RS50236B - Nukleozidni derivati kao inhibitori rnk-zavisne rnk virusne polimeraze - Google Patents

Description

OBLAST TEHNIKE

Ovaj pronalazak se odnosi na nukleozidna jedinjenja i njihove određene derivate, njihovu sintezu i njihovo korišćenje kao inhibitora RNK-zavisne RNK virusne polimeraze. Jedinjenja ovog pronalaska su inhibitori RNK-zavisne RNK virusne replikacije i korisna su za lečenje RNK-zavisne RNK virusne infekcije. Oni su posebno korisni kao inhibitori NS5B polimeraze virusa hepatitisa C (HCV), kao inhibitori replikacije HCV-a i za lečenje infekcije hepatitisom C.

STANJE TEHNIKE

Infekcija virusom hepatitisa C (HCV) predstavlja važan zdravstveni problem, koji vodi ka hroničnim bolestima jetre, kao što su ciroza i hepatocelularni karcinom, u značajnom broju inficiranih jedinki, za koju je utvrđeno da u svetskoj populaciji iznosi 2-15%. Prema navodima Centra za kontrolu bolesti SAD-a utvrđeno je da, samo u Sjedinjenim Američkim Državama, postoji 4.5 miliona inficiranih ljudi. Prema navodima Svetske zdravstvene organizacije, postoji više od 200 miliona inficiranih pojedinaca širom sveta, pri čemu svake godine najmanje 3 do 4 miliona ljudi biva inficirano. Jednom inficirano lice u oko 20% slučajeva se oslobađa virusa, ali u preostalim slučajevima ostaje nosilac virusa do kraja života Deset do dvadeset procenata hronično inficiranih pojedinaca, eventualno, razvija po jetru razornu cirozu ili rak. Virusna bolest se prenosi parenteralno, putem kontaminirane krvi ili krvnih produkata ili kontaminiranih igala, ili seksualnim putem i vertikalno, od inficiranih majki ili majki nosilaca na svoje potomstvo. Sadašnji oblici lečenja HCV infekcija, koji se ograničavaju na imunoterapiju sa rekombinantnim a interferonom, samim ili u kombinaciji sa nukleozidnim analogom ribavirina, ograničenog su kliničkog efekta. Pored toga, nije utvrđena vakcina za HCV. Sledstveno tome, postoji urgentna potreba za poboljšanim terapeutskim agensima, koji su efikasni u borbi sa hroničnom HCV infekcijom. Prikazano je stanje u oblasti lečenja HCV infekcija, a reference se odnose na sledeće publikacije: B. Dvmock, i sar., "Novel approaches to the treatment of hepatitis C virus infection", Antiviral Chemistrv & Chemotherapv. 11:79-96 (2000); H. Rosen, i sar., "Hepatitis C virus: current understanding and procpects for future therapies, " Molecular Medicine Todav. 5:393-399 (1999); D. Moradpour, i sar., "Current and evolving therapies for hepatitis C", European J. Gastroenterol. Hepatol.. 11:1189-1202 (1999); R. Bartenschlager, "Candidate Targets for Hepatitis C Virus-Speciflc Antiviral Therapv", Intervirologv. 40:378-393 (1997); G. M. Lauer i B.D. VValker, "Hepatitis C Virus Infection," N. Engl. J. Med- 345:41-52 (2001); B.W. Dvmock, "Emerging therapies for hepatitis C virus infection," Emerging Drugs, 6:13-42 (2001); i C. Crabb, "Hard-Won Advances Spark Excitement about Hepatitis C", Science: 506-507 (2001); od kojih su sadržaji svih ovde u celosti uključeni, kao reference.

Uzeti su različiti pristupi terapiji HCV-a, koji uključuju inhibiciju virusne serin proteinaze (NS3 proteaze), helikaze i RNK-zavisne RNK polimeraze (NS5B) i razvijanje vakcine.

HCV virion je RNK virus sa omotačem i pozitivnim lancem, sa jednom oligoribonukleotidnom genomskom sekvencom od oko 9600 baza, koje kodiraju poliprotein od oko 3,010 aminokiselina. Proteinski proizvodi HCV gena sastoje se od strukturnih proteina C, E1 i E2, i ne-strukturnih proteina NS2, NS3, NS4A i NS4B, i NS5A i NS5B. Nestrukturni (NS) proteini, veruje se, obezbeđuju kataiitičku mašineriju za virusnu replikaciju. NS3 proteaza oslobađa NS5B, RNK-zavisnu RNK polimerazu iz poliproteinskog lanca. NS5B polimeraza HCV-a je potrebna za sintezu dvo-lančane RNK iz jedno-lančane virusne RNK, koja služi kao obrazac u ciklusu replikacije HCV-a. NS5B polimeraza se, zato, smatra esencijalnom komponentom kompleksa replikacije HCV-a. [vidi K. Ishi, i sar., "Expression of Hepatitis C Virus NS5B Protein: Characterization of Its RNA Polvmerase Activitv and RNA Binding", Hepatologv. 29:1227-1235 (1999) i V. Lohmann, i sar., "Biochemical and Kinetic Analvses of NS5B RNA Polvmerase of the Hepatitis C Virus", Virologv. 249:108-118 (1998)]. Inhibicija NS5B polimeraze HCV-a sprečava obrazovanje dvolančane RNK HCV-a i, zato, čini zanimljiv pristup razvoju HCV-specifičnih antivirusnih terapija.

Sada je utvrđeno da su nukleozidna jedinjenja ovog pronalaska i njegovi određeni derivati moćni inhibitori RNK-zavisne RNK virusne replikacije, a posebno replikacije HCV-a. 5-trifosfatni derivati ovih nukleozidnih jedinjenja su inhibitori RNK-zavisne RNK virusne polimeraze, a posebno HCV NS5B polimeraze. Tekuća nukleozidna jedinjenja i njihovi derivati korisni su za lečenje RNK-zavisne RNK virusne infekcije, posebno HCV infekcije.

Zbog toga je cilj ovog pronalaska da obezbedi nukleozidna jedinjenja i njihove određene derivate, koji su korisni kao inhibitori RNK-zavisne RNK virusne polimeraze, a posebno kao inhibitori NS5B polimeraze HCV-a.

Drugi cilj ovog pronalaska je da obezbedi nukleozidna jedinjenja i njihove odredjene derivate, koji su korisni kao inhibitori replikacije RNK-zavisnog RNK virusa, a posebno kao inhibitori replikacije virusa hepatitisa C.

Drugi cilj ovog pronalaska je da obezbedi nukleozidna jedinjenja i njihove odredjene derivate, koji su korisni u tečenju RNK-zavisne RNK virusne infekcije, posebno u lečenju HCV infekcije.

Drugi cilj ovog pronalaska je da obezbedi farmaceutske kompozicije, koje sadrže nukleozidna jedinjenja ovog pronalaska, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

Drugi cilj ovog pronalaska je da obezbedi farmaceutske kompozicije, koje sadrže nukleozidna jedinjenja i njihove derivate, iz ovog pronalaska, za korišćenje u vidu inhibitora RNK-zavisne RNK virusne polimeraze, posebno u vidu inhibitora HCV NS5B polimeraze.

Drugi cilj ovog pronalaska je da obezbedi farmaceutske kompozicije, koje sadrže nukleozidna jedinjenja i njihove derivate, iz ovog pronalaska, kako bi se koristili kao inhibitori RNK-zavisne RNK virusne replikacije, posebno kao inhibitori HCV replikacije.

Drugi cilj ovog pronalaska je da obezbedi farmaceutske kompozicije, koje sadrže nukleozidna jedinjenja i njihove derivate iz ovog pronalaska, za upotrebu u lečenju RNK-zavisne RNK virusne infekcije, posebno u lečenju HCV infekcije.

Drugi cilj ovog pronalaska je da obezbedi farmaceutske smeše, koje sadrže nukleozidna jedinjenja i njihove derivate iz ovog pronalaska, u kombinaciji sa drugim agensima, koji su aktivni prema RNK-zavisnom RNK virusu, a posebno prema HCV-U.

Drugi cilj ovog pronalaska je da obezbedi metode za inhibiciju RNK-zavisne RNK virusne polimeraze, a posebno za inhibiciju NS5B polimeraze HCV-a.

Drugi cilj ovog pronalaska je da obezbedi metode za inhibiciju RNK-zavisne RNK virusne replikacije, a posebno za inhibiciju replikacije HCV-a.

Drugi cilj ovog pronalaska je da obezbedi metode za proizvodnju leka zalečenje RNK-zavisne RNK virusne infekcije, a posebno za lečenje HCV infekcije.

Drugi cilj ovog pronalaska je da obezbedi metode za proizvdnju leka za lečenje RNK-zavisne RNK virusne infekcije, u kombinaciji sa drugim agensima, koji su aktivni prema RNK-zavisnom RNK virusu, a posebno za lečenje HCV infekcije, u kombinaciji sa drugim agensima, koji su aktivni prema HCV-u.

Drugi cilj ovog pronalaska je da obezbedi nukleozidna jedinjenja i odredjene njihove derivate i njihove farmaceutske kompozicije, da bi se koristili kao lek za inhibiciju RNK-zavisne RNK virusne replikacije i/ili za lečenje RNK-zavisne RNK virusne infekcije, a posebno za inhibiciju replikacije HCV-a i/ili za lečenje HCV infekcije.

Drugi cilj ovog pronalaska je da se obezbedi upotreba nukleozidnih jedinjenja i odredjenih njihovih derivata iz ovog pronalaska, i njihovih farmaceutskih kompozicija, za izradu leka za inhibiciju RNK-zavisne RNK virusne replikacije i/ili za lečenje RNK-zavisne RNK virusne infekcije, a posebno za inhibiciju replikacije HCV-a I/ili za lečenje HCV infekcije.

Ovi i drugi ciljevi lako ce postati jasni iz detaljnog opisa, koji sledi.

IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA

Ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenja sa strukturnom formulom I, naznačene stereohemijske konfiguracije:

0)

ili na njegovu farmaceutski prihvatljivu so;

gde je R<1>C^alkenil, C2.4aikinil ili C^alkil, pri čemu je alkil nesupstituisan ili supstituisan sa hidroksi, amino, C^alkoksi, CV4alkiltio, ili sa jednim do tri atoma fluora;

R<2>je vodonik, fluor, hidroksi, merkapto, C^alkoksi ili C^alkil; ili R<1>i R<2>zajedno sa atomom ugljenika, za koji su oni vezani obrazuju 3- do 6- člani zasićeni monociklični prstenasti sistem, koji opciono sadrži heteroatom, odabran od O, S i NC^alkila;

svaki od R<3>i R<4>nezavisno je odabran iz grupe, koju čine vodonik, cijano, azido, halogen, hidroksi, merkapto, amino, Ct.4alkoksi, C^alkenil, C^alkinil i C^alkil, pri čemu je alkil nesupstituisan ili supstituisan sa hidroksi, amino, C^alkoksi, CMalkiltio, ili sa jednim do tri atoma fluora.

R<5>je vodonik, C^^lkilkarbonil, P309Hv P208Haili P(0)R<13>R<14>;

svaki od R<8>i R<7>je nezavisno vodonik, metil, hidroksimetil ili fluorometil;

R<8>je vodonik, C^alkil, CMalkinil, halogen, cijano, karboksi, C^alkiloksikarbonil, azido, amino, C^alkilamino, di(C,^alkil)amino, hidroksi, C^aikoksi, C^alkiitio, C^alkilsulfonil, (C^alkilJ^aminometil ili C^cikloheteroalkil, koji je nesupstituisan ili supstituisan sa jednom do dve grupe, nezavisno odabrane od halogena, hidroksi, amino, C^alkila i C,.4alkoksi;

R<9>je vodonik, cijano, nitro, C^alkil, NHCONH2, CONR12R<12>, CSNR<12>R<12>, COOR<12>, C(=NH)NH2, hidroksi, C^aalkoksi, amino, C^alkilamino, ći( C^.4alkil)amino, halogen, (1,3-oksazol-2-il), (1,3-tiazol-2-il) ili (imidazol-2-il); pri čemu je alkil nesupstituisan ili supstituisan sa jednom do tri grupe, koje su nezavisno odabrane od halogena, amino, hidroksi, karboksi i C^alkoksi; svaki od R<10>i R<11>je nezavisno vodonik, hidroksi, halogen, G,_4alkoksi, amino, C,.4alkilamino, dKG^alkiOamino, C3^cikloalkilamino, di(CMcikloalkil) amino ili C^cikloheteroalkil, koji je nesupstituisan ili supstituisan sa jednom do dve grupe, koje su nezavisno odabrane od halogena, hidroksi, amino, C^alkila i CMalkoksi;

svaki R<12>je nezavisno vodonik ili C1_0alkii; i

svaki odR13i R<14>je nezavisno hidroksi, OCHaCH2SC(=0)C1^alkil, OCH20(C=0)OC^alkil, NHCHMeC02Me, 0CH(C1.4alkii)O(C=O)Cwalkil,

pod uslovom da, kada je R<1>{3-metil, a R<4>vodonik ili je R<4>{3-metil, a R<1>vodonik,R2i R<3>su a-hidroksi, R<10>je amino i R<5>, R<6>, R<7>,R<8>i R11, su vodonik, tada R<9>nije cijano ili CONH2.

Jedinjenja sa formulom I su korisna kao inhibitori RNK-zavisne RNK virusne polimeraze, a posebno NS5B polimeraze HCV-a. Ona su, takode, inhibitori RNK-zavisne RNK virusne replikacije, posebno HCV replikacije, i korisna su za lečenje RNK-zavisne RNK virusne infekcije, a posebno za lečenje HCV infekcije.

Takodje su, u okviru ovog pronalaska, sadržane farmaceutske kompozicije, koje sadrže sama jedinjenja ili jedinjenja u kombinaciji sa drugim agensima, koji su aktivni prema RNK-zavisnom RNK virusu, a posebno prema HCV-U, kao i metode za inhibiciju RNK-zavisne RNK virusne replikacije i za lečenje RNK-zavisne RNK virusne infekcije.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenja sa strukturnom formulom I, naznačene stereohemijske konfiguracije:

ili na njegovu farmaceutski prihvatljivu so;

gdeje R<1>C2^alkenil, C2-*alkinil ili Ci^alkil, pri čemu je alkil nesupstituisan ili supstituisan sa hidroksi, amino, C1-4alkoksi, C1-4alkiltio, ili sa jednim do tri atoma fluora

R<2>je vodonik, fluor, hidroksi, merkapto, C^alkoksi ili C^alkil; ili R<1>i R<2>zajedno sa atomom ugljenika, za koji su vezani obrazuju 3- do 6- člani zasićeni monociklični prstenasti sistem, koji opciono sadrži heteroatom, odabran od O, S i NC^alkila;

svaki od R<3>i R<4>nezavisno je odabran iz grupe, koju čine vodonik, cijano, azido, halogen, hidroksi, merkapto, amino, C^alkoksi, C^alkenil, CMaikinil i C^alkil, pri čemu je alkil nesupstituisan ili supstituisan sa hidroksi, amino, G^alkoksi, C^alkiltio, ili sa jednim do tri atoma fluora;

R<5>je vodonik, C^alkiikarbonil, PaOgH«, P208H3ili P(0)R<13>R<14>;

svaki od R8 i R<7>je nezavisno vodonik, metil, hidroksimeti! ili fluorometii;

R<8>je vodonik, C^alkil, C^alkinil, halogen, cijano, karboksi, C^alkiloksikarbonil, azido, amino, CV4alkifamino, difC^alkilJamino, hidroksi, C^alkoksi, C^lkiltio, C^alkilsulfonil, (C^alkil^aminometil ili C^cikloheteroalkil, koji je nesupstituisan ili supstituisan sa jednom do dve grupe, nezavisno odabrane od halogena, hidroksi, amino, CV4alkiIa i C,.4alkoksi;

R<9>je vodonik, cijano, nitro, C^alkil, NHCONH2, CONR<12>R<12>,CSNR<12>R12, COOR<12>, C(=NH)NH2, hidroksi, C^alkoksi, amino, C^alkilamino, di(C1.4alkil)amino, halogen, (1,3~oksazol-2-ii), (1,3-tiazol-2-il) ili (imidazol-2-il); pri čemu je alkil nesupstituisan ili supstituisan sa jednom do tri grupe, koje su nezavisno odabrane od halogena, amino, hidroksi, karboksi i C^alkoksi; svaki od R<10>i R1' je nezavisno vodonik, hidroksi, halogen, C^alkoksi, amino, CV4alkilamino, dKC^alkiOamino, C3^cikloalkilamino, di(C3.acikloalkil) amino ili C^cikloheteroalkil, koji je nesupstituisan ili supstituisan sa jednom do dve grupe, koje su nezavisno odabrane od halogena, hidroksi, amino, C^alkila i C^alkoksi;

svaki R<t2>je nezavisno vodonik ili C^alkil; i

svaki od R<13>i R<14>je nezavisno hidroksi, OCH2CH2SC<=0)CMalkil, OCH20(C=0)OCMalkil, NHCHMeC02Me, 0CH(CMalkil)0(C=O)CMalkil,

pod usiovom da, kada je R<1>p-metil, a R<4>vodonik ili je R<4>p-metil, a R<1>vodonik, R<2>i R<3>su a-hidroksi, R<10>je amino i R<5>, R<e>,R<7>,R<8>i R11 su vodonik, tada R<9>nije cijano ili CONH2.

Jedinjenja sa formulom I su korisna kao inhibitori RNK-zavisne RNK virusne polimeraze. Ona su, takođe, inhibitori RNK-zavisne RNK virusne replikacije, i korisna su za lečenje RNK-zavisne RNK virusne infekcije.

U jednom ostvarenju jedinjenja sa strukturnom formulom I su jedinjenja sa strukturnom formulom II:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so;

gde je

R<1>C^alkil, pri čemu je alkil nesupstituisan ili supstituisan sa hidroksi, amino, C,.3alkoksi, C^alkiltio ili sa jednim do tri atoma fluora;

R<2>je hidroksi, fluoro ili C^alkoksi;

R<3>je vodonik, halogen, hidroksi, amino ili C^alkoksi;

R<5>je vodonik, P309H4, P2OeH3ili P03H2;

R<a>je vodonik, amino ili C^alkilamino;

R<9>je vodonik, cijano, metil, halogen ili CONH2; i

svaki od R<10>i R11 je nezavisno vodonik, halogen, hidroksi, amino, C^alkilamino, di(C1.4alkil)amino ili C3.eCikloalkilamino;

pod uslovom da, kada jeR<1>P-metil,R2i R<3>su a-hidroksi, R<10>je amino iR<5>, R° i R11 su vodonik, tada R<9>nij<e>cijano ili CONH2.

U drugom ostvarenju jedinjenja sa strukturnom formulom I su jedinjenja sa strukturnom formulom II, gde je: R<1>metil, fluorometil, hidroksimetil, difluorometil, trifluorometil ili aminometil;

R<2>je hidroksi, fluoro ili metoksi;

R<3>je vodonik, fluoro, hidroksi, amino ili metoksi;

R<5>je vodonik ili P309H4;

R<8>je vodonik ili amino;

R<9>je vodonik, cijano, metil, halogen ili CONH2; i

svaki od R<10>i R11 je nezavisno vodonik, fluoro, hidroksi ili amino;

pod uslovom da, kada je R<1>P-metil, R<2>i R<3>su a-hidroksi, R<10>je amino i R<5>, R° i R11 su vodonik, tada R<9>nij<e>cijano ili CONH2.

Ilustrativni, ali neograničavajući, primeri jedinjenja ovog pronalaska sa strukturnom fomulom I, koji su korisni kao inhibitori RNK-zavisne RNK virusne polimeraze, su sledeći: 4-amino-7-(2-ametil-p-D-arabin^ 4-amino-7-(2-C^metil-p-D-ribofuranoziI)-7/^pirolo[23-<^pirimidin^ 4-metilamino-7-(2-C^metil-P-D-ribofura^ 4-dimetilamino-7-(2-C^metiI-3-D-ribofuranozil)-7yt3tpirolo[2,3- o^pirimidin, 4-ciklopropilamino-7-(2-Ć^met^ 4-amino-7-(2-ć>vinH-p-D-ribofuranozil)-7//pirolo[2,3-a3pirimidin, 4-amino-7-(2-CLhidroksimetil-p-D-ribofuranozil)-7Mpirolo[2,3-^pirim 4-amino-7-(2-C^fluorometil-(5-D-ribofuranozil)-7/^pirolo[2,3-^pirimid 4-amino-5-metil-7-(2-ć>metil-P-D-ribofura^ 4-amino-7-(2-ć^metil-p-D-ribofura^ kiselina,

4-amino-5-bromo-7-(2-C^metil-P-D-ribofurarK)zil)-7/^pirolo[2,3-fl] pirimidin, 4-amino-5-hloro-7-(2- <>metil-p^D-ribofuranozil)-7Mpirolo [2,3- d\ pirimidin, 4-amino-5-fluoro-7-(2-C^metil-P-D-ribofuranozil)-7iM-pirolo[2,3-i^|pirirnidin, 2,4-diamino-7-(2-C?-met!l-P-D-ribofuranozil)-7Aj<t>pirolo[2,3-o3pirimidin, 2-amino-7-(2-^rnetil-p-D-ribofuranozil)-7^fpirolo[2,3-<^pirirnidin, 2-amino-4-ciklopropilamino-7-(2-^metil-P-D-ribofuranozil)-7/TLpirolo[2,3^d\ pirimidin,

2-amino-7-(2-(^metil-p-D-ribofuranozii)-7/<t>/-pirolo[2,3-d]pirimidin-4(3i^-on, 4-amino-7-(2-£>etil-p-D-ribofuranozil)-7/7Lpirolo[2,3-<^pirimidin, 4-amino-7-(2-C;2-Cklimetil-p-D-ribofuranozil)-7/4-pirolo[2,3-<^pirimidin, 7-(2-Cimeti I-P-D-ribof u ranozil)-7>^pirolo[2,3-<3!| pirimidin-4(3/T)-on, 2-amino-5-metil-7-(2-(S;2-<>dimetil-|3-D-irbofuranozil)-7/T'-pirolo[2,3-a]pirimidin-4(3/S)-on,

4-amino-7-(3<leoksi-2-<>metil-j3-D-ribofuranozil)-7A3tpirolo[2,3-a]pirimidin,

4-amino-7-(3-deoksi-2-C-metil-^ djpirimidin,

4-amino-2-fluoro-7-(2-C-metil-B-D-ribofuranozil)-7-W-pirolo[2,3-d]pirimidin, 4-amino-7-(2,4-di- C-metil-p -D-ribofuranozil)-7-W-pirolo[2,3-a]pirimidin, i 4-amino-7-(3-deoksi-3-fluoro-2-C-metil-p-D-ribofuranozil)-7-W-pirolo[2,3-cfl pirimidin,

i odgovarajući 5-trifosfati;

ili njihova farmaceutski prihvatljiva so.

Dalju ilustraciju ovog pronalaska predstavljaju jedinjenja, koja su odabrana iz grupe, koju čine: 4-amino-7-(2-C-metil-<p->D-arabinofuranozil)-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin,

4-amino-7-(2-C-metil-p-D-ribofuranozil)-7H-p/ro/o[2,3-d] pirimidin,

4-amino-7-(2-C-fluorometil-p-D-ribofuranozil)-7H- pirolo[ 2, 3- d\ pirimidin,4-amino-5-metil-7-(2-C<:->metil-p-D-ribofuranozil)-7H- piroto[ 2, 3- d\ pirimidin,4-amino-5-bromo-7-(2-C-metil-p-D-ribofuranozil)-7H- pirolo[ 2, Z- dl pirimidin,4-amino-5-hloro-7-(2-C-metil-p-D-ribofuranozil)-7H- pitx>lo[ 2, 3- d\ pirimidin,

4-amino-5-fluoro-7-(2-C-metil-p-D-ribofuranoziQ-7H- pirolo[ 2, 3- d\pirimidin, i.

4-amino-7-(2-C,2-0-dimetil-P-D-ribofuranozil)-7H- pirolo[ 2, 3- d\ pirimidin,

i odgovarajući 5-trifostati;

ili njihova farmaceutski prihvatljiva so.

U jednom ostvarenju ovog pronalaska, nukleozidna jedinjenja ovog pronalaska su korisna kao inhibitori jednolančane, sens-pozitivne RNK-zavisne RNK virusne polimeraze, kao inhibitori jednolančane, sens-pozitivne RNK-zavisne RNK virusne replikacije, i/ili za lečenje jednolančane, sens-pozitivne RNK-zavisne RNK virusne infekcije. U klasi ovog ostvarenja sens-pozitivni jednolančani RNK-zavisni RNK virus, pozitivnog sensa, jeFlaviviridaevirus iliPicornaviridaevirus. U podklasi ove klase,Picornaviridaevirus je rinovirus, poliovirus ili virus hepatitisa A. U drugoj podklasi ove klase,Flaviviridaevirus je odabran iz grupe, koju čine virus hepatitisa C, virus žute groznice, virus Denge, virus Zapadnog Nila, virus japanskog encefalitisa, Banzi virus i virus goveđe virusne dijareje (BVDV). U podklasi ove podklase,Flaviviridaevirus je virus hepatitisa C.

Drugi aspekt ovog pronalaska odnosi se na metodu za inhibiciju RNK-zavisne RNK virusne polimeraze, metodu inhibicije RNK-zavisne RNK virusne replikacije i/ili metodu lečenja RNK-zavisne RNK virusne infekcije kod sisara, kome takvo lečenje treba, koja obuhvata primenu sisaru, terapeutski efektivne količine jedinjenja sa strukturnom formulom I.

U jednom ostvarenju ovog aspekta tekućeg pronalaska, RNK-zavisna RNK virusna polimeraza je jednolančana, sens-pozitivna RNK-zavisna RNK virusna polimeraza. U klasi ovog ostvarenja jednolančana, sens-pozitivna RNK-zavisna RNK virusna polimeraza jeFlaviviridaevirusna polimeraza iliPicornaviridaevirusna polimeraza. U podklasi ove klase,Picornaviridaevirusna polimeraza je rinovirusna polimeraza, poliovirusna polimeraza ili polimeraza virusa hepatitisa A. U drugoj podklasi ove klase,Flaviviridaevirusna polimeraza je odabrana iz grupe, koju čine polimeraza virusa hepatitisa C, polimeraza virusa žute groznice, polimeraza virusa Denge, polimeraza virusa Zapadnog Nila, polimeraza virusa japanskog encefalitisa, polimeraza Banzi virusa i polimeraza virusa goveđe virusne dijareje (BVDV). U podklasi ove podklase,Flaviviridaevirusna polimeraza je polimeraza virusa hepatitisa C.

U drugom ostvarenju ovog aspekta tekućeg pronalaska, RNK-zavisna RNK virusna replikacija je jednolančana, sens-pozitivna RNK-zavisna RNK virusna replikacija. U klasi ovog ostvarenja, jednolančana, sens-pozitivna RNK-zavisna RNK virusna replikacija je virusna replikacijaFlaviviridaeili virusna replikacijaPicornaviridae.U podklasi ove klase, virusna replikacijaPicornaviridaeje replikacija rinovirusa, replikacija poliovirusa ili replikacija virusa hepatitisa A. U drugoj podklasi ove klase, virusna replikacijaFlaviviridaeje odabrana iz grupe, koju čine replikacija virusa hepatitisa C, replikacija virusa žute groznice, replikacija virusa Denge, replikacija virusa Zapadnog Nila, replikacija virusa japanskog encefalitisa, replikacija Banzi virusa i replikacija virusa goveđe virusne dijareje (BVDV). U podklasi ove podklase, virusna replikacija virusaFlaviviridaeje replikacija virusa hepatitisa C.

U trećem ostvarenju ovog aspekta tekućeg pronalaska, RNK-zavisna RNK virusna infekcija je jednolančana, sens-pozitivna RNK-zavisna RNK virusna infekcija. U klasi ovog ostvarenja jednolančana, sens-pozitivna RNK-zavisna RNK virusna infekcija jeFlaviviridaevirusna infekcija iliPicornaviridaevirusna infekcija. U podklasi ove klase,Picornaviridaevirusna infekcija je infekcija rinovirusom, infekcija poliovirusom ili infekcija virusom hepatitisa A. U drugoj podklasi ove klase,Flaviviridaevirusna infekcija je odabrana iz grupe, koju čine infekcija virusom hepatitisa C, infekcija virusom žute groznice, infekcija virusom Denge, infekcija virusom Zapadnog Nila, infekcija viusom japanskog encefalitisa, infekcija Banzi virusom i infekcija virusom goveđe virusne dijareje (BVDV). U podklasi ove podklase,Flaviviridaevirusna infekcija je infekcija virusom hepatitisa C.

Kroz sadržaj tekuće prijave, sledeći izrazi imaju navedene značenja: Alkil grupe, prethodno navedene, određene su da uključe one alkil grupe naznačene dužine, ili u ravnolančanoj u razgranatoj konfiguraciji. Primeri takvih alkil grupa su metil, etil, propil, izopropil, butil, sek-butil, tercijarni butil, pentil, izopentil, heksil, izoheksil i slično.

Izraz "alkenil" označava ravnolančane ili razgranate alkene sa ukupno dva do šest atoma ugljenika, ili sa bilo kojim brojem unutar ovog raspona (npr., etenil, propenil, butenil, pentenil, itd.).

Izraz "alkinil" označava ravnolančane ili razgranate alkine sa ukupno dva do šest atoma ugljenika, ili sa bilo kojim brojem unutar ovog raspona (npr., etinil, propinil, butinil, pentinil, itd.).

izraz "cikloalkil" označava ciklične prstenove alkana, sa ukupno tri do osam atoma ugljenika, ili sa bilo kojim brojem unutar ovog raspona (npr., ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil, cikloheptil ili ciklooktil).

Izraz "cikloheteroalkil" određen je kako bi obuhvatio ne-aromatične heterocikle, koji sadrže jedan ili dva heteroatoma, odabrana od azota, kiseonika i sumpora. Primeri 4-6 članih ctkloheteroalkila obuhvataju azetidinii, pirolidinil, piperidinil, morfolinil, tiamorfolinil, imždazolidinil, tetrahidrofuranil, tetrahidropiranil, tetrahidrotiofenil, piperaztnil i slično.

Izraz "alkoksi" odnosi se na alkokside ravnog ili razgranatog lanca, sa naznačenim brojem atoma ugljenika (npr., C,.4alkoksi) ili sa bilo kojim brojem u okviru ovog raspona [tj., metoksi (MeO), etoksi, izopropoksi, itd.].

Izraz "aikiltio" odnosi se na ravnolančane ili razgranate alkilsulfide sa naznačenim brojem atoma ugljenika (npr., C^alkiltio) ili sa bilo kojim brojem u okviru ovog raspona [tj., metiftio (MeS-), etiltio, izopropiltio, itd.].

Izraz "alkilamino" odnosi se na ravne ili razgranate alkilamine sa naznačenim brojem atoma ugljenika (npr., C^aikilamino), ili sa bilo kojim brojem u okviru ovog raspona [tj., metilamino, etilamino, izopropilamino, t-butilamino, itd.].

Izraz "alkilsulfonil" odnosi se na ravnolančane ili razgranate alkilsulfonate, sa naznačenim brojem atoma ugljenika (npr., C^ealkilsulfonil), ili sa bilo kojim brojem u okviru ovog raspona [tj., metilsulfonil (MeS02-), etilsuifonil, izopropilsulfonii, itd.].

Izraz "alkoksikarbonil" odnosi se na ravnolančane ili razgranate estre derivata karboksilne kiseline ovog pronalaska sa naznačenim brojem atoma ugljenika (npr., C^alkiloksikarbonil), ili sa bilo kojim brojem u okviru ovog raspona [tj., metiloksikarbonil (MeOCO-), etiloksikarbonil ili butiloksikarbonil].

Izraz "ari!" obuhvata oba fenila, naftil i piridil. Aril grupa je opciono supstituisana sa jednom do tri grupe, koje su nezavisno odabrane od C^alkila, halogena, cijano, nitro, trifluorometila, C^alkoksi i C1-4alkiltio.

Izraz "halogen" određen je s namerom da uključi halogene atome fluora, hlora, broma i joda.

Izraz "supstituisan" treba shvatiti tako da uključuje višestruke stepene supstitucije navedenim supstituentom. U slučaju kada se prikazuju ili zahtevaju delovi sa višestrukim supstituentima, jedinjenje, koje se supstituiše, može biti nezavisno supstituisano sa jednim ili više izloženih ili zahtevanih supstituentskih delova, pojedinačno ili sa više njih.

Izraz "5'-trifosfat" odnosi se na derivate estra trifosforne kiseline, na 5'-hidroksil grupi nukleozidnog jedinjenja ovog pronalaska, koje ima siedeću opštu strukturnu formulu III:

gde su R<1->R" kao što su prethodno definisan«. Jedinjenja ovog pronalaska, takođe su određena, kako bi uključila farmaceutski prihvatljive soli trifosfatnog estra, kao i farmaceutski prihvatljive soli derivata 5'-monofosfatnog i 5'-difosfatnog estra sa strukturnom formulom IV, odnosno

V.

Izraz "5-(S-acil-2-tioetil)fosfar ili 'SATE" odnosi se na derivate mono- ili di-estra derivata 5 -monofosfatnog nukleozida ovog pronalaska sa strukturnom formulom VI, odnosno VII, kao i na farmaceustki prihvatljive soli mono-estra.

Izraz "kompozicija", kao u izrazu "farmaceutska kompozicija", odredjen je kako bi obuhvatio proizvod, koji sadrži aktivni sastojak(sastojke) i inertni sastojak(sastojke), koji čini nosač, kao i bilo koji proizvod, koji potiče, direktno ili indirektno, iz kombinacije, kompleksacije ili agregacije bilo koja dva ili više sastojaka, ili iz disocijacije jednog ili više sastojaka, ili potiče iz drugih tipova reakcija ili interakcija jednog ili više sastojaka. U skladu s tim, farmaceutska kompozicija ovog pronalaska obuhvata bilo koju kompoziciju, koja se priprema mešanjem jedinjenja ovog pronalaska i farmaceutski prihvatljivog nosača.

Izrazi "primena" ili "primenjivanje" jedinjenja, bili bi shvaćeni tako da označavaju davanje jedinjenja pronalaska ili proleka jedinjenja pronalaska ispitaniku, kome je to potrebno.

Drugi aspekt ovog pronalaska odnosi se na metodu inhibicije NS5B polimeraze HCV-a, inhibicije replikacije HCV-a ili lečenja HCV infekcije sa jedinjenjem ovog pronalaska, u kombinaciji sa jednim ili više agenasa, korisnih za lečenje HCV infekcije. Takvi agensi, koji su aktivni prema HCV-U, uključuju, ali se njima ne ograničavaju, ribavirin, levovirin, viramidin, timozin arfa-1, interferon-a, pegilovani interferon-cr (peginterferon-a), kombinaciju interferona-a i ribavirina, kombinaciju peginterferona-a i ribavirina, kombinaciju interferona-a i levovirina i kombinaciju peginterferona-a i levovirina. Interferon-a uključuje, ali bez ograničenja, rekombinantni interferon-a2a (kao što je Roferon interferon, koji je komercijalno dostupan posredstvom Hoffmann-LaRoche, Nutley, NJ), pegilovani interferon-a2a (Pegasys™), interferon-a2b (kao što je Intron-A interferon, koji je raspoloiživ posredstvom Schering Corp., Kenilworth, NJ), pegilovani interferon-a2b (Peglntron™), rekombinantni konsenzus interferon (kao što je interferon alfakon-1) i prečišćeni proizvod interferona-a. Amgenov rekombinantni konsenzus interferon ima brend ime Infergen®. Levovirin je L-enantiomer ribavirina, koji pokazuje imunomodulatomu aktivnost, sličnu ribavirinu. Viramidin predstavlja analog ribavirina, koji je izložen u WO 01/60379 (koji pripada ICN Pharmaceuticals). U skladu sa ovom metodom tekućeg pronalaska, pojedinačne komponente kombinovanog oblika, mogu biti primenjene zasebno, u različitim vremenskim intervalima, tokom trajanja terapije ili istovremeno u podeljenim formama ili u jedinstvenim kombinovanim oblicima. Tekući pronalazak, zato, treba shvatiti tako da obuhvata sve režime simultanog ili naizmeničnog lečenja, a izraz "primena" treba interpretirati u skladu s tim. Treba da bude shvaćeno da okvir kombinacija jedinjenja ovog pronalaska sa drugim agensima, koji su korisni u lečenju HCV infekcije, u principu, uključuje bilo koju kombinaciju sa bilo kojom farmaceutskom kompozicijom za lečenje HCV infekcije. Kada se jedinjenje ovog pronalaska ili njegova farmaceutski prihvatljiva so koristi u kombinaciji sa drugim terapeutskim agensom, koji je aktivan prema HCV-u, doza svakog jedinjenja može biti ili ista ili različita u odnosu na dozu, kada se jedinjenje koristi samo.

Za lečenje HCV infekcije, jedinjenja ovog pronalaska mogu se, isto tako, primeniti u kombinaciji sa agensom, koji je inhibitor HCV NS3 serin proteaze. HCV NS3 serin proteaza je esencijalni virusni enzim i opisan je kao odlična meta inhibicije replikacije HCV-a. Oba inhibitora HCV NS3 proteaze, i inhibitor, baziran na supstratu i onaj, koji nije baziran na supstratu, izloženi su u WO 98/22496, WO 98/46630, WO 99/07733, WO 99/07734, WO 99/38888, WO 99/50230, VVO 99/64442, WO 00/09543, WO 00/59929 i GB-2337262. HCV NS3 proteaza, kao meta za razvijanje inhibitora HCV replikacije i za lečenje HCV infekcije razmatrana je u B. W. Dvmock, "Emerging therapies for hepatitis C virus infection", Emerging Drugs, 6:13-42 (2001).

Ribavirin, levovirin i viramidin mogu vršiti svoje anti-HCV delovanje, moduliranjem intraćeiijskih pulova nukleotida gvanina, putem inhibicije intraćelijskog enzima inozirt monofosfat dehidrogenaze (IMPDH). IMPDH je enzim ograničavanja brzine na biosintetskom putu ude novobiosintezi gvanin nukleotida. Ribavirin se lako fosforiliše intraćelijski, a derivat monofosfata je inhibitor IMPDH-a. Zbog toga, inhibicija IMPDH-a predstavlja drugi koristan cilj za istraživanje inhibitora HCV replikacije. Iz tih razloga, jedinjenja ovog pronalaska, mogu se, takođe, primeniti u kombinaciji sa inhibitorom IMPDH-a, kao što je VX-497, koji je prikazan u VVO 97/41211 i VVO 01/00622 (koji pripada Vertex-u); drugim inhibitorom IMPDH-a, kao što je onaj, koji je izložen u WO 00/25780 (pripada Bristol-Myers Squibb-u); ili mikofenolat mofetilom [vidi A.C. Allison i E.M. Eugui, Agents Action, 44 (Suppl.): 165(1993)].

Za lečenje HCV infekcije, jedinjenja ovog pronalaska mogu se, isto tako, primeniti u kombinaciji sa antivirusnim agensom amantadinom (1-aminoadamantan) {za opširan opis ovog agensa, vidi J. Kirschbaum, Anal. Profiles Drua Subs. 12: 1-36 (1983)].

Izrazom "farmaceutski prihvatljiv" označava se da nosač, razblaživač ili, ekscipijent moraju biti kompatibilni sa drugim sastojcima formulacije, a ne štetni za primaoca iste.

Takodje su, u okvire ovog pronalaska uključene farmaceutske kompozicije, koje sadrže nukleozidna jedinjenja i njihove derivate iz ovog pronalaska, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Drugi primer pronalaska je farmaceutska kompozicija, pripremljena kombinovanjem bilo kog od, gore pomenutih, jedinjenja i farmaceutski prihvatljivog nosača. Druga ilustracija pronalaska je postupak izrade farmaceutske kompozicije, koji obuhvata spajanje bilo kog od prethodno opisanih jedinjenja i farmaceutski prihvatljivog nosača.

Unutar ovog pronalaska, takode su uključene farmaceutske kompozicije, koje su korisne za inhibiciju RNK-zavisne RNK virusne polimeraze, posebno HCV NS5B polimeraze, koje sadrže efektivnu količinu jedinjenja ovog pronalaska i farmaceutski prihvatljivog nosača. Farmaceutske kompozicije, korisne za lečenje RNK-zavisne RNK virusne infekcije, a posebno HCV infekcije, takodje su obuhvaćene ovim pronalaskom, kao i metoda inhibicije RNK-zavisne RNK virusne polimeraze, posebno HCV NS58 polimeraze, i metoda lečenja RNK-zavisne virusne replikacije, a posebno replikacije HCV-a. Dodatno, ovaj pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži terapeutski efektivnu količinu jedinjenja ovog pronalaska, u kombinaciji sa terapeutski efektivnom količinom drugog agensa, koji je aktivan prema RNK-zavisnom RNK virusu, posebno prema HCV. Agensi, koji su aktivni prema

HCV-U, uključuju, ali se njima ne ograničavaju, ribavirin, levovirin, viramidin, timozin alfa-1, inhibitor HCV NS3 serin proteaze, interferon-a, pegilovani interferon-a (peginterferon-a), kombinaciju interferona-a i ribavirina, kombinaciju peginterferona-a i ribavirina, kombinaciju interferona-a i levovirina i kombinaciju peginterferona-a i levovirina. Interferon-a uključuje, ali bez ograničenja, rekombinantni interferon-a2a (kao sto je Roferon interferon, koji se komercijalno dostupan posredstvom Hoffmann-LaRoche, Nutlev, NJ), interferon-a2b (kao stoje Intron-A interferon, koji je raspoloživ posredstvom Schering Corp., Kenilworth, NJ), konsenzus interferon i prečišćeni proizvod interferona-a. Za razmatranje ribavirina i njegove aktivnosti prema HCV-u, vidi J.O. Saunders i S.A. Ravbuck, "Inosine Monophosphate Dehvdrogenase: Consideration of Structure, Kinetics, and Therapeutics Potential." Ann. Re<p>. Med. Chem.. 35: 201-210 (2000).

Drugi aspekt ovog pronalaska obezbedjuje upotrebu nukleozidnih jedinjenja, njihovih derivata i njihovih farmaceutskih kompozicija, za izradu leka za inhibiciju RNK-zavisne RNK virusne replikacije, posebno HCV replikacije i/ili za lečenje RNK-zavisne RNK virusne infekcije, posebno HCV infekcije. Jedan dalji aspekt ovog pronalaska obezbedjuje nukleozidna jedinjenja, njihove derivate i njihove farmaceutske kompozicije, koji se koriste kao lek za inhibiciju RNK-zavisne RNK virusne replikacije, posebno HCV replikacije i/ili za lečenje RNK-zavisne RNK virusne infekcije, posebno HCV infekcije.

Farmaceutske kompozicije ovog pronalaska sadrže jedinjenje sa strukturnom formulom I, kao aktivni sastojak ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, a mogu, takodje, sadržavati farmaceutski prhvatljiv nosač i opciono druge terapeutske sastojke.

Kompozicije obuhvataju kompozicije, koje su pogodne za oralnu, rektalnu, površinsku, parenteralnu (uključujući subkutanu, intramuskularnu i intravensku), okulamu (oftalmičku), pulmonalnu (nazalnu ili bukalnu inhalaciju), ili nazalnu primenu, iako će najpogodniji put u bilo kom datom slučaju zavisiti od prirode i ozbiljnosti stanja, koje se leči i od prirode aktivnog sastojka. One mogu biti pogodno predstavljene u formi jedinične doze i pripremljene bilo kojom, u oblasti farmacije, dobro poznatom metodom.

Za praktičnu upotrebu, jedinjenja sa strukturnom formulom I mogu se kombinovati sa aktivnim sastojkom u bliskoj mešavini sa farmaceutskim nosačem, u skladu sa konvencionalnim tehnikama farmaceutskog sjedinjavanja. Nosač može poprimiti širok spektar oblika, u zavisnosti od forme pripreme, poželjne za primenu, npr., oralno ili parenteralno (uključujući intravensku primenu). U izradi kompozicija za oralne oblike doziranja, može se upotrebiti bilo koji od uobičajenih farmaceutskih medijuma, kao što su, na primer, voda, glikoli, ulja, alkoholi, agensi za ukus, konzervansi, agensi za boju i slično, u slučaju oralnih tečnih preparata, kao što su, primera radi, suspenzije, eliksiri i rastvori; ili nosači, kao što su škrob, šećeri, mikrokristalna celuloza, razblalivači, granulišuci agensi, lubrikanti, vezujući agensi, dezintegrišući agensi i slično, u slučaju oralnih čvrstih preparata, kao što su, na primer, prašci, tvrde i meke kapsule i tablete, pri čemu su čvrsti oralni preparati poželjniji u odnosu na tečne preparate.

Zbog njihove jednostavne primene, tablete i kapsule predstavljaju najpogodniju oralnu formu dozne jedinice, u kom slučaju su očigledno uključeni čvrsti farmaceutski nosači. Ukoliko se to želi, tablete mogu biti presvučene standardnim vodenim ili ne-vodenim tehnikama. Takve kompozicije i preparati sadrže najmanje 0.1 procenat aktivnog jedinjenja. Procenat aktivnog jedinjenja u ovim kompozicijama može, naravno, varirati, a pogodno može biti između približno 2 procenta do oko 60 procenata težine jedinice. Količina aktivnog jedinjenja u takvim, terapeutski korisnim, smešama jeste takva da se postiže efektivna dozaža. Aktivno jedinjenje se, takodje, može primeniti intranazalno, kao, na primer, u vidu tečnih kapi ili spreja.

Tablete, pilule, kapsule i slično, mogu isto tako sadržavati vezujući agens, kao što je lepak tragakant, akacija, kukuruzni škrob ili želatin; ekscipijente, kao što je dikalcijum fosfat; dezintegrišući agens, kao što je kukuruzni škrob, krornpirov škrob, alginska kiselina; lubrikant, kao što je magnezijum stearat i agens za zasladjivanje, kao što je saharoza, laktoza ili saharin. Kada je forma dozne jedinice kapsula, ona može sadržavati, pored materijala, gore navedenog tipa, i težni nosač, kao što je masno ulje.

Različiti drugi materijali mogu biti prisutni kao omotači ili kao materijali za modifikovanje fizičke forme jedinice doze. Na primer, tablete mogu biti omotane šelakom, šećerom ili sa oboje. Sirup ili eliksir može sadržavati, pored aktivnog sastojka, saharozu, kao agens za zasladjivanje, metil i propilparabene kao konzervanse, boju i agens za ukus, kao stoje ukus višnje ili pomorandže.

Jedinjenja sa strukturnom formulom I mogu, takodje, biti primenjena parenteraino. Rastvori ili suspenzije ovih aktivnih jedinjenja mogu biti pripremljeni u vodi, pogodno se mešajuci sa surfaktantom, kao što je hidroksi-propilceluloza. Disperzije se, takodje, mogu pripremiti u glicerolu, tečnim polietilen glikolima i njihovim mešavinama u uljima. Pod uobičajenim uslovima čuvanja i korišćenja, ovi preparati sadrže konzervans, da bi se sprečio porast mikroorganizama.

Farmaceutske forme, koje su pogodne za injekcijsku upotrebu, uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za brzu pripremu sterilnih rastvora ili disperzija za injekcije. U svim slučajevima, forma mora biti sterilna i mora biti tečna do granice kada postaje jednostavna za ubrizgavanje. Mora biti stabilna pod uslovima izrade i skladištenja i mora biti čuvana od kontaminacijskog učinka mikroorganizama, kao što su bakterije i gljivice. Nosač može biti rastvarač ili disperzivni medijum, koji, prirnera radi, sadrži, vodu, etanol, poliol (npr., glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol), njihove pogodne smeše i biljna ulja.

Za primenu sisarima, posebno ljudima, može se upotrebiti pogodan put primene, sa efektivnom dozom jedinjenja ovog pronalaska. Na primer, može se koristiti oralni, rektalni, površinski, parenteralni, okulami, pulmonalni, nazalni i sličan put. Forme dozaže uključuju tablete, pastile, disperzije, suspenzije, rastvore, kapsule, kremove, masti, aerosole i slično. Poželjno, jedinjenja sa strukturnom formulom I se primenjuju oralno.

Za oralnu primenu ljudima, raspon dozaže je 0.01 do 1000 mg/kg telesne teižine u podeljenim dozama. U jednom ostvarenju dozni raspon je 0.1 do 100 mg/kg telesne težine u podeljenim dozama. U drugom ostvarenju dozni raspon je 0.5 do 20 mg/kg telesne težine u podeljenim dozama. Za oralnu primenu, kompozicije su poželjno obezbedjene u formi tableta ili kapsula, koje sadrže 1.0 do 1000 miligrama aktivnog jedinjenja, posebno, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75,100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 750, 800, 900 i 1000 miligrama aktivnog sastojka za simptomatsko doterivanje dozaže pacijentu, koji se leči.

Efektivna dozaža aktivnog sastojka, koja je upotrebljena, može varirati, u zavisnosti od pojedinog, upotrebljenog jedinjenja, načina primene, stanja, koje se leči i ozbiljnosti lečenog stanja. Takva dozaža se može prilagoditi, da bi se postigao optimalni terapeutski odgovor.

Jedinjenja ovog pronalaska sadrže jedan ili više asimetričnih centara i zato, mogu postojati kao racemati i racemske smeše, pojedinačni enantiomeri, mešavine diastereomera i kao pojedinačni diastereoizomeri. Odredjeno je da se ovim pronalaskom obuhvate nukleozidna jedinjenja, koja imaju 8-D stereohernijsku konfiguraciju za peto-člani furanozni prsten, kao što je prikazano na strukturnoj formuli ispod, koja predstavlja nukleozidna jedinjenja, u kojima supstituenti na C-1 i C-4 peto-članog prstena imaju B-stereohemijsku konfiguraciju (orijentacija "na gore", kao što je naznačeno podebljanom linijom).

Neka od ovde opisanih jedinjenja sadrže olefinske dvostruke veze, i ukoliko nije drugačije odredjeno, smatra se da su uključena oba, i E i Z geometrijska izomera.

Neka od ovde opisanih jedinjenja mogu postojati kao tautomeri, kao što su keto-enolni tautomeri. Pojedinačni tautomeri, kao i njihove mešavine, obuhvaćene su zajedno sa jedinjenjima strukturne formule I.

Primer keto-enolnih tautomera, određenih da budu obuhvaćeni u okviru jedinjenja ovog pronalaska, ilustrativno su prikazani dole:

Jedinjenja sa strukturnom formulom I mogu se izdvojiti u svoje pojedinačne stereoizomere, na primer, frakcionom kristalizacijom, iz pogodnog rastvarača, na primer, metanola, etil acetata ili njihovih mešavina, ili hiralnom hromatografijom, koristeći optički aktivnu stacionarnu fazu.

Alternativno, bilo koji stereoizomer jedinjenja sa strukturnom formulom I može se dobiti stereospecifičnom sintezom, korišćenjem optički čistih polaznih materijala ili reagenasa poznate konfiguracije.

Stereohemija supstituenata na položajima C-2 i C-3 furanoznog prstena jedinjenja ovog pronalaska sa strukturnom formulom I je naznačena uvijenim linijama, koje označavaju da supstituenti R1, R<2>, R<3>i R<4>mogu imati ili a (supstituent "dole") ili (3 (supstituent "gore") konfiguraciju, nezavisno jedan od drugog. Označavanje stereohemije podebljanom linijom, kao na, položajima C-1 i C-4 furanoznog prstena, pokazuje da supstituent ima 0-konfiguraciju (supstituent "gore").

Jedinjenja ovog pronalaska mogu biti primenjena u obliku farmaceutski prihvatljive soli. Izraz "farmaceutski prihvatljiva so" odnosi se na soli, koje su pripremljene iz farmaceutski prihvatljivih ne-toksičnih baza ili kiselina, uključujući neorganske ili organske baze i neorganske ili organske kiseline. Soli baznih jedinjenja, koje su obuhvaćene izrazom "farmaceutski prihvatljiva so", odnose se na ne-toksične soli jedinjenja ovog pronalaska, koje se uopšteno, pripremaju reakcijom slobodne baze sa pogodnom organskom ili neorganskom kiselinom. Rerezentativne soli baznih jedinjenja ovog pronalaska uključuju, ali se njima ne ograničavaju, sledeće: acetat, benzensulfonat, benzoat, bikarbonat, bisulfat, bitartarat, borat, bromid, kamsilat, karbonat, hlorid, klavulanat, citrat, dihidrohlorid, edetat, edisilat, estolat, esilat, fumarat, giuceptat, giukonat, glutamat, glikolilarsanilat, heksilrezorcinat, hidrabamin, hidrobromid, hidrohlorid, hidroksinaftoat, jodid, izotionat, laktat, laktobionat, laurat, malat, maleat, mandelat, meziiat, metilbromid, metilnitrat, metilsulfat, mučat, napsilat, nitrat, amonijumova so N-metilglukamina, oleat, oksalat, pamoat (embonat), palmitat, pantotenat, fosfat/difosfat, poiigalakturonat, salicilat, stearat, sulfat, subacetat, sukcinat, tanat, tartarat, teoklat, tozilat, trietjodid i valerat. Dalje, u slučajevima, kada jedinjenja pronalaska nose kiseli deo, njihove pogodne farmaceutski prihvatljive soli uključuju, ali bez ograničenja, soli, dobijene iz neorganskih baza, uključujući baze aluminijuma, amonijaka kalcijuma, bakra, feri, fero, litijuma, magnezijuma, mangani, mangano, kalijuma, natrijuma, cinka i slične. Posebno poželjne su amonijum soli, soli kalcijuma, magnezijuma, kalijuma i natrijuma. Soli, koje su dobijene iz farmaceutski prihvatljivih organskih ne-toksičnih baza, uključuju soli primarnih, sekundarnih i tercijarnih amina, cikličkih amina i baznih jon-izmenjivačkih smola, kao što je arginin, betain, kafein, holin, N,N-dibenziettilendiamin, dietilamin, 2-dietilaminoetanol, 2-dimetilaminoetanol, etanolamin, etilendiamin, N-etilmorfolin, N-etiipiperidin, glukamin, glukozamin, histidin, hidrabamin, izopropilamin, lizin, metilglukamin, morfolin, piperazin, piperidin, poliamin smole, prokain, purini, teobromin, trietilamin, trimetilamin, tripropilamin, trometamin i slično.

Isto tako, u slučaju, kada su na jedinjenjima ovog pronalaska prisutne grupe karboksilne kiseline (-COOH) ili alkoholne grupe, mogu biti uključeni farmaceutski prihvatljivi estri derivata karboksilne kiseline, kao što su metil, etil ili pivaloiloksimetil ili acil derivati alkohola, kao što su acetat ili maleat. Uključeni su oni estri i acil grupe, koje su poznate u ovoj oblasti, za modifikovanje rastvorljivosti ili hidroliznih karakteristika, za korišćenje u vidu formulacija sa kontinuiranim oslobađanjem ili formulacija proieka.

Izrada nukleozidnih jedinjenja i derivata pronalaska

Nukleozidna jedinjenja i njihovi derivati ovog pronalaska mogu se pripremiti sledeći sintetske metodologije, koje su dobro utvrđene u praksi nukieozidne i nukieotidne hernije. Referenca se odnosi na sledeći tekst sa opisom sintetskih metoda, koje su korišćene u izradi jedinjenja ovog pronalaska: "Chemistrv of Nucleosides and Nucleotides," LB. Tovvnsend, ed., Vols. 1-3, Plenum Press, 1988, koji kao referenca ovde sadržan u svojoj celosti.

Reprezentativni opšti metod za izradu jedinjenja ovog pronalaska prikazan je u Šemi 1, ispod. Ova šema ilustruje sintezu jedinjenja ovog pronalaska sa strukturnom formulom 1£7, gde furanozni prsten ima p-D-ribo konfiguraciju. Polazni materijal je 3,5-bis-O-zaštićeni alkil furanozid, kao što je metil furanozid sa strukturnom formulom V^. C-2 hidroksil grupa se zatim oksiduje sa pogodnim oksidujućim agensom, kao što je hrom trioksid ili hromat reagens, Dess-Martin perjodinan, ili Svvernovom oksidacijom, da bi se dobio C-2 keton sa strukturnom formulom 1_£. Adicija Grignardovog reagensa, kao što je alkil, alkenil ili alkinil magnezijum halid (na primer, MeMgBr, EtMgĐr, vinilMgBr, aiilMgBr i etinilMgBr), ili alkil, alkenil ili alkinil litijum, kao što je MeLi, preko karbonilne dvostruke veze jedinjenja 1^2, u pogodnom organskom rastvaraču, kao što je tetrahidrofuran, dietiletar i slično, proizvodi C-2 tercijarni alkohol sa strukturnom formulom 1<3. Zatim se uvodi dobra odlazeća grupa (kao što je Cl, Br i J), na C-1 (anomerički) položaj furanoznog šećernog derivata, obradom furanozida sa formulom 1^3, sa vodonik halidom, u pogodnom organskom rastvaraču, kao što je vodonik bromid u sirćetnoj kiselini, da bi se dobio intermedijer furanozil halid 1^. C-1 sulfonat, kao što je metansulfonat (MeS020-), trifluorometansulfonat (CF3S020-) ili p-toluensulfonat (-OTs), takođe, može poslužiti kao korisna odlazeća grupa u reakciji, koja sledi, da bi se stvorila glukozidna (nukleozidna) veza. Nukleozidna veza se izgradi obradom intermedijera sa strukturnom formulom 1j4, sa soli metala (kao što je litijum, natrijum ili kalijum) pogodno supstituisanog 1 #pirolo[2,3-d]pirimidina V5, kao što je pogodno supstituisani 4-halo-l/i<t>pirolo[2,3-d]pirimidin, koji se proizvodiin situ,obradom sa alkalnim hidridom (kao što je natrijum hidrid), alkalnim hidroksidom (kao što je kalijum hidroksid), alkanim karbonatom (kao što je kalijum karbonat), ili sa alkalnim heksametildisilazidom (kao što je NaHMDS), u pogodnom bezvodnom organskom rastvaraču, kao što je acetonitril, tetrahidrofuran, 1 -metil-2-pirolidinon ili N,N-dimetilformamid (DMF). Reakcija zamene može biti katalizovana, korišćenjem katalizatora faznog transfera, kao što je TDA-1 ili trietiibenzil-amonijum hlorid, u dvo-faznom sistemu (čvrsta faza-tečnost ili tečnost-tečnost). Opcione zaštitne grupe u zaštićenom nukleozidu sa strukturnom formulom JH3, zatim se uklanjaju sledeći utvrđene metodologije deprotekcije, kao što su one, koje su opisali T.W. Greene i P.G.M. Wuts, u "Protective Groups in Organic Synthesis," 3. izdanje, John Wiley & Sons, 1999. Opciono uvođenje amino grupe na 4-položaj pirolo[2,3-d]pirimidinskog jezgra izvodi se obradom 4-halo intermedijera 1^6, sa pogodnim aminom, kao što je alkoholni amonijak ili tečni amonijak, da bi se proizveo primarni amin na C-4 položaju (-NH2), sa alkilaminom da bi se proizveo sekundarni amin (-NHR), ili sa dialkilaminom, da bi se proizveo tercijarni amin (-NRR'). Jedinjenje 7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4(3H)ona može se dobiti hidrolizom jedinjenja rj>, sa vodenom bazom, kao što je vodeni natrijum hidroksid. Alkoholizom (kao što je metanoliza) jedinjenja ;H5, dobije se C-4 aikoksid (-OR), dok se obradom sa alkil merkaptidom dobije C-4 alkiltio (-SR) derivat. Da bi se dobila željena jedinjenja ovog pronalaska, mogu biti potrebne sledeće hemijske manipulacije, koje su dobro poznate licima, upućenim u praktičnu oblast organsko/medicinske hernije.

Primeri, koji slede, daju navode iz literaturnih publikacija, koji sadrže detalje za izradu konačnih jedinjenja ili intermedijera, koji su uključeni u izradu finalnih jedinjenja ovog pronalaska. Nukleozidna jedinjenja ovog pronalaska pripremljena su prema postupcima, koji su detaljno opisani u sledećim primerima. Namera nije da primeri budu ograničenje okvira tekućeg pronalaska na bilo koji način, tako da ne bi trebali biti tako shvaćeni. Lica, koja su upućena u oblast sinteze nukleozida i nukleotida, lako će proceniti da se za izradu ovih i drugih jedinjenja ovog pronalaska, mogu koristiti poznate varijacije uslova i postupaka iz sledećih preparativnih procedura. Sve. temperature su u stepenima Celzijusa, ukoliko nije drugačije navedeno.

PRIMER 1

4- amino- 7-( 2- g- metil- B- D- arabinofuranozil)- 7/ Te- pirolor2, 3- o1 pirimidin

U hrom trioksid (1.57 g, 1.57 mmol) u dihlorometanu (DCM) (10 mL), dodaje se, na 0°C, anhidrid sirćetne kiseline (145 mg, 1.41 mmol), a zatim piridin (245 mg, 3.10 mmol). Smeša se meša tokom 15 minuta, a zatim se dodaje 7-[3,5-0-[1,1,3,3-tetrakis(1-metiletil)-1,3-disiloksandiii]-p-D-ribofuranozii]-7/^pirolo[2,3-^|pirimidin-4-amin [za izradu, vidi J. Am. Chem. Soc. 105:4059 (1983)] (508 mg, 1.00 mmol) u DCM-u (3 mL). Nastali rastvor se meša tokom 2 h, a zatim ulije u etil acetat (10 mL) i onda filtrira preko silika gela, koristeći etil acetat kao eiuent. Sjedinjeni fiitrati se uparein vacuo,stave se u dietil etar/THF (1:1) (20 mL), ohlade do -78°C i dodaje se, kap po kap, metilmagnezijum bromid (3M, u THF) (3.30 mL, 10 mmol). Smeša se meša na -78°C, tokom 10 minuta, onda se ostavi da se zagreje do sobne temperature (rt), a zatim se ugasi dodatkom zasićenog vodenog amonijum hlorida (10 mL) i ekstrahuje se sa DCM-om (20 mL). Organska faza se upariin vacuo,a sirovi proizvod se prečisti na silika gelu, koristeći 5%-tni metanol u dihlorometanu kao eluent. Frakcije, koje sadrže proizvod se sjedine i uparein vacuo.Nastalo ulje se stavi u THF (5 mL) i dodaje se tetrabutilamonijum fluorid (TBAF) na silikatu (1.1 mmol/g na silikatu) (156 mg). Smeša se meša na rt tokom 30 minuta, filtrira se i upariin vacuo.Sirovi proizvod se prečisti na silika gelu, koristeći 10%-tni metanol u dihlorometanu kao eluent. Frakcije, koje sadrže proizvod se sjedine i uparein vacuo,da bi se dobilo željeno jedinjenje (49 mg), u vidu bezbojne čvrste mase.

'H NMR (DMSO-O0: 5 1.08 (s, 3H), 3.67 (m. 2H), 3.74 (m, 1H), 3.83 (m, 1H), 5.19 (m, 1H), 5.23 (m, 1H), 5.48 (m, 1H), 6.08 (1H, s), 6.50 (m, 1H). 6.93 (bs, 2H), 7.33 (m, 1H), 8.02 (s, 1H).

PRIMER 2

4- amino- 7-( 2- g- metil- B- D- irbofuranozil)- 7/ S'- pirolor2, 3- oJ| pirimidin

Korak A: 3, 5- bis- C^( 2, 4- dihlorofenilmetin- 1- ametil- g- D- ribofurano2a

Smeša 2-Oacetil-3,5-bis-CJ-(2,4-dihlorofenilmetil)-1 -Ometil-a-D-ribofuranoze [za izradu, vidi: Helv. Chim. Acta 78:486 (1995)] (52.4 g, 0.10 mol) u metanolnom K2C03(500 mL, zasićen na rt) meša se na sobnoj temperaturi tokom 45 minuta, a zatim ukoncentriše, pod smanjenim pritiskom. Uljani ostatak se suspenduje u CH2CI2(500 mL), ispere vodom (300 mL + 5 X 200 mL) i slanim rastvorom (200 mL), osuši (Na-jSO«), flitrira i ukoncentriše, da bi se dobilo naslovljeno jedinjenje (49.0 g), u vidu bezbojnog ulja, koje se koristi, bez daljeg prečišćavanja, u koraku B, koji sledi.

'H NMR (DMSO-o^: 5 3.28 (s, 3H, OCH3), 3.53 (d, 2H. J54=4.5 Hz, H-5a, H-5b), 3.72 (dd, 1H, ^4=3.6 Hz, 4^=6.6 Hz. H-3), 3.99 (ddd, 1H.Jv=4. 5Hz.^^. 6Hz, H-2), 4.07 (m, 1H, HA), 4.50 (s. 2H, CHfh), 4.52, 4.60 (2d, 2H,v/B„-13.6 Hz.CHfh),4.54 (d. 1H, OH-2), 4.75 (d, 1H, H-1), 7.32-7.45, 7.52-7.57 (2m, 1QH, 2Ph).

<13>C NMR (DMSO-o^: 5 55.40, 69.05, 69.74, 71.29, 72.02, 78.41, 81.45. 103.44. 127.83, 127.95, 129.05, 129.28, 131.27, 131.30, 133.22, 133.26, 133.55. 133.67. 135.45, 135.92.

Korak B: 3, 5- bis- Q-( 2, 4- dihlorofenilmetil)- 1- ć>metil-

a- D- gA/ frp- pentofuranoz- 2- uloza

Ledeno-hladnoj suspenziji Dess-Martinovog perjodinana (50.0 g, 118 mmol) u anhidrovanom CH2CI2(350 mL), pod argonom (Ar), dodaje se rastvor jedinjenja iz Koraka A (36.2 g, 75 mmol) u bezvodnom CH2CI2(200 mL), kap po kap, tokom 0.5 h. Reakciona smeša se meša na 0°C, tokom 0.5 h, a zatim na sobnoj temperaturi tokom 3 dana. Smeša se razblaži sa anhidrovnim Et20 (600 mL) i ulije na ledeno-hladnu smešu Na2S203.5H20 (180 g) u zasićenom vodenom NaHC03(1400 mL). Izdvoje se slojevi, a organski sloj se ispere zasićenim vodenim rastvorom NaHC03(600 mL), vodom (800 mL) i slanim rastvorom (600 mL), osuši se (MgSOJ, filtrira i upari, da bi se dobilo naslovljeno jedinjenja (34.2 g), u vidu bezbojnog ulja, koje se koristi, bez daljeg prečišćavanja, u narednom koraku C.

<1>H NMR (CDClj): 5 3.50 (s, 3H, OCHJ, 3.79 (dd. 1H, ^»=11.3 Hz, ^=3.5 Hz, H-5a), 3.94 (dd, 1H,4„.4=2.3Hz, H-5b), 4.20 (dd, 1H, 4,=1.3 Hz, 4.4=8.4 Hz, H-3). 4.37 (ddd, 1H. H-4). 4.58. 4.69 (2d, 2H, ^=13.0Hz, C/%Ph), 4.87 (d, 1H, H-1), 4.78, 5.03 (2d, 2H. ^=12.5 Hz, C//2Ph), 7.19-7.26, 7.31-7.42 (2m, 10H. 2Ph).

,3C NMR (DMSO-c/«): 8 55.72, 69.41, 69.81, 69.98, 77.49, 78.00, 98.54, 127.99, 128.06, 129.33, 129.38, 131.36, 131.72, 133.61, 133.63, 133.85, 133.97, 13472, 135.32, 208.21.

Korak C: 3, 5- bis- 0-( 2, 4- dihlorofenilmetii)- 2- g- metil- 1- 0- metil-

g- D- ribofuranoza

Rastvoru MeMgBr u anhidrovanom EtzO (0.48 N, 300 mL), na -55°C, dodaje se, kap po kap, rastvor jedinjenja iz Koraka B (17.40 g, 36.2 mmol) u anhidrovanom EtsO (125 mL). Reakciona smeša se ostavi da se zagreje do -30°C i meša se tokom 7 h na temperaturi od -30°C do -15°C, zatim se ulije u ledeno-hladnu vodu (500 mL) i smeša se snažno meša na sobnoj temperaturi tokom 0.5 h. Smeša se filtrira preko čepa od celita (10 X 5 cm), koji se potpuno ispere sa Et20. Organski sloj se osuši (MgSOJ, filtrira i ukoncentriše. Ostatak se rastvori u heksanima (~30 mL), nanese na kolonu od silikatnog gela (10 X 7 cm, prepakovanu u heksanima), i eluira sa heksanima i heksani-EtOAc-om (9/1), da bi se naslovljeno jedinjenje (16.7 g) dobilo u vidu bezbojnog sirupa.

'H NMR (CDCl,): 8 1.36 (d, 3H,J^ o* =0- 9Hz, 2C-Me), 3.33 (q. 1H, OH), 3.41 (d, 1H,c/34=3.3 Hz), 3.46 (s, 3H. OCBj), 3.66 (d, 2H,^=3.7Hz, H-5a, H-5b), 4.18 (očito q, 1H, H-4), 4.52(s, 1H, H-1), 4.60 (s, 2H, CHfh), 4.63, 4.81 (2d, 2H,«/gm=13.2Hz, C//2Ph), 7.19-7.26, 7.34-7.43 (2m, 10H, 2Ph).

<13>C NMR (CDCI3): 5 24.88, 55.45, 69.95, 70.24, 70.88, 77.06, 82.16. 83.01, 107.63, 127.32. 129.36, 130.01, 130.32, 133.68, 133.78, 134.13, 134.18, 134.45, 134.58.

Korak D: 4- hloro- 7- r3, 5- bis- 0-( 2, 4- dihlorofenilmetil)- 2- g- metil-3- D- ribofuranozin- 7//- pirolor2, 3-^| pirimidin

Rastvoru jedinjenja iz Koraka C (9.42 g, 19 mmol) u anhidrovanom dihlorometanu (285 mL), dodaje se, na 0°C, kap po kap, HBr (5.7 M u sirćetnoj kiselini, 20 mL, 114 mmol). Nastali rastvor se meša na 0°C, tokom 1 h, a zatim na rt tokom 3 h, upari sein vacuo,i ko-evaporiše sa anhidrovanim toluenom (3 X 40 mL). Uljani ostatak se rastvori u bezvodnom acetonitrilu (50 mL) i dodaje se u rastvor natrijumove soli 4-h!oro-1/fpirolo[2,3-ćflpirimidina u acetonitrilu [proizvedenin situiz 4-hloro-1 Mpirolo[2,3-d]pirimidina [za izradu, vidi: J. Chem. Soc.: 131 (1960)] (8.76 g, 57 mmol) u anhidrovanom acetonitrilu (1000 mL) i NaH (60% u mineralnom ulju, 2.28 g, 57 mmol), nakon 4 h snažnog mešanja na rt]. Sjedinjena mešavina se meša na rt tokom 24 h, a zatim se upari do suvog stanja. Ostatak se suspenduje u vodi (250 mL) i ekstrahuje sa EtOAc (2 X 500 mL). Sjedinjeni ekstrakti se isperu slanim rastvorom (300 mL, osuše iznad NagSO^filtriraju i upare. Sirovi proizvod se prečisti na koloni od silika gela (10 cm x 10 cm), koristeći etil acetat/heksan (1:3 i 1:2), kao eluent. Frakcije, koje sadrže proizvod, sjedine se i upare in vacuo, da bi se dobio željeni proizvod (5.05 g), u vidu bezbojne pene.

<1>H NMR {CDCL,): 5 0.93 (s, 3H, CHJ, 3.09 (s, 1H, OH), 3.78 (dd, 1H. ^.=10.9 Hz, ^4=2.5 Hz, H-5'), 3.99 (dd, 1H, 4-,4=2.2 Hz, H-5"), 4.23-4.34 (m, 3H, H-3\ H-4'), 4.63, 4.70 (2d, 2H, 4m=12.7 Hz,CHfh).4.71, 4.80 (2d, 2H, ^„=12.1 Hz, CA/2Ph) 6.54 (d, 1H, «/se=3.8 Hz, H-5), 7.23-7.44 (2m, 10H, 2Ph).

<13>C NMR (CDCl,): 5 21.31, 69.10, 70.41, 70.77, 79.56, 80.41, 81.05, 91.11, 100.57, 118.21, 127.04, 127.46, 127.57, 129.73, 129.77, 130.57, 130.99, 133.51, 133.99, 134.33, 134.38, 134.74, 135.21, 151.07, 151.15, 152.47.

Korak E: 4- hloro- 7-( 2- g- metil- B- D- ribofuranozil)- 7AZ- oirolo[ 2, 3- 01 pirimidin

Rastvoru jedinjenja iz Koraka D (5.42 g, 8.8 mmol) u dihlorometanu (175 mL), dodaje se, na -78°C, kap po kap, bor trihlorid (1M u dihlorometanu, 88 mL, 88 mmol). Smeša se meša na -78°C tokom 2.5 h, a zatim na -30°C do -20°C tokom 3 h. Reakcija se prekida dodatkom metanol/dihlorometana (1:1) (90 mL), nastala mešavina se meša na -15°C tokom 30 minuta, a zatim neutrališe sa vodenim amonijakom na 0°C i meša na rt tokom 15 minuta. Čvrsta faza se filtrira i ispere sa Cr-^CIs/MeOH (1/1, 250 mL). Sjedinjeni filtrat se upari, a ostatak se prečisti fleš hromatografijom preko silika gela, koristeći gradijent CH2CI2i CH2CI2:MeOH (99:1, 98:2, 95:5 i 90:10), kao eluent, da bi se dobilo željeno jedinjenje (1.73 g) u vidu bezbojne pene, koja posle obrade sa MeCN prelazi u amorfnu čvrstu masu.<1>H NMR (DMSO-ag: 8 0.64 (s. 3H, CH^. 3.61-3.71 (m, 1H, H-5'), 3.79-3.88 (m, 1H. H-5"), 3.89-4.01 (m, 2H. H-3\ H-4'), 5.15-5.23 (m, 3H, 2'-OH, 3'-OH. 5"-OH), 6.24 (s, 1H, H-1'), 6.72 (d, 1H,«/„=3-8Hz, H-5), 8.13 (d, 1H, H-6), 8.65 (s. 1H, H-2).

,3CNMR(DMSO-ay:520.20,59.95, 72.29, 79.37, 83.16, 91.53. 100.17, 117.63, 128.86, 151.13. 151.19, 151.45.

Korak F: 4- amino- 7-( 2- C^ metil- 3- D- ribofuranozil)- 7/ ¥pirolor2, 3- o1 pirimidin

Jedinjenju iz Koraka E (1.54 g, 5,1 mmol) dodaje se metanolni amonijak (zasićen na 0°C; 150 mL). Smeša se zagreva u autoklavu od nerđajućeg čelika, na 85°C, tokom 14 h, a zatim se ohladi i upariin vacuo.Sirova smeša se prečisti na koloni od silika gela, sa CH2Cl2/MeOH (9/1) kao eluentom, da bi se dobilo naslovljeno jedinjenje u vidu bezbojne pene (0.8 g), koja se, posle obrade sa MeCN, izdvaja kao amorfna čvrsta masa. Amorfna čvrsta masa se rekristališe iz metanol/acetonitriia; m.p. 222°C.

'H NMR (DMSO-flQ8 0.62 (s, 3H, CH3). 3.57-3.67 (m, 1H. H-5<1>). 3.75-3.97 (m. 3H, H-5". H-4', H-3'), 5.00 (s, 1H, 2'-OH), 5.04 (d, 1H, ^,^6.8 Hz, 3'-OH), 5.06 (t, 1H, ^oh.s.s-^-1 Hz, 5'-OH), 6.11 (s, 1H, H-1'), 6.54 (d, 1H, ^se=3.6 Hz, H-5), 6.97 (br s, 2H, NHa), 7.44 (d, 1H, H-6), 8.02 (s, 1H, H-2).

,<3>C NMR (DMSO-d^ 8 20.26. 60.42, 72.72. 79.30, 82.75, 91.20, 100.13, 103.08. 121.96, 150.37, 152.33, 158.15.

LC-MS: Utvrđeno:279.10 (M-H<*>); izračunato za C12H18N404+H<+>: 279.11.

PRIMER 3

4- amino- 7-( 2- CLetil- 3- D- ribofuranozil)- 7AApirolof2, 3- o1pirimidin

Korak A: 3, 5- bis- C^( 2. 4- dihlorofenilrnetin- 2- g- etil- 1- č>metil- g- D- ribofurano2a Dietil etru (300 mL) se dodaje, na -78°C, polako, EtMgBr (3.0 M, 16.6 mL), a zatim, kap po kap, jedinjenje iz Koraka B iz Primera 2 (4.80 g, 10.0 mmol) u anhidrovanom Et20 (100 mL). Reakciona smeša se meša na -78°C, tokom 15 minuta, zatim se ostavi da se zagreje do -15°C i meša se tokom naredna 2 h, a zatim se ulije u izmešanu smešu vode (300 mL) i EtaO (600 mL). Organska faza se izdvoji, osuši (MgSOJ i upariin vacuo.Sirovi proizvod se prečisti na silika gelu, koristeći etil acetat/heksan (1:2), kao eluent. Frakcije, koje sadrže proizvod, se sjedine i uparein vacuo,da bi se dobio željeni proizvod (3.87 g), u vidu bezbojnog ulja.

Korak B: 4- hloro- 7- r3, 5- bis- 0-( 2, 4- dihlorofenilmetil)- 2- g- etil-B- D- ribofuranozil1- 7/^ pirotof2, 3- o1pirimidin

Rastvoru jedinjenja iz Koraka A (1.02 mg, 2.0 mmol) u dihlorometanu (40 mL), dodaje se, na 0°C, kap po kap, HBr (5.7 M u sirćetnoj kiselini) (1.75 mL, 10.0 mmol). Nastali rastvor se meša na sobnoj temperaturi, tokom 2 h, upari sein vacuo,i ko-evaporiše dva puta iz toluena (10 mL). Uljani ostatak se rastvori u acetonitrilu (10 mL) i dodaje se u snažno izmešanu smešu 4-hloro-1/^pirolo[2,3-o]pirimidina (307 mg, 2.0 mmol), kalijum hidroksida (337 mg, 6.0 mmol) i tris[2-(2-metoksietoksi)etil]amina (130 mg, 0.4 mmol) u acetonitrilu (10 mL). Nastala smeša se meša na rt, preko noći, a zatim se ulije u izmešanu smešu zasićenog amonijum hlorida (100 mL) i etil acetata (100 mL). Organski sloj se izdvoji, ispere slanim rastvorom (100 mL), osuši iznad MgS04, filtrira i upariin vacuo.Sirovi proizvod se prečisti na koloni od silika gela, koristeći etil acetat/heksan (1:2) kao eluent, da bi se dobio željeni proizvod (307 mg), u vidu bezbojne pene.

Korak C: 4- hloro- 7-( 2- C^ til- B- D- ribofuranozin- 7^ pirolor2, 3- Qlpirimidin

Rastvoru jedinjenja iz Koraka B (307 mg, 0.46 mmol) u dihlorometanu (8 mL), dodaje se, na -78°C, bor trihlorid (1M u dihlorometanu) (4.50 mL, 4.50 mmol). Smeša se meša na -78°C, tokom 1 h, a zatim, na -10°C tokom 3 h. Reakcija se prekida dodatkom metanol/dihlorometana (1:1) (10 mL), meša se na -15°C tokom 30 minuta i neutrališe dodatkom vodenog amonijum hidroksida. Smeša se upari pod smanjenim pritiskom, a nastalo ulje se prečisti na silika gelu, koristeći, kao eluent, metanol/dihlorometan (1:9). Frakcije, koje sadrže proizvod se sjedine i uparein vacuo,da bi se dobio željeni proizvod (112 mg), u vidu bezbojne pene.

Korak D: 4- amino- 7-( 2-( ?- etil- B- D- ribofuranozin- 7A( c- pirolof2, 3- o1 pirimidin

Jedinjenju iz Koraka C (50 mg, 0.16 mmol) dodaje se zasićeni amonijak u metanolu (4 mL). Smeša se meša na 75°C tokom 72 h, u zatvorenom kontejneru, ohladi se i upariin vacuo.Sirova smeša se prečisti na silika gelu, koristeći, kao eluent, metanol/dihlorometan (1:9). Frakcije, koje sadrže proizvod se sjedine i uparein vacuo,da bi se dobio željeni proizvod (29 mg), u vidu bezbojnog praška.

'H NMR (200 MHz, DMSO-o^: 5 0.52 (t, 3H), 1.02 (m, 2H), 4.01^3.24 (m, 6H), 5.06 (m, 1H), 6.01 (s, 1H), 6.51 (d, 1H), 6.95 (s br, 2H), 6.70 (d, 1H). 7.99 (s,1H).

LC-MS: Utvrđeno: 295.2 (M+H<+>); izračunato za C13H18N404+H<+>: 295.14.

PRIMER 4

2' amino- 7-( 2-( >metil- B- D- ribofuranozil)- 7/-/- pirolor2. 3- o1pirimidin- 4f3H)- on

Korak A: 2- amino- 4- htoro- 7- r3, 5- bis- af2. 4- dihlorofenilrrietin- 2- C>metil-B- D- ribofuranozill- 7# pirolof2. 3- o1pirimidin

Ledeno-hladnom rastvoru proizvoda iz Koraka C Primera 2 (1.27 g, 2.57 mmol), u CH2CI2(30 mL) dodaje se, kap po kap, HBr (5.7 M u sirćetnoj kiselini; 3 mL). Reakciona smeša se meša na sobnoj temperaturi, tokom 2 h, ukoncentriše se pod smanjenim pritiskom i ko-evaporiše sa toluenom (2 X 15 mL). Nastalo ulje se rastvori u acetonitrilu (MeCN) (15 mL) i dodaje se, kap po kap, u dobro izmešanu smešu 2-amino-4-hloro-7/-£ pirolo[2,3-o3pirimidina [za izradu, vidi Heterocvcles 35:825 (1993)] (433 mg, 2.57 mmol), KOH (85%, praškasti) (0.51 g. 7.7 mmol) i tris[2-(2-metoksietoksi)etil]amina (165 ul, 0.1 mmol) u acetonitrilu (30 mL). Nastala smeša se meša na rt, tokom 1 h, filtrira i upari. Ostatak se prečisti na koloni od silika gela, koristeći heksani/BOAc, 5/1, 3/1 i 2/1, kao eluent, da bi se dobilo naslovljeno jedinjenje, u vidu bezbojne pene (0.65 g).

Korak B: 2- amino- 4- hloro- 7-( 2- g- metil- B- D- ribofuranozin- 7/^

pi rolo f2. 3- o1 pirimidin

Rastvoru proizvoda iz Koraka A (630 mg, 1.0 mmol) u CH2CI2(20 mL) dodaje se, na -78°C, bor trihlorid (1M u Cr-Lplg) (10 mL, 10 mmol). Smeša se meša na -78°C, tokom 2 h, a zatim, na -20°C tokom 2.5 h. Reakcija se prekida dodatkom CHgCla/MeOH (1:1) (10 mL), meša se na -20°C tokom 0.5 h i neutrališe, na 0°C, sa vodenim amonijakom. Čvrsta mase se filtrira, ispere sa CHjCIg/MeOH (1:1), a sjedinjeni filtrat se upariin vacuo.Ostatak se prečisti na koloni od silika gela, sa CHaCIg/MeOH, 50/1 i 20/1, kao eluentom, da bi se dobilo naslovljeno jedinjenje u vidu bezbojne pene (250 mg).

Korak C: 2- amino- 7-( 2' Ometil-&- D- ribofuranozin- 7/ fpirolo

r2, 3- ojpirimidin- 4( 3/^- on

Smeša proizvoda iz Koraka B (90 mg, 0.3 mmol) u vodenom NaOH (2N, 9 mL) zagreva se na temperaturi refluksa tokom 5 h, a zatim neutrališe na 0°C, sa 2N-im vodenim HCI i upari do suvog stanja. Prečišćavanjem na koloni od silika gela, sa CHjCIj/MeOH, 5/1, kao eluentom, proizvodi se naslovljeno jedinjenje u vidu bele čvrste mase (70 mg).

'H NMR (200 MHz, CD3OD): 8 0.86 (s, 3H), 3.79 (m, 1H), 3.90-4.05 (m, 3H), 6.06 (s, 1H), 6.42 (d, J=3J Hz, 1H), 7.05(d, J=3JHz, 1H).

PRIMER 5

2- amino- 4- ciklopropilamino- 7- f2- g- metil- 6- D- ribofuranozin- 7/ t^ pirolo

f2, 3- o1 pirimidin

Rastvor 2-amino-4-hloro-7-(2-ć?-metil-p-D-ribofuranoztl)-7/^pirolo [2,3-03pirimidina (Primer 4, Korak B) (21 mg, 0.07 mmol) u ciklopropilaminu (0.5 mL) zagreva se na 70°C tokom dva dana, a zatim se upari do uljanog ostatka i prečisti na koloni od silika gela, sa CH2Clj/MeOH, 20/1, kao eluentom, da bi se dobilo naslovljeno jedinjenje u vidu bele čvrste mase (17 mg).

<1>H NMR (200 MHz, CD3CN): 5 0.61 (m, 2H), 0.81 (m, 2H). 0.85 (s, 3H), 2.83 (m, 1H), 3.74-3.86 (m, 1H), 3.93-4.03 (m, 2H), 4.11 (d,J=8. 9Hz, 1H), 6.02 (s, 1H), 6.49 (d, J=3. 7 Hz, 1H), 7.00(d, J=3. 7Hz, IH).

PRIMER 6

4- amino- 7-( 2-( >metil- S- D- ribofuranozil)- 7Mpirotor2. 3- ollDirimidin- 5- karbonitril

Ovo jedinjenje se priprema sledeći postupke, koje su opisali Y. Murai i sar., u Heterocvcles 33: 391-404 (1992).

PRIMER 7

4- amino- 7-( 2-^ metil- B- D- ribofuranozil)- 7/^ pirolor2, 3- o1pirimidin- 5- karboksamid

Ovo jedinjenje se priprema sledeći postupke, koje su opisali Y. Murai i sar., u Heterocvcles 33: 391-404 (1992).

PRIMER 8

Opšti postupak za SATE deo proleka

S-acil-2-tioetil (SATE) pronukleotide razmatrali su C.R. VVagner, V.V. Iyer i EJ. Mclntee u "Pronucleotides:Toward the In Vivo Delivery of Antiviral and Anticancer Nucieotides," Med. Res. Rev., 20:1-35 (2000), koji je ovde sadržan kao referenca u svojoj celosti. SATE derivati nukleozida su takođe, izloženi u U.S. patentima broj 5,770,725; 5,849,905 i 6,020,482, čiji sadržaji su u svojoj celosti ovde uključeni, kao reference.

Bis( S- acetil- 2- tioetil)-/ V, A£diizopropilfosforamidit

2-merkaptoetanol (5 g, 64 mmol) se rastvori u CH2CI2(50 mL). Ovom rastvoru se dodaje trietilamin (7.67 mL, 57.6 mmol), a reakciona smeša se ohladi u ledenom kupatilu do 0°C. Tokom 10 minuta dodaje se, kap po kap, anhidrid sirćetne kiseline (4.54 mL, 48 mmol) i reakciona smeša se meša tokom 1 h na 0°C. Reakciona smeša se zatim ostavi da se, tokom perioda od 2 h, zagreje do sobne temperature. Reakciona smeša se razblaži sa CH2CI2(50 mL) i ispere vodom (75 mL), 5%-tnim vodenim NaHC03(75 mL) i slanim rastvorom (75 mL). Organska faza se osuši nad anhidrovanim Na2S04i ukoncentrišein vacuo,da bi se dobilo ulje. Ulje se zatim rastvori u anhidrovanom THF (40 mL) i dodaje mu se anhidrovani trietilamin (7.76 mL). Ovoj mešavini se dodaju aktivirana molekulama sita (4A) i čuva se na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta. Reakciona smeša se ohladi u ledenom kupatilu do 0°C i dodaje joj se diizopropilfosforamidus dihlorid (6.47 g, 32.03 mmol). Reakciona mešavina se meša na 0°C tokom 2 h, u inertnoj atmosferi. Reakcionoj smeši se dodaje heksan (40 mL),a obrazovani precipitat se filtrira. Filtrat se ukoncentriše do jedne četvrtine zapre mine, prečisti se hromatografski, na koloni napunjenoj silika gelom i eluira heksanom, koji sadrži 3% trietilamina i dodatnu količinu etil acetata (0 do 7%), da bi se dobilo naslovljeno jedinjenje, u vidu ulja (2.36 g).

'H NMR (CDCta): 5 1.17 (s, 6H), 1.21 (s, 6H). 2.36 (S, 6H), 3.14 (t, ^=6.44 Hz), 3.51-3.84 (m, 6H);<13>C NMR (CDCI3): 6 24.47, 24.61, 30.48, 42.85, 43.1, 61.88, 62.23, 195.26;<13>P NMR (CDCU: 8 146.96.

PRIMER 9

Derivati 5- trifošfata

Nukleozid 5-trifosfati ovog pronalaska pripremaju se sledeći opšte postupke, koji su opisani uChem. Rev,100:2047 (2000).

PRIMER 10

Prečišćavanje i analiza čistoće derivata 5'- trifosfata

Derivati trifosfata se prečišćavaju anjon izmenjivačkom (AX) hromatografijom, koristeći 30 X 100 mm Mono Q kolonu (Pharmacia), sa puferskim sistemom, od 50 mM Trisa, pH 8. Eluirajući gradijenti su uglavnom od 40 mM NaCI do 0.8 M NaCI u dve zapremine kolone, na 6.5 mL/min. Odgovarajuće frakcije sa anjon izmenjivačke hromatografije se sakupe i izvede se desalinacija reverzno-faznom (RP) hromatografijom, koristeći Luna C18 250 X 21 mm kolonu (Phenomenex), sa brzinom protoka od 10 mL/min. Eluirajući gradijenti su bili uopšteno od 1% do 95% metanola u vremenu od 14 minuta, pri konstantnoj koncentraciji od 5 mM trietilamonijum acetata (TEAA).

Maseni spektri prečišćenih trifosfata određeni su korišćenjem on-line HPLC masene spektrometrije, na Hevvlett-Packardovom (Palo Alto, CA) MSD 1100. Za RP HPLC je korišćena Phenomenex Luna (C18(2)), 150 X 2 mm, plus 30 x 2 mm zaštićena kolona, sa veličinom čestice od 3 um 0 do 50%-tni linearni gradijent (15 minuta) acetonitrila u 20 mM TEM (trietilamonijum acetat) pH 7, se izvodi u serijama sa masenom spektralnom detekcijom, na način negativne jonizacije. Za proizvodnju spreja se koriste gas azota i pneumatski nebulizer. Uzet je maseni raspon od 150 - 900. Molekulske mase su određene korišćenjem HP Chemstation analitičkog pakovanja.

Čistoća prečišćenih trifosfata je određena analitičkom RP i AX HPLC. RP HPLC sa Phenomonex Luna ili. Jupiter kolonom (250 X 4.6 mm) i veličinom čestica od 5 u,m, uglavnom se pokreće sa 2-70%-tnim gradijentom acetonitrila, na 15 minuta u 100 mM TEM, pH 7. AX HPLC se izvodi na 1.6 X 5 mm Mono Q koloni (Pharmacia). Trifosfati se eluiraju sa. gradijentom od 0 do 0.4 M NaCI, na konstantnoj koncentraciji od 50 mM Trisa, pH 8. Čistoća trifosfata uopšteno je >80%.

PRIMER 11

Derivati S'- monofosfata

5'-monofosfati nukleozida ovog pronalaska pripremljeni su sledeći opšte postupke, koji su opisani uTetrahedron Lett.50: 5065 (1967).

PRIMER 12

Masena spektralna karakterizaciia derivata 5'- trifosfata

Maseni spektri 5'-trifosfata jedinjenja ovog pronalaska određeni su kao što je opisano u Primeru 10. Navodi u sledećoj tabeli predstavljaju izračunate i eksperimentalne mase reprezentativnih 5'-trifosfata, pripremljenih u skladu sa postupcima iz Primera 9. Brojevi primera odgovaraju matičnom jedinjenju 5'-trifosfata.

PRIMER 13

r4- amino- 7-( 2- g- metil- 6- D- ribof uranozil)- 7/^ pirolo r2, 3- o1 pirimidinl- 5 - monofosf at

Jedinjenju iz Koraka F Primera 2 (14 mg, 0.05 mmol) (osušenog koevaporacijom sa piridinom i nekoliko puta sa toluenom) dodaje se trimetil fosfat (0.5 mL). Smeša se meša preko noći u zatvorenom kontejneru. Zatim se ohladi do 0°C i preko šprica se dodaje fosforni oksihlorid (0.0070 mL, 0.075 mmol). Smeša se meša tokom 3 h, na 0°C, a zatim se reakcija prekida dodatkom tetraetilamonijum bikarbonata (TEAB) (1M) (0.5 mL) i vode (5 mL). Reakciona smeša se prečisti i analizira prema postupku, koji je opisan u Primeru 10.

Elektron sprej maseni spektar (ES-MS): Utvrđeno: 359.2 (M-H<+>); izračunato za C12H17N407P-H+: 359.1.

PRIMER 14

r4- amino- 7-( 2- ametil- 6- D- ribcfaranozin- 7^ Diro( or2, 3- o1pirimždin1- 5,- difosfat

Jedinjenju iz Koraka F Primera 2 (56 mg, 0.20 mmol) (osušenog koevaporacijom sa piridinom i nekoliko puta sa toluenom) dodaje se trimetil fosfat (čuvan preko rešetki) (1.0 mL). Smeša se meša preko noći u zatvorenom sudu. Zatim se ohladi do 0°C i preko šprica se dodaje fosforni oksihlorid (0.023 mL, 0.25 mmol). Smeša se meša tokom 2 h, na 0<o>C) a zatim se dodaje tributilamin (0.238 mL, 1.00 mmol) i tributilamonijum fosfat (dobijen iz fosforne kiseline i tributilamina u piridinu, nakon čega sledi ponovljena azeotropska evaporacija sa piridinom i acetonitrilom) (1.0 mmol u 3.30 mL acetonitrila). Smeša se meša tokom dodatnih 30 minuta na 0°C, zatvorena boca se zatim otvori i reakcija se prekida dodatkom TEAB-a (1M)

(1.0 mL) i vode (5 mL). Reakciona smeša se prečisti i analizira prema postupku, koji je opisan u Primeru 10.

ES-MS: Utvrđeno: 439.0 (M-H<+>); izračunato za C12H18N4O10P2-H<+>: 439.04.

PRIMER 15

r4- amžno- 7-( 2- C^ metil- 6- D- rito^

Jedinjenju iz Koraka F Primera 2 (20 mg, 0.07 mmol) (osušenog koevaporacijom sa piridinom i nekoliko puta sa toluenom) dodaje se trimetil fosfat (čuvan preko rešetki) (0.4 mL). Smeša se meša preko noći u zatvorenom sudu. Zatim se ohladi do 0°C i preko šprica se dodaje fosforni oksihlorid (0.0070 mL, 0.075 mmol). Smeša se meša tokom 3 h, na 0°C, a zatim se dodaje tributilamin (0.083 mL, 0.35 mmol), tributilamonijum pirofosfat (127 mg, 0.35 mmol) i acetonitrii (čuvan preko rešetki) (0.25 mL). Smeša se meša tokom dodatnih 30 minuta, na 0°C, zatvorena boca se zatim otvori i reakcija se prekida dodatkom TEAB-a (1M) (0.5 mL) i vode (5 mL). Reakciona smeša se prečisti i analizira prema postupku, koji je opisan u Primeru 10.

ES-MS: Utvrđeno: 519.0 (M-F<T>); izračunato za C12H19N4013P3-H<+>: 519.01.

PRIMER 16

7-( 2- Ć>metil- B- DHlbofuranozil)- 7/^ irotor2. 3^ piirmidin1- 4( 3/^- on

Jedinjenju iz Koraka E Primera 2 (59 mg, 0.18 mmol) dodaje se vodeni natrijum hidroksid (1M). Smeša se zagreva do refluksa tokom 1 h, ohladi se, neutrališe sa vodenom HCI (2M) i upari in vacuo. Ostatak se prečisti na silika gelu, koristeći dihlorometan/metanol (4:1), kao eluent. Frakcije, koje sadrže proizvod se sjedine i upare in vacuo, da bi se dobio željeni proizvod (53 mg), u vidu bezbojnog ulja.

<1>H NMR (CD3CN): 6 0.70 (s, 3H), 3.34-U5 (preklopljeno m, 7H), 6.16 (s, IH), 6.57 (d, 3.6 Hz, 1H). 7.37 (d, 3.6 Hz. 1H), 8.83 (s, 1H).

PRIMER 17

4- amino- 5- hioro- 7-( 2- g- metil- 6- D- ribofuranozil)- 7>¥- pirolor2. 3- Ql pirimidin

Prethodno ohlađenom rastvoru (0°C) jedinjenja iz Koraka F Primera 2 (140 mg, 0.50 mmol) u DMF (2.5 mL), dodaje seN-hlorosukcinimid (0.075 g, 0.55 mmol) u DMF (0.5 mL), kap po kap. Rastvor se meša na rt tokom 1 h, a reakcija se ugasi dodatkom metanola (4 mL) i upari in vacuo. Sirovi proizvod se prečisti na silika gelu, koristeći metanol/dihlorometan (1:9), kao eluent. Frakcije, koje sadrže proizvod se sjedine i upare in vacuo, da bi se dobio željeni proizvod (55 mg), u vidu bezbojne čvrste mase.

<1>H NMR (CD3CN): 6 0.80 (S, 3H). 3.65-4.14 (preklopljeno m, 7H), 5.97 (s br, 2H), 6.17 (s, 1H), 7.51 (s, 1H), 8.16 (s, 1H).

ES-MS: Utvrđeno: 315.0 (M+H<*>); izračunato za C12H1SCIN404+H<+>: 315.09.

PRIMER 18

4- amino- 5- bromo- 7- f2- g- metil- fi- D- ribofuranozil)- 7A/- pirolof2. 3- o1pirimidin

Prethodno ohlađenom rastvoru (0°C) jedinjenja iz Koraka F Primera 2 (28 mg, 0.10 mmol) u DMF (0.5 mL), dodaje se/Vbromosukcinimid (0.018 g, 0.10 mmol) u DMF (0.5 mL), kap po kap. Rastvor se meša na 0°C, tokom 20 minuta, a zatim na rt tokom 10 minuta. Reakcija se ugasi dodatkom metanola (4 mL) i upari in vacuo. Sirovi proizvod se prečisti na silika gelu, koristeći metanol/dihlorometan (1:9), kao eluent. Frakcije, koje sadrže proizvod se sjedine i upare in vacuo, da bi se dobio željeni proizvod (13.0 mg), u vidu bezbojne čvrste mase.

'H NMR (CD3CN): 5 0.69 (s, 3H). 3.46-4.00 (preklopljeno m. 7H). 5.83 (s br, 2H), 6.06 (s, 1H). 7.45 (s, 1H), 8.05 (s, 1H).

ES-MS: Utvrđeno: 359.1 (M+H<*>); izračunato za C12H15BrN404+H<*>: 359.04.

PRIMER 19

2- amino- 7-( 2- g- metil- fj- D- ribofuranozil)- 7/ T'- pirolor2, 3-( 3'| pirimidin

Smeša 2-amino-4-hloro-7-(2-C<:->metil-p-D-ribofuranozil)-7/Ttpirolo[2,3-ojpirimidina (Primer 4, Korak B) (20 mg, 0.07 mmol) u EtOH (1.0 mL), piridina (0.1 mL) i 10%-tnog Pd/C (6 mg), pod H2(atmosferski pritisak) se meša preko noći, na sobnoj temperaturi. Smeša se filtrira preko celitne podloge, koja se temeljno ispere sa EtOH. Sjedinjeni filtrat se upari i prečisti na koloni silika gela sa C^CIj/MeOH, 20/1 i 10/1, kao eluenta da bi se dobilo naslovljeno jedinjenje u vidu bele čvrste mase (16mg).

'H NMR (200 MHz, CD3OD): 8 0.86 (s, 3H, 2'C-Me), 3.82 (dd,JS4^ 3. 6Hz,Js^ 2. 7Hz, 1H, H-5"), 3.94-4.03 (m, 2H, H-5', H-4'), 4.10 (d, ^.4=8.8 Hz. 1H, H-3'), 6.02 (s, 1H, H-1"), 6.41 (d. ^9=3.8 Hz, 1H, H-5), 7.39 (d, 1H, H-6), 8.43 (s. 1H, H-4). ES MS: 281.4

(MH<*>).

PRIMER 20

2- amino- 5- metil- 7-( 2- C. 2- <^ dimetil- g- D- ribofuranozil)- 7/ fpirolor2, 3- i^

pirimidin- 4( 3/ Tl>- on

Korak A: 2- amino- 4- hloro- 7- r3, 5- bis- <J-( 2, 4- dihlorofenilmetil)- 2- <>rrietil-B- D- ribofuranozil1- 5- rnetil- 7^- pirolo- r2i3- <3lpirirnidin

Ledeno-hladnom rastvoru proizvoda iz Koraka C Primera 2 (1.57 g, 3.16 mmol) u CH2CI2(50 mL) je dodat HBr (5.7 M u sirćetnoj kiselini; 3.3 mL), u vidu kapi. Reakciona smeša je mešana na 0°C u toku 1 h i zatim, 2 h na sobnoj temperaturi, ukoncentrisana in vacuo i ko-uparena sa toluenom (2 x 20 mL). Nastalo ulje je rastvoreno u MeCN (20 mL) i u vidu kapi je dodato rastvoru natrijumove soli 2-amino-4-hloro-5-metil-1/^pirolo[2,3-aJpirimidina u acetonitrilu [generisanin situiz 2-amino-4-hloro-5-metil-1/Ttpirolo[2,3-a3pirimidina [za izradu, vidi Liebtgs Ann. Chem. 1984: 708-721] (1.13 g, 6.2 mmol) u anhidrovanom acetonitrilu (150 mL), i NaH (60% u mineralnom ulju, 248 mg, 6.2 mmol), posle 2 h snažnog mešanja na sobnoj t]. Sjedinjena mešavina je mešana na sobnoj temperaturi tokom 24 h i onda uparena do suva. Ostatak je suspendovan u vodi (100 mL) i ekstrahovan sa EtOAc (300 + 150 mL). Sjedinjeni ekstrakti su isprani slanim rastvorom (100 mL), osušeni nad Na^SO«, filtrirani i upareni. Sirov proizvod je prečišćen na koloni silika gela (5x7 cm) upotrebom etil acetat/heksana (0 do 30% EtOAc u 5% step gradijentu) kao eluenta. Frakcije, koje sadrže proizvod su sjedinjene i uparene in vacuo kako bi se dobio željeni proizvod (0.96 g) u vidu bezbojne pene.

Korak B: 2- amino- 4- hloro- 7- f3, 5- bis- 0-( 2. 4- dihlorofenilmetil)- 2- C2- 0

dimetil- 6- D- ribofuranozin- 5- metil- 7/^ pirolof2. 3- o1pirimidin

Ledeno-hladnoj mešavini proizvoda iz Koraka A (475 mg, 0.7 mmol) u THF-u (7 mL) je dodat NaH (60% u mineralnom ulju, 29 mg) i mešana je na 0°C u toku 0.5 h. Zatim je dodat MeJ (48 u.L) i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 24 h. Reakcija je završena sa MeOH i smeša uparena. Sirov proizvod je prečišćen na koloni silika gela (5 x 3.5 cm) upotrebom heksan/etil acetata (9/1, 7/1, 5/1 i 3/1) kao eluenta. Frakcije, koje sadrže proizvod su sjedinjene i uparene kako bi se dobio željeni proizvod (200 mg) u vidu bezbojne pene.

Korak C: 2- amino- 7- f3, 5- bis- C^( 2, 4- dihlorofeniirnetin- 2- g, 2- Q- dimetil-P- D- ribofuranozin- 5- metil- 7/^ pirolof2, 3- o1pirimidin- 4( ;3/ M- on

Mešavina proizvoda iz Koraka B (200 mg, 0.3 mmol) u 1,4-dioksanu (15 mL) i vodenog NaOH (2N, 15 mL) u balonu pod pritiskom je zagrevana tokom noći na 135°C. Mešavina je zatim, ohlađena do 0°C, neutralisana sa 2N vodenim HCI i uparena do suva. Sirov proizvod je suspendovan u MeOH, filtriran, a Čvrsta materija pažljivo isprana sa MeOH. Sjedinjeni filtrati su ukoncentrisani, a ostatak prečišćen na koloni silika gela (5x5cm) upotrebom CHgCljj/MeOH (40/1, 30/1 i 20/1) kao eluenta da bi se dobilo željeno jedinjenje (150 mg) u vidu bezbojne pene.

Korak D: 2- amino- 5- metil- 7-( 2- C2- Odimetil- B- D- ribofuranozil)- 7/ t/ pirolo

r2, 3- <^ pirimidin- 4( 3/^- on

Mešavina proizvoda iz Koraka C (64 mg, 0.1 mmol) u MeOH (5 mL), Et3N (0.2 mL) i 10% Pd/C (24 mg) je hidrogenizovana u Parr-ovom hidrogenatoru pri 50 psi i na sobnoj temperaturi tokom 1.5 dana, zatim je filtrirana kroz sloj Celit-a, koji je pažljivo ispran sa MeOH. Sjedinjeni filtrati su upareni, a ostatak prečišćen na koloni silika gela (3 x 4 cm) sa C^CIj/MeOH (30/1, 20/1) kao eluentom da bi se dobio 2-amino-5-metil-7-(5-C^benzil-2-C,2-C>dimetil-p-D-ribofuranozil)-7/Ttpirolo[2,3-crJpirimidin-4(3/T)-on. Jedinjenje (37 mg) je dalje hidrogenizovano u EtOH (2 mL) sa 10% Pd/C pod atmosferskim pritiskom vodonika. Posle mešanja od 2 dana na sobnoj temperaturi, reakciona mešavina je filtrirana kroz Celit, filtrat uparen, a sirov proizvod prečišćen na koloni silika gela (1x7 cm) sa CHjjCIa/MeOH (30/1, 20/1 i 10/1) kao eluentom da bi se dobilo naslovljeno jedinjenje (12 mg) posle sušenja smrzavanjem.

<1>H NMR (200MHz, CD3OD): 5 0.81 (s, 3H, 2<*>C-Me). 2.16 (d, ^»,=1.3 Hz, 3H. C5-Mo), 3.41 (s, 3H, 2'-OMe), 3.67 (dd, 44.=3.4 Hz, 4.^12.6 Hz, 1H, H-5'), 3.81-3.91 (m, 3H, H-5". H-4', H-3'), 6.10 (S, 1H, H-1'), 6.66 (d, 1H, H-6). ES MS: 323.3 (M-H)<*>.

PRIMER 21

4- amino- 5- metil- 7-( 2- g- metil- P- D- ribofuranozil)- 7/ y- pirolor2, 3- Qlpirimidin

Korak A: 4- hloro- 7- r3. 5- bis- C>f2. 4- dihlorofenilmetil)- 2- g- metil-

g- D- ribofurano2ill- 5- rnetil- 7/ ¥pirolo- f2, 3- o,| pirimidin

Ledeno-hladnom rastvoru proizvoda iz Koraka C Primera 2 (1.06 gT2.1 mmol) u CH2CI2(30 mL) je dodat HBr (5.7 M u sirćetnoj kiselini; 2.2 mL) u vidu kapi. Reakciona smeša je mešana na 0°C u toku 1 h i zatim, 2 h na sobnoj temperaturi, ukoncentrisana in vacuo i ko-uparena sa toluenom (2 x 15 mL). Nastalo ulje je rastvoreno u MeCN (10 mL) i u vidu kapi je dodato rastvoru natrijumove soli 4-hloro-5-metil-1/T<t>pirolo[2,3-aJpirimidina u acetonitrilu [generisanin situiz 4-hloro-5-metil-1 A/-pirolo[2,3-o]pirimidina [za izradu, vidi J. Med. Chem. 33:1984 (1990)]

(0.62 g, 3.7 mmol) u anhidrovanom acetonitrilu (70 mL), i NaH (60% u mineralnom ulju, 148 mg, 3.7 mmol), posle 2 h snažnog mešanja na sobnoj tj. Sjedinjena mešavina je mešana na sobnoj temperaturi tokom 24 h i onda uparena do suva. Ostatak je suspendovan u vodi (100 mL) i ekstrahovan sa EtOAc (250 + 100 mL). Sjedinjeni ekstrakti su isprani slanim rastvorom (50 mL), osušeni nad NaaSO^, filtrirani i upareni. Sirov proizvod je prečišćen na koloni silika gela (5x5 cm) upotrebom heksan/etil acetatnog (9/1, 5/1, 3/1) gradijenta kao eluenta. Frakcije, koje sadrže proizvod su sjedinjene i uparene in vacuo kako bi se dobio željeni proizvod (0.87 g) u vidu bezbojne pene.

Korak B: 4- htoro- 5- metil- 7-( 2- 6^ metil- 3- D~ ribofuranozil)- 7//

pirotor2. 3- o1pirimidin

Rastvoru jedinjenja iz Koraka A (0.87 g, 0.9 mmol) u dihlorometanu (30 mL) na -78°Cje dodat bortrihlorid (1M u dihlorometanu, 9.0 mL, 9.0 mmol) u vidu kapi. Mešavina je mešana je na -78°C u toku 2.5 h i zatim, na -30°C do -20°C tokom 3 h. Reakcija je završena dodatkom metanol/dihlorometana (1:1) (9 mL) i nastala smeša je mešana na -15°C tokom 30 minuta, zatim, neutralisana vodenim amonijakom na 0°C i mešana na sobno] temperaturi još 15 minuta. Čvrsta materija je filtrirana i isprana sa CHgCIg/MeOH (1/1, 50 mL). Sjedinjeni filtrati su upareni, a ostatak prečišćen na koloni silika gela (5x5 cm) upotrebom CH2CI2i CHaCIjj/MeOH (40/1 i 30/1) gradijenta kao eluenta kako bi se dobilo željeno jedinjenje (0.22 g) u vidu bezbojne pene.

Korak C: 4- amcno- 5- metil- 7-( 2- g- metil- B- D- ribofuranozin- 7/ y-pirolor2. 3- o1pirimidin

Jedinjenju iz Koraka B (0.2 g, 0.64 mmol) je dodat amonijak u metanolu (zasićen na 0°C; 40 mL). Smeša je zagrevana u nerđajućem čeličnom autoklavu na 100°C tokom 14 h, onda ohlađena i uparenain vacuo.Sirova smeša je prečišćena na koloni silika gela (5x5cm) sa CH2Cl2/MeOH (50/1, 30/1, 20/1) gradijentom kao eluentom da bi se dobilo naslovljeno jedinjenje u vidu bele čvrste mase (0.12 g).

'H NMR (DMSO-cy: 5 0.60 (s, 3H, 2'C-Me), 2.26 (s, 3H, 5C-Me), 3.52-3.61 (m, 1H, H-5'), 3.70-3.88 (m, 3H, H-5", H-4', H-3<1>), 5.00 <S, 1H, 2'-OH), 4.91-4.99 (m, 3H, 2'-OH, 3'-OH, 5'-OH), 6.04 (S, 1H, H-1'), 6.48 (brS, 2H, NHJi, 7.12 (S, 1H. H-6), 7.94 (s,1H, H-2). ES MS: 2S5.2 (MH<*>).

PRIMER 22

4- amino- 7-( 2- g- metil- 8- D- ribofuranozil)- 7/ T<-

pirolof2. 3- o1pirimidin- 5- karboksilna kiselina

Jedinjenje iz Primera 6 (0.035 g, 0.11 mmol) je rastvoreno u smeši vodenog amonijaka (4 mL, 30 wt%) i metanola zasićenog amonijakom (2 mL), a zatim je dodat rastvor H2Ozu vodi (2 mL, 35 wt%). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 18 h. Rastvarao je uklonjen pod sniženim pritiskom, a dobijem* ostatak prečišćen HPLC-om na reverzno-faznoj koloni (Altech Altima C-18, 10x299 mm, A=voda, B=acetonitril, 10 do 60% B u 50 min, protok 2 mL/min) kako bi se dobilo naslovljeno jedinjenje (0.015 g, 41%) u vidu bele čvrste mase.

'H NMR (CD3OD): 6 0.85 (s, 3H, Me), 3.61 (m, 1H), 3.82 (m, 1H), 3.99-4.86 (m, 2H), 6.26 (s, 1H), 8.10 (S, 2H). 8.22 (S, 1H);,<3>C NMR (CD3OD): 20.13, 61.37, 73.79, 80.42, 84.01, 93.00, 102.66, 112.07, 130.07, 151.40, 152.74, 159.12, 169.30. HRMS (FAB) Izrač. za C13H,7N408<+>325.1148, nađeno 325.1143.

PRIMER 23

4- amino- 7-( 2- g- vinil- B- D- ržbofuranozin- 7/ y- pirolof2. 3- Ql pirimidin

Korak A: 3, 5- bis- <9-( 2, 4- dihlorofenilmetil)- 2- g- vinil- 1- č>metil-

g- D- ri bof uranoza

Cerijum hlorid heptahidrat (50 g, 134.2 mmol) je dobro smrvljen u žitku masu pre zagrevanja i prenet u balon zaobljenog dna, opremljen mehaničkom mešalicom. Balon je zagrevan pod visokim vakuumom tokom noći na 160°C. Vakuum je oslobođen argonom i balon ohlađen do sobne temperature. U balon je putem kanile ukapan anhidrovani THF (300 mL). Dobijena suspenzija je mešana na sobnoj temperaturi u toku 4 h i zatim ohlađena na -78°C. Dodat je vinilmagnezijum bromid (1M u THF-u, 120 mL, 120 mmol) i mešanje nastavljeno na -78°C tokom 2 h. Ovoj suspenziji je dodat rastvor 3,5-bis-0-(2,4-dihlorofenilmetil)-1-C-metil-a-D-eritro-pentofuranoza-2-uloze (14 g, 30 mmol) [iz Primera 2, Korak B] u anhidrovanom THF-u (100 mL) u vidu kapi i uz stalno mešanje. Reakciona smeša je mešana na -78°C tokom 4 h. Reakcija je završena dodatkom zasićenog rastvora amonijum hlorida i ostavljena da se ugreje do sobne temperature. Mešavina je filtrirana kroz celitni sloj i ostatak ispran sa EtzO (2x500 mL). Organski sloj je izdvojen i vodeni sloj ekstrahovan sa E^O (2x200 mL). Sjedinjeni organski slojevi su osušeni nad anhidrovanim Na2S04i ukoncentrisani do viskoznog žutog ulja. Ulje je prečišćeno fleš hromatografijom (Si02, 10% EtOAc u heksanima). Naslovljeno jedinjenje (6.7 g, 13.2 mmol) je dobijeno u vidu bledo žutog ulja.

Korak B: 4- htoro- 7- r3. 5- bis- <0- f2. 4- dihlorofenilmetil)- 2- g- vinii- B- D-ribofuranozil"|- 7A/- pirolor2. 3- Qlpirimidin

Rastvoru jedinjenja iz Koraka A (6.4 g, 12.6 mmol) u anhidrovanom dihlorometanu (150 mL) na -20°C je dodat HBr (30%-tni rastvor u AcOH, 20 mL, 75.6 mmol) u vidu kapi. Nastali rastvor je mešan između -10°C i 0°C u toku 4 h, uparen in vacuo i ko-uparen sa anhidrovanim toluenom (3x40 mL). Uljani ostatak je rastvoren u anhidrovanom acetonitrilu (100 mL) i dodat je rastvor natrijumove soli 4-hloro-1//piro'o[2,3-o]pirimidina (5.8 g, 37.8 mmol) u acetonitrilu (generisan in situ, kao što je opisano u Primeru 2) na -20°C. Nastala smeša je ostavljena da se tigreje do sobne temperature i mešana na sobnoj temperaturi tokom 24 h. Mešavina je zatim, uparena do suva, preneta u vodu i ekstrahovana sa EtOAc (2x300 mL). Sjedinjeni ekstrakti su osušeni nad Na2S04, filtrirani i upareni. Sirova mešavina je prečišćena fleš hromatografijom (Si02, 10%-tni EtOAc u heksanima), a naslovljeno jedinjenje (1.75 g) izolovano u vidu bele pene.

Korak C: 4- amino- 7- f3. 5- bis-( J-( 2, 4- dihlorofenilmetil)- 2-( S'- vinil- f3- D-ribofuranozill- 7// pirolof2, 3- c3lpirimidin

Jedinjenje iz Koraka B (80 mg), rastvoreno je u minimalnoj količini 1,4-dioksana i smešteno u bombu od nerđajućeg čelika. Bomba je ohlađena do -78°C i dodat je tečni amonijak. Bomba je zapečaćena i grejana na 90°C tokom 24 h. Amonijak je ostavljen da upari, a ostatak ukoncentrisan do bele čvrste mase, koja se u sfedećem koraku koristi bez daljeg prečišćavanja.

Korak D: 4- amino- 7-( 2- C^ vinil- 3- D- ribofuranozžll- 7Mpirolof2, 3- o1pirimidin

Rastvoru jedinjenja iz Koraka C (60 mg) u dihlorometanu. na -78°C je dodat bortrihlorid (1M u dihlorometanu) u vidu kapi. Mešavina je mešana je na -78°C u toku 2.5 h i zatim, na -30°C do -20°C tokom 3 h. Reakcija je završena dodatkom metanol/dihlorometana (1:1) i nastala smeša je mešana na -15°C tokom 0.5 h, zatim, neutralisana vodenim amonijakom na 0°C i mešana na sobnoj temperaturi još 15 minuta. Čvrsta materija je filtrirana i isprana sa metanol/dihlorometanom (1:1). Sjedinjeni filtrati su upareni, a ostatak prečišćen fleš hromatografijom (Si02, 10%-tni metanol u EtOAc koji sadrži 0.1% trietilamina). Frakcije koje sadrže proizvod su uparene kako bi se dobilo naslovljeno jedinjenje u vidu bele čvrste mase (10 mg).

<1>H NMR (DMSO-đs): 5 3.6 (m. 1H. H-5"), 3.8 (m. 1H, H-5"), 3.9 (m d, 1-H, H-4'), 4.3 (t, 1H. H-3'), 4.8-5.3 (m, 6H, CH=CH2, 2'-OH, 3<*->OH, 5<*->OH), 6.12 (s, 1H, H-1'). 6.59

(d, 1H, H-5), 7.1 (brS, 1H, NHg), 7.43 (d, 1H, H-6), 8.01 (s, 1H, H-2). ES MS: Nađeno: 291.1 (M-H"); izrač. za C^H^O, - H": 291.2.

PRIMER 24

4- amino- 7-( 2- <S:- hidroksirnetil- 6- D- ribofuranozil)- 7/^ pirolor2, 3- o1 pirimidin

Korak A: 4- hloro- 7- f3, 5- bis- <^( 2, 4Hjihlorofenilmetil)- 2- g- hidroksimetil- P- P-ribofuranozin- 7/ L/- pirolor2, 3- Qlpirimidin

Rastvoru jedinjenja iz Primera 23, Korak B (300 mg, 0.48 mmol) u 1,4-dioksanu (5 mL) je dodat AAmetilmorfolin-AAoksid (300 mg, 2.56 mmol) i osmijum tetroksid (4%-tni rastvor u vodi, 0.3 mL). Mešavina je mešana u mraku tokom 14 h. Talog je uklonjen filtracijom preko celitnog sloja, razblažen vodom (3x) i ekstrahovan sa EtOAc. Sloj EtOAc je osušen nad N^SC^ i ukoncentrisan in vacuo. Uljasti ostatak je stavljen u dihlorometan (5 mL) i mešan nad NaJ04na silika gelu (3 g, 10%-tni NaJOJ tokom 12 h. Silika gel je uklonjen filtracijom i ostatak uparen i zatim, prenet u apsolutni etanol (5 mL). Rastvor je ohlađen u ledenom kupatilu i postepeno je dodat natrijum borhidrat (300 mg, 8 mmol). Nastala smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 4 h i zatim razblažena sa EtOAc. Organski sloj je ispran vodom (2x20 mL), slanim rastvorom (20 mL) i osušen nad Na»SO.. Rastvarao ie uoaren i ostatak prečišćen fleš hromatografijom (Si02, 2:1 heksani/EtOAc) da bi se dobilo naslovljeno jedinjenje (160 mg, 0.25 mmol) u vidu belih Ijuspica.

Korak B: 4- amino- 7- f3, 5- bis- 0( 2. 4- dihlorofenilmetil)- 2- g- hidroksimetil- 6- D-ribofuranozil1- 7/ tTt- pirolof2, 3- o1pirimidin

Jedinjenje iz Koraka A (150 mg, 0.23 mmol), rastvoreno je u minimalnoj količini 1,4-dioksana (10 mL) i smešteno u bombu od nerđajućeg čelika. Bomba je ohlađena do -78°C i dodat je tečni amonijak. Bomba je zapečaćena i grejana na 90°C tokom 24 h. Amonijak je ostavljen da upari, a ostatak ukoncentrisan do bele čvrste mase, koja se u sledećem koraku koristi bez daljeg prečišćavanja.

Korak C: 4- amino- 7- f2- g- hidroksimetil- P- D- ribofuranoziQ-7/ fpirolof2. 3- ofoirimidin

Jedinjenje iz Koraka B (120 mg, 0.2 mmol) je rastvoreno u 1:1 smeši metanol/dihlorometana, dodat je 10%-tni Pd-C i suspenzija mešana u atmosferi H2tokom 12 h. Katalizator je uklonjen filtriranjem kroz celitni sloj i ispran istim količinama metanola. Sjedinjeni filtrati su upareni in vacuo i ostatak prečišćen fleš hromatografijom (SiOz, 10%-tni metanol u EtOAc koji sadrži 0.1% trietilamina) kako bi se dobilo naslovljeno jedinjenje (50 mg) u vidu belog praška.

'H NMR (CD3OD): 5 3.12 (d. 1H, CH2'), 3.33 (d, 1H, CH2"), 3.82 (m, 1H, H-5'), 3.99-4.1 <m, 2H, H-4', H-5"), 4.3 (d, 1H, H-3')>6.2 (s, 1H, H-1'), 6.58 (d. 1H, H-5). 7.45 (d, 1H, H-6), 8.05 (s, 1H, H-2).

LC-MS: nađeno: 297.2 (M+H<*>); izrač. za CiaH18N4Os+ H<*>: 297.3.

PRIMER 25

4- amino- 7-( 2- g- fluorometil-' 3- D- ribofuranozil)- 7/^ pirolof2. 3- oi pirimidin

Korak A: 4- hloro- 7- f3. 5- bis-^ f2. 4- dihlorofenilmetin- 2-( ?- fiuorometil- l3- D-ribofuranozit'|- 7/ y- p) rolof2, 3- dlpirimidin

Rastvoru jedinjenja iz Primera 24, Korak A (63 mg, 0.1 mmol) u anhidrovanom dihlorometanu (5 mL) pod argonom, dodat je 4-dimetilaminopiridin (DMAP) (2 mg, 0.015 mmol) i trietilamin (62 u.L, 0.45 mmol). Rastvor je ohlađen u ledenom kupatilu i dodat je p-toluensulfonil hlorid (30 mg, 0.15 mmol). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi preko noći, isprana sa NaHC03(2x10 mL), vodom (10 mL), slanim rastvorom (10 mL), osušena nad Na^SO., i ukoncentrisana in vacuo do ružičaste čvrste mase. Čvrsta masa je rastvorena u anhidrovanom THF-u (5 mL) i ohlađena u ledenom kupatilu. Dodat je tetrabutilamonijum fluorid (1M rastvor u THF-u, 1 mL, 1 mmol) i mešavina mešana na sobnoj temperaturi tokom 4 h. Rastvarač je uklonjen in vacuo, ostatak prenesen u dihlorometan i ispran sa NaHC03(2x10 mL), vodom (10 mL) i slanim rastvorom (10 mL). Dihlorometanski sloj je osušen nad anhidrovanim Na^SO.«, ukoncentrisan in vacuo i prečišćen fleš hromatografijom (Si02, 2:1 heksani/EtOAc) kako bi se dobilo naslovljeno jedinjenje (20 mg) u vidu bele čvrste mase.

Korak B: 4- amino- 7- r3, 5- bis- C>-( 2. 4- dihlorofenilmetih- 2- C!- fluorometil- B- D-ribofuranozil1- 7^ pirolor2, 3- oipirimidin

Jedinjenje iz Koraka A (18 mg, 0.03 mmol), rastvoreno je u minimalnoj količini 1,4-dioksana i smešteno u bombu od nerđajućeg čelika. Bomba je ohlađena do -78°C i dodat je tečni amonijak. Bomba je zapečaćena i grejana na 90°C tokom 24 h. Amonijak je ostavljen da upari, a ostatak ukoncentrisan do bele čvrste mase, koja se u sledećem koraku koristi bez daljeg prečišćavanja.

Korak C: 4- amino- 7-( 2- g- fluorometil- l3- D- ribofuranozil)-7^ pirolof2. 3- p, lDirimidin

Jedinjenje iz Koraka B (16 mg) je rastvoreno u 1:1 smeši metanol/dihlorometana, dodat je 10%-tni Pd-C i suspenzija mešana u atmosferi H2tokom 12 h. Katalizator je uklonjen filtriranjem kroz celitni sloj i ispran istim količinama metanola. Sjedinjeni filtrati su upareni in vacuo i ostatak prečišćen fleš hromatografijom (Si02, 10%-tni metanol u EtOAc koji sadrži 0.1% trietilamina) kako bi se dobilo naslovljeno jedinjenje (8 mg) u vidu belog praška.

<1>H NMR (DMSO-de): 5 3.6-3.7 (m, 1H, H-5'). 3.8-4.3 (m, 5H, H-5", H-4', H-3\ CHL), 5.12 (t, 1H, 5'-OH), 5.35 (d, 1H, 3'-OH), 5.48 (s, 1H, 2'-OH), 6.21 {s, 1H, H-1'), 6.52 (d, 1H, H-5), 6.98 (br s, 2H, NH2), 7.44 (d, 1H, H-6), 8.02 (s, 1H, H-2).

<19>F NMR (DMSO-de): 5 -230.2 (t).

ES-MS: nađeno: 299.1 (M+H<+>); izrač. za C12H1SFN40S+ H<+>: 299.27.

PRIMERI 26 i 27

4- amino- 7-{ 3- deoksi- 2- G- metil- B- D- ribofuranozil)- 7/-/- pirolof2, 3- <^ pirimidin i

4- amino- 7- f3- deoksi- 2-^ metil- B- D- arabinofuranozin- 7/ 7t- pirolof2. 3- o1

pirimidin

Korak A: 7- f2, 5- bis-( 9-(/' g^ >butildimetilsilil)- P- D- ribofuranozil')- 7A/- piroto

r2. 3- đpirimidin i 7- f3. 5- bis- <3-( te/ p- butildimetilsilin- B- D-ribofuranozill- 7/^ pirolof2. 3- o1 pirimidin

U mešani rastvor tubercidina (5.0 g, 18.7 mmol) u mešavini piridina (7.5 mL) i DMF-a (18.5 mL) je dodat srebro nitrat (6.36 g, 38.8 mmol). Ova smeša je mešana na sobnoj temperaturi u toku 2 h. Ohlađena je u ledenom kupatilu i dodati su THF (37.4 mL) iterobutildimetilsilil hlorid (5.6 g, 37 mmol) i mešavina mešana tokom 2 h na sobnoj temperaturi. Smeša je zatim, filtrirana kroz sloj celita i isprana THF-om. Filtrat i ispirci su razblaženi etrom, koji je sadržavao malu količinu hloroforma. Organski sloj je ispran redom sa natrijum bikarbonatom i vodom (3x50 mL), osušen nad anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentrisan. Piridin je uklonjen kouparavanjem sa toluenom i ostatak prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu upotrebom 5-7%-tnog MeOH u CH2CI2kao eluenta; prinos 3.0 g.

Korak B: 7- r2, 5- bis- ć>(/ er<?- butildimetilsilil)- 3- D- ribofuranozil1- 4- fdi-( 4-

metoksifenil) fenilmetil] amino- 7/^ pirolof2. 3- o1pirimidin i

7- f3, 5- bis- Q-( te/ p- butildimetilsiliD- B- D- ribof uranozil1- 4- fdi-( 4-

metoksifenil) fenilmetilfamino- 7Mpirolor2, 3- fl1 pirimidin

Rastvoru smeše jedinjenja iz Koraka A (3.0 g, 6.0 mmol) u anhidrovanom piridinu (30 mL) je dodat 4,4'-dimetoksitritil hlorid (2.8 g, 8.2 mmoi) i reakciona mešavina je mešana na sobnoj temperaturi u toku noći. Smeša je zatim, triturisana vodenim piridinom i ekstrahovana etrom. Organski sloj je ispran vodom, osušen nad anhidrovanim natrijum sulfatom i ukoncentrisan do žute pene (5.6 g). Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom nad silika gelom upotrebom 20-25% EtOAc u heksanima, kao eluenta. Odgovarajuće frakcije su sakupljene i ukoncentrisane da bi se dobio 2,,5'-bis-0-(terc-butildimetilsilil)- i 3',5'-bis-0-(terc-butilmetilsrlil)

zaštićeni nukleozidi u vidu bezbojne pene (2.2 g i 1.0 g, pojedinačno).

Korak C: 7- r2, 5- bis- 0(/ gAg- butildimetilsilil)- 3- Otozil- g- D- ribofuranozil|-4-

rdi-( 4- metoksifenil) fenilmetinamino- 7A^ pirolof2, 3- c1 pirimidin

Ledeno-hladnom rastvoru 2',5'-bis-0-(terc-butildimetilsilil)-zaštićenog nukleozida iz Koraka B (2.0 g, 2.5 mmol) u piridinu (22 mL) je dodat p-toluensulfonil hlorid (1.9 g, 9.8 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi u toku četiri dana. Zatim je triturisana vodenim piridinom (50%, 10 mL) i ekstrahovana etrom (3x50 mL) koji sadrži malu količinu CH2CI2(10 mL). Organski sloj je ispran natrijum bikarbonatom i vodom (3x30 mL). Organski sloj je osušen nad anhidrovanim Na2S04i ukoncentrisan. Piridin je uklonjen ko-uparavanjem sa toluenom {3x25 mL). Ostatak ulja se filtrira kroz sloj silika gela upotrebom heksan:etil acetat smeše (70:30) kao eluenta; prinos 1.4 g.

Korak D: 4- rdi-( 4- metoksifenil) fenilmetinamino- 7- r3- Q- tozil- B- D-ribofuranozil- 7ySt- pirolor2. 3- o1pirimidin.

Rastvor jedinjenja iz Koraka C (1.0 g, 1.1 mmol) i THF (10 mL) je mešan sa tetrabutilamonijum fluoridom (1M rastvor u THF, 2.5 mL) tokom 0.5 h. Mešavina je ohlađena i razblažena etrom (50 mL). Rastvor je ispran vodom (3 x 50 mL), osušen nad anhidrovanim Na^O,, i ukoncentrisan do ulja. Ostatak je prečišćen propuštanjem kroz sloj silika gela upotrebom smeše heksan:etil acetat (1:1) kao eluenta; prinos 780 mg.

Korak E: 4- amino- 7-( 3- deoksi- 2- g- metil- S- D- ribofuranozil)- 7/ Tt- pirolo

f2. 3- Qlpirimidin i 4- amino- 7-( 3- deoksi- 2-( 3- metil- B- D-arabinofuranozil)- 7/^ pirolo- f2. 3- ofoirimidin

Rastvor CH3MgJ (3.0M rastvor u etru, 3.0 mL) u anhidrovanom toluenu (3.75 mL) je ohlađen u ledenom kupatilu. Ovome je dodat rastvor jedinjenja iz Koraka D (500 mg, 0.8 mmol) u anhidrovanom toluenu (3.7 mL). Nastala mešavina je mešana na sobnoj temperaturi u toku 3.5 h. Ohlađena je i tretirana vodenim NH4CI rastvorom i ekstrahovana etrom (50 mL, koji sadrži 10 mL CH2CI2). Organski sloj je izdvojen i ispran slanim rastvorom (2 x 30 mL) i vodom (2 x 25 mL), osušen nad anhidrovanim Na2S04i ukoncentrisan do ulja, koje je prečišćeno fleš hromatografijom na silika gelu upotrebom 4%-tnog MeOH u CH2CI2da bi se dobilo 2-C-a-metil jedinjenje (149 mg) i 2-C-B-metil jedinjenje (34 mg). Ovi derivati su odvojeno tretirani 80%-tnom sirćetnom kiselinom i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi u toku 2.5 h. Sirćetna kiselina je uklonjena ponavljanim ko-uparavanjem sa etanolom i toluenom. Ostatak je podeljen između hloroforma i vode. Vodeni sloj je ispran sa hloroformom i ukoncentrisan. Upareni ostatak je prečišćen na silika gelu upotrebom 5-10% MeOH u CH2CI2kao eluenta, kako bi se dobila željena jedinjenja u vidu belih čvrstih materija.

4- amino- 7-( 3- deoksi- 2- C?- metil- B- D- ribofuranozil)- 7/ Tt- pirotor2, 3- <3lpirimidin

(9.0 mg):

<1>H NMR (DMSO-de): 8 0.74 (s, 3H, CrtJ, 1.77 (dd, 1H, H-3'), 2.08 (t, 1H, H-3"), 3.59 (m. 1H, H-5'), 3.73 (m. 1H, H-5"), 4.15 (m, 1H, H-4<*>), 5.02 (t, 1H, OH-5"), 5.33 (s, 1H, OH-2'), 6.00 (S, 1H, H-V), 6.54 (d, 1H, H-7), 6.95 (brS, 2H, NHJ, 7.47 (d,1H, H-8), 8.00 (s. 1H. H-2); ES-MS: 263.1 [M H].

4- amino- 7-( 3- deoksi- 2- <^ metil- 3- D- arabinofuranozil)- 7/^

(15 mg):

'H NMR (DMSO-d6): 5 1.23 (s, 3H, CH3), 2.08 (ddd, 2H, H-3' t 3"), 3.57 (m, 2H, H-5' i 5"), 4.06 (m, 1H. H-4), 5.10 (s, 1H, OH-2'), 5.24 (t, 1H, OH-5'), 6.01 (s, 1H, H-1'), 6.49 (d, 1H, H-7), 6.89 (br s, 2H, NH^, 7.35 (d. 1H, H-8), 8.01 (S, 1H. H-2). ES-MS: 265.2 [M+H].

PRIMER 28

4- amino- 7-( 2t4- dimetil- B- D- ribofuranozil)- 7Mpirolof2, 3- o1 pirimidin

Korak A: 5- deoksi- 1, 2- Oizopropiliden- D- ksitofuranoza

1,2-CMzopropiliden-D-ksilofuranoza (38.4 g, 0.2 mol), 4-dimetilaminopiridin (5 g), trietilamin (55.7 mL, 0.4 mol) su rastvoreni u dihlorometanu (300 mL). Dodaje se p-toluensulfonil hlorid (38.13 g, 0.2 mol) i reakciona smeša meša na sobnoj temperaturi u toku 2 h. Reakciona smeša se zatim izliva u zasićeni vodeni natrijum bikarbonat (500 mL) i izdvajaju se dva sloja. Organski sloj se ispira vodenim rastvorom limunske kiseline (20%-tni, 200 mL), suši (Na^SOJ i upari da bi se dobila čvrsta masa (70.0 g). Čvrsta masa se rastvara u suvom THF-u (300 mL) i doda se LiAIH4(16.0 g, 0.42 mol) iz delova u toku 30 minuta. Mešavina se meša na sobnoj temperaturi tokom 15. U vidu kapi

se doda etil acetat tokom 30 minuta i smeša filtrira kroz sloj silika gela. Filtrat se ukoncentriše i nastalo ulje podvrgne hromatografiji na silika gelu (EtOAc/heksan 1/4) kako bi se dobio proizvod u vidu čvrste mase (32.5 9)-

Korak B: 3, 5- bis- 0( 2, 4- dihlorofenilmetil')- 1- 0- metil- 4- mettl-

g- D- ribofuranoza

Hromijum oksid (50 g, 0.5 mol), sirćetni anhidrid (50 mL, 0.53 mol) i piridin (100 mL, 1.24 mol) su dodati dihlorometanu (1 L) u ledenom-vodenom kupatilu i smeša je mešana tokom 15 minuta. Doda se 5-deoksi-1,2-<3-izopropiliden-D-ksiiofuranoza (32 g, 0.18 mol) u dihlorometanu (200 mL) i smeša meša na istoj temperaturi u toku 30 minuta. Reakcioni rastvor se razblaži etil acetatom (1 L) i filtrira kroz sloj silika gela. Filtrat se ukoncentriše da bi se dobilo žuto ulje. Ulje se rastvara u 1,4-dioksanu (1 L) i formaldehidu (37%, 200 mL). Rastvor se ohladi na 0°C i doda se čvrst KOH (50 g). Mešavina se meša na sobnoj temperaturi preko noći i podvrgava ekstrakciji sa etil acetatom (6x200 mL). Posle ukoncentrisavanja, ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu (EtOAc) da bi se dobio proizvod u vidu ulja (1.5 g). Ulje se rastvori u 1-metil-2-pirolidinonu (20 mL) i doda se 2,4-dihlorofenilmetil hlorid (4 g, 20.5 mmol) i NaH (60%, 0.8 g). Smeša se tokom noći meša i razblaži toluenom (100 mL). Mešavina se zatim, ispira zasićenim vodenim natrijum bikarbonatom (3x50 mL), suši (NajSO^ i upari. Ostatak se rastvori u metanolu (50 mL) i doda se HCI u dioksanu (4M, 2 mL). Rastvor se meša preko noći i upari. Ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu (EtOAc/heksan:1/4) da bi se dobio željeni proizvod u vidu ulja (2.01

g)<.>

Korak C: 3, 5- bis- <X2, 4- dihlorofenilmetil)- 2, 4- di- C'- metil- 1- ć>metil-

g- D- ribof u ranoza

Proizvod (2.0 g, 4.0 mmoi) iz Koraka B i Dess-Martinov perjodinan (2.0 g) u dihlorometanu (30 mL) su mešani tokom noći na sobnoj temperaturi i zatim, ukoncentrisani pod sniženim pritiskom. Ostatak je usitnjen etar etrom (50 mL) i filtriran. Filtrat je ispran rastvorom Na2S203.5H20 (2.5 g) u zasićenom vodenom rastvoru natrijum bikarbonata (50 mL), osušen (MgSOJ, filtriran i uparen. Ostatak je rastvoren u anhidrovanom Et20 (20 mL) i u vidu kapi je dodat rastvor MeMgBr tr Et20 (3M, 10 mL) na -78°C. Reakciona smeša je ostavljena da se zagreje do -30°C i mešana je na -30°C do -15°C u toku 5 h, zatim, izručena u zasićen vodeni amonijum hlorida (50 mL). Izdvojena su dva sloja i organski sloj je osušen (MgSOJ, filtriran i ukoncentrisan. Ostatak je podvrgnut hromatografiji na silika gelu (EtOAc/heksan:1/9) da bi se dobilo naslovljeno jedinjenje u vidu sirupa (1.40 g).

Korak D: 4- hloro- 7- f3, 5- bis- CL( 2, 4- dihlorofenilmetil)- 2, 4- di- 6i- metil- B- D-ribofuranozin- 7/ t-^ pirolof2, 3- oipirimidin

Jedinjenje iz Koraka C (0.70 g, 1.3 mmol) je dodato HBr-u (5.7M u sirćetnoj kiselini, 2 mL). Nastali rastvor se meša u toku 1 h na sobnoj temperaturi, upari in vacuo i ko-upari sa anhidrovanim toluenom (3 x 10 mL). 4-hloro- //^pirolofos-ojpirimidin (0.5 g, 3.3 mmol) i sprašeni KOH (85%, 150 mg, 2.3 mmol) se mešaju u 1 -metil-2-pirolidinonu (5 mL) tokom 30 minuta i mešavina se ko-upari sa toluenom (10 mL). Nastali rastvor je izručen u gornji bromo šećerni ostatak i mešavina se meša preko noći. Smeša jo razblažena toluenom (50 mL), isprana vodom (3 x 50 mL) i ukoncentrisana pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu eluirajući sa smešom EtOAc/heksan (15/85) da bi se dobila čvrsta masa (270 mg).

Korak E: 4- amino- 7-( 2. 4- C'- dimetil- g- D- ribofuranozil)-7/^ pirolof2, 3- ofoirim' din

Jedinjenje iz Koraka D (270 mg) je rastvoreno u dioksanu (2 mL) i tečnom amonijaku (20 g) i stavljeno je u autoklav od nerđajućeg čelika. Smeša se zagreva na 100°C tokom 15, zatim, ohladi i upari. Ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu (EtOAc) kako bi se dobila čvrsta masa (200 mg). Čvrsta masa (150 mg) i Pd/C (10% 150 mg) u rnetanolu (20 mL) se mućka pod H2(30 psi) u toku 3 h, filtrira i upari. Ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu (MeOH/CH2CI2:1/9) kako bi se dobio željeni proizvod u vidu čvrste mase (35 mg).

<1>H NMR (DMSO-og: 5 0.65 (s, 3H), 1.18 (s, 3H), 3.43 (m, 2H), 4.06 (d, 1H,J 6. 3Hz), 4.87 (S, 1H), 5.26 (br, 1H), 5.08 (d, 1H,J 6. 3Hz), 5.25 (t, 1H,J 3. 0Hz), 6.17 (s, 1H), 6.54 (d, 1H, 7 3.5 Hz), 6.97 (s, br, 2H), 7.54 (d, 1H,J 3.4Hz), 8.02 (s, 1H).<13>CNMR(DMSO-og: 6 18.19, 21.3a 65.38, 73.00, 79.33, 84.80, 90.66, 99.09, 102.41, 121.90, 149.58, 151.48, 157.38.

LOMS: Nađeno: 295.1 (M+H<*>); izračunato za C^H^N^+H<*>: 295.1.

PRIMER 29

4- amino- 7-( 3- deoksi- 3- fluoro- 2- g- metil- g- D- ribofuranozil')- 7AApirolof2, 3- o1

pirimidin

Korak A: 3- deoksi- 3- fluoro- 1- Q- metil- 5- <9- toluoil- a-- D- ribofuranoza

1,2-CMzopropiliden-D-ksilofuranoza (9.0 g, 50 mmol) i p-toluoil hlorid (7.0 mL, 50 mmol) u piridinu (50 mL) su mešani tokom 30 minuta. Dodata j©voda (10 mL) i smeša ukoncentrisana pod sniženim pritiskom. Ostatak je rastvoren u toluenu (500 mL) i rastvor ispran vodom (200 mL) i zasićenim vodenim natrijum bikarbonatdm (200 mL). Dva sloja se izdvajaju i organski sloj upari. Ostatak se rastvori u rnetanolu (100 mL) i doda se HCI u dioksanu (4M, 10 mL). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom noći i zatim, uparena pod sniženim pritiskom. Nastalo ulje je podvrgnuto hromatografiji na silika gelu (EtOAc/heksan:1/1) da bi se dobilo ulje (10.1 g). Ulje je rastvoreno u dihlorometanu (100 mL) i dodat je dietilaminosumpor trifluorid (DAST) (5.7 mL). Smeša je mešana preko noći i zatim izručena u zasićeni vodeni rastvor natrijum bikarbonata (100 mL). Smeša je ekstrahovana toluenom (2x50 mL), a sjedinjeni organski slojevi se ukoncentrišu. Ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu (EtOAc/heksan: 15/85) kako bi se dobilo naslovljeno jedinjenje u vidu ulja (1.50 g).

Korak B: 3- deoksi- 3- fluoro- 2- g- metil- 1 - Pmetil- 5- ĆMoluoil-

g- D- ribofuranoza

Proizvod iz Koraka A (1.0 g, 3.5 mmol) i Dess-Martinov perjodinan (2.5 g) u dihlorometanu (20 mL) su mešani tokom noći na sobnoj temperaturi i zatim, ukoncentrisani pod sniženim pritiskom. Ostatak je usitnjen dietil etrom (50 mL) i filtriran. Fiitrat je ispran rastvorom Na2S203.5H20 (12.5 g) u zasićenom vodenom rastvoru natrijum bikarbonata (100 mL), osušen (MgSOJ, filtriran i uparen. Ostatak je rastvoren u anhidrovanom THF-u (50 mL). Dodati su TiCI4(3mL) i metil magnezijum bromid u etil etru (3M, 10 mL) na -78°C i smeša je mešana na -50°C do -30°C u toku 2 h. Smeša je izručena u zasićeni vodeni rastvor natrijum bikarbonata (100 mL) i filtrirana kroz Celit. Filtrat je ekstrahovan toluenom (100 mL) i uparen. Ostatak je podvrgnut hromatografiji na silika gelu (EtOAc/heksan:15/85) da bi se dobilo naslovljeno jedinjenje u vidu ulja (150 mg).

Korak C: 4- amino- 7-( 3- deoksi- 3- fluoro- 2- g- metil- 6- D-ribofuranozil)- 7/^ pirolof2. 3- olpirimidin

Jedinjenje iz Koraka B (150 mg, 0.5 mmol) je rastvoreno u HBr-u (30%) i sirćetnoj kiselini (2mL). Posle jednog sata rastvor se upari pod sniženim pritiskom i ko-upari sa toluenom (10mL). 4-h'oro-/#-pirolo[2,3-o]pirimidin (0.5 g, 3.3 mmol) i sprašeni KOH (85%, 150 mg, 2.3 mmol) se mešaju u DMF-u (3mL) tokom 30 minuta i mešavina se ko-upari sa toluenom (2mL). Nastali rastvor se izruči u gornji bromo šećer i mešavina se meša preko noći. Smeša je razblažena toluenom (50mL), isprana vodom (3x50mL) i ukoncentrisana pod sniženim pritiskom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu (EtOAc/heksan: 15/85) da bi se dobilo ulje (60mg). Ulje je rastvoreno u dioksanu (2mL) i dodaje se tečni amonijak (20g) u autoklavu od nerđajućeg čelika. Smeša se zagreva na 85°C tokom 18 h, zatim, hladi i upari. Ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu (metanol/dihlorometan:1/9) kako bi se dobilo naslovljeno jedinjenje u vidu čvrste mase (29mg).

'H NMR (DMSO-fl^: 5 0.81 (s, 3H), 3.75 (m, 2H), 4.16 (m, 1H), 5.09 (dd, 1H,J53.2, 7.8 Hz), 5.26 (br, 1H), 5.77 (s, 1H). 6.15 (d, 1H,J 2.9Hz), 6.59 (d, 1H,J 3.4Hz), 7.02 (Sbr, 2H), 7.39 (d, 1H,J3AHz), 8.06 (s, 1H).

<13>CNMR(DMSO-oy: 519.40, 59.56, 77.24, 79.29, 90.15, 91.92, 99.88, 102.39, 121.17, 149.80, 151.77, 157.47.

,<9>F NMR (DMSO-oy: 5 14.66 (m).

ES-MS: Nađeno: 283.1 (M+H<*>); izračunato za C,3H1SFN403+H<*>: 283.1.

PRIMER 30

4- amino- 7-( 2- C, 2- C>- dimetil- 3- D- ribofuranozil)- 7// pirolor2, 3- o! pirimidin

Korak A: 4- hloro- 7- f3. 5- bis-( J-( 2. 4- dihlorofenilmetil)- 2- a2- č>dimetil-B- D- ribofuranozil1- 7/^ pirolof2, 3- dpirimidin

U prethodno hlađeni (0°C) rastvor jedinjenja iz Primera 2, Koraka D {618 mg, 1.0 mmol) u THF-u (8 mL) je dodat metil jodid (709 mg, 5.0 mmol) i NaH (60% u mineralnom ulju) (44 mg, 1.1 mmol). Nastala mešavina je mešana preko noći na sobnoj temperaturi i zatim, izručena u mešanu smešu zasićenog vodenog amonijum hlorida (50mL) i dihlorometana (50mL). Organski sloj je ispran vodom (50mL), osušen (MgSOJ i uparen in vacuo. Nastali sirovi proizvod je prečišćen na silika gelu upotrebom acetat/heksana, kao eluenta. Frakcije, koje sadrže proizvod su sjedinjene i uparene in vacuo da bi se dobio željeni proizvod (735 mg) u vidu bezbojne pene.

Korak B: 4- amino- 7- r3. 5- bis- 0( 2, 4- dihlorofenilmetil)- 2- C2- Odimetil-B- D- rioofuranozill- ZMpirolofe. S- ofoirimidin

Jedinjenju iz Koraka A (735 mg, 1.16 mmol) je dodat amonijak u rnetanolu (zasićen na 0°C) (20mL). Smeša je grejana u autoklavu od nerđajućeg čelika na 80°C u toku noći, zatim, ohlađena i sadržaj uparen in vacuo. Sirova smeša je prečišćena na silika gelu upotrebom etil acetat/heksan smeše kao eluenta. Frakcije, koje sadrže proizvod su sjedinjene i uparene in vacuo da bi se dobio željeni proizvod (504 mg) u vidu bezbojne pene.

Korak C: 4- amino- 7- f2- 6'. 2- Č>dimetil- B- D- ribofuranozil)- 7/ cTf:

pirolof2, 3- o1pirimidin

Smeša proizvoda iz Koraka C (64 mg, 0.1 mmol), MeOH (5mL), EtjN (0.2mL) i 10%-tni Pd/C (61 mg) je u toku noći hidrogenizovana na Parr-ovom hidrogenatoru pri 50 psi i sobnoj temperaturi. Smeša je filtrirana preko celita, uparena in vacuo i filtrirana kroz sloj silika gela upotrebom 2%-tnog metanola u dihlorometanu, kao eluenta. Željeni proizvod je sakupljen i uparen in vacuo. Jedinjenje je ponovo rastvoreno u rnetanolu (10ml_) i dodato je 10% Pd/C (61 mg). Smeša je tokom dve nedelje hidrogenizovana na Parr-ovom hidrogenatoru pri 55 psi i sobnoj temperaturi. Smeša je filtrirana kroz celit, uparena in vacuo i prečišćena na silika gelu upotrebom 10%-tnog metanola u dihlorometanu, kao eluenta. Frakcije, koje sadrže proizvod su sjedinjene i uparene in vacuo da bi se dobio željeni proizvod (110mg) u vidu bezbojne pene.

<1>H NMR (DMSO-oy: 5 0.68 (s, 3H), 3.40 (S. 3H), 3.52-3.99 (preklapajuća m, 4H), 4.92 (d, 1H), 5.07 (t, 1H), 6.26 (s, 1H), 6.55 (d, 1H), 7.00 br, 2H), 7.46 (d, 1H), 8.05 (s, 1H).

LC-MS: Nađeno: 293.1 (M-H<*>); izračunato za C12H1SN404-H<*>: 293.12.

PRIMER 31

4- metilamino- 7-( 2- g- metil- B- D- ribofuranozil)- 7A^ pirolof2, 3- grl pirimidin

Jedinjenje iz Koraka E Primera 2 (200 mg, 0.67 mmol) je dodato metilaminu (5 mL kondenzovan u malom autoklavu od nerđajućeg čelika) i zagrevano je na 85°C u toku 48 h, zatim, ohlađeno i upareno in vacuo. Sirova smeša je prečišćena na silika gelu sa etanolom, kao eluentom da bi se dobilo naslovljeno jedinjenje koje se izdvojilo u vidu amorfne Čvrste mase posle tretmana sa MeCN-om. Amorfna čvrsta masa se rastvori u vodi i liofilizuje kako bi se dobio bezbojni prašak (144mg).

<*>H NMR (DMSO-cQ: 5 0.63 (s, 3H, CHg), 3.32 (s, 3H, N CH,), 3.58-3:67(m,1H, H-5'), 3.79-3.39 (m, 3H, H-5", H-4<1>, H-3'), 5.03 (S, 1H, 2'OH), 5.04-5.11 (1H.3--OH, 1H,

5 -OH), 6.14 (S, 1H, H-1'), 6.58 (d, 1H, 4.6=3-6 Hz, H-5), 7.46 (d, 1H, H-6), 7.70 (br

S, 1H, NH), 8.14 (S, 1H, H-2).

LC-MS: Nađeno: 295.1 (M-H<*>); izračunato za C13H13N404+H<+>: 294.3.

PRIMER 32

4- dimetilamino- 7-( 2- g- metil- B- D- ribofuranozil)- 7yt/ pirolof2, 3- o1 pirimidin

Jedinjenje iz Koraka E Primera 2 (200 mg, 0.67 mmol) je dodato dimetilaminu (5 mL kondenzovan u malom autoklavu od nerđajućeg čelika) i zagrevano je na 85°C u toku 48 h, zatim, ohlađeno i upareno in vacuo. Sirova smeša je prečišćena na silika gelu sa etanolom, kao eluentom da bi se dobilo naslovljeno jedinjenje koje se izdvojilo u vidu amorfne čvrste mase posle tretmana sa MeCN-om. Amorfna čvrsta masa se rastvori u vodi i liofilizuje kako bi se dobio bezbojni prašak (164mg).

'H NMR (DMSO-og: S 0.64 (s, 3H, CH3), 3.29 (s, 3H, N CH3), 3.32 (S, 3H, N CH,), 3.60-3.66 (m, 1H, H-5<*>), 3.77-3.97 (m, 3H, H-5", H-4", H-3<*>), 5.04 (S, 1H. 2'-OH), 5.06-5.11 (1H, 3'-OH, 1H, 5'-OH), 6.21 (s, 1H, H-1'), 6.69 (d, 1H,v4«=3.6 Hz, H-5), 7.55 (d, 1H, H-6), 8.13 (S, 1H, H-2).

LC-MS: Nađeno: 309.3 (M-H<*>); izračunato za C^H^C+H<*>: 308.33.

PRIMER 33

4- ciklopropilamino- 7-( 2- f>metil- f3- D- ribofuranozil)- 7A/- pirolof2, 3- o1 pirimidin

Jedinjenje iz Koraka E Primera 2 (200 mg, 0.67 mmol) je dodato ciklopropilaminu (5 mL kondenzovan u malom autoklavu od nerđajućeg čelika) i zagrevano je na 85°C u toku 48 h, zatim, ohlađeno i upareno in vacuo. Sirova smeša je prečišćena na silika gelu sa etanolom, kao eluentom da bi se dobilo naslovljeno jedinjenje koje se izdvojilo u vidu amorfne čvrste mase posle tretmana sa MeCN-om. Amorfna čvrsta masa se rastvori u vodi i liofilizuje kako bi se dobio bezbojni prašak (148mg).

'H NMR (DMSO-oy: 6 0.51-0.58 (m, 2H), 0.64 (s, 3H, CH,), 0.74-0.076 (m, 2H), 3.62-3.67 (m, 1H, H-5'), 3.79-3.82 (m, 3H, H-5"), 3.92-3.96 (m. H-4", H-3'), 5.03 (s, 1H, 2'-OH), 5.05-5.10 (1H, 3'-OH, 1H, 5'-OH), 6.15 (s, 1H, H-1"), 7.48 (d. 1H,«/5S=3.6 Hz, H-5), 7.59 (d, 1H, H-6), 8.13 (s, 1H, H-2).

LC-MS: Nađeno: 321.1 (M-H<*>); izračunato za C^HaoN^+H*: 320.3.

PRIMER 34

4- amino- 7-( 3- g>metil- B- D- ksilofuranozil)- 7/^ pirolof2. 3- o1 pirimidin

Korak A: 7- f2, 5- bis- <X,/ g/ z>butildimetilsilil)- l3- D- ribofuranozil1- 4- f( 4-

metoksifenil) difenilmetinamino- 7/ y- pirolof2. 3- o1pirimidin i

7- r3, 5- bis- <J-( et/ p- butildimetilsilil)- B- D- ribofuranozin- 4- R4-

metoksifenil) difenilmetillamino- 7// pirolor2, 3- <3'| pirimidin

Rastvoru mešavine jedinjenja iz Koraka A Primera 26 i 27 (0.32 g, 0.65 mmol) u anhidrovanom piridinu (6mL) je dodat monometoksitritil hlorid (0.30 g, 0.98 mmol) i reakciona mešavina je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Smeša je zatim, ukoncentrisana i ostatak podeljen između CH2CI2(70mL) i vode (20ml_). Organski sloj je ispran vodom i slanim rastvorom, osušen (Na^SOJ i ukoncentrisan. Ostatak je prečišćen na koloni silika gela upotrebom 5-13% EtOAc u heksanu, kao eluenta. Odgovarajuće frakcije su sakupljene i ukoncentrisane da bi se dobili 2',5'-bis-0-(/e/(Obutildimetilsilil)- i 3',5'-bis-0-(/e/-<>butildimetilsili!) zaštićeni nukleozidi u vidu bezbojnih pena (343 mg i 34 mg, pojedinačno).

Korak B: 7- f2, 5- bis-( >(/ gA£>butildimetilsilil)- 3- D- g/ yfrg>- pentofuranoz- 3-

ulozil1- 4- f( 4- metoksifenil) difenilmetinamino- 7A/- pirolor2, 3- ol

pirimidin

U dobro izmešanu suspenziju hromijum trioksida (91 mg, 0.91 mmol) u CH2CI2(4ml_) na 0°C je dodat piridin (147 u.L, 1.82 mmol) i zatim, sirćetni anhidrid (86 u.L, 0.91 mmol). Mešavina je mešana na sobnoj temperaturi u toku 0.5 h. Zatim, dodat je 2'5'-bis-0-(fe/ev butildimetilsilil) zaštićeni nukleozid iz Koraka A (343 mg, 0.45 mmol) u CH2CI2(2.5 mL) i smeša je mešana na sobnoj temperaturi 2 h. Smeša je zatim, izručena u ledeno-hladni EtOAc (10mL) i filtrirana kroz kratku kolonu silika gela upotrebom EtOAc, kao eluenta. Filtrat je uparen i ostatak prečišćen na koloni silika gela sa heksanima i šmešom heksani/EtOAc (7/1), kao eluentom kako bi se dobilo naslovljeno jedinjenje (180 mg).

Korak C: 7- f2, 5- bis-( X/ grg>- butildimetilsilil)- 3- Ci- metil- 3- D- ribofuranozil1-4- rf4- metoksifenil) difenilmetinamino- 7/ LTf- pirolof2, 3- o! pirimidin i

7- r2, 5- bis- 0( te/ o- butildimetilsilil)- 3- g- metil- B- D- ksilofuranozil)- 4-f( 4- metoksifenil) difenilmetilTamino- 7/ T,- pirolof2, 3- o1 pirimidin

Mešavini MeMgBr (3.0 M rastvor u etru; 0.17 mL, 0.5 mmol) u anhidrovanim heksanima (1.5mL) na sobnoj temperaturi, u vidu kapi je dodat rastvor jedinjenja iz Koraka B (78 mg, 0.1 mmol) u anhidrovanim heksanima (0.5mL). Posle 2 h mešanja na sobnoj temperaturi, reakciona smeša je izručena u ledeno-hladnu vodu (10mL) i razblažena sa EtOAc

(20mL) zatim, filtrirana kroz Celit, koji je onda temeljno ispran sa EtOAc. Slojevi su razdvojeni i organski sloj je ispran slanim rastvorom, osušen (Na2S04) i ukoncentrisan. Ostatak je prečišćen na koloni silika gela upotrebom 8 do 25% EtOAc u heksanima, kao eluenta da bi se dobio 3-C-metilksilo- (60mg) i 3-C-metilribo- izomer (20mg).

Korak D: 4- amino- 7-( 3- Ometil- 6- D- ksilofuranozil)- 7/' Tf- pirolof2, 3- o1

pirimidin

U ledeno-hladni rastvor 3-C-metil-ksiio-izomernog oblika iz Koraka C (60mg, 0.08 mmol) u THF-u (2mL) je dodat TBAF (1 M u THF-u; 0.32 mL, 0.32 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 5 h zatim, razblažena sa CH2CI2(50mL), isprana vodom (3x15mL), osušena i uparena. Ostatak je rastvoren u dioksanu (0.3mL) i dodata je 80%-tna sirćetna kiselina (3mL). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 dana i onda uparena. Ostatak je ko-uparen sa dioksanom, prenet u vodu (50mL) i ispran sa CH2CI2(2x1 OmL). Vodeni sloj je ukoncentrisan i zatim, osušen smrzavanjem. Ostatak je prečišćen na koloni silika gela sa CH-jCL/MeOH (20/1 i 10/1), kao eluenta da bi se dobilo naslovljeno jedinjenje u vidu belog paperjastog jedinjenja<p>osle sušenja smrzavanjem (10mg).

'HNMR (CD3CN):5 1.28 (S,3H,CH,),3.56 (brs,1H, OH), 3.78 (m, 3H, H-4<*>,H-5', H- 5").4.10 (brS,1H,OH),4.44 (d, 1H,^.=3.9Hz, H-2'), 5.58 (d, 1H, H-1'),5.85(brs,2H, NHa), 6.15 (brs,1H, OH), 6.48 (d,1H, ^i6=3.7 Hz,H-5), 7.23 (d,1H, H-6),8.11(3, 1H,H-2).

ES-MS: 281[MH]<*>.

PRIMER 35

4- amino- 7-( 3- g- metil- 6- D- ribofuranozil)- 7/,-/- pirolof2. 3- o1 pirimidin

Ribo-izomernom obliku (20 mg) iz Koraka C Primera 32 je uklonjena zaštita upotrebom postupka opisanog u Koraku D Primera 32 kako bi se dobilo naslovljeno jedinjenje (4mg).

<1>H NMR (CD3CN): 5 1.43 (S, 3H, CHg), 3.28 (brS, 1H, OH), 3.58 (m, 2H, H-5', H-5"), 3.99 (m, 1H, H-4<*>), 4.10 (br s, 1H, OH), 4.62 (d, 1H, ^.=8.1 Hz, H-2'), 5.69 (d, 1H, H-1<1>), 5.88 (br s, 3H. OH, NHJ, 6.45 (br s, 1H, OH), 6.51 (d, 1H, «4e=3.7 Hz, H-5), 7.19 (d, 1H, H-6), 8.12 (s, 1H, H-2).

ES-MS: 281 [MH]<*>.

PRIMER 36

2, 4- diamino- 7-( 2- g- metil- 3- D- ribofuranozil)- 7/ i, :pirolor2, 3- <7l pirimidin

Smeša proizvoda iz Koraka B Primera 4 (24mg) u vodenom amonijaku (30%, 10mL) je zagrevana u autoklavu od nerđajućeg čelika na 100°C preko noći zatim, ohlađena i uparena. Ostatak je prečišćen na koloni silika gela sa CHgCL/MeOH (10/1 i 5/1), kao eluentom kako bi se dobilo naslovljeno jedinjenje (15mg).

'H NMR (DMSO-o^: 8 0.68 (s, 3H, CH3), 3.48-3.58 (m, 1H, H-5'), 3.68-3.73 (m, 2H, H-5". H-4'), 3.84 (m, 1H. H-3'). 4.72 (s, 1H, 2'-OH), 4.97-5.03 (m, 2H, 3"-OH, 5'-OH), 5.45 (br s, 2H, NH2), 6.00 (s, 1H, H-1), 6.28 (d, 1H,J=3. 7Hz, H-5), 6.44 (br s, 2H, NHZ), 6.92 (d, 1H, J=3.7 Hz. H-6).

ES MS: 294.1 (M-H<*>).

PRIMER 37

4- amino- 2- fluoro- 7-( 2- g- metil- B- D- ribofuranozil)- 7/ Tf- pirolof2, 3- cr1 pirimidin

Rastvoru HF/piridin (70%, 2 mL) razblaženom sa piridinom (1mL) na -30°C dodato je jedinjenje iz Primera 36 (60 mg, 0.2 mmol) u 0.5 mL piridina, a zatim, fe/z>butil nitrit (36 mL, 0.3 mmol). Mešanje se nastavlja tokom 5 min. -25°C. Potom se rastvor izruči u ledenu vodu (5mL), neutrališe sa 2N-nim vodenim NaOH i upari do suva. Ostatak se prečisti na koloni silika gela sa ChLCIg/MeOH (20/1 i 10/1), kao eluentom kako bi se dobilo naslovljeno jedinjenje.

PRIMER 38

4- amino- 5- fluoro- 7-( 2- g- metil- B- D- ribofuranoziO- 7/^ pirolor2, 3- Ql pirimidin

Korak A: 4^- acetilamino- 7-( 2, 3, 5- tri- <>acetil- 2-(^ rnetil- 0- D- ribofuranozi[)-7/ Sf- pirolof2, 3- o1pirimidin

Rastvoru jedinjenja iz Koraka F Primera 2 (280 mg, 1.00 mmol) u piridinu je dodat sirćetni anhidrid (613 mg, 6.0 mmol). Nastali rastvor je mešan tokom noći na temperaturi sredine, uparen in vacuo i dobijena sirova mešavina prečišćena na silika gelu, korišćenjem smeše etil acetat/heksan, kao eluenta. Frakcije, koje sadrže željeni proizvod se sjedinjuju i upare in vacuo da bi se dobio željeni proizvod.

Korak B: 4- acetilamino- 5- bromo- 7-( 2, 3, 5- tri- C''- acetil- 2- C- metil- B- D-ribofuranozil)- 7/ Tf- pirolof2. 3- c?1pirimidin

U prethodno hlađeni (0°C) rastvor jedinjenja iz Koraka A (460 mg, 1.00 mmol) u DMF-u je dodat /V-bromosukcinimid (178 mg, 1.0 mmol) u DMF-u. Nastali rastvor se meša na 0°C tokom 30 minuta zatim, na sobnoj temperaturi još 30 minuta. Reakcija se završava dodatkom metanola i upari in vacuo. Nastala sirova smeša se prečisti na silika gelu upotrebom smeše etil acetat/heksan, kao eluenta. Frakcije, koje sadrže željeni proizvod se sjedine i upare in vacuo kako bi se dobio željeni proizvod.

Korak C: 4- amino- 5- fluoro- 7-( 2- C'- metil- B- D- ribofuranozil)- 7/ ¥

pirolof2. 3- <3lpžrimidin

U prethodno hlađeni (-78°C) rastvor jedinjenja iz Koraka B (520 mg, 1.00 mmol) u THF-u je dodat butil litijum (2M u heksanima) (0.5 mL, 1.00 mmol). Nastali rastvor se meša na -78°C tokom 30 minuta zatim, reakcija se završava dodatkom /Vfluorobenzensulfonamida (315 mg, 1.00 mmol) u THF-u. Nastali rastvor se ostavi da se sporo ugreje do temperature sredine i zatim, izruči u mešanu smešu zasićenog vodenog amonijum hlorida i dihlorometana. Organske faze se upare in vacuo i tretiraju amonijum hidroksidom na 55°C u zatvorenom sudu preko noći. Nastala sirova smeša se prečisti na silika gelu upotrebom smeše dihlorometan/metanol, kao eluenta. Frakcije, koje sadrže željeni proizvod se sjedine i upare in vacuo kako bi se dobio željeni proizvod.

BIOLOŠKI TESTOVI

U nastavku su opisani testovi koji se koriste za merenje inhibicije HCV NS5B polimeraze i replikacije HCV.

Delotvornost jedinjenja ovog pronalaska, kao inhibitora HCV NS5B RNK-zavisne RNK polimeraze (RdRp) je izmerena u testu koji sledi.

A. Test inhibicije HCV NS5B polimeraze:

Ovaj test je upotrebljen da izmeri sposobnost nukleozidnih derivata ovog pronalaska da inhibiraju enzimsku aktivnost RNK-zavisne RNK polimeraze (NS5B) hepatitis C virusa na heteromernom RNK templatu.

Postupak:

Puferski uslovi testa: (50u.L - total/reakcija)

20 mM Tris, pH 7.5

50 juM EDTA

5 mM DTT

2 mM MgCI2

80 mM KCI

0.4 U/U.L RNKzin (Promega, gotov iznosi 40 jedinica/u.L)

0.75 jjg t500 (500-nt RNK napravljen upotrebom T7 prekinute transkripcije sa sekvencom iz NS2/3 regiona hepatitis C genoma) 1.6 ug prečišćenog hepatitis C NS5B (oblik sa 21 aminokiselinom,

C-terminalno odsečen)

1 u,M A, C, U, GTP (mešavina nukleozidnih trifosfata)

[alfa-<32>P]-GTP ili [alfa-^Pj-GTP

Jedinjenja su testirana pri raznim koncentracijama sve do 100 u,M konačne koncentracije.

Odgovarajuća zapremina reakcionog pufera je napravljena uključujući enzim i temptat t500. Nukleozidni derivati ovog pronalaska su pipetirani u okna ploče sa 96 mesta. Napravljena je smeša nukleozidnih trifosfata (NTP-i), uključujući radioobeleženi GTP i pipetirana je u okna ploče sa 96 reakcionih mesta. Reakcija je započeta dodavanjem enzim-templat reakcionog rastvora i ostavljena je da teče tokom 1-2 h na sobnoj temperaturi.

Reakcija je zaustavljena dodavanjem 20 u,L 0.5M EDTA, pH 8.0. Uključene su i reakcije slepe u kojima se rastvor sa zaustavljenom reakcijom dodaje u NTP-e pre dodavanja reakcionog pufera.

Na diskove DE81 filtera (VVhatman) utačka se 50U-L rastvora sa zaustavljenom reakcijom i ostavi da se osuši u toku 30 minuta. Filteri se ispiraju sa 0.3 M amonijum formatom, pH 8 (150 mL/ispiranju sve dok cpm u 1 mL ispirka nije manji od 100, uobičajeno 6 ispiranja). Filteri se broje u 5-mL scintilacione tečnosti u scintilacionom brojaču.

Procenat inhibicije se računa prema sledećoj jednačini: %inhibicije = [1-(cpm u reakciji testa - cpm u reakciji slepe) / (cpm u kontrolnoj reakciji - cpm u slepoj)] x 100.

Prikazana jedinjenja, testirana testom HCV NS5B polimeraze ispoljavaju vrednosti IC50koje su manje od 100 mikromola.

B. Test inhibicije HCV RNK replikacije:

Jedinjenja ovog pronalaska su, takođe, ispitana na njihovu sposobnost da utiču na replikaciju RNK hepatitis C virusa u ćelijama kulture hepatoma (HuH-7), koje sadrže subgenomičnu HCV replikaciju. Detalji testa su opisani u nastavku. Ovaj test replikacije je modifikacija onog, koji je opisan u V. Lohmann, F. Korner, J-O. Koch, U. Herian, L. Theilmann, and R. Bartenschlager, "Replication of a Sub-genomic Hepatitis C Virus RNAs in a Hepatoma Cell Une", Science 285:110

(1999).

Protokol:

Test je bioin situribonukleazna zaštita, Test na ploči zasnovan na scintilacionom proksimitetu (SPA). U 100-200 uL medijuma, koji sadrži 0.8 mg/mL G418 zasejano je 10,000-40,000 ćelija, u citostar pločama sa 96 mesta (Amersham). Ćelijama su dodata jedinjenja pri raznim koncentracijama sve do 100 uL u 1% DMSO, tokom vremena od 0 do 18 h, a zatim su uzgajane u kulturi tokom 24-96 h. Ćelije su fiksirane (20 minuta, 10% formalin), permeabilizovane (20 minuta, 0.25% Triton X-100/PBS) i hibridizovane (preko noći, 50°C) sa jedno-lančanom<33>P RNK probom komplementarnom sa (+) lancem NS5B (ili drugim genima) koji je sadržan u RNK virusnom genomu. Ćelije se isperu, tretiraju sa RNK-azom, ispiraju, zagrevaju do 65°C i broje u Top-Count-u. Inhibicija replikacije se čita kao pad impulsa po minuti (cpm).

Humane HuH-7 hepatoma ćelije, koje su izabrane da imaju subgenomičnu replikaciju, nose citoplazmatsku RNK HCV 5' ne-translacionog regiona (NTR), neomicin selektabilni marker, EMCVIRES (položaj unosa unutrašnjeg ribozoma) i HCV ne-strukturne proteine NS3 do NS5B, zatim, 3' NTR.

Prikazana jedinjenja koja su ispitana testom replikacije ispojjila su vrednosti ECsomanje od 100 mikromola.

Nukleozidni derivati ovog pronalaska su, takođe, ispitani na ćelijsku toksičnost i anti-virusnu specifičnost u counterscreens, opisanim u nastavku.

C. Counterscreens:

Sposobnost nukleozidnih derivata ovog pronalaska da inhibiraju humane DNK polimeraze je izmerena sledećim testovima.

a. Inhibiciia humanih DNK polimeraza alfa i beta:

Uslovi reakcije:

50 uL reakcione zapremine

Sastojci reakcionog pufera:

20 mM Tris-HCI, pH 7.5

200 ug/mL govedjeg serumskog aibumina

100 mMKCI

2 mM 8-merkaptoetanola

10 mM MgCI2

1.6 uM dA, dG.dC, dTTP

M-saP-dATP

Enzim i templat:

0.05 mg/mL DNK templat raspuknute riblje sperme

0.01 U/u.L DNK polimeraze a ili B

Priprema DNK templata raspuknute riblje sperme:

Dodati 5 u.L 1M MgCI2u 500U.L aktivirane DNK riblje sperme (USB 70076);

Zagrejati na 37°C i dodati 30 u,L 65 U/uL egzonukfeaze III (GibcoBRL 18013-011);

Inkubirati 5 minuta na 37°C;

Završiti reakciju zagrevanjem na 65°C tokom 10 minuta;

Naneti 50-100 u.L alikvota na Bio-spin 6 hromatografsku kolonu (Bio-Rad 732-6002) uravnoteženu sa 20 mM Tris-HCI-a, pH 7.5;

Eluirati centrifugiranjem pri 1,000Xg tokom 4 minuta;

Sjediniti efuate i izmeriti apsorbancu na 260 nm da bi se odredila koncentracija.

DNK templat je razblažen u odgovarajućoj zapremini 20 mM-og Tris-HCI-a, pH 7.5, a enzim je razblažen u odgovarajućoj zapremini 20 mM-og Tris-HCI-a, koji sadrži 2 mM B-merkaptoetanola i 100 mM KCI. Templat i enzim su pipetirani u mikrocentrifuške epruvete ili ploče sa 96 reakcionih mesta. Takođe su pripremljene i reakcije slepe, koje isključuju enzim, kao i kontrolne reakcije, koje isključuju test jedinjenje pojedinačnom upotrebom pufera za razblaživanje enzima i rastvarača za test jedinjenje. Reakcija je otpočeta reakcionim puferom sa sastojcima, kao što su gore pobrojani. Reakcija je inkubirana tokom 1 sata na 37°C. Reakcija je završena dodavanjem 20 u.L 0.5M-og EDTA. 50 u.L rastvora završene reakcije je utačkano na fiiterske diskove VVhatman DE81 i osušeno na vazduhu. Filterski diskovi su ponavljano ispirani sa 150 mL 0.3M-im amonijum formatom, pH 8 sve dok 1 mL ispirka nije imao < 100 cpm. Diskovi su dva puta isprani sa 150 mL apsolutnog etanola i jedan put sa 150 mL anhidrovanog etra, osušeni i izmereni u 5 mL scintilacione tečnosti.

Procenat inhibicije je izračunat prema sledećoj jednačini: %inhibicije = [1-(cpm u reakciji testa - cpm u slepoj) / (cpm u kontrolnoj reakciji - cpm u slepoj)] x 100.

b. Inhibicita humane DNK polimeraze gama:

Mogućnost inhibicije humane DNK polimeraze gama je izmerena u reakcijama koje uključuju 0.5 ng/u.L enzima; 10 u.M dATP, dGTP, dCTP i TTP; 2 u.Ci/reakciji [ct-^Pj-dATP i 0.4 pg/u.L aktivirane DNK riblje sperme (kupljene od US Biochemical) u puferu koji sadrži 20 mM Tris-a pH 8, 2 mM B-merkaptoetanola, 50 mM KCI-a, 10 mM MgCI2i 0.1 pg/u-L BSA. Reakcije se razvijaju tokom 1 h na 37°C, a završavaju dodatkom 0.5M EDTA do konačne koncentracije od 142 mM. Formiranje proizvoda je mereno anjonskom izmenom filterskog vezivanja i scintilacionim brojanjem. Jedinjenja su testirana sve do 50 u,M.

Procenat inhibicije je izračunat prema sledećoj jednačini: %inhibicije = [1-(cpm u reakciji testa - cpm u slepoj) / (cpm u kontrolnoj reakciji - cpm u slepoj)] x 100.

Sposobnost nukleozidnih!derivata ovog pronalaska da inhibiraju infektivnost HlV-a i širenje HlV-a je izmerena u sledećim testovima.

c. Test infektivnosti HlV- a

Test se izvodi sa varijantom HeLa Magi ćelija, koja vrši ekpresiju i CXCR4 i CCR5, izabranih za nizak bekgraund ekspresije p-galaktozidaze (B-gal). Ćelije su infektovane tokom 48 h, a proizvodnja P-gal iz integrisanog HIV-1 LTR promotera je izmerena sa hemiluminescentnim supstratom (Galactolight Plus, Tropix, Bedford, MA). Inhibitori su titrirani (u duplikatu) u dvostrukim serijskim razblaženjima počevši od 100 u.M; procenat inhibicije pri svakoj koncentraciji je računat u odnosu na kontrolnu infekciju.

d. Inhibicija širenja HlV- a

Sposobnost jedinjenja ovog pronalaska da inhibiraju širenje virusa humane imunodeficijencije (HIV) izmerena je metodom, opisanom u U.S. Patentu Br. 5,413,999 (9. Maj 1995.) i J.P.Vacca, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.. 91: 4096-4100 (1994), koji su ovde u celosti uključeni kao reference.

Nukleozidni derivati ovog pronalaska se, takođe, ispituju na citotoksičnost prema hepatoma (HuH-7) kulturi ćelija, koja sadrži subgenomičnu HCV replikaciju u testu zasnovanom na MTS ćelijama, kao što je opisano u testu, u nastavku. HuH-7 Ćelijska loza je opisana u H.Nakabavashi, et al., Cancer Res., 42:3858 (1982).

e. Test citotoksičnosti

Ćelijske lulture su pripremljene u odgovarajućem medijumu pri koncentracijama od otprilike 1.5 x 10<5>ćelija/m L za kulture suspenzija u 3 inkubaciona dana i 5.0 x 10<4>ćelija/mL za adherentne kulture u 3 inkubaciona dana. 99 u,L ćelijske kulture se prenosi u okna ploče sa 96 reakcionih mesta za tretiranje kulturom tkiva i dodaje se 1 juL 100-puta konačne koncentracije test jedinjenja u DMSO. Ploče su inkubirane na 37°C i pod 5% COzu određenom vremenskom periodu. Posle perioda inkubacije, u svako okno se dodaje 20 ui_ reagensa CellTiter 96 Vodenog rastvora Jedan Testa ćelijske proliferacije (MTS) (Promega) i

ploče se inkubiraju na 37°C pri 5%COau sledećem vremenskom periodu od do 3 h. Ploče su mućkane da bi se izmešala okna i na 490 nm se čita apsorbanca, korišćenjem čitača za ploče. Pripremi se standardna kriva suspenzije kulture ćelija sa poznatim brojem ćelija neposredno pre dodavanja reagensa MTS. Metabolički aktivne ćelije redukuju MTS do formazana. Formazan apsorbuje na 490 nm. Apsorbanca na 490 nm u prisustvu jedinjenja se upoređuje sa apsorbancom u ćelijama bez dodatog bilo kog jedinjenja. Referenca: Cory, A.H.et a/.,"Use of an aqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cell grovvth assavs in culture", Cancer Commun. 3:207 (1991).

Sledeći testovi su korišćeni za merenje aktivnosti jedinjenja ovog pronalaska prema drugim RNK-zavisnim RNK virusima: a. Određivanje in vitro antivirusne aktivnosti jedinjenja prema rinovirusima

( Cvtopathic Effect Inhibition Assav) :

Uslovi testa su opisani u članku koji su napisali Sidvvell i Huffman, "Use of disposable microtissue culture piates for antiviral and interferon induction studies", Appl. Microbiol. 22:797-801 (1971).

Virusi:

Tip 2 rinovirusa (RV-2), lanac HGP, je upotrebljen sa KB ćelijama i medijumom {0.1% NaHC03, bez antibiotika), kao što se zahteva u Sidvvell and Huffman referenci. Virus dobijen od ATCC, bio je iz brisa ždrela odraslog muškarca sa umerenom akutnom febriinom bolešću gornjeg respiratornog trakta.

Tip 9 rinovirusa (RV-9), lanac 211 i rinovirus tip 14 (RV-14), lanac Tow su, takođe, dobijeni od American Type Culture Collection (ATCC) iz Rockville-a, MD. RV-9 je bio iz humanih ispiraka grla, a RV-14 iz brisa ždrela mlađih odraslih osoba sa bolešću gornjih respiratornih puteva. Ova oba virusa su upotrebljena sa HeLa Ohio-1 ćelijama (Dr Fred Havden, Univ. of VA), koje su bile ćelije humanog karcinoma cervikalnog epitela. Kao medijum za rast je korišćen MEM (Eagle's minimum essential medium) sa 5% fetalnim goveđim serumom (FBS) i 0.1% NaHC03. Antivirusni test medijum za sva tri tipa virusa bio je MEM sa 5% FBS, 0.1% NaHC03, 50 u.g gentamicina/mL i 10 mM MgCI2.

2000 u.g/ml_ je bila najveća koncentracija, upotrebljena u ispitivanju jedinjenja ovog pronalaska. Virus je dodat test ploči otprilike 5 minuta posle test jedinjenja. Vlastite kontrole su, takođe, sprovedene. Test ploče su inkubirane pod vlažnim vazduhom i 5% COzna 37°C. Citotoksičnost se pratila u kontrolnim ćelijama mikroskopski, na morfološke promene. Regresionom analizom virusnih CPE podataka i podataka kontrole toksičnosti dobile su se vrednosti ED50 (50% efektivne doze) i CC50 (50% citotoksične koncentracije). Indeks selektivnosti (SI) se izračunavao pomoću formule: SI = CC50 + ED50.

b. Određivanje in vitro antivirusne aktivnosti jedinjenja prema Dengi,

Banzi i žutoj groznici ( CPE test inhibicije)

Detalji testa su dobijeni iz gornje reference Sidvvell and Huffman-a.

Virusi:

Tip 2 Denga virusa, lanac Nova Gvineja dobijen je iz Centra za kontrolu bolesti. Za kulturisanje virusa i izvođenje antivirusnog testiranja (MA-104), korišćene su bubrežne ćelije afričkog zelenog majmuna (Vero). Oba, virus žute groznice, lanac 17D, pripremljen iz inficiranog mozga miša i Banzi virus, lanac H 336, izolovan iz seruma febrilnog dečaka u Južnoj Africi, dobijeni su od ATCC. Vero ćelije su korišćene sa oba ova virusa i za testiranje.

ćelije i medijum:

MA-104 ćelije (BioVVhittaker, Inc., VValkersville, MD) i Vero ćelije (ATCC) su upotrebljene u Medijumu 199 sa 5% FBS i 0.1% NaHC03i bez antibiotika.

Test medijum za Denga, žutu groznicu i Banzi viruse je bio MEM, 2% FBS, 0.18% NaHC03i 50 jug gentamicin/mL.

Antivirusno testiranje jedinjenja ovog pronalaska se izvodi u skladu sa referencom Sidwell-a i Huffman-a i slično prethodnom antivirusnom testiranju rinovirusa. Adekvatna čitanja citopatskog efekta (CPE) se postižu posle 5-6 dana za svaki od ovih virusa.

c. Određivanje in vitro antivirusne aktivnosti jedinjenja prema VVest Nile

virusu ( Test CPE inhibicije)

Detalji testa su dostupni u gore citiranoj Sidvvell i Huffman referenci. Od Centra za kontrolu bolesti je dobijen VVest Nile virus, New York izolat izveden iz mozga vrane. Uzgojene su Vero ćelije i upotrebljene, kao što je gore opisano. Test medijum je bio MEM, 1% FBS, 0.1% NaHC03i 50 urj gentamicina/mL.

Antivirusno testiranje jedinjenja ovog pronalaska se izvodi sledeći metode Sidwell-a i Huffman-a, koje su slične onima, koje se koriste za testiranje aktivnosti rinovirusa. Adekvatna čitanja citopatskog efekta (CPE) su postignuta posle 5-6 dana.

d. Određivanje in vitro antivirusne aktivnosti jedinjenja prema virusima

rino, žute groznice, Denge, Banzi i VVest Nile ( Test Neutral Red Uptake)

Posle izvođenja gore opisanog testa CPE inhibicije, korišćena je dodatna metoda citopatske detekcije, koja je opisana u "Microtiter Assay for Interferon: Microspectrophotometric Ouantitation of Cvtopathic Effect", Appl. Environ. Microbioi. 31:35-38 (1976). Za čitanje test ploča se

koristio Model EL309 čitača mikroploča (Bio-Tek Instruments Inc.). Vrednosti ED50 i CD50 su izračunate, kao i gore.

PRIMERI FARMACEUTSKIH FORMULACIJA

Kao specifično ostvarenje oralne kompozicije jedinjenja ovog pronalaska, 50 mg jedinjenja Primera 1 ili Primera 2 se formuliše sa dovoljno fino podeljenom laktozom da bi se obezbedila količina od 580 do 590 mg za punjenje teških želatinskih kapsula, veličine O.

Tokom opisivanja pronalaska i ilustrovanja u odnosu na posebna njegova ostvarenja, vični u struci će shvatiti da se mogu ostvariti razne promene, modifikacije i zamene, a da se ne udalji od smisla i cilja pronalaska. Na primer, efektivne doze, drugačije od poželjnih doza koje su ovde prethodno objašnjene mogu biti primenjive kao posledica varijacija u odgovoru ljudskog bića koje se tretira zbog ozbiljnosti HCV infekcije. Slično tome, farmakološki odgovor, koji se dobija može varirati u skladu sa i zavisno od posebnog izabranog aktivnog jedinjenja ili, ukoliko su prisutni farmaceutski nosači, kao i od tipa formulacije i načina primene koji se koriste takve očekivane varijacije ili razlike u rezultatima se razmatraju u skladu sa predmetima i praksom ovog pronalaska. Zbog toga se insistira da se pronalazak ograničava samo okvirom patentnih zahteva koji slede i da se takvi patentni zahtevi tumače toliko široko koliko je to razumno.

Claims (20)

1.Jedinjenje sa strukturnom formulom (D ili njegova farmaceutski prihvatljiva so; gde je R<1>C2-4alkenil, C2.4alkinil ili Ci-4alkil, pri čemu je alkil nesupstituisan ili supstituisan sa hidroksi, amino, Ci.4alkoksi, Ci-4alkiltio, ili sa jednim do tri atoma fluora; R<2>je vodonik, fluor, hidroksi, merkapto, Ci.4alkoksi ili C^alkil; ili R<1>i R<2>zajedno sa atomom ugljenika, za koji su vezani obrazuju 3- do 6- člani zasićeni monociklični prstenasti sistem, koji opciono sadrži heteroatom, odabran od O, S i NC0-4alkila; svaki od R<3>i R<4>nezavisno je odabran iz grupe, koju čine vodonik, cijano, azido, halogen, hidroksi, merkapto, amino, Ci.4alkoksi, C2-4alkenil, C2-4alkinil i Ci.4alkil, pri čemu je alkil nesupstituisan ili supstituisan sa hidroksi, amino, Ci^alkoksi, Ci.4alkiltio, ili sa jednim do tri atoma fluora; R<5>je vodonik, C^oalkilkarbonil, P309H4, P206H3 Ili P(0)R<13>R<14>; svaki od R<6>i R<7>je nezavisno vodonik, metil, hidroksimetil ili fluorometil; R<8>je vodonik, Ci^alkil, C2.4alkinil, halogen, cijano, karboksi, C^alkiloksikarbonil, azido, amino, Ci.4alkilamino, di(Ci.4alkil)amino, hidroksi, Ci.6alkoksi, Ci.6alkiltio, Ci^alkilsulfonil, (Ci.4alkil)0-2aminometil ili C^cikloheteroalkil, koji je nesupstituisan ili supstituisan sa jednom do dve grupe, nezavisno odabrane od halogena, hidroksi, amino, C^alkila i C,.4alkoksi; R<9>je vodonik, cijano, nitro, C^aikil, NHCONH2, CONR<12>R<12>, CSNR12R12,COOR<12>, C(=NH)NH2, hidroksi, C^alkoksi, amino, C^alkilamino, diCC^alkilJamino, halogen, (1,3-oksazol-2-il), (1,3-tiazol-2-il) ili (imidazol-2-il); pri čemu je alkil nesupstituisan ili supstituisan sa jednom do tri grupe, koje su nezavisno odabrane od halogena, amino, hidroksi, karboksi i C^alkoksi; svaki od R<10>i R11 je nezavisno vodonik, hidroksi, halogen, G^alkoksi, amino, C^alkilamino, di(C1^alkii)amino, C3^cikloalkilamino„ difC^cikloalkil) amino ili C^cikloheteroalkil, koji je nesupstituisan ili supstituisan sa jednom do dve grupe, koje su nezavisno odabrane od halogena, hidroksi, amino, C^alkila i C^alkoksi; svaki R<12>je nezavisno vodonik ili C^alkil; i svaki od R<13>i R<14>je nezavisno hidroksi, OCH2CH2SC(=0)C1^alkil, OCH20(C=0)OCMalkilINHCHMeC02Me, OCMfC^alkilJO^OJC^alkil, pod uslovom da, kada je R<1>p-metil, a R<4>vodonik ili je R<4>p-metil, a R<1>vodonik, R<2>i R<3>su a-hidroksi, R<10>je amino i R5,Ra,R7, R<8>i R<11>su vodonik, tada R<9>nije cijano ili CONH2.

2. Jedinjenje, kao u patentnom zahtevu 1, naznačeno time što ima strukturnu formulu II: ili njegova farmaceutski prihvatljiva so; gde je R<1>C^alkil, pri čemu je alkil opciono supstituisan sa hidroksi, amino, C,.3alkoksi, G^alkiltio ili sa jednim do tri atoma fluora; R<2>je hidroksi, fluoro ili C^alkoksi,- R<3>je vodonik, halogen, hidroksi, amino ili C^alkoksi; R<5>je vodonik, P309H4, P206H3ili P03H2; Rfl je vodonik, amino ili C^alkilamino; R<9>je vodonik, cijano, metil, halogen ili CONH2; i svaki od R<10>i R<11>je nezavisno vodonik, halogen, hidroksi, amino, C^alkilamino, di(C1^alkil)amino ili C^cikloalkilamino; pod uslovom da, kada je R<1>P-metil, R<2>i R<3>su a-hidroksi, R<10>je amino i R<5>, R<8>i R<11>su vodonik, tada R<9>nij<e>cijano ili CONH^

3. Jedinjenje, kao u patentnom zahtevu 2, naznačeno time što R<1>metil, fluorometil, hidroksimetil, difluorometil, trifluorometil ili aminometil; R<2>je hidroksi, fluoro ili metoksi; R<3>je vodonik, fluoro, hidroksi, amino ili metoksi; R<5>je vodonik ili P309H4; R<8>je vodonik ili amino; R<9>je vodonik, cijano, metil, halogen ili CONH2; i svaki od R<10>i R11 je nezavisno vodonik, fluoro, hidroksi ili amino; pod uslovom da, kada je R<1>P-metil,R2i R<3>su a-hidroksi, R<10>je amino i R<5>, R<8>i R<11>su vodonik, tada R<9>nije cijano ili CONH2.

4. Jedinjenje, kao u patentnom zahtevu 1, naznačeno time što je izabrano iz grupe, koja se sastoji od: 4-amino-7-(2-C-metil-(3-D-arabinofuranozil)-7/f<p>irolo[2,3-c7]pirimidin, 4-amino-7-(2-C1-metil-3-D-ribofuranozil)-7/rTf-pirolo[2,3-<7]pirimidin, 4-metilamino-7-(2-<<?->metil-|3-D-ribofuranozil)-7/<T>'-pirolo[2,3-o]pirimidin, 4-dimetilamino-7-(2-CLmetil-B-D-ribofuranozil)-7/3f-pirolo[2,3-o3pirimidin, 4-ciklopropilamino-7-(2-(>metil-p-D-ribofuranozil)-7<A>/-pirolo[2,3-o]pirimidin, 4-amino-7-(2-C;-vinil-P-D-ribofuranozil)-7/y-piroio[2,3-(3]pirimidin, 4-amino-7-(2-<7-hidroksimetil-P-D-ribofuranozii)-7>f-/-pirolo[2,3-<3]pirimidin, 4-amino-7-(2-C<:->fluorometil-p-D-ribofuranozil)-7A^pirolo[2,3-£<y>]pirimidin, 4-amino-5-metil-7-(2-ć?-metil-p-D-ribofuranozil)-7/t7f-pirolo[2,3-o] pirimidin, 4-amino-7-(2-C,-metil-p-D-ribofuranozil)-7/Stpirolo[2,3-c'3pirimidin-5-karboksilna kiselina, 4-amino-5-bromo-7-(2-C<:->metil-P-D-ribofuranozil)-7><fc>/-pirolo[2,3-a3pirimidin, 4-amino-5-hloro-7-(2-(^metil-p-D-ribofuranozil)-7/T'-pirolo[2,3-c<y>|pirirnidin, 4-amino-5-fluoro-7-(2-C,-metil-p-D-ribofuranozil)-7/T<t>pirolo[2,3-a|3pirimidin, 2,4-diamino-7-(2-C<?->metil-P-D-ribofuranozil)-7/<t>T<t>pirolo[2,3-c3]pirimidinI2-amino-7-(2-C<L>metil-p-D-ribofuranoz!i)-7/<t>J<t>pirolo[2,3-cr]pirimidin, 2-amino-4-dklopropilamino-7-(2-f>rrietil-p-D-ribofuranozil)-7rV-pirolo[2,3-d\ pirimidin, 2-amino-7-(2-C^metil-p-D-ribofuranozil)-7/T<t>ptroto[2,3-£j3pirimidin-4(3/^-on, 4-amino-7-(2-C^etil-p-Drribofuranozil)-7Mpirolo[2,3-o]pirimidin, 4-amino-7-(2-C,2-0-dimetil-3-D-ribofuranozil)-7^ 7-(2-C-metil-p-r>nbofura 2-amino-5-metil-7-(2-CJ2-0^irnetil-p-D-ribofurad]pirimidin-4(3H)-on, 4-amino-7-(3<leoksi-2-C-nTetil-3-D-irbofuranozi^ 4-amincn7-(3-deoksi-2-0-metil-P-r>arabinofuranozil)-7H-pidjpirimidin, 4-amino-2-fluoro-7-(2-CHTnetil-B-D-ribofura^4-amincH7-(2,4-di-(>metil-p-D-ribofuranozi^ 3-d]pirimidin, i4-amino-7-(3-deoksi-3-fluoropirimidin, iodgovarajući 5-trifosfati; ili njihova farmaceutski prihvatljiva so.

5. Jedinjenje, kao u patentnom zahtevu 4, naznačeno time što je izabranoiz grupe, koja se sastoji od:4-amincH7-(2-C-metil-p-r>arabinofuranozil)-7AV-piroIo[2,3-d]pirimidin,4-amino-7-(2-C-metil-B-D-ribofuranozil)-7H-p/ro/o[2,3-d] pirimidin,4-amino-7-(2-C-fluorometil-3-D-ribofuranozil)-7H- pirolo{ 2, 3- d\pirimidin,4-amino-5-metil-7-(2-C'-metil-P-D-ribofuranozil)-7H- pirolc\ 2, Z- d[pirimidin,4-amino-5-bromo-7-(2-C-metil-B-D-ribofuranozil)-7H- pinolo[ 2, 3- d\ pirimidin,4-amino-5-hloro-7-(2-C-metil-B-D-ribofuranozil)-7H-p/ro/o[2,3-d] pirimidin,4-amino-5-fluoro-7-(2-C-metil-P-D-ribofuranozil)-7H- pirolo[ 2, 3- dlpirimidin, i 4-amino-7-(2-C,2-0-dimetil-P-D-ribofuranozil)-7H-p//r>/o[2,3-d]pirimidin,i odgovarajući 5-trifostati;ili njihova farmaceutski prihvatljiva so.

6. Jedinjenje, kao u patentnom zahtevu 5, naznačeno time što je 4-amino-7-(2-C-metil-S-D-arabinofuranozil)-7H-pirolo-[2,3-d/pirimidin; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

7. Jedinjenje, kao u patentnom zahtevu 5, naznačeno time što je 4-amino-7-(2-C-metil-P-D-ribofuranozil)-7H-pirolo-[2,3-d] pirimidin; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

8. Jedinjenje, kao u patentnom zahtevu 5, naznačeno time što je 4-amino-7-(2-C-fIuorometil-B-D-ribofuranozil)-7H-pirolo-I2I3-djpirimidin; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

9. Jedinjenje, kao u patentnom zahtevu 5, naznačeno time što je 4-amino-5-hloro-7-(2-C-metil-3-D-ribofuranozil)-7W-pirolo-[2,3d]pirimidin; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

10. Jedinjenje, kao u patentnom zahtevu 5, naznačeno time što je 4-amino-5-bromo-7-(2-C-metil-3-D-ribofuranozil)-7H-pirolo-[2,3-đjpirimidin; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

11. Farmaceutska kompozicija, koja uključuje jedinjenje, kao u patentnom zahtevu 1 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

12. Farmaceutska kompozicija, kao u patentnom zahtevu 11, naznačena time što je korisna za inhibiranje RNK-zavisne RNK virusne polimeraze, za inhibiranje RNK-zavisne RNK replikacije i/ili za lečenje RNK-zavisne RNK virusne infekcije.

13. Farmaceutska kompozicija, kao u patentnom zahtevu 12, naznačena time što navedena RNK-zavisna RNK virusna polimeraza je HCV NS5B polimeraza, navedena RNK-zavisna RNK virusna replikacija je HCV replikacija i navedena RNK-zavisna RNK virusna infekcija je HCV infekcija.

14. Upotreba jedinjenja kao u patentnom zahtevu 1 naznačena time što je za proizvodnju leka za inhibiranje RNK-zavisne RNK virusne polimeraze ili inhibiciju RNK-zavisne RNK virusne replikacije ili za tretiranje RNK-zavisne RNK virusne infekcije kod sisara.

15. Upotreba, kao u patentnom zahtevu 14, naznačena time što navedena RNK-zavisna RNK virusna polimeraza je NS5B polimeraza i navedena RNK-zavisna RNK virusna replikacija je replikacija HCV virusa.

16. Upotreba jedinjenja kao u patentnom zahtevu 14 naznačena time što je za proizvodnju leka za lečenja RNK-zavisne RNK virusne infekcije kod sisara.

17. Upotreba, kao u patentnom zahtevu 16, naznačena time što navedena RNK-zavisna RNK virusna infekcija je HCV infekcija.

18. Upotreba, kao u patentnom zahtevu 17, naznačena time što je kombinacija sa terapeutski efektivnom količinom drugog agensa aktivnog protiv HCV.

19. Upotreba, kao u patentnom zahtevu 18, naznačena time što je navedeni agens aktivan protiv HCV: ribavirin; levovirin; timozin alfa-1; inhibitor NS3 serin proteaze; inhibitor inozin monofosfat dehidrogenaze; interferon-a ili pegilovani interferon-a, sam ili u kombinaciji sa ribavirinom ili levovirinom.

20. Upotreba, kao u patentnom zahtevu 19, naznačena time što je navedeni agens aktivan protiv HCV interferon-a ili pegilovani interferon-a, sam ili u kombinaciji sa ribavirinom.