PL204701B1 - Liofilizowana kompozycja czynnika VIII bez dodatku albuminy i jej zastosowanie - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest liofilizowana kompozycja czynnika VIII bez dodatku albuminy oraz jej zastosowanie.

Czynnik VIII stanowi występujące w osoczu białko, które odgrywa rolę kofaktora w kaskadzie reakcji prowadzących do krzepnięcia krwi. Niedobór aktywności czynnika VIII we krwi powoduje zaburzenie krzepliwości, znane jako hemofilia A, dziedziczną chorobę dotykającą głównie mężczyzn. Hemofilię A leczy się obecnie preparatami leczniczymi czynnika VIII pochodzącymi z osocza ludzkiego lub wytwarzanymi z wykorzystaniem technologii rekombinacji DNA. Preparaty takie podaje się albo w odpowiedzi na incydent krwawienia (terapia na żądanie) lub w czę stych, regularnych odstę pach czasu dla zapobiegania niekontrolowanym incydentom krwawienia (profilaktyka).

Wiadomo, że czynnik VIII jest stosunkowo nietrwały w preparatach farmaceutycznych. W osoczu krwi czynnik VIII jest zazwyczaj kompleksowany innym białkiem osocza, czynnikiem von Willebrand'a (vWF), który występuje w osoczu w dużym nadmiarze molowym w stosunku do czynnika VIII, w ten sposób zapobiega jego przedwczesnemu rozkładowi. W stabilizacji czynnika VIII in vivo może również odgrywać rolę inne cyrkulujące białko osocza, albumina. Aktualnie wytwarzane preparaty czynnika VIII bazują na stosowaniu do stabilizowania czynnika VIII w trakcie procesu wytwarzania i przechowywania przede wszystkim albuminy i/lub czynnika vWF.

Jednak w aktualnie wytwarzanych preparatach czynnika VIII albumina i vWF pochodzą z osocza krwi ludzkiej i ich stosowanie jest ograniczone przez szereg niedogodności. Z powodu konieczności dodawania do preparatów ogromnego nadmiaru molowego albuminy w stosunku do czynnika VIII w celu jego stabilizacji, wystę pują trudnoś ci ze scharakteryzowaniem samego biał ka czynnika VIII w powyższych preparatach. Dodanie albuminy pochodzącej z osocza ludzkiego do czynnika VIII jest również postrzegane jako niekorzystne w stosunku do preparatów czynnika VIII wytwarzanego metodą rekombinacji. Wynika to z faktu, że preparaty czynnika VIII wytwarzanego metodą rekombinacji, przy braku dodawanej albuminy, nie zawierają białek pochodzących z osocza ludzkiego, co teoretycznie zmniejsza ryzyko przenoszenia wirusów.

Opisano kilka prób formułowania czynnika VIII bez albuminy lub vWF (albo o stosunkowo niskiej zawartości tych składników). Na przykład w patencie USA 5565427 (EP 508194) złożonym na rzecz Freudenberga (należącym do Behringwerke) opisane są preparaty czynnika VIII zawierające oprócz substancji pomocniczych, takich jak chlorek sodu i sacharoza, szczególne połączenie substancji powierzchniowo czynnej i aminokwasu, a konkretnie argininy i glicyny. Substancja powierzchniowo czynna, polisorbat 20 lub polisorbat 80, jest obecna w ilości od 0,001 do 0,5% (obj./obj.), podczas gdy arginina i glicyna są obecne w ilości od 0,01 do 1 mola/l. Sacharoza jest obecna w ilości od 0,1 do 10%. W przykładzie 2 tego patentu podano, że roztwory: (1) sacharoza 0,75%, glicyna 0,4 M i NaCl 0,15 M oraz (2) cytrynian sodu 0,01 M, glicyna 0,08 M, lizyna 0,016 M, CaCl2 0,0025 M i NaCl 0,4 M po 16 godzinach nie były stabilne w roztworach, podczas gdy roztwory (3) sacharoza 1%, arginina 0,14 M, NaCl 0,1 M i (4) sacharoza 1%, glicyna 0,4 M, arginina 0,14 M, NaCl 0,1 M i Tween 80 0,05% wykazywały stabilność.

W patencie USA 5763401 (EP 818204) na rzecz Nayera (należącym do Bayer) również opisano preparaty farmaceutyczne czynnika VIII niezawierające albuminy, o składzie: sacharoza 15-60 mM, NaCl do 50 mM, CaCl2 do 5 mM, glicyna 65-400 mM i histydyna do 50 mM. Jako stabilne określono następujące konkretne preparaty: (1) NaCl 150 mM, CaCl2 2,5 mM i mannitol 165 mM; oraz (2) sacharoza 1%, NaCl 30 mM, CaCl2 2,5 mM, histydyna 20 mM i glicyna 290 mM. Preparat zawierający większe ilości cukru (maltoza 10%, NaCl 50 mM, CaCl2 2,5 mM i histydyna 5 mM) w postaci liofilizatu wykazuje słabą stabilność w porównaniu z preparatem (2).

W patencie USA 5733873 (EP 627 924) na rzecz Osterberga (należącym do Pharmacia & Upjohn) ujawniono preparaty o zawartości środka powierzchniowo czynnego w zakresie 0,01-1 mg/ml. W patencie tym ujawniono preparaty zawierające następujące substancje pomocnicze: polisorbat 20 lub 80 w iloś ci co najmniej 0,01 mg/ml, korzystnie 0,02-1,0 mg/ml; NaCl co najmniej 0,1 M; sól wapnia co najmniej 0,5 mM; oraz histydyna co najmniej 1 mM. W szczególności ujawnione zostały następujące konkretne preparaty: (1) histydyna 14,7-50-65 mM; NaCl 0,31-0,6 M, CaCl2 4 mM, polisorbat 80 0,001-0,02-0,025%, z 0,1% PEG 4000 lub bez PEG 4000 albo sacharoza 19,9 mM; oraz (2) mannitol 2 0 mg/ml, histydyna 2,67 mg/ml, NaCl 18 mg/ml, CaCl2 3,7 mM; i polisorbat 80 0,23 mg/ml.

Opisano także inne próby zastosowania chlorku sodu w niskich lub wysokich stężeniach. W patencie USA 4877608 (EP 315968) na rzecz Lee (należącym do Rhone-Poulenc Rorer) ujawniono prePL 204 701 B1 paraty o stosunkowo niskim stężeniu chlorku sodu, konkretnie preparaty o składzie: NaCl 0,5-15 mM, CaCl2 5 mM, histydyna 0,2-5 mM, chlorowodorek lizyny 0,01-10 mM i do 10% cukru. „Cukier może stanowić maltoza w stężeniu do 10%, 10% sacharoza lub 5% mannitol.

W patencie USA 5605884 (EP 0314 095) na rzecz Lee (należącym do Rhone-Poulenc Rorer) ujawniono stosowanie preparatów o stosunkowo wysokim stężeniu chlorku sodu. Preparaty te zawierają: NaCl 0,35-1,2 M, CaCl2 1,5-40 mM, histydynę 1-50 mM i „cukier w stężeniu do 10% taki jak mannitol, sacharoza lub maltoza. Podano przykład preparatu zawierającego: NaCl 0,45 M, CaCl2 2,3 mM i histydynę 1,4 mM.

W międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 96/22107 na rzecz Rosera (należącym do Quadrant Holdings Cambridge Limited) opisano preparaty zawierające cukier trehalozę. Preparaty te mają następujący skład: (1) NaCl 0,1 M, CaCl2 15 mM, histydyna 15 mM i trehaloza 1,27 M (48%); lub (2) CaCl2 0,011%, histydyna 0,12%, Tris 0,002%, Tween 80 - 002%, PEG 33500- 004%, trehaloza 7,5% oraz NaCl 0,13% albo 1,03%.

Pozostałe preparaty farmaceutyczne czynnika VIII znane ze stanu techniki na ogół zawierają albuminę i/lub vWF, w celu stabilizacji czynnika VIII, a zatem nie mają istotnego znaczenia dla obecnego wynalazku. Na przykład w patencie USA 5328694 (EP 511234) na rzecz Schwinna (należącym do Octapharma AG) opisano preparat o następującym składzie: disacharyd 100-650 mM i aminokwas 100 mM - 1,0 M. W szczególności ujawnione są następujące preparaty: (1) sacharoza 0,9 M, glicyna 0,25 M, lizyna 0,25 M i CaCl2 3 mM; oraz (2) sacharoza 0,7 M, glicyna 0,5 M i CaCl2 5 mM.

Mimo wielu wysiłków w kierunku formułowania czynnika VIII bez albuminy lub vWF, nadal istnieje zapotrzebowanie na preparaty farmaceutyczne czynnika VIII wykazujące stabilność bez obecności albuminy lub innych białek.

Niniejszy wynalazek dotyczy zatem kompozycji farmaceutycznych czynnika VIII trwałych bez dodatku albuminy.

Liofilizowana kompozycja czynnika VIII formułowana bez dodatku albuminy według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera oprócz czynnika VIII następujące substancje pomocnicze:

NaCl w stężeniu 300 mM do 500 mM, a korzystnie około 400 mM;

stabilizator wybrany z grupy obejmującej sacharozę, trehalozę, rafinozę i argininę - 1% do 4% wag./obj;

sól wapnia w stężeniu 1 mM do 5 mM;

oraz środek buforujący utrzymujący pH w przybliżeniu w zakresie od 6 do 8.

W zakres wynalazku wchodzi ponadto zastosowanie liofilizowanej kompozycji okreś lonej powyżej do wytwarzania środka leczniczego do leczenia hemofilii.

Definicje

O ile nie stwierdzono inaczej, określenia stosowane w tym opisie należy rozumieć w sposób następujący:

Czynnik VIII - cząsteczka czynnika VIII występuje w naturze oraz w preparatach farmaceutycznych w postaci niejednorodnie rozproszonych polipeptydów wywodzących się z jednego genu (patrz, np. Andersson i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 2979-2983, maj 1986). Określenie „czynnik VIII stosowane tutaj odnosi się do wszystkich takich polipeptydów, pochodzących z osocza krwi lub wytworzonych przy użyciu technik rekombinacji DNA. Dostępne na rynku przykłady preparatów farmaceutycznych zawierających czynnik VIII obejmują sprzedawane pod nazwą handlową HEMOFIL M i REKOMBINATE (dostępne z firmy Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, Illinois, USA). Inne preparaty znajdujące się aktualnie w badaniach zawierają przede wszystkim pojedyncze podzbiory cząsteczek czynnika VIII, z brakującą częścią domeny B cząsteczki. International Unit, IU - jednostka międzynarodowa - stanowi jednostkę miary aktywności (mocy) czynnika VIII przy krzepnięciu krwi mierzoną standardowym testem, na przykład jednym z następujących:

Test jednostopniowy. Testy jednostopniowe znane są w stanie techniki, jak np. opisane w publikacji Lee, Martin L i wsp., An Effect of Predilution on Potency Assays of Factor VIII Concentrates, Thrombosis Research (Pergamon Press Ltd.) 30, 511-519 (1983).

Testy barwne. Testy barwne, takie jak Coatest Factor VIII, są do nabycia na rynku z Chromogenix AB, Molndal, Szwecja.

Wygrzewanie - określenie „wygrzewanie będzie stosowane do wskazania etapu procesu liofilizacji preparatu farmaceutycznego poddawanego liofilizacji, występującego przed zamrażaniem preparatu, w trakcie którego temperaturę preparatu podwyższa się od temperatury niższej do wyższej, a następnie po pewnym okresie czasu ponownie obniża się.

PL 204 701 B1

Środek objętościowy - dla celu obecnego wynalazku środki objętościowe stanowią jednostki chemiczne nadające strukturę „plackowi lub pozostałej stałej masie preparatu farmaceutycznego po jego liofilizacji, zapobiegające jego zapadaniu. Krystalizujący środek objętościowy oznaczać będzie niniejszym opisany środek objętościowy, który można poddawać krystalizacji podczas liofilizacji, inny niż chlorek sodu. Do tej grupy krystalizujących środków objętościowych nie zalicza się HES.

Sublimacja, zamrażanie, liofilizacja - „sublimacja, jeśli nie wynika inaczej z kontekstu, w jakim się pojawia, będzie stosowana do wskazania części procesu liofilizacji, w której podwyższa się temperaturę preparatu farmaceutycznego w celu odprowadzenia z niego wody. Etapy „zamrażania w procesie liofilizacji są to etapy poprzedzające etap „sublimacji. „Liofilizacja, jeśli nie wskazano inaczej, będzie odnosić się do całego procesu liofilizacji, obejmującego zarówno etapy zamrażania jak i sublimacji.

Jeśli nie zaznaczono inaczej, określenia procentowe wyrażają procenty wagowo-objętościowe, a temperatura wyraż ona jest w skali Celsjusza.

Składniki preparatów

Kompozycje czynnika VIII według wynalazku zawierają środki objętościowe, stabilizatory, środki buforujące, chlorek sodu, sole wapnia i ewentualnie inne substancje pomocnicze. Substancje pomocnicze dobiera się w celu zwiększenia trwałości czynnika VIII w liofilizowanym preparacie. Jednakże kompozycje czynnika VIII według wynalazku są trwałe także w postaci ciekłej.

Stosowane w preparacie według wynalazku stabilizatory wybrane są z grupy obejmującej sacharozę, trehalozę, rafinozę i argininę. Środki te są obecne w preparacie według wynalazku w zakresie ilościowym 1-4%, korzystnie 2-3%, bardziej korzystnie około 2%. Rozważano użycie jako potencjalnych stabilizatorów sorbitolu i glicerolu, ale okazały się one słabymi stabilizatorami preparatów.

Dodatkowo, ze względu na możliwość szkodliwego wpływu zmian pH na cząsteczkę czynnika VIII w trakcie liofilizacji, preparat zawiera substancje buforujące. Wartość pH powinna być utrzymywana w zakresie 6-8, bardziej korzystnie około 7. Substancję buforującą może stanowić dowolny fizjologicznie akceptowalny związek chemiczny lub połączenie związków chemicznych, posiadające odpowiednią pojemność buforową, między innymi histydyna, Tris, BIS-Tris Propan, PIPES, MOPS, HEPES, MES i ACES. Pełne nazwy chemiczne substancji buforujących przedstawiono w tabeli 1 poniżej. Zazwyczaj substancja buforująca jest obecna w stężeniu 10-50 mM. W przypadku dodawania do preparatu histydyny, stosuje się ją w stężeniach ponad 20 mM, korzystnie ponad 25 mM, samą lub w połączeniu z innymi buforami, takimi jak Tris. Histydyna stanowi bufor szczególnie przydatny do stosowania w kompozycjach według wynalazku, co zostanie opisane szczegółowo poniżej.

T a b e l a 1 - substancje buforujące

Tris	Tris-(hydroksymetylo)-aminometan
BIS-Tris Propan	1,3-bis-[tris-(hydroksymetylo)metyloamino]-propan
PIPES	Kwas piperazyno-N,N'-bis-(2-etanosulfonowy)
MOPS	Kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy
HEPES	Kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowy
MES	Kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy
ACES	Kwas N-2-acetamido-2-aminoetanosulfonowy

Dla zachowania aktywności czynnika VIII istotna jest obecność w preparatach według wynalazku wapnia lub innego dwuwartościowego kationu zdolnego do oddziaływania z czynnikiem VIII i podtrzymywania jego aktywności, przypuszczalnie przez utrzymywanie asocjacji ciężkich i lekkich łańcuchów czynnika VIII. Można stosować od 1 mM do 5 mM sól wapnia, korzystnie 3-4 mM, szczególnie korzystnie około 4 mM. Sól wapnia korzystnie stanowi chlorek wapnia, ale może to być również inna sól wapnia, taka jak glukonian wapnia, glubionian wapnia lub glukoheptonian wapnia.

Kompozycje czynnika VIII według wynalazku korzystnie zawierają także środek powierzchniowo czynny, korzystnie w ilości 0,1% lub mniejszej, bardziej korzystnie w ilości około 0,03%. Środek powierzchniowo czynny może być na przykład wybrany z grupy obejmującej polisorbat 20, polisorbat 80,

PL 204 701 B1 po-liole Pluronic i Brij 35 (eter monolaurynowy glikolu polioksyetylenowego). Dostępnych jest kilkanaście gatunków polioli Pluronic (sprzedawanych pod nazwą handlową Pluronic, wytwarzanych przez BASF Wyandotte Corporation). Jako środki powierzchniowo czynne stosowane są poliole o zróżnicowanym ciężarze cząsteczkowym (od 1000 do ponad 16000) i własnościach fizyko-chemicznych. Zarówno Pluronic F-38, ciężar cząsteczkowy 5000 jak i Pluronic F-68, ciężar cząsteczkowy 9000, zawierają 80% (wagowych) hydrofilowych grup polioksyetylenowych i 20% hydrofobowych grup polioksypropylenowych. Jednakże preferowany w obecnym preparacie jest Tween-80, handlowy polisorbat, w szczególnoś ci Tween-80 pochodzenia roś linnego.

Preparaty czynnika VIII według wynalazku korzystnie zawierają także przeciwutleniacz. Stwierdzono, że dodanie do liofilizowanych preparatów według wynalazku przeciwutleniacza wpływa na poprawę stabilności preparatów i przedłuża ich okres trwałości. Stosowane przeciwutleniacze muszą wykazywać zgodność ze składnikami preparatu, a dodatkowo korzystne jest aby były rozpuszczalne w wodzie. W przypadku dodawania do preparatu przeciwutleniaczy, powinno si ę je dodawać w ostatniej chwili w procesie poprzedzającym liofilizację, aby uniknąć samorzutnego utleniania przeciwutleniacza. W tabeli 2 zestawiono przeciwutleniacze dostępne w handlu poprzez firmy takie jak Calbiochem i Sigma.

T a b e l a 2 - przeciwutleniacze

N-acetylo-L-cysteina / Homocysteina Glutation

Kwas 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochromano-2-karboksylowy (Troxol)

Kwas liponowy Metionina

Tiosiarczan sodu Platyna

Glicyna-glicyna-histydyna (tripeptyd)

Butylohydroksytoluen (BHT)

Spośród wymienionych przeciwutleniaczy preferowany jest glutation. Stwierdzono, że stężenia w zakresie około 0,05 mg/ml do ponad 1,0 mg/ml podnoszą trwałość kompozycji czynnika VIII, ale należy przypuszczać, że równie odpowiednie będą stężenia wyższe (do momentu wystąpienia działania toksycznego lub niepożądanych efektów przetwórczych, takich jak obniżenie temperatury zeszklenia liofilizowanego produktu).

Stwierdzono w szczególności, że na trwałość kompozycji czynnika VIII korzystne działanie synergiczne ma połączenie histydyny i glutationu. Histydyna, działając jako bufor, może odgrywać także rolę czynnika chelatującego. W zakresie, w jakim dezaktywacja czynnika VIII jest spowodowana wywołanym obecnością metalu utlenianiem, histydyna może działać stabilizująco na czynnik VIII, wiążąc utleniające jony metalu. Uważa się, że wiążąc metale, glutation (lub inny przeciwutleniacz) jest w stanie zapewnić dalszą ochronę przed utlenianiem, ponieważ działanie utleniające jonów metalu ulega zahamowaniu w wyniku ich związania przez histydynę.

W kompozycjach według wynalazku można takż e stosować inne środki chelatujące. Jeś li w kompozycji stosowane są sole wapnia, to ś rodki chelatują ce powinny wykazywać wię ksze powinowactwo do wiązania metali takich jak miedź i żelazo niż wapń. Jeden z odpowiednich chelatorów stanowi deferoksamina, środek chelatujący ułatwiający wiązanie jonów A1+++ i żelaza. Mesylan deferoksaminy, C25H48N6O8*CH4O3S, można nabyć z Sigma (Sigma Prod. Nr D9533). Jest to chelator glinu i żelaza(II), chelatujący żelazo (jako kompleks chelatowy 1:1) tylko na stopniu utlenienia +3, a nie +2, mogący ponadto chelatować także jony manganu i innych metali. Deferoksaminę można korzystnie stosować w ilości 0,25 mg/l.

Stosowany w preparatach według wynalazku czynnik VIII może stanowić albo czynnik VIII o wysokim stopniu czystoś ci pochodzą cy z osocza ludzkiego lub bardziej korzystnie moż e to być czynnik VIII wytwarzany metodą rekombinacji. Rekombinantowy czynnik VIII może być wytwarzany przez komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) transfekowane wektorem niosącym sekwencję DNA kodującą cząsteczkę czynnika VIII. Sposoby otrzymywania takich transfekowanych komórek CHO są opi6

PL 204 701 B1 sane, między innymi, w patencie USA nr 4757006 na rzecz Toole, Jr., z techniki znane są również alternatywne metody (patrz np. patent US 4868112, również Toole, Jr., oraz zgłoszenie międzynarodowe PCT WO-A-91-09122). Metody stosowane do hodowli komórek CHO wytwarzających czynnik VIII są także znane z techniki, na przykład ze zgłoszenia patentu europejskiego EP 0362218 należącego do Genetics Institute, zatytułowanego „Improved method for producing Factor VIII:C-type proteins. Rekombinantowy czynnik VIII może być także wytwarzany na innych liniach komórkowych, takich jak komórki nerek noworodków chomika (BHK). Wytwarzana metodą rekombinacji cząsteczka czynnika VIII może stanowić albo czynnik VIII pełnej długości lub jego pochodną z delecją, taką jak cząsteczka czynnika VIII pozbawiona domeny B.

Opisane w tym zgłoszeniu kompozycje czynnika VIII mogą być liofilizowane i odtwarzane do wskazanego stężenia, dla specjalisty jest więc oczywiste, że preparaty można także odtwarzać w bardziej rozcieńczonej postaci. Na przykład, preparat według wynalazku liofilizowany i/lub normalnie odtwarzany w 2 ml roztworu, może być także odtwarzany w większej objętości rozpuszczalnika, na przykład w 5 ml. Szczególnie dogodne jest bezzwłoczne wstrzykiwanie preparatu czynnika VIII pacjentowi, ponieważ w tym przypadku czynnik VIII jest mniej narażony na zmniejszenie aktywności, która następuje w sposób gwałtowniejszy w bardziej rozcieńczonych roztworach czynnika VIII.

Opracowanie preparatu i liofilizacji

W celu uzyskania maksymalnej stabilnoś ci, kompozycje czynnika VIII wedł ug wynalazku korzystnie poddaje się liofilizacji. Podczas liofilizacji, czynnik VIII przechodzi z fazy ciekłej w bezpostaciową fazę amorficzną, co jest uważane za zabezpieczające białko przed niestabilnoś cią chemiczną i/lub konformacyjną. Liofilizowany preparat oprócz fazy amorficznej zawiera także składnik ulegający podczas liofilizacji krystalizacji. Przypuszczalnie umożliwia to szybką liofilizację kompozycji czynnika VIII i powstawanie bardziej zadowalającego placka (to znaczy placka, który w minimalnym stopniu odstaje od brzegu pojemnika, w którym był liofilizowany). W preparatach według wynalazku stabilizatory dobrano tak, aby występowały przede wszystkim w fazie amorficznej liofilizowanego produktu.

Zarówno czynnik VIII jak i stabilizator korzystnie są rozproszone w fazie amorficznej placka liofilizacyjnego. Masa stabilizatora korzystnie jest stosunkowo duża w porównaniu z masą pozostałych substancji pomocniczych fazy amorficznej. Ponadto, pozorna temperatura zeszklenia (Tg') fazy amorficznej podczas sublimacji korzystnie jest stosunkowo wysoka, podobnie jak temperatura zeszklenia (Tg) stałej substancji podczas przechowywania. Stwierdzono, że pożądana jest krystalizacja chlorku sodu w produkcie, ponieważ amorficzny chlorek sodu będzie obniżał Tg' fazy amorficznej.

W celu uniknięcia zapadania się placka w konkretnej kompozycji, główne suszenie korzystnie prowadzi się przy temperaturze produktu niższej od pozornej temperatury zeszklenia zamrożonego koncentratu. Dla uzyskania obniżenia Tg' może być także konieczne wydłużenie czasu suszenia. Dalsze informacje na temat liofilizacji można znaleźć w publikacji Carpenter, J.F. i Chang, B.S., Lyophilization of Protein Pharmaceuticals, Biotechnology and Biopharmaceutical Manufacturing, Processing and Preservation, wyd. K.E. Avis i V.L. Wu (Buffalo Grove, Izrael: Interpharm Press, Inc.), str. 199-264 (1996).

P r z y k ł a d 1

Wpływ stężenia czynnika VIII i dodatku stabilizatora na odtwarzanie czynnika VIII badano w szeregu prób. Badania te prowadzono stosują c jako wzorcowy ś rodek obję toś ciowy mannitol, a jako wzorcowy stabilizator sacharozę. W tabeli 3 opisano trzy próbne preparaty stosowane w badaniach. Wszystkie stosowane w badaniach preparaty zawierały 10 mM Tris, 200 mM NaCl, 8% mannitol, 4 mM CaCl2 i 0,02% Tween-80 i miał y pH 7,0.

T a b e l a 3

Próbka nr	Stężenie początkowe czynnika VIII (lU/ml)	Sacharoza %
IA	600	-
IB	60	-
IC	60	2

Próbki te poddawano liofilizacji, stosując cykl sublimacji przedstawiony w tabeli 4, mający na celu utrzymanie temperatury produktu poniżej pozornej temperatury zeszklenia (Tg'). Badania metodą

PL 204 701 B1 skaningowej kalorymetrii różnicowej (DSC) wykazały w preparatach opartych na mannitolu występowanie przemiany w temperaturze w przybliżeniu -40°C. W celu utrzymania temperatury produktu poniżej tej wartości, temperaturę półki podczas głównego suszenia ustalono na -32°C. Główne suszenie prowadzono w tych warunkach przez około 55 godzin, podczas gdy cały cykl trwał około 80 godzin.

T a b e l a 4

Metoda zamrażania/wytwarzania	Opis
I (zamrażanie)	Chłodzenie do +5°C; Chłodzenie do -5°C z szybkością 1°C /min, utrzymywanie przez 20 minut, Chłodzenie do -20±5°C z szybkością 1°C/min, utrzymywanie przez 1 godzinę (do 3 godzin); Chłodzenie do -45°C z szybkością 0,5°C /min, utrzymywanie przez 1 godzinę.
II	Zamrażanie według metody I Utrzymywanie w temperaturze -35°C przez 48 godzin.
III	Zamrażanie według metody I Utrzymywanie w temperaturze -35°C przez 48 godzin; Utrzymywanie w temperaturze -20°C przez 48 godzin.
IV (sublimacja)	Półka -32°C podczas głównego suszenia przez około 55 godzin (do 100 godzin); Produkt <40°C podczas głównego suszenia; Jednostajny wzrost od -32°C do +40°C z szybkością 0,2°C/min; Półka +40°C podczas drugiego suszenia przez 3 godziny.

Aktywność czynnika VIII w próbkach, określano metodą jednostopniowego testu na krzepliwość, porównywano z próbką kontrolną utrzymywaną w temperaturze -45°C. Wyniki oznaczenia przedstawiono w tabeli 5.

T a b e l a 5

Metoda wytwarzania	% utraty aktywności czynnika VIII podczas każdego etapu
	Preparat IA (600 lU/ml)	Preparat IB (60 lU/ml)	Preparat IC (60 lU/ml, 2% sacharozy)
I	6,7	37,5	41,7
II	2,0	9,3	3,9
III	7,3	11,6	5,0
IV (liofilizacja)	20,0	24,2	18,3

Rezultaty wskazują, że stężenie białka wywiera wpływ na odtwarzanie czynnika VIII podczas zamrażania. Preparaty zawierające 60 IU/ml utraciły około 37-42% początkowej aktywności czynnika VIII podczas etapu zamrażania, podczas gdy w preparatach zawierających 600 IU/ml utrata aktywności czynnika VIII wynosiła 6,7%. Rezultaty te wskazują, że wyższe stężenie białka wywiera działanie krioochronne podczas zamrażania. Jakkolwiek sacharoza zapewniała pewną ochronę czynnikowi VIII przy temperaturach pośrednich, jak również podczas sublimacji, to nie wykazywała działania ochronnego w etapie głównego zamrażania.

P r z y k ł a d 2

W rezultacie opracowania metody liofilizacji przedstawionej w przykładzie 1, podjęto dalsze próby optymalizacji tego procesu. Stwierdzono, że kompozycje liofilizatu posiadające wyższą temperaturę zeszklenia (i, teoretycznie, większą trwałość czynnika VIII) można wytwarzać przez: (1) obniżenie temperatury pierwszego zamrażania do -45°C lub poniżej (na przykład do około -50°C lub -55°C); (2) podniesienie temperatury do -20°C lub -22°C (±5°C); a następnie (3) ponowne obniżenie temperatury do -45°C lub poniżej. Temperaturę podnosi się lub obniża, zależnie od przypadku, z szybkością w zakresie od okoł o 0,5°C do okoł o 1,0°C/minut ę . Po osią gnię ciu pożądanej temperatury, kompozycję

PL 204 701 B1 utrzymuje się w tej temperaturze przez czas od 1 do 3 godzin. Ten ulepszony cykl zamrażania przedstawiono w tabeli 6.

T a b e l a 6

Metoda zamrażania	Opis
I	Chłodzenie do +5°C; Chłodzenie do -5°C z szybkością 0,5-1 °C/min, utrzymywanie przez 20 minut; Chłodzenie do temp. od -55°C do -45°C z szybkością 0,5° - 1 C/min, utrzymywanie przez 1 godzinę; Ogrzewanie do -22°C (±5°C) z szybkością 0,5-1°C/min, utrzymywanie przez 1 do 3 godzin; Chłodzenie do -45°C z szybkością 0,5-1°C/ minutę, utrzymywanie przez około 1 godzinę.

Jeśli nie wskazano inaczej, temperatury podane w tym i pozostałych przykładach odnoszą się do temperatur półki liofilizatora, a nie do temperatury samego produktu. Po ulepszeniu cyklu zamrażania, pozostałą część procesu liofilizacji można prowadzić jak wskazano w przykładzie 1, lub w inny opisany tutaj sposób albo zgodnie z wiedzą specjalisty.

Ten ulepszony sposób liofilizacji okazał się przydatny w przypadku preparatów zawierających jako środek objętościowy glicynę, jak również dla preparatów z mannitolem. Ma on także zastosowanie do wytwarzania preparatów wykorzystujących inne środki objętościowe według wynalazku.

P r z y k ł a d 3

Należy przypuszczać, że w celu uzyskania produktu sublimacji o akceptowalnym wyglądzie placka i temperaturze zeszklenia, może zajść potrzeba krystalizacji środka objętościowego liofilizowanych preparatów farmaceutycznych zawierających chlorek sodu, takiego jak glicyna lub mannitol. Opracowano zatem następującą ulepszoną metodę liofilizacji dla krystalizujących substancji objętościowych.

T a b e l a 7a - etapy zamrażania

Etap procesu	Temperatura	Czas trwania etapu
Pierwsze zamrażanie	-40°C lub poniżej	1 godzina
Pierwsze wygrzewanie	od -25°C do -27°C	3 godziny
Drugie zamrażanie	-55°C	1 godzina
Drugie wygrzewanie	-36°C	4 godziny
Trzecie zamrażanie	-50°C	1 godzina

T a b e l a 7b - etapy sublimacji

Etap procesu	Temperatura	Czas trwania etapu
Pierwsze suszenie	-35°C	Do 100 godzin
Drugie suszenie: etap pierwszy	40°C	3 godziny
Drugie suszenie: etap drugi	45°C	3 godziny
Drugie suszenie: etap trzeci	50°C	3 godziny

Zmiany temperatury w etapach zamrażania następowały z szybkością od około 0,5°C/minutę do około 1°C /minutę. Należy przypuszczać, że dłuższy czas trwania poszczególnych etapów byłby równie skuteczny.

Przed pierwszym etapem zamrażania, ustala się temperaturę w zakresie od około 2°C do około 8°C przez około 1 godzinę, w celu doprowadzenia wszystkich ampułek do mniej więcej jednakowej temperatury. Następnie liofilizator chłodzi się do -5°C. Pierwszy etap zamrażania powinno się prowadzić w temperaturze poniżej -30°C, korzystnie poniżej -35°C, szczególnie korzystnie około -40°C. Po jego zakończeniu, pierwszy etap wygrzewania powinien być prowadzony w temperaturze w zakresie

PL 204 701 B1 od -30°C do -19°C, bardziej korzystnie albo w zakresie od około -25°C do -28°C (jeśli środek objętościowy stanowi glicyna), albo w zakresie od -21°C do -24°C (jeśli środek objętościowy stanowi mannitol), przy czym najbardziej preferowane są temperatury od -23°C do -26°C, w których jak należy przypuszczać, krystalizujące środki objętościowe ulegają, co najmniej częściowej, krystalizacji. Niższy zakres temperatur, w pobliżu -27°C, w przypadku preparatów zawierających mannitol lub argininę nie jest zalecany. Ten etap prowadzi się korzystnie przez około 3 godziny.

Po zakończeniu pierwszego etapu wygrzewania, obniża się temperaturę, korzystnie do poniżej około -50°C, a bardziej korzystnie do poniżej -55°C przez około 1 godzinę. Należy przypuszczać, że w tym czasie w preparacie zarodkuje chlorek sodu.

Podczas drugiego etapu wygrzewania, temperaturę preparatu farmaceutycznego podnosi się do zakresu od około -30°C do -39°C, korzystnie do około -33°C dla kompozycji zawierających mannitol i -36°C dla kompozycji zawierających glicynę. Należy przypuszczać, że w tym czasie następuje, czynnika VIII według wynalazku przynajmniej częściowy, wzrost kryształów NaCl. Ten etap prowadzi się przez około 4 godziny. Po jego zakończeniu, temperaturę liofilizatora obniża się do około -50°C, korzystnie przez około 1 godzinę, w celu obniżenia temperatury preparatu.

W następujących potem etapach sublimacji, zmiany temperatury zachodzą z szybkością w zakresie od około 0,1°C/minutę do około 0,5°C/minutę. Po obniżeniu ciśnienia w liofilizatorze do około 8,67Pa (65 mTorów), temperaturę podnosi się do zakresu od około -32°C do około -35°C dla pierwszego suszenia. W tej temperaturze sublimują z preparatu kryształy lodu. Etap prowadzi się przez czas do 100 godzin, albo do czasu aż większość lodu ulegnie sublimacji. Temperaturę, w której większość lodu uległa sublimacji można określić, na przykład, stosując czujnik punktu rosy, który wskazuje koniec sublimacji lodu, gdy odczyt spada (punkt przegięcia).

Po etapie pierwszego suszenia temperaturę podnosi się do +40°C, korzystnie z szybkością 0,2°C/minutę, dla zapoczątkowania drugiego suszenia mającego na celu usunięcie kolejnej części wody z preparatu. Temperaturę tę utrzymuje się korzystnie przez około 3 godziny. Drugi i trzeci etap drugiego suszenia następują po etapie pierwszym, gdzie temperaturę podnosi się do około +45°C przez około 3 godziny, a następnie do około +50°C przez kolejne trzy godziny w celu obniżenia zawartości wody w placku liofilizacyjnym do poniżej 2% (wag./wag.).

P r z y k ł a d 4

W innym badaniu określono charakterystyki fizyczne szeregu potencjalnych preparatów czynnika VIII, zawierających siedem wytypowanych stabilizatorów i pięć środków objętościowych. Oprócz środka objętościowego i stabilizatora, wszystkie zebrane w tabeli 8 preparaty (z wyjątkiem preparatu 11), zawierały 10 mM Tris*HCl, 200 mM NaCl, 0,02% Tween-80, 4 mM CaCl2 i miały pH 7,0. Preparat 11 zawierał 10 mM Tris*HCl, 0,02% Tween-80 i 4 mM CaCl2, jego pH wynosiło 7,0. Wszystkich pomiarów pH dokonywano w temperaturze pokojowej.

T a b e l a 8

Próbka nr	Substancja objętościowa	Stabilizator białka
1	8% mannitol	2% sacharoza
2	8% mannitol	2% trehaloza
3	8% mannitol	2% rafinoza
4	8% mannitol	2% arginina
5	8% mannitol	2% lizyna
6	8% mannitol	2% sorbitol
7	8% mannitol	2% glicerol
8	4% hydroksyetyloskrobia 8% glicyna	2% sacharoza
9	8% glicyna	2% sacharoza
10	400 mM NaCl	2% trehaloza
11	8% alanina	2% sacharoza
12		2% sacharoza

PL 204 701 B1

W celu przewidzenia zachowania próbek podczas sublimacji stosowano pomiary temperatury zapadania metodą mikroskopii sublimacyjnej i pomiary przemian termicznych metodą DSC. W celu określenia stopnia krystaliczności liofilizowanych próbek stosowano także DSC, dyfrakcję proszkową i mikroskopię ze ś wiatł em spolaryzowanym. Oceniano te ż czas odtwarzania i wyglą d próbek. Rezultaty wszystkich pomiarów zebrano w tabeli 9.

T a b e l a 9

Próbka nr	Tpc (°C)	—1 O o	Tg (°C)	Odtwarzanie (s)	Zawartość wody (%)	Wygląd
1	-14	-10	54	64	n/k	Zadowalający
2	-20	-15	53	62	1,4	Wierzchołek częściowo zapadnięty
3	-15	-10	54	77	1,7	Zadowalający
4						Częściowo zapadnięty
5	-	-	-	-	-	Zapadnięty
6	n/k	n/k	<10 C*	63	0,6	Zadowalający
7	-	-	<10C*	-	-	Zadowalający
8	-	-	86	49	0,7	Zadowalający, ale odstaje od brzegów
9	-	-	54	22	0,8	Zadowalający
10	-	-	63	18	-	Zadowalający
11	-	-	66	11	0,4	Zadowalający (warstwa na dnie)
12	-	-	-	57	0,5	Zadowalający

* sorbitol i glicerol mają temperatury zeszklenia <10°C. Zakres skanowania DSC nie obejmował temperatur w tym przedziale n/k = nieklarowny

Tpc = temperatura, w której występuje częściowe zapadanie pod mikroskopem sublimacyjnym

Tc = temperatura, w której występuje całkowite zapadanie pod mikroskopem sublimacyjnym

Tg = temperatura zeszklenia

Z wyją tkiem preparatów zawierają cych mannitol - lizynę , wszystkie preparaty posiadał y odpowiedni wygląd. Lizyna przeszkadzała krystalizacji zarówno mannitolu jak i glicyny, co powodowało obniżanie temperatury zeszklenia i zapadanie się placka liofilizacyjnego.

P r z y k ł a d 5

Kompozycje czynnika VIII opisane w tabeli 8 umieszczono na różne okresy czasu w magazynie w temperaturach -70°C, 25°C, 40°C i 50°C w celu okreś lenia ich stabilnoś ci. Poziomy aktywnoś ci czynnika VIII określano po 2 tygodniach, 1 miesiącu, 2 miesiącach i 3 miesiącach, a rezultaty zebrano w tabeli 10. Dwie próbki, jedna z mannitolem jako ś rodkiem obję tościowym i sorbitolem jako stabilizatorem oraz druga z mannitolem jako środkiem objętościowym i glicerolem jako stabilizatorem, wykazały niską stabilność.

Wszystkie pozostałe preparaty wykazały zdolność stabilizowania czynnika VIII.

T a b e l a 10

Opis preparatu	Temp. (°C)	% na początku miesiąca
0	0,5	1	2	3
1	2	3	4	5	6	7
Glicyna - sacharoza	-70	100,0	97,43	101,71	99,89	97,97
	25	100,0				85,44
	40	100,0		79,87	71,52	63,06
	50	100,0	76,34	67,99	52,14	47,64

PL 204 701 B1 cd. tabeli 10

1	2	3	4	5	6	7
Glicyna - trehaloza	-70	100,0	89,22	96,00	95,90	94,64
	25	100,0				83,17
	40	100,0		79,93	72,42	68,03
	50	100,0	80,97	64,28	57,60	50,92
Mannitol - trehaloza	-70	100,0	91,32	97,72	96,10	98,26
	25	100,0				85,79
	40	100,0		82,54	70,72	59,44
	50	100,0	66,16	65,51	48,81	52,06
Mannitol - sacharoza	-70	100,0	100,45	100,56	105,47	99,22
	25	100,0				87,04
	40	100,0		85,59	80,78	55,42
	50	100,0	81,68	75,53	57,88	43,46
Mannitol - arginina	-70	100,0	102,26	105,53	103,72	105,08
	25	100,00				95,15
	40	100,00		91,53	80,93	69,19
	50	100,00	82,28	68,06	56,32	45,94
Mannitol - rafinoza	-70	100,00	93,88	98,41	100,68	103,62
	25	100,00				83,13
	40	100,00		81,09	73,61	67,16
	50	100,00	71,69	68,52	54,25	47,11
Mannitol - glycerol	-70
	25
	40
	50
Mannitol - sorbitol	-70	100,00	104,06
	25	100,00
	40	100,00
	50	100,00	32,73
HES - sacharoza	-70	100,00	102,74	103,03	100,90
	25	100,00
	40	100,00		76,89	77,47
	50	100,00	71,47	67,40	30,02
NaCl - sacharoza	-70	100,00	88,54	88,44	95,58
	25	100,00
	40	100,00		71,56	58,30
	50	100,00	52,71	37,90	30,34

PL 204 701 B1 cd. tabeli 10

1	2	3	4	5	6	7
Alanina - sacharoza	-70	100,00	109,78	109,67	108,96
	25	100,00
	40	100,00		92,99	73,03
	50	100,00	83,25	74,91	57,65
Glicyna - rafinoza	-70	100,00	111,51	114,51	105,25
	25	100,00
	40	100,00		89,20	82,10
	50	100,00	93,21	72,22	53,24

P r z y k ł a d 6

W oparciu o informacje uzyskane w trakcie badań opisanych w przykładach 5 i 6, podję to decyzję o wybraniu do dalszych badań preparatów zawierających substancje pomocnicze przedstawione w tabeli 11.

T a b e l a 11

Substancja pomocnicza	Stężenie
Mannitol lub glicyna	6-9%
Arginina lub trehaloza	1-3%
Tween-80	0,005-0,04%
NaCI	200-250 mM
CaCI2	3-5 mM
TRIS	20-30 mM
Histydyna lub HEPES	10-50 mM
Glutation	0,15-0,25 mg/ml

W oparciu o powyż sze parametry, opracowano nastę pujące konkretne preparaty:

T a b e l a 12

Preparat #1	Preparat #2	Preparat #3	Preparat #4	Preparat #5
10 mM HEPES 20 mM Tris 225 mM NaCI 0,03% (obj) Tween-80 8% (wag/obj) mannitolu 2% (wag/obj) trehalozy 0,2 mg/ml zredukowanego glutationu 4 mM CaCI2	10 mM HEPES 20 mM Tris 225 mM NaCI 0,03% (obj) Tween-80 8% (wag/obj) glicyny 2% (wag/obj) trehalozy 0,2 mg/ml zredukowanego glutationu 4 mM CaCI2	10 mM HEPES 20 mM Tris 225 mM NaCI 0,03% (obj) Tween-80 8% (wag/obj) mannitolu 2% (wag/obj) argininy 0,2 mg/ml zredukowanego glutationu 4 mM CaCI2	25 mM histydyny 20 mM Tris 225 mM NaCI 0,03% (obj) Tween-80 0,03% (wag/obj) mannitolu 2% (wag/obj) trehalozy 0,2 mg/ml zredukowanego glutationu 4 mM CaCI2	25 mM histydyny 20 mM Tris 225 mM NaCI 0,03% (obj) Tween-80 8% (wag/obj) glicyny 2% (wag/obj) trehalozy 0,2 mg/ml zredukowanego glutationu 4 mM CaCI2

PL 204 701 B1

Claims (3)

1. Liofilizowana kompozycja czynnika VIII formułowana bez dodatku albuminy, znamienna tym, że zawiera oprócz czynnika VIII następujące substancje pomocnicze:

NaCl w stężeniu 300 mM do 500 mM;

stabilizator wybrany z grupy obejmującej sacharozę, trehalozę, rafinozę i argininę - 1% do 4% wag./obj.;

sól wapnia w stężeniu 1 mM do 5 mM;

oraz środek buforujący utrzymujący pH w przybliżeniu w zakresie od 6 do 8.

2. Liofilizowana kompozycja czynnika VIII według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera NaCl w stężeniu około 400 mM.

3. Zastosowanie liofilizowanej kompozycji określonej w zastrz. 1 do wytwarzania środka leczniczego do leczenia hemofilii.