PL233838B1 - Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodnikow roslin ozdobnych, metoda Real Time PCR - Google Patents
Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodnikow roslin ozdobnych, metoda Real Time PCR Download PDFInfo
- Publication number
- PL233838B1 PL233838B1 PL410978A PL41097815A PL233838B1 PL 233838 B1 PL233838 B1 PL 233838B1 PL 410978 A PL410978 A PL 410978A PL 41097815 A PL41097815 A PL 41097815A PL 233838 B1 PL233838 B1 PL 233838B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- aphelenchoides
- species
- nematodes
- identification
- time pcr
- Prior art date
Links
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 title claims abstract description 31
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 title abstract description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 43
- 241000894007 species Species 0.000 claims abstract description 27
- 241000134843 Aphelenchoides besseyi Species 0.000 claims abstract description 15
- 241000680417 Aphelenchoides ritzemabosi Species 0.000 claims abstract description 14
- 241001220357 Longidorus elongatus Species 0.000 claims abstract description 14
- 241000193940 Pratylenchus penetrans Species 0.000 claims abstract description 14
- 241000294568 Aphelenchoides fragariae Species 0.000 claims abstract description 13
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 29
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 29
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 14
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 9
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 8
- 241000294569 Aphelenchoides Species 0.000 claims description 7
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 claims description 4
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 claims description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 7
- 241001132771 Rotylenchus buxophilus Species 0.000 abstract description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 241000220223 Fragaria Species 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 241000418444 Aphelenchoides composticola Species 0.000 description 3
- 241000201425 Longidoridae Species 0.000 description 3
- 241000825546 Longidorus attenuatus Species 0.000 description 3
- 241000855013 Rotylenchus Species 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 235000021012 strawberries Nutrition 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 241001220360 Longidorus Species 0.000 description 2
- 241001130178 Longidorus macrosoma Species 0.000 description 2
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193945 Pratylenchidae Species 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000003562 morphometric effect Effects 0.000 description 2
- 238000013425 morphometry Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000196509 Anguinidae Species 0.000 description 1
- 241001341708 Aphelenchoides subtenuis Species 0.000 description 1
- 241001467594 Aphelenchoididae Species 0.000 description 1
- 235000007516 Chrysanthemum Nutrition 0.000 description 1
- 240000005250 Chrysanthemum indicum Species 0.000 description 1
- 241001133184 Colletotrichum agaves Species 0.000 description 1
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 1
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 1
- 102100030378 Hemoglobin subunit theta-1 Human genes 0.000 description 1
- 241000243783 Heteroderidae Species 0.000 description 1
- 101000843063 Homo sapiens Hemoglobin subunit theta-1 Proteins 0.000 description 1
- 241001540512 Hoplolaimidae Species 0.000 description 1
- 241001021844 Longidorus aetnaeus Species 0.000 description 1
- 241000985100 Longidorus africanus Species 0.000 description 1
- 241000716055 Longidorus andalusicus Species 0.000 description 1
- 241000588908 Longidorus artemisiae Species 0.000 description 1
- 241001130176 Longidorus caespiticola Species 0.000 description 1
- 241000985102 Longidorus diadecturus Species 0.000 description 1
- 241001194824 Longidorus distinctus Species 0.000 description 1
- 241000825545 Longidorus euonymus Species 0.000 description 1
- 241001130179 Longidorus intermedius Species 0.000 description 1
- 241000825521 Longidorus leptocephalus Species 0.000 description 1
- 241000588910 Longidorus lignosus Species 0.000 description 1
- 241001096501 Longidorus poessneckensis Species 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 206010027146 Melanoderma Diseases 0.000 description 1
- 241001287835 Meloidogynidae Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000193943 Pratylenchus Species 0.000 description 1
- 241000193957 Pratylenchus crenatus Species 0.000 description 1
- 241001148486 Pratylenchus pratensis Species 0.000 description 1
- 241000725693 Raspberry ringspot virus Species 0.000 description 1
- 108020001027 Ribosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000071675 Rotylenchus uniformis Species 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000024293 detection of nematode Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 244000045561 useful plants Species 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000009369 viticulture Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
Ujawniono zarówno sposób jak i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników roślin ozdobnych, metodą Real Time PCR. W szczególności wynalazek dotyczy sposobu i zestawu do identyfikacji nicieni obejmujących gatunki Aphelenchoides besseyi, Aphelenchoides fragariae, Aphelenchoides ritzemabosi, Longidorus elongatus, Rotylenchus buxophilus oraz Pratylenchus penetrans. Dzięki specyficznie dobranym starterom i sondom rozwiązanie według wynalazku umożliwia precyzyjną identyfikację wskazanych gatunków nicieni, niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników roślin ozdobnych, metodą Real Time PCR, w szczególności wynalazek dotyczy sposobu i zestawu do identyfikacji nicieni wybranych z grupy obejmującej gatunki Aphelenchoides besseyi, Aphelenchoides fragariae i Aphelenchoides ritzemabosi z rodziny Aphelenchoididae, Rotylenchus buxophilus z rodziny Hoplolaimidae, Longidorus elongatus z rodziny Longidoridae oraz Pratylenchus penetrans z rodziny Pratylenchidae.
Według najnowszej klasyfikacji rodzinę Anguinidae reprezentują w Polsce 34 gatunki, Heteroderidae 17 gatunków, Meloidogynidae 5 gatunków, a w rodzinie Pratylenchidae 5 gatunków. Wiele spośród nich to szkodniki roślin uprawnych oraz ozdobnych. Porażone rośliny mają uszkodzony system korzeniowy, a zmniejszony pobór wody prowadzi do ich zamierania. Wymienione powyżej gatunki nicieni uznawane są za pasożyty lub potencjalne pasożyty roślin. Aphelenchoides fragariae zimują w dolnych częściach roślin lub w glebie. Od wiosny żerują na roślinie początkowo powierzchniowo, w późniejszym czasie wchłaniają się do wnętrza rośliny głównie do liści. Dorosłe zapł odnione samice składają jaja, z których wylęgają się inwazyjne larwy przemieszczające się do zdrowych części rośli n, gdzie rozmnażają i rozwijają. Jedno pokolenie rozwija się 14 dni, w ciągu roku wykształca się 10-15 pokoleń. Gatunek atakuje głównie truskawkę i rośliny ozdobne, straty wynoszą od 30-60%. Występuje najczęściej na plantacjach truskawek. Objawy są widoczne na owocach. Truskawki są zniekształcone o poskręcanych ogonkach, karłowe. Aphelenchoides ritzemabosi od wielu lat jest znanym i powszechnym szkodnikiem truskawki i chryzantemy, a także występuje na kilkunastu gatunkach bylin i krzewów ozdobnych. W Europie wykazano obecność 79 gatunków Longidoridae, z których 13 występuje w Polsce. Przedstawiciele tej rodziny zaliczani są do pasożytów roślin, są również wektorami wirusów atakujących rośliny. Rozmnażają się w glebie. Okres ich rozwoju jest długi i może trwać nawet kilka miesięcy. Mogą pasożytować na wielu roślinach użytkowych. Porażone rośliny są karłowate lub zamierają, szczególnie gdy porażone zostaną we wczesnym stadium swego rozwoju. Longidorus attenuatus, L. elongatus i L. macrosoma mogą przenosić wirusa czarnej plamistości pierścieniowej pomidorów i wirusa pierścieniowej plamistości malin.
Identyfikacja gatunków nicien oparta jest na analizie cech morfologicznych i morfometrycznych, w tym diagnozowane są m.in.: zabarwienie samicy na poszczególnych etapach rozwojowych, kształt cysty, długość i kształt guzów sztyletu, długość larwy inwazyjnej, wzór na płytce perinealnej. Jest to jednak analiza bardzo pracochłonna i czasochłonna. Wymaga dużo wiedzy i doświadczenia w pracy z materiałem biologicznym. Ponadto, istnieje możliwość nachodzenia na siebie wymiarów różnych gatunków. Metody opartej na analizie cech morfologicznych i morfometrycznych nie można zastosować do identyfikacji młodocianych osobników, u których cechy morfologiczne nie są jeszcze wykształcone.
Obecnie w diagnostyce nematologicznej coraz częściej stosowane są techniki oparte na analizie kwasów nukleinowych, w tym wykorzystujące łańcuchową reakcję polimerazy (PCR). Podstawą techniki PCR jest powielenie fragmentu/ów DNA, specyficznego dla określonego organizmu, do poziomu umożliwiającego jego szybką i prostą detekcję przy użyciu elektroforezy. Uzyskuje się to stosując krótkie jednoniciowe oligonukleotydy (12-40 nukleotydów), tzw. startery, specyficzne dla powielanego fragmentu DNA oraz enzym - termostabilną polimerazę, która umożliwia powielenie żądanego fragmentu w cyklicznej, trzyetapowej reakcji, złożonej z denaturacji, wiązania starterów oraz syntezy DNA. Zazwyczaj po około 30 cyklach reakcji uzyskuje się ponad milion kopii powielanego fragmentu DNA, co pozwala zidentyfikować go techniką elektroforezy żelowej.
Udoskonaleniem łańcuchowej reakcji polimerazy jest Real Time PCR, to jest rekcji PCR z pomiarem ilości powielonego fragmentu w każdym cyklu reakcji. Do pomiaru ilości powielonego fragmentu wykorzystuje się fluorochromy (barwniki fluorescencyjne), np.: SYBR Green I, SYTO9, Eva Green, SYBR Gold, których fluorescencja jest proporcjonalna do ilości powielonego fragmentu. Identyfikację powstałych produktów przeprowadza się poprzez pomiar wielkości fluorescencji oraz analizę krzywej topnienia produktów reakcji bez elektroforezy. Czułość reakcji Real Time PCR jest znacznie większa niż tradycyjnego PCR, a brak elektroforezy skraca czas analizy. Wadą Real Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi (podobnie jak tradycyjnego PCR) jest ograniczona specyficzność reakcji. W większości przypadków reakcja PCR zachodzi nie tylko w przypadku 100% identyczności sekwencji starterów do sekwencji matrycy, lecz również gdy 1-2 nukleotydy są nieidentyczne. Ta właściwość tradycyjnego PCR i Real Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi wymaga precyzyjnego ustawienia parametrów termicznych reakcji. Ponadto, barwniki fluorescencyjne wiążą się z każdym dwuniciowym fragmentem
PL 233 838 B1
DNA, powstałym również w wyniku amplifikacji starterów (produkty primer-primer, primer-dimer), co wymaga również starannego doboru odpowiedniego stężenia starterów.
Alternatywą dla barwników fluorescencyjnych są sondy DNA znakowane fluorescencyjnie. Są to krótkie odcinki DNA, komplementarne do poszukiwanej sekwencji, które po przyłączeniu do DNA podczas reakcji PCR emitują fluorescencję o określonej długości fali. Obecnie znanych jest kilka rodzajów sond, np.: TaqMan, FRET, molecular beacons czy scorpions. Specyficzność reakcji Real Time PCR ze znakowanymi sondami jest znacznie wyższa niż z barwnikami fluorescencyjnymi. W odróżnieniu od starterów niedopasowanie jednego nukleotydu w sekwencji sondy prowadzi przeważnie do braku reakcji lub bardzo istotnego zmniejszenia wydajności, co jest łatwe do stwierdzenia podczas monitorowania przebiegu reakcji lub analizy wyników reakcji.
McCuiston J.L., Hudson L.C., Subbotin S.A., Davis E.L., Warfield C.Y. Conventional and PCR Detection of Aphelenchoides fragariae in Diverse Ornamental Host Plant Species. J Nematol. Dec 2007; 39(4): 343-355 opracowali startery do identyfikacji Aphelenchoides fragariae. Rybarczyk-Mydłowska K., Mooyman P., Megen H., Elsen S., Vervoort M., Veenhuizen P., Doom J., Dees R., Karssen G., Bakker J., Helder J. 2012 Small Subunit Ribosomal DNA-Based Phylogenetic Analysis of Foliar Nematodes (Aphelenchoides spp.) and Their Quantitative Detection in Complex DNA Backgrounds. Nematology 102(12): 1153-1160 opracowali startery do identyfikacji czerech gatunków Aphelenchoides (Aphelenchoides besseyi, A. fragariae, A. ritzemabosi oraz A. subtenuis) metodą Real Time PCR z barwnikiem fluorescencyjnym SYBR.
Metoda polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych PCR-RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism) wykorzystuje enzymy restrykcyjne, które tną nić DNA w specyficznym dla siebie miejscu. Różnice w długości pociętych fragmentów DNA świadczą o zmienności, co pozwoliło autorom opracować metodę do identyfikacji 11 gatunków: Longidorus aetnaeus, L. africanus, L. andalusicus, L. artemisiae, L. caespiticola, L. distinctus, L. elongatus, L. euonymus, L. intermedius, L. leptocephalus i L. lignosus (Subbotin S.A., Rogozhin E.A., Chizhov V.N. Molecular characterisation and diagnostics of some Longidorus species (Nematoda: Longidoridae) from Russia and other countries using rRNA genes. 2014 Eur J Plant Pathol 138: 377-390).
Hubschen J., Kling L., Ipach U., Zinkernagel V., Brown D.J.F., Neilson R. 2004. Development and validation of species-specific primers that provide a molecular diagnostic for virus-vector lorigidorid nematodes and related species in German viticulture. European Journal of Plant Pathology 110: 883-891 również opisali startery do identyfikacji trzech gatunków Longidorus (L. attenuatus, L. elongatus, L. macrosoma) metodą klasycznego PCR.
Do identyfikacji Pratylenchus penetrans metodą klasycznego PCR sekwencje starterów opisali Al-Banna L., Ploeg A.T., Williamson V.M., Kaloshian I., 2004. Discrimination of Six Pratylenchus Species Using PCR and Species-Specific Primers. Journal of Nematology 36(2): 142-146, a później startery do dipleksu Waeyenberge L., Viaene N., Moens M. 2009. Species-specific duplex PCR for the detection of Pratylenchus penetrans. Nematology. 11(6): 847-857.
W stanie techniki istnieje nadal potrzeba dostarczenia narzędzia umożliwiającego detekcję wybranych gatunków nicieni nie identyfikowanych metodami genetycznymi, jak również dostarczenia udoskonalonego sposobu identyfikacji tych gatunków nicieni, które są wykrywane znanymi technikami genetycznymi, natomiast nie zapewniają wysokiej precyzyjności i nie wykluczają błędów w analizie.
Celem wynalazku jest dostarczenie sposobu umożliwiającego identyfikację gatunków nicieni z dużą czułością i specyficznością. Celem wynalazku jest również dostarczenie sposobu identyfikacji nicieni, które nie były dotychczas wykrywane metodami analizy materiału genetycznego badanych gatunków. Celem wynalazku jest również dostarczenie nowych sekwencji nukleotydowych starterów i sond bądź nieoczywistego wyboru znanych sekwencji i sond, mających zastosowanie w sposobie wykrywania nicieni techniką PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.
Powyższe cele zrealizowano w niniejszym wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikacji nicieni w próbce gleby wyb ranych z grupy zawierającej gatunki Aphelenchoides besseyi, Aphelenchoides fragariae, Aphelenchoides ritzemabosi, Longidorus elongatus oraz Pratylenchus penetrans, obejmujący następujące etapy:
a) dostarczenie próbki gleby zawierającej nicienie do identyfikacji;
b) wypłukanie nicieni z gleby;
c) izolację DNA;
PL 233 838 Β1
d) przeprowadzenie reakcji PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, z zastosowaniem pary starterów 3' i 5' oraz sondy;
e) porównanie krzywej amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej oraz kontroli negatywnej, przy czym do identyfikacji jednego z powyższych gatunków w reakcji PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, stosuje się właściwe dla danego gatunku startery 3' i 5' oraz sondę wybrane z listy:
| Gatunek | 5 ’ starter | 3’ starter | Sonda | |||
| Nazwa | Sekwencja | Nazwa | Sekwencja | Nazwa | Sekwencja | |
| Aphelenchoides besseyi | Abesfv | ccgtgactaggacttgttc | Abesrv | ggacttccaccagagtttc | Abes | etctggcttcatcctgttcgg |
| Aph e lenchoidesjwgariae | Afrafv | gaccaattgggcctagtc | Afrarv | cgtacaccttaaactccttg | Afra | tgaccgactggacaccgaat |
| Aphelenchoides ritzemabosi | Aritfr | gttggtgtgggtgaattc | Ari.trv | ccgactatacaccgagtc | Arit | cgcacgaacggaccaacgac |
| Longidorus elongatus | Lelonfs | gtcgaattgaggtggaaa | Łelonnf | ccaactatccatcgctta | Lelon | accagttcgtcggcttgtaatc |
| Pratylenchus penetrans | Ppenfv | cggattggaggaatgttg | Ppenrv | gaaggcacatgttgcatg | Ppen | aactgccaccccacaccaat |
| Rotylenchus biaophilus | Rbuxfv | ctcccagggaaacctaac | Rbuxrv | gctctggactcaaaacac | Rbux | atgagtccgagccacaacag |
Przedmiotem wynalazku jest również zestaw do identyfikacji nicieni wybranych z grupy obejmującej gatunki Aphelenchoides besseyi, Aphelenchoides fragariae, Aphelenchoides ritzemabosi, Longidorus elongatus, Rotylenchus buxophilus oraz Pratylenchus penetrans, metodą PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, zawierający właściwe dla danego gatunku startery 3' i 5' oraz sondę wybrane z listy:
| Gatunek | Nazwa | 5’ starter | 3’ starter | Sonda | ||
| Sekwencja | Nazwa | Sekwencja | Nazwa | Sekwencja | ||
| Aphelenchoides besseyi | Abesfv | ccgtgactaggacttgftc | Abesrv | ggacttccaccagagtttc | Abes | etctggcttcatcctgttcgg |
| Aphelenchoides Jragariae | Afrafv | gaccaattgggcetagtc | Afrarv | cgtacaccttaaactccttg | Afra | tgaccKactggacaccgaat |
| Aphelenchoides ritzemabosi | Aritfr | gttggtgtęggtgaattc | Aritrv | ccgactatacaccgagtc | Arit | cgcacgaacggaccaacgac |
| Longidorus elongatus | Lelonfy | gtcgaattgaggtggaaa | l.elonrx | ccaactatccatcgctta | Lelon | accagttcgtcggcttgtaatc |
| Pratylenchus penetrans | Ppenfv | cggattggaggaatgttg | Ppenrv | gaaggcacatgttgcatg | Ppen | aactgccaccccacaccaat |
| Rotylenchus biaophilus | Rbuxfv | ctcccagggaaacctaac | Rbuxrv | gctctggactcaaaacac | Rbux | atgagtccgagccacaacag |
Mieszanina reakcyjna zawiera bufor, termostabilną Taq polimerazę, jony magnezu, startery i sondę. Stężenie starterów w mieszaninie reakcyjnej wynosi 1-2 μΜ, sondy 50-100 nM, jonów magnezu 2-5 mM. Reakcję prowadzi się przy temperaturze przyłączania starterów 55-60°C, w objętości mieszaniny reakcyjnej 10-20 μΙ, przy zastosowaniu od 35 do 40 cykli reakcji. Identyfikacji produktów dokonuje się poprzez porównanie krzywych amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej.
Nazwom sekwencji starterów oraz sond odpowiadają kolejne numery sekwencji: Abesfv (SEKW NR ID: 1), Abesrv (SEKW NR ID: 2), Abes (SEKW NR ID: 3), Afrafv (SEKW NR ID: 4), Afrarv (SEKW NR ID: 5), Afra (SEKW NR ID: 6), Aritfr (SEKW NR ID: 7), Aritrv (SEKW NR ID: 8), Arit (SEKW NR ID: 9), Lelonfv (SEKW NR ID: 10), Lelonrv (SEKW NR ID: 11), Lelon (SEKW NR ID: 12), Ppenfv (SEKW NR ID: 13), Ppenrv(SEKWNR ID: 14), Ppen (SEKW NR ID: 15), Rbuxfv (SEKW NR ID: 16), Rbuxrv(SEKW NR ID: 17), Rbux (SEKW NR ID: 18).
Fig. 1 przedstawia krzywe amplifikacji dla Aphelenchoides besseyi.
Fig. 2 przedstawia krzywe amplifikacji dla Aphelenchoides fragariae.
Fig. 3 przedstawia krzywe amplifikacji dla Aphelenchoides ritzemabosi.
Fig. 4 przedstawia krzywe amplifikacji dla Longidorus elongatus.
Fig. 5 przedstawia krzywe amplifikacji dla Pratylenchus penetrans.
Fig. 6 przedstawia krzywe amplifikacji dla Rotylenchus buxophilus.
Poniżej podano przykłady identyfikacji każdego z wchodzących w skład zestawu gatunków nicieni. Każdorazowo identycznym warunkom izolacji i amplifikacji poddawano próbę zerową (dejonizowana H2O wolna od nukleaz) oraz próbę ujemną. Materiałem dla próby ujemnej było DNA gatunku nicienia należącego do tego samego rodzaju co badany, mieszanina równych ilości DNA nicieni należących do tego samego gatunku co badany gatunek lub w przypadku braku gatunków należących do tego samego rodzaju, gatunek z tej samej rodziny.
Przykład 1
Identyfikacja nicieni z gatunku Aphelenchoides besseyi
DNA izolowano przy użyciu komercyjnych zestawów do izolacji DNA NucleoSpin Tissue XS firmy Macherey-Nagel. W reakcji użyto starterów i sondy o następujących sekwencjach:
PL 233 838 Β1
| Starter/sonda | Sekwencja |
| Abesfv | ccgtgactaggacttgttc |
| Abesrv | ggacttccaccagagtttc |
| Abes | ctctggcttcatcctgttcgg |
Reakcję Real Time PCR przeprowadzano w mieszaninie o objętości 20 μΙ w aparacie RotorGene 6000 firmy Qiagen przy użyciu odczynników z zestawu LuminoCt qPCR Ready Mix (Sigma-Aldrich) w następujących ilościach:
- H2O wolna od nukleaz do objętości 20 μΙ,
- 2 μ110,0 μΜ każdego ze starterów Abesfv i Abesrv,
- 1 μΙ 4,0 μΜ sondy Abes znakowanej na końcu 5' barwnikiem JOE, a 3'-końcu wygaszaczem HBQ1,
- 10 μΙ 2X LuminoCt qPCR ReadyMix (Sigma-Aldrich),
- 2 μΙ DNA.
Mieszaninę reakcyjną umieszczano w probówce o objętości 20 μΙ, umieszczano w rotorze termocyklera RotorGene 6000 i przeprowadzano reakcję amplifikacji w 40 cyklach w następujących warunkach:
| Etap | Temperatura [°C] | Czas [s] | Pomiar fluorescencji | |
| Pre-inkubacja | 95 | 180 | - | |
| Amplifikacja | denatu racja | 95 | 30 | - |
| przyłączanie | 55 | 30 | pojedynczy | |
| synteza | 72 | 30 | - | |
| Chłodzenie | 40 | 20 | - |
Kontrolę negatywną stanowiła mieszanka równych objętości roztworów DNA Aphelenchoides composticola, Aphelenchoides ritzemabosi.
Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na fig. 1.
Przykład 2
Identyfikacja nicieni z gatunku Aphelenchoides fragariae
Warunki izolacji i amplifikacji odpowiadały warunkom przedstawionym w przykładzie 1. W reakcji Real-Time PCR użyto następujących starterów i sondy:
| Starter/sonda | Sekwencja |
| Afrafv | gaccaattgggcctagtc |
| Afrarv | cgtacaccttaaactccttg |
| Afra | tgaccgactggacaccgaat |
Kontrolę negatywną stanowiła mieszanka równych objętości roztworów DNA Aphelenchoides besseyi, Aphelenchoides composticola, Aphelenchoides ritzemabosi.
Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na fig. 2. Przykład 3
Identyfikacja nicieni z gatunku Aphelenchoides ritzemabosi
Warunki izolacji i amplifikacji odpowiadały warunkom przedstawionym w przykładzie 1. W reakcji Real-Time PCR użyto następujących starterów i sondy:
PL 233 838 Β1
| Starter/sonda | Sekwencja |
| Aritfr | gttggtgtgggtgaattc |
| Aritrv | ccgactatacaccgagtc |
| Arit | cgcacgaacggaccaacgac |
Kontrolę negatywną stanowiła mieszanka równych objętości roztworów DNA Aphelenchoides besseyi, Aphelenchoides composticola, Aphelenchoides fragariae.
Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na fig. 3. Przykład 4
Identyfikacja nicieni z gatunku Longidorus elongatus
Warunki izolacji i amplifikacji odpowiadały warunkom przedstawionym w przykładzie 1. W reakcji Real-Time PCR użyto następujących starterów i sondy:
| Starter/sonda | Sekwencja |
| Lelonfv | gtcgaattgaggtggaaa |
| Lelonrv | ccaactatccatcgctta |
| Lelon | accagttcgtcggcttgtaatc |
Kontrolę negatywną stanowiła mieszanka równych objętości roztworów DNA Longidorus diadecturus, Longidorus attenuatus, Longidorus poessneckensis.
Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na fig. 4. Przykład 5
Identyfikacja nicieni z gatunku Pratylenchus penetrans
Warunki izolacji i amplifikacji odpowiadały warunkom przedstawionym w przykładzie 1. W reakcji Real-Time PCR użyto następujących starterów i sondy:
| Starter/sonda | Sekwencja |
| Ppenfv | cggattggaggaatgttg |
| Ppenrv | gaaggcacatgttgcatg |
| Ppen | aactgccaccccacaccaat |
Kontrolę negatywną stanowiła mieszanka równych objętości roztworów DNA Pratylenchus crenatus, Pratylenchus pratensis.
Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na fig. 5.
Przykład 6
Identyfikacja nicieni z gatunku Rotylenchus buxophilus
Warunki izolacji i amplifikacji odpowiadały warunkom przedstawionym w przykładzie 1. W reakcji Real-Time PCR użyto następujących starterów i sondy:
| Starter/sonda | Sekwencja |
| Rbuxfv | ctcccagggaaacctaac |
| Rbuxrv | gctctggactcaaaacac |
| Rbux | atgagtccgagccacaacag |
Kontrolę negatywną stanowiła mieszanka równych objętości roztworów DNA Rotylenchus capitatus i Rotylenchus uniformis.
Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na fig. 6.
PL 233 838 Β1
Rozwiązanie według wynalazku pozwala na wykrycie nicieni w glebie w przeciągu kilku godzin, uwzględniając w tym etapy przygotowania prób, izolacji DNA oraz reakcji Real-Time PCR. Metodę według wynalazku można zastosować do identyfikacji wyżej wymienionych gatunków nicieni niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.
Proponowany zestaw sond pozwala identyfikować wyżej wymienione gatunki nicieni w reakcji Real Time PCR, która jest znacznie czulsza i szybsza od innych metod PCR. Zastosowanie w reakcji Real Time PCR sond znacznie zwiększa specyficzność reakcji w stosunku do reakcji Real Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi.
Zastrzeżenia patentowe
Claims (2)
1. Sposób identyfikacji gatunków nicieni Aphelenchoides besseyi, Aphelenchoides fragariae, Aphelenchoides ritzemabosi, Longidorus elongatus oraz Pratylenchus penetrans w próbce gleby, obejmujący następujące etapy:
a) dostarczenie próbki gleby zawierającej nicienie do identyfikacji;
b) wypłukanie nicieni z gleby;
c) izolację DNA;
d) przeprowadzenie reakcji Real-Time PCR z zastosowaniem pary starterów 3' i 5' oraz sondy;
e) porównanie krzywej amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej oraz kontroli negatywnej, przy czym do identyfikacji jednego z powyższych gatunków w reakcji Real-Time PCR stosuje się właściwe dla danego gatunku startery 3' i 5' oraz sondy wybrane z listy:
2. Zestaw do identyfikacji gatunków nicieni Aphelenchoides besseyi, Aphelenchoides fragariae, Aphelenchoides ritzemabosi, Longidorus elongatus oraz Pratylenchus penetrans metodą Real-Time PCR, zawierający właściwe dla danego gatunku startery 3' i 5' oraz sondy wybrane z listy:
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL410978A PL233838B1 (pl) | 2015-01-16 | 2015-01-16 | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodnikow roslin ozdobnych, metoda Real Time PCR |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL410978A PL233838B1 (pl) | 2015-01-16 | 2015-01-16 | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodnikow roslin ozdobnych, metoda Real Time PCR |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL410978A1 PL410978A1 (pl) | 2016-07-18 |
| PL233838B1 true PL233838B1 (pl) | 2019-11-29 |
Family
ID=56370086
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL410978A PL233838B1 (pl) | 2015-01-16 | 2015-01-16 | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodnikow roslin ozdobnych, metoda Real Time PCR |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL233838B1 (pl) |
-
2015
- 2015-01-16 PL PL410978A patent/PL233838B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL410978A1 (pl) | 2016-07-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102174650B (zh) | 一种象耳豆根结线虫lamp快速检测方法及应用 | |
| CN110951838A (zh) | 基于rpa-lfd技术检测北方根结线虫的引物、探针、试剂盒及应用 | |
| JP2023060024A (ja) | ブラシカ・オレラセア植物の異型検出法 | |
| CN106893764A (zh) | 一种青枯菌的lamp检测引物组合及其lamp检测试剂盒和lamp方法 | |
| JP5855335B2 (ja) | 海水性二枚貝検出用プライマーセットとこれを利用した海水性二枚貝幼生の検出・定量方法 | |
| PL233838B1 (pl) | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodnikow roslin ozdobnych, metoda Real Time PCR | |
| PL233837B1 (pl) | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodnikow upraw roslin motylkowych, metoda Real Time PCR | |
| CN105296668B (zh) | 一种特异性检测3型有蹄类博卡细小病毒的引物、探针和试剂盒 | |
| PL230914B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| Hossain et al. | Karyotype and RAPD analysis of male and female Coccinia grandis L. from Bangladesh | |
| CN110029176B (zh) | 以高分辨率熔解曲线为基础的三带喙库蚊鉴定试剂盒及其鉴定方法 | |
| PL231512B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Longidorus intermedius, szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL231513B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Longidorus poessneckensis, szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL233892B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Longidorus eonymus szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL233888B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paralongidorus maximus szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL233836B1 (pl) | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni szkodzacych drzewom i krzewom owocowym metoda Real Time PCR | |
| PL230915B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników roślin okopowych, metodą Real Time PCR | |
| PL232394B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Xiphinema diversicaudatum, szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL233887B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Aphelenchoides sacchari, szkodnika grzybów, metodą Real Time PCR | |
| PL233889B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paraphelenchus myceliophthorus, szkodnika grzybów, metodą Real Time PCR | |
| PL233839B1 (pl) | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodnikow zboz i traw, metoda Real Time PCR | |
| PL231509B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paraphelenchus tritici, szkodników grzybów, metodą Real Time PCR | |
| CN113817852B (zh) | 检测稻黄单胞菌致病变种的特异性引物及应用 | |
| PL233893B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Heterodera goettingiana, ważnego szkodnika roślin uprawnych, metodą Real Time PCR | |
| PL233894B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Merlinius microdorus, szkodnika zbóż i traw, metodą Real Time PCR |