PL207405B1

PL207405B1 - Pochodne nukleozydów, zawierająca je kompozycja farmaceutyczna i ich zastosowanie

Info

Publication number: PL207405B1
Application number: PL363216A
Authority: PL
Inventors: Steven S. Carroll; Malcolm Maccoss; David B. Olsen; Balkrishen Bhat; Neelima Bhat; Phillip Dan Cook; Anne B. Eldrup; Thazha P. Prakash; Marija Prhavc; Quanlai Song
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc; Merck & Co Inc
Priority date: 2001-01-22
Filing date: 2002-01-18
Publication date: 2010-12-31
Also published as: BG108000A; AU2002243791B2; EP2360166A1; HK1066014A1; EP1355916B1; EP2399588B1; PT1355916E; CN1267446C; US20020147160A1; US20070275912A1; EA200300819A1; US20050272676A1; NO20033289L; WO2002057425A2; JP3914156B2; CA2433878A1; NO326431B1; CY1109012T1; US20040072788A1; IS6860A

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są pochodne nukleozydów, zawierająca je kompozycja farmaceutyczna i ich zastosowanie. Związki według wynalazku są inhibitorami zależnej od RNA replikacji wirusów RNA i znajdują zastosowanie w leczeniu infekcji wirusowych zależnych od RNA. Są one szczególnie przydatne jako inhibitory polimerazy NS5B wirusa wywołującego zapalenie wątroby typu C (HCV), jako inhibitory replikacji wirusa i jako środki do leczenia zapalenia wątroby typu C.

Wirusowe zapalenie wątroby typu C (HCV) stanowi istotny problem zdrowotny. HCV doprowadza do znaczącego odsetka zakażonych, których liczbę ocenia się na 2-15% populacji świata i prowadzi do przewlekłych schorzeń wątroby, takich jak marskość wątroby i rak wątrobowokomórkowy. Według Amerykańskiego Centrum Kontroli Chorób, w samych Stanach Zjednoczonych jest około 4,5 mln osób zakażonych. Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO), na świecie jest ponad 200 min zakażonych, a corocznie zakaża się co najmniej od 3 do 4 min ludzi. Po zakażeniu, około 20% osób usuwa wirusa z organizmu, ale reszta pozostaje nosicielami HCV do końca swojego życia. U 10 do 20% przewlekle zarażonych rozwija się niszcząca wątrobę marskość lub rak. Ta choroba wirusowa przenoszona jest drogą pozajelitową przez zakażoną krew i produkty krwiopochodne, zakażone igły lub też drogą płciową i wertykalną z zakażonych matek i ciężarnych na ich potomstwo. Obecne leczenie infekcji HCV, ograniczone do immunoterapii z zastosowaniem albo samego interferonu-α, albo jego kombinacji z nukleozydowymi analogami rybawiryny, przynosi ograniczone korzyści kliniczne. Co więcej, nie opracowano szczepionki przeciwko HCV. W związku z tym istnieje pilne zapotrzebowanie na ulepszone czynniki terapeutyczne, zdolne do efektywnego zwalczenia przewlekłego zakażenia HCV. Dokonano przeglądu aktualnej wiedzy na temat leczenia infekcji HCV w oparciu o następujące publikacje: B. Dymock, et al., Novel approaches to the treatment of hepatitis C virus infection. Antiviral Chemistry & Chemotherapy. 11: 79-96 (2000); H. Rosen, et al., Hepatitis C virus: current understanding and prospects for future therapies, Molecular Medicine Today, 5: 393-399 (1999); D. Moradpour, et al., Current and evolving therapies for hepatitis C, European J. Gastroenterol. Hepatol. 11: 1189-1202 (1999); R. Bartenschlager, Candidate Targets for Hepatitis C Virus-Specific Antiviral Therapy, Intervirology, 40: 378-393 (1997); G.M. Lauer and B.D. Walker, Hepatitis C Virus Infection, N. Engl. J. Med., 345: 41-52 (2001); B.W. Dymock, Emerging therapies for hepatitis C virus infection, Emerging Drugs, 6: 13-42 (2001); and C. Crabb, Hard-Won Advances Spark Excitement about Hepatitis C, Science: 506-507 (2001).

Podejmowano różne próby terapii HCV, w tym hamowania wirusowej proteinazy serynowej (proteazy NS3), helikazy, RNA-zależnej polimerazy RNA (NS5B) i opracowania szczepionki.

Wirion HCV składa się z otoczki, wewnątrz której znajduje się dodatnia nić wirusowego RNA z sekwencją genomową pojedynczych oligorybonukleotydów o długości około 9600 zasad, kodującą poliproteinę złożoną z około 3010 aminokwasów. Białkowy produkt genu HCV składa się z białek strukturalnych C, E1 i E2, a także z niestrukturalnych białek NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A i NS5B. Uważa się, że białka niestrukturalne (NS) stanowią układ katalityczny replikacji wirusowej. Proteaza NS3 uwalnia NS5B, RNA-zależną polimerazę RNA, z łańcucha poliproteinowego.

Polimeraza HCV NS5B jest niezbędna do syntezy dwuniciowego RNA z jednoniciowego wirusowego RNA, które służy jako matryca w cyklu replikacyjnym HCV. Zatem polimeraza NS5B jest uważana za zasadniczy element kompleksu replikacyjnego HCV [patrz K. Ishi, et al., Expression of Hepatitis C Virus NS5B Protein: Characterization of Its RNA Polymerase Activity and RNA Binding, Hepatology, 29: 1227-1235 (1999) and V. Lohmann, et al., Biochemical and Kinetic Analyses of NS5B RNA-Dependent RNA Polymerase of the Hepatitis C Virus, Virology, 249: 108-118 (1998)]. Hamowanie polimerazy HCV NS5B zapobiega tworzeniu dwuniciowego RNA HCV i dlatego stanowi interesujący punkt wyjścia do rozwoju specyficznych dla HCV terapii antywirusowych.

Stwierdzono, że związki nukleozydowe według niniejszego wynalazku są silnymi inhibitorami RNA-zależnej replikacji wirusa RNA, a w szczególności replikacji HCV. 5'-trifosforanowe pochodne tych związków nukleozydowych są inhibitorami RNA-zależnej wirusowej polimerazy RNA, a w szczególności polimerazy NS5B HCV. Zatem związki nukleozydowe według wynalazku są przydatne w leczeniu infekcji wirusami RNA zależnymi od RNA, a w szczególności infekcji HCV.

Niniejszy wynalazek dotyczy pochodnych nukleozydów o wzorze strukturalnym II o wskazanej konfiguracji stereochemicznej:

PL 207 405 B1

(U)

N R¹¹ oraz ich dopuszczalnych farmaceutycznie soli; w którym to wzorze:

R¹ oznacza C1-3 alkil ewentualnie podstawiony przez grupę hydroksylową lub jeden do trzech atomów fluoru;

R² oznacza grupę hydroksylową lub C1-4 alkoksyl;

R³ oznacza wodór, halogen lub grupę hydroksylową;

R⁵ oznacza wodór, P3O9H4, P2O6H3, lub PO3H2;

R⁸ oznacza wodór;

R⁹ oznacza wodór, metyl lub halogen; a

R¹⁰ i R¹¹ każdy niezależnie oznaczają wodór, halogen, grupę hydroksylową, grupę aminową, grupę C1-4 alkiloaminową, grupę di(C1-4alkilo)aminową, lub grupę C3-6cykloalkiloaminową.

Korzystnie w związku o wzorze strukturalnym II:

R¹ oznacza metyl, fluorometyl lub hydroksymetyl;

R² oznacza grupę hydroksylową lub metoksyl;

R³ oznacza wodór, fluor lub grupę hydroksylową;

R⁵ oznacza wodór lub P3O9H4;

R⁸ oznacza wodór;

R⁹ oznacza wodór, metyl lub halogen; a

R¹⁰ i R¹¹ każdy niezależnie oznaczają wodór, fluor, grupę hydroksylową lub grupę aminową. Korzystnymi związkami o wzorze strukturalnym II według wynalazku, które są użyteczne jako inhibitory zależnej od RNA wirusowej polimerazy RNA, są następujące związki:

4-amino-7-(2-C-metylo-e-D-arabinofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna,

4-amino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna,

4-metyloamino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna,

4-dimetyloamino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna,

4-cyklopropyloamino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna,

4-amino-7-(2-C-hydroksymetylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna,

4-amino-7-(2-C-fluorometylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna,

4-amino-5-metylo-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna,

4-amino-5-bromo-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna,

4-amino-5-chloro-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna,

4-amino-5-fluoro-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna,

2,4-diamino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna,

2-amino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna,

2-amino-4-cyklopropyloamino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna,

2-amino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyn-4(3H)-on,

4-amino-7-(2-C-etylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna,

4-amino-7-(2-C,2-0-dimetylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna,

7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyn-4(3H)-on,

2-amino-5-metylo-7-(2-C,2-0-dimetylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyn-4(3H)-on,

4-amino-7-(3-deoksy-2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna,

4-amino-7-(3-deoksy-2-C-metylo-e-D-arabinofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna,

4-amino-2-fluoro-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna, i

4-amino-7-(3-deoksy-3-fluoro-2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo-[2,3-d]pirymidyna;

PL 207 405 B1 i odpowiadają ce 5'-trifosforany;

oraz ich dopuszczalne farmaceutycznie sole.

Wśród tych związków szczególnie korzystne są następujące związki:

4-amino-7-(2-C-metylo-e-D-arabinofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna,

4-amino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna,

4-amino-7-(2-C-fluorometylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna,

4-amino-5-metylo-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna,

4-amino-5-bromo-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna,

4-amino-5-chloro-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna,

4-amino-5-fluoro-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna i

4-amino-7-(2-C,2-0-dimetylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna, i odpowiadające 5'-trifosforany;

lub ich dopuszczalne farmaceutycznie sole.

Bardzo korzystne są następujące związki:

4-amino-7-(2-C-metylo-e-D-arabinofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna lub jej dopuszczalne farmaceutycznie sole,

4-amino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna lub jej dopuszczalne farmaceutycznie sole.

4-amino-7-(2-C-fluorometylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-tf]pirymidyna lub jej dopuszczalne farmaceutycznie sole,

4-amino-5-chloro-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna lub jej dopuszczalne farmaceutycznie sole,

4-amino-5-bromo-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-tf]pirymidyna lub jej dopuszczalne farmaceutycznie sole.

Związki nukleozydowe według niniejszego wynalazku są użyteczne jako inhibitory wirusowej polimerazy RNA zależnej od dodatnio-sensownego, jednoniciowego RNA, inhibitory replikacji wirusa RNA zależnego od dodatnio-sensownego, jednoniciowego RNA i/lub do leczenia infekcji wirusem RNA zależnym od dodatnio-sensownego, jednoniciowego RNA. Wirusem RNA zależnym od dodatniosensownego, jednoniciowego RNA jest wirus Flaviviridae lub wirus Picornaviridae. W podklasie tej klasy, wirusem Picornaviridae jest wirus nieżytu nosa, wirus polio, lub wirus zapalenia wątroby typu A. W drugiej podklasie tej klasy, wirusem Flaviviridae jest wirus wybrany z grupy składającej się z wirusa zapalenia wątroby typu C, wirusa żółtej febry, wirusa Denga, wirusa Zachodniego Nilu, wirusa japońskiego zapalenia opon mózgowych, wirusa Banzi i wirusa biegunki wirusowej (BVDV). W podklasie tej klasy, wirusem Flaviviridae jest wirus zapalenia wątroby typu C.

Zależną od RNA polimerazą RNA jest dodatnio-sensowna, jednoniciowa, zależna od RNA wirusowa polimeraza RNA. Taką polimerazą RNA jest polimeraza wirusa Flaviviridae lub polimeraza wirusa Picornaviridae. Polimeraza wirusa Picornaviridae jest polimeraza wirusa nieżytu nosa, polimeraza wirusa polio lub polimeraza wirusa zapalenia wątroby typu A. W drugiej podklasie, polimeraza wirusa Flaviviridae jest wybrana z grupy składającej się z polimerazy wirusa zapalenia wątroby typu C, polimerazy wirusa wirusa żółtej febry, polimerazy wirusa Denga, polimerazy wirusa Zachodniego Nilu, polimerazy wirusa japońskiego zapalenia opon mózgowych, polimerazy wirusa Banzi i polimerazy wirusa biegunki wirusowej (BVDV).

Replikacją wirusa RNA zależnego od RNA jest replikacja wirusa RNA zależnego od dodatniosensownego, jednoniciowego RNA. Replikacja wirusa RNA zależnego od dodatnio-sensownego, jednoniciowego RNA jest replikacja wirusa Flaviviridae lub replikacja wirusa Picornaviridae. Replikacją wirusa Picornaviridae jest replikacja wirusa nieżytu nosa, replikacja wirusa polio, lub replikacja wirusa zapalenia wątroby typu A. Replikacja wirusa Flaviviridae jest wybrana z grupy składającej się z replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C, replikacji wirusa żółtej febry, replikacji wirusa Denga, replikacji wirusa Zachodniego Nilu, replikacji wirusa japońskiego zapalenia opon mózgowych, replikacji wirusa Banzi, i replikacji wirusa biegunki wirusowej (BVDV).

Infekcją zależnym od RNA wirusem RNA jest infekcja wirusem RNA zależnym od dodatnio-sensownego, jednoniciowego RNA. Infekcją taką jest infekcja wirusem Flaviviridae lub infekcja wirusem Picornaviridae. Infekcją wirusem Picornaviridae jest infekcja wirusem nieżytu nosa, infekcja wirusem polio, lub infekcja wirusem zapalenia wątroby typu A. W drugiej podklasie tej klasy, infekcja wirusem Flaviviridae jest wybrana z grupy składającej się z infekcji wirusem zapalenia wątroby typu C, infekcji wirusem żółtej febry, infekcji wirusem Denga, infekcji wirusem Zachodniego Nilu, infekcji wiruPL 207 405 B1 sem japońskiego zapalenia opon mózgowych, infekcji wirusem Banzi i infekcji wirusem biegunki wirusowej (BVDV).

W niniejszym zgłoszeniu stosowany termin alkiloaminowa odnosi się do alkiloamin o ł a ńcuchu prostym lub rozgałęzionym mających określoną liczbę atomów węgla, np. metyloaminowa, etyloaminowa, izopropyloaminowa, t-butyloaminowa.

Termin halogen obejmuje atomy fluorowców: fluor, chlor, brom i jod.

Termin 5'-trifosforan odnosi się do pochodnej estru kwasu trifosforowego grupy 5'-hydroksylowej związku według niniejszego wynalazku, mającej następujący wzór strukturalny III:

w którym R¹, R², R³, R⁵, R⁸, R⁹, R¹⁰ i R¹¹ maj ą znaczenia jak zdefiniowane powyż ej, a R⁴ i R⁷oznaczają H. Związki według niniejszego wynalazku obejmują również dopuszczalne farmaceutycznie sole estrów trifosforanowych oraz dopuszczalne farmaceutycznie sole pochodnych 5'-monofosforanowych i 5'-difosforanowych o wzorach strukturalnych odpowiednio IV i V.

W zakres wynalazku wchodzi też kompozycja farmaceutyczna, która obejmuje zwią zek wedł ug niniejszego wynalazku jako substancję czynną i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.

Kompozycja taka jest użyteczna do hamowania zależnej od RNA wirusowej polimerazy RNA, hamowania replikacji zależnego od RNA wirusa RNA i/lub leczenia infekcji zależnym od RNA wirusem RNA.

Kompozycja według wynalazku korzystnie hamuje polimerazę NS5B, replikację HCV oraz korzystnie jest użyteczna do leczenia infekcji wirusem HCV.

Wynalazek dotyczy też zastosowania pochodnej według wynalazku do wytwarzania leku do hamowania zależnej od RNA wirusowej polimerazy RNA lub hamowania replikacji wirusa RNA zależnego od RNA u ssaka, do wytwarzania leku do leczenia infekcji wirusem zależnym od RNA u ssaka, zwłaszcza wirusem zapalenia wątroby typu C.

Kompozycję według wynalazku lub lek wytwarzany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku można podawać w połączeniu z jednym lub więcej niż jednym środkiem użytecznym do leczenia infekcji HCV. Do takich środków aktywnych przeciwko HCV należą, nieograniczająco, rybawiryna,

PL 207 405 B1 lewowiryna, wiramidyna, tymozyna alfa-1, interferon-α, pegylowany interferon-α (peginterferon-α), kombinacja interferonu-α i rybawiryny, kombinacja peginterferonu-α i rybawiryny, kombinacja interferonu-α i lewowiryny oraz kombinacja peginterferonu-α i lewowiryny. Interferon-α obejmuje, nieograniczająco, rekombinacyjny interferon-a2a (taki jak interferon Roferon dostępny z firmy HoffmannLaRoche, Nutley, NJ), pegylowany interferon-a2a (Pegasys™), interferon-a2b (taki jak Intron-A interferon dostępny z firmy Schering Corp., Kenilworth, NJ), pegylowany interferon-a2b (PegIntron™), rekombinacyjny interferon consensus (taki jak interferon alfacon-1) i oczyszczony interferon-α. Rekombinacyjny interferon consensus firmy Amgen ma nazwę Infergen®. Lewowiryna jest to enancjomer L rybawiryny, który ma aktywność immunomodulacyjną podobną do rybawiryny. Wiramidyna jest analogiem rybawiryny ujawnionym w WO 01/60379 (ICN Pharmaceuticals). Pojedyncze składniki kombinacji mogą być podawane oddzielnie w różnym czasie podczas terapii lub równolegle w formach oddzielnych lub pojedynczych łączonych, według reżimów leczenia jednoczesnego lub naprzemiennego. Zgodnie z tym należy interpretować termin podawanie. Należy rozumieć, że zakres kombinacji związków lub kompozycji według niniejszego wynalazku z innymi środkami użytecznymi do leczenia infekcji HCV obejmuje w zasadzie każdą kombinację z każdą z kompozycji farmaceutycznych do leczenia infekcji HCV. Gdy związek według niniejszego wynalazku lub jego dopuszczalne farmaceutycznie sole jest stosowany w kombinacji z drugim środkiem terapeutycznym czynnym przeciwko HCV, dawka każdego ze związków może być albo taka sama albo inna niż dawka, gdy związek jest stosowany sam.

Do leczenia infekcji HCV, kompozycje według niniejszego wynalazku mogą być również podawane w kombinacji ze środkiem będącym inhibitorem proteazy serynowej HCV NS3. Proteaza serynowa HCV NS3 jest zasadniczym enzymem wirusowym i opisana jest jako doskonały cel do hamowania replikacji HCV. Inhibitory proteazy serynowej HCV NS3, zarówno substratowe jak i niesubstratowe, ujawniono w WO 98/22496, WO 98/46630, WO 99/07733, WO 99/07734, WO 99/38888, WO 99/50230, WO 99/64442, WO 00/09543, WO 00/59929, i GB-2337262. Proteaza HCV NS3 jako cel do badań rozwojowych inhibitorów replikacji HCV i do leczenia infekcji HCV jest omówiona w B.W. Dymock, Emerging therapies for hepatitis C virus infection, Emerging Drugs, 6: 13-42 (2001).

Rybawiryna, lewowiryna i wiramidyna mogą wywierać swoje działania anty-HCV przez modulowanie wewnątrzkomórkowych puli nukleotydów guaninowych na drodze hamowania enzymu wewnątrzkomórkowego, dehydrogenazy inozynomonofosforanowej (IMPDH). IMPDH jest enzymem limitującym szybkość na ścieżce biosyntetycznej biosyntezy de novo nukleotydu guaninowego. Rybawiryna ulega łatwo wewnątrzkomórkowej fosforylacji, a pochodna monofosforanowa jest inhibitorem IMPDH. Zatem, hamowanie IMPDH stanowi inny użyteczny cel dla odkrywania inhibitorów replikacji HCV. W związku z tym, związki według niniejszego wynalazku mogą być również podawane w kombinacji z inhibitorem IMPDH, takim jak VX-497, który jest ujawniony w WO 97/41211 i WO 01/00622 (Vertex); innym inhibitorem IMPDH, takim jak ujawniony w WO 00/25780 (Bristol-Myers Squibb); lub mykofenolanem mofetilu [patrz A.C. Allison i E.M. Eugui, Agents Action, 44 (Suppl.): 165 (1993).

Do leczenia infekcji HCV, związki według niniejszego wynalazku mogą być również podawane w kombinacji ze środkiem przeciwwirusowym, amantadyną (1-aminoadamantan) [wyczerpujący opis tego środka, patrz J. Kirschbaum, Anal. Profiles Drug Subs. 12: 1-36 (1983)].

Przez dopuszczalny farmaceutycznie rozumie się, że nośnik, rozcieńczalnik lub zaróbka muszą być kompatybilne z innymi składnikami formulacji i nieszkodliwe dla jej biorcy.

Kompozycje według wynalazku obejmują kompozycje odpowiednie do podawania doustnego, doodbytniczego, miejscowego, pozajelitowego (w tym podskórnego, domięśniowego i dożylnego), doocznego (oftalmicznego), dopłucnego (donosowo lub przez inhalacje dopoliczkowe) lub donosowego, chociaż w każdym konkretnym przypadku najbardziej odpowiednia droga podawania będzie zależała od rodzaju składnika czynnego i stopnia zaawansowania choroby. Mogą mieć one dogodnie formę jednostkowych postaci dawkowania i mogą być wytworzone dowolną z metod dobrze znanych w farmacji.

W praktycznym stosowaniu, związki o wzorze strukturalnym II jako składnik czynny mogą być połączone w dokładną mieszaninę z nośnikiem farmaceutycznym za pomocą typowych technik farmaceutycznych sporządzania mieszanin. Nośnik może mieć różnorodne formy, zależnie od pożądanej do podawania postaci leku, np. doustnego lub pozajelitowego (w tym dożylnego). Do wytwarzania kompozycji do postaci leku do podawania doustnego w przypadku ciekłych preparatów doustnych, takich jak na przykład zawiesiny, eliksiry i roztwory, można zastosować dowolne typowe ośrodki farmaceutyczne, takie jak na przykład woda, glikole, oleje, alkohole, środki smakowe, konserwanty, środki

PL 207 405 B1 barwiące i podobne. W przypadku stałych preparatów doustnych, takich jak na przykład proszki, twarde i miękkie kapsułki i tabletki, można zastosować nośniki takie jak skrobie, cukry, celuloza mikrokrystaliczna, rozcieńczalniki, środki granulujące, środki smarne, środki wiążące, środki rozsadzające i podobne. Stał e preparaty doustne są korzystniejsze niż ciekł e preparaty doustne.

Ze względu na łatwość podawania, tabletki i kapsułki stanowią najbardziej korzystną doustną postać jednostkową, w której oczywiście stosuje się stałe nośniki farmaceutyczne. W razie potrzeby, tabletki mogą być powlekane standardowymi technikami wodnymi lub niewodnymi. Takie kompozycje i preparaty powinny zawierać co najmniej 0,1% zwią zku czynnego. Zawartość procentowa związku czynnego w tych kompozycjach może być oczywiście różna i dogodnie może być w zakresie między około 2% a około 60% wagowych na jednostkę. Ilość składnika czynnego w takiej kompozycji jest taka, aby uzyskać skuteczne dawkowanie. Związki czynne mogą być również podawane donosowo, na przykład w postaci ciekłych kropli lub płynu do rozpylania.

Tabletki, pigułki, kapsułki i podobne mogą również zawierać środek wiążący, taki jak guma tragakantowa, guma arabska, skrobia kukurydziana lub żelatyna, środki pomocnicze, takie jak wodorofosforan diwapnia; środek rozsadzający taki jak skrobia kukurydziana, skrobia ziemniaczana, kwas alginowy; środek smarny, taki jak stearynian magnezu, oraz środek słodzący, taki jak sacharoza, laktoza lub sacharyna. Gdy postacią dawkowania jest kapsułka, może ona, poza materiałami powyższego typu, zawierać ciekły nośnik, taki jak olej tłuszczowy.

Mogą być obecne różne inne materiały jako powłoczki lub w celu modyfikowania formy fizycznej jednostki dawkowania. Na przykład, tabletki mogą być powlekane szelakiem i/lub cukrem. Syrop lub eliksir poza składnikiem czynnym może zawierać sacharozę jako środek słodzący, metylo- i propyloparabeny jako konserwanty, barwnik oraz środek smakowy, taki jak aromat wiśniowy lub pomarańczowy.

Związki o wzorze strukturalnym II mogą być również podawane pozajelitowo. Roztwory lub zawiesiny tych związków czynnych można wytworzyć w wodzie, odpowiednio zmieszanej z surfaktantem, takim jak hydroksypropyloceluloza. Dyspersje można wytworzyć w glicerynie, ciekłych glikolach polietylenowych i ich mieszaninach w olejach. W zwykłych warunkach przechowywania i stosowania, preparaty te zawierają konserwant w celu zapobieżenia rozwojowi mikroorganizmów.

Postacie farmaceutyczne odpowiednie do stosowania przez iniekcje obejmują jałowe roztwory lub dyspersje wodne i jałowe proszki do sporządzania jałowych roztworów lub dyspersji wodnych tuż przed użyciem. W każdym przypadku, postać leku musi być jałowa i musi być płynna w stopniu umożliwiającym łatwe pobieranie strzykawką. Musi być ona stabilna w warunkach wytwarzania i przechowywania i musi być zakonserwowana przeciwko zanieczyszczającemu działaniu mikroorganizmów, takich jak bakterie i grzyby. Nośnikiem może być rozpuszczalnik lub ośrodek dyspergujący, zawierający na przykład wodę, etanol, poliol (np. gliceryna i ciekłe glikole polietylenowe), ich odpowiednie mieszaniny i oleje roślinne.

Dla dostarczenia ssakowi, zwłaszcza człowiekowi, skutecznej dawki związku według niniejszego wynalazku można zastosować dowolną odpowiednią drogę podawania. Przykładowo, można zastosować drogę doustną, doodbytniczą, miejscową, pozajelitową, oczną, dopłucną, donosową i podobne. Postacie leku obejmują tabletki, kołaczyki, dyspersje, zawiesiny, roztwory, kapsułki, kremy, maście, aerozole i podobne. Korzystnie, związki o wzorze strukturalnym II podaje się doustnie.

Dla podawania doustnego ludziom, zakres dawkowania wynosi 0,01 do 1000 mg/kg wagi ciała w dawkach podzielonych. W jednym wykonaniu zakres dawkowania wynosi 0,1 do 100 mg/kg wagi ciała w dawkach podzielonych. W innym wykonaniu zakres dawkowania wynosi 0,5 do 20 mg/kg wagi ciała w dawkach podzielonych. Kompozycje do podawania doustnego korzystnie mają postać tabletek lub kapsułek zawierających 1,0 do 1000 miligramów składnika czynnego, zwłaszcza 1,5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 750, 800, 900, i 1000 miligramów składnika czynnego dla objawowego dostosowania dawki dla leczonego pacjenta.

Skuteczna dawka zastosowanego składnika czynnego może być różna, zależnie od konkretnego zastosowanego związku, sposobu podawania, leczonego stanu i ciężkości leczonego stanu. Takie dawkowanie może łatwo ustawić specjalista. Ten reżim dawkowania można ustawić tak, aby uzyskać optymalną odpowiedź terapeutyczną.

Związki według niniejszego wynalazku zawierają jedno lub więcej centrum asymetryczne i mogą zatem występować jako racematy i mieszaniny racemiczne, pojedyncze enancjomery, mieszaniny diastereoizomerów i pojedyncze diastereoizomery. Niniejszy wynalazek obejmuje zatem związki nukleozydowe mające konfigurację stereochemiczną β-D pięcioczłonowego pierścienia furanozowego,

PL 207 405 B1 jak zobrazowano na poniższym wzorze strukturalnym, to znaczy związki nukleozydowe, w których podstawniki przy C-1 i C-4 pięcioczłonowego pierścienia furanozowego mają konfigurację stereochemiczną β (orientacja do góry, jak wskazano pogrubioną kreską).

Niektóre z opisanych tu związków zawierają olefinowe wiązania podwójne, i jeśli nie wskazano inaczej, obejmują oba izomery geometryczne E i Z.

Niektóre z opisanych tu związków mogą istnieć jako tautomery, takie jak tautomery keto-enolowe. Związki o wzorze strukturalnym II obejmują pojedyncze tautomery oraz ich mieszaniny. Przykład tautomerów keto-enolowych objętych zakresem związków według niniejszego wynalazku zilustrowano poniżej:

Związki o wzorze strukturalnym II można rozdzielić na ich pojedyncze diastereoizomery na przykład przez krystalizację frakcjonowaną z odpowiedniego rozpuszczalnika, na przykład z metanolu lub octanu etylu lub ich mieszanin, lub na drodze chiralnej chromatografii przy użyciu optycznie czynnej fazy stacjonarnej.

Alternatywnie, każdy ze stereoizomerów związku o wzorze strukturalnym II można otrzymać przez syntezę stereospecyficzną, stosując optycznie czyste substraty lub reagenty o znanej konfiguracji.

Stereochemię podstawników w pozycjach C-2 i C-3 pierścienia furanozowego związków według niniejszego wynalazku o wzorze strukturalnym II oznacza się za pomocą linii wężykowych, co oznacza, że podstawniki R¹, R², R³ i R⁴ mogą mieć niezależnie od siebie konfigurację α (podstawnik w dół) lub β (podstawnik do góry). Notacja stereochemii pogrubioną linią w pozycjach C-1 i C-4 pierścienia furanozowego oznacza, że podstawnik ma konfigurację β (podstawnik do góry).

PL 207 405 B1

Związki według niniejszego wynalazku mogą być podawane w postaci dopuszczalnej farmaceutycznie soli. Termin dopuszczalna farmaceutycznie sól odnosi się do soli wytworzonych z dopuszczalnych farmaceutycznie nietoksycznych zasad nieorganicznych lub organicznych i kwasów nieorganicznych lub organicznych. Termin dopuszczalna farmaceutycznie sól w przypadku związku zasadowego odnosi się do nietoksycznych soli związków według wynalazku, które generalnie wytwarza się przez reakcję wolnej zasady z odpowiednim kwasem organicznym lub nieorganicznym. Reprezentatywne sole związków zasadowych według niniejszego wynalazku obejmują następujące nieograniczające sole: octan, benzenosulfonian, benzoesan, wodorowęglan, wodorosiarczan, wodorowinian, boran, bromek, kamsylan, węglan, chlorek, klawulanian, cytrynian, dichlorowodorek, edetan, edisylan, estolan, esylan, fumaran, gluceptan, glukonian, glutaminian, glikoliloarsanilan, heksylorezorcynian, hydrabaminian, bromowodorek, chlorowodorek, hydroksylonaftoesan, jodek, izotionian, mleczan, laktobionian, laurynian, jabłczan, maleinian, migdalan, mesylan, metylobromek, metyloazotan, metylosiarczan, śluzan, napsylan, azotan, sól N-metyloglukaminoamoniowa, oleinian, szczawian, pamoesan (embonian), palmitynian, pantotenian, fosforan/difosforan, poligalakturonian, salicylan, stearynian, siarczan, suboctan, bursztynian, taninian, winian, teoklanian, tosylan, trietojodek i walerianian. Ponadto, gdy związki według wynalazku mają ugrupowanie kwasowe, ich odpowiednie dopuszczalne farmaceutycznie sole obejmują, nieograniczająco, sole wytworzone z zasad nieorganicznych, w tym sole glinowe, amonowe, wapniowe, miedziowe, żelazowe, żelazawe, litowe, magnezowe, manganowe, manganawe, potasowe, sodowe, cynkowe i podobne. Szczególnie korzystne są sole amonowe, wapniowe, magnezowe, potasowe i sodowe. Sole otrzymane z dopuszczalnych farmaceutycznie nietoksycznych zasad organicznych obejmują sole amin pierwszo-, drugo- i trzeciorzędowych, amin cyklicznych i zasadowych żywic jonowymiennych, jak arginina, betaina, kofeina, cholina, N,N-dibenzyloetylenodiamina, dietyloamina, 2-dietyloaminoetanol, 2-dimetyloamino-etanol, etanolamina, etylenodiamina, N-etylomorfolina, N-etylopiperydyna, glukamina, glukozamina, histydyna, hydrabamina, izopropyloamina, lizyna, metyloglukamina, morfolina, piperazyna, piperydyna, żywice poliaminowe, prokaina, puryny, teobromina, trietyloamina, trimetyloamina, tripropyloamina, trometamina, i podobne.

Również, w przypadku obecności w związkach według niniejszego wynalazku grupy kwasu karboksylowego (-COOH) lub grupy alkoholowej, można stosować dopuszczalne farmaceutycznie estry pochodnych karboksylowych, takie jak metylowy, etylowy lub piwaloiloksymetylowy, lub pochodne acylowe alkoholi, takie jak octan lub maleinian. Obejmuje to grupy estrowe i acylowe znane w technice jako modyfikujące charakterystykę rozpuszczalności lub hydrolizy, do stosowania w preparatach o przedłużonym uwalnianiu lub prolekowych.

Wytwarzanie pochodnych nukleozydów według wynalazku

Pochodne nukleozydów według niniejszego wynalazku można wytwarzać zgodnie z poniższymi metodami syntetycznymi, dobrze znanymi w praktyce chemii nukleozydów i nukleotydów. Opis metod syntetycznych stosowanych do wytwarzania związków według niniejszego wynalazku można znaleźć w następującej pozycji: Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, L.B. Townsend, ed., Vols. 1-3, Plenum Press, 1988.

Reprezentatywna metoda ogólna wytwarzania związków według niniejszego wynalazku jest przedstawiona w zarysie na poniższym schemacie 1. Schemat ten ilustruje syntezę związków według niniejszego wynalazku o wzorze strukturalnym 1-7, w którym pierścień furanozowy ma konfigurację β-D-rybo. Substratem jest 3,5-bis-O-zabezpieczony alkilofuranozyd, taki jak metylofuranozyd, o wzorze strukturalnym 1-1. Następnie utlenia się grupę C-2 hydroksylową odpowiednim utleniaczem, takim jak tritlenek chromu lub chromian, perjodynan Dess-Martin'a, lub przez utlenianie Swern'a, otrzymując C-2 keton o wzorze strukturalnym 12. Addycja do karbonylowego wiązania podwójnego 1-2 odczynnika Grignarda, takiego jak halogenek alkilo-, alkenylo-, lub alkinylomagnezowy (na przykład MeMgBr, EtMgBr, winyloMgBr, alliloMgBr, i etynyloMgBr) lub alkilo-, alkenylo- lub alkinylolitu, takiego jak MeLi, w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym, takim jak tetrahydrofuran, eter dietylowy, i podobne, daje trzeciorzędowy alkohol C-2 o wzorze strukturalnym 1-3. Następnie wprowadza się dobrą grupę opuszczającą (taką jak Cl, Br i I) w pozycji C-1 (anomerycznej) furanozowej pochodnej cukrowej przez działanie na furanozyd o wzorze 1-3 halogenowodorem w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym, takim jak bromowodór w kwasie octowym, otrzymując pośredni halogenek furanozylowy 1-4. Jako użyteczna grupa odchodząca w następującej później reakcji tworzenia wiązania glikozydowego (nukleozydowego) może służyć również sulfonian w pozycji C-1, taki jak metanosulfonian (MeSO2O-), trifluorometanosulfonian (CF3SO2O-), lub p-toluenesulfonian (-OTs). Wiązanie nukleozydowe konstruuje się przez działanie na związek pośredni o wzorze strukturalnym 1-4 solą metalu (taką) jak litowa,

PL 207 405 B1 sodowa lub potasowa) odpowiednio podstawionej 1H-pirolo[2,3-d]pirymidyny 1-5, takiej jak odpowiednio podstawiona 4-halo-1H-pirolo[2,3-d]pirymidyna, która może być generowana in situ przez działanie wodorkiem metalu alkalicznego (takim jak wodorek sodu), wodorotlenkiem metalu alkalicznego (takim jak wodorotlenek potasu), węglanem metalu alkalicznego (takim jak węglan potasu), lub heksametylodisilazydkiem metalu alkalicznego (takim jak NaHMDS) w odpowiednim bezwodnym rozpuszczalniku organicznym, takim jak acetonitryl, tetrahydrofuran, 1-metylo-2-pirolidynon, lub N,N-dimetyloformamid (DMF). Reakcję podstawienia można katalizować stosując katalizator przeniesienia fazowego, taki jak TDA-1 lub chlorek trietylobenzyloamoniowy, w układzie dwufazowym (ciało stałe-ciecz lub cieczciecz). Następnie ewentualne obecne grupy zabezpieczające w zabezpieczonym nukleozydzie o wzorze strukturalnym 1-6 rozszczepia się stosując znane metodyki odbezpieczania, takie jak opisane w T.W. Greene i P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3^rd ed., John Wiley & Sons, 1999. Ewentualne wprowadzenie grupy aminowej w pozycji 4 rdzenia pirolo[2,3-d]pirymidynowego przeprowadza się przez działanie na 4-halogenowy związek pośredni 1-6 odpowiednią aminą, taką jak alkoholowy roztwór amoniaku lub ciekły amoniak, wytwarzając pierwszorzędową grupę aminową w pozycji C-4 (-NH2), alkiloaminą z wytworzeniem drugorzędowej grupy aminowej (-NHR), lub dialkilo-aminą z wytworzeniem trzeciorzędowej grupy aminowej (-NRR'). Związek 7H-pirolo[2,3-d]pirymidyn-4(3H)onowy można otrzymać przez hydrolizę związku 1-6 wodnym roztworem zasady, takim jak wodny roztwór wodorotlenku sodu. Alkoholiza (np. metanoliza) związku 1-6 daje alkoholan w pozycji C-4 (-OR), natomiast działanie alkilomerkaptydem daje pochodną alkilotio w pozycji C-4 (-SR). Dla uzyskania żądanych związków według niniejszego wynalazku mogą być wymagane dalsze manipulacje chemiczne dobrze znane fachowcom o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie chemii organicznej/medycznej.

Schemat 1

PL 207 405 B1

W poniższych przykładach podano odnośniki do publikacji literaturowych, które zawierają szczegóły wytwarzania związków końcowych lub związków pośrednich stosowanych do wytwarzania związków końcowych według niniejszego wynalazku. Związki nukleozydowe według niniejszego wynalazku wytworzono według procedur przedstawionych szczegółowo w poniższych przykładach. Przykłady nie stanowią jakiegokolwiek ograniczenia zakresu wynalazku i powinny być tak interpretowane. Dla fachowców w dziedzinie syntezy nukleozydów i nukleotydów będzie oczywiste, że do wytwarzania tych i innych związków według niniejszego wynalazku można stosować znane odmiany warunków i sposobów przedstawionych w poniższych procedurach preparatywnych. Wszystkie temperatury są w stopniach Celsjusza.

PRZYKŁAD 1

4-Amino-7-(2-C-metylo-e-D-arabinofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna

HÓ Me

Do tritlenku chromu (1,57 g, 1,57 mmoli) w dichlorometanie (DCM) (10 ml) w temperaturze 0°C dodano bezwodnik octowy (145 mg, 1,41 mmoli) i następnie pirydynę (245 mg, 3,10 mmoli). Mieszaninę mieszano przez 15 min, następnie dodano roztwór 7-[3,5-O-[1,1,3,3-tetrakis(1-metyloetylo)-1,3-disiloksanodiylo]-e-D-rybofuranozylo]-7H-pirolo[2,3-d]-pirymidyn-4-aminy [wytwarzanie, patrz J. Am. Chem. Soc. 105: 4059 (1983)] (508 mg, 1,00 mmoli) w DCM (3 ml). Uzyskany roztwór mieszano przez 2 h i następnie wylano do octanu etylu (10 ml), i następnie przesączono przez żel krzemionkowy, stosując octan etylu jako eluent. Połączone przesącze odparowano pod próżnią, przeniesiono do mieszaniny eter dietylowy/THF (1:1) (20 ml), ochłodzono do -78°C i wkroplono bromek metylomagnezowy (3M, w THF) (3,30 ml, 10 mmoli). Mieszaninę mieszano w temperaturze -78°C przez 10 min, następnie pozostawiono do dojścia do temperatury pokojowej i dodano nasycony wodny roztwór chlorku amonu (10 ml) i ekstrahowano DCM (20 ml). Fazę organiczną odparowano pod próżnią i surowy produkt oczyszczono na silikażelu, stosując 5% metanol w dichlorometanie jako eluent. Frakcje zawierające produkt połączono i odparowano pod próżnią. Uzyskany olej przeniesiono do THF (5 ml) i dodano fluorek tetrabutyloamoniowy (TBAF) na silikażelu (1,1 mmol/g na silikażelu) (156 mg). Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 minut, przesączono, i odparowano pod próżnią. Surowy produkt oczyszczono na silikażelu, stosując 10% metanol w dichlorometanie jako eluent. Frakcje zawierające produkt połączono i odparowano pod próżnią, otrzymując żądany związek (49 mg) w postaci bezbarwnego ciała stałego.

¹H NMR (DMSO-d6): δ 1,08 (s, 3H), 3,67 (m, 2H), 3,74 (m, 1H), 3,83 (m, 1H), 5,19 (m, 1H), 5,23 (m, 1H), 5,48 (m, 1H), 6,08 (1H, s), 6,50 (m, 1H), 6,93 (bs, 2H), 7,33 (m, 1H), 8,02 (s, 1H).

PRZYKŁAD 2

4-Amino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo]-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna

Etap A: 3,5-Bis-0-(2,4-dichlorofenylometylo)-1-0-metylo-a-D-rybofuranoza

Mieszaninę 2-0-acetylo-3,5-bis-0-(2,4-dichlorofenylometylo)-1-0-metylo-a-D-rybofuranozy [wytwarzanie, patrz: Helv. Chim. Acta 78: 486 (1995)] (52,4 g, 0,10 moli) w metanolowym roztworze

PL 207 405 B1

K2CO3 (500 ml, nasycony w temp. pok.) mieszano w temperaturze pokojowej przez 45 minut i następnie zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Oleistą pozostałość zawieszono w CH2CI2 (500 ml), przemyto wodą (300 ml + 5 x 200 ml) i solanką (200 ml), wysuszono (Na2SO4), przesączono i zatężono, otrzymując związek tytułowy (49,0 g) w postaci bezbarwnego oleju, który użyto bez dalszego oczyszczania w poniższym etapie B.

¹H NMR (DMSO-d6): δ 3,28 (s, 3H, OCH3), 3,53 (d, 2H, J5,4 = 4,5 Hz, H-5a, H-5b), 3,72 (dd, 1H, J3,4 = 3,6 Hz, J3,2 = 6,6 Hz, H-3), 3,99 (ddd, 1H, d J2,1 = 4,5 Hz, J2,OH-2 = 9,6 Hz, H-2), 4,07 (m, 1H, H-4), 4,50 (s, 2H, CH2Ph), 4,52, 4,60 (2d, 2H, Jgem = 13,6 Hz, CH2Ph), 4,54 (d, 1H, OH-2), 4,75 (d, 1H, H-1), 7,32-7,45, 7,52-7,57 (2m, 10H, 2Ph).

¹³C NMR (DMSO-d6): δ 55,40, 69,05, 69,74, 71,29, 72,02, 78,41, 81,45, 103,44, 127,83, 127,95,

129,05, 129,28, 131,27, 131,30, 133,22, 133,26, 5 133,55, 133,67, 135,45, 135,92.

Etap B: 3,5-Bis-0-(2,4-dichlorofenylometylo)-1-0-metylo-a-D-erytropentofuranoz-2-uloza

Do chłodzonego lodem perjodynanu Dess-Martina (50,0 g, 118 mmoli) w bezwodnym CH2CI2 (350 ml) pod argonem (Ar) wkroplono w ciągu 0,5 h roztwór związku z etapu A (36,2 g, 75 mmoli) w bezwodnym CH2CI2 (200 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 0°C przez 0,5 h i następnie w temperaturze pokojowej przez 3 dni. Mieszaninę rozcieńczono bezwodnym Et2O (600 ml) i wylano do chłodzonej lodem mieszaniny Na₂S₂O₃^5H₂O (180 g) w nasyconym wodnym roztworze NaHCO3 (1400 ml). Warstwy rozdzielono, i warstwę organiczną przemyto nasyconym wodnym roztworem NaHCO3 (600 ml), wodą (800 ml) i solanką (600 ml), wysuszono (MgSO4), przesączono i odparowano, otrzymując związek tytułowy (34,2 g) w postaci bezbarwnego oleju, który użyto bez dalszego oczyszczania w poniższym etapie C.

¹H NMR (CDCI3): δ 3,50 (s, 3H, OCH3), 3,79 (dd, 1H, J5a,5b =11,3 Hz, J5a,4 = 3,5 Hz, H-5a), 3,94 (dd, 1H, J5b,4 = 2,3 Hz, H-5b), 4,20 (dd, 1H, J3.1 = 1,3 Hz, J3,4 = 8,4 Hz, H-3), 4,37 (ddd, 1H, H-4), 4,58, 4,59 (2d, 2H, Jgem = 13,0 Hz, CH2Ph), 4,87 (d, 1H, H-1), 4,78, 5,03 (2d, 2H, Jgem = 12,5 Hz, CH2Ph), 7,19-7,25, 7,31-7,42 (2m, 10H, 2Ph).

¹³C NMR (DMSO-d6): δ 55,72, 59,41, 59,81, 69,98, 77,49, 78,00, 98,54, 127,99, 128,05, 129,33, 129,38, 131,35, 131,72, 133,51, 133,53, 133,85, 133,97, 134,72, 135,32, 208,21.

Etap C: 3,5-Bis-0-(2,4-dichlorofenylometylo)-2-C-metylo-1-0-metylo-a-D-rybofuranoza

Do roztworu MeMgBr w bezwodnym Et₂O (0,48 M, 300 ml) w temperaturze -55°C wkroplono roztwór związku z etapu B (17,40 g, 36,2 mmoli) w bezwodnym Et2O (125 ml). Mieszaninę reakcyjną pozostawiono do ogrzania -30°C i mieszano przez 7 h w temperaturze -30°C do -15°C, następnie wylano do wody z lodem (500 ml) i mieszaninę energicznie mieszano w temperaturze pokojowej przez 0,5 h. Mieszaninę przesączono przez warstwę celitu (10 x 5 cm), którą starannie przemyto Et2O. Warstwę organiczną wysuszono (MgSO4), przesączono i zatężono. Pozostałość rozpuszczono w heksanach (-30 ml), naniesiono na kolumnę z żelem krzemionkowym (10 x 7 cm, uprzednio upakowaną w heksanach) i eluowano heksanami i mieszaniną heksany/EtOAc (9/1), otrzymując tytułowy związek (16,7 g) w postaci bezbarwnego syropu.

¹H NMR (CDCI3): δ 1,35 (d, 3H, JMe,OH = 0,9 Hz, 2C-Me), 3,33 (q, 1H, OH), 3,41 (d, 1H, J3,4 = 3,3 Hz), 3,46 (s, 3H, OCH3), 3,55 (d, 2H, J5,4 = 3,7 Hz, H-5a, H-5b), 4,18 (pozorny q, 1H, H-4), 4,52 (s, 1H, H-1), 4,60 (s, 2H, CH2Ph), 4,63, 4,81 (2d, 2H, Jgem = 13,2 Hz, CH2Ph), 7,19-7,26, 7,34-7,43 (2m, 10H, 2Ph).

¹³C NMR (CDCI3): δ 24,88, 55,45, 69,95, 70,24, 70,88, 77,06, 82,18, 83,01, 107,63, 127,32, 129,36, 130,01, 130,32, 133,68, 133,78, 134,13, 134,18, 134,45, 134,58.

Etap D: 4-Chloro-7-[3,5-bis-0-(2,4-dichlorofenylometylo]-2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo]-7H-pirolo-[2,3-cflpirymidyna

Do roztworu związku z etapu C (9,42 g, 19 mmoli) w bezwodnym dichlorometanie (285 ml) w temperaturze 0°C wkroplono HBr (5,7M roztwór w kwasie octowym, 20 ml, 114 mmoli). Uzyskany roztwór mieszano w temperaturze 0°C przez 1 h i następnie w temperaturze pokojowej przez 3 h, odparowano pod próżnią i odparowano razem z bezwodnym toluenem (3 x 40 ml). Oleistą pozostałość rozpuszczono w bezwodnym acetonitrylu (50 ml) i dodano do roztworu soli sodowej 4-chloro-1H-pirolo[2,3-d]pirymidyny w acetonitrylu [generowany in situ z 4-chloro-1H-pirolo[2,3-d]pirymidyny [wytwarzanie, patrz: J. Chem. Soc: 131 (1960)] (8,76 g, 57 mmoli) w bezwodnym acetonitrylu (1000 ml) i NaH (60% w oleju mineralnym, 2,28 g, 57 mmoli), po 4 h energicznego mieszania w temp. pokojowej]. Połączoną mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 24 h, i następnie odparowano do sucha. Pozostałość zawieszono w wodzie (250 ml) i ekstrahowano EtOAc (2 x 500 ml). Połączone ekstrakty przemyto solanką (300 ml, wysuszono nad Na2SO4, przesączono i odparowano. Surowy

PL 207 405 B1 produkt oczyszczono na kolumnie z silikażelem (10 x 10 cm), stosując mieszaninę octan etylu/heksan (1:3 i 1:2) jako eluent. Frakcje zawierające produkt połączono i odparowano pod próżnią, otrzymując żądany produkt (5,05 g) w postaci bezbarwnej pianki.

¹H NMR (CDCI₃): δ 0,93 (s, 3H, CH₃), 3,09 (s, 1H, OH), 3,78 (dd, 1H, J₅,_s· = 10,9 Hz, J₅'₄ = 2,5 Hz, H-5') 3,99 (dd, 1H, J₅„₄ = 2,2 Hz, H-5), 4,23-4,34 (m, 2H, H-3', H-4'), 4,63, 4,70 (2d, 2H, J_gem ' = 12,7 Hz, CH2Ph), 4,71, 4,80 (2d, 2H, Jgem = 12,1 Hz,CH2Ph), 6,54 (d, 1H, J5,6 = 3,8 Hz, H-5), 7,23-7,44 (m, 10H, 2Ph).

¹³C NMR (CDCI3): δ 21,31, 69,10, 70,41, 70,77, 79,56, 80,41, 81,05, 91,11, 100,57, 118,21, 127,04, 127,46, 127,57, 129,73, 129,77, 130,57, 130,99, 133,51, 133,99, 134,33, 134,38, 134,74, 135,21, 151,07, 151,15 152,47.

Etap E: 4-Chloro-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-cf]-pirymidyna

Do roztworu związku z etapu D (5,42 g, 8,8 mmoli) w dichlorometanie (175 ml) w temperaturze -78°C wkroplono trichlorek boru (1M w dichlorometanie, 88 ml, 88 mmoli). Mieszaninę mieszano w temperaturze -78°C przez 2,5 h, następnie w temperaturze -30°C do -20°C przez 3 h. Reakcję przerwano przez dodanie mieszaniny metanol/dichlorometan (1:1) (90 ml) i uzyskaną mieszaninę mieszano w temperaturze -15°C przez 30 min., następnie zobojętniono wodnym roztworem amoniaku w temperaturze 0°C i mieszano w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Osad przesączono i przemyto CH2Cl2/MeOH (1/1, 250 ml). Połączone przesącze odparowano, i pozostałość oczyszczono przez chromatografię flash na silikażelu, stosując jako eluent CH2CI2 i gradient CH2Cl2:MeOH (99:1, 98:2, 95:5 i 90:10), otrzymując żądany związek (1,73 g) w postaci bezbarwnej pianki, która po obróbce MeCN przeszła w bezpostaciowy osad.

¹H NMR (DMSO-d6): δ 0,64 (s, 3H, CH3), 3,61-3,71 (m, 1H, H-5'), 3,79-3,88 (m, 1H, H-5), 3,89-4,01 (m, 2H, H-3', H-4'), 5,15-5,23 (m, 3H, 2'-OH, 3'-OH, 5'-OH), 6,24 (s, 1H, H-1'), 6,72 (d, 1H, J5,6 = 3,8 Hz, H-5), 8,13 (d, 1H, H-6), 8,65 (s, 1H, H-2).

¹³C NMR (DMSO-d6): δ 20,20, 59,95, 72,29, 79,37, 83,16, 91,53, 100,17, 117,63, 128,86, 151,13, 151,19, 151,45.

Etap F: 4-Amino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-cf]-pirymidyna

Do związku z etapu E (1,54 g, 5,1 mmoli) dodano metanolowy roztwór amoniaku (nasycony w temperaturze 0°C; 150 ml). Mieszaninę ogrzewano w autoklawie ze stali nierdzewnej w temperaturze 85°C przez 14 h, następnie ochłodzono i odparowano pod próżnią. Surową mieszaninę oczyszczono na kolumnie z silikażelem z CH2Cl2/MeOH (9/1) jako eluentem, otrzymując tytułowy związek w postaci bezbarwnej pianki (0,8 g), który po obróbce MeCN oddzielono jako bezpostaciowy osad. Bezpostaciowy osad rekrystalizowano z mieszaniny metanol/acetonitryl; t.t. 222°C.

¹H NMR (DMSO-d6): δ 0,62 (s, 3H, CH3), 3,57-3,67 (m, 1H, H-5'), 3,75-3,97 (m, 3H, H-5, H-4', H-3'), 5,00 (s, 1H, 2'-OH), 5,04 (d, 1H, J₃oh3' = 6,8 Hz, 3'-OH), 5,06 (t, 1H, J_5Oh₅'5 = 5,1 Hz, 5'-OH), 6,11 (s, 1H, H-1'), 6,54 (d, 1H, J5,6 = 3,6 Hz, H-5), 6,97 (br s, 2H, NH2), 7,44 (d, 1H, H-6), 8,02 (s, 1H, H-2).

¹³C NMR (DMSO-d6): δ 20,26, 60,42, 72,72, 79,30, 82,75, 91,20, 100,13, 103,08, 121,96, 150,37, 152,33, 158,15.

LC-MS: Stwierdzono: 279,10 (M-H⁺); obliczono dla C12H16N4O4+H⁺: 279,11.

PRZYKŁAD 3

4-Amino-7-(2-C-etylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna

Etap A: 3,5-Bis-(2,4-dichlorofenylometylo)-2-C-etylo-1-0-metylo-α-D-rvbofuranoza

Do eteru dietylowego (300 ml) w temperaturze -78°C powoli dodano EtMgBr (3,0 M, 16,6 ml) i następnie wkroplono związek z etapu B z przykładu 2 (4,80 g, 10,0 mmoli) w bezwodnym Et2O (100 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze -78°C przez 15 min, pozostawiono do ogrzania do -15°C i mieszano przez jeszcze 2 h, i następnie wylano do mieszanej mieszaniny wody (300 ml)

PL 207 405 B1 i Et2O (600 ml). Fazę organiczną oddzielono, wysuszono (MgSO4), i odparowano pod próż nią . Surowy produkt oczyszczono na silikażelu, stosując mieszaninę octan etylu/heksan (1:2) jako eluent. Frakcje zawierające produkt połączono i odparowano pod próżnią, otrzymując żądany produkt (3,87 g) w postaci bezbarwnego oleju.

Etap B: 4-Chloro-7-[3,5-bis-O-(2,4-dichlorofenylometylo)-2-C-etylo-e-D-rybofuranozylo]-7H-pirolo-[2,3-dlpirymidyna

Do roztworu związku z etapu A (1,02 mg, 2,0 mmoli) w dichlorometanie (40 ml) wkroplono w temperaturze 0°C HBr (5,7 M w kwasie octowym) (1,75 ml, 10,0 mmoli). Uzyskany roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 h, odparowano pod próżnią i odparowano dwukrotnie z toluenu (10 ml). Oleistą pozostałość rozpuszczono w acetonitrylu (10 ml) i dodano do energicznie mieszanej mieszaniny 4-chloro-1H-pirolo[2,3-d]pirymidyny (307 mg, 2,0 mmoli), wodorotlenku potasu (337 mg, 6,0 mmoli) i tris[2-(2-metoksyetoksy)etylo]aminy (130 mg, 0,4 mmoli) w acetonitrylu (10 ml). Uzyskaną mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej do następnego dnia, i następnie wylano do mieszanej mieszaniny nasyconego chlorku amonu (100 ml) i octanu etylu (100 ml). Warstwę organiczną oddzielono, przemyto solanką (100 ml), wysuszono nad MgSO4, przesączono i odparowano pod próżnią. Surowy produkt oczyszczono na silikażelu, stosując jako eluent mieszaninę octan etylu/heksan (1:2), otrzymując żądany produkt (307 mg) w postaci bezbarwnej pianki.

Etap C: 4-Chloro-7-(2-C-etylo-e-D-rybofuranozylo1-7H-pirolo[2,3-d1pirymidyna

Do roztworu związku z etapu B (307 mg, 0,45 mmoli) w dichlorometanie (8 ml) dodano trichlorek boru (1M w dichlorometanie) (4,50 ml, 4,50 mmoli) w temperaturze -78°C. Mieszaninę mieszano w temperaturze -78°C przez 1 h, następnie w temperaturze -10°C przez 3 h. Reakcję przerwano przez dodanie mieszaniny metanol/dichlorometan (1:1) (10 ml), mieszano w temperaturze -15°C przez 30 minut, i zobojętniono przez dodanie wodnego roztworu wodorotlenku amonu. Mieszaninę odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem i uzyskany olej oczyszczono na silikażelu, stosując jako eluent mieszaninę metanol/dichlorometan (1:9). Frakcje zawierające produkt połączono i odparowano pod próżnią, otrzymując żądany produkt (112 mg) w postaci bezbarwnej pianki.

Etap D: lAmino-Z-T-C-etylo-e-D-rybofuranozylolTH-pirololZS-dlpirymidyna

Do związku z etapu C (50 mg, 0,16 mmoli) dodano nasycony roztwór amoniaku w metanolu (4 ml). Mieszaninę mieszano w temperaturze 75°C przez 72 h w zamkniętym pojemniku, ochłodzono i odparowano pod próżnią. Surową mieszaninę oczyszczono na silikażelu, stosując jako eluent metanol/dichlorometan (1:9). Frakcje zawierające produkt połączono i odparowano pod próżnią, otrzymując żądany produkt (29 mg) w postaci bezbarwnego proszku.

¹HNMR (200 MHz, DMSO-d6): δ 0,52 (t, 3H), 1,02 (m, 2H), 4,01-3,24 (m, 6H), 5,06 (m, 1H), 6,01 (s, 1H), 6,51 (d, 1H), 6,95 (s br, 2H), 6,70 (d, 1H), 7,99 (s, 1H).

LC-MS: Stwierdzono: 295,2 (M+H⁺); obliczono dla C13H18N4O4+H⁺: 295,14.

PRZYKŁAD 4

2-Amino-7-(2-C-metylo-β-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d1pirvmidyn-4(3H)-on

Etap A: 2-Amino-4-chloro-7-[3,5-bis-O-(2,4-dichlorofenylometylo)-2-C-metylo-e-D-rybofuranozyloWH-pirolo^O-rflpirymidyna

Do chłodzonego lodem roztworu produktu z etapu C z przykładu 2 (1,27 g, 2,57 mmoli) w CH2CI2 (30 ml) wkroplono HBr (5,7M roztwór w kwasie octowym; 3 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 h, zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i odparowano z toluenem (2 x 15 ml). Uzyskany olej rozpuszczono w acetonitrylu (MeCN) (15 ml) i wkroplono do dobrze mieszanej mieszaniny 2-amino-4-chloro-7H-pirolo[2,3-d1pirvmidyny [wytwarzanie, patrz Heterocycles 35: 825 (1993)] (433 mg, 2,57 mmoli), KOH (85%, sproszkowany) (0,51 g, 7,7 mmoli), tris-[2-(2-metoksyetoksy)etylo1aminy (165 0,51 mmoli) w acetonitrylu (30 ml). Uzyskaną mieszaninę miePL 207 405 B1 szano w temperaturze pokojowej przez 1h, przesączono i odparowano. Pozostałość oczyszczono na kolumnie z silikażelem, stosując heksany/EtOAc, 5/1, 3/1 i 2/1, jako eluent, otrzymując tytułowy związek w postaci bezbarwnej pianki (0,65 g).

Etap B: 2-Amino-4-chloro-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo [2,3-dlpirymidyna Do roztworu produktu z etapu A (630 mg, 1,0 mmoli) w CH₂CI₂ (20 ml) w temperaturze -78°C dodano trichlorek boru (1M w CH2CI2) (10 ml, 10 mmoli). Mieszaninę mieszano w temperaturze -78°C przez 2 h, następnie w temperaturze -20°C przez 2,5 h. Reakcję wygaszono mieszaniną CH2Cl2/MeOH (1:1) (10 ml), mieszano w temperaturze -20°C przez 0,5 h, i zobojętniono w temperaturze 0°C wodnym roztworem amoniaku. Osad przesączono, przemyto mieszaniną CH2Cl2/MeOH (1:1) i połączone przesącze odparowano pod próżnią. Pozostałość oczyszczono na kolumnie z silikażelem, stosując mieszaninę CH2Cl2/MeOH, 50/1 i 20/1, jako eluent, otrzymując tytułowy związek w postaci bezbarwnej pianki (250 mg).

Etap C: 2-Amino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d1pirymidyn-4(3H)-on Mieszaninę produktu z etapu B (90 mg, 0,3 mmoli) w wodnym roztworze NaOH (2N, 9 ml) ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 5 h, następnie zobojętniono w temperaturze 0°C 2N wodnym roztworem HCl i odparowano do sucha. Po oczyszczeniu na kolumnie z silikażelem z układem CHaCl2/MeOH, 5/1 jako eluentem otrzymano związek tytułowy w postaci białego osadu (70 mg).

¹H NMR (200 MHz, CD3OD): δ 0,85 (s, 3H), 3,79 (m 1H), 3,90-4,05 (m, 3H), 6,06 (s, 1H), 6,42 (d, J= 3,7 Hz, 1H), 7,05 (d, J= 3,7 Hz, 1H).

PRZYKŁAD 5

2-Amino-4-cyklopropyloamino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d1pirymidyna

Roztwór 2-amino-4-chloro-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyny (przykład 4, Etap B) (21 mg, 0,07 mmoli) w cyklopropyloaminie (0,5 ml) ogrzewano w temperaturze 70^oC przez dwa dni, następnie odparowano do oleistej pozostałości i oczyszczono na kolumnie z silikażelem z mieszaniną CH2Cl2/MeOH, 20/ 1 jako eluentem, otrzymując tytułowy związek w postaci białego osadu (17 mg).

¹H NMR (200 MHz, CD3CN): δ 0,61 (m, 2H), 0,81 (m, 2H), 0,85 (s, 3H), 2,83 (m, 1H), 3,74-3,86 (m, 1H), 3,93-4,03 (m, 2H), 4,11 (d, J= 8,9 Hz, 1H), 6,02 (s, 1H), 6,49 (d, J = 3,7 Hz, 1H), 7,00 (d, J= 3,7 Hz, 1H).

PRZYKŁAD 6

4-Amino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-cflpirymidyno-5-karbonitryl

Związek ten wytworzono według procedur opisanych przez Y. Murai et al. w Heterocycles 33: 391-404 (1992).

PRZYKŁAD 7

4-Amino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d1pirymidyna-5-karboksyamid

PL 207 405 B1

PRZYKŁAD 8

Pochodne 5'-trifosforanowe

5'-Trifosforany nukleozydów według niniejszego wynalazku wytworzono zgodnie z ogólnymi procedurami opisanymi w Chem. Rev. 100: 2047 (2000).

PRZYKŁAD 9

Oczyszczanie i analiza czystości pochodnych 5'-trifosforanowych

Pochodne trifosforanowe oczyszczono przez chromatografię aniono-wymienną (AX), stosując kolumnę 30 x 100 mm Mono Q (Pharmacia) z systemem buforującym 50 mM Tris, pH 8. Gradienty elucji typowo wynosiły od 40 mM NaCl do 0,8 M NaCl w dwóch objętościach kolumny przy szybkości przepływu 6,5 ml/min. Odpowiednie frakcje z chromatografii anionowymiennej zebrano i odsolono za pomocą chromatografii w układzie z odwróconymi fazami (RP), stosując kolumnę Luna C18 250 x 21 mm (Phenomenex) przy szybkości przepływu 10 ml/min. Gradienty elucji typowo wynosiły od 1% do 95% metanolu przez 14 minut przy stałym stężeniu 5 mM octanu trietyloamoniowego (TEAA).

Widma masowe oczyszczonych trifosforanów zmierzono stosując HPLC ze spektrometrią masową on-line na aparacie Hewlett-Packard (Palo Alto, CA) MSD 1100. Do RP HPLC stosowano kolumnę Phenomenex Luna (Cl8(2)), 150 x 2 mm, plus pre-kolumnę 30 x 2 mm, wielkość cząstek 3 μm. Przeprowadzono gradient liniowy 0 do 50% (15 min) acetonitrylu w 20 mM TEAA (octan trietyloamoniowy) pH 7 z detekcją za pomocą spektroskopii masowej w trybie jonizacji ujemnej. Do generowania strumienia elektronów zastosowano gazowy azot i nebulizer pneumatyczny. Badano zakres ciężaru cząsteczkowego 150-900. Ciężary cząsteczkowe oznaczono stosując zestaw do analizy HP Chemstation.

Czystość oczyszczonych trifosforanów zmierzono stosując analityczną RP i AX HPLC. RP HPLC na kolumnie Phenomonx Luna lub Jupiter (250 x 4,6 mm), wielkość cząstek 5-L.im typowo przeprowadzano z gradientem 2-70% acetonitrylu w ciągu 15 minut w 100 mM TEAA, pH 7. AX HPLC przeprowadzano na kolumnie 1,6 x 5 mm Mono Q (Pharmacia). Trifosforany eluowano gradientem 0 do 0,4 M NaCl przy stałym stężeniu 50 mM Tris, pH 8. Czystość trifosforanów generalnie wynosi >80%.

PRZYKŁAD 10

Pochodne 5-monofosforanowe

5'-Monofosforany nukleozydów według niniejszego wynalazku wytworzono według ogólnych procedur opisanych w Tetrahedron Lett. 50: 5065 (1967).

PRZYKŁAD 11

Charakterystyka pochodnych 5'-trifosforanowvch za pomocą spektroskopii mas

Widma mas 5'-trifosforanów związków według niniejszego wynalazku zmierzono, tak jak opisano w przykładzie 10. W poniższej tabeli podano obliczone i eksperymentalne masy dla reprezentatywnych 5'-trifosforanów wytworzonych według procedur z przykładu 8. Numery przykładów odpowiadają związkowi macierzystemu 5'-trifosforanu.

Przykład	Obliczono	Stwierdzono
1	520,0	519,9
2	520,0	520,0
3	534,0	534,0
4	536,0	536,0

PL 207 405 B1

PRZYKŁAD 12

5'-Monofosforan 4-Amino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo-[2,3-d]pirymidyny

Do związku z etapu F z przykładu 2(14 mg, 0,05 mmoli) (wysuszonego przez odparowanie z pirydyną i kilka razy z toluenem) dodano fosforan trimetylu (0,5 ml). Mieszaninę mieszano do następnego dnia w zamkniętym pojemniku. Następnie ochłodzono ją do 0°C i dodano za pomocą strzykawki tlenochlorek fosforu (0,0070 ml, 0,075 mmoli). Mieszaninę mieszano przez 3 h w temperaturze 0°C, następnie reakcję przerwano przez dodanie wodorowęglanu tetraetyloamoniowego (TEAB) (1M) (0,5 ml) i wody (5 ml). Mieszaninę reakcyjną oczyszczono i analizowano według procedury opisanej w przykładzie 10.

Widmo mas z elektrorozpylaniem (ES-MS): Stwierdzono: 359,2 (M-H⁺), obliczono dla C12H17N4O7P- H⁺: 359,1.

PRZYKŁAD 13

5'-Difosforan 4-amino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo-[2,3-d]pirymidyny

Do związku z etapu F z przykładu 2 (56 mg, 0,20 mmoli) (wysuszonego przez odparowanie razem z pirydyną i kilka razy z toluenem) dodano fosforan trimetylu (przechowywany nad sitami) (1,0 ml). Mieszaninę mieszano do następnego dnia w zamkniętym pojemniku. Następnie ochłodzono ją do 0°C i dodano za pomocą strzykawki tlenochlorek fosforu (0,023 ml, 0,25 mmoli). Mieszaninę mieszano przez 2 h w temperaturze 0°C, następnie dodano tributyloaminę (0,238 ml, 1,00 mmoli) i fosforan tributyloamonowy (wytworzony z kwasu fosforowego i tributyloaminy w pirydynie, następnie kilkakrotnie azeotropowo odparowywany z pirydyną i acetonitrylem) (1,0 mmol w 3,30 ml acetonitrylu). Mieszaninę mieszano przez dodatkowe 30 minut w temperaturze 0°C, następnie zatopioną fiolkę otwarto i reakcję przerwano przez dodanie TEAB (IM) (1,0 ml) i wody (5 ml). Mieszaninę reakcyjną oczyszczono i analizowano według procedury opisanej w przykładzie 9.

ES-MS: Stwierdzono: 439,0 (M-H⁺), obliczono dla C12H18N4O10P2- H⁺: 439,04.

PRZYKŁAD 14

5'-Trifosforan 4-amino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo-[2,3-d]pirymidyny

Do związku z etapu F z przykładu 2 (20 mg, 0,07 mmoli) (wysuszonego przez odparowanie z pirydyną i kilka razy z toluenem) dodano fosforan trimetylu (przechowywany nad sitami) (0,4 ml). Mieszaninę mieszano do następnego dnia w zamkniętym pojemniku. Następnie ochłodzono ją do 0°C i dodano za pomocą strzykawki tlenochlorek fosforu (0,0070 ml, 0,075 mmoli). Mieszaninę mieszano przez 3 h w temperaturze 0°C, dodano następnie tributyloaminę (0,083 ml, 0,35 mmoli), pirofosforan tributyloamoniowy (127 mg, 0,35 mmoli) i acetonitryl (przechowywany nad sitami) (0,25 ml). Mieszaninę mieszano przez dodatkowe 30 minut w temperaturze 0°C, następnie zamkniętą fiolkę otworzono i reakcję przerwano przez dodanie TEAB (1M) (0,5 ml) i wody (5 ml). Mieszaninę reakcyjną oczysz18

PL 207 405 B1 czono i analizowano według procedury opisanej w przykładzie 9. ES-MS: Stwierdzono: 519,0 (M-H⁺), obliczono dla C12H19N4O13P3- H⁺: 519,01.

PRZYKŁAD 15

7-(2-C-metvlo-e-D-rvbofuranozvlol-7H-pirolo[2₁3-dlpirvmidvn-4(3H)-on

Do związku z etapu E z przykładu 2 (59 mg, 0,18 mmoli) dodano wodny roztwór wodorotlenku sodu (1M). Mieszaninę ogrzewano do wrzenia przez 1 h1 ochłodzono1 zobojętniono wodnym roztworem HCl (2M) i odparowano pod próżnią. Pozostałość oczyszczono na silikażelu1 stosując jako eluent dichlorometan/metanol (4:1). Frakcje zawierające produkt połączono i odparowano pod próżnią1 otrzymując żądany produkt (53 mg) w postaci bezbarwnego oleju.

¹H NMR (CD3CN): δ 0170 (s1 3H)1 3134-4115 (nakładający się m1 7H)1 6116 (s1 1H)1 6157 (d1 316

Hz1 1H)1 7137 (d1 316 Hz1 1H)1 8183 (s1 1H).

PRZYKŁAD 16

4-Amino-5-chloro-7-(2-C-metvlo-e-D-rvbofuranozvlo)-7H-pirolo[2i3-cnpirvmidvna

Do wstępnie ochłodzonego roztworu (0°C) związku z etapu F z przykładu 2 (140 mg1 0150 mmoli) w DMF (215 ml) wkroplono N-chlorosukcynoimid (01075 g1 0155 mmoli) w DMF (015 ml). Roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 h i reakcję przerwano przez dodanie metanolu (4 ml) i odparowano pod próżnią. Surowy produkt oczyszczono na silikażelu1 stosując metanol/dichlorometan (1:9) jako eluent. Frakcje zawierające produkt połączono i odparowano pod próżnią1 otrzymując żądany produkt (55 mg) w postaci bezbarwnego ciała stałego.

¹H NMR (CD3CN): δ 0180 (s1 3H)1 3165-4114 (nakładający się m1 7H)1 5197 (s br1 2H)1 6117 (s1 1H)1 7151 (s1 1H)1 8116 (s1 1H).

ES-MS: Stwierdzono: 31510 (M+H⁺)1 obliczono dla C12H15CIN4O4 + H⁺: 315109.

PRZYKŁAD 17

4-Amino-5-bromo-7-(2-C-metvlo-e-D-rvbofuranozvlo)-7H-pirolo[2,3-cnpirvmidvna

Do ochłodzonego roztworu (0°C) związku z etapu F z przykładu 2 (28 mg1 0110 mmoli) w DMF (015 ml) wkroplono N-bromosukcynoimid (01018 g1 0110 mmoli) w DMF (015 ml). Roztwór mieszano w temperaturze 0°C przez 20 minut1 następnie w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Reakcję

PL 207 405 B1 przerwano przez dodanie metanolu (4 ml) i odparowano pod próżnią. Surowy produkt oczyszczono na silikażelu, stosując metanol/dichlorometan (1:9) jako eluent. Frakcje zawierające produkt połączono i odparowano pod próżnią, otrzymując żądany produkt (13,0 mg) w postaci bezbarwnego ciała stałego.

¹H NMR (CD3CN): δ 0,69 (s, 3H), 3,46-4,00 (nakładający się m, 7H), 5,83 (s br, 2H), 6,06 (s, 1H), 7,45 (s, 1H), 8,05 (s, 1H).

ES-MS: Stwierdzono: 359,1 (M+H⁺), obliczono dla C12H15BrN4O4 + H⁺: 359,04.

PRZYKŁAD 18

2-Amino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna

Mieszaninę 2-amino-4-chloro-7-(2-C-metylo-p-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyny (przykład 4, Etap B) (20 mg, 0,07 mmoli) w EtOH (1,0 ml), pirydyny (0,1 ml) i 10% Pd/C (6 mg) pod H2 (ciśnienie atmosferyczne) mieszano do następnego dnia w temperaturze pokojowej. Mieszaninę przesączono przez warstwę celitu, którą starannie przemyto EtOH. Połączone przesącze odparowano i oczyszczono na kolumnie z silikażelem z mieszaniną CH2Cl2/MeOH, 20/1 i 10/1 jako eluentem, otrzymując tytułowy związek w postaci białego osadu (16 mg).

¹H NMR (200 MHz, CD3OD): δ 0,86 (s, 3H, 2'C-Me), 3,82 (dd, J5,4 = 3,6 Hz, J5',5' = 12,7 Hz, 1H, H-5'), 3,94-4,03 (m, 2H, H-5', H-4'), 4,10 (d, J3,4 = 8,8 Hz, 1H, H-3'), 6,02 (s, 1H, H-1'), 6,41 (d, J5,6 = 3,8 Hz, 1H, H-5), 7,39 (d, 1H, H-6), 8,43 (s, 1H, H-4). ES MS: 281,4 (MH⁺).

PRZYKŁAD 19

2-Amino-5-metylo-7-(2-C,2-0-dimetylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo-[2,3-cf]pirymidyn-4(3H)-on

Etap A: 2-Amino-4-chloro-7-[3,5-bis-0-[2,4-dichlorofenylometylo)-2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo]-5-metylo-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna

Do chłodzonego lodem roztworu produktu z etapu C z przykładu 2 (1,57 g, 3,15 mmoli) w CH2Cl2 (50 ml) wkroplono HBr (5,7M roztwór w kwasie octowym; 3,3 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 0°C przez 1 h i następnie w temperaturze pokojowej przez 2 h, zatężono pod próżnią i odparowano z toluenem (2 x 20 ml). Uzyskany olej rozpuszczono w MeCN (20 ml) i wkroplono do roztworu soli sodowej 2-amino-4-chloro-5-metylo-1H-pirolo[2,3-d]pirymidyny w acetonitrylu [generowany in situ z 2-amino-4-chloro-5-metylo-1H-pirolo[2,3-d]pirymidyny [wytwarzanie, patrz Liebigs Ann. Chem. 1984: 708-721] (1,13 g, 6,2 mmoli) w bezwodnym acetonitrylu (150 ml), i NaH (60% w oleju mineralnym, 248 mg, 6,2 mmoli), po 2 h energicznego mieszania w temperaturze pokojowej]. Połączoną mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 24 h i następnie odparowano do sucha. Pozostałość zawieszono w wodzie (100 ml) i ekstrahowano EtOAc (300 + 150 ml). Połączone ekstrakty przemyto solanką (100 ml), wysuszono nad Na2SO4, przesączono i odparowano. Surowy produkt oczyszczono na kolumnie z silikażelem (5 x 7 cm), stosując jako eluent mieszaninę octan etylu/heksan (0 do 30% EtOAc, gradient krokowy co 5%). Frakcje zawierające produkt połączono i odparowano pod próżnią, otrzymując żądany produkt (0,96 g) w postaci bezbarwnej pianki.

Etap B: 2-Amino-4-chloro-7-[3,5-bis-0-(2,4-dichlorofenylometylo]-2-C,2-0-dimetylo-e-D-rybofuranozylo]-5-metylo-7H-pirolo-[2,3-cf]pirymidyna

Do ochłodzonej lodem mieszaniny produktu z etapu A (475 mg, 0,7 mmoli) w THF (7 ml) dodano NaH (60% w oleju mineralnym, 29 mg) i mieszano w temperaturze 0°C przez 0,5 h. Następnie

PL 207 405 B1 dodano Mel (48 μθ i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 24 h. Reakcję przerwano MeOH i mieszaninę odparowano. Surowy produkt oczyszczono na kolumnie z silikażelem (5 x 3,5 cm), stosując jako eluent heksan/octan etylu (9/1, 7/1, 5/1 13/1). Frakcje zawierające produkt połączono i odparowano, otrzymując żądany związek (200 mg) w postaci bezbarwnej pianki.

Etap C: 2-Amino-7-[3,5-bis-0-(2,4-dichlorofenylometylo)-2-C,2-0-dimetylo-e-D-rybofuranozylo]-5-metylo-7H-pirolo[2,3-dj-pirymidyna-4(3H)-on

Mieszaninę produktu z etapu B (200 mg, 0,3 mmoli) w 1,4-dioksanie (15 ml) i wodnym NaOH (2N, 15 ml) w butli ciśnieniowej ogrzewano do następnego dnia w temperaturze 135°C. Mieszaninę następnie ochłodzono do 0°C, zobojętniono 2N wodnym HCl i odparowano do sucha. Surowy produkt zawieszono w MeOH, przesączono, i osad starannie przemyto MeOH. Połączone przesącze zatężono, i pozostałość oczyszczono na kolumnie z silikażelem (5 x 5 cm), stosując CH2Cl2/MeOH (40/1, 30/1 i 20/ 1) jako eluent, otrzymując żądany związek (150 mg) w postaci bezbarwnej pianki.

Etap D: 2-Amino-5-metylo-7-(2-C,2-0-dimetylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d1pirymidyn-4(3H)-on

Mieszaninę produktu z etapu C (64 mg, 0,1 mmoli) w MeOH (5 ml) i Et₃N (0,2 ml) i 10% Pd/C (24 mg) uwodorniano w aparacie Parr'a pod ciśnieniem 0,345 MPa (50 psi) w temperaturze pokojowej przez 1,5 dni, następnie przesączono przez warstwę celitu, którą starannie przemyto MeOH. Połączone przesącze odparowano i pozostałość oczyszczono na kolumnie z silikażelem (3 x 4 cm) z CH2Cl2/MeOH (30/1, 20/1) jako eluentem, otrzymując 2-amino-5-metylo-7-(5-0-benzylo-2-C,2-0-dimetylo-p-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d1pirymidyn-4(3H)-on. Związek (37 mg) uwodorniano dalej w EtOH (2 ml) za pomocą 10% Pd/C i pod atmosferycznym ciśnieniem wodoru. Mieszano przez 2 dni w temperaturze pokojowej, po czym mieszaninę reakcyjną przesączono przez celit, przesącz odparowano i surowy produkt oczyszczono na kolumnie z silikażelem (1 x 7 cm) z CH2Cl2/MeOH (30/1, 20/1 i 10/1) jako eluentem, otrzymując po liofilizacji związek tytułowy (12 mg).

¹H NMR (200 MHz, CD3OD): δ 0,81 (s, 3H, 2'C-Me), 2,16 (d, JH-6,C5-Me = 1,3 Hz, 3H, C5-Me), 3,41 (s, 3H, 2'-OMe), 3,67 (dd, J5'4'= 3,4 Hz, J5'5” = 12,6 Hz, 1H, H-5'), 3,81-3,91 (m, 3H, H-5, H-4', H-3'), 6,10 (s, 1H, H-1'), 6,66 (d, 1H, H-6). ES MS: 323,3 (M-H)⁺

PRZYKŁAD 20

4-Amino-5-metylo-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d1pirymidyna

Etap A: 4-Chloro-7-[3,5-bis-0-(2,4-dichlorofenylometylo)-2-C-metylo-8-D-rybofuranozylo]-5-metylo-7H-pirolo[2,3-d1pirymidyna

Do chłodzonego lodem roztworu produktu z etapu C z przykładu 2 (1,06 g, 2,1 mmoli) w CH2CI2 (30 ml) wkroplono HBr (5,7M roztwór w kwasie octowym; 2,2 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 0°C przez 1 h i następnie w temperaturze pokojowej przez 2 h, zatężono pod próżnią i odparowano z toluenem (2 x 15 ml). Uzyskany olej rozpuszczono w MeCN (10 ml) i wkroplono do roztworu soli sodowej 4-chloro-5-metylo-1H-pirolo[2,3-d1pirymidyny w acetonitrylu [generowany in situ z 4-chloro-5-metylo-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyny [wytwarzanie, patrz J. Med. Chem. 33: 1984 (1990)1 (0,62 g, 3,7 mmoli) w bezwodnym acetonitrylu (70 ml), i NaH (60% w oleju mineralnym, 148 mg, 3,7 mmoli), po 2 h energicznego mieszania w temperaturze pokojowej1. Połączoną mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 24 h i następnie odparowano do sucha. Pozostałość zawieszono w wodzie (100 ml) i ekstrahowano EtOAc (250 + 100 ml). Połączone ekstrakty przemyto solanką (50 ml), wysuszono nad Na2SO4, przesączono i odparowano. Surowy produkt oczyszczono na kolumnie z silikażelem (5 x 5 cm) stosując jako eluent gradient mieszaniny heksan/octan etylu (9/1, 5/1, 3/1). Frakcje zawierające produkt połączono i odparowano pod próżnią, otrzymując żądany produkt (0,87 g) w postaci bezbarwnej pianki.

PL 207 405 B1

Etap B: 4-Chloro-5-metylo-7-(2-C-metylo-β-D-ι'vbofuranozylo)-7H-pirolo[2l3-cflpirymidyna

Do roztworu związku z etapu A (0187 g1 019 mmoli) w dichlorometanie (30 ml) w temperaturze -78°C wkroplono trichlorek boru (1M w dichlorometanie1 910 ml1 910 mmoli). Mieszaninę mieszano w temperaturze -78°C przez 215 h1 następnie w temperaturze -30°C do -20°C przez 3 h. Reakcję przerwano przez dodanie mieszaniny metanol/dichlorometan (1:1) (9 ml) i uzyskaną mieszaninę mieszano w temperaturze -15°C przez 30 minut1 następnie zobojętniono wodnym roztworem amoniaku w temperaturze 0°C i mieszano w temperaturze pokojowej przez 15 min. Osad przesączono i przemyto CH2Cl2/MeOH (1/11 50 ml). Połączone przesącze odparowano1 i pozostałość oczyszczono na kolumnie z silikażelem (5 x 5 cm) stosując gradient CH2CI2 i CH2Cl2/MeOH (40/1 i 30/1) jako eluent1 otrzymując żądany związek (0122 g) w postaci bezbarwnej pianki.

Etap C: 4-Amino-5-metylo-7-(2-C-metylo-β-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2l3-dlpirymidyna

Do związku z etapu B (012 g1 0164 mmoli) dodano metanolowy roztwór amoniaku (nasycony w temperaturze O°C; 40 ml). Mieszaninę ogrzewano w autoklawie ze stali nierdzewnej w temperaturze 100°C przez 14 h1 następnie ochłodzono i odparowano pod próżnią. Surową mieszaninę oczyszczono na kolumnie z silikażelem (5 x 5 cm) stosując gradient CH2Cl2/MeOH (50/11 30/11 20/ 1) jako eluent1 otrzymując tytułowy związek w postaci białego osadu (0112 g).

¹H NMR (DMSO-d6): δ 0160 (s1 3H1 2'C-Me)1 2126 (s1 3H1 5C-Me)1 3152-3161 (m1 1H1 H-5')1 3170-3188 (m1 3H1 H-51 H-4'1 H-3')1 5100 (s1 1H1 2'-OH)1 4191-4199 (m1 3H1 2'-OH1 3'-OH1 5'-OH)1 6104 (s1 1H1 H-1')1 6148 (br s1 2H1 O NH2)1 7112 (s1 1H1 H-6)1 7194 (s1 1H1 H-2). ES MS: 29512 (MH⁺).

PRZYKŁAD 21

Kwas 4-amino-7-(2-C-metylo-β-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2l3-dlpirymidyno-5-karboksylowy

Związek z przykładu 6 (01035 g1 0111 mmoli) rozpuszczono w mieszaninie wodnego roztworu amoniaku (4 ml1 30% wagowych i nasyconego metanolowego roztworu amoniaku (2 ml)1 i dodano roztwór H2O2 w wodzie (2 ml1 35% wag.). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 18 h. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem1 i otrzymaną pozostałość oczyszczono przez HPLC na kolumnie w układzie faz odwróconych (Altech Altima C-181 10x 299 mm1 A = woda1 B = acetonitryl1 10 do 60% B w ciągu 50 min1 przepływ 2 ml/min)1 otrzymując związek tytułowy (01015 g1 41 %) w postaci białego osadu.

¹H NMR (CD3OD): δ 0185 (s1 3H1 Me)1 3161 (m1 1H)1 3182 (m1 1H) 3199-4186 (m1 2H)1 6126 (s1 1H)1 8110 (s1 2H) 8122(s1 1H);

¹³C NMR (CD3OD): 201131 611371 731791 801421 841011 931001 1021661 1121071 1301071 1511401 1521741 1591121 169130.

HRMS (FAB) Obliczono dla C13H17N4O6⁺ 325111481 Stwierdzono 32511143.

PRZYKŁAD 22

4-Amino-7-(2-C-winylo-β-D-rybofuranozylol-7H-pirolo[2l3-dlpirymidyna

PL 207 405 B1

Etap A: 3,5-Bis-O-(2,4-dichlorofenylometylo)-2-C-winylo-1-O-metylo-a -D-rybofuranoza

Heptahydrat chlorku ceru (50 g, 134,2 mmoli) rozdrobniono dokładnie w ogrzanym moździerzu i przeniesiono do kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło mechaniczne. Kolbę ogrzewano pod wysoką próżnią w temperaturze 160°C do następnego dnia. Próżnię usunięto argonem i kolbę ochłodzono do temperatury pokojowej. Do kolby dodano za pomocą kaniuli bezwodny THF (300 ml). Uzyskaną zawiesinę mieszano w temperaturze pokojowej przez 4 h i następnie ochłodzono do -78°C. Dodano bromek winylomagnezowy (1M w THF, 120 ml, 120 mmoli) i kontynuowano mieszanie w temperaturze -78°C przez 2 h. Do tej zawiesiny wkroplono, ciągle mieszając, roztwór 3,5-bis-O-(2,4-dichlorofenylometylo)-1-O-metylo-a-D-erytro-pentofuranozo-2-ulozy (14 g, 30 mmoli) [z przykładu 2, Etap B] w bezwodnym THF (100 ml). Reakcję mieszano w temperaturze -78 °C przez 4 h. Reakcję przerwano nasyconym wodnym roztworem chlorku amonu i pozostawiono do dojścia do temperatury pokojowej. Mieszaninę przesączono przez warstwę celitu i pozostałość przemyto Et2O (2 x 500 ml). Warstwę organiczną oddzielono i warstwę wodną ekstrahowano Et2O (2 x 200 ml). Połączone warstwy organiczne wysuszono nad bezwodnym Na2SO4 i zatężono, otrzymując lepki olej. Olej oczyszczono przez chromatografię flash (SiO2, 10% EtOAc w heksanach). Otrzymano związek tytułowy (6,7 g, 13,2 mmoli) w postaci jasno-żółtego oleju.

Etap B: 4-Chloro-7-[3,5-bis-O-(2,4-dichlorofenylometylo)-2-C-winylo-e-D-rybofuranozylol-7H-piro-lo[2.3-cflpirymidyna

Do roztworu związku z etapu A (6,4 g, 12,6 mmoli) w bezwodnym dichlorometanie (150 ml) w temperaturze -20°C wkroplono HBr (30% roztwór AcOH, 20 ml, 75,6 mmoli). Uzyskany roztwór mieszano między -10°C i 0°C przez 4 h, odparowano pod próżnią i odparowano razem z bezwodnym toluenem (3 x 40 ml). Oleistą pozostałość rozpuszczono w bezwodnym acetonitrylu (100 ml) i do roztworu dodano sól sodową 4-chloro-1H-pirolo[2,3-d]pirymidyny (5,8 g, 37,8 mmoli) w acetonitrylu (wytworzoną in situ tak jak opisano w przykładzie 2) w temperaturze -20°C. Uzyskaną mieszaninę pozostawiono do dojścia do temperatury pokojowej i mieszano w temperaturze pokojowej przez 24 h. Następnie mieszaninę odparowano do sucha, roztworzono w wodzie i ekstrahowano EtOAc (2 x 300 ml). Połączone ekstrakty wysuszono nad Na2SO4, przesączono i odparowano. Surową mieszaninę oczyszczono przez chromatografię flash (SiO2, 10% EtOAc w heksanach) i tytułowy związek wydzielono w postaci białej pianki (1,75 g).

Etap C: 4-Amino-7-[3,5-bis-O-(2,4-dichlorofenylometylo)-2-C-winylo-e-D-rybofuranozylol-7H-piro-lo [2,3-cflpirymidyna

Związek z etapu B (80, mg) rozpuszczono w minimalnej ilości 1,4-dioksanu i umieszczono w bombie ze stali nierdzewnej. Bombę ochłodzono do -78°C i dodano ciekły amoniak. Bombę zamknięto i ogrzewano w temperaturze 90°C przez 24 h. Pozwolono aby amoniak odparował i pozostałość zatężono, otrzymując biały osad, który użyto w następnym etapie bez dalszego oczyszczania.

Etap D: 4-Amino-7-(2-C-winylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-cflpirymidyna

Do roztworu związku z etapu C (60 mg) w dichlorometanie w temperaturze -78 °C wkroplono trichlorek boru (1M w dichlorometanie). Mieszaninę mieszano w temperaturze -78 °C przez 2,5 h, następnie w temperaturze -30°C do -20°C przez 3 h. Reakcję przerwano przez dodanie mieszaniny metanol/dichlorometan (1:1) i uzyskaną mieszaninę mieszano w temperaturze -15°C przez 0,5 h, następnie zobojętniono wodnym roztworem amoniaku w temperaturze 0°C i mieszano w temperaturze pokojowej przez 15 min. Osad przesączono i przemyto mieszaniną metanol/dichlorometan (1:1). Połączone przesącze odparowano i pozostałość oczyszczono przez chromatografię flash (SiO2, 10% metanol w EtOAc, zawierający 0,1% trietyloaminy). Frakcje zawierające produkt odparowano, otrzymując związek tytułowy w postaci białego osadu (10 mg).

¹H NMR (DMSO-d6): δ 3,6 (m, 1H, H-5'), 3,8 (m, 1H, H-5), 3,9 (m d, 1-H, H-4'), 4,3 (t, 1H, H-3'), 4,8-5,3 (m, 6H, CH=CH2, 2'-OH, 3'-OH, 5'-OH) 6,12 (s, 1H, H-1'), 6,59 (d, 1H, H-5), 7,1 (br s, 1H, NH2), 7,43 (d, 1H, H-6), 8,01 (s, 1H, H-2).

ES-MS: Stwierdzono: 291,1 (M-H); obliczono dla C13H16N4O4 - H^-: 291,2.

PRZYKŁAD 23

4-Amino-7-(2-C-hydroksymetylo-e-D-rybofuranozylol-7H-pirolo[2,3-dlpirymidyna

PL 207 405 B1

Etap A: 4-Chloro-7-[3,5-bis-O-(2,4-dichlorofenylometylo)-2-C-hydroksymetylo-e-D-rybofuranozylo1-7H-pirolo[2,3-d1-pirymidyna

Do roztworu związku z przykładu 23, Etap B (300 mg, 0,48 mmoli) w 1,4-dioksanie (5 ml) dodano N-tlenek N-metylomorfoliny (300 mg, 2,56 mmoli) i czterotlenek osmu (4% roztwór w wodzie, 0,3 ml). Mieszaninę mieszano w ciemności przez 14 h. Osad usunięto przez filtrację przez warstwę celitu, rozcieńczono wodą (3 x), i ekstrahowano EtOAc. Warstwę EtOAc wysuszono nad Na2SO4 i zatężono pod próżnią. Oleistą pozostałość przeniesiono do dichlorometanu (5 ml) i mieszano nad NalO4 na silikażelu (3 g, 10% NalO4) przez 12 h. Silikażel usunięto przez filtrację i pozostałość odparowano i przeniesiono do absolutnego etanolu (5 ml). Roztwór ochłodzono w łaźni lodowej i dodano małymi porcjami borowodorek sodu (300 mg, 8 mmoli). Uzyskaną mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 4 h i następnie rozcieńczono EtOAc. Warstwę organiczną przemyto wodą (2 x 20 ml), solanką (20 ml) i wysuszono nad Na2SO4. Rozpuszczalnik odparowano i pozostałość oczyszczono przez chromatografię flash (SiO2, 2:1 heksany/EtOAc), otrzymując tytułowy związek (160 mg, 0,25 mmoli) w postaci białych płatków.

Etap B: 4-Amino-7-[3,5-bis-O-(2,4-dichlorofenylometylo)-2-C-hydroksymetylo-e-D-rybofuranozylo1-7H-pirolo[2,3-d1pirymidyna

Związek z etapu A (150 mg, 0,23 mmoli) rozpuszczono w minimalnej ilości 1,4-dioksanu (10 ml) i umieszczono w bombie ze stali nierdzewnej. Bombę ochłodzono do -78 °C i dodano ciekły amoniak. Bombę zamknięto i ogrzewano w temperaturze 90°C przez 24 h. Pozostawiono do odparowania amoniaku i pozostałość zatężono, otrzymując biały osad, którego użyto w następnym etapie bez dalszego oczyszczania.

Etap C: 4-Amino-7-(2-C-hydroksymetylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo [2,3-d1pirymidyna

Związek z etapu B (120 mg, 0,2 mmoli) rozpuszczono w mieszaninie 1:1 metanol/dichlorometan, dodano 10% Pd-C i zawiesinę mieszano w atmosferze H2 przez 12 h. Katalizator usunięto przez filtrację przez warstwę celitu i przemyto obficie metanolem. Połączone przesącze odparowano pod próżnią, i pozostałość oczyszczono przez szybką chromatografię (SiO2, 10% metanol w EtOAc, zawierający 0,1% trietyloaminy), otrzymując tytułowy związek (50 mg) w postaci białego proszku.

¹H NMR (CD3OD): δ 3,12 (d, IH, CH2'), 3,33 (d, 1H, CH2), 3,82 (m, 1H, H-5'), 3,99-4,1(m, 2H, H-4', H-5), 4,3 (d, 1H, H-3'), 6,2 (s, 1H, H-1'), 6,58 (d, 1H, H-5), 7,45 (d, 1H, H-6), 8,05 (s, 1H, H-2). LC-MS: Stwierdzono: 297,2 (M+H⁺); obliczono dla C12H16N4O5 + H⁺: 297,3.

PRZYKŁAD 24

4-Amino-7-(2-C-fluorometylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2.3-d1pirymidyna

Etap A: 4-Chloro-7-[3,5-bis-O-(2,4-dichlorofenylometvlo)-2-C-fluorometylo-e-D-rybofuranozylo1-7H-pirolo[2,3-cf1pirymidyna

Do roztworu związku z przykładu 24, Etap A (63 mg, 0,1 mmoli) w bezwodnym dichlorometanie (5 ml) pod argonem, dodano 4-dimetyloaminopirydynę (DMAP) (2 mg, 0,015 mmoli) i trietyloaminę (62 μ(

PL 207 405 B1

0,45 mmoli). Roztwór ochłodzono w łaźni lodowej i dodano chlorek p-toluenosulfonylu (30 mg, 0,15 mmoli). Reakcję mieszano w temperaturze pokojowej do następnego dnia, przemyto NaHCO3 (2 x 10 ml), wodą (10 ml), solanką (10 ml), wysuszono nad Na2SO4 i zatężono pod próżnią, otrzymując różowy osad. Osad rozpuszczono w bezwodnym THF (5 ml) i ochłodzono w łaźni lodowej. Dodano fluorek tetrabutylamoniowy (1M roztwór w THF, 1 ml, 1 mmoli) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 4 h. Rozpuszczalnik usunięto pod próżnią, pozostałość przeniesiono do dichlorometanu, i przemyto NaHCO3 (2 x 10 ml), wodą (10 ml) i solanką (10 ml). Warstwę dichlorometanową wysuszono nad bezwodnym Na2SO4, zatężono pod próżnią, i oczyszczono przez szybką chromatografię (SiO2, 2:1 heksany/EtOAc), otrzymując związek tytułowy (20 mg) w postaci białego osadu.

Etap B: 4-Amino-7-[3,5-bis-O-(2,4-dichlorofenvlometvlo)-2-C-fluorometvlo-β-D-rvbofuranozvlo1-ZH-pirolore^-cflpirymidyna

Związek z etapu A (18 mg, 0,03 mmoli) rozpuszczono w minimalnej ilości 1,4-dioksanu i umieszczono w bombie ze stali nierdzewnej. Bombę ochłodzono do -78 °C i dodano ciekły amoniak. Bombę zamknięto i ogrzewano w temperaturze 90°C przez 24 h. Pozostawiono do odparowania amoniaku i pozostałość zatężono, otrzymując biały osad, którego użyto w następnym etapie bez dalszego oczyszczania.

Etap C: 4-Amino-7-(2-C-fluorometvlo-β-D-rvbofuranozvlo)-7H-pirolo[2,3-d1pirvmidvna

Związek z etapu B (16 mg) rozpuszczono w mieszaninie 1:1 metanol/dichlorometan, dodano 10% Pd-C, i zawiesinę mieszano w atmosferze H2 przez 12 h. Katalizator usunięto przez filtrację przez warstwę celitu i przemyto obficie metanolem. Połączone przesącze odparowano pod próżnią i pozostałość oczyszczono przez szybką chromatografię (SiO2, 10% metanol w EtOAc zawierający 0,1% trietyloaminy), otrzymując tytułowy związek (8 mg) w postaci białego proszku.

¹H NMR (DMSO-c6): δ 3,6-3,7 (m, 1H, H-5, 3,8 - 4,3 (m, 5H, H-5, H-4', 5 H-3', CH2) 5,12 (t, 1H, 5'-OH), 5,35 (d, 1H, 3'-OH), 5,48 (s, 1H, 2'-OH), 6,21 (s, 1H, H-1'), 6,52 (d, 1H, H-5), 6,98 (br s, 2H, NH2), 7,44 (d, 1H, H-6), 8,02 (s, 1H, H-2).

¹⁹F NMR (DMSO-c6): δ -230,2 (t).

ES-MS: Stwierdzono: 299,1 (M+H⁺), obliczono dla C12H15FN4O4+ H⁺: 3 299,27.

PRZYKŁADY 25 i 26

4-Amino-7-(3-deoksv-2-C-metylo-β-D-rvbofuranozvlo)-7H-pirolo[2,3-<C1pirvmidvna i 4-amino-7-(3-deoksy^-C-metylo-p-D-arabinofuranozylo^H-pirolo^^-Clpiiymidyna

Etap A: 7-[2,5-Bis-O-(tert-butvlodimetvlosililo)-β-D-rvbofuranozvlo1-7H-pirolo[2.3-d1pirvmidvna

LT-JOd-bis-O-itęrt-butylodimetylosiilol-e-D-rybofuranozyol-TH-piroloJ^^-Cpirymidyna

Do mieszanego roztworu tubercydyny (5,0 g, 18,7 mmoli) w mieszaninie pirydyny (7,5 ml) i DMF (18,5 ml) dodano azotan srebra (6,36 g, 38,8 mmoli). Mieszaninę tę mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 h. Ochłodzono ją w łaźni lodowej i dodano THF (37,4 ml) i chlorek tert-butylodimetylosililu (5,6 g, 37 mmoli) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 h. Następnie mieszaninę przesączono przez warstwę celitu i przemyto THF. Przesącz i przemywki rozcieńczono eterem zawierającym małą ilość chloroformu. Warstwę organiczną przemyto kolejno wodorowęglanem sodu i wodą (3 x 50 ml), wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i zatężono. Pirydynę usunięto przez odparowanie razem z toluenem i pozostałość oczyszczono przez szybką chromatografię na silikażelu, stosując 5-7% MeOH w CH2CI2 jako eluent; wydajność 3,0 g.

Etap B: T-IZ^d-Bis-O-iieii-butylodimetylosililoj-e-D-rybofuranozylojJ-Z-fdi-iZ-metoksyfenylolfeny -lometylolamino^H-pirolo^^-dlpirymidyna i 7-i3,5-bis-O-(terf-butylodimetylosililo)-e-D- rybofuranozyloHddi-M-metoksyfenylofenylometylolamino^H-pirolore^-dlpirymidyna

Do roztworu mieszaniny związków z etapu A (3,0 g, 6,0 mmoli) w bezwodnej pirydynie (30 ml) dodano chlorek 4,4'-dimetoksytritylu (2,8 g, 8,2 mmoli) i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej do następnego dnia. Następnie mieszaninę roztarto z wodną pirydyną i ekstrahowano etePL 207 405 B1 rem. Warstwę organiczną przemyto wodą, wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i zatężono, otrzymując żółtą piankę (5,6 g). Pozostałość oczyszczono przez chromatografię flash na silikażelu, stosując 20-25% EtOAc w heksanach jako eluent. Odpowiednie frakcje zebrano i zatężono, otrzymując 2',5'-bis-O-(tert-butylodimetylosililo)- i 3',5'-bis-O-(tert-butylodimetylosililo) zabezpieczone nukleozydy w postaci bezbarwnej pianki (odpowiednio 2,2 g i 1,0 g).

Etap C: 7-[2,5-Bis-O-(fe/Y-butylodimetylosililo]-3-O-tosylo-e-D-rybofuranozylo)]-4-[di-(4-metoksy-fenylo)fenylometylo]amino-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna

Do ochłodzonego lodem roztworu 2',5'-bis-O-((e/Y-butylodimetylosililo)-zabezpieczonego nukleozydu z etapu B (2,0 g, 2,5 mmoli) w pirydynie (22 ml) dodano chlorek p-toluenosulfonylu (1,9 g, 9,8 mmoli). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez cztery dni. Następnie roztarto ją z wodną pirydyną (50%, 10 ml) i ekstrahowano eterem (3 x 50 ml), zawierającym małą ilość CH2CI2 (10 ml). Warstwę organiczną przemyto wodorowęglanem sodu i wodą (3 x 30 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad bezwodnym Na2SO4 i zatężono. Pirydynę usunięto przez odparowanie razem z toluenem (3 x 25 ml). Pozostały olej przesączono przez warstwę silikażelu, stosując heksan:octan etylu (70:30) jako eluent; wydajność 1,4 g.

Etap D: 4-[di-(4-metoksyfenylo)fenylometylo]amino-7-[3-O-tosylo-3-D-rybofuranozylo-7H-pirolo-[2,3-ó]pirymidyna

Roztwór związku z etapu C (1,0 g, 1,1 mmoli) i THF (10 ml) mieszano z fluorkiem tetrabutylamoniowym (1M roztwór w THF, 2,5 ml) przez 0,5h. Mieszaninę ochłodzono i rozcieńczono eterem (50 ml). Roztwór przemyto wodą (3 x 50 ml), wysuszono nad bezwodnym Na2SO4, i zatężono, otrzymując olej. Pozostałość oczyszczono przez przepuszczenie przez warstwę silikażelu, stosując heksan: octan etylu (1:1) jako eluent; wydajność 780 mg.

Etap E: 4-Amino-7-(3-deoksy-2-C-metylo-3-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna i 4-amino-7-(3-deoksy-2-C-metylo-3-D-arabinofuranozylo)-7H-pirolo-[2,3-d]pirymidyna

Roztwór CH₃Mgl (3,0 M roztwór w eterze, 3,0 ml) w bezwodnym toluenie (3,75 ml) ochłodzono w łaźni lodowej. Dodano do niego roztwór związku z etapu D (500 mg, 0,8 mmoli) w bezwodnym toluenie (3,7 ml). Uzyskaną mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 3,5 h. Ochłodzono ją i zadano wodnym roztworem NH4CI i ekstrahowano eterem (50 ml, zawierający 10 ml CH2CI2). Warstwę organiczną oddzielono i przemyto solanką (2 x 30 ml) i wodą (2 x 25 ml), wysuszono nad bezwodnym Na2SO4 i zatężono, otrzymując olej, który oczyszczono przez chromatografię flash na silikażelu, stosując 4% MeOH w CH₂CI₂, otrzymując związek 2-C-«-metylowy (149 mg) i związek 2-C-p-metylowy (34 mg). Pochodne te oddzielnie traktowano 80% kwasem octowym i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 2,5 h. Kwas octowy usunięto przez kilkakrotne odparowywanie razem z etanolem i toluenem. Pozostałość rozdzielono między chloroform i wodę. Warstwę wodną przemyto chloroformem i zatężono. Pozostałość po odparowaniu oczyszczono na silikażelu, stosując 5-10% MeOH w CH2CI2 jako eluent, otrzymując żądane związki w postaci białych osadów.

4-Amino-7-(3-deoksy-2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-ó]pirymidyna (9,0 mg):

¹H NMR (DMSO-ó₆): δ 0,74 (s, 3H, CH₃), 1,77 (dd, 1H, H-3'), 2,08 (t, 1H, H-3), 3,59 (m, 1H, H-5'), 3,73 (m, 1H, H-5), 4,15 (m, 1H, H-4'), 5,02 (t, 1H, OH-5'), 5,33 (s, 1H, OH-2'), 6,00 (s, 1H, H-1'), 6,54 (d, 1H, H-7), 6,95 (br s, 2H, NH2), 7,47 (d, 1H, H-8), 8,00 (s, 1H, H-2); ES-MS: 263,1 [M-H].

4-Amino-7-(3-deoksy-2-C-metylo-3-D-arabinofuranozylo]-7H-pirolo[2,3-ó]pirymidyna (15 mg):

¹H NMR (DMSO-ó₆): δ 1,23 (s, 3H, CH₃), 2,08 (ddd, 2H, H-3' i 3), 3,57 (m, 2H, H-5' i 5), 4,06 (m, 1H, H-4), 5,10 (s, 1H, OH-2'), 5,24 (t, 1H, OH-5'), 6,01 (s, 1H, H-1'), 6,49 (d, 1H, H-7), 6,89 (br s, 2H, NH2), 7,35 (d, 1H, H-8), 8,01 (s, 1H, H-2).

ES-MS: 265,2[M+H].

PRZYKŁAD 27

4-Amino-7-(2,4-C-dimetylo-3-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-ó]pirymidyna

PL 207 405 B1

Etap A: 5-Deoksy-1,2-0-izopropylideno-D-ksylofuranoza

1,2-0-Izopropylideno-D-ksylofuranozę (38,4 g, 0,2 moli), 4-dimetyloaminopirydynę (5 g), trietyloaminę (55,7 ml, 0,4 moli) rozpuszczono w dichlorometanie (300 ml). Dodano chlorek p-toluenosulfonylu (38,13 g, 0,2 moli) i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 h. Mieszaninę reakcyjną wylano następnie do nasyconego wodnego roztworu wodorowęglanu sodu (500 ml) i dwie warstwy rozdzielono. Warstwę organiczną przemyto wodnym roztworem kwasu cytrynowego (20%, 200 ml), wysuszono (Na2SO4) i odparowano, otrzymując osad (70,0 g). Osad rozpuszczono w suchym THF (300 ml) i dodano porcjami w ciągu 30 min. LiAlH4 (16,0 g, 0,42 moli). Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 15 h. Wkroplono w ciągu 30 minut octan etylu (100 ml) i mieszaninę przesączono przez złoże silikażelu. Przesącz zatężono i uzyskany olej chromatografowano na silikażelu (EtOAc/heksan 1/4), otrzymując produkt w postaci osadu (32,5 g).

Etap B: 3,5-Bis-0-(2,4-dichlorofenylometylo]-1-0-metylo-4-metvlo-a-D-rybofuranoza

Tlenek chromu (50 g, 0,5 moli), bezwodnik octowy (50 ml, 0,53 moli) i pirydynę (100 ml, 1,24 moli) dodano do dichlorometanu (1 l) w łaźni lodowo-wodnej i mieszaninę mieszano przez 15 minut. Dodano 5-deoksy-1,2-0-izopropylideno-D-ksylofuranozę (32 g, 0,18 moli) w dichlorometanie (200 ml), i mieszaninę mieszano w tej samej temperaturze przez 30 minut. Roztwór reakcyjny rozcieńczono octanem etylu (1 l) i przesączono przez złoże silikażelu. Przesącz zatężono, otrzymując żółty olej. Olej rozpuszczono w 1,4-dioksanie (1 l) i formaldehydzie (37%, 200 ml). Roztwór ochłodzono do 0°C i dodano stały KOH (50 g). Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej do następnego dnia i następnie ekstrahowano octanem etylu (6 x 200 ml). Po zatężeniu, pozostałość chromatografowano na silikażelu (EtOAc), otrzymując produkt w postaci oleju (1,5 g). Olej rozpuszczono w 1-metylo-2-pirolidynonie (20 ml) i dodano chlorek 2,4-dichlorofenylometylu (4 g, 20,5 mmoli) i NaH (60%, 0,8 g). Mieszaninę mieszano do następnego dnia i rozcieńczono toluenem (100 ml). Mieszaninę następnie przemyto nasyconym wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (3 x 50 ml), wysuszono (Na2SO4) i odparowano. Pozostałość rozpuszczono w metanolu (50 ml) i dodano HCl w dioksanie (4 M, 2 ml). Roztwór mieszano do następnego dnia i odparowano. Pozostałość chromatografowano na silikażelu (EtOAc/heksan: 1/4), otrzymując żądany produkt w postaci oleju (2,01 g).

Etap C: 3,5-Bis-0-(2,4-dichilorofenylometylo)-2,4-di-C-metylo-1-0-metylo-a-D-rybofuranoza Produkt (2,0 g, 4,0 mmoli) z etapu B i perjodinan Dess-Martin'a (2,0 g) w dichlorometanie (30 ml) mieszano do następnego dnia w temperaturze pokojowej i następnie zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość macerowano z eterem (50 ml) i przesączono. Przesącz przemyto roztworem Na2S2O3-5H2O (2,5 g) w nasyconym wodnym roztworze wodorowęglanu sodu (50 ml), wysuszono (MgSO4), przesączono i odparowano. Pozostałość rozpuszczono w bezwodnym Et2O (20 ml) i wkroplono do roztworu MeMgBr w Et2O (3 M, 10 ml) w temperaturze -78°C. Mieszaninę reakcyjną pozostawiono do ogrzania do -30°C i mieszano w temperaturze -30°C do -15°C przez 5 h, następnie wylano do nasyconego wodnego roztworu chlorku amonu (50 ml). Dwie warstwy rozdzielono i warstwę organiczną wysuszono (MgSO4), przesączono i zatężono. Pozostałość chromatografowano na silikażelu (EtOAc/heksan: 1/9), otrzymując związek tytułowy w postaci syropu (1,40 g).

Etap D: 4-Chloro-7-[3,5-bis-0-(2,4-dichlorofenylometylo)-2,4-di-C-metylo-e-D-rybofuranozylo]-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna

Do związku z etapu C (0,70 g, 1,3 mmoli) dodano HBr (5,7 M roztwór w kwasie octowym, 2 ml). Uzyskany roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 h, odparowano pod próżnią i odparowano razem z bezwodnym toluenem (3 x 10 ml). 4-Chloro-1H-pirolo[2,3-d]pirymidynę (0,5 g, 3,3 mmoli) i sproszkowany KOH (85%, 150 mg, 2,3 mmoli) mieszano w 1-metylo-2-pirolidynonie (5 ml) przez 30 minut i mieszaninę odparowano z toluenem (10 ml). Uzyskany roztwór wylano do powyższej reszty bromocukrowej i mieszaninę mieszano do następnego dnia. Mieszaninę rozcieńczono toluenem (50 ml), przemyto wodą (3 x 50 ml) i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość chromatografowano na silikażelu, eluując mieszaniną EtOAc/heksan (15/85), otrzymując osad (270 mg).

Etap E: 4-Amino-7-(2,4-C-dimetylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna

Związek z etapu D (270 mg) rozpuszczono w dioksanie (2 ml) w autoklawie ze stali nierdzewnej i dodano ciekły amoniak (20 g). Mieszaninę ogrzewano w temperaturze 100°C przez 15 h, następnie ochłodzono i odparowano. Pozostałość chromatografowano na silikażelu (EtOAc), otrzymując osad (200 mg). Osad (150 mg) i Pd/C (10%, 150 mg) w metanolu (20 ml) wytrząsano w atmosferze H2 0,207 MPa (30 psi) przez 3 h, przesączono i odparowano. Pozostałość chromatografowano na silikażelu (MeOH/CH2CI2: 1 /9), otrzymując żądany produkt w postaci osadu (35 mg).

PL 207 405 B1 ¹H NMR (DMSO-d6): δ 0165 (s1 3H)1 1118 (s1 3H)1 3143 (m1 2H)1 4106 (d1 1H1 J613 Hz)1 4187 (s1 1H)1 5126 (br1 1H)1 5108 (d1 1H1 J613 Hz)1 5125 (t1 1H1 J 310 Hz)1 6117 (s1 1H)1 6154 (d1 1H1 J315 Hz)1 6197 (s1 br1 2H)1 7154 (d1 1H1 J 314 Hz)1 8102 (s1 1H).

¹³C NMR (DMSO-d6): δ 181191 211321 651381 731001 791331 841801 901661 991091 1021411 1211901 1491581 1511481 157138.

LC-MS: Stwierdzono: 29511 (M+H⁺); obliczono dla C13H18N4O4+H⁺: 29511.

PRZYKŁAD 28

4-Amino-7-(3-deoksy-3-fluoro-2-C-metylo-β-D-rybofuranozylol-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna

Etap A: 3-Deoksy-3-fluoro-1-0-metylo-5-0-toluoilo-a-D-rybofuranoza

1,2-O-Izopropylideno-D-ksylofuranozę (9,0 g, 50 mmoli) i chlorek p-toluoilu (7,0 ml, 50 mmoli) w pirydynie (50 ml) mieszano przez 30 minut. Dodano wodę (10 ml) i mieszaninę zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w toluenie (500 ml) i roztwór przemyto wodą (200 ml) i nasyconym wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (200 ml). Dwie warstwy rozdzielono i warstwę organiczną odparowano. Pozostałość rozpuszczono w metanolu (100 ml) i dodano HCl w dioksanie (4M, 10 ml). Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej do następnego dnia i następnie odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskany olej chromatografowano na silikażelu (EtOAc/heksan: 1/1), otrzymując olej (10,1 g). Olej rozpuszczono w dichlorometanie (100 ml) i dodano trifluorek dietyloaminosiarki (DAST) (5,7 ml). Mieszaninę mieszano do następnego dnia i następnie wylano do nasyconego wodnego roztworu wodorowęglanu sodu (100 ml). Mieszaninę ekstrahowano toluenem (2 x 50 ml) i połączone warstwy organiczne zatężono. Pozostałość chromatografowano na silikażelu (EtOAc/heksan: 15/85), otrzymując związek tytułowy w postaci oleju (1,50 g).

Etap B: 3-Deoksv-3-fluoro-2-C-metylo-1-0-metylo-5-0-toluoilo-a-D-rybofuranoza

Produkt z etapu A (1,0 g, 3,5 mmoli) i perjodynan Dess-Martin'a (2,5 g) w dichlorometanie (20 ml) mieszano do następnego dnia w temperaturze pokojowej i następnie zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość macerowano z eterem dietylowym (50 ml) i przesączono. Przesącz przemyto roztworem Na₂S₂O₃^5H₂O (12,5 g) w nasyconym wodnym roztworze wodorowęglanu sodu (100 ml), wysuszono (MgSO4), przesączono i odparowano. Pozostałość rozpuszczono w bezwodnym THF (50 ml). Dodano w temperaturze -78°C TiCl4 (3 ml) i bromek metylomagnezowy w eterze etylowym (3M, 10 ml) i mieszaninę mieszano w temperaturze -50 do -30°C przez 2 h. Mieszaninę wylano do nasyconego wodnego roztworu wodorowęglanu sodu (100 ml) i przesączono przez celit. Przesącz ekstrahowano toluenem (100 ml) i odparowano. Pozostałość chromatografowano na silikażelu (EtOAc/heksan: 15/85), otrzymując związek tytułowy w postaci oleju (150 mg).

Etap C: 4zAmjnozZz(3deoksy3-fluoro-2-C-metylo-e-D-rybgfuranozylo)_z7Hj_:piroJoI2₁3-d]£irymL· dyna

Produktu z etapu B (150 mg, 0,5 mmoli) rozpuszczono w HBr (30%) w kwasie octowym (2 ml). Po jednej godzinie mieszaninę odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem i odparowano z toluenem (10 ml). 4-Chloro-1H-pirolo[2,3-d]pirymidynę (0,5 g, 3,3 mmoli) i sproszkowany KOH (85%, 150 mg, 2,3 mmoli) mieszano w DMF (3 ml) przez 30 minut i mieszaninę odparowano z toluenem (2 ml). Uzyskany roztwór wylano do powyższego bromocukru i mieszaninę mieszano do następnego dnia. Mieszaninę rozcieńczono toluenem (50 ml), przemyto wodą (3 x 50 ml) i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość chromatografowano na silikażelu (EtOAc/heksan: 15/85), otrzymując olej (60 mg). Olej rozpuszczono w dioksanie (2 ml) w autoklawie ze stali nierdzewnej i dodano ciekły amoniak (20 g). Mieszaninę ogrzewano w temperaturze 85°C przez 18 h, następnie ochłodzono i odparowano. Pozostałość chromatografowano na silikażelu (metanol/dichlorometan: 1/9), otrzymując związek tytułowy w postaci osadu (29 mg).

PL 207 405 B1 ¹H NMR (DMSO-d6): δ 0,81 (s, 3H), 3,75 (m, 2H), 4,16 (m, 1H), 5,09 (dd, 1H, J53,2, 7,8 Hz), 5,26 (br, 1H), 5,77 (s, 1H), 6,15 (d, 1H, J2,9 Hz), 6,59 5 (d, 1H, J3,4 Hz), 7,02 (s br, 2H), 7,39 (d, 1H, J3,4 Hz), 8,06 (s, 1H).

¹³C NMR (DMSO-d6): 19,40, 59,56, 77,24, 79,29, 90,15, 91,92, 99,88, 102,39, 121,17, 149,80, 151,77, 157,47.

19F NMR (DMSO-d6): δ 14,66 (m).

ES-MS: Stwierdzono: 283,1 (M+H⁺); obliczono dla C12H15FN4O3+H+: 283,1.

PRZYKŁAD 29

4-Amino-7-(2-C,2-0-dimetvlo-e-D-rvbofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-c/lpirvmidvna

Etap A: 4-chloro-7-|3,5-bis-O-(2,4-dichlorofenvlometylo]-2-C_ł2-O-dimetvlo-β-D-rvbofuranozvlo]^H-pirolo^^-dlpirymidyna

Do ochłodzonego (0°C) roztworu związku z przykładu 2, Etap D (618 mg, 1,0 mmoli) w THF (8 ml) dodano jodek metylu (709 mg, 5,0 mmoli) i NaH (60% w oleju mineralnym) (44 mg, 1,1 mmoli). Uzyskaną mieszaninę mieszano do następnego dnia w temperaturze pokojowej i następnie wylano do mieszanej mieszaniny nasyconego wodnego roztworu chlorku amonu (50 ml) i dichlorometanu (50 ml). Warstwę organiczną przemyto wodą (50 ml), wysuszono (MgSO4) i odparowano pod próżnią. Uzyskany surowy produkt oczyszczono na silikażelu, stosując mieszaninę octan etylu/heksan jako eluent. Frakcje zawierające produkt połączono i odparowano pod próżnią, otrzymując żądany produkt (735 mg) w postaci bezbarwnej pianki.

Etap B: 4-amino-7-|3,5-bis-O-(2,4-dichlorofenvlometvlo)-2-C,2-O-dimetvlo-β-D-rvbofuranozvlo]yB-pirolo^^-dlpirymidyna

Do związku z etapu A (735 mg, 1,16 mmoli) dodano metanolowy roztwór amoniaku (nasycony w temperaturze 0°C) (20 ml). Mieszaninę ogrzewano w autoklawie ze stali nierdzewnej w temperaturze 80°C do następnego dnia, następnie ochłodzono i zawartość odparowano pod próżnią. Surową mieszaninę oczyszczono na silikażelu, stosując mieszaninę octan etylu/heksan jako eluent. Frakcje zawierające produkt połączono i odparowano pod próżnią, otrzymując żądany produkt (504 mg) w postaci bezbarwnej pianki.

Etap C: 4-amino-7-(2-C,2-O-dimetvlo-β-D-rvbofuranozvlo)-7H-pirolo[2,3-d1pirvmidvna

Mieszaninę produktu z etapu C (64 mg, 0,1 mmoli), MeOH (5 ml), Et3N (0,2 ml) i 10% Pd/C (61 mg) uwodorniano w aparacie Parra pod ciśnieniem 50 psi w temperaturze pokojowej do następnego dnia. Mieszaninę przesączono przez celit, odparowano pod próżnią i przesączono przez warstwę silikażelu, stosując 2% metanol w dichlorometanie jako eluent. Żądany produkt zebrano i odparowano pod próżnią. Związek ponownie rozpuszczono w metanolu (10 ml) i dodano 10% Pd/C (61 mg). Mieszaninę uwodorniano w aparacie Parra pod ciśnieniem 0,38 MPa (55 psi) w temperaturze pokojowej przez 2 tygodnie. Mieszaninę przesączono przez celit, odparowano pod próżnią i oczyszczono na silikażelu, stosując 10% metanol w dichlorometanie jako eluent. Frakcje zawierające produkt połączono i odparowano pod próżnią, otrzymując żądany produkt (110 mg) w postaci bezbarwnej pianki.

¹H NMR (DMSO-d6): δ 0,68 (s, 3H), 3,40 (s, 3H), 3,52-3,99 (nakładający się m, 4H), 4,92 (d, 1H), 5,07 (t, 1H), 6,26 (s, 1H), 6,55 (d, 1H), 7,00 (s br, 2H), 7,46 (d, 1H), 8,05 (s, 1H).

LC-MS: Stwierdzono: 293,1 (M-H⁺); obliczono dla C12H16N4O4-H⁺: 293,12.

PRZYKŁAD 30

4-MetylQamjnQ-7-(2-CmetylQ-g-D-rybQfuranQzYlQ)-7H-pirQlo|23-ę[1pijymidYna

PL 207 405 B1

NHMe

ΗΟ\Ό

ch₃

HO OH

Związek z etapu E z przykładu 2 (200 mg, 0,67 mmoli) dodano do metyloaminy (5 ml skroplone w małym autoklawie ze stali nierdzewnej) i ogrzewano w temperaturze 85°C przez 48 h, następnie ochłodzono i odparowano pod próżnią. Surową mieszaninę oczyszczono na silikażelu z etanolem jako eluentem, otrzymując tytułowy związek, który po obróbce MeCN oddzielono w postaci amorficznego ciała stałego. Amorficzny osad rozpuszczono w wodzie i liofilizowano, otrzymując bezbarwny proszek (144 mg).

¹H NMR (DMSO-d6): δ 0,63 (s, 3H, CH3), 3,32 (s, 3H, N CH3), 3,58-3,67 (m, 1H, H-5'), 3,79-3,39 (m, 3H, H-5, H-4', H-3'), 5,03 (s, 1H, 2'-OH), 5,04-5,11 (1H,3'-OH, 1H, 5'-OH), 6,14 (s, 1H, H-1'), 6,58 (d, 1H, J5,6 = 3,6 Hz, H-5), 7,46 (d, 1H, H-6), 7,70 (br s, 1H, NH), 8,14 (s, 1H, H-2).

LC-MS: Stwierdzono: 295,1 (M-H⁺); obliczono dla C13H18N4O4+H⁺: 294,3.

PRZYKŁAD 31

4-Dimetyloamino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-cflpirymidyna

NMe₂

HO OH

Związek z etapu E z przykładu 2 (200 mg, 0,57 mmoli) dodano do metyloaminy (5 ml skroplone w małym autoklawie ze stali nierdzewnej) i ogrzewano w temperaturze 85°C przez 48 h, następnie ochłodzono i odparowano pod próżnią. Surową mieszaninę oczyszczono na silikażelu z etanolem jako eluentem, otrzymując tytułowy związek, który po obróbce MeCN oddzielono w postaci amorficznego ciała stałego. Amorficzny osad rozpuszczono w wodzie i liofilizowano, otrzymując bezbarwny proszek (164 mg).

¹H NMR (DMSO-d6): δ 0,64 (s, 3H, CH3), 3,29 (s, 3H, N CH3), 3,32 (s, 3H, N CH3), 3,50-3,55 (m, 1H, H-5'), 3,77-3,97 (m, 3H, H-5, H-4', H-3'), 5,04 (s, 1H, 2'-OH), 5,05-5,11 (1H, 3'-OH, 1H, 5'-OH), 5,21 (s, 1H, H-1'), 6,69 (d, 1H, J5,6 = 3,6 Hz, H-5), 7,55 (d, 1H, H-5), 8,13 (s, 1H, H-2).

LC-MS: Stwierdzono: 309,3 (M-H⁺); obliczono dla C14H20N4O4+H⁺: 308,33.

PRZYKŁAD 32

4-Cyklopropyloamino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-cflpirymidyna

HO OH

PL 207 405 B1

Związek z etapu E z przykładu 2 (200 mg, 0,67 mmoli) dodano do cyklopropyloaminy (5 ml skroplone w małym autoklawie ze stali nierdzewnej) i ogrzewano w temperaturze 85°C przez 48 h, następnie ochłodzono i odparowano pod próżnią. Surową mieszaninę oczyszczono na silikażelu z etanolem jako eluentem, otrzymując tytułowy związek, który po obróbce MeCN oddzielono w postaci amorficznego ciała stałego. Amorficzny osad rozpuszczono w wodzie i liofilizowano, otrzymując bezbarwny proszek (148 mg).

¹H NMR (DMSO-d6): δ 0,51-0,58 (m, 2H), 0,64 (s, 3H, CH3), 0,74- 0,076 (m, 2H), 3,62-3,67 (m, 1H, H-5'), 3,79-3,82 (m, 3H, H-5), 3,92-3,96 (m, H-4', H-3'), 5,03 (s, 1H, 2'-OH), 5,05-5,10 (1H, 3'-OH, 1H, 5'-OH), 6,15 (s, 1H, H-1'), 7,48 (d, 1H, J5,6 = 3,6 Hz, H-5), 7,59 (d, 1H, H-6), 8,13 (s, 1H, H-2).

LC-MS: Stwierdzono: 321,1 (M-H⁺); obliczono dla C15H20N4O4+H⁺: 320,3.

PRZYKŁAD 33

4-Amino-7-(3-C-metylo-e-D-ksylofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna

Me OH

Etap A: 7-[2,5-Bis-0-(fe/f-butylodimetylosililo)-e-D-rybofuranozylo)]-4-[(4-metoksyfenylo)difenylometylo]amino-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna i 7-[3,5-bis-O-(te/Y-butylodimetylosililo)-e-D-rybofuranozylo]-4-[(4-metoksyfenylo)difenylometylo]amino-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna

Do roztworu mieszaniny związków z etapu A z przykładów 26 i 27 (0,32 g, 0,65 mmoli) w bezwodnej pirydynie (6 ml) dodano chlorek monometoksytritylu (0,30 g, 0,98 mmoli) i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej do następnego dnia. Mieszaninę następnie zatężono i pozostałość rozdzielono między CH2CI2 (70 ml) i wodę (20 ml). Warstwę organiczną przemyto wodą i solanką, wysuszono (Na2SO4) i zatężono. Pozostałość oczyszczono na kolumnie z silikażelem, stosując 5-13% EtOAc w heksanach jako eluent. Odpowiednie frakcje zebrano i zatężono, otrzymując 2',5'-bis-0-(te/t-butylodimetylosililo)- i 3',5'-bis-O-(te/t-butylodimetylosililo)-zabezpieczone nukleozydy w postaci bezbarwnych pianek (odpowiednio 343 mg i 84 mg).

Etap B: 7-[2,5-Bis-0-(fe/Y-butylodimetylosililo)-e-D-e/'yfrp-pentofuranoz-3-ulozylo]-4-[(4-metoksyfenylo)difenylometylo]amino-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna

Do dobrze mieszanej zawiesiny tritlenku chromu (91 mg, 0,91 mmoli) w CH2CI2 (4 ml) w temperaturze 0°C dodano pirydynę (147 gl, 1,82 mmoli) i następnie bezwodnik octowy (86 gl, 0,91 mmoli). Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 0,5 h. Następnie dodano 2',5'-bis-0-(te/tbutylodimetylosililo) zabezpieczony nukleozyd z etapu A (343 mg 0,45 mmoli) w CH2CI2 (2,5 ml) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 h. Mieszaninę następnie wylano do lodowatego EtOAc (10 ml) i przesączono przez krótką kolumnę z silikażelem, stosując EtOAc jako eluent. Przesącz odparowano i pozostałość oczyszczono na kolumnie z silikażelem z heksanami i mieszaniną heksany/EtOAc (7/1) jako eluentem, otrzymując tytułowy związek (180 mg).

Etap C: 7-[2,5-Bis-0-(te/Y-butylodimetylosililo)-3-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-4-[(4-metoksyfenylo)difenylometylo]amino-7H-pirolo[2,3-d]pirvmidyna i 7-[2,5-bis-0-(te/Y-butylodimetylosililo)-Cmetylo-e-D-ksylofuranozylo)-4-[(4-metoksyfenylo)difenylometylo]amino-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna

Do mieszaniny MeMgBr (3,0 M roztwór w eterze; 0,17 ml, 0,5 mmoli) w bezwodnym heksanie (1,5 ml) w temperaturze pokojowej wkroplono roztwór związku z etapu B (78 mg, 0,1 mmoli) w bezwodnym heksanie (0,5 ml). Mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 h, po czym mieszaninę reakcyjną wylano do wody z lodem (10 ml) i rozcieńczono EtOAc (20 ml), następnie przesączono przez celit, który następnie starannie przemyto EtOAc. Warstwy rozdzielono i warstwę organiczną przemyto solanką, wysuszono (Na2SO4) i zatężono. Pozostałość oczyszczono na kolumnie z silikażelem, stosując 8 do 25% EtOAc w heksanach jako eluent, otrzymując izomer 3-C-metyloksylo- (60 mg) i izomer 3-C-metylorybo- (20 mg).

Etap D: 4-Amino-7-(3-C-metylo-β-D-ksylofuranozylo]-7H-pirolo[2,3-d]pirvmidyna

PL 207 405 B1

Do lodowato zimnego roztworu izomeru 3-C-metylo-ksylo z etapu C (60 mg, 0,08 mmoli) w THF (2 ml) dodano TBAF (1M w THF; 0,32 ml, 0,32 mmoli). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 5 h, następnie rozcieńczono CH2CI2 (50 ml), przemyto wodą (3x15 ml), wysuszono, i odparowano. Pozostałość rozpuszczono w dioksanie (0,3 ml) i dodano 80% kwas octowy (3 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 dzień i następnie odparowano. Pozostałość odparowano razem z dioksanem, przeniesiono do wody (50 ml) i przemyto CH2CI2 (2 x 10 ml). Warstwę wodną zatężono i następnie liofilizowano. Pozostałość oczyszczono na kolumnie z silikażelem z mieszaniną CH2Cl2/MeOH (20/1 i 10/1) jako eluentem, otrzymując po liofilizacji tytułowy związek w postaci białego puszystego osadu (10 mg).

¹H NMR (CD3CN): δ 1,28 (s, 3H, CH3), 3,56 (br s, 1H, OH), 3,78 (m, 3H, H-4', H-5', H-5), 4,10 (br s, 1H, OH), 4,44 (d, 1H, J2,1' = 3,9 Hz, H-2'), 5,58 (d, 1H, H-1'), 5,85 (br s, 2H, NH2), 6,15 (br s, 1H, OH), 6,48 (d, 1H, J5,6 = 3,7 Hz, H-5), 7,23 (d, 1H, H-6), 8,11 (s, 1H, H-2). ES-MS: 281 [MH1⁺

PRZYKŁAD 34

4-Amino-7-(3-C-metylo-e-D-rybofuranozylo1-7H-pirolo[2,3-d1pirymidyna

HÓ

Izomer rybo- (20 mg) z etapu C z przykładu 31 odbezpieczono, stosując procedurę opisaną w etapie D z przykładu 31, otrzymując związek tytułowy (4 mg).

¹H NMR (CD3CN): δ 1,43 (s, 3H, CH3), 3,28 (br s, 1H, OH), 3,58 (m, 2H, H-5', H-5), 3,99 (m, 1H, H-4'), 4,10 (br s, 1H, OH), 4,62 (d, 1H, J2'1' = 8,1 Hz, H-2'), 5,69 (d, 1H, H-1'), 5,88 (br s, 3H, OH, NH2), 6,45 (br s, 1H, OH), 6,51 (d, 1H, J5,6 = 3,7 Hz, H-5), 7,19 (d, 1H, H-6), 8,12 (s, 1H, H-2).

ES-MS: 281 [MH1⁺

PRZYKŁAD 35

2,4-Diamino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-cf1pirymidyna

Mieszaninę produktu z etapu B z przykładu 4 (24 mg) w wodnym roztworze amoniaku (30%, 10 ml) ogrzewano w autoklawie ze stali nierdzewnej w temperaturze 100°C do następnego dnia, następnie ochłodzono i odparowano. Pozostałość oczyszczono na kolumnie z silikażelem z mieszaniną CH2Cl2/MeOH (10/1 15/1) jako eluentem, otrzymując związek tytułowy (15 mg).

¹H NMR (DMSO-d6): δ 0,68 (s, 3H, CH3), 3,48-3,58 (m 1H, H-5'), 3,68-3,73 (m, 2H, H-5, H-4'), 3,84 (m, 1H, H-3'), 4,72 (s, 1H, 2'-OH), 4,97-5,03 (m, 2H, 3'-OH, 5'-OH), 5,45 (br s, 2H, NH2), 6,00 (s, 1H, H-1', 6,28 (d, 1H, J = 3,7 Hz, H-5), 6,44 (br s, 2H, NH2) 6,92 (d, 1H J= 3,7 Hz, H-6).

ES MS: 294,1 (M-H⁺).

PRZYKŁAD 36

4-Amino-2-fluoro-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo-7H-pirolo[2,3-d1pirymidyna

PL 207 405 B1

Do roztworu HF/pirydyna (70%, 2 ml) rozcieńczonego pirydyną (1 ml) w temperaturze -30°C dodano związek z przykładu 36 (60 mg, 0,2 mmoli) w 0,5 ml pirydyny, a następnie azotyn tert-butylu (36 gl, 0,3 mmoli). Kontynuowano mieszanie w temperaturze -25°C przez 5 minut. Następnie roztwór wylano do wody z lodem (5 ml), zobojętniono 2N wodnym roztworem NaOH, i odparowano do sucha. Pozostałość oczyszczono na kolumnie z silikażelem z mieszaniną CH2Cl2/MeOH (20/ 1 i 10/1) jako eluentem, otrzymując związek tytułowy.

PRZYKŁAD 37

4-Amino-5-fluoro-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna

Etap A: 4-Acetyloamino-7-(2,3,5-tri-0-acetylo-2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo [2,3-d]pirymidyna

Do roztworu związku z etapu F z przykładu 2 (280 mg, 1,00 mmoli) w pirydynie dodano bezwodnik octowy (613 mg, 6,0 mmoli). Uzyskany roztwór mieszano do następnego dnia w temperaturze otoczenia, odparowano pod próżnią i uzyskaną surową mieszaninę oczyszczono na silikażelu, stosując mieszaninę octan etylu/heksan jako eluent. Frakcje zawierające żądany produkt połączono i odparowano pod próżnią, otrzymując żądany produkt.

Etap B: 4-Acetyloamino-5-bromo-7-(2,3,5-tri-O-acetylo-2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna

Do ochłodzonego (0°C) roztworu związku z etapu A (460 mg, 1,00 mmoli) w DMF dodano N-bromosukcynoimid (178 mg, 1,0 mmoli) w DMF. Uzyskany roztwór mieszano w temperaturze 0°C przez 30 minut, następnie w temperaturze pokojowej przez jeszcze 30 minut. Reakcje wygaszono przez dodanie metanolu i odparowano pod próżnią. Uzyskaną surową mieszaninę oczyszczono na silikażelu, stosując mieszaninę octan etylu/heksan jako eluent. Frakcje zawierające żądany produkt połączono i odparowano pod próżnią, otrzymując żądany produkt.

Etap C: 4-Amino-5-1^uoro-7-(2-C-metylo-β-D-rybofuranozylol-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna

Do ochłodzonego (-78°C) roztworu związku z etapu B (529 mg, 1,00 mmoli) w THF dodano butylolit (2M w heksanie) (0,5 ml, 1,00 mmoli). Uzyskany roztwór mieszano w temperaturze -78°C przez 30 min. i następnie przerwano reakcję przez dodanie N-fluorobenzenosulfonimidu (315 mg, 1,00 mmoli) w THF. Uzyskany roztwór pozostawiono do bardzo powolnego dojścia do temperatury otoczenia i następnie wylano do mieszanej mieszaniny nasyconego wodnego roztworu chlorku amonu i dichlorometanu. Fazę organiczną odparowano pod próżnią i traktowano wodorotlenkiem amonu w temperaturze 55°C w zamkniętym pojemniku do następnego dnia. Uzyskaną surową mieszaninę oczyszczono na silikażelu, stosując mieszaninę dichlorometan/metanol jako eluent. Frakcje zawierające żądany produkt połączono i odparowano pod próżnią, otrzymując żądany produkt.

PL 207 405 B1

TESTY BIOLOGICZNE

Poniżej opisano testy użyte do oceny hamowania polimerazy NS5B HCV i replikacji HCV.

Skuteczność związków według wynalazku jako inhibitorów RNA-zależnej polimerazy RNA (RdRp) NS5B HCV była oceniana w następujących testach.

A. Test hamowania polimerazy NS5B HCV

Tego testu użyto do oceny zdolności pochodnych nukleozydów według wynalazku do hamowania aktywności enzymatycznej RNA-zależnej polimerazy RNA (NS5B) wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) na heteromerycznej matrycy RNA.

Procedura:

Skład Buforu Testowego: (50 Ll łącznie na reakcję) mM Tris, pH 7,5

LM EDTA mM DTT mM MgCl2 mM KCl

0,4 U/Ll RNAsin (Promega, roztwór podstawowy 40 jednostek/Ll) 0,75 Lg t500 ( 500-nt RNA utworzony przy użyciu T7 transkrypcji sekwencji z regionu NS2/3 genomu HCV)

1,6 Lg oczyszczonej HCV NS5B (forma z uciętymi 21 aminokwasami od końca C)

LM A,C,U,GTP (mieszanina trifosforanów nukleozydów))

[alfa^-32Pl-GTP lub [alfa^-33Pl-GTP

Związki były badane w różnych stężeniach aż do stężenia finalnego 100 LM.

Przygotowano odpowiednią objętość buforu reakcyjnego dodając zarówno enzym jak i matrycę t500. Pochodne nukleozydów według wynalazku rozpipetowano do 96 studzienek na płytce. Przygotowano mieszaninę trifosforanów nukleozydów (NTP's) zawierającą znakowany radioizotopem GTP i rozpipetowano ją do 96 studzienek na płytce. Reakcję zainicjowano przez dodanie roztworu reakcyjnego z enzymem-matrycą i pozostawiono w temperaturze pokojowej na 1-2h.

Reakcję przerwano przez dodanie 20 Ll 0,5M EDTA, pH 8,0. Przeprowadzono również ślepą próbę, w której roztwór przerywający dodano do NTPs przed dodaniem buforu reakcyjnego.

Ll wygaszonej mieszaniny reakcyjnej umieszczono na krążkach filtracyjnych DE 81 (Whatman) i pozostawiono na 30 minut do wyschnięcia. Filtry spłukiwano 0,3 M mrówczanem amonu, pH 8 (150 ml/płukanie, dopóki cpm in 1 ml popłuczyn nie było niższe od 100, zazwyczaj 6 płukań). Filtry zostały sczytane po dodaniu 5 ml płynu scyntylacyjnego w liczniku scyntylacyjnym.

Procent hamowania obliczano zgodnie z następującym równaniem:

% hamowania= [1-(cpm w reakcji testowej - cpm w próbie ślepej)/(cpm w reakcji kontrolnej - cpm w próbie ślepej)l x 100, gdzie cpm oznacza liczbę impulsów na minutę.

Reprezentatywne związki badane w teście polimerazy HCV NS5B wykazywały IC50 mniejsze niż 100 mikromoli.

B. Test Hamowania Replikacji HCV RNA:

Związki według wynalazku były również oceniane pod względem ich wpływu na replikację wirusa RNA zapalenia wątroby typu C w hodowlach komórek wątrobiaka (HuH-7), zawierających subgenomowy replikon HCV. Szczegóły testu opisano poniżej. Ten test replikonowy stanowi modyfikację testu opisanego przez V. Lohmann, F. Korner, J-O. Koch, U. Herian, L. Theilmann, and R. Bartenschlager, Replication of a Sub-genomic Hepatitis C Virus RNAs in a Hepatoma Cell Line, Science 285:110 (1999).

Protokół:

Użyto testu ochrony rybonukleaz in situ opartego na ocenie scyntylacji na płytce (Ribonuclease protection Scintillation Proximity based-plate Assay-SPA). Po 10 000 - 40 000 komórek umieszczano w 100-200 Ll podłoża zawierającego 0,8 mg/ml G418 na płytce cytostar z 96 studzienkami (Amersham). Do komórek dodawano badane związki w różnych stężeniach aż do 100 LM w 1% DMSO w czasie od 0 do 18h i następnie hodowano przez 24-96 h. Komórki utrwalano (20 minut, 10% formalina), przesączano (20 minut, 0.25% Triton X-100/PBS), i hybrydyzowano (przez noc w 50°) z sondą z jednoniciowego znakowanego ³³P RNA, komplementarną do (+) nici NS5B (lub innych genów) zawartej w RNA genomu wirusa. Komórki płukano, poddawano działaniu RNA-zy, płukano, ogrzewano do 65°C i zliczano w liczniku Top-Count. Hamowanie replikacji odczytywano jako spadek cpm.

Ludzkie komórki HuH-7 wątrobiaka, które były dobrane pod względem zawartości subgenomowego replikonu, przenoszą cytoplazmatyczny RNA składający się z 5'regionu HCV, który nie uległ

PL 207 405 B1 translacji (NTR), neomycynowego markera selekcji, EMCV IRES (wewnętrzne miejsca wiązania rybosomów), oraz niestrukturalnych białek HCV od NS3 do NS5B, po którym następował 3'NTR.

Reprezentatywne związki badane w teście replikacji wykazywały EC50 mniejszą niż 100 mikromoli.

Pochodne nukleozydów według wynalazku oceniano również pod względem toksyczności komórkowej i specyficzności antywirusowej w badaniach przesiewowych opisanych poniżej.

Badania przesiewowe:

Zdolność pochodnych nukleozydów według wynalazku do hamowania ludzkiej polimerazy DNA oceniano w następujących testach.

a. Hamowanie ludzkiej polimerazy DNA alfa i beta.

Warunki Reakcji:

pl - objętość reakcji

Skład Buforu Reakcyjnego:

mM Tris-HCl, pH 7,5

200 μg/ml, albumina osocza bydlęcego

100 mM KCl mM β-merkaptoetanol mM MgCl2

1,6 pM dA, dG, dC, dTTP a-³³P-dATP

Enzym i matryca:

0,05 mg/ml matrycy DNA z nasienia rybiego

0,01 U/pl polimerazy DNA α lub β

Przygotowanie matrycy DNA z nasienia rybiego

Dodać 5 pl 1M MgCl₂ do 500 μl aktywowanego DNA z rybiego nasienia (USB 70076);

Ogrzać do 37°Ci dodać 30 μl egzonukleazy III (65 U/pl-GibcoBRL 18013-011);

Inkubować 5 min w 37°C;

Zakończyć reakcję poprzez ogrzanie do 65°C przez 10 min;

Rozdzielić po 50-100 μl do kolumn chromatograficznych Bio-spin 6 (Bio-Rad 732-6002) zrównoważonych 20 mM Tris-HCl, pH 7,5;

Wirować 1000 x g przez 4 min.

Zebrać supernatant i oznaczyć stężenie przez pomiar absorbancji przy 260 nm.

Matrycę DNA rozcieńczono do odpowiedniej objętości 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 i enzym rozcieńczono do odpowiedniej objętości 20 mM Tris-HCl, zawierającym 2 mM β-merkaptoetanolu i 100 mM KCl. Matrycę i enzym pipetowano do probówek mikrowirówki lub na płytkę z 96 studzienkami. Przygotowano także ślepą próbę, niezawierającą enzymu i próby kontrolne bez testowanego związku, używając odpowiednio buforu do rozcieńczania enzymu lub rozpuszczalnika dla badanych związków. Reakcję zainicjowano przy użyciu buforu reakcyjnego, którego skład przedstawiono powyżej. Reakcję inkubowano przez 1h w 37°C. Reakcję wygaszono przez dodanie 20 μl 0,5M EDTA. Po 50 μl roztworu reakcyjnego z zatrzymanej reakcji umieszczono na płytkach filtracyjnych Whatman DE81 i wysuszono na powietrzu. Płytki filtracyjne były kilkakrotnie płukane 150 ml 0,3M mrówczanu amonu, pH 8, dopóki cpm w 1 ml popłuczyn nie było <100. Płytki przepłukano dwukrotnie 150 ml czystego etanolu i jeden raz 150 ml bezwodnego eteru, wysuszono i zliczono z użyciem 5 ml płynu scyntylacyjnego.

Procent zahamowania był obliczany według następującego równania:

% hamowania = [1-(cpm badanej reakcji - cpm próby ślepej)/(cpm reakcji kontrolnej - cpm próby ślepej)1 x 100.

b. Hamowanie ludzkiej polimerazy DNA gamma

Zdolność do hamowania ludzkiej polimerazy DNA gamma był mierzony w reakcji, która zawierała 0,5 ng/pl enzymu; 10 μM dATP, dGTP, dCTP, i TTP; 2 pCi/na reakcję [a-³³P1-dATP, i 0,4 pg/pl aktywowanego DNA z rybiego nasienia (nabyte w US Biochemical) w buforze zawierającym 20 mM Tris pH 8, 2 mM β-merkaptoetanolu, 50 mM KCl, 10 mM MgCl₂, i 0,1 pg/pl BSA. Reakcja przebiegała przez 1 godzinę w temperaturze 37°C i została wygaszona przez dodanie 0,5 M EDTA, do stężenia ostatecznego 142 mM. Tworzenie produktu oceniano ilościowo metodą wiązania na filtrach wymiany anionowej i w liczniku scyntylacyjnym. Badane związki były testowane do 50 pM.

Procent zahamowania był obliczany według następującego równania:

PL 207 405 B1 % hamowania = [1-(cpm badanej reakcji - cpm próby ślepej)/(cpm reakcji kontrolnej - cpm próby ślepej)] x 100.

Zdolność pochodnych nukleozydów według wynalazku do hamowania zakaźności i rozsiewania się HIV mierzono za pomocą następujących testów.

c. Test zakaźności HIV

Testy przeprowadzano przy użyciu wariantu komórek HeLa Magi, w których zachodzi ekspresja zarówno CXCR4 jak i CCR5, dobranych pod kątem niskiej ekspresji tła β-galaktozydazy (β-gal). Komórki były infekowane przez 48h i oceniano produkcję (β-gal) z połączonego promotora HIV-1 LTR z użyciem substratu do chemiluminescencji (Galactolight Plus, Tropix, Bedford, MA). Inhibitory były miareczkowane (w dwóch próbach) w podwójnych, seryjnych rozcieńczeniach zaczynając od 100 μM; procent hamowania dla każdego stężenia był obliczany w odniesieniu do kontroli zakażenia.

d. Hamowanie rozsiewania się HIV

Zdolność związków według wynalazku do hamowania rozsiewania się wirusa ludzkiego niedoboru odporności (HIV) była mierzona przy użyciu metody opisanej w opisie patentowym U.S. Nr 5,413,999 (Macy 9, 1995) i J.P.Vacca, et al.. Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 4096-4100 (1994).

Pochodne nukleozydów według wynalazku były również badane pod względem cytotoksyczności w stosunku do hodowli komórek wątrobiaka (HuH-7), zawierających subgenomowy replikon HCV, w teście komórkowym MTS (MTS cell-based assay) opisanym poniżej. Linia komórek HuH-7 jest opisana w H. Nakabayashi, et al., Cancer Res., 42: 3858 (1982).

e. Test cytotoksyczności:

Hodowle komórkowe zostały przygotowane na odpowiednich podłożach w stężeniu około 1,5 x 10⁵komórek/ml dla hodowli w zawiesinie w 3-dniowej inkubacji i 5,0 x 10⁴ komórek/ml dla hodowli przylegających w 3-dniowej inkubacji. 99 μl hodowli komórkowej przenoszono na płytkę do hodowli tkankowych z 96 studzienkami i dodawano 1 μl 100-krotnego stężenia ostatecznego badanego związku w DSMO. Płytki inkubowano przez określony czas w 37°C i w 5% CO2. Po inkubacji do każdej studzienki dodawano 20 μl odczynnika CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) (Promega), a płytki inkubowano w 37°C i w 5% CO2 przez dodatkowy czas aż do 3 h. Płytki wstrząsano w celu dobrego wymieszania i odczytywano absorbancję przy 490 nm w czytniku płytkowym. Standardowa krzywa dla hodowli w zawiesinie została opracowana przy znanej liczbie komórek, tuż przed dodaniem odczynnika MTS. Komórki aktywne metabolicznie redukują MTS do formazanu. Formazan absorbuje przy 490 nm. Absorbancja przy 490 nm w obecności badanego związku była porównywana do absorbancji komórek, do których nic nie dodawano. Odnośnik: Cory, A. H. et al, Use of an aqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth assays in culture, Cancer Commun. 3: 207 (1991).

Poniższe testy zostały użyte do pomiaru aktywności związków według wynalazku przeciwko innym RNA-zależnym wirusom RNA:

a. Ocena aktywności antywirusowej związków in vivo przeciwko rinowirusowi (test hamowania efektu cytopatycznego)

Warunki testu są opisane w artykule Sidwell'a i Huffman'a, Use of disposable microtissue culture plates for antiviral and interferon induction studies. Appl. Microbiol. 22: 797-801 (1971).

Wirusy

Użyto rinowirusa typu 2 (RV-2), szczep HPG z komórkami KB oraz podłoża (0,1% NaHCO₃, bez antybiotyków), zgodnie z artykułem Sidwell'a i i Huffman'a. Wirus, uzyskany z ATCC, pochodził z wymazu z gardła dorosłego mężczyzny z podostrą chorobą gorączkową górnych dróg oddechowych.

Rinowirusy typ 9 (RV-9), szczep 211 i rinowirus typ 14(RV-14), szczep Tow, również uzyskano z American Type Culture Collection (ATCC)) w Rockville, MD. RV-9 pochodził z ludzkich popłuczyn z gardła, a RV-14 -z wymazu z gardła młodego dorosłego ze schorzeniem górnych dróg oddechowych. W obu przypadkach użyto linii komórek HeLa Ohio-1 (Dr. Fred Hayden, Univ. of VA), które są komórkami ludzkiego raka nabłonkowego szyjki macicy. Jako podłoża wzrostowego użyto MEM (Eagle's minimum essential medium - podstawowe podłoże minimalne) z dodatkiem 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 0,1% NaHCO3. Testowym podłożem antywirusowym dla wszystkich trzech wirusów było MEM z 5% FBS, 0,1% NaHCO₃, 50 μg gentamycyny/ml i 10 mM MgCl₂.

Najwyższe stężenie związków według wynalazku stosowane w testach wynosiło 2000 μg/ml. Wirus był dodawany na płytkę testową około 5 minut po badanym związku. Przygotowano również odpowiednie kontrole. Płytki testowe były inkubowane w nawilżonym powietrzu i 5% CO2 w 37°C. W komórkach kontrolnych poszukiwano mikroskopowo zmian morfologicznych świadczących o cytotoksyczności. Do określenia ED50 (50% dawki skutecznej) i CC50 (50% stężenia cytotoksycznego)

PL 207 405 B1 użyto analizy regresji danych dotyczących CPE wirusa i danych z kontroli toksyczności. Indeks selektywności (SI) był obliczany według równania: SI = CC50 + ED50.

b. Ocena In Vitro Aktywności Antywirusowej Związków Względem Wirusów Dengi, Banzi i Żółtej

Febry (Test hamowania CPE)

Szczegóły testu zawarte są w cytowanym powyżej odnośniku do Sidwell'a i Huffman'a.

Wirusy:

Wirus Dengi typu 2, szczep Nowa Gwinea, uzyskano z Center for Disease Control. Do hodowli wirusa i przeprowadzenia testów antywirusowych (MA-104) użyto dwóch linii komórek nerki afrykańskiej małpy zielonej (Vero). Zarówno wirus żółtej febry, szczep 17D, z zainfekowanego mózgu myszy, jak i wirus Banzi, szczep H 336, z surowicy gorączkującego chłopca z południowej Afryki, uzyskano z ATCC. Do obu wirusów i do testu użyto komórek Vero.

Komórki i Podłoża:

Komórki MA-104 (BioWhittaker, Inc., Walkersville, MD) i komórki Vero (ATCC) zostały użyte w podłożu 199 z 5% FBS i 0,1% NaHCO3 bez antybiotyków.

Podłożem testowym dla wirusów Dengi, żółtej febry i Banzi było MEM, 2% FBS, 0.18% NaHCO3 z 50 μg gentamycyny/ml.

Testowanie właściwości antywirusowych badanych związków przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Sidwella i Huffman'a, analogicznie do testów antywirusowych przeprowadzonych dla rinowirusa. Dla każdego z wirusów odpowiedni odczyt efektu cytopatycznego (CPE) uzyskano po 5-6 dniach.

c. Ocena In Vitro Aktywności Antywirusowej Związków Względem Wirusa Gorączki Zachodniego Nilu (Test hamowania CPE)

Szczegóły testu zawarte są w cytowanym powyżej odnośniku do Sidwell'a i Huffman'a. Izolowanego z mózgu krowy wirusa gorączki Zachodniego Nilu, izolat New York, uzyskano z Center for Disease Control. Komórki Vero hodowano i wykorzystano w sposób opisany powyżej. Podłożem testowym było MEM, 1% FBS, 0,1% NaHCO₃ z 50 μg gentamycyny/ml.

Testowanie właściwości antywirusowych związków według wynalazku przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Sidwell'a i Huffman'a, podobnie do testów antywirusowych przeprowadzonych dla rinowirusa. Odpowiedni odczyt efektu cytopatycznego (CPE) uzyskano po 5-6 dniach.

d. Ocena in vitro aktywności antywirusowej związków względem rinowirusów, wirusów żółtej febry, Dengi, Banzi i gorączki Zachodniego Nilu (test wychwytu neutralnej czerwieni - Neutral Red Uptake Assay)

Po przeprowadzeniu powyższych testów hamowania CPE, zastosowano dodatkową metodę wykrywania zmian cytopatycznych, opisaną w Microtiter Assay for Interferon: Microspectrophotometric Quantitation of Cytopathic Effect, Appl. Environ. Microbiol. 31: 35-38 (1976). Do odczytu płytek testowych użyto czytnika mikropłytek model EL309. Wartości ED₅₀ i CD₅₀ obliczono w sposób opisany powyżej.

Przykład preparatu farmaceutycznego

Jako przykład doustnej kompozycji związku według niniejszego wynalazku, 50 mg związku z przykładu 1 lub z przykładu 2 formułowano z dostatecznie rozdrobnioną laktozą do ilości łącznej 580 do 590 mg do napełniania twardych kapsułek żelatynowych wielkości O.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Pochodne nukleozydów o wzorze strukturalnym II:

Λ

N R¹¹ (li)

PL 207 405 B1 oraz ich dopuszczalne farmaceutycznie sole; w którym

R¹ oznacza C1-3 alkil ewentualnie podstawiony przez grupę hydroksylową lub jeden do trzech atomów fluoru;

R² oznacza grupę hydroksylową lub C1-4 alkoksyl;

R³ oznacza wodór, halogen lub grupę hydroksylową;

R⁵ oznacza wodór, P3O9H4, P2O6H3, lub PO3H2;

R⁸ oznacza wodór;

R⁹ oznacza wodór, metyl lub halogen; a

R¹⁰ i R¹¹ każdy niezależnie oznaczają wodór, halogen, grupę hydroksylową, grupę aminową, grupę C1-4 alkiloaminową, grupę di(C1-4 alkilo)aminową, lub grupę C3-6cykloalkiloaminową.
2. Związek według zastrz. 1, w którym:

R¹ oznacza metyl, fluorometyl lub hydroksymetyl;

R² oznacza grupę hydroksylową lub metoksyl;

R³ oznacza wodór, fluor lub grupę hydroksylową;

R⁵ oznacza wodór lub P3O9H4;

R⁸ oznacza wodór;

R⁹ oznacza wodór, metyl lub halogen; a

R¹⁰ i R¹¹ każdy niezależnie oznaczają wodór, fluor, grupę hydroksylową, lub grupę aminową.
3. Związek według zastrz. 1, wybrany z grupy składającej się z następujących: 4-amino-7-(2-C-metylo-e-D-arabinofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-C1pirymidyna, 4-amino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-C1pirymidyna, 4-metyloamino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-C1pirymidyna, 4-dimetyloamino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-C1pirymidyna, 4-cyklopropyloamino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-C1pirymidyna, 4-amino-7-(2-C-hydroksymetylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-C1pirymidyna, 4-amino-7-(2-C-fluorometylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna, 4-amino-5-metylo-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-C1pirymidyna, 4-amino-5-bromo-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-C1pirymidyna, 4-amino-5-chloro-7-{2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-C1pirymidyna, 4-amino-5-fluoro-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-C1pirymidyna, 2,4-diamino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-C1pirymidyna, 2-amino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-C1pirymidyna, 2-amino-4-cyklopropyloamino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-C1pirymidyna. 2-amino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-C1pirymidyn-4(3H)-on, 4-amino-7-(2-C-etylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-C1pirymidyna, 4-amino-7-(2-C,2-O-dimetylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-C1pirymidyna, 7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-C1pirymidyn-4(3H)-on, 2-amino-5-metylo-7-(2-C,2-O-dimetylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-C1pirymidyn-4(3H)-on, 4-amino-7-(3-deoksy-2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-C1pirymidyna, 4-amino-7-(3-deoksy-2-C-metylo-e-D-arabinofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-C1pirymidyna, 4-amino-2-fluoro-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-C1pirymidyna i 4-amino-7-(3-deoksy-3-fluoro-2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo-[2,3-C1pirymidyna;

i odpowiadających 5'-trifosforanów;

oraz ich dopuszczalnych farmaceutycznie soli.
4. Związek według zastrz. 3, wybrany z grupy składającej się z następujących: 4-amino-7-(2-C-metylo-e-D-arabinofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-C1pirymidyna, 4-amino-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-C1pirymidyna, 4-amino-7-(2-C-fluorometylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-C1pirymidyna, 4-amino-5-metylo-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-C1pirymidyna, 4-amino-5-bromo-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-C1pirymidyna, 4-amino-5-chloro-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-C1pirymidyna, 4-amino-5-fluoro-7-(2-C-metylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-C1pirymidyna. 4-amino-7-(2-C,2-O-dimetylo-e-D-rybofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-C1pirymidyna, i odpowiadających 5'-trifosforanów;

lub ich dopuszczalnych farmaceutycznie soli.

PL 207 405 B1
5. Związek według zastrz. 4, którym jest:

4-amino-7-(2-C-metylo-β-D-arabinofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirvmidyna; lub jego dopuszczalne farmaceutycznie sole.
6. Związek według zastrz. 4, którym jest:

4-amino-7-(2-C-metylo-β-D-rvbofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirvmidyna; lub jego dopuszczalne farmaceutycznie sole.
7. Związek według zastrz. 4, którym jest:

4-amino-7-(2-C-fluorometylo-β-D-rvbofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirvmidyna; lub jego dopuszczalne farmaceutycznie sole.
8. Związek według zastrz. 4, którym jest:

4-amino-5-chloro-7-(2-C-metylo-β-D-rvbofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirvmidyna; lub jego dopuszczalne farmaceutycznie sole.
9. Związek według zastrz. 4, którym jest:

4-amino-5-bromo-7-(2-C-metylo-β-D-rvbofuranozylo)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyna; lub jego dopuszczalne farmaceutycznie sole.
10. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję czynną i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera pochodną określoną w zastrz. 1.
11. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 10, użyteczna do hamowania zależnej od RNA wirusowej polimerazy RNA, hamowania replikacji zależnego od RNA wirusa RNA, i/lub leczenia infekcji zależnym od RNA wirusem RNA.
12. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 11, znamienna tym, że zależną od RNA polimerazą wirusa RNA jest polimeraza HCV NS5B, replikacją zależnego od RNA wirusa RNA jest replikacja HCV i infekcją zależnym od RNA wirusem RNA jest infekcja wirusem HCV.
13. Zastosowanie pochodnej określonej w zastrz. 1 do wytwarzania leku do hamowania zależnej od RNA wirusowej polimerazy RNA lub hamowania replikacji wirusa RNA zależnego od RNA u ssaka.
14. Zastosowanie pochodnej określonej w zastrz. 1, do wytwarzania leku do leczenia infekcji wirusem zależnym od RNA u ssaka.
15. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że infekcją zależnym od RNA wirusem RNA jest infekcja wirusem zapalenia wątroby typu C.