmola) i kwas octowy (0,65 ml, 11,4 mmola). Następnie wkraplano w trakcie 25 minut wodorek tributylocyny (4,51 ml, 17,02 mmola). Po dodaniu HSnBu3 mieszaninę mieszano w 23°C przez 20 minut. Reakcję przesączono przez kolumnę z żelem krzemionkowym, ubijanym w heksanie. Otrzymano 35 (1,38 g, 78%) przez kolejne - przemywanie mieszaniną octanu etylu i heksanu, w gradiencie od 1:2 do 15:1. Dane diagnostyczne związku 35 zostały uprzednio ujawnione w PCT/GB00/01852.

Otrzymano następujące związki 36, ET-770 i ET-743 według tych samych procedur uprzednio ujawnionych w PCT/GB00/01852.

Droga 5

Pierwszy etap tej drogi (przekształcenie związku 21 w 146) opisano powyżej w przykładzie 71.

Do roztworu 146 (8,72 g, 16,78 mmola) w DMF (20,1 ml) dodano w 0°C imidazol (3,43 g, 50,34 mmola), tert-butylodimetylochlorosilan (7,58 ml, 50,34 mmola) i DMAP (0,2 g, 1,7 mmola). Po 3,5 godzinnym mieszaniu w 23°C mieszaninę reakcyjną zadano wodą (100 ml) i ekstrahowano mieszaniną EtOAc/heksan 1:3 (2 x 75 ml). Połączone warstwy organiczne przemyto 0,1 M HCI (50 ml) i warstwę wodną ekstrahowano ponownie mieszaniną EtOAc/heksan 1:3 (40 ml). Połączone warstwy organiczne wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono w próżni. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (heksan:EtOAc 10:1, 3:1) otrzymując 165 (9,85 g, 93%) w postaci białego ciała stałego.

Rf=0,39 w heksan:AcOEt 2:1.

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 6,43(s,1H), 6,15-6,03(m, 1H), 5,92(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,84(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,67(s, 1H), 5,41(dd, J1=1,5, J2=17,1 Hz, 1H), 5,26(dd, J1=1,5, J2=10,5 Hz, 1H), 4,44(d, J=2,7 Hz, 1H), 4,20-4,08(m, 3H), 3,97(dd, J1=2,7, J2=8,1 Hz, 1H), 3,75(s, 3H), 3,61 (dd, J1=2,71, J2=9,9 Hz, 1H), 3,18(brd, J=8,7 Hz, 1H), 3,22-3,16(m, 2H), 2,99(dd, J1=8,1 Hz, J2=17,4 Hz, 1H), 2,65(d, J=17,4 Hz, 1 H), 2,28(s, 3H), 2,25(s, 3H), 2,11(s, 3H), 1,89(dd, J1=12, J2=15,6 Hz, 1H), 0,8(s, 9H), -0,05(s,3H), -09(s, 3H).

PL 203 745 B1

103 ¹³C NMR (75 MHz, CDCI3) δ 148,2, 146,5, 143,8, 142,4, 138,9, 133,8, 131,0, 128,0, 121,5,

120,4, 118,4, 117,1, 112,8, 111,6, 100,7, 74,0, 68,2, 61,5, 60,2, 58,6, 57,1, 56,5, 55,2, 41,3, 26,2,

25,4, 25,2, 20,6, 17,8, 15,3, 13,8, 9,0, -3,9, -6,0.

ESI-MS m/z: obliczono dla C35H47N3O6Si: 633,85; znaleziono (M+1)⁺: 634,2.

Do roztworu 165 (7,62 g, 12,02 mmola) w THF (87,64 ml) i wodzie (0,24 ml) dodano w -6°C MEMCI (2,33 ml, 20,43 mmola). Dodawano porcjami przez 45 minut 60% NaH (0,72 g, 18,03 mmola), a nastę pnie mieszaninę mieszano przez 1,5 godz. w tej temperaturze. Reakcję zakończono dodając wodę (150 ml) i całość ekstrahowano CH2CI2 (2 x 100 ml). Połączone warstwy organiczne wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono w próżni otrzymując 166 (8,69 g, 100%) w postaci białego ciała stałego, które użyto w następnych etapach bez dalszego oczyszczania.

Rf=0,24 heksan:AcOEt 2:1.

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 6,64(s, 1H), 6,16-6,05(m,1 H), 5,92(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,85(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,41(dd=17,1 Hz, 1H), 5,29-5,24(m, 2H), 5,14(d, J=6Hz, 1H), 4,42(d, J=2,7 Hz, 1H), 4,21-4,06(m, 3H), 4,01-3,95(m, 2H), 3,88-3,82(m, 1H), 3,72(s, 3H), 3,64-3,57(m, 3H), 3,39(s, 3H), 3,29(brd J=7,5 Hz, 1H), 3,25-3,15(m, 2H), 3,00(dd, J1=8,1, J2=17,4 Hz, 1H), 2,65(d, J=18 Hz, 1H), 2,30(s, 3H), 2,21(s, 3H), 2,11(s, 3H), 1,82(dd, J1=12, J2=15,6 Hz, 1H), 0,79(s, 9H), -0,06(s, 3H), -0,11(s, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCI3) δ 148,4, 148,1, 144,1, 139,2, 133,9, 130,9, 130,8, 130,2, 128,8, 125,1, 124,2, 121,5, 118,8, 117,45, 113,0, 111,9, 101,0, 98,2, 74,1, 71,7, 69,3, 68,3, 61,7, 59,6, 59,0,

58,9, 57,3, 57,1, 55,5, 41,6, 29,7, 26,4, 25,8, 25,5, 25,4, 15,7, 9,2, -5,6, -5,6.

ESI-MS m/z: obliczono dla C39H55N3O8Si: 721,3; znaleziono (M+1)⁺: 722,3.

Do roztworu 166 (10,76 g, 14,90 mmola) w bezwodnym CH2CI2 (275 ml) dodano, w atmosferze argonu w 23°C, Pd(PPh3P)2CI2 (837 mg, 1,19 mmola), kwas octowy (4,26 ml, 74,5 mmola) i wodorek tributylocyny (11,85 ml, 44,7 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 23°C przez 15 minut. (TLC; AcOEt/heksan 1:1 wykazała brak materiału wyjściowego). Dodano heksan (100 ml) i mieszaninę wylano na kolumnę chromatograficzną typu flash (SiO2, EtOAc:heksan, gradient od 0:100, 1:4, 2:3 do 1:1) i uzyskano związek 167 (9,95 g, 98%) w postaci żółtego ciała stałego.

Rf=0,42 heksan:EtOAc 3:7.

¹H-NMR (300 MHz, CDCI3): δ 6,63(s, 1H), 5,89(d, J=1,4 Hz, 1H), 5,79(d, J=1,4 Hz, 1H), 5,76(m, 1H), 5,38(d, J=5,6 Hz, 1H), 5,23(d, J=5,9 Hz, 1H), 4,53(d, J=2,7 Hz, 1H), 4,17(dd, J1=1,95 Hz, J2=6,05 Hz, 1H), 4,11(dd, J1=7,0 Hz, J2=12,5 Hz, 1H), 4,01-3,92(m, 2H), 3,70(s, 3H), 3,67(m, 3H), 3,40(s, 3H),

104

PL 203 745 B1

3,29(m, 1H), 3,24-3,13(m, 3H), 2,99(dd, J1=8,0 Hz J2=1,7,5 Hz, 1H), 2,67(d, J=17,5 Hz, 1H), 2,28(s, 3H), 2,09(s, 3H), 2,05(s, 3H), 1,80(dd, J1=11,2 Hz, J2=14,9 Hz, 1H), 0,82(s, 9H), -0,03(s, 3H), -0,07(s, 3H).

¹³C-RMN (75 MHz, CDCI3): δ 148,4, 147,3, 145,5, 144,1, 136,2, 134,9, 134,8, 130,9, 130,2,

124,8, 123,1, 118,6, 112,8, 112,1, 106,2, 100,4, 98,4, 71,5, 69,2, 68,9, 61,7, 59,6, 58,7, 58,6, 56,9, 56,6, 55,3, 41,5, 29,5, 25,7, 25,3, 17,9, 15,5, 8,7, -5,7, -5,8.

ESI-MS m/z: obliczono dla C36H51N3O8Si: 681,89; znaleziono (M+1)⁺: 682,3.

HPLC: warunki: kolumna - Symmetry C18; faza ruchoma AcN-bufor fosforanowy 25 mM, pH=5, izokratycznie (65% AcN) przez 5 minut, a następnie gradient AcN 65-92% przez 31 minut; 0: 0,6 ml/min, t^a: 40°C. Czas retencji: 27,89 minuty. Czystość według HPLC na postawie pola powierzchni pików: 89,62%.

Do roztworu 167 (9,95 g, 14,6 mmola) w bezwodnym CH2CI2 (300 ml) dodano wkraplając w atmosferze argonu w -15°C, roztwór bezwodnika kwasu benzenoseleninowego (7,51 g, 14,6 mmola, reagent czysty 70%) w bezwodnym CH2CI2 (120 ml) (wsytępujące białe ciało stałe usunięto). Następnie roztwór mieszano w -15°C przez 15 minut (TLC EtOAc/heksan 2:3 wykazała brak materiału wyjściowego). Do mieszaniny reakcyjnej w tej temperaturze dodano nasycony wodny roztwór kwaśnego węglanu sodu (150 ml). Warstwę organiczną oddzielono, a warstwę wodną ekstrahowano CH2CI2 (500 ml). Połączone ekstrakty organiczne wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono, a rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, EtOAc:heksan, gradient od 2:3 do 3:1) i uzyskano 168 (9,86 g, 97%) w postaci żółtego ciała stałego.

Rf=0,33 heksan:EtOAc 3:7.

¹H-NMR (300 MHz, CDCI₃) (proporcja izomerów: « 3:2): 5 6,59(s, 1H), 6,57(s, 1H), 5,77(s, 1H), 5,76(s, 1H), 5,68(s, 1H), 5,63(s, 1H), 5,19(d, J=6,0 Hz, 1H), 5,09(d, J=6,0 Hz, 1H), 5,07(d, J=6,1 Hz, 1H), 5,00(d, J=6,1 Hz, 1H), 4,40(d, J=2,7 Hz, 1H), 4,27(d, J=2,44 Hz, 1H), 4,22(d, J=10,5 Hz, 1H), 3,95(d, J=1,7 Hz, 1H), 3,86-3,75(m, 2H), 3,81(s, 3H), 3,72-3,68(m, 2H), 3,65(m, 2H), 3,54(s, 3H), 3,50(m, 3H), 3,31(s, 3H), 3,29(s, 3H); 3,24(m, 1H), 3,09(dt, J=3,2 Hz, J=7,6 Hz, 1H), 3,02(d, J=11,2 Hz, 1H), 2,92(m, 2H), 2,48(d, J=9,5 Hz, 1H), 2,43(d, J=9,3 Hz, 1H), 2,21(s, 3H), 2,14(s, 3H), 2,13(s, 3H), 2,03(m, 2H), 1,73(s, 3H), 1,71(s, 3H), 0,86 (s, 9H), 0,77(s, 9H), 0,04(s, 3H), 0,02(s, 3H).

¹³C-NMR (75 MHz, CDCI3): 200,5, 197,2, 159,8, 157,7, 148,4, 148,2, 147,7, 140,0, 137,6,

130,5, 130,2, 129,9, 129,4, 124,9, 124,7, 124,0, 122,7, 117,1, 116,9, 113,4, 110,8, 103,9, 103,8, 101,0, 100,4, 97,8, 72,8, 71,3, 69,7, 68,9, 68,8, 65,4, 64,1, 60,2, 59,9, 59,3, 59,1, 59,0, 58,6, 58,5,

56,8, 56,5, 56,2, 55,5, 54,9, 54,8, 42,5, 41,1, 40,9, 35,8, 25,6, 25,5, 25,4, 25,3, 20,6, 17,9, 17,8, 15,5,

15,3, 13,8, 7,0, 6,7, -5,7, -6,0, -6,1.

ESI-MS m/z: obliczono dla C36H51N3O9Si: 697,89; znaleziono (M+1)⁺: 698,8.

HPLC: warunki: kolumna - Symmetry C18; faza ruchoma AcN, bufor fosforanowy 25 mM, pH=5, gradient AcN 30-100% przez 50 minut; 0: 1,2 ml/min, t^a: 40°C. Czas retencji: 30,70 minuty i 30,95 minuty (dwa izomery). Czystość według HPLC na postawie pola powierzchni pików: 60,77% i 31,99%.

PL 203 745 B1

105

Do roztworu 168 (16,38 g, 23,47 mmola) w bezwodnym THF (727 ml, 0,03M) dodano, wkraplając w 23°C, 1M roztwór TBAF w THF (59 ml, 59 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 23°C przez 45 minut. Następnie mieszaninę podzielono pomiędzy nasycony wodny roztwór Nacl (850 ml) i CH2CI2 (950 ml). Obydwie warstwy rozdzielono, a warstwę organiczną wysuszono nad bezwodnym Na2SO4, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, EtOAc:heksan w gradiencie od 40:60, 50:50, 70:30, 90:10 do 100:0) i uzyskano 169 (12,17 g, 89%) w postaci jasnożółtego ciała stałego.

Rf=0,1 heksan:EtOAc 3:7.

¹H-MNR (300 MHz, CDCI3) (proporcja izomerów: 3:2): δ 6,63(s, 1H), 6,57(s, 1H), 5,79(s, 1H), 5,77(s, 1H), 5,75(s, 1H), 5,62(s, 1H), 5,23(s, 1H), 5,18(d, J=6,1 Hz, 1H), 5,08(d, J=6,1 Hz, 1H), 5,01(d, J=6,1 Hz, 1H), 4,22(d, J=2,7 Hz, 1H), 4,09(d, J=2,4 Hz, 1H), 4,00(m, 4H), 3,82(s, 3H), 3,87-3,64(m, 6H), 3,55(s, 3H), 3,51-3,44(m, 2H), 3,30(s, 3H), 3,29(s, 3H), 3,26(m, 1H), 3,18(dt, J1 =2,9 Hz, J2 =7,3 Hz, 1H), 2,94(m, 4H) 2,50(m, 4H), 2,22(s, 3H), 2,16(s, 3H), 2,15(s, 3H), 2,11(s, 3H), 2,02(d, J=7,3 Hz, 2H), 1,72(s, 3H), 1,69(s, 3H).

¹³C-NMR (75 MHz, CDCI3): 200,2, 200,1, 159,6, 158,5, 148,5, 148,4, 148,1, 147,9, 140,5,

137,4, 130,9, 130,4, 130,1, 130,0, 125,1, 124,9, 123,8, 122,7, 116,9, 116,6, 113,3, 110,7, 104,5,

103.9, 101,4, 100,7, 98,1, 97,9, 71,9, 71,5, 71,4, 70,1, 69,0, 69,0, 62,0, 60,1, 59,5, 58,7, 58,5, 58,1, 57,4,

56.9, 56,8, 56,4, 55,9, 55,1, 55,0, 41,3, 41,0, 36,1, 31,3, 25,3, 25,2, 22,4, 15,6, 15,5, 13,8, 7,0, 6,8.

ESI-MS m/z: obliczono dla C30H37N3O9: 583,63; znaleziono (M+1)⁺: 584,2.

Do roztworu 169 (11,49 g, 19,69 mmola) i Alloc-Cys-(Fm) (11,32 g, 29,53 mmola) (otrzymywanie, patrz Kruse, C.H.; Holden, K. G., J. Org. Chem. 1985, 50, str. 2792-2794) w bezwodnym CH2CI2 (688 ml) dodano w 23°C DMAP (2,4 g, 19,69 mmola) i EDC^HCI (9,44 g, 49,22 mmola). Następnie dodano w 0°C DIPEA (5,14 ml, 29,53 mmola) i reakcję mieszano w 23°C przez 3 godziny. Mieszaninę przemyto kolejno nasyconym wodnym roztworem NaHCO3 (500 ml), NaCI (400 ml) i NH4CI (2 x 300 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, AcOEt:heksan w gradiencie od 1:1, 6:4 do 7:3) i uzyskano 170 (14,76 g, 79%) w postaci jasnożółtego ciała stałego.

Rf=0,31 i 0,40 heksan:EtOAc 3:7 (mieszanina izomerów).

¹H-NMR (300 MHz, CDCI3): 7,74(d, J=7,6 Hz, 4H), 7,63(dd, J=7,0 Hz, J=15,3 Hz, 4H), 7,38(t, J=7,3 Hz, 4H), 7,29(m, 4H), 6,61 (s, 1H), 6,54(s, 1H), 5,89(m, 2H); 5,73(s, 1H), 5,70(s, 1H), 5,69(s, 1H), 5,62(s, 1H), 5,55(m, 1H), 5,32(d, J=15,1 Hz, 1H), 5,23(d, J=6,1 Hz, 1H), 5,22(d, J=10,6 Hz, 1H), 5,14(d, J=5,9 Hz, 1H), 5,13(d, J=6,0 Hz, 1H), 5,07(d, J=6,3 Hz, 1H), 4,68(m, 1H), 4,56(m, 4H), 4,51

106

PL 203 745 B1

55,2, 53,9, 46,9, 41,9, 41,4, 41,2, 37,2, 36,9, 35,4, 31,5, 29,6, 25,6, 25,4, 22,6, 15,8, 15,7, 14,1, 7,3, 7,0. ES|-MS m/z: obliczono dla C51H56N4O12S: 948,36; znaleziono (M+1)⁺: 949,3.

P r z y k ł a d 96

OMe

170

1) DMSO, Tf₂O

2) DIPEA

3) 'BuOH

4) N*Bu

X

Me₂N NMe₂

OMe

Me

C s

A_o

ĆN

171

5) Ac₂O, CH₂CI₂

Kolbę reakcyjną wygrzewano dwukrotnie płomieniem, przedmuchując próżnią/argonem kilka razy i utrzymywano pod argonem podczas reakcji. Do roztworu DMSO (5,4 ml) w bezwodnym CH2C|2 (554 ml) wkroplono bezwodnik kwasu triftalowego (5,11 ml, 30,4 mmola) w -78°C. Mieszaninę reakcyjną mieszano w -78°C przez 20 minut. Następnie dodano przez kaniulę roztwór 170 (14,43 g, 15,2 mmola) w bezwodnym CH2C|2 w -78°C. Podczas dodawania utrzymywano temperaturę -78°C w obydwu kolbach, przy czym kolor reakcji był żółty. Mieszaninę reakcyjną mieszano w -40°C przez 35 minut. Podczas tego okresu kolor roztworu uległ zmianie z żółtego na ciemnozielony. Po tym okresie czasu dodano wkraplając i-Pr2NEt (21,2 ml, 121,6 mmola) i mieszaninę reakcyjną trzymano w 0°C przez 45 minut. Podczas tego okresu kolor roztworu zmienił się na jasnobrązowy. Następnie dodano wkraplając t-BuOH (5,8 ml, 60,8 mmola) i tert-butyloguanidynę (18,3 ml, 106,4 mmola), i mieszaninę reakcyjną mieszano w 23°C przez 40 minut. Po tym okresie dodano kroplami bezwodnik octowy (14,34 ml, 152 mmola) i mieszaninę reakcyjną trzymano w 23°C przez 1 godzinę dłużej. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńczono CH2C|2 (38 ml) i przemyto nasyconym wodnym roztworem NH4C| (500 ml), NaHCO3 (500 ml) i NaC| (500 ml). Połączone warstwy organiczne wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, EtOAc:heksan w gradiencie od 3:7 do 4:6) i uzyskano 171 (6,24 g, 52%) w postaci jasnożółtego ciała stałego.

Rf=0,38 heksan:EtOAc 1:1.

ES|-MS m/z: obliczono dla C39H46N4O12S: 794,87; znaleziono: 796 (M+1)⁺, 817 (M+23)⁺.

HPLC: warunki: kolumna - Symmetry C18; faza ruchoma AcN/bufor fosforanowy (pH=5), gradient 45 do 65% przez 15 minut, a następnie 65-90% przez 36 minut; 0: 0,8 ml/min, t^a: 40°C. Czas retencji: 19,734 minuty. Czystość według HPLC na postawie pola powierzchni pików: 83,17%.

PL 203 745 B1

107

P r z y k ł a d 97

OMe

Do roztworu 171 (2,26 g, 2,85 mmola) w bezwodnym CH2CI2 (74 ml) i acetonitrylu (74 ml) dodano w 0°C Nal (3,42 g, 22,8 mmola) oraz TMSCI (świeżo przedestylowany znad CaH2) (2,6 ml, 22,8 mmola) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 35 minut. Do mieszaniny reakcyjnej w tej temperaturze dodano nasycony wodny roztwór kwaś nego wę glanu sodu (150 ml). Warstwę organiczną oddzielono, a warstwę wodną ekstrahowano CH2CI2 (2 x 100 ml). Połączone ekstrakty organiczne wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono, a rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymując 164 (2,4 g, 100%) w postaci jasnożółtego ciała stałego, które użyto w kolejnych reakcjach bez dalszego oczyszczania. Dane diagnostyczne związku 164 opisano powyżej w przykładzie 88.

Przekształcenie 164 w 35 zostało opisane powyżej w przykładzie 89.

Otrzymano półprodukty 35, 36, ET-770 i ET-743 według tych samych procedur, które zostały uprzednio ujawnione w PCT/GB00/01852.

Droga 6

Do roztworu 144 (7 g, 7,6 mmola) w MeOH (140 ml) dodano 1M NaOH (15,1 ml) i reakcję mieszano przez 10 minut w 23°C. Do mieszaniny reakcyjnej dodano nasycony wodny roztwór NH4CI (100 ml). Warstwę organiczną oddzielono i przemywano 5% HCI aż kolor ulegnie zmianie na żółty. Ekstrakt organiczny wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono, a rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, EtOAc:heksan w gradiencie od 0:1, 1:3, 1:2, 1:1, 1:1 do 3:1) i uzyskano związek 161 (3,76 g, 85%). Dane diagnostyczne związku 161 zostały uprzednio ujawnione w opisie patentowym USA. 5.721.362.

108

PL 203 745 B1

Do roztworu związku 161 (200 mg, 0,37 mmo|a) i cysteiny 152 (240 mg, 0,55 mmo|a) w bezwodnym CH₂CI₂ (20 ml) dodano w 23°C DMAP (110 mg, 0,925 mmola) i EDC^HCI (170 mg, 0,925 mmola) i reakcję mieszano w tej samej temperaturze przez 1,5 godziny. Następnie mieszaninę przemyto ko|ejno nasyconym wodnym roztworem NaHCO3 (15 ml), NaCI (15 ml) i NH4CI (2x10 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash na żelu krzemionkowym (SiO2, AcOEt/heksan w gradiencie od 1:4 do 1:2) i uzyskano związek 172 (285 mg, 80%) w postaci białego ciała stałego.

Rf=0,3 heksan:EtOAc 2:1.

¹H NMR (CDCI3) δ 7,73(d, J=7,5 Hz, 2H), 7,59-7,57(m, 2H), 7,40-7,28(m, 9H), 6,60(s, 1H), 5,69(s, 1H), 5,65(s, 1H), 5,54(d, J=7,8 Hz, 1H), 5,11-5,08(m, 4H), 4,52-4,49(m, 1H), 4,21-3,90(m, 6H), 3,83(s, 3H), 3,49(s, 3H), 3,21(d, J=6,6 Hz, 1H), 3,09-2,90(m, 6H), 2,41(d, J=18 Hz, 1H), 2,34-2,31(m, 1H), 2,25(s, 3H), 2,19(s, 3H), 1,88-1,83(m, 1H), 1,77(s, 3H).

¹³C-NMR (CDCI3) δ 198,7, 170,5, 158,4, 155,9, 148,9, 148,8, 145,8, 142,5, 141,3, 136,2, 131,4, 130,0, 128,8, 128,6, 128,4, 127,9, 127,3, 125,3, 125,0, 124,9, 123,0, 120,1, 117,5, 108,5, 104,8, 101,7,

99,5, 70,8, 67,4, 60,5, 57,8, 57,0, 56,5, 56,0, 55,5, 47,1, 41,6, 37,4, 37,1, 31,8, 25,8, 22,8, 15,9, 14,3, 7,6.

ESI-MS m/z: obliczono dla C53H54N4O11S: 954,35; znaleziono (M+23)⁺: 977,8.

P r z y k ł a d 100

Kolbę reakcyjną wygrzewano dwukrotnie płomieniem, przedmuchując próżnią/argonem kilka razy i utrzymywano pod argonem podczas reakcji. Do roztworu DMSO (977 μ!) w bezwodnym CH₂CI₂ (118 ml) wkroplono bezwodnik kwasu triflanowego (930 μΙ, 5,5 mmola) w -78°C. Mieszaninę reakcyjną mieszano w -78°C przez 20 minut. Następnie dodano przez kaniulę roztwór 172 (2,63 g, 2,75 mmola) w bezwodnym CH2CI2 (26 ml przy dodawaniu i 13 ml do przemycia) w -78°C (czas dodawania: 5 min). Podczas dodawania utrzymywano temperaturę -78°C w obydwu kolbach, przy czym kolor reakcji uległ zmianie z żółtego na brązowy. Mieszaninę reakcyjną mieszano w -40°C przez 35 minut. Podczas tego okresu kolor roztworu uległ zmianie z żółtego na ciemnozielony. Po tym okresie czasu dodano wkraplając i-Pr2NEt (3,48 ml, 22 mmola) i mieszaninę reakcyjną trzymano w 0°C przez 45 minut, kolor roztworu wówczas zmienił się na brązowy. Następnie dodano kroplami t-BuOH (1,04 ml, 11 mmola) i tert-bu-tylotetrametyloguanidynę (3,31 ml, 19,25 mmola), i mieszaninę reakcyjną mieszano w 23°C przez 40 minut. Po tym okresie dodano, wkraplając, bezwodnik octowy (2,6 ml, 27,5 mmola) i mieszaninę reakcyjną trzymano w 23°C przez 1 godzinę dłużej. Następnie mieszaninę reakcyjną rozPL 203 745 B1

109 cieńczono CH2CI2 (70 ml) i przemyto kolejno nasyconym wodnym roztworem NH4CI (180 ml), NaHCO3 (180 ml) i NaCI (180 ml). Połączone warstwy organiczne wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, heksan:EtOAc w gradiencie od 4:1, 3:1 do 2:1) i uzyskano związek 173 (1,145 g, 52%) w postaci białego ciała stałego.

Rf=0,31 heksan:EtOAc 3:2.

¹H NMR (CDCI3) δ 7,37(bs, 5H), 6,67(s, 1H), 6,08(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,99(d, J=1,2 Hz, 1H), 5,19-5,00(m, 4H), 4,82(d, J=9,3 Hz, 1H), 4,49(bs, 1H), 4,32-4,15(m, 5H), 3,67(s, 3H), 3,55(s, 3H), 3,44(d, J=4,8 Hz, 1H), 3,39(d, J=6 Hz, 1H), 2,90-2,87(m, 2H), 2,28(s, 3H), 2,19(s, 3H), 2,15-2,07(m, 2H), 2,03(s, 3H), 2,00(s, 3H).

¹³C-NMR (CDCI3) δ 170,6, 168,8, 155,8, 149,9, 148,5, 146,0, 141,2, 140,6, 136,6, 132,0, 130,4, 128,8, 128,7, 128,5, 125,2, 124,9, 120,5, 118,2, 113,7, 113,6, 102,2, 99,4, 67,2, 61,6, 60,7, 59,7, 59,3,

57,6, 55,1, 54,8, 54,2, 41,9, 41,6, 33,0, 29,9, 23,9, 20,6, 15,6, 9,8.

ESI-MS m/z: obliczono dla C41H44N4O11S: 800,87; znaleziono (M+23)⁺: 823,7.

Do roztworu związku 173 (100 mg, 0,125 mmola) w CH2CI2 (2 ml) i CH3CN (2 ml) dodano w 0°C Nal (75 mg, 0,5 mmola) i TMSCI (63 gl, 0,5 mmola). Po 50 minutowym mieszaniu w 23°C, do mieszaniny dodano wodę (30 ml) i ekstrahowano CH2CI2 (2 x 20 ml). Połączone warstwy organiczne przemyto kolejno nasyconym wodnym roztworem NaCI (20 ml) i ditioninem sodu (20 ml), wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono w próżni. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (SiO2, EtOAc:heksan w gradiencie od 1:4, 1:2 do 1:1) i uzyskano związek 158 (66 mg, 70%) w postaci białego ciała stałego.

Rf=0,21 heksan:EtOAc 1:1.

Dane diagnostyczne związku 158 opisano powyżej w przykładzie 19.

Przekształcenie 158 w 35 opisano powyżej w przykładzie 85. Otrzymano półprodukty 36, ET-770 i ET-743 według tych samych procedur, jak uprzednio ujawnione w PCT/GB00/01852.

Bibliografia

Patent europejski 309.477.

Patent amerykański 5.721.362.

Sakai, R., Jares-Erijman, E.A., Manzanares, I., Elipe, M.V.S. oraz Rinehart, K.L., J. Am. Chem. Soc, (1996), 118, 9017-9023.

Martinez, E.J., Owa, T., Schreiber, S.L. oraz Corey, E.J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 3496-3501.

Patent japoński Kokai JP-A2 59/225189.

Patent japoński Kokai JP-A2 60/084288.

Arai, T., Kubo, A., w The Alkaloids, Chemistry and Pharmacology; Brossi. A., ed.; Academic: Nowy Jork, 1983, wol. 21; str. 56-110.

Remers, W. A., w The Chemistry of Antitumor Antibiotics; wol. 2; Wiley; Nowy Jork, 1988, str. 93-118.

Gulavita N.K., Scheuer, P.J., Desilva, E.D., abstrakt z: Indo-United States Symp. on Bioactive Compounds from Marine Organisms; Goa, Indie, luty 23-27,1989, str. 28.

Arai, T., Takahashi, K., Kubo, A., J. Antibiot., 1977, 30, 1015-1018.

Arai, T., Takahashi, K., Nakahara, S., Kubo. A., Experientia, 1980, 36, 1025-1028.

110

PL 203 745 B1

Mikami, Y., Takahashi, K., Yazawa, K., Hour-Young, C, Arai, T., Saito, N., Kubo, A., J. Antibiot., 1988, 47, 734-740.

Arai, T., Takahashi, K., Ishiguro, K., Yazawa, K., J. Antibiot., 1980, 33, 951-960.

Yazawa, K., Takahashi, K., Mikami, Y., Arai, T., Saito, N., Kubo, A., J. Antibiot., 1986, 39,

1639-1650.

Arai, T., Yazawa, K., Takahashi, K., Maeda, A., Mikami, Y., Antimicrob. Agent Chemother.,1985, 25, 5-11.

Takahashi, K., Yazawa, K., Kishi, K., Mikami, Y., Arai, T., Kubo, A., J. Antibiot., 1982, 35, 196-201. Yazawa, K., Asaoka, T., Takahashi, K., Mikami. Y., Arai, T., J. Antibiot., 1982, 35, 915-917.

Frincke, J.M., Faulkner, D.J., J. Am. Chem. Soc, 1982, 104, 265-269.

He, H.-Y., Faulkner, D.J., J. Org. Chem., 1989, 54, 5822-5824.

Kubo, A., Saito, N., Kitahara, Y., Takahashi, K., Tazawa, K., Arai, T., Chem. Pharm. Bull.,

1987, 35, 440-442.

Trowitzsch-Kienast, W., Irschik, H., Reichenback, H., Wray, V., Hofle, G., Liebigs Ann. Chem.,

1988, 475-481.

Ikeda, Y., Idemoto, H., Hirayama, F., Yamamoto, K., Iwao, K., Asano, T., Munakata, T. J., Antibiot., 1983, 36, 1279-1283.

Asaoka, T., Yazawa, K., Mikami, Y., Arai, T., Takahashi, K., J. Antibiot., 1982, 35, 1708-1710.

Lown, J. W., Hanstock, C. C, Joshua, A. V., Arai, T, Takahashi, K., J. Antibiot., 1983, 36,

1184-1194.

Munakata, et al., patent amerykański, 4.400.752, 1984.

Y. Ikeda, et al., The Journal of Antibiotics., wol. XXXVI, nr 10, 1284, 1983.

R. Cooper, S. Unger, The Journal of Antibiotics, wol. XXXVIII, nr 1, 1985.

Corey, et al., patent amerykański, 5.721.362, 1998.

Corey, et al., J. Am. Chem. Soc, wol. 118, str. 9202-92034, 1996.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA., wol. 96. str. 3496-3501. 1999.

Claims (12)

1. Sposób wytwarzania związku ekteinascydynowego, znamienny tym, że obejmuje etap odbiezpieczania związku o wzorze A, w którym usuwa się obie grupy zabezpieczające w jednym etapie i wytwarza się α-aminolakton o wzorze 35, według poniższego schematu na którym Prot^NH oznacza grupę zabezpieczającą grupę aminową, a Prot^OH oznacza grupę zabezpieczającą grupę hydroksylową.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że Prot^NH oznacza t-butyloksykarbonyl, zaś Prot^OH oznacza metoksymetyl.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że Prot^NH oznacza t-butyloksykarbonyl, zaś Prot^OH oznacza metoksyetosymetyl.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje ponadto etap utleniania α-aminolaktonu o wzorze 35 do odpowiadającego α-ketolaktonu o wzorze 36 poprzez transaminację:

PL 203 745 B1

111

5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że obejmuje ponadto etap stereospecyficznego wytwarzania spirotetrahydroizochinolinowego związku Et770 z α-ketolaktonu o wzorze 36 poprzez reakcję Pictet-Spengler'a:

trowej w pozycji C-21 Et770 przez grupę hydroksy i wytworzenie Et743:

7. Sposób wytwarzania związku ekteinascydynowego, znamienny tym, że obejmuje etap, w którym utlenia się α-aminolakton o wzorze 35 do odpowiadającego α-ketolaktonu o wzorze 36 po-

112

PL 203 745 B1

8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że obejmuje ponadto etap stereospecyficznego wytwarzania spirotetrahydroizochinolinowego związku Et770 z α-ketolaktonu o wzorze 36 poprzez reakcję Pictet-Spengler'a:

9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że obejmuje ponadto etap zastąpienia grupy nitrowej w pozycji C-21 Et770 przez grupę hydroksy i wytworzenie Et743:

10. Sposób wytwarzania związku ekteinascydynowego, znamienny tym, że obejmuje etap, w którym prowadzi się stereospecyficzne wytwarzanie spirotetrahydroizochinolinowego związku Et770 z α-ketolaktonu o wzorze 36 poprzez reakcję Pictet-Spengler'a:

PL 203 745 B1

113

11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że obejmuje ponadto etap zastąpienia grupy nitrowej w pozycji C-21 Et770 przez grupę hydroksy i wytworzenie Et743:

12. Związek pośredni w syntezie związku ekteinascydynowego stanowiący związek o wzorze 35

13. Związek pośredni w syntezie związku ekteinascydynowego stanowiący związek o wzorze 36