RS59263B1

RS59263B1 - Postupci i sredstva za proizvodnju heterodimernih ig-sličnih molekula

Info

Publication number: RS59263B1
Authority: RS
Inventors: Kruif Cornelis Adriaan De; Linda Johanna Aleida Hendriks; Ton Logtenberg
Original assignee: Merus Nv
Priority date: 2012-04-20
Filing date: 2013-04-19
Publication date: 2019-10-31
Also published as: NZ799532A; SG10201607369QA; JP7723694B2; MX360109B; AU2013249985B2; KR102104601B1; AU2018201325A1; US12123043B2; JP2025109759A; KR102545770B1; US9358286B2; US20240344102A1; SMT201900493T1; PT2838917T; LT2838917T; MX2014012700A; US11926859B2; KR20220046711A; HRP20191409T1; US20170327860A1

Description

Opis

POLJE PRONALASKA

[0001] Pronalazak se odnosi na oblasti molekularne biologije, medicine i bioloških terapeutika. On se posebno odnosi na polje terapeutskih antitela za lečenje različitih bolesti.

OSNOVA PRONALASKA

[0002] Mnogi biološki terapeutici koji se trenutno upotrebljavaju su izolovana rekombinantna, humana ili humanizovana monoklonalna antitela koja poboljšavaju sposobnost imunskog sistema tela da neutrališe ili eliminiše ćelije i/ili molekule uključene u tokove bolesti ili da unište invaziju patogena ili infektivnih agenasa. Monoklonalna antitela se vezuju za jednu specifičnu oblast, ili epitop, antigena i, za upotrebu u terapiji, često se biraju zbog poželjnog funkcionalnog svojstva kao na primer ubijanje tumorskih ćelija, blokiranje receptor-ligand interakcija ili neutralizaciju virusa. Danas postoji oko 30 FDA odobrenih monoklonalnih antitela, koja se tipično proizvode u velikim količinama i njihove biofizičke i biohemijske karakteristike se mogu detaljno analizirati kako bi se osigurala konzistentnost od serije do serije, što olakšava regulatornu prihvatljivost. Uprkos ovim povoljnim karakteristikama, monoklonalna antitela imaju nekoliko nedostataka, neki od njih se odnose na njihovu monospecifičnu prirodu i kompleksnosti bolesti. Tokovi bolesti su često multifaktorski po prirodi i uključuju prekomerno ili sinergističko delovanje medijatora bolesti ili povećanu regulaciju različitih receptora, uključujući uzajamni dijalog (crosstalk) između njihovih signalnih mreža. Kao posledica toga, blokada višestrukih, različitih faktora i puteva uključenih u patologiju mogu rezultovati u poboljšanoj terapeutskoj efikasnosti. Po prirodi njihove monospecifičnosti, monoklonalna antitela mogu ometati samo jedan korak unutar kompleksnih tokova bolesti što često nema optimalan efekat. Pored toga što nije u potpunosti pokrila višestruke aspekte toka bolesti, postalo je jasno da ciljanje jednog epitopa na jednom ćelijskom ili rastvorljivom proteinu ili patogenu često neće biti dovoljno da se efikasno leči bolest zato što ciljni epitop možda više nije dostupan da se za njega veže monoklonalno antitelo i vrši poželjni efekat. Kao primer, tumorske ćelije često izbegavaju terapiju monoklonalnim antitelom smanjenom regulacijom, mutacijom ili zaštitom ciljnog epitopa prisutnog na receptoru faktora rasta. Aktiviranjem alternativnih receptora i/ili njihovih liganada, tumorske ćelije onda mogu iskoristiti drugačiji put koji vodi ka kontinuiranom rastu i metastazi. Slično tome, virusi i drugi patogeni često mutiraju i gube ili štite ciljni epitop, time izbegavajući lečenje monoklonalnim antitelom. Monoklonalna antitela koja se vezuju za jedan epitop često ne regrutuju puni spektar efektorskih mehanizama izazvanih poliklonalnim antitelima, uključujući, između ostalog, opsonizaciju (povećanje fagocitoze antigena), steričku prepreku (antigeni obloženi antitelima sprečeni su da se vežu za ćelije domaćina ili mukozne površine), neutralizaciju toksina, aglutinaciju ili taloženje (antitela koja vežu nekoliko rastvorljivih antigena uzrokuju agregaciju i naknadni klirens), aktivaciju komplementa i ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (antitela omogućavaju ubijanje ciljnih ćelija ćelijama prirodnim ubicama i neutrofilima).

[0003] Poliklonalna antitela za terapeutske primene mogu se dobiti iz puliranog humanog seruma. Takva terapeutska poliklonalna antitela izvedena iz seruma mogu na primer da se koriste za lečenje ili prevenciju infekcija izazvanih virusima kao što su virus besnila, citomegalovirus i respiratorni sincicijalni virus, da neutrališu toksine kao što su toksin tetanusa i botulinum toksin ili da sprečavaju imunizaciju Rhesus D alografta. Rasprostranjenija upotreba preparata poliklonalnog antitela koji su izvedeni iz seruma sprečena je činjenicom da je izvorna plazma dostupna samo za ograničeni opseg ciljeva kao što su infektivne bolesti i toksini. Štaviše, proizvodi su u velikoj meri zavisni od dostupnosti donorske krvi, i u smislu količine i pogodnosti, što rezultuje značajnim varijacijama između serija. Pored toga, tehnologije skrininga ne uspevaju da održe korak sa virusima koji konstantno evoluiraju, tako da imunoglobulinski proizvodi nose potencijalni rizik od prenosa zaraznih bolesti. Konačno, dug postupak sakupljanja krvi, skrininga i prečišćavanja imunoglobulina znači da su imunoglobulini izvedeni iz plazme skupi za proizvodnju.

[0004] Smeše monoklonalnih antitela mogu da poboljšaju efikasnost monoklonalnih antitela uz izbegavanje ograničenja povezanih sa poliklonalnim antitelima izvedenim iz seruma. U struci, kombinacije dva humana ili humanizovana monoklonalna antitela su testirana u pretkliničkim modelima i u kliničkim ispitivanjima (na primer, smeše 2 monoklonalna antitela prema HER2 receptoru, smeše 2 antitela prema EGFR receptoru i, 2 monoklonalna antitela prema virusu besnila). U struci, pokazano je da kombinacije 2 monoklonalna antitela mogu da imaju aditivne ili sinergističke efekte i regrutuju efektorske mehanizme koji nisu povezani sa bilo kojim samim antitelom. Na primer, pokazano je da smeše 2 monoklonalna antitela prema EGFR ili HER2 potentnije ubijaju tumorske ćelije što je zasnovano na kombinaciji aktivnosti uključujući poboljšanu internalizaciju receptora, poboljšanu blokadu signalnih puteva nishodno od receptora, kao i pojačanu citotoksičnost posredovanu imunskim efektorom. Za kombinovane terapije koje su zasnovane na 2 monoklonalna antitela, antitela komponente mogu biti proizvedena odvojeno i kombinovana na nivou proteina. Nedostatak ovog pristupa je ogroman trošak razvoja 2 antitela pojedinačno u kliničkim ispitivanjima i (delimično) ponavljanje tog postupka sa kombinovanjem. To bi dovelo do neprihvatljivih troškova lečenja zasnovanog na kombinacijama antitela. Alternativno, 2 rekombinantne ćelijske linije koje proizvode monoklonalna antitela komponente mogu biti pomešane u fermentoru i rezultujuća smeša antitela može biti prečišćena kao jedan preparat (WO2004/061104). Nedostatak ovog pristupa je loša kontrola nad kompozicijom i stoga reproducibilnost rezultujućeg preparata rekombinantnog poliklonalnog antitela, naročito kada se uzme u obzir da se takve kompozicije mogu promeniti tokom vremena kako se ćelije kultivišu.

[0005] Tokom protekle decenije, bispecifična antitela su se pojavila kao alternativa upotrebi kombinacija 2 antitela. Dok kombinacija 2 antitela predstavlja smešu 2 različita molekula imunoglobulina koji se vezuju za različite epitope na istim ili različitim ciljevima, u bispecifičnom antitelu to se postiže jednim molekulom imunoglobulina. Vezivanjem za 2 epitopa na istim ili različitim ciljevima, bispecifična antitela mogu imati slične efekte u poređenju sa kombinacijom 2 antitela koja se vezuju za iste epitope. Dalje, pošto bispecifična antitela IgG formata kombinuju 2 različita monovalentna vezujuća regiona u jednom molekulu i smeše 2 IgG antitela kombinuju 2 različita bivalentna vezujuća molekula u jednom preparatu, različiti efekti ovih formata takođe su primećeni. Iz tehnološke i regulatorne perspektive, to čini razvoj jednog bispecifičnog antitela manje kompleksnim, jer proizvodnja, pretklinička i klinička ispitivanja uključuju jedan molekul. Dakle, terapije na bazi jednog bispecifičnog antitela olakšane su manje komplikovanim i ekonomičnim postupkom razvoja leka dok obezbeđuju efikasnije terapije antitelima.

[0006] Bispecifična antitela na bazi IgG formata, koja se sastoje od 2 teška i dva laka lanca proizvedena su različitim postupcima. Na primer, bispecifična antitela se mogu proizvesti fuzijom dve ćelijske linije koje sekretuju antitela da se stvori nova ćelijska linija ili ekspresijom dva antitela u jednoj ćeliji koristeći tehnologiju rekombinantne DNK. Ovi pristupi daju više vrsta antitela, pošto odgovarajući teški lanci iz svakog antitela mogu da formiraju monospecifične dimere (koji se nazivaju i homodimeri), koji sadrže dva identična sparena teška lanca iste specifičnosti, i bispecifične dimere (koji se nazivaju i heterodimeri) koji sadrže dva različita sparena teška lanca različitih specifičnosti. Dodatno, laki lanci i teški lanci iz svakog antitela mogu se nasumično sparivati da bi formirali neprikladne, nefunkcionalne kombinacije. Ovaj problem, poznat kao pogrešno sparivanje teškog i lakog lanca, može se rešiti odabirom antitela koja dele zajednički laki lanac za ekspresiju kao bispecifični. Ali čak i kada se upotrebljava zajednički laki lanac, ekspresija dva teška lanca i jedan zajednički laki lanac u jednoj ćeliji će rezultovati u 3 različite vrste antitela, tj. dva monospecifična „roditeljska“ antitela i bispecifično antitelo tako da bispecifično antitelo od interesa treba da se prečisti iz rezultujuće smeše antitela. Iako su korišćene tehnologije za dalje povećanje procenta bispecifičnih antitela u smešama roditeljskih i bispecifičnih antitela i smanjenje procenta pogrešno sparenih teških i lakih lanaca, ostaje potreba za bispecifičnim formatima koji eliminišu ili minimalizuju neke od gore pomenutih nedostataka.

[0007] Uzevši zajedno, ova struka daje različite tehnologije i postupke za generisanje monoklonalnih antitela, bispecifičnih antitela, smeša monoklonalnih antitela, ili smeša monospecifičnih i bispecifičnih antitela koje se mogu kasnije koristi za terapeutsku primenu kod pacijenata. Međutim, kao što je gore razmotreno, svaki od ovih postojećih tehnologija i postupaka ima svoje nedostatke i ograničenja.

[0008] Stoga postoji potreba za poboljšanjem i/ili alternativnim tehnologijama za proizvodnju bioloških terapeutika u obliku smeša ili bispecifičnih pristupa za ciljanje više molekula koji modifikuju bolesti

OPIS PRONALASKA

[0009] Pronalazak daje postupke i sredstva za poboljšane i/ili alternativne tehnologije za proizvodnju bioloških terapeutika u obliku smeša ili bispecifičnih pristupa za ciljanje više molekula koji modifikuju bolest, kao i proizvode i upotrebe koji su rezultat ovih metoda i sredstava.

U struci su opisani različiti pristupi da bi se promovisalo formiranje određenog bispecifičnog antitela od interesa, čime se smanjuje sadržaj nepoželjnih antitela u rezultujućoj smeši.

Za antitela, dobro je poznato da je CH3-CH3 interakcija primarni pokretač Fc dimerizacije (Ellerson JR., al., J. Immunol 1976 (116) 510-517; Deisenhofer J. biochemistry 1981 (20) 2361-2370). Dalje je dobro poznato da kada dva CH3 domena međusobno interaguju, oni se sreću u protein-protein interfejsu koji sadrži „kontaktne“ ostatke (koji se nazivaju i kontaktne amino-kiseline, interfejs ostaci ili interfejs amino-kiseline). Kontaktne amino-kiseline prvog CH3 domena interaguju sa jednom ili više kontaktnih amino-kiselina drugog CH3 domena. Kontaktne amino-kiseline su tipično unutar 5,5 Å (poželjno unutar 4,5 Å) jedna od druge u trodimenzionalnoj strukturi antitela. Interakcija između kontaktnih ostataka jednog CH3 domena i kontaktnih ostataka drugog CH3 domena može na primer biti preko Van der Valsovih (Van der Waals) sila, vodoničnih veza, vodom posredovanih vodoničnih veza, sonih mostova ili drugih elektrostatičkih sila, privlačnih interakcija između aromatičnih bočnih lanaca, disulfidnih veza, ili drugih sila koje su poznate stručnjacima u oblasti. Prethodno je pokazano da približno jedna trećina bočnih lanaca kontaktne amino-kiseline na interfejsu CH3 domena humanog IgG1 može biti zaslužna za većinu doprinosa savijanju i pridruživanju domena. Dalje se može zamisliti da drugi (susedni) ostaci amino-kiselina mogu uticati na interakcije protein-protein u interfejsu.

[0010] Pristupi za ometanje dimerizacije teških lanaca antitela su korišćeni u struci. Specifično projektovanje u CH3 domenima je primenjeno da bi se favorizovala heterodimerizacija u odnosu na homodimerizaciju. Primeri takvog projektovanja CH3-CH3 interfejsa uključuju uvođenje komplementarnih mutacija isturenosti i šupljina, takođe poznatih kao „izbočina-u-udubljenje“ („knob-into-hole“) pristupi kao što je opisano na primer u WO1998/050431, Ridgeway et al., 1996 i Merchant et al.1998.

Uopšteno, postupak uključuje uvođenje isturenosti na interfejsu prvog polipeptida i odgovarajuće šupljine u interfejsu drugog polipeptida, tako da se isturenost može postaviti u šupljinu kako bi se promovisalo formiranje heteromultimera i ometalo formiranje homomultimera. „Isturenosti“ ili „izbočine“ su konstruisane zamenom malih bočnih lanaca amino-kiselina sa interfejsa prvog polipeptida većim bočnim lancima (npr. tirozin ili triptofan). Kompenzatorne „šupljine“ ili „udubljenja“ jednake ili slične veličine kao i izbočine se stvaraju u interfejsu drugog polipeptida zamenom velikih bočnih lanaca amino-kiselina manjim (npr. alanin ili treonin). Izbočina i šupljina se mogu napraviti sintetičkim sredstvima, kao što je menjanje nukleinske kiseline koja kodira polipeptide ili sintezom peptida.

Upotrebom samo tehnologije „izbočina-u-udubljenje“, proporcija bispecifičnog antitela od interesa je u najboljem slučaju 87% smeše 2 roditeljska i bispecifična antitela. Merchant et al., su uspeli da povećaju proporciju bispecifičnih antitela do 95% smeše uvođenjem dodatne disulfidne veze između dva CH3 domena u CH3-CH3 interfejsu. Ipak, da bi se koristilo takvo bispecifično antitelo kao medikament, bispecifično antitelo mora biti prečišćeno (odvojeno) od homodimera i formulisano u farmaceutski prihvatljiv diluent ili ekscipijent. Prečišćavanje heterodimera iz ovakvih smeša predstavlja veliki izazov zbog sličnosti u fizičko-hemijskim svojstvima homodimera i heterodimera. Jedan cilj ovog pronalaska je da da postupke za proizvodnju bispecifičnog antitela u klonu jedne ćelije sa dodatno poboljšanim proporcijama bispecifičnog antitela u smeši. U skladu sa pronalaskom, izbočina-u-udubljenje tehnologija može se stoga upotrebiti kao jedan od sredstava, zajedno sa drugim sredstvima, da bi se postigla pomenuta dalje poboljšana bispecifična proporcija u smeši.

Drugi primer takvog projektovanja CH3-CH3 interfejsa daje heterodimerna Fc tehnologija koja podržava dizajniranje bispecifičnih i asimetričnih fuzionih proteina osmišljavanjem projektovanih domena za razmenu lanaca (strand-exchange engineered domain (SEED)) CH3 heterodimera. Ovi SEED CH3 heterodimeri proizašli su iz humanih IgG i IgA CH3 domena koji su sačinjeni od alternirajućih segmenata humanih IgA i IgG CH3 sekvenci koje rezultuju u parovima komplementarnih humanih SEED CH3 heterodimera, takozvanim SEED-telima (Davis JH. Et al., Protein Engineering, Design & Selection) 2010(23) 195-202; WO2007/110205).

Još jedan pristup za proizvodnju datog bispecifičnog antitela od interesa je zasnovan na elektrostatičkom projektovanju kontaktnih ostataka unutar CH3-CH3 interfejsa koji su prirodno naelektrisani, kao što je na primer opisano u EP01870459 ili US2010/0015133, WO2007/147901, WO2010/129304, Gunasekaran et al (2010) i WO 2009/089004. Ove publikacije opisuju mutacije u CH3 domenima teških lanaca pri čemu se prirodno prisutni naelektrisani amino-kiselinski kontaktni ostaci zamenjuju amino-kiselinskim ostacima suprotnog naelektrisanja (tj. strategija preokreta naelektrisanja). Ovo stvara izmenjenu polarnost naelektrisanja duž interfejsa Fc dimera tako da ko-ekspresija elektrostatički sparenih Fc lanaca podržava povoljne privlačne interakcije čime se promoviše formiranje poželjnog Fc heterodimera, dok nepovoljne interakcije odbijajućeg naelektrisanja suprimiraju formiranje nepoželjnog Fc homodimera.

Opisano je da su u okviru CH3-CH3 interfejsa četiri jedinstvena naelektrisana para ostatka uključena u domen-domen interakciju. Oni su D356/K439’, E357/K370’, K392/D399’ i D399/K409’ (numerisanje prema Kabatu (1991) gde su ostaci u prvom lancu odvojeni od ostataka u drugom lancu sa „/“ i gde prim (’) označava numerisanje ostatka u drugom lancu). Kako CH3-CH3 interfejs prikazuje bilateralnu simetriju, svaki jedinstveno naelektrisani par je predstavljen dva puta u intaktnom IgG (tj., takođe K439/D356’, K370/E357’, D399/K392’ i K409/D399’ interakcije naelektrisanjem su prisutne u interfejsu). Iskoristivši ovu bilateralnu simetriju, pokazano je da je samo jedan preokret naelektrisanja, npr. K409D u prvom lancu, ili D399’K u drugom lancu rezultovao smanjenim formiranjem homodimera zbog odbijanja identičnih naelektrisanja. Kombinovanjem različitih preokreta naelektrisanja dodatno je poboljšan ovaj odbijajući efekat. Pokazano je da ekspresija različitih CH3 domena koji sadrže različite, komplementarne preokrete naelektrisanja, može pokrenuti heterodimerizacije, što rezultuje u povećanju proporcije bispecifičnih vrsta u smeši.

[0011] Upotrebom gore opisanog pristupa, moguće je proizvesti bispecifično antitelo u jednoj ćeliji sa proporcijama u opsegu između oko 76% i oko 96%.

[0012] U jednom aspektu, predmetni pronalazak daje postupak prema patentnim zahtevima za proizvodnju najmanje dva različita antitela od jedne ćelije domaćina.

[0013] Često je poželjno da se proizvede više od jednog (bispecifičnog) antitela, na primer da bi se efikasnije interferiralo sa više bioloških puteva uključenih u proces bolesti ili sa invazijom, replikacijom i/ili širenjem patogena.

[0014] Smeša više od jednog bispecifičnog antitela je takođe posebno korisna za lečenje određenih bolesti. Na primer, tumorske ćelije upotrbljavaju mnogo različitih strategija da razviju rezistenciju tokom lečenja antitelima ili lekovima malog molekula. Rezistencija može uključivati više ćelijskih površinskih receptora i rastvorljive molekule i smatra se korisnim da se razvijaju lečenja za kancere koja su zasnovana na antitelima koja pokrivaju više takvih molekula koji su povezani sa bolešću i sa izbegavanjem istovremeno. U slučaju da je uključeno više od 2 takva ciljna molekula ili epitopa koji se odnose na bolest i izbegavanje, smeša bispecifičnih antitela daje inovativan i atraktivan terapeutski format. Poželjno, takve smeše bispecifičnih antitela proizvodi jedna ćelija da bi se olakšao postupak razvoja leka koji je manje komplikovan sa regulatorne tačke gledišta i ekonomičan i izvodljiv sa tačke gledišta proizvodnje leka i kliničkog razvoja. U pristupu koji se zasniva na jednoj ćeliji, poželjno je upotrebiti postupke koji omogućavaju kontrolisanu i efikasnu proizvodnju bispecifičnih antitela, čime se smanjuje ili čak potpuno poništava potreba odvajanja poželjne smeše bispecifičnih IgG molekula od nepoželjnih monospecifičnih IgG molekula. U prethodnom stanju tehnike, smeše monospecifičnih i bispecifičnih antitela su proizvedena od strane jedne ćelije (WO2004/009618), ali ove smeše predstavljaju kompleksne mešavine nekoliko različitih bispecifičnih i monospecifičnih vrsta antitela. Sledeći cilj predmetnog pronalaska je obezbediti sredstva i postupke za proizvodnju definisanih smeša bispecifičnih antitela u pojedinačnim ćelijama. Poželjno, obezbeđeni su postupci koji rezultuju u smešama (bispecifičnih) antitela sa proporcijom od najmanje 95%, najmanje 97% ili čak više od 99% dimernih IgG molekula, bez obzira na količinu monomernih sporednih proizvoda, videti ovde u daljem tekstu. Tipično, u ćeliji gde su proizvedeni višestruki intaktni molekuli IgG, mogu biti prisutne polovine molekula (monomerni sporedni proizvodi) koje mogu biti jednostavno uklonjene ekskluzionom hromatografijom poznatom u stanju tehnike.

[0015] U jednom primeru izvođenja predmetni pronalazak daje postupke za proizvodnju definisane smeše najmanje dva različita molekula slična Ig u pojedinačnim ćelijama, umesto pojedinačnog (bispecifičnog) antitela od interesa, pri čemu je formiranje drugih, neželjenih dimernih vrsta antitela smanjeno ili čak odsutno. Dobijena smeša je dobro definisana i njen sastav je kontrolisan dizajnom mutanata CH3 domena. Pored toga, regulacija nivoa ekspresje i/ili različitih odnosa transfekcije korišćenih za ekspresiju utiče na sastav smeše. U postupku prema pronalasku, prvi molekul nukleinske kiseline kodira CH3 domen koji se preferencijalno sparuje sa CH3 domenom kodiranim od strane drugog molekula nukleinske kiseline, i treći molekul nukleinske kiseline kodira CH3 domen koji se preferencijalno sparuje sa CH3 domenom kodiranim od strane četvrtog molekula nukleinske kiseline. Predmetni pronalazak takođe daje smeše najmanje dva različita molekula slična Ig koji se mogu dobiti pomoću postupaka prema pronalasku.

[0016] Kao što je ovde korišćen, termin "preferencijalno sparivanje navedenog prvog i drugog polipeptida koji sadrže CH3 domen" označava da će suštinski svi rezultujući dimeri koji sadrže prvi polipeptid koji sadrži CH3 domen i/ili drugi polipeptid koji sadrži CH3 domen biti dimeri koji se sastoje od jednog prvog polipeptida koji sadrži CH3 domen sparenog sa jednim drugim polipeptidom koji sadrži CH3 domen. Slično, termin "preferencijalno sparivanje navedenog trećeg i četvrtog polipeptida koji sadrži CH3 domen" označava da će suštinski svi od rezultujućih dimera koji sadrže treći polipeptid koji sadrži CH3 domen i/ili četvrti polipeptid koji sadrži CH3 domen biti dimeri koji se sastoje od jednog trećeg polipeptida koji sadrži CH3 sparenog sa jednim četvrtim polipeptidom koji sadrži CH3 domen. Kao rezultat, kada su molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju četiri različita (A, B, C, D) polipeptida koji sadrže CH3 domen uvedeni u jednu ćeliju, umesto smeše 10 različitih dimera sličnih Ig (AA, AB, AC, AD, BB, BC, BD, CC, CD i DD), proizvedena je smeša pretežno dva specifična molekula slična Ig.

Kao što je ovde ispod detaljnije objašnjeno, pomenuti prvi polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen sadrži ostatak lizina (K) na aminokiselinskom položaju 366 u skladu sa EU sistemom numeracije, i pomenuti drugi polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen sadrži ostatak asparaginske kiseline (D) na aminokiselinskom položaju 351 u skladu sa EU sistemom numeracije. Ove aminokiselinske promene su sredstva za preferencijalno sparivanje navedenog prvog i drugog polipeptidnog lanca koji sadrži CH3 domen.

Pomenuti prvi polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen poželjno dalje sadrži ostatak lizina (K) na aminokiselinskom položaju 351 u skladu sa EU sistemom numeracije. Pored toga, pomenuti drugi polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen poželjno dalje sadrži ostatak glutaminske kiseline (E) ili ostatak asparaginske kiseline (D) na položaju amino-kiseline 349 u skladu sa EU sistemom numeracije, i/ili ostatak glutaminske kiseline (E) na aminokiselinskom položaju 368 u skladu sa EU sistemom numeracije, najpoželjnije ostatak glutaminske kiseline (E) na aminokiselinskom položaju 368 u skladu sa EU sistemom numeracije. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, navedeni treći polipeptid koji sadrži CH3 domen sadrži lizin (K) ostatak na aminokiselinskom položaju 356 prema EU sistemu numeracije i lizin (K) ostatak na aminokiselinskom položaju 399 prema EU sistemu numeracije, i navedeni četvrti polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen sadrži ostatak asparaginske kiseline (D) na aminokiselinskom položaju 392 prema EU sistemu numeracije i ostatak asparaginske kiseline (D) na aminokiselinskom položaju 409 prema EU sistemu numeracije.

U postupku u skladu sa ovim pronalaskom, svaki od polipeptidnih lanaca koji sadrže CH3 domen poželjno dalje sadrži varijabilni region koji prepoznaje ciljni epitop. Varijabilni regioni koji su deo polipeptidnih lanaca koji sadrže CH3 domen, poželjno dele zajednički laki lanac. U tom slučaju samo se VH varijabilnih regiona razlikuju dok je VL u svim varijabilnim regionima u suštini isti. Prema tome, u poželjnom aspektu dat je postupak u skladu sa pronalaskom, koji dalje sadrži davanje pomenute ćelije domaćina sa molekulom nukleinske kiseline koji kodira zajednički laki lanac.

U jednom naročito poželjnom primeru izvođenja, svaki od navedena 4 varijabilna regiona 4 polipeptidna lanca koji sadrže CH3 domen prepoznaje različiti ciljni epitop. Na primer, ako prvi molekul nukleinske kiseline kodira težak lanac koji dalje sadržik varijabilni domen sa specifičnošću za antigen A, drugi molekul nukleinske kiseline kodira težak lanac koji dalje sadrži varijabilni domen sa specifičnošću za antigen B, treći molekul nukleinske kiseline kodira težak lanac koji dalje sadrži varijabilni domen sa specifičnošću za antigen C, i četvrti molekul nukleinske kiseline kodira težak lanac koji dalje sadrži varijabilni domen sa specifičnošću za antigen D, tada će biti proizvedena smeša koja sadrži bispecifične molekule slične Ig koji su specifični za AB i bispecifične molekule slične Ig koji su specifični za CD. Formiranje monospecifičnih antitela (sa specifičnošću za AA, BB, CC ili DD) ili bispecifičnih antitela sa specifičnošću za AC, AD, BC ili BD je snižena ili čak odsutna zbog sredstava za preferencijalno sparivanje navedenog prvog i drugog polipeptida koji sadrži CH3 domen i navedenog trećeg i četvrtog polipeptida koji sadrže CH3 domen. Naravno, moguće je koristiti dodatne molekule nukleinske kiseline, na primer koji kodiraju peti i šesti polipeptid koji sadrže CH3 domen, u cilju proizvodnje definisanih smeša koje sadrže više od dva različita molekula slična Ig.

Potrebno je navesti da odnos nukleinskih kiselina korišćenih u postupku prema pronalasku ne mora da bude 1:1:1:1 i odnos rezultujućih molekula sličnih Ig koji su eksprimirani ne mora da bude 1:1. Moguće je koristiti sredstva poznata u stanju tehnike za proizvodnju smeša antitela sa optimizovanim odnosima. Na primer, ekspresioni nivoi molekula nukleinskih kiselina i stoga odnosi rezultujućih proizvedenih molekula sličnih Ig mogu biti regulisani upotrebom različitih genetičkih elemenata kao što su promotori, pojačivači i represori ili kontrolom mesta genomske ugradnje broja kopije DNK konstrukata koji kodiraju antitela.

Navedena sredstva za preferencijalno sparivanje mogu da sadrže konstruisane komplementarne mutacije dugme-u-rupu, disulfidne mostove, mutacije naelektrisanja uključujući mutacije koje vrše reverziju naelektrisanja ili njihove kombinacije. Stručnjak iz date oblasti tehnike će razumeti da navedena sredstva za preferencijalno sparivanje mogu biti izabrana unutar određenog tipa mutacija, tj. svih najmanje 4 molekula nukleinske kiseline koji kodiraju polipeptidne lance koji sadrže CH3 domen mogu na primer da sadrže mutacije naelektrisanja kao sredstvo za preferencijalno sparivanje. Dodatno, takođe nekonstruisani divlji tip CH3 može u određenim slučajevima biti korišćen za preferencijalno sparivanje dva polipeptida lanca koji sadrže divlji tip CH3 domena. U naročito poželjnom aspektu, navedena sredstva za preferencijalno sparivanje sadrže najmanje jednu CH3 mutaciju izabranu iz Tabele B, kao što je objašnjeno na drugom mestu u ovoj prijavi. Jedan poželjan primer izvođenja na taj način obezbeđuje postupak prema patentnim zahtevima, gde su sva 4 od navedenih molekula nukleinskih kiselina obezbeđeni sa sredstvima za preferencijalno sparivanje navedenog prvog i drugog polipeptida koji sadrže CH3 domen i navedenog trećeg i četvrtog polipeptida koji sadrže CH3 domen, pri čemu su navedena sredstva za preferencijalno sparivanje navedenog prvog i drugog polipeptida koji sadrže CH3 domen različiti od onih sredstava za preferencijalno sparivanje navedenog trećeg i četvrtog polipeptida koji sadrže CH3 domen.

[0017] Jedan aspekt predmetnog pronalaska daje postupak prema patentnim zahtevima, pri čemu navedena sredstva za preferencijalno sparivanje navedenog prvog i drugog polipeptida koji sadrže CH3 domen su različita od navedenih sredstava za preferencijalno sparivanje navedenog trećeg i četvrtog polipeptida koji sadrže CH3 domen. ’Različit’ označava da su sredstva za preferencijalno sparivanje navedenog prvog i drugog polipeptida koji sadrže CH3 domen dizajnirana tako da je preferencijalno sparivanje prvog i drugog lanca poželjno. Dizajn je takav da suštinski neće biti interakcije između prvog i trećeg i/ili četvrtog polipeptidnog lanca koji sadrži CH3 domen. Drugim rečima, dimerizacija između navedenog prvog polipeptida koji sadrži CH3 domen io navedenog trećeg ili četvrtog polipeptida je smanjena suštinski do nule i tako dalje. Treći i četvrti polipeptid koji sadrži CH3 domen mogu biti divljeg tipa ili mogu da sadrže sredstva za preferencijalno sparivanje koja su različita od sredstava za preferencijalno sparivanje prvog i drugog CH3 domena. Trenutne studije su se fokusirale na proizvodnju jednog bispecifičnog antitela, upotrebom na primer tehnologije dugme-u-rupi ili mutacija (reverzija) naelektrisanih kontaktnih aminokiselina prisutnih u CH3 domenima. Proizvodnja definisanih smeša najmanje dva (bispecifična) molekula slična Ig, bez značajne istovremene proizvodnje drugih dimernih sporednih proizvoda, međutim, nije realizovana pre predmetnog pronalaska.

Predmetni pronalazak daje postupke za efikasnu i kontrolisanu proizvodnju dobro definisane smeše molekula sličnih Ig, sa visokom proporcijom bispecifičnih molekula u smeši. Čak proporcija (dva) bispecifična molekula od najmanje 95%, najmanje 97% ili više je dobijena u sistemu gde su poželjna dva bispecifična molekula. Ovo znači da je dobijeno samo najviše 5%, najviše 3% ili manje monospecifičnih bivalentnih sporednih proizvoda. Treba napomenuti da je količina monomernih sporednih proizvoda, tj. polovina molekula, manje važna zbog toga što se polovine molekula lako odvajaju od dimera upotrebom njihove razlike u veličini.

[0018] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, varijabilni regioni prvog i drugog polipeptidnog lanca koji sadrže CH3 domen prepoznaje različite ciljne epitope, dok varijabilni regioni trećeg i četvrtog polipeptidnog lanca koji sadrže CH3 domen prepoznaju iste ciljne epitope. Ovo će imati za rezultat predominantnu proizvodnju jedne vrste bispecifičnog molekula sličnog Ig i jedne vrste monospecifičnog molekula sličnog Ig. Na primer, ako varijabilni regioni prvog i drugog polipeptidnog lanca koji sadrže CH3 domen prepoznaju različite ciljne epitope i ako varijabilni regioni trećeg i četvrtog polipeptidnog lanca koji sadrži CH3 domen oba prepoznaju isti ciljni epitop koji se razlikuje od ciljnih epitopa koji su prepoznati od strane prvog i drugog CH3 domena, biće formirana smeša molekula sličnih Ig koji imaju specifičnost za AB ili CC. Dalje je prema tome obezbeđen postupak prema pronalasku, gde je ciljni epitop koga prepoznaju varijabilni regioni trećeg i četvrtog polipeptidnog lanca koji sadrže CH3 domen isti, ali različit od ciljnog epitopa koga prepoznaje varijabilni region prvog ili drugog polipeptidnog lanca koji sadrže CH3 domen. Alternativno, kada varijabilni regioni prvog i drugog polipeptidnog lanca koji sadrže CH3 domen prepoznaju različite ciljne epitope i kada varijabilni regioni trećeg i četvrtog polipeptidnog lanca koji sadrže CH3 domen oba prepoznaju isti epitop kao prvi ili drugi polipeptidni lanac koji sadrže CH3 domen, biće formirana smeša molekula sličnih Ig koji imaju specifičnost za AB i AA, ili AB i BB. Postupak prema pronalasku, u kome ciljni epitop koga prepoznaju varijabilni regioni trećeg i četvrtog polipeptidnog lanca koji sadrže CH3 domen je isti kao ciljni epitop koga prepoznaje varijabilni region prvog ili drugog polipeptidnog lanca koji sadrže CH3 domen je prema tome takođe ovde obezbeđen.

[0019] Sledeći cilj pronalaska je obezbediti sredstva i postupke za proizvodnju definisanih smeša bispecifičnih antitela i monospecifičnih antitela u jednoj ćelijskoj kulturi. Neograničavajući primer takve dobro definisane smeše je smeša bispecifičnih antitela sa specifičnošću za AB i monospecifičnih antitela sa specifičnošću za AA. Sledeći primer je smeša bispecifičnih antitela sa specifičnošću za AB i monospecifičnih antitela sa specifičnošću za BB. Sledeći priemr je smeša bispecifičnih antitela sa specifičnošću za AB i monospecifičnih antitela sa specifičnošću za CC. Ponovo, obezbđena su poželjna sredstva i postupci koji proizvode smeše antitela od interesa sa najmanje 90%, poželjnije najmanje 95% i najpoželjnije najmanje 97% ili čak više od 99% željenih antitela.

[0020] U sledećem primeru izvođenja, obezbđene je postupak prema pronalasku u kome varijabilni regioni prvog i drugog polipeptidnog lanca koji sadrže CH3 domen prepoznaju isti ciljni epitop, dok varijabilni regioni trećeg i četvrtog polipeptidnog lanca koji sadrže CH3 domen prepoznaju drugi ciljni epitop koji se razlikuje od ciljnog epitopa koga prepoznaju navedeni prvi i drugi varijabilni region. Ovo će rezultirati u predominantnoj proizvodnji monospecifičnih molekula sličnih Ig koji imaju specifičnost za AA ili specifičnost za BB. Formiranje bispecifičnih molekula sličnih Ig je smanjeno ili čak izbegnuto. U nekoliko primera izvođenja poželjno je proizvoditi smeše monospecifičnih antitela u jednoj ćeliji, pre nego smeše bispecifičnih antitela. Na primer slučaj kada je željeno unakrsno vezivanje dva identična ciljna molekula, ili kada su dva ciljna mesta locirana međusobno predaleko tako da ne mogu da se vežu pomoću jednog bispecifičnog antitela. Takođe može biti povoljno proizvoditi smeše monospecifičnih antitela u jednoj ćeliji jer se smeša može smatrati jednim terapeutskim proizvodom. U stanju tehnike, terapeutska efikasnost i bezbednost različitih monospecifičnih antitela je već dokazana i dozvola za stavljanje u promet je dobijena. Proizvodnja smeša monospecifičnih antitela u jednoj ćeliji će na taj način olakšati testiranje za efikasnost i bezbednost nekoliko takvih smeša i smanjiće napore i troškove za regulatornu dozvolu i proizvodnju. Međutim, trenutno nema postupaka dostupnih za proizvodnju specifičnih smeša monospecifičnih antitela u jednoj ćeliji gde je formiranje bispecifičnih sporednih proizvoda smanjena do ispod 5%. Sledeći cilj predmetnog pronalaska je obezbediti sredstva i postupke za proizvodnju takvih dobro definisanih smeša homodimernog antitela u pojedinačnim ćelijama gde je formiranje bispecifičnih antitela smanjeno do ispod 5%.

[0021] Stoga, postupak prema predmetnom pronalasku je pogodan za proizvodnju bilo koje željene smeše bispecifičnih i/ili monospecifičnih molekula sličnih Ig. Ponovo, moguće je koristiti dodatne molekule nukleinske kiseline, na primer koji kodiraju peti i šesti (i sedmi i osmi i tako dalje) polipeptid koji sadrži CH3 domen, u cilju proizvodnje definisanih smeša koje sadrže više od dva različita molekula slična Ig.

[0022] U postupku u skladu sa ovim pronalaskom upotrebljena su najmanje dva CH3 domena koja sadrže najmanje jednu kombinaciju mutacija datih ovim pronalaskom. Kroz ove mutacije formiraju se nove specifične interakcije između dva CH3 domena. Ove mutacije u skladu sa ovim pronalaskom su razmatrane detaljnije u daljem tekstu.

[0023] Termin "Ig-sličan molekul/molekul sličan Ig", kako se ovde upotrebljava, označava proteinski molekul koji poseduje najmanje jedan imunoglobulinski (Ig) domen. Pomenuti Igsličan molekul sadrži sekvencu koja sadrži funkciju najmanje imunoglobulinskog CH3 domena, poželjno sekvenca sadrži IgG1 CH3 domen. Proteinski molekuli koji poseduju najmanje CH3 domen mogu biti dodatno opremljeni specifičnim veznim grupama. CH3 domeni ovog pronalaska, koji sadrže sredstva za preferencijalno sparivanje, mogu se dakle upotrebljavati za preferencijalno sparivanje dva proteinska molekula koji sadrže CH3-domen za dizajniranje poželjnih heterodimernih vezujućih molekula ili smeša vezujućih molekula. Vezujući ostaci koji mogu biti projektovani na proteinske molekule koje sadrže CH3-domen mogu biti bilo koji vezujući agens, uključujući, ali ne ograničavajući se na, Fvs jednostruki lanac, jednostruki lanac ili Tandem diatela (TandAb®), VHHs, Anticalins®, Nanobodies®, BiTE®, Fab, ankirin ponovljene proteine ili DARPINs®, Avimers®, DART, TCR-slično antitelo, Adnectins®, Affilins®, Trans-bodies®, Affibodies®, TrimerX®, Mikroproteine, Fynomers®, Centyrins® ili KALBITOR®. U poželjnom primeru izvođenja, vezne grupe su varijabilni regioni antitela (tj. VH/VL kombinacije). Varijabilni regioni koji su deo polipeptidnih lanaca koji sadrže CH3-domena poželjno dele zajednički laki lanac. U tom slučaju, samo se VH varijabilnih regiona razlikuju, dok je VL u svim varijabilnim regionima u suštini isti.

Alternativno, ili dodatno, drugi molekuli mogu biti projektovani na CH3 domene ovog pronalaska, uključujući citokine, hormone, rastvorljive ligande, receptore i/ili peptide.

U postupku prema pronalasku, pomenuti Ig-sličan molekul sadrži okosnicu Fc pune dužine. U najpoželjnijem primeru izvođenja, Ig-slični molekuli su antitela. Varijabilni regioni ovih antitela poželjno dele zajednički laki lanac, ali oni se mogu razlikovati u svojim VH regionima. Termin "antitelo", kako se ovde upotrebljava, označava proteinski molekul koji pripada imunoglobulinskoj klasi proteina, koji sadrži jedan ili više domena koji vezuju epitop na antigenu, gde su takvi domeni izvedeni iz ili dele homologiju sekvence sa varijabilnim regionom antitela. Antitela su poznata u struci i uključuju nekoliko izotipova, kao što su IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE, i IgM. Antitelo u skladu sa pronalaskom može biti IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4, Ig-slični molekuli proizvode se tako što su antitela izotipa IgG zato što IgG antitela npr. imaju duži poluživot u odnosu na antitelima drugih izotipova.

Antitela proizvedena postupcima u skladu sa ovim pronalaskom imaju humane sekvence. Antitela se mogu sastojati od sekvenci samo jednog porekla, kao što su potpuno humana antitela, ili mogu imati sekvence više od jednog porekla, što rezultuje na primer u himernim ili humanizovanim antitelima. Antitela za terapeutsku upotrebu su poželjno što je moguće bliža prirodnim antitelima subjekta koji se tretira (na primer humana antitela za humane subjekte). Vezivanje antitela može biti izraženo u smislu specifičnosti i afiniteta. Specifičnost određuje koji antigen ili njegov epitop je vezan za vezujući domen. Afinitet je mera jačine vezivanja za određeni antigen ili epitop. Specifično vezivanje je definisano kao vezivanje sa afinitetima (KD) od najmanje 1x10-5 M, poželjnije 1x10<-7>M, poželjnije više od 1x10<-9>M. Tipično, monoklonalna antitela za terapeutske primene imaju afinitete do 1x10<-10>M ili čak više. Termin "antigen", kako se ovde upotrebljava, označava supstancu ili molekul koji, kada se unese u telo, izaziva proizvodnju antitela od strane imunskog sistema. Antigen, između ostalog, može biti izveden iz patogenih organizama, tumorskih ćelija ili drugih aberantnih ćelija, iz haptena, ili čak iz sopstvenih struktura. Na molekularnom nivou, antigen je naznačen svojom sposobnošću da bude vezan za antigen-vezujuće mesto na antitelu. Takođe smeše antigena mogu se smatrati „antigenom“, tj. stručnjak bi cenio da ponekad lizat tumorskih ćelija, ili virusnih čestica može se smatrati kao „antigen“, pošto takav lizat tumorske ćelija ili preparat virusne čestice postoji od mnogih antigenih determinanti. Antigen sadrži najmanje jedan, ali često više, epitopa. Termin „epitop“, kako se ovde upotrebljava, označava deo antigena koji je prepoznat od strane imunskog sistema, posebno antitela, B ćelija, ili T ćelija. Iako se za epitope obično misli da su izvedeni iz nesopstvenih proteina, sekvence izvedene od domaćina koje mogu biti prepoznate su takođe klasifikovane kao epitopi.

[0024] Termin „CH3 domen“ je dobro poznat u struci. IgG struktura ima četiri lanca, dva laka i dva teška lanca; svaki laki lanac ima dva domena, varijabilni i konstantni laki lanac (VL i CL) i svaki teški lanac ima četiri domena, varijabilni teški lanac (VH) i tri konstantna domena teškog lanca (CH1, CH2, CH3). CH2 i CH3 region domena teškog lanca se naziva Fc (fragment koji može da kristalizuje) deo, Fc fragment, Fc okosnica ili jednostavno Fc. Molekul IgG je heterotetramer koji ima dva teška lanca koji se drže zajedno pomoću disulfidnih veza (-S-S-) na zglobnom regionu i dva laka lanca. Teški lanci dimerizuju preko interakcija na interfejsu CH3-CH3 domena i preko interakcija u zglobnom regionu. Broj zglobnih disulfidnih veza varira među podgrupama imunoglobulina (Papadea i Check 1989). Fc fragment molekula imunoglobulina je dimer dva C-terminalna konstantna regiona, tj. CH2 i CH3 domena teškog lanca. Među njegovim fiziološkim funkcijama su interakcije sa sistemom komplementa i sa specifičnim receptorima na površini različitih ćelija. Poznato je da interakcije između CH3 domena dva pojedinačna teška lanca igraju važnu ulogu u pokretanju dimerizacije teškog lanca. Prema tome, CH3 domeni upravljaju asocijacijom teških lanaca antitela, i poznato je da interfejs između CH3 domena sadrži više od 20 kontaktnih ostataka iz svakog lanca koji igraju ulogu u CH3-CH3 interakciji (Deisenhofer J., Biochemistry 1981(20)2361-2370; Miller S., J. Mol. Biol. 1990(216)965-973; Padlan, Advances in Protein Chemistry 1996 (49) 57-133). CH3 varijante ovog pronalaska mogu se stoga upotrebljavati vezana sa drugim domenima antitela da bi se generisala antitela pune dužine koja su ili bispecifična ili monospecifična. Specifičnost antitela kao što je definisano kombinacijama VH/VL tipično ne utiče na ponašanje dimerizacije teškog lanca koja je pokrenuta CH3 domenima.

Termini „kontaktni ostatak“, „kontaktna amino-kiselina“, „interfejs ostatak“ i „interfejs amino-kiselina“ kako se ovde upotrebljavaju tipično se odnose na bilo koji amino-kiselinski ostatak prisutan u CH3 domenu koji može biti uključen u kontakte između domena, kao što može biti izračunato pomoću tehnologija poznatih u struci, uključujući računanje pristupačne površinske površine rastvarača (ASA) ostataka CH3 domena u prisustvu i odsustvu drugog lanca (Lee i Richards J. Mol. Biol.1971(55)379) gde su ostaci koji pokazuju razliku (> 1 Å2) u ASA između dva izračunavanja identifikovani kao kontaktni ostaci. Kontaktni ostaci koji su identifikovani uključuju ostatke na položajima 347, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 360, 364, 366, 368, 370, 390, 392, 394, 395, 397, 399, 400, 405, 407, 409, 439 u skladu sa EU sistemom numeracije (Tabela A).

Tabela A: Spisak interfejs ostataka CH3 domena

[0025] Kontaktni ostaci unutar CH3-CH3 interfejsa mogu biti ili amino-kiseline koje su naelektrisane, ili ostaci amino-kiselina koji su neutralni. Termin „naelektrisani aminokiselinski ostatak“ ili „naelektrisani ostatak“, kako se ovde upotrebljava, označava aminokiselinske ostatke sa električno naelektrisanim bočnim lancima. Oni mogu biti ili pozitivno naelektrisani bočni lanci, kao što su prisutni u argininu (Arg, R), histidinu (His, H) i lizinu (Lis, K) ili mogu biti negativno naelektrisani bočni lanci, kao što su prisutni u asparaginskoj kiselini (Asp, D) i glutaminskoj kiselini (Glu, E). Termin „neutralni amino-kiselinski ostatak“ ili neutralni ostatak kako se ovde upotrebljava odnosi se na sve druge amino-kiseline koje ne nose električno naelektrisane bočne lance. Ovi neutralni ostaci uključuju serin (Ser, S), treonin (Thr, T), asparagin (Asn, N), glutamin (GLu, Q), cistein (Cys, C), glicin (Gly, G), prolin (Pro, P), alanin (Ala, A), valin (Val, V), izoleucin (Ile, I), leucin (Leu, L), metionin (Met, M), fenilalanin (Phe, F), tirozin (Tyr, Y) i triptofan (Trp, T).

[0026] Termin „CH3-CH3 domen interfejs“, ili „CH3 interfejs“, „CH3-CH3 sparivanje“, „domen interfejs“ ili jednostavno „nterfejs“, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na vezu između dva CH3 domena odvojenih polipeptida koji sadrže CH3-domen koja je rezultat interakcije amino-kiselinskih ostataka, tj. najmanje jedne interakcije između amino-kiseline prvog CH3 domena i amino-kiseline drugog CH3 domena. Takva interakcija je na primer preko Van der Valsovih sila, vodončnih veza, vodom posredovanih vodoničnih veza, sonih mostova ili drugih elektrostatičkih sila, privlačnih interakcija između aromatičnih bočnih lanaca, formiranja disulfidnih veza, ili drugih sila koje su poznate stručnjacima u oblasti.

[0027] Kao što su ovde korišćena, navedena sredstva za preferencijalno sparivanje prvog i drugog polipeptida koji sadrže CH3 domen i navedenog trećeg i četvrtog polipeptida koji sadrže CH3 domen mogu biti bilo koja sredstva poznata u stanju tehnike. U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan molekul nukleinske kiseline kodira CH3 domen koji sadrži na položaju kontaktnog ostatka veliki aminokiselinski ostatak (tj. "dugme" ili "ispupčenje") kao što je na primer R, F, Y, W, I ili L, pri čemu najmanje jedan drugi molekul nukleinske kiseline kodira CH3 domen koji sadrži na položaju komplementarnog kontaktnog ostatka mali aminokiselinski statak (tj. "rupa" ili "šupljina") kao što je na primer G, A, S, T ili V. Rezultujući CH3 domeni će preferencijalno međusobno da se sparuju zbog steričke konformacije navedenih kontaktnih aminokiselina. Tehnologija dugme-u-rupi je opisana ovde u ranijem tekstu detaljnije. U dodatnom primeru izvođenja prema predmetnom pronalasku, najmanje jedan molekul nukleinske kiseline kodira CH3 domen koji sadrži na položaju kontaktnog ostatka koji je prirodno naelektrisan, tj. prirodni K, H, R, D ili E, aminokiselinu koja nosi suprotno naelektrisanje u poređenju sa divljim tipom, pri čemu najmanje jkedan drugi molekul nukleinske kiseline kodira CH3 domen koji sadrži na položaju komplementarnog kontaktnog ostataka koji je prirodno naelektrisan, aminokiselinu koja nosi suprotno naelektrisanje u poređenju sa divljim tipom. Rezultujući konstruisani CH3 domeni će preferencijalno da se sparuju međusobno zbog suprotnih naelektrisanja navedenih kontaktnih aminokiselina, dok će sparivanje identičnih CH3 domena biti smanjeno zbog elektrostatičkog odbijanja. U jednom primeru izvođenja, korišćene su mutacije CH3 kao što su opisane u EP01870459, WO 2009/089004, Gunasekaran et al (2010). Poželjno, oba navedena sredstva za preferencijalno sparivanje navedenog prvog i drugog polipeptida koji sadrže CH3 domen i navedenog trećeg i četvrtog polipeptida koji sadrže CH3 domen su aminokiseline konstruisane prema naelektrisanju. U jednom primeru izvođenja, različiti aminokiselinski ostaci su konstruisani za preferencijalno sparivanje navedenog prvog i drugog polipeptida koji sadrže CH3 domen u poređenju sa aminokiselinskim ostacima koji su konstruisani za preferencijalno sparivanje navedenog trećeg i četvrtog polipeptida koji sadrže CH3 domen. U postupku u skladu sa pronalaskom, najmanje prvi i drugi molekul nukleinske kiseline kodiraju CH3 domene sa novim mutacijama kao što je dato ovim pronalaskom. Kao što je ovde ispod detaljnije opisano, ovaj pronalazak daje nove CH3 mutacije koje omogućavaju proizvodnju određenih bispecifičnih Ig-sličnih molekula od interesa bez značajne količine nepoželjnih (dimernih) sporednih proizvoda. Ovaj pronalazak takođe daje nove CH3 mutacije koje omogućavaju proizvodnju određenih monospecifičnih Ig-sličnih molekula od interesa bez značajne količine nepoželjnih (dimernih) sporednih proizvoda. Upotreba najmanje jedne od ovih CH3 mutacija u skladu sa ovim pronalaskom je, prema tome, poželjna.

[0028] Termin „polipeptid“, „polipeptidni molekul“ ili „polipeptidni lanac“ kako se ovde upotrebljava odnosi se na lanac amino-kiselina koje su kovalentno povezane preko peptidnih veza. Proteini su obično sačinjeni od jednog ili više molekula polipeptida. Jedan kraj svakog polipeptida, nazvan amino terminus ili N-terminus, ima slobodnu amino grupu. Drugi kraj, sa svojom slobodnom karboksilnom grupom, naziva se karboksilni terminus ili C-terminus. Polipeptidi u skladu sa ovim pronalaskom mogu da prođu kroz procese post-translacione modifikacije i mogu npr. biti glikozilovani. Polipeptidni lanci koji sadrže CH3 domen u ovog pronalaska se stoga odnose na polipeptidne lance koji najmanje uključuju Ig CH3 domen i koji su možda prošli kroz procese post-translacione modifikacije.

[0029] Termin „molekul nukleinske kiseline“ kako se ovde upotrebljava definisan je kao molekul koji sadrži lanac nukleotida, poželjnije DNK i/ili RNK. U jednom primeru izvođenja, upotrebljava se dvolančana RNK. U drugim primerima izvođenja molekul nukleinske kiseline iz pronalaska sadrži druge vrste struktura nukleinske kiseline kao što je na primer heliks DNK/RNK, peptidna nukleinska kiselina (PNK), zaključana nukleinska kiselina (LNK) i/ili ribozim. Dakle, termin „molekul nukleinske kiseline“ takođe obuhvata lanac koji sadrži neprirodne nukleotide, modifikovane nukleotide i/ili nenukleotidne gradivne blokove koji pokazuju istu funkciju kao i prirodni nukleotidi.

[0030] Predmetni pronalazak dalje daje postupak prema patentnim zahtevima za pripremu ćelije domaćina za proizvodnju najmanje dva različita antitela. Navedeni postupci za pripremu navedenih ćelija domaćina poželjno dalje sadrže korak uvođenja u navedenu ćeliju domaćina sekvence nukleinske kiseline koja kodira zajednički laki lanac.

[0031] Ovde je takođe data rekombinantna ćelija domaćin prema patentnim zahtevima koja sadrži sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju najmanje prvi, drugi, treći i četvrti polipeptidni lanac koji sadrže CH3 domen.

[0032] Rekombinantna ćelija domaćin u skladu sa pronalaskom poželjno dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira zajednički laki lanac.

[0033] „Ćelija domaćin“ u skladu sa pronalaskom može biti bilo koja ćelija domaćin koja je sposobna za ekspresiju rekombinantnih molekula DNK, uključujući bakterije kao što su na primer Escherichia (npr. E. coli), Enterobacter, Salmonalla, Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, kvasci kao što su S. cerevisiae, K. lactis, P. pastoris, Candida, ili Yarrowia, filamentozne gljive kao što su Neurospora, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans i Aspergillus niger, ćelije insekata kao što su Spodoptera frugiperda SF-9 ili SF-21 ćelije, i poželjno ćelije sisara, kao što su ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), BHK ćelije, mišije ćelije uključujući SP2/0 ćelije i NS-0 ćelije mijeloma, ćelije primata kao što su COS i Vero ćelije, MDCK ćelije, BRL 3A ćelije, hibridomi, tumorske ćelije, imortalizovane primarne ćelije, humane ćelije kao što su W138, HepG2, HeLa, HEK293, HT1080 ili ćelije embrionalne mrežnjače kao što je PER. C6, i slične. Često, sistem ekspresije od izbora uključivaće vektor ekspresije i domaćina ćelije sisara tako da antitela mogu biti odgovarajuće glikozilovana. Humana ćelijska linija, poželjno PER.C6 se može korisno koristiti za dobijanje antitela sa potpuno humanim glikozilacionim obrascem. Uslovi za rast ili umnožavanje ćelija (videti npr. Tissue Culture, Academic Press, Kruse i Paterson, editors (1973)) i uslovi za ekspresiju rekombinantnog proizvoda mogu se donekle razlikovati, i optimizacija procesa se obično vrši da bi se povećale proporcije proizvoda i/ili rast ćelija u odnosu jedna na drugu, u skladu sa postupcima opšte poznatim stručnjaku u oblasti. Načelno, principi, protokoli, i praktične tehnike za maksimiziranje produktivnosti kultura ćelija sisara može se pronaći u Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach (M. Butler, ed., IRL Press, 1991). Ekspresija antitela u rekombinantnim ćelijama domaćina detaljno je opisana u struci (videti npr. EP0120694; EP0314161; EP0481790; EP0523949; US patent 4,816,567; WO 00/63403). Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju lake i teške lance mogu biti prisutni kao ekstrahromozomske kopije i/ili stabilno integrisane u hromozom ćelije domaćina, ovo drugo je poželjno.

Dalji aspekt ovog pronalaska je da se da kulturu rekombinantnih ćelija domaćina u skladu sa pronalaskom, ili kulturu rekombinantnih ćelija domaćina koje se mogu dobiti ili dobijene postupkom u skladu sa pronalaskom, pomenuta kultura proizvodi najmanje dva različita antitela.

[0034] Da bi se dobila ekspresija sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju polipeptide koji sadrže CH3 domen, dobro je poznato stručnjacima u ovoj oblasti da sekvence sposobne za pokretanje takve ekspresije mogu biti funkcionalno povezane sa sekvencama nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptide koji sadrže CH3 domen. Funkcionalno povezana treba da opiše da su sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptide koji sadrže CH3 domen ili njihove prekursore povezane sa sekvencama koje su sposobne da pokrenu ekspresiju tako da ove sekvence mogu pokrenuti ekspresiju polipeptida koji sadrže CH3 domen ili njihovih prekursora. Korisni vektori ekspresije su dostupni u struci, npr. pcDNK vektor serije Invitrogen. Tamo gde je pravilno ubačena sekvenca koja kodira polipeptid od interesa sa referencom na sekvence koje regulišu transkripciju i translaciju kodiranog polipeptida, rezultujuća kaseta ekspresije je korisna za proizvodnju polipeptida od interesa, što se oznašava kao ekspresija. Sekvence koje pokreću ekspresiju mogu uključivati promotore, pojačivače i njihove kombinacije. One treba da budu sposobne za funkcionisanje u ćeliji domaćinu, time pokrećući ekspresiju sekvenci nukleinske kiseline koje su funkcionalno povezane sa njima. Promotori mogu biti konstitutivni ili regulatorni, i mogu se dobiti iz različitih izvora, uključujući viruse, prokariotske, ili eukariotske izvore, ili biti veštački dizajnirani. Ekspresija nukleinskih kiselina od interesa može biti od prirodnog promotora ili njegovog derivata ili od potpuno heterolognog promotora. Neki dobro poznati i veoma upotrebljavani promotori za ekspresiju u eukariotskim ćelijama sadrže promotore izvedene iz virusa, kao što je adenovirus, npr. E1A promotor, promotore izvedene iz citomegalovirusa (CMV), kao što je CMV neposredni rani (IE) promotor i promotore izvedene iz Simian Virusa 40 (SV40). Pogodni promotori mogu takođe biti izvedeni iz eukariotskih ćelija, kao što su metalotioneinski (MT) promotori, faktor elongacije 1α (EF-1α) promotor, promotor aktina, promotor imunoglobulina i promotori toplotnog šoka. Bilo koji promotor ili pojačivač/promotor sposoban za pokretanje ekspresije sekvence od interesa u ćeliji domaćinu je pogodan u pronalasku. U jednom primeru izvođenja, sekvenca sposobna za pokretanje ekspresije sadrži region iz promotora CMV, poželjno region koji sadrži nukleotide -735 do 95 CMV neposrednog ranog genskog pojačivača/promotora. Iskusni stručnjak u oblasti biće svestan da se ekspresione sekvence koje se upotrebljavaju u pronalasku mogu pogodno kombinovati sa elementima koji mogu stabilizovati ili pojačati ekspresiju, kao što su izolatori, regioni za pričvršćivanje matriksa i STAR elementi (WO 03/004704). Ovo može povećati stabilnost i/ili nivoe ekspresije. Proizvodnja proteina u rekombinantnim ćelijama domaćinima je detaljno opisana, npr. u Current Protocols in Protein Science, 1995, Coligan JE, Dunn BM, Ploegh HL, Speicher DW, Wingfield PT, ISBN 0-471-11184-8; Bendig, 1988. Kultivacija ćelije je napravljena da omogući metabolizam, i/ili rast i/ili deljenje i/ili proizvodnju rekombinantnih proteina od interesa. Ovo se može postići postupcima koji su dobro poznati stručnjacima iz oblasti, i uključuju ali nisu ograničeni na obezbeđivanje hranljivih materija za ćeliju. Postupci sadrže prijanjanje na površine, rast u suspenziji, ili njihove kombinacije. Nekoliko uslova kultivacije može se optimizovati postupcima koji su dobro poznati u struci da bi se optimizovali prinosi proizvodnje proteina. Kultivacija se može vršiti na primer u posudama, rotirajućim bocama ili u bioreaktorima, upotrebom batch, fed-batch, kontinualnih sistema, šupljeg vlakna, i slično. Da bi se postigla velika (kontinuirana) proizvodnja rekombinantnih proteina preko ćelijske kulture, poželjno je u struci imati ćelije sposobne da rastu u suspenziji, i poželjno je imati ćelije sposobne da se gaje u odsustvu seruma koji je izveden iz životinje ili čoveka ili komponenti seruma koje su izvedene iz životinje ili čoveka. Prema tome, prečišćavanje je lakše i sigurnost je poboljšana zbog odsustva dodatnih životinjskih ili humanih proteina izvedenih iz medijuma za kulturu, dok je sistem takođe veoma pouzdan jer su sintetički medijumi najbolji u reproducibilnosti.

[0035] Ig-slični molekuli se eksprimiraju u ćelijama domaćina i sakupljaju iz ćelija ili, poželjno, iz medijuma ćelijske kulture postupcima koji su opšte poznati stručnjaku u ovoj oblasti. Nakon sakupljanja, ovi Ig-slični molekuli mogu biti prečišćeni upotrebom postupaka poznatih u struci. Takvi postupci mogu uključivati taloženje, centrifugiranje, filtraciju, ekskluzionu hromatografiju, afinitetnu hromatografiju, katjonsku i/ili anjonsku izmenjivačku hromatografiju i hromatografiju hidrofobnih interakcija. Za smešu antitela koja sadrže molekule IgG, protein A ili protein G afinitetna hromatografija može biti pogodno upotrebljena (videti npr. US patenti 4,801,687 i 5,151,504).

[0036] Ig-slični molekuli, i/ili njihove smeše, proizvedeni postupcima u skladu sa ovim pronalaskom poželjno imaju zajednički laki lanac. Dalje je dat, prema tome, postupak u skladu sa pronalaskom, koji dalje sadrži davanje pomenute ćelije domaćina sa molekulom nukleinske kiseline koja kodira zajednički laki lanac. Ovo je laki lanac koji je sposoban za sparivanje sa najmanje dva različita teška lanca, čime se formiraju funkcionalni domeni za vezivanje antigena. Funkcionalni domen za vezivanje antigena je sposoban za specifično vezivanje za antigen. Poželjno, upotrebljava se zajednički laki lanac koji je sposoban za sparivanje sa svim teškim lancima proizvedenim postupkom u skladu sa pronalaskom, čime se formiraju funkcionalni domeni za vezivanje antigena, tako je izbegnuto pogrešno sparivanje neporedivih teških i lakih lanaca. U jednom aspektu, koriste se samo zajednički laki lanci sa jednom identičnom amino-kiselinskom sekvencom. Alternativno, stručnjaci u ovoj oblasti će prepoznati da se „zajednički“ takođe odnosi na funkcionalne ekvivalente lakog lanca čija amino-kiselinska sekvenca nije identična. Mnoge varijante pomenutog lakog lanca postoje gde su prisutne mutacije (delecije, supstitucije, adicije) koje ne utiču materijalno na formiranje funkcionalnih vezujućih regiona. Takve varijante su tako isto sposobne za vezivanje različitih teških lanaca i formiranje funkcionalnih domena za vezivanje antigena. Termin „zajednički laki lanac“, kako se ovde upotrebljava, odnosi se tako na lake lance koji mogu biti identični ili imati neke razlike u amino-kiselinskoj sekvenci zadržavajući specifičnost vezivanja rezultujućeg antitela nakon sparivanja sa teškim lancem. Na primer, moguće je pripremiti ili pronaći lake lance koji nisu identični, ali su ipak funkcionalno ekvivalentni, npr. uvođenjem i testiranjem promena konzervativne amino-kiseline, i/ili promena amino-kiselina u regionima koji ne doprinose ili samo delimično doprinose specifičnosti vezivanja kada se spare sa teškim lancem. Kombinacija određenog zajedničkog lakog lanca i takvih funkcionalno ekvivalentnih varijanti je obuhvaćena terminom "zajednički laki lanac". Referenca je napravljena na WO 2004/009618 za detaljan opis upotrebe zajedničkih lakih lanaca. Poželjno, u ovom pronalasku se upotrebljava zajednički laki lanac koji je laki lanac sličan germinativnoj liniji, poželjnije laki lanac germinativne linije, poželjno preuređen humani kappa laki lanac germinativne linije, najpoželjnije ili preuređen humani kappa laki lanac germinativne linije IgVκl-39/Jκ ili IGVκ3-20/Jκ.

Alternativno, stručna osoba može izabrati, kao alternativu upotrebi zajedničkog lakog lanca i da bi se izbeglo pogrešno sparivanje neporedivih teških i lakih lanaca, sredstva za prisilno sparivanje teškog i lakog lanca, kao što je na primer opisano u WO2009/080251, WO2009/080252 i/ili WO2009/080253.

[0037] Ovaj pronalazak obezbeđuje nove projektovane CH3 domene kao i nove kombinacije CH3 mutacija. Pre ovog pronalaska, naelektrisane kontaktne amino-kiseline CH3 domena za koje se zna da su uključene u CH3-CH3 sparivanje su supstituisane amino-kiselinama suprotnog naelektrisanja (preokretanje naelektrisanja), utičući na CH3-CH3 sparivanje. Mutacije u skladu sa ovim pronalaskom su inventivna alternativa ovom pristupu, jer su sada CH3 amino-kiseline koje nisu naelektrisane ili su neutralne u divljem tipu CH3 supstituisane naelektrisanim ostacima. Ovaj pronalazak u ovom primeru izvođenja ne zamenjuje naelektrisane kontaktne amino-kiseline amino-kiselinama suprotnog naelektrisanja već supstituiše nenaelektrisane amino-kiseline CH3 za naelektrisane. Pristup predmetnog pronalaska daje ne samo postupak za efikasno upravljanje dimerizacijom CH3 domena, već takođe ima prednost da je stvorena najmanje jedna dodatna interakcija naelektrisanjenaelektrisanje u CH3 interfejsu. Imajući u vidu ovu dodatnu interakciju naelektrisanjenaelektrisanje pored postojećih naelektrisanih parova u CH3-CH3 interfejsu, dimeri u skladu sa pronalaskom su generalno stabilniji u poređenju sa dimerima divljeg tipa (dimer divljeg tipa je definisan kao bispecifični IgG (AB) bez CH3 projektovanja nasuprot svojim roditeljskim homodimerima (AA ili BB)). Štaviše, iznenađujuće je postalo moguće još više povećati proporciju jednog ili više Ig-sličnih molekula od interesa u smeši. Kao što je ovde ranije opisano, postupci poznati u struci za preferencijalnu proizvodnju bispecifičnog antitela tipično uključuju proizvodnju nekog nepoželjnog dimernog sporednog proizvoda. Na primer, proporcija bispecifičnog antitela od interesa koristeći tehnologiju „izbočina-u-udubljenje“ je u najboljem slučaju 87%, dok pristup elektrostatičkog projektovanja pri čemu su naelektrisane kontaktne amino-kiseline supstituisane amino-kiselinama suprotnog naelektrisanja, takođe rezultuje u proporcijama do 96% (videti na primer Primer 11). Prilično iznenađujuće, sadašnji pronalazači su uspeli da uvedu mutacije koje dalje povećavaju proporciju Ig-sličnog molekula od interesa u smeši. Na primer, Primer 17 opisuje postupak koji upotrebljava mutacije u skladu sa ovim pronalaskom, pri čemu je proporcija bispecifičnog antitela od interesa povećana do te mere da se dimerni sporedni proizvod uopšte nije moguće detektovati u dobijenoj smeši. Nespareni polu-molekuli koji se sastoje od samo jednog teškog lanca sparenog sa zajedničkim lakim lanacem bili su prisutni u određenoj meri u smešama, ali su oni rezultat neuravnotežene ekspresije teških lanaca i mogu se lako izdvojiti iz smeše ekskluzionom hromatografijom. Stoga, sa takvim mutacijama u skladu sa ovim pronalaskom, bispecifični Ig-sličan molekul može biti proizveden u jednoj ćeliji sa visokom proporcijom suštinski bez prisutnih kontaminirajućih dimernih sporednih proizvoda, što je posebno pogodno za proizvodnju farmaceutske kompozicije.

[0038] Prijavljeno je da su amino-kiseline na položaju 366 jednog CH3 domena i na položaju 351 drugog CH3 domena par kontaktnih ostataka u CH3-CH3 interfejsu, što znači da se nalaze dovoljno blizu jedna drugoj u trodimenzionalnoj konformaciji rezultujućeg Ig-sličnog molekula da bi bile sposobne za interakciju jedna sa drugom. Dakle, prvi CH3 domen će se prvenstveno spariti sa drugim CH3 domenom. U postupku prema pronalasku, treonin (T) na položaju 366 prvog CH3 domena je zamenjen lizinom (K) i leucin (L) na položaju 351 drugog CH3 domena je zamenjen asparaginskom kiselinom (D).

Ako prvi polipeptid koji sadrži CH3 domen, koji nosi lizin (K) na položaju 366, dalje sadrži varijabilni domen koji ima specifičnost za antigen A, i ako drugi polipeptid koji sadrži CH3 domen, koji nosi asparaginsku kiselinu (D) na položaju 351, dalje sadrži varijabilni domen koji ima specifičnost za antigen B, bispecifični Ig-slični molekuli sa AB specifičnošću biće pretežno formirani. Prema tome, obezbeđen je postupak prema predmetnom pronalasku, pri čemu navedena sredstva za preferencijalno sparivanje navedenog prvog i drugog polipeptida koji sadrže CH3 domen ili navedena sredstva za preferencijalno sparivanje navedenog trećeg i četvrtog polipeptida koji sadrže CH3 domen su supstitucija treonina na položaju 366 navedenog prvog ili trećeg CH3 domena lizinom (K) i supstitucija leucina na položaju 351 navedenog drugog ili četvrtog CH3 domena asparaginskom kiselinom (D).

[0039] Jedna poželjna kombinacija mutacija u skladu sa ovim pronalaskom je supstitucija treonina (T) lizinom (K) na položaju 366 prvog polipeptida koji sadrži CH3 domen, koji dalje sadrži varijabilni domen (na primer sa specifičnošću A) i supstitucija leucina (L) asparaginskom kiselinom (D) na položaju 351 drugog polipeptida koji sadrži CH3 domen koji dalje sadrži varijabilni domen (na primer sa specifičnošću B). Ovo je označeno kao T366K/L351'D par mutacije. Kao što je ranije objašnjeno, prijavljeno je da su amino-kiseline na položaju 366 jednog CH3 domena i na položaju 351 drugog CH3 domena par kontaktnih ostataka u CH3-CH3 interfejsu. Lizin koji je uveden na položaj 366 i asparaginska kiselina uvedena na položaj 351 imaju suprotna naelektrisanja, tako da će ove amino-kiseline elektrostatički privući jedna drugu. Dakle, prvi CH3 domen će prvenstveno privući drugi CH3 domen i Ig-slični molekuli koje sadrže prvi CH3 domen koji sadrži lizin na položaju 366 sparen sa drugim CH3 domenom koji sadrži asparaginsku kiselinu na položaju 351 će biti pretežno formirani. Ako prvi polipeptid koji sadrži CH3 domen ima specifičnost za antigen A, i ako drugi polipeptid koji sadrži CH3 domen ima specifičnost za antigen B, bispecifični Igslični molekuli sa „AB“ specifičnošću biće pretežno formirani. Imajte na umu da, u nekim primerima izvođenja specifičnost varijabilnih domena oba pomenuta prvog i drugog polipeptidnog lanca koji sadrže CH3 domen može biti ista, što će rezultovati formiranjem monospecifičnih Ig-sličnih molekula (na primer sa „AA“ specifičnošću). Kao što je pomenuto gore, jedna od prednosti mutacija u skladu sa ovim pronalaskom je činjenica da je nova stvorena interakcija između novouvedenog para naelektrisanih amino-kiselina, umesto da zamene interakcije postojećih naelektrisanih amino-kiselina. Ovo nije ranije objavljeno niti predloženo. Jedan aspekt pronalaska stoga daje postupak prema predmetnom pronalasku za proizvodnju najmanje dva različita antitela iz jedne ćelije domaćina, pri čemu navedeni prvi polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen sadrži lizin (K) ostatak na aminokiselinskom položaju 366 prema EU sistemu numeracije i navedeni drugi polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen sadrži ostatak asparaginske kiseline (D) na aminokiselinskom položaju 351 prema EU sistemu numeracije.

[0040] Upotrebom gore pomenutih amino-kiselinskih supstitucija u skladu sa ovim pronalaskom, postalo je moguće da se proizvede heterodimerni Ig-sličan molekul iz jedne ćelije, pri čemu je prisustvo kontaminirajućih homodimera manje od 5%, poželjno manje od 2%, poželjnije manje od 1%, ili, najpoželjnije, pri čemu su kontaminirajući homodimeri suštinski odsutni.

Poželjno, obezbeđen je postupak prema predmetnom pronalasku za proizvodnju najmanje dva različita antitela u kome navedeni prvi polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen dalje sadrži lizin (K) ostatak na aminokiselinskom položaju 351 prema EU sistemu numeracije. Dalje je poželjno da navedeni drugi polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen dalje sadrži ostatak glutaminske kiseline (E) ili ostatak asparaginske kiseline (D) na aminokiselinskom položaju 349 prema EU sistemu numeracije i/ili ostatak glutaminske kiseline (E) na aminokiselinskom položaju 368 prema EU sistemu numeracije. Najpoželjnije navedeni drugi polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen dalje sadrži ostatak glutaminske kiseline (E) na aminokiselinskom položaju 368 prema EU sistemu numeracije.

[0041] Tako, u poželjnom primeru izvođenja, gore pomenute T366K/L351'D mutacije u skladu sa ovim pronalaskom se dalje kombinuju sa supstitucijom leucina (L) glutaminskom kiselinom (E) na položaju 368 drugog CH3 domena. Ovo je, na primer, označeno kao T366K/L351'D,L368'E mutacija (ali alternativni načini označavanja su takođe mogući, kao što su T336K/L351D-L368E ili T366K/L351D,L368E ili T366K - L351D,L368E). Kao što je prikazano u Primeru 17, uvođenje ove mutacije u skladu sa pronalaskom u prvi polipeptid koji sadrži CH3 domen u sa specifičnošću za antigen A, i drugi polipeptid koji sadrži CH3 domen sa specifičnošću za antigen B rezultuje posebno dobrom proporcijom bispecifičnih Igsličnih molekula sa dvojnom AB specifičnošću. Sa ovim mutacionim parom čak je postalo moguće da se dobije bispecifično antitelo bez formiranja bilo koje detektabilne količine homodimera.

[0042] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, treonin (T) je supstituisan lizinom (K) na položaju 366 prvog CH3 domena i leucin (L) je supstituisan asparaginskom kiselinom (D) na položaju 351 drugog CH3 domena i tirozin (Y) je supstituisan glutaminskom kiselinom (E) na položaju 349 pomenutog drugog CH3 domena. Ovo je na primer označeno kao T366K/L351'D,Y349'E mutacija ali drugi načini označavanja ovih mutacija mogu uključivati na primer T366K - L351D:Y349E, ili T366K/L351D,Y349E ili jednostavno T366K/L351DY349E. Ostatak Y349 je susedni ostatak ostatku na položaju 351 koji može doprineti interakciji dimera. U skladu sa in silico podacima, Y349E doprinosi stabilnosti heterodimera (niži in silico rezultati) kao i destabilizaciji monodimera (viši in silico rezultati) i glutaminska kiselina (E) na položaju 349 je povoljnija od asparaginske kiseline (D). Prema tome, uvođenje druge amino-kiselinske supstitucije u drugi polipeptid koji sadrži CH3 domen, koji već sadrži amino-kiselinsku supstituciju na položaju 351, dalje favorizuje heterodimerizaciju.

[0043] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, treonin (T) je supstituisan lizinom (K) na položaju 366 prvog CH3 domena i leucin (L) je supstituisan asparaginskom kiselinom (D) na položaju 351 drugog CH3 domena i tirozin (Y) je supstituisan glutaminskom kiselinom (E) na položaju 349 pomenutog drugog CH3 domena i leucin (L) je supstituisan glutaminskom kiselinom (E) na položaju 368 pomenutog drugog CH3 domena. Ovo je označeno kao mutacija T366K/L351'D,Y349'E,L368'E. Dva ostatka Y349 i L368 su ostaci koji mogu doprineti interakcijama dimera. U skladu sa in silico podacima, Y349E i L368E doprinose stabilnosti heterodimera (niži in silico rezultati), kao i destabilizaciji BB dimera (viši in silico rezultati) i glutaminske kiseline (E) na položajima 349 i 368 su povoljnije od asparaginske kiseline (D). Tako, uvođenje druge i treće amino-kiselinske supstitucije u B-lanac, koji već sadrži amino-kiselinsku supstituciju na položaju 351, dalje favorizuje heterodimerizaciju.

[0044] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, treonin (T) je supstituisan lizinom (K) na položaju 366 prvog CH3 domena i leucin (L) je supstituisan lizinom (K) na položaju 351 pomenutog prvog CH3 domena i leucin (L) je supstituisan asparaginskom kiselinom (D) na položaju 351 drugog CH3 domena i leucin (L) je supstituisan glutaminskom kiselinom (E) na položaju 368 pomenutog drugog CH3 domena. Ovo se označava kao T366K, L351K/L351'D,L368'E mutacija. Ova mutacija takođe povećava proporciju (bispecifičnog) antitela od interesa, kao što je prikazano u Primerima. Takođe sa ovom mutacijom postalo je moguće dobiti bispecifično antitelo bez bilo koje detektabilne količine formiranih homodimera.

[0045] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, treonin (T) je supstituisan lizinom (K) na položaju 366 prvog CH3 domena i leucin (L) je supstituisan lizinom (K) na položaju 351 pomenutog prvog CH3 domena i leucin (L) je supstituisan asparaginskom kiselinom (D) na položaju 351 drugog CH3 domena i tirozin (Y) supstituisan asparaginskom kiselinom (D) na položaju 349 pomenutog drugog CH3 domena i arginin (R) je supstituisan asparaginskom kiselinom (D) na položaju 355 pomenutog drugog CH3 domena. Ovo je označeno kao T366K,L351K/L351'D,Y349'D,R355'D mutacija. Par T366K-L351K/L351'D-Y349'D može se dodatno poboljšati mutacijom R355'D u B-lancu, što rezultuje višim BB in silico rezultatom, ali i AB in silico rezultat je nešto viši.

[0046] Tabela B daje pregled mutacija koje se mogu uvesti u CH3 domene kao poželjno sredstvo za preferencijalno sparivanje kako bi se stvorili ili heterodimeri ili homodimeri.

Tabela B:

[0047] Postupak prema predmetnom pronalasku za proizvodnju najmanje dva različita antitela, pri čemu navedena sredstva za preferencijalno sparivanje navedenog prvog i drugog polipeptida koji sadrže CH3 domen i/ili navedena sredstva za preferencijalno sparivanje navedenog trećeg i četvrtog polipeptida koji sadrže CH3 domen sadrže najmanje jednu kombinaciju mutacija kao što je prikazano u Tabeli B je prema tome takođe ovde objavljen. Poželjno, navedena sredstva za preferencijalno sparivanje navedenog prvog i drugog polipeptida koji sadrže CH3 domen i navedena sredstva za preferencijalno sparivanje navedenog trećeg i četvrtog polipeptida koji sadrže CH3 domen sadrže najmanje dve kombinacije mutacija kao što su prikazane u Tabeli B.

[0048] Predmetni pronalazak takođe otkriva nove kombinacije CH3 mutacija sa kojima je postalo moguće proizvoditi smešu najmanje dva monospecifična molekula slična Ig u jednoj ćeliji, pri čemu su kontaminirajući bispecifični molekuli slični Ig manje od 5%, poželjno manje od 2%, čak poželjnije manje od 1%, i najpoželjnije čak suštinski odsutni. Ove mutacije prema pronalasku su, prema tome, naročito pogodne za proizvodnju smeše monospecifičnih antitela, što je na primer korisno kada je željen visok nivo unakrsnog vezivanja dva identična ciljna molekula, kada bi gustina antitela na ciljnim ćelijama trebalo da bude dovoljno visoka za regrutaciju određenih efektornih funkcija kao što je liza tumorske ćelije posredovana preko komplementa, ili kada su dva ciljna mesta locirana predaleko tako da se ne mogu vezati pomoću jednog bispecifičnog antitela, ili u cilju pojednostavljenja postupaka regulatorne dozvole. U takvim slučajevima, često je žečljena optimizacija proizvodne platforme za takva monospecifična antitela. Kao što je prikazano u Primeru 10, predmetni pronalazak daje razumevanje da kada je lizin (K) na položaju 392 prvog polipeptida koji sadrži CH3 domen (na primer koji ima specifičnost za A) supstituisan asparaginskom kiselinom (D) i kada je asparaginska kiselina (D) na položaju 399 navedenog prvog polipeptida koji sadrži CH3 domen je supstituisana lizinom (K) i kada je lizin (K) na položaju 409 navedenog prvog polipeptida koji sadrži CH3 domen supstituisan asparaginskom kiselinom (D), postalo je moguće proizvoditi smešu najmanje dva različita monospecifična molekula slična Ig u jednoj ćeliji, uključujući monospecifične molekule slične Ig sa specifičnošću za AA, pri čemu je formiranje bispecifičnih sporednih proizvoda (bispecifični molekula sličnih Ig) smanjeno do ispod 5%, ili čak do ispod 3%, ili čak suštinski uopšte se ne može detektovati. Stoga, gore navedena kombinacija mutacija (označene ovde kao K392D, D399K, K409D) je naročito poželjna za proizvodnju smeše monospecifičnih molekula sličnih Ig. Stručnjak iz date oblasti tehnike će razumeti da njegove funkcionalne varijante, tj., K392E, D399R, K409E, mogu da rezultiraju u sličnim efektima. Dodatno, dvostruki mutanti koji sadrže D399K i K409D supstitucije, ili druge funkcionalne varijante kao što su npr. K392D i K409D, D399R i K409E i tako dalje, mogu takođe da rezultuju u sličnim efektima. Isto važi za kombinaciju mutacija gde je glutaminska kiselina (E) na položaju 356 prvog polipeptida koji sadrži CH3 domen supstituisana lizinom (K) i pri čemu je glutaminska kiselina (E) na položaju 357 navedenog prvog polipeptida koji sadrži CH3 domen supstituisana lizinom (K) i pri čemu je lizin (K) na položaju 439 navedenog prvog polipeptida koji sadrži CH3 domen supstituisan asparaginskom kiselinom (D) i pri čemu je lizin (K) na položaju 370 navedenog prvog polipeptida koji sadrži CH3 domen supstituisan asparaginskom kiselinom (D). Ova kombinacija mutacija (označene ovde kao E356K, E357K, K439D, K370D) je takođe naročito poželjna za proizvodnju smeše monospecifičnih molekula sličnih Ig. Stručnjak iz date oblasti tehnike će razumeti da njihove funkcionalne varijante, tj., E356R, E357R, K439E, K370E, mogu da rezultuju u sličnim efektima. Pored toga, trostruki ili dvostruki mutanti koji sadrže E356K i K439D, i E357K i K370D supstitucije, ili druge funkcionalne varijante takođe mogu da rezultuju u sličnim efektima. Pored toga otkriven je prema tome postupak za proizvodnju najmanje dva različita monospecifična molekula slična Ig iz jedne ćelije domaćina, pri čemu svaki od navedena dva molekula slična Ig sadrži dva CH3 domena koja su sposobna da formiraju interfejs, pri čemu navedeni postupak sadrži obezbeđivanje u navedenoj ćeliji

a) prvog molekula nukleinske kiseline koji kodira prvi polipeptid koji sadrži CH3 domen koji ima specifičnost za A,

b) drugog molekula nukleinske kiseline koji kodira drugi polipeptid koji sadrži CH3 domen koji ima specifičnost za B,

pri čemu navedeni prvi polipeptid koji sadrži CH3 domen sadrži K392D, D399K, K409D mutaciju i navedeni drugi polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen sadrži CH3 domen divljeg tipa ili sadrži E356K, E357K, K439D, K370D mutaciju, pri čemu navedeni postupak dalje sadrži korak kultivacije navedene ćelije domaćina i omogućavanje ekspresije navedenih molekula nukleinske kiseline i sakupljanje iz kulture navedena najmanje dva različita molekula slična Ig. Alternativan aspekt otkriva postupak za proizvodnju najmanje dva različita monospecifična molekula slična Ig iz jedne ćelije domaćina, pri čemu svaki od navedena dva molekula slična Ig sadrži dva CH3 domena koji su sposobni da formiraju interfejs, pri čemu navedeni postupak sadrži obezbeđivanje u navedenoj ćeliji

a) prvog molekula nukleinske kiseline koji kodira prvi polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen koji ima specifičnost za A,

b) drugog molekula nukleinske kiseline koji kodira drugi polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen koji ima specifičnost za B,

pri čemu navedeni prvi polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen sadrži CH3 domen divljeg tipa ili sadrži K392D, D399K, K409D mutaciju i navedeni drugi polipeptidni lanac sadrži CH3 domen koji sadrži E356K, E357K, K439D, K370D mutaciju, pri čemu navedeni postupak dalje sadrži korak kultivacije navedene ćelije domaćina i omogućavanje ekspresije navedenih molekula nukleinske kiseline i sakupljanje navedena najmanje dva različita molekula slična Ig iz kulture.

[0049] Kao što je prikazano u Primeru 10, dva monospecifična molekula slična Ig mogu biti proizvedena u jednoj ćeliji, pri čemu je formiranje bispecifičnih molekula sličnih Ig suštinski nedetektabilno. Stručnjak iz date oblasti tehnike može da izabere treći molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptidni lanac koji sadrži divlji tip ili konstruisani CH3 domen da bi se obezbedilo navedenoj ćeliji domaćinu tako da se proizvodi smeša 3 monospecifična antitela, i tako dalje.

[0050] U jednom aspektu ovog pronalaska, dat je postupak u skladu sa pronalaskom za proizvodnju najmanje dva različita antitela, pri čemu svaki od polipeptidnih lanaca koji sadrže CH3-domen dalje sadrže varijabilni region koji prepoznaje različiti ciljni epitop, pri čemu se ciljni epitopi nalaze na istom molekulu. Ovo često omogućava efikasnije odupiranje (biološkoj) funkciji pomenutog ciljnog molekula u poređenju sa situacijom gde je ciljan samo jedan epitop. Na primer, heterodimerni Ig-sličan molekul može istovremeno da se veže za 2 prisutna epitopa, npr., receptore faktora rasta ili rastvorljive molekulima koji su kritični za proliferaciju tumorskih ćelija, čime se efikasno blokira nekoliko nezavisnih signalnih puteva koji vode do nekontrolisane proliferacije, i bilo koja kombinacija najmanje dva Ig-slična molekula može se istovremeno vezati za 2, ili čak 3 ili 4 epitopa prisutna na takvim receptorima faktora rasta ili rastvorljivim molekulima.

U poželjnom primeru izvođenja, ciljni molekul je rastvorljivi molekul. U drugom poželjnom primeru izvođenja, ciljni molekul je molekul vezan za membranu.

[0051] U drugom aspektu pronalaska, dat je postupak u skladu sa pronalaskom za proizvodnju najmanje dva različita antitela, pri čemu svaki od polipeptidnih lanaca koji sadrže CH3-domen dalje sadrži varijabilni region koji prepoznaje ciljni epitop, pri čemu se ciljni epitopi nalaze na različitim molekulima. U ovom slučaju, svaki od različitih ciljnih molekula može biti ili rastvorljivi molekul ili molekul vezan za membranu. U jednom primeru izvođenja, različiti ciljni molekuli su rastvorljivi molekuli. Alternativno, jedan ciljni molekul je rastvorljiv molekul dok je drugi ciljni molekul molekul vezan za membranu. U još jednoj alternativi, oba ciljna molekula su molekuli vezani za membranu. U jednom primeru izvođenja različiti ciljni molekuli su eksprimirani na istim ćelijama, dok se u drugim primerima izvođenja različiti ciljni molekuli eksprimiraju na različitim ćelijama. Kao neograničavajući primer, bilo koji heterodimerni Ig-sličan molekul ili bilo koja kombinacija od najmanje dva Ig-slična molekula mogu biti pogodni za istovremeno blokiranje više receptora vezanih za membranu, neutralisanje više rastvorljivih molekula kao što su citokini ili faktori rasta za tumorske ćelije ili za neutralisanje različitih virusnih serotipova ili virusnih sojeva.

[0052] Jedan poželjni primer izvođenja daje postupak u skladu sa pronalaskom za proizvodnju najmanje dva različita antitela, pri čemu se najmanje jedan od pomenutih ciljnih epitopa nalazi na tumorskoj ćeliji. Alternativno, ili dodatno, najmanje jedan od pomenutih ciljnih epitopa se nalazi na površini efektorske ćelije. Ovo je na primer prikladno za regrutovanje T ćelija ili NK ćelija za ubijanje tumorske ćelije. Na primer, najmanje jedan Igsličan molekul je proizvoden postupkom u skladu sa pronalaskom koji je sposoban da regrutuje imunske efektorske ćelije, poželjno humane imunske efektorske ćelije, specifično se vezujući za ciljni molekul koji se nalazi na imunskim efektorskim ćelijama. U daljem primeru izvođenja, pomenuta imunska efektorska ćelija se aktivira nakon vezivanja Ig-sličnog molekula za ciljni molekul. Regrutovanje efektorskih mehanizama može na primer obuhvatiti preusmeravanje imunski modulirane citotoksičnosti primenom Ig-sličnog molekula proizvedenog postupkom u skladu sa pronalaskom koji je sposoban da se veže za citotoksični okidački molekul kao što je T ćelijski receptor ili Fc gama receptor, čime se aktiviraju nishodni imunski efektorski putevi. Termin „imunska efektorska ćelija“ ili „efektorska ćelija“, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na ćeliju unutar prirodnog repertoara ćelija imunskog sistem sisara koja se može aktivirati da bi uticala na održivost ciljne ćelije. Imunske efektorske ćelije uključuju ćelije limfoidne linije kao što su ćelije prirodne ubice (natural killer (NK)), T ćelije uključujući citotoksične T ćelije, ili B ćelije, ali i ćelije mijeloidne linije se mogu smatrati imunskim efektorskim ćelijama, kao što su monociti ili makrofagi, dendritske ćelije i neutrofilni granulociti. Prema tome, pomenuta efektorska ćelija je poželjno NK ćelija, T ćelija, B ćelija, monocit, makrofag, dendritska ćelija ili neutrofilni granulocit. Ciljni antigeni prisutni na imunskim efektorskim ćelijama mogu da uključuju CD3, CD16, CD25, CD28, CD64, CD89, NKG2D i NKp46. Stoga je dalje dat postupak u skladu sa pronalaskom za proizvodnju najmanje dva različita antitela, pri čemu se pomenuti ciljni epitop nalazi na CD3, CD16, CD25, CD28, CD64, CD89, NKG2D ili NKp46 molekulu.

Održivost ciljne ćelije može uključivati preživljavanje ćelije, proliferaciju i/ili sposobnost da interaguje sa drugim ćelijama.

[0053] U poželjnom primeru izvođenja, obezbeđen je postupak prema ponalasku za proizvodnju najmanje dva različita antitela, pri čemu, navedena najmanje dva različita antitela su antitela IgG1 izotipa, kao što su opisani u prethodnom tekstu.

[0054] Dalje je obezbeđena smeša najmanje dva antitela, koja se može dobiti pomoću postupka prema predmetnom pronalasku. Navedena smeša antitela poželjno sadrži najmanje jednu CH3 mutaciju kao što je prikazana u Tabeli B. Takođe je obezbeđena farmaceutska kompozicija koja sadrži smešu najmanje dva antitela prema predmetnom pronalasku. U jednom primeru izvođenja navedeno antitelo je bispecifično antitelo. U sledećem primeru izvođenja navedeno antitelo je monospecifično antitelo. Jedan poželjan primer izvođenja daje smešu najmanje dva različita antitela koja se mogu dobiti pomoću postupka prema pronalasku, pri čemu navedena najmanje dva različita antitela se vezuju za različite epitope na istom antigenu i/ili za različite epitope na različitim antigenima. Prednosti i poželjne upotrebe takvih smeša i antitela su ovde opisani u prethodnom tekstu. Pronalazak takođe obezbeđuje smešu najmanje dva različita antitela koja se mogu dobiti pomoću postupka prema pronalasku, pri čemu navedena najmanje dva različita antitela sadrže najmanje jedno heterodimerno antitelo. U jednom primeru izvođenja, dva od navedena najmanje dva različita antitela su heterodimerna antitela. Još jedan poželjan primer izvođenja daje smeše koje sadrže heterodimerno antitelo koje sadrži dva CH3 domena humanog IgG, pri čemu jedan od pomenuta dva CH3 domena sadrži amino-kiselinske supstitucije L351D i L368E i pri čemu drugi od pomenuta dva CH3 domena sadrži amino-kiselinske supstitucije T366K i L351K.

Ove amino-kiselinske supstitucije su poželjna sredstva za preferencijalno sparivanje pomenuta dva CH3 domena, kao što je prethodno objašnjeno. Amino-kiselinske supstitucije L351D i L368E u jednom od pomenuta dva CH3 domena i amino-kiselinske supstitucije T366K i L351K u drugom od pomenuta dva CH3 domena zajedno se nazivaju „DEKK kombinacija mutacija“, „DEKK varijanta“, „DEKK par“, „DEKK projektovani CH3 domeni“, „DEKK“ ili se upotrebljavaju alternativna imena koja se odnose na DEKK. CH3 domen koji nosi amino-kiselinske supstitucije L351D i L368E su takođe je nazvan „DE-strana“ i CH3 domen koji nosi amino-kiselinske supstitucije T366K i L351K je takođe nazvan „KK-strana“.

[0055] Takođe je data farmaceutska kompozicija koja sadrži smešu najmanje dva antitela koja se mogu dobiti bilo kojim postupkom u skladu sa pronalaskom. Pomenuta farmaceutska kompozicija može sadržati smešu koja sadrži monospecifična ili bispecifična antitela. Pored toga, farmaceutska kompozicija u skladu sa pronalaskom sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač. Kako se ovde upotrebljava, takav „farmaceutski prihvatljiv nosač“ uključuje bilo koji i sve rastvarače, soli, disperzione medijume, premaze, antibakterijske i antifungalne agense, izotonična i sredstva za odlaganje apsorpcije, i slična koja su fiziološki kompatibilna. U zavisnosti od puta primene (npr., intravenozno, subkutano, intra-artikularno i slično) antitela mogu biti obložena materijalom da bi se antitela zaštitila od dejstva kiselina i drugih prirodnih uslova koji mogu inaktivirati antitela. U jednom aspektu, data je farmaceutska kompozicija koja sadrži smešu najmanje dva antitela koja se mogu dobiti bilo kojim postupkom u skladu sa pronalaskom, pri čemu su navedena najmanje dva razliučita antitela proizvedena od strane rekombinantnih ćelija domaćina u skladu sa ovim pronalaskom.

[0056] Molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen i koji sadrži najmanje jednu mutaciju kao što je prikazano u Tabeli B takođe je opisan ovde, kao i rekombinantna ćelija domaćina koja sadrži najmanje jedan molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen i koji sadrži bar jednu mutaciju kao što je prikazano u Tabeli B.

[0057] Pronalazak je dalje ilustrovan sledećim primerima. Ovi primeri ne ograničavaju pronalazak na bilo koji način, već samo služe da pojasne pronalazak.

Kratak opis crteža

[0058]

Slika 1: A) šematski prikaz konstrukt vektora MV1057. Region za punjenje - stafer (stuffer region) je region u koji je VH region antitela kloniran. B) šematski prikaz fagnog pokaznog vektora (phage display vector) MV1043.

Slika 2: amino-kiselinska sekvenca Fc divljeg tipa IgG1, kao što je prisutna u konstrukt vektoru MV1057 (primenjena je šema EU numeracije).

Slika 3: nukleotidne i amino-kiselinske sekvence VH regiona koje su upotrebljene za kloniranje u različite konstrukte.

Slika 4: podaci masene spektrometrije transfekcija A, G i H.

Slika 5: podaci masene spektrometrije transfekcija M i U.

Slika 6: podaci masene spektrometrije transfekcije O.

Slika 7: prevencija homodimerizacije supstitucijom neutralnih amino-kiselina za aelektrisane amino-kiseline.

Slika 8: Nativni MS spektar uzorka transfekcije ZO (T366K/L351'D) (A) i komplikovan MS spektar uzorka transfekcije ZO (T366K/L351'D). Drugi/glavni pik predstavlja bispecifični molekul (B).

Slika 9: HADDOCK rezultati na eksperimentalno verifikovanim parovima mutacija

Slika 10: Crteži interakcija u CH3-CH3 interfejsu; A) K409D:K392D/D399'K:E356'K, B) D399K:E356K/D399'K:E356'K, C) K409D:K392D/K409'D:K392'D

Slika 11: HADDOCK rezultati za različite 366/351' naelektrisane mutante

Slika 12: Crteži interakcija u CH3-CH3 interfejsu; A) L351D/L351'D, B) L351D:S354A:R355D/L351'D:S354'A:R355'D

Slika 13: HADDOCK rezultati za dodatne mutacije naelektrisanja oko položaja L351

Slika 14: HADDOCK rezultati za dodatne mutacije naelektrisanja oko položaja T366 u lancu A i položaja L351 u lancu B.

Slika 15: Crteži interakcija u CH3-CH3 interfejsu

Slika 16: HADDOCK rezultati za varijante oko T366/L351

Slika 17: HADDOCK rezultati za dodatne varijante oko T366/L351

Slika 18: Primeri nMS spektara za bispecifični IgG dobijeni nakon ko-ekspresije konstrukta T366K,L351K sa bilo konstruktom L351D (levi panel) ili L351D,Y349E (desni panel), zumiran na stanju jednog naelektrisanja punog IgG-a (polu tela nisu prikazana)

Slika 19: A) Rezultati nativne MS pokazuju relativnu zastupljenost AA, AB, BB, A i B (ukupno svih vrsta je 100%); B) isto ali sada bez AB da se imao bolji pregled nepoželjnih vrsta AA, BB, A i B

Slika 20: Rezultati testa termostabilnosti. Kvadrati: divlji tip; trouglovi: par preokrenutog naelektrisanja E356K:D399K/K392D:K409D; krugovi: mutantne CH3 kombinacije kao što je naznačeno iznad svakog grafikona.

Slika 21: Rezultati eksperimenta 10x zamrzavanja i odmrzavanja. 1122=prvo roditeljsko antitelo BB; 1337=drugo roditeljsko antitelo AA; divlji tip=AA, AB, BB; CR=bispecifični par preokrenutog naelektrisanja E356K:D399K/K392D:K409D; 3-6 i 9-12=bispecifični molekuli iz kombinacija 3-6 i 9-12 iz Tabele 15.

Slika 22: Rezultati stabilnosti seruma, mereni ELISA-om upotrebom fibrinogena kao oblažućeg antigena. A) ELISA podaci sa IgG uzorcima razblaženi do 0,5 μg/ml; B) ELISA podaci sa IgG uzorcima razblaženim do 0,05 μg/ml;. Rezultati su normalizovani do vremenske tačke T=0 dana (100%). 1337=drugo roditeljsko antitelo AA; divlji tip=AA, AB, BB; CR=bispecifični par preokrenutog naelektrisanja E356K:D399K/K392D:K409D; 3-6 i 9-12=bispecifični molekuli iz kombinacija 3-6 i 9-12 iz Tabele 15.

Slika 23: nMS rezultati eksperimenata odnosa sa odnosima transfekcije od 1:5 do 5:1. A) DEKK kombinacija mutacija, sa specifičnošću „A“ na DE-strani i „B“ na KK-strani; B) DEKK kombinacija mutacija, sa specifičnošću „C“ na DE-strani i „B“ na KK-strani; C) kombinacija mutacija preokrenutog naelektrisanja, sa specifičnošću „A“ na E356K:D399K-strani i „B“ na K392D:K409D-strani

Slika 24: nMS rezultati transfekcija # 1-11 iz Tabele 20.

Slika 25: HADDOCK rezultati za dimere sa različitim CH3 projektovanim vektorima. Sivi stupci: Poželjne vrste AB i CD; crni stupci: nepoželjne vrste AA, BB, CC, DD, AC, BC, AD, BD.

Slika 26: SDS-PAGE transfekcija # 1-11 iz Tabele 20. Kontrolni uzorci DE/KK, DE/DE i KK/KK su takođe uključeni.

Slika 27: nMS transfekcija # 9 (A) i # 11 (B).

Slika 28: nMS gel filtriranih uzoraka 1516:1516 (A), 1337:1337 (B) i 1516:1337 (C). Slika 29: nivoi seruma uzoraka DEKK projektovanog antitela i njegova dva roditeljska antitela (pK studija).

Primeri

Primer 1: amino-kiselinske supstitucije da bi se stvorili različiti CH3-domeni

[0059] Da bi imali širok spektar Ig-sličnih molekula koji se razlikuju u svojim CH3 domenima tako da je sparivanje Ig-sličnih molekulima koji sadrže CH3-domen prvenstveno promovisano ili inhibirano, više amino-kiselinskih supstitucija za koje je poznato je promovišu formiranje heterodimera, kao i brojne alternativne amino-kiselinske supstitucije koje nisu prethodno prijavljene niti testirane, ali koje su izabrane da promovišu formiranje homodimera, uvedene su u konstrukt vektor (konstrukt vektor MV1057; slika 1A). Konstrukt vektor MV1057 sadrži sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju Fc deo normalnog IgG1divljeg tipa, kao što je prikazano na slici 2. Tabela 1 navodi amino-kiselinske supstitucije koje su uvedene u ovaj Fc divljeg tipa, što rezultuje nizom od sedam konstrukata. Svi konstrukti su napravljeni u Geneart-u. Konstrukti 1, 2 i 3, ili njihove alternative, prethodno je opisano da pokreću heterodimerizaciju (EP01870459, WO2009/089004) kao i konstrukti 6 i 7 (WO98/50431). Konstrukti 4 i 5 su novi i dizajnirani su da promovišu homodimerizaciju.

Tabela 1

Primer 2: kloniranje VH u konstrukte sa CH3 mutacijama

[0060] Nekoliko VH regiona antitela sa poznatim specifičnostima i poznatom sposobnošću sparivanja sa humanim IGKV1-39 lakim lancem su upotrebljeni za kloniranje u ove konstrukte. Kao što je ranije navedeno, sve CH3 varijante se mogu upotrebiti u kombinaciji povezane sa drugim domenima antitela da bi se dobila antitela pune dužine koja su ili bispecifična ili monospecifična. Specifičnost antitela kao što je definisano kombinacijama VH/VL neće uticati na ponašanje dimerizacije teškog lanca koje se pokreće CH3 domenima. Kombinacije VH/VL modela su upotrebljene tokom eksperimenata, pri čemu su svi VL bazirani na IGKV1-39 humane germinativne linije i VH-ovi variraju. Slika 3 daje potpune sekvence i specifičnosti VH regiona antitela koje su upotrebljene tokom eksperimenata. MF kodiranje se odnosi na unutrašnju Merus oznaku za različite VH, npr. VH MF1337 ima specifičnost za tetanus toksoid, MF1025 za tiroglobulin svinje, MF1122 za fibrinogen govečeta. VH regioni prisutni u fagnom pokaznom vektoru MV1043 (Slika 1B) su digestirani restrikcionim enzimima SfiI i BstEII (New England Biolabs/ cat# R0123L i R0162L/ u skladu sa uputstvima proizvođača) koji oslobađaju VH fragment iz ovog vektora. Vektor MV1057 je digestiran SfiI i BstEII u skladu sa standardnim procedurama (u skladu sa uputstvima proizvođača). Fragmenti i vektor su prečišćeni preko gela (Promega/ cat# V3125/ u skladu sa uputstvima proizvođača) da bi se izolovali isečen vektor i VH genski inserti. Oba su kombinovana ligacijom nakon čega je ligacija transformisana u E. coli DH5α (Invitrogen/ cat# 12297-016/ u skladu sa uputstvima proizvođača). Posle selekcije preko noći pojedinačne kolonije su izabrane i vektori sa ispravnim insertom su identifikovani sekvenciranjem.

Primer 3: transfekcija i ekspresija potpunog IgG u HEK293T ćelijama

[0061] Transfekcija različitih plazmida koji kodiraju reklonirane VH varijante, i dalje kodiraju zajednički lanac huIGKV1-39, u HEK293T ćelijama je izvedena u skladu sa standardnim procedurama, tako da IgG može da se eksprimira (de Kruif etal Biotech Bioeng.

2010). Nakon transfekcije, nivoi ekspresije IgG u supernatantima su mereni upotrebom ForteBIO Octet-QK sistema, koji je baziran na Bio-Lajer interferometriji (Bio-Layer Interferometry) (BLI) i koji omogućava kvantifikaciju u realnom vremenu i kinetičku karakterizaciju biomolekularnih interakcija; za detalje videti www.fortebio.com. Kada su izmereni nivoi ekspresije koji su prelazili 5 μg/ml, IgG je prečišćen upotrebom Protein A afinitetnog prečišćavanja.

Primer 4: Prečišćavanje IgG

[0062] Supernatanti iz kulture su prečišćeni upotrebom protein A kolona (GE Healthcare/ cat# 11-0034-95/ u skladu sa uputstvima proizvođača) i eluirani u 0,1 M citratnom puferu pH 3,0 i odmah neutralizovani u jednakoj zapremini 1,0 M Tris-HCL pH 8,0 ili direktno repuferisani u PBS upotrebom kolone za desalinizaciju. Alternativno se IgG može prečistiti korišćenjem protein A perli (sefaroza perle CL-4B, GE healthcare cat #170780-01)

Primer 5: Ag-specifične ELISA-e

[0063] Izvršene su antigen specifične ELISA-e kako bi se utvrdila aktivnost vezivanja prema antigenu i uhvaćene ELISA-e su sprovedene da bi se pokazala aktivnost vezivanja bispecifičnih antitela. Biotinilovani drugi antigen je upotrebljen za detekciju kompleksa. (de Kruif etal Biotech Bioeng. 2010)

Primer 6: SDS-PAGE

[0064] Prečišćene IgG smeše su analizirane pomoću SDS-PAGE (NuPAGE® 4-12% bis-tris gel/ Invitrogen/ cat# NP0323BOX) pod redukujućim i neredukujućim uslovima u skladu sa standardnim procedurama, i bojenje proteina u gelu je sprovedeno koloidnim plavim (PageBlue ™ rastvor za bojenje proteina/ Fermentas/ cat# RO571).

Primer 7: Enzimska deglikozilacija IgG1

[0065] Kako postoji heterogenost u glikozilaciji IgG-a, proteini su deglikozilovani da bi se stvorio jedan proizvod sa osobitom masom, pogodan za maseno spektrometrijsku analizu. Jedna jedinica N-glikozidaze F (PNGase F; Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) je inkubirana na 10 μg IgG1, preko noći na 37°C. Zamena pufera je izvršena upotrebom 10 kDa MWCO centrifugalnih filter kolona (Millipore) da se ukloni originalni pufer za prečišćavanje (0,1 M citratni pufer pH 3,0 / 1,0 M Tris-HCL pH 8,0) i repuferiše PBS-om. Slične procedure zamene pufera izvršene su da se uklone odvojeni glikanski lanci, i da bi se promeni pufer 150 mM amonijum acetatom pH 7,5. Filteri su oprani sa 200 μl 150 mM amonijum acetata pH 7,5, tokom 12 min 11000 rpm i 4°C. Posle ispiranja 50 μl deglikozilovanog IgG je napunjeno na filter i dodato je 450 μl 150 mM amonijum acetata pH 7,5, zatim praćeno drugim krugom centrifugiranja od 12 min na 11000 rpm na 4°C. Centrifugiranje je ukupno ponovljeno 5 puta, svaki put je dodat svež 150 mM pufer amonijum acetata pH 7,5 do ukupne zapremine od 500 μl. Posle poslednjeg koraka centrifugiranja preostali pufer zamenio je deglikozilovan IgG1, približno 25 μl, sakupljeno je i prebačeno u ependorf tubu, spremno za masenu spektrometrijsku analizu.

Primer 8: Nativna masena spektrometrijska analiza

[0066] Masena spektrometrija je upotrebljena za identifikaciju različitih IgG vrsta u prečišćenim IgG smešama i za utvrđivanje u kojim odnosima su prisutne ove IgG vrste. Ukratko, 2-3 μl u koncentraciji od 1 μM u 150 mM amonijum acetata pH 7,5 IgG-a je napunjeno u borosilikatne kapilare obložene zlatom napravljene u kući (upotrebom Sutter P-97 pulera [Sutter Instruments Co., Novato, CA, USA] i Edwards Scancoat šestostrukog prskač-oblagača [Edwards Laboratories, Milpitas, CA, USA]) za analizu na LCT 1 masenom spektrometru (Waters Corp., Milford, MA, USA), podešenom za optimalne performanse u detekciji velike mase (Tahallah et al., RCM 2001). Upotrebljen je kapilarni napon od 1300 V i napon konusa za uzorkovanje od 200 V; međutim, ova podešavanja su prilagođena kada je bila potrebna veća rezolucija odnosa signal-šum. Potisni pritisak izvora je povišen da bi se poboljšalo kolizijsko hlađenje do približno 7,5 mbar. Za merenje IgG1 u denaturišućim uslovima proteini su prskani u koncentraciji od 1 μM u 5% mravljoj kiselini.

Primer 9: Obrada podataka i kvantifikacija

[0067] Obrada dobijenih spektara izvedena je upotrebom softvera MassLynx 4.1 (Waters Corp., Milford, MA, USA). Upotrebljeno je minimalno izglađivanje, nakon čega su spekatri centrirani. Izračunata je masa vrste upotrebom svakog stanja naelektrisanja u seriji. Odgovarajući intenziteti svakog stanja naelektrisanja dodeljeni su od strane MassLynx-a i sumirani. Ovaj pristup je omogućio relativnu kvantifikaciju svih vrsta u uzorku. Alternativno, kvantifikacija pikova može se izvesti upotrebom postupaka površina-ispod-krive (area-underthe-curve (AUC)), koji su poznati u struci. Sve analize su ponovljene tri puta da se izračunaju standardne devijacije i masa IgG kao i njihovih relativnih zastupljenosti.

Primer 10: smeše 2 ili 3 monospecifična antitela iz jedne ćelije

[0068] Nekoliko VH regiona antitela sa poznatim specifičnostima i poznatom sposobnošću sparivanja sa humanim IGKV1-39 lakim lancem (Slika 3) upotrebljeni su za rekloniranje u konstrukt vektor MV1057 divljeg tipa, ili u konstrukt 4 ili konstrukt 5 iz Tabele 1, rezultujući vektorima I-III (Tabela 2). Rezultujući vektori I, II i III, koji svi sadrže sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju zajednički humani laki lanac kao i Ig teški lanac sa različitim CH3 regionom i različito VH specifičnošću, posle toga su transfektovani u ćelije, bilo sami da demonstriraju formiranje samo intaktnih monospecifičnih antitela, ili u kombinaciji sa jednim ili dva druga konstrukt vektora da bi se dobile smeše dva monospecifična ili tri monospecifična antitela. Tabela 3 prikazuje raspored transfekcije i rezultate.

Tabela 2: VH specifičnost umetnuta u različite konstrukte

[0069] Primećeno je da transfekcije A, G i H rezultuju samo u formiranju homodimera, i 100% bivalentnih monospecifičnih AA, BB ili CC je dobijeno iz ćelija transfektovanih bilo kojim od vektora I, II ili III (Sl. 4). Iako je ovo bilo očekivano i prethodno pokazano za transfekciju A, zapravo sada je prvi put pokazano da je homodimerizacija CH3-projektovanih Ig teških lanaca koji sadrže ili trostruku amino-kiselinsku supstituciju konstrukta 4 (tj., K392D, D399K, K409D) ili četvorostruku amino-kiselinsku supstituciju konstrukta 5 (tj., E356K, E357K, K439D, K370D) prijavljena (transfekcije G i H).

[0070] Sledeće, izvedeni su eksperimenti ko-ekspresije dva vektora u jednoj ćeliji. Zanimljivo, transfekcije M i N pokazuju da divlji tip i CH3 projektovani Ig teški lanci mogu biti ko-eksprimirani u jednoj ćeliji zajedno sa zajedničkim lakim lancem što rezultuje smešama dve vrste monospecifičnih antitela bez prisustva nepoželjnog bispecifičnog antitela i sa samo 4-5% kontaminirajućih „drugih molekula“ prisutnih u smeši. „Drugi molekuli“ je definisano kao svi molekuli koji nemaju masu intaktnog IgG, i uključuje polu molekule koji se sastoje od jednog para teškog i lakog lanca. Važno je da frakcija „drugi“ ne uključuje bispecifični proizvod. U transfekciji M, odnos AA:BB je bio blizu 1:1 nakon transfekcije jednakih odnosa vektorske DNK. Međutim, transfekcija N rezultovala je gotovo 10:1 odnosom AA:CC. Prema tome, ova transfekcija je ponovljena sa podešenim odnosima DNK (transfekcija U). Zaista, odnos 1:5 vektorske DNK I:III izjednačio je odnos AA:CC proizvoda antitela u smeši prema skoro 1:1 odnosu. Tako, transfekcije M i U pokazuju da je moguće eksprimirati dva različita, u suštini čista, monospecifična antitela u jednoj ćeliji, bez nepoželjnih sporednih proizvoda (tj. bez obilnog prisustva AC ili polu molekula A ili C) (sl.

5). Nove CH3 modifikacije konstrukata 4 i 5 značajno se razlikuju od divljeg tipa CH3, tako da se heterodimerizacija između divljeg tipa i 4, ili divljeg tipa i 5, ne dešava, što je povoljno za primenu u proizvodnji velikih razmera smeša monospecifičnih antitela iz pojedinačnih ćelija.

[0071] Analogno ovim rezultatima, takođe transfekcija dva različita CH3 projektovana Ig teška lanca (konstrukti 4 i 5) očekuje se da će rezultovati smešama samo dva različita monospecifična antitela, bez prisustva dodatnih nepoželjnih vrsta. Obrazloženo je da se CH3 modifikacije konstrukta 4 značajno razlikuju od CH3 modifikacija konstrukta 5, tako da se heterodimerizacija ne dešava. U tom slučaju, ko-ekspresija CH3-projektovanih teških lanaca konstrukata 4 i 5, zajedno sa CH3 teškim lancima divljeg tipa u jednoj ćeliji rezultovala bi samo u 3 monospecifična antitela.

[0072] Zaista, primećeno je da je ovo slučaj kao što je nađeno da bi se takođe smeša tri čista monospecifična antitela mogla dobiti ekspresijom tri različita Ig teška lanca, dizajnirana da formiraju homodimere pre nego heterodimere, zajedno sa zajedničkim lakim lancem u jednoj ćeliji, bez kontaminacija prisutnih u smeši (transfekcija O) (Sl. 6). Kao što je jasno iz Tabele 3, sa jednakim odnosima vektorske DNK upotrebljene tokom transfekcije O, nije dobijen 1:1:1 odnos antitela AA:BB:CC. Transfekcije sa promenjenim odnosima vektorske DNK (1:1:10, transfekcija V) pokazale su da se odnosi AA:BB:CC u smešama mogu usmeriti prema poželjnim odnosima. Uzeti zajedno, ovi eksperimenti pokazuju da se dva ili tri suštinski čista monospecifična antitela mogu eksprimirati u jednoj ćeliji bez nepoželjnih sporednih proizvoda, nudeći prednosti za proizvodnju velikih razmera smeša terapeutskih monospecifičnih antitela.

Primer 11: smeše 2 bispecifična antitela iz jedne ćelije

[0073] Dok je upotreba CH3-projektovanih teških lanaca za proizvodnju pojedinačnih bispecifičnih antitela prijavljena na drugom mestu, ovaj eksperiment je dizajniran da istraži da li je izvodljivo proizvesti smeše 2 različita bispecifična antitela iz jedne ćelije.

[0074] VH regioni antitela sa poznatim specifičnostima i poznatom sposobnošću sparivanja sa humanim IGKV1-39 lakim lancem (sl.3) upotrebljeni su za rekloniranje u vektore koji sadrže konstrukte 1-3 ili 6-7 iz Tabele 1, što je rezultovalo vektorima IV-X (Tabela 4). Vektori IV-X, koji svi sadrže sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju zajednički humani laki lanac kao i Ig teški lanac sa različitim CH3 regionom i različitom VH specifičnošću, posle toga su transfektovani u ćelije, bilo sami da demonstriraju da je formiranje intaktnih monospecifičnih antitela ometeno, ili u kombinaciji sa drugim konstrukt vektorom da bi se dobila bispecifična antitela ili smeše dva bispecifična antitela. Tabela 5 prikazuje raspored transfekcije i rezultate.

Tabela 4: VH specifičnost umetnuta u različite konstrukte

[0075] Prethodno je demonstrirano da su CH3-projektovani Ig teški lanci koji su kodirani konstruktima 1 i 2 još uvek sposobni da formiraju homodimere kada se eksprimiraju sami u pojedinačnim ćelijama (WO2009/089004). Međutim, WO2009/089004 dalje navodi da CH3 domeni koji su projektovani tako da sadrže trostruke mutacije naelektrisanog para, kao što je prisutno u konstruktu 3, više nisu sposobni da formiraju homodimere kada se eksprimiraju sami.

[0076] U ovoj studiji, ovi nalazi su samo delimično potvrđeni. Zaista, rezultati transfekcija B, C i D pokazali su prisustvo potpunih IgG, pored visoke proporcije nesparenih polu molekula, pokazujući neke homodimerizacije CH3 domena kodiranih konstruktima 1 i 2. Transfekcije E i F su takođe rezultovale proizvodnjom potpunih IgG pored nesparenih polu molekula, pokazujući da trostruke mutacije naelektrisanja konstrukta 3 ne ometaju potpuno homodimerizaciju.

[0077] Dalje je još pokazano da i „izbočina“ i „udubljenje“ CH3 varijante konstrukata 6 i 7 formiraju homodimere (18% homodimera za „izbočina-izbočina“ i 42% homodimera za „udubljenje-udubljenje“).

[0078] CH3 varijante koje potpuno sprečavaju homodimerizaciju kada se eksprimiraju same su poželjne, da bi se sprečili ili minimizirali nepoželjni sporedni proizvodi (homodimeri) nakon ko-ekspresije sa drugom CH3 varijantom za heterodimerizaciju.

[0079] Interesantno, ovi eksperimenti po prvi put pokazuju da takođe smeše bispecifičnih antitela mogu biti eksprimirane u pojedinačnim ćelijama praktično bez homodimera u smeši. Transfekcije K i L jasno pokazuju da su očekivane bispecifične vrste BC AB zaista dobijene (38% 47% u transfekciji K, i 16% 60% u transfekciji L). U obe transfekcije primećen je relativno visok procenat nepoželjnih polu molekula (15% polu molekula A polu molekula C u transfekciji K, i 24% polu molekula A polu molekula C u transfekciji L). Relativno visok procenat polu molekula koji su još uvek prisutni pripisan je malim količinama poredivih teških lanaca vektora IV zbog neuravnotežene ekspresije teških lanaca u poredivom paru. Prema tome, transfekcije su ponovljene sa prilagođenim odnosom vektorske DNK, 2:1:1, u transfekcijama S i T. Ovo je rezultovalo u jednakim količinama IgG teških lanaca koji su činili poredivi par i čistoj smeši bispecifičnog IgG bez prisustva polu molekula IgG i sa prisutnih samo 3% homodimernih BB. Idealno, ovu malu proporciju kontaminirajućeg monospecifičnog proizvoda trebalo bi smanjiti suštinski na nulu. Stoga je poželjno da se pronađu dodatni CH3-mutanti koji bi rezultovali u smešama bispecifičnih antitela sa minimalnim prisustvom kontaminirajućih monospecifičnih antitela.

[0080] Ova studija prvi put pokazuje da se suštinski čiste smeše dva bispecifična antitela koja prepoznaju 3 različita ciljna epitopa mogu proizvesti u jednoj ćeliji, sa minimalnim prisustvom monospecifičnih antitela u smeši.

Primer 12: vrste smeša

[0081] Kao što je pokazano da je proizvodnja smeša 2 bispecifična antitela koja prepoznaju 3 epitopa iz jedne ćelije, ili proizvodnja smeša 2 ili 3 monospecifična antitela iz jedne ćelije tehnički izvodljiva, sledeće smo istražili izvodljivost kontrolisane proizvodnje različitih drugih smeša. Četvrti VH region antitela sa poznatom specifičnošću i poznatom sposobnošću sparivanja sa humanim IGKV1-39 lakim lancem biće upotrebljen za rekloniranje u vektore koji sadrže konstrukte 1-3 ili 7 iz Tabele 1, što je rezultovalo vektorima I', II', III' ili X' (' ukazuje na različitu specifičnost u poređenju sa odgovarajućim brojevima vektora). Rezultujući vektori I'-III', X' i IV-IX, od koji svi sadrže sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju zajedinički humani laki lanac kao i Ig teški lanac sa različitim CH3 regionom i različitom VH specifičnošću, posle toga će biti transfektovani u ćelije, u kombinaciji sa drugim konstrukt vektorima da bi se dobile različite smeše bispecifičnih i/ili monospecifičnih antitela. Različite smeše koje će se dobiti uključuju smeše 2 bispecifična antitela koja prepoznaju 4 epitopa, 2 bispecifična antitela i jednog monospecifičnog antitela, ili smeše jednog bispecifičnog i jednog monospecifičnog antitela iz jedne ćelije. Tabela 6 prikazuje raspored i transfekcije očekivane rezultate.

Tabela 6:

[0082] Iako, teoretski, proizvodnja svih smeša treba da bude izvodljiva, poznato je iz prethodnog rada drugih da je proizvodnja velikih razmera klasičnih varijanti izbočina-uudubljenje ometana problemima nestabilnosti. Tako se očekuje da smeše koje rezultuju iz transfekcija ZA, ZB, ZL, ZM i ZN postanu problematične kada se prenesu na proizvodnju većih razmera.

[0083] Tako, trenutni skup konstrukata prisutnih u Tabeli 1 ne bi dozvolio proizvodnju svih teoretskih smeša iz pojedinačnih ćelija u većim razmerama, pošto se navodi da su varijante izbočina-u-udubljenje nestabilne, i ne može se isključiti da će CH3 domeni koji sadrže „izbočinu“ ili „udubljenje“ dimerizovati sa bilo nelektrisanim varijantama ili CH3 domenima divljeg tipa. Tako je poželjno dizajnirati nove CH3-varijante koje su projektovane tako da preferencijalno formiraju samo homodimere ili heterodimere i koje neće homo- ili heterodimerizovati sa konstruktima 1-5 iz Tabele 1 kako bi omogućile ko-ekspresiju u pojedinačnim ćelijama.

Primer 13: identifikacija novih mutanata naelektrisanog para

[0084] Cilj ove studije bio je da se projektuje CH3 region IgG da rezultuje proizvodnjom samo heterodimera ili samo homodimera nakon mešovite ekspresije različitih teških lanaca IgG u jednoj ćeliji, pri čemu novo projektovani CH3 domeni neće homo- ili heterodimerizovati sa poznatim projektovanim CH3 domenima, ili sa CH3 domenima divljeg tipa. Stoga, kao prvi korak u identifikaciji novo projektovanih CH3 domena koji bi zadovoljili kriterijume, mnogi interfejs kontaktni ostaci u CH3 domenu IgG su skenirani jedan po jedan ili u grupama za supstitucije koje bi rezultovale odbijanjem identičnih teških lanaca - tj. redukovanim formiranjem homodimera - preko elektrostatičkih interakcija. Cilj je bio da se dobije spisak ostataka koji bi, kada bi bili supstituisani naelektrisanim ostatkom, rezultovali u odbijanju identičnih lanaca tako da se ove mutacije mogu upotrebiti za pokretanje formiranja homo- i/ili heterodimera nakon mešovite ekspresije različitih teških lanaca IgG, pri čemu su dobijeni IgG potpune dužine stabilni i proizvode se sa visokim proporcijama. U nastavku, identifikovane supstitucije će biti upotrebljene za generisanje bispecifičnih antitela ili smeša bispecifičnih ili monospecifičnih antitela projektovanjem poredivih parova ostataka CH3 u jednom ili više CH3 regiona teških lanaca IgG. Dodatno, novo identifikovani naelektrisani mutantni parovi se mogu kombinovati sa postojećim parovima, tako da više molekula nukleinske kiseline kodira različite teške lance, svi nose različite i komplementarne CH3 mutacije, mogu se upotrebiti za ekspresiju u ćelijama tako da se poželjno mogu dobiti smeše samo monospecifičnih antitela, ili samo bispecifičnih antitela, ili smeše definisanih monospecifičnih i bispecifičnih antitela. Ostaci koji se testiraju u ovoj studiji su kontaktni ostaci kao što su prethodno identifikovani (Deisenhofer J., 1981; Miller S., 1990; Padlan, 1996, Gunasekaran, 2010). Obrazloženje za ovaj pristup je da su odbijajuća naelektrisanja projektovana u svakom raspoloživom paru kontaktnih ostataka. Uzorci su zatim analizirani neredukujućim SDS-PAGE da bi se identifikovali parovi u kojima je formiranje dimera smanjeno, kao što je vizualizovano prisustvom traka od približno 72 kD. Svi raspoloživi parovi će biti prikazani kao pojedinačne mutacije ili u kombinaciji sa jednom drugom mutacijom jer odbijajuća elektrostatička interakcija između jednog neporedivog para može ili ne mora biti dovoljna da rezultuje u dovoljnim količinama polu-molekula za detekciju ovim postupkom, mutacije su takođe kombinovane.

[0085] Amino-kiselinske supstitucije uvedene su u konstrukt vektor MV1057 Geneart u skladu sa tabelom 7 i ekspresija konstrukata je izvedena transfekcijom u HEK293T ćelije, u skladu sa standardnim procedurama. Nivoi ekspresije IgG su mereni u Oktet-u (Octet). Kada je proizvodnja dva puta propala, mutacija se smatrala štetnom za ekspresiju i dalje se nije insistiralo na toj mutaciji.

Tabela 7: spisak amino-kiselinskih supstitucija u različitim konstruktima koji su napravljeni (EU numeracija)

[0086] Supernatanti koji sadrže ≥5 μg/ml IgG analizirani su SDS-PAGE i IgG je prečišćen upotrebom proteina A. Proteini su obojeni upotrebom koloidnog plavog. Homodimeri su bili vidljivi kao traka od približno 150 kD. Manje trake od oko 75 kD predstavljale su prisustvo polu molekula (videti negativnu kontrolu: K392D, K409D). Blotovi su prikazani na Slici 7.

[0087] Rezultati SDS-PAGE gelova su analizirani i ocenjeni kako je prikazano u tabeli 7, desna kolona. Niz ostataka je smatran obećavajućim za dalja ispitivanja u kombinaciji, uključujući ostatke Q347, S354, Y349, L351, K360, T366, T394, i V397. Izbor je zasnovan na visokim rezultatima za inhibiciju formiranja homodimera u kombinaciji sa raspoloživošću kontaktnih ostataka koji se mogu modifikovati bez ulaska u probleme kao što su druga nekomplementarni naelektrisanja. Na primer, poznato je da ostaci F405 i Y407 imaju višestruke interakcije u CH3-CH3 interfejsu, uključujući interakcije sa ostacima koji su već naelektrisani, što može biti problematično nakon uvođenja višestrukih mutacije naelektrisanja među ove interagujuće ostatke (videti Tabelu A). Novi konstrukti napravljeni su u vektoru MV1057 (Tabela 8), i VH regioni antitela sa poznatim specifičnostima i poznatom sposobnošću da se sparuju sa humanim IGKV1-39 lakim lancem upotrebljeni su za rekloniranje u vektore koji sadrže ove nove konstrukte (videti Tabelu 9) tako da se kombinacije mogu dalje testirati. Tabela 10 prikazuje raspored transfekcije i rezultate.

Tabela 8:

Tabela 9: VH specifičnost umetnuta u različite konstrukte

Tabela 10:

[0088] Kombinacije CH3 varijanti su eksprimirane, i analizirane SDS-PAGE (podaci nisu prikazani) i nativnom masenom spektrometrijom (MS). Rezultati su sumirani u Tabeli 10. Transfekcija ZO rezultovala je najvećim proporcijom heterodimera u smešama (69% AC). Zanimljivo je da u ZO transfekciji, AA homodimer nije bio prisutan dok je CC homodimer činio malu proporciju (7%). Maseno spektrometrijska analiza otkrila je da se preostali protein u smeši sastojao od polu molekula A, verovatno koji su rezultovali iz nejednake ekspresije A i C teških lanaca. Sirovi MS podaci iz uzorka transfekcije ZO prikazani su na Slici 8.

[0089] Iznenađujuće, dok je transfekcija ZO rezultovala pristojnim količinama bispecifičnog proizvoda, par preokrenutog naelektrisanja transfekcije ZP (L351K/T366'D nasuprot T366K/L351'D ZO) nije rezultovala sličnim rezultatima, i samo 52% bispecifičnog proizvoda je opaženo, sa značajnim količinama dva homodimera koji su bili prisutni (30% AA i 13% CC). Objašnjenje za ovo može biti da negativno naelektrisana D strukturno blisko podseća na T, tako da T366D ne može biti dovoljno moćna da odbije sebe i T366D će tako i dalje formirati homodimere, kao što je to zaista i opaženo.

[0090] Može se zamisliti da suptilne varijante novootkrivenog T366K/L351'D para (npr. testiranjem svih permutacija uključujući nove konstrukte T366R i L351E) mogu rezultovati sličnim procentima BsAbs.

Primer 14: HADDOCK za dizajniranje novih CH3 mutanata za pokretanje efikasne heterodimerizacije.

[0091] Kao što je opisano u primeru 13, novopronađeni naelektrisani par T366K/L351'D povećava proporciju heterodimera u smeši (69%) sa malim delom nepoželjnih CC homodimera (7%) (L351D/L351'D) i značajnim delom polu molekula A (24%) koji „kontaminiraju“ smešu. U ovom primeru, in silico pristup je upotrebljen za generisanje daljeg uvida u amino-kiselinske ostatke uključene u interakcije CH3 interfejsa, za testiranje komplementarnih supstitucija u naspramnim CH3 regionima i za pronalaženje novih CH3 parova koji sadrže komplementarne supstitucije koje dalje povećavaju efikasnost heterodimerizacije dok sprečavaju efikasno formiranje homodimera dva teška lanca.

[0092] HADDOCK (protein-protein pristajanje pokrenuto visokom dvosmislenošću (High Ambiguity Driven protein-protein DOCKing)) je informacijama-pokrenut pristup fleksibilnog pristajanja za modeliranje biomolekulskih komplekasa. HADDOCK se razlikuje od ab-initio postupaka pristajanja u činjenici da on kodira informacije iz identifikovanih ili predviđenih proteinskih interfejsova u dvosmislenim ograničenjima interakcije (ambiguous interaction restraints (AIRs)) da bi pokrenuo postupak pristajanja. (de Vries et al., 2010).

[0093] Ulazni podatak za HADDOCK web server sastoji se od fajla strukture proteina, koji može biti kristalna struktura, NMR klaster struktura ili modelirana struktura. Posle pristajanja ili dorade, HADDOCK vraća takozvani HADDOCK rezultat, koji je procenjen prosek VanderValsove energije, elektrostatičke energije, energije zakopane površinske površine i desolvatacije. HADDOCK rezultat se može tumačiti kao pokazatelj energije vezivanja ili afiniteta, iako je često teško postići direktnu translaciju na eksperimentalne podatke. Pored toga, HADDOCK daje strukturne fajlove za "četiri glavne" strukture koje su rezultat niza pristajanja. Ovi strukturni fajlovi mogu se preuzeti i vizualizovati, omogućujući detaljnu analizu interakcija pojedinačnih ostataka.

[0094] U ovom primeru, proučavane su interakcije između CH3-domena teških lanaca IgG1. Kao početna struktura upotrebljena je kristalna struktura visoke rezolucije Fc dela IgG (struktura 1L6X) (http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1l6x; Idusogie, E.E. et al., J.I.2000(164)4178-4184).

[0095] U primeru 13, pronađeno je da ko-transfekcija vektora XIII i XVI rezultuje formiranjem CC homodimernog kontaminanta (Tabela 10). HADDOCK je upotrebljen za traženje dodatnih mutacija za T366K/L351'D par koji sprečava homodimerizaciju.

[0096] HADDOCK izlazni podaci se sastoje od skupa izračunatih energija, HADDOCK rezultata (koji je procenjeni prosek energija) i četiri strukturna fajla koji odgovaraju četirima strukturama sa najnižih energija koje je našao program. HADDOCK-rezultati se upotrebljavaju za poređenje različitih struktura; druge energije se upotrebljavaju samo da bi se dobila naznaka o tome šta se dešava u strukturama (npr. dobre elektrostatičke interakcije, manja zakopana površina, visoka Van der Valsova energija). Što je niži HADDOCK rezultat, to bolje. Za svaki par mutacije, izračunati su rezultati za AA, AB i BB dimere.

[0097] Skupovi mutacijskih parova iz primera 12 su pokrenuti u HADDOCK-u da se vidi hoće li izračunate energije korelirati sa eksperimentalnim podacima. Tabela 11 prikazuje sve teoretske energije, koje su vizualizovanena Slici 9.

Tabela 11:

[0098] Sa 2 CH3 domena divljeg tipa, HADDOCK rezultati su isti za AA, AB i BB pošto su A i B CH3 regioni identični. U većini drugih slučajeva, AB par ima najniži rezultat, što je i očekivano. Za T366K/L351D par BB rezultat je nešto bolji od AB rezultata (-210.6 prema -212.5), ali ova razlika je u okviru greške izračunavanja. Upotrebom HADDOCK, strukture heterodimera ovih parova su vizualizovane. Na primer, konstrukt kombinacije 1-2, 1-1 i 2-2 prikazane su na Slici 10. Iz ovih vizualizacija je očigledno da se soni mostovi formiraju u heterodimeru (Slika 10A levi panel) dok se elektrostatičko odbijanje dešava između ostataka identičnih lanaca (Slika 10B i C, srednji i desni panel). Veći HADDOCK rezultati za homodimere se tako mogu objasniti elektrostatičkom odbojnošću mutiranih ostataka interfejsa. Ovi ostaci moraju da se savijaju jedan od drugog i nemaju interakciju sa ostacima na drugom lancu, uzrokujući pad afiniteta.

[0099] Tabela 11 i Slika 9 potvrđuju ono što je opaženo u primeru 13. T366K/L351'D AC heterodimer i L351D/L351'D CC homodimer formiraju se sa sličnom energijom, objašnjavajući prisustvo i heterodimera i homodimera u smeši. T366K/T366'K AA homodimer, s druge strane, jedva da se može detektovati u smeši iako su T366K polu A molekuli prisutni. Tabela 11 i Slika 9 zaista pokazuju da je HADDOCK rezultat za T366K/T366'K AA homodimer veći od rezultata za AC heterodimer; stoga je formiranje ovog homodimera energetski manje povoljno.

Primer 15: 366/351 varijacije

[0100] U primeru 13, postavljena je hipoteza da se alternative za T366K/L351'D mutirani naelektrisani par mogu dizajnirati koje mogu imati slične rezultate u pogledu procenta bispecifičnih antitela u smeši. Alternative mogu uključivati supstitucije T366R, T366D, T366E, L351E, L351K i L351R. Proporcija CC homodimera L351D/L351'D može se smanjiti stvaranjem varijanti para 366/351. Svi mogući parovi mutacije su sprovedeni u HADDOCK-u i rezultujući rezultat su predstavljeni u Tabeli 12 i vizualizovani na Slici 11.

Tabela 12

[0101] Kada se posmatraju HADDOCK rezultati, opaženo je da neke od mutacija imaju sličan „obrazac“ kada se porede sa T366K/L351'D. Za većinu permutacija pronađeno je da AA homodimer ima veći HADDOCK-rezultat od AB heterodimera, ali je BB homodimer izgledao podjednako povoljan kao i AB heterodimer. Iako je poznato da je 351 ostatak „komšija“ sebi na drugom lancu, tj. ostatak 351 lanca A sparuje se sa ostatkom 351 lanca B u CH3-CH3 interfejsu, jedva da postoji negativan uticaj identičnih naelektrisanja kada je BB dimer formiran. Gledajući strukturu L351D/L351'D to se objašnjava time što se asparaginske kiseline savijaju jedna od druge i stabilizujućim uticajem barem Arginina koji se prirodno nalazi na položaju 355 i takođe nekom stabilizacijom negativnog naelektrisanja Serinom koji se prirodno nalazo na položaju 354 (videti Sliku 12A). Mutacija ovih ostataka (S354A i R355D) daje samo malo poboljšanja. Iz slike 12B je jasno da vodonik okosnice A354 uzrokuje stabilizaciju homodimera. Iz ove serije, izgleda da je par T366R/L351'E najpovoljniji, sa najnižim HADDOCK rezultatom za bispecifični molekul.

Primer 16: mutacije oko T366K/ L351'D

[0102] U seriji HADDOCK analiza u ovom primeru, par T366K/L351'D ili T366K/L351'E uzeti su kao početna struktura. Da bi se identifikovale dodatne mutacije koje bi dalje povećale predviđeni procenat bispecifika ovih A i B lanaca, dodatne mutacije na B-lancu su upotrebljene za izračunavanje HADDOCK-rezultata i energija. Kada se proučava struktura CH3 domena upotrebom posmatrača za vizuelizaciju proteinskih struktura na molekularnom nivou (YASARA, www.yasara.org), mogu se izračunati udaljenosti između pojedinačnih ostataka. Dok se tako radi, primećeno je da su dva ostatka Y349 i L368 komšijski ostaci koji mogu pozitivno ili negativno doprineti interakcijama dimera i one su bile mutirane u ovom primeru –pored L351D mutacije – da bi se proučio rezultat formiranja dimera homo- i heterodimera (videti sliku 13). Čini se da oba ostatka dodaju stabilnosti heterodimera (niži HADDOCK rezultati) kao i destabilizaciji BB dimera (viši HADDOCK rezultati). Glutaminske kiseline (E) na položajima 349 i 368 su izgleda povoljnije od asparaginskih kiselina (D). Tako, uvođenje druge amino-kiselinske supstitucije u B-lanac, koji već sadrži amino-kiselinsku supstituciju na položaju 351, izgleda da dalje favorizuje heterodimerizaciju.

[0103] U sledećem setu HADDOCK analiza, T366K/L351'D par je ponovo uzet kao početna struktura. Pored supstitucija u B lancu koje su dalje povećavale heterodimerizaciju (tj. Y349D/E i L368E), dodatne mutacije su dodate A-lancu koji već sadrži T366K supstituciju. Kao što je prikazano na Slici 14, postoji nekoliko parova mutacija koji izgledaju povoljno prema formiranju bispecifičnih heterodimera. U paru T366K-L351K/L351'D-Y349'D, sva četiri mutirana ostatka su uključena u heterodimerno sparivanje, što nije slučaj za T366K-L351K/L351'E-L368'E u kome K351 nije direktno uključen u vezivanje. Međutim, HADDOCK-rezultat za ovaj drugi heterodimer je -228,9; značajno niži od -214,2 za T366K/L351'E-L368'E, što se može objasniti interakcijama vezivanjem vodonika K na položaju 351 (videti Sliku 15).

[0104] T366K-L351K/L351'D-Y349'D par se može dalje poboljšati mutacijom R355'D u B-lancu, što rezultuje većim BB-HADDOCK rezultatom, ali je i AB HADDOCK rezultat nešto veći. Sveukupno, dodatni L351K rezultuje nižim AB rezultatima i sličnim AA i BB rezultatima u poređenju na samom T366K mutaciju u A lancu. Teoretski ovo bi rezultovalo većim količinama bispecifičnih heterodimera u uzorcima.

[0105] Kao što je očigledno sa slike 11, imati R pre nego K na položaju 366 može biti potentnije u pokretanju heterodimerizacije. Zbog toga su neke od HADDOCK analiza prikazane na slici 13 su ponovljene ali sada sa T366R pre nego T366K u A-lancu. Pokazano je da nije povoljno kombinovati R366 u lancu A s duplim mutacijama u lancu B (slika 16). Ovo može biti zbog velike veličine ovog ostatka, koja ometa druge interfejs interakcije, čak iako su svi očekivani soni-mostovi sa R366 prisutni u strukturama. Takođe, HADDOCK rezultat za AA homodimer je niži za R366 nego za K366, što takođe ne doprinosi povoljno formiranju heterodimera. Zbog toga nisu izvršene dalje HADDOCK analize upotrebom R366 u interfejsu.

[0106] Ukupno je izabrano 14 parova koji su se najbolje pokazali, u skladu sa HADDOCK predviđanjima (videti Tabelu 13 i Sliku 17). U nekim parovima, R355D supstitucija je uključena da bi se uklonio stabilizujući uticaj R355 koja se prirodno nalazi na L351/L351'D interakciju.

Tabela 13:

Primer 17: in vitro ekspresija bispecifika upotrebom CH3 mutanata na osnovu HADDOCK predviđanja

[0107] Analiza u primeru 16 sugerisala je da bi neke CH3 varijante sa dodatnim mutacijama oko T366K/L351'D para proizvele smeše sa većim proporcijama bispecifične komponente i potencijalno manjim proporcijama homodimerne komponente. Ovi parovi koji su se najbolje pokazali su odabrani za proizvodnju i dalju analizu. Pored toga, konstrukti T366R i L351E su takođe generisani. Tabela 14 navodi konstrukte koji su napravljeni i koji su upotrebljeni za rekloniranje VH regiona antitela sa poznatim specifičnostima i poznatom sposobnošću za sparivanje sa humanim IGKV1-39 lakim lancem. Ekspresija IgG-a koji sadrže pojedinačne konstrukte prethodno je prijavljena u primeru 13, i ponovljena je za konstrukte čiji je spisak dat u Tabeli 14. Cilj je bio da se proceni koji od konstrukata homodimerizuje u odsustvu poredivog heterodimerizacionog partnera. Idealno, formirali bi se visoki procenti polu tela i niski procenti homodimera. Kao kontrola, konstrukti koji sadrže ranije prijavljene mutacije naelektrisanja i konstrukti koji sadrže ranije prijavljene mutacije izbočina-u-udubljenje su takođe upotrebljeni za ekspresiju kao ceo IgG od strane rekombinantnih ćelija. Prečišćeni supernatanti proteina A su analizirani SDS-PAGE; rezultati su analizirani i ocenjeni kako je prikazano u Tabeli 14

Tabela 14:

[0108] Rezultati ko-ekspresije zajedničkog lakog lanca i dva različita teška lanca koji nose amino-kiselinske supstitucije konstrukata prikazanih u Tabeli 14 ili teških lanaca koji nose amino-kiselinske supstitucije prethodnih konstrukata su prikazani u Tabeli 15. Ekspresija dva različita teška lanca koji sadrže amino-kiselinske supstitucije T366K i L351'D:L368'E je redom rezultovalo sa približno 87% bispecifičnog AB heterodimera u smeši bez prisutnih AA ili BB homodimera (kombinacija br. 3 u Tabeli 15). Oko 12% polu molekula (polu A) koji sadrže T366K supstituciju je opaženo. Pored toga, pronađeno je da se procenat bispecifičnog AB heterodimera povećao kada je dodatna amino-kiselinska supstitucija L351K uvedena u prvi teški lanac. Na primer, ko-ekspresija dva različita teška lanca koji sadrže aminokiselinske supstitucije T366K:L351K i L351'D:L368'E redom su rezultovale u približno 92% bispecifičnog AB heterodimera, dok su AA i BB homodimeri suštinski odsutni u smeši (kombinacija br. 12 u Tabeli 15). Kombinacije 10 i 11 takođe su rezultovale povoljnom raspodelom visokih procenata heterodimera i praktično odsustvom homodimera. Odsustvo homodimera je povoljno, jer je frakcija koja sadrži intaktne molekule IgG sastavljena samo od AB heterodimera. Za prečišćavanje i kasniju terapeutsku primenu, polu molekuli mogu biti uklonjeni standardnim pristupima, kao što je ekskluziona hromatografija. Stoga, primena ovih novo identifikovanih mutanata naelektrisanja u proizvodnom postupku za generisanje bispecifičnih antitela daje prednosti nad poznatim mutantima naelektrisanja i izbočina-uudubljenje mutantima gde prisustvo „kontaminirajućih“ homodimernih antitela nije isključeno. Dodatno, T366K/L351'D:L368'E i T366K:L351K/L351'D:L368'E naelektrisani parovi imaju dodatnu prednost nad prethodno opisanim E356K:D399K/K392'D:K409'D i E356K:D399K/K392'D:K409'D:K439'D parovima preokrenutog naelektrisanja, u tome da su prethodno opisane naelektrisane varijante zasnovane na promeni postojećih naelektrisanja unutar CH3-CH3 interfejsa dok novo identifikovane naelektrisane varijante dodaju dodatne naelektrisane parove (interakcije naelektrisanje-naelektrisanje) CH3-CH3 interfejsu.

Uvođenje dodatnih naelektrisanih parova u CH3-CH3 interfejs može dalje da poveća stabilnost interfejsa i time intaktnog antitela. Isto važi i za mutacije upotrebljene u kombinacijama br. 4, 5, 6, 9, 10, i 11, koje su takođe rezultovale povoljnim proporcijama bispecifičnog heterodimera sa izuzetno niskim proporcijama AA i BB homodimera prisutnih u smešama.

Tabela 15:

Nativna MS

[0109] Nativna MS je izvedena na svim bispecifičnim uzorcima. Dobijeni grafikoni su analizirani da bi se utvrdili relativni odnosi prisutnih vrsta na dva načina: po visini pika i po površini pika. Površina pika je naučno ispravniji način analize, ali pošto su sve prethodne analize za druge studije rađene na osnovu visine pika, oba postupka su uključena u analizu, radi poređenja. Razlike između postupaka bile su u okviru greške merenja, te su stoga samo vrednosti površine pika upotrebljene za buduća merenja. Dva tipična spektra prikazana su na Slici 18. Pregled rezultata prikazan je grafički na Slici 19, numeričke vrednosti se mogu naći u Tabeli 15. U oko polovini uzoraka ukupna kontaminacija monospecifičnog IgG je manja od 5%, a samo u tri slučaja je > 10% dok je za wt IgG očekivano da se pronađe oko 50% monospecifičnog IgG u smeši.

[0110] Panel od deset kombinacija od po 2 različita teška lanca je izabran iz Tabele 15 za dalje analize. Ovih deset kombinacija su uključivale kombinacije 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11 i 12 (Tabela 15). Izbor ovih deset je zasnovan na niskim procentima homodimera prisutnih u smešama kao što je određeno nMS-om, ali i na zasnovan na njihovim sveukupnim fizičkohemijskim svojstvima, uključujući prinose proizvodnje, SDS-PAGE, kao i broj mutacija prisutnih u CH3 domenu.

Primer 18: analize stabilnosti IgG

[0111] U ovoj studiji, serija CH3 parova mutacije koji su rezultovali visokim proporcijama bispecifičnih heterodimera u intaktnoj frakciji IgG i veoma malim količinama (<5%) roditeljskih IgG biće dalje analizirani na stabilnost Fc dela IgG molekula. Mutirani CH3 domeni koji se upotrebljavaju za promovisanje heterodimerizacije teških lanaca mogu imati neočekivane destabilizujuće efekte na Fc region IgG, koji mogu rezultovati neželjenim svojstvima kao što je redukcija in vivo polu života, smanjenje efektorske funkcije i/ili povećanje imunogenosti. Novo identifikovani naelektrisani parovi će se upoređivati sa bispecificima divljeg tipa i bispecifikom koji sadrži prethodno identifikovane mutacije naelektrisanja (lanac A koji sadrži konstrukt 1 i lanac B koji sadrži konstrukt 2). Svi bispecifici u ovoj studiji će sadržati iste varijabilne regione teškog i lakog lanca, obezbeđujući da su uočeni efekti uzrokovani mutacijama u Fc-delu molekula a ne varijacijom u varijabilnim regionima.

[0112] Serija studija stabilnosti će biti izvedena na ovim bispecificima. Ove studije uključuju spektroskopske (UV-Vis apsorbancu, fluorescenciju i raspršivanje svetlosti) i mikroskopske (svetlosna i fluorescentna mikroskopija sa Nil crvenim (Nile Red) bojenjem) analize koje pružaju informacije o stanju agregacije CH3 varijanti.

[0113] Spektri apsorbance UV-Vis će biti snimljeni dvostrukim snopom, dva monohromatora Kari (Cary) 300 Bio spektrofotometra na 25°C. Spektri će se pratiti između 250 i 400 nm koristeći dužinu puta od 1 cm. Apsorbanca na talasnim dužinama od 320 nm i dužim pruža informacije o stanju agregacije IgG.

[0114] Spektri intrinzične fluorescencije će se pratiti na 25°C upotrebom FluoroMaks (FluoroMax) spektrofluorimetra. Postupak fluorescencije će biti optimizovan. Emisija fluorescencije će pružiti informacije o svojstvima konformacije i agregacije.

[0115] Spektri rasipanja svetlosti od 90° će se pratiti na 25°C upotrebom FluoroMaks spektrofluorimetra provođenjem sinhronog skeniranja (λem= λek) između 400 nm i 750 nm sa vremenom integracije od 0,01s. Prorezi ekscitacije i emisije će biti optimizovani. Na primer, rasipanje svetlosti pod pravim uglom može izdvojiti IgG uzorke koji nemaju i one koji imaju 5% dimera.

[0116] Za fluorescentnu mikroskopiju sa Nil crvenim bojenjem, neposredno pre merenja, Nil crvena u etanolu biće dodata uzorku. Uzorci će biti napunjeni na mikroskopsku pločicu i analizirani fluorescentnom mikroskopijom. Čestice će se brojati. Donja granična veličina čestica koja se može posmatrati pomoću fluorescentne mikroskopije je približno 0,5 μm.

[0117] Primena stresa kao što je temperatura, pH, mehanički stres ili denaturanti proteina mogu rezultovati u promeni konformacije (npr. odvijanje) i/ili agregacije. Kao što je ranije prijavljeno da su bispecifična antitela projektovanog naelektrisanja smanjila temperaturu topljenja modifikovanog CH3 (Gunasekaran 2010), ove studije imaju za cilj da naprave razliku između novih naelektrisanih mutanata ovog pronalaska i postojećih poznatih naelektrisanih mutanata.

[0118] Studije termostabilnosti upotrebom Oktet-a su istražene, i sa biosenzorima proteina A i upotrebom FcRn vezivanja na IgG. Da bi se ispitala termička stabilnost CH3 projektovanih IgG-a, uzorci će biti inkubirani u koncentraciji od 100 ug / ml (u PBS) na 4, 50, 55, 60, 65, 70 i 75°C tokom 1 sata upotrebom PCR mašine. Nakon ovoga uzorci će se ohladiti polako tokom perioda od 15 minuta do 25°C i držati na ovoj temperaturi 2 sata, posle čega će se čuvati preko noći na 4°C.

[0119] Istaložena antitela će se ukloniti centrifugiranjem, posle čega će ukupna IgG koncentracija rastvorljivih antitela biti određena pomoću Oktet-a upotrebom protein A Biosensor (1/10 razblaženje u PBS). Istražuju se testovi koji mere vezivanje CH3 projektovanog IgG za FcRn upotrebom Oktet-a. Ili se protein L biosenzori upotrebljavaju za vezivanje lakog lanca IgG za senzor, nakon čega sledi inkubacija sa FcRn u rastvoru, ili se upotrebljavaju antipenta-HIS biosenzori za vezivanje His-označenog FcRn proteina, nakon čega sledi inkubacija sa IgG od interesa. Ovi postupci mogu biti osetljiviji od upotrebe protein A biosenzora i mogu se upotrebljavati za studije termičke stabilnosti.

[0120] Svi uzorci će takođe biti analizirani na stabilnost seruma. Ukratko, uzorci (projektovanog) IgG biće inkubirani na 37°C u humanom serumu, kontrolni uzorci će se čuvati na 4°C. Posle 1, 2, 3 i 4 nedelje, uzorci se centrifugiraju da se uklone istaloženi IgG. Posle toga, uzorak se titrira u ELISA testu specifičnom za antigen kako bi se odredile relativne količine funkcionalnog IgG. Prečišćeno kontrolno antitelo sveže ubačeno u humani serum biće upotrebljeno kao referenca.

Primer 19: analize stabilnosti

[0121] U prethodnim eksperimentima, visoki procenti bispecifičnih antitela su dobijeni koekspresijom dva različita teška lanca koji sadrže CH3 mutacije, i zajedničkog lakog lanca (primer 17).

[0122] Panel od osam kombinacija od po 2 različita teška lanca je izabran iz Tabele 15 za dalje analize. Ovih osam kombinacija su uključivale kombinacije 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11 i 12 (Tabela 15). U ovoj studiji, ovih osam kombinacija su analizirane, sa jakim fokusom na stabilnost Fc dela IgG. Kao kontrole, uključeni su bispecifici divljeg tipa (tj. bez CH3 mutacija) i/ili bispecifici zasnovani na prethodno prijavljenim mutacijama CH3 naelektrisanja. Primetiti da se za bispecifike divljeg tipa, 2 teška lanca i zajednički laki lanac ko-eksprimiraju bez sredstava za preferencijalno upravljanje prema heterodimerima. Ovi „bispecifici divljeg tipa“ tako predstavljaju smešu AA, AB i BB. Svi bispecifici u ovoj studiji su dizajnirani da nose iste VH/VL-kombinacije, osiguravajući da su opaženi efekti uzrokovani mutacijama u Fc-delu molekula i ne varijacijom (varijacijama) u Fab delovima.

[0123] Postavljena je hipoteza da mutacioni parovi koji su upotrebljeni za promociju heterodimernog sparivanja dva različita teška lanca mogu biti povezani sa neočekivanim strukturnim ili drugim destabilizujućim efektima na Fc region IgG. To bi kasnije moglo rezultovati u nepoželjnim problemima koji bi ometali dalji klinički razvoj, kao što je smanjenje in vivo polu života, redukovana efektorska funkcija i/ili povećana imunogenost zbog prisustva ovih mutacija.

Termo stabilnost

[0124] Primena stresa kao što su povećanja ili smanjenja temperature mogu rezultovati u promeni konformacije (npr. odvijanje) i/ili agregaciji proteina. Da bi se ispitala termička stabilnost CH3-projektovanih IgG-a, bispecifični molekuli iz kombinacija 3-6 i 9-12 (Tabela 15), kao i bispecifici divljeg tipova i bispecifični molekuli dobijeni kada se upotrebljavaju konstrukti 1 i 2 (kombinacija E356K:D399K/ K392D’:K409D’, takođe nazvana par „preokrenutog naelektrisanja“) inkubirani su u koncentraciji od 100 μg/ml (u PBS) na 4, 60, 62,5, 65, 67,5, 70 i 72,5°C tokom jednog sata upotrebom PCR mašine. Nakon ovoga, uzorci su polako ohlađeni tokom perioda od 15 minuta do 25°C i držani na ovoj temperaturi 2 sata, posle čega su čuvani preko noći na 4°C. Sledećeg dana su istaložena antitela uklonjena centrifugiranjem (18,000 rpm; 4°C, 20 min), nakon čega je ukupna koncentracija IgG rastvorljivih antitela bila određena Oktet-om upotrebom protein A biosenzora (1/10 razblaženje u PBS). Rezultati su prikazani na slici 20. Uočeno je da kontrolno CH3 projektovano bispecifično antitelo (kombinacija preokrenutog naelektrisanja E356K:D399K/K392D':K409D') (trouglovi)) ima smanjenu termičku stabilnost u poređenju sa bispecifikom divljeg tipa (kvadrati). Bispecifični molekuli iz kombinacija 3-6 i 9-12 (dijamanti) takođe su pokazali smanjenu termičku stabilnost u poređenju sa divljim tipom. Značajno je, međutim, da su tri kombinacije pokazale poboljšanu stabilnost u poređenju sa kontrolnim CH3 projektovanim bispecifičnim antitelom. Bispecifici kombinacija 9, 10 i 11 su značajno stabilniji od drugih CH3 projektovanih (preokrenutog naelektrisanja) bispecifika i stabilni su kao bispecifici divljeg tipa na najvišoj izmerenoj temperaturi.

Stabilnost na zamrzavanje-odmrzavanje

[0125] Da bi se ispitala stabilnost CH3-projektovanih IgG-a nakon ponavljanog zamrzavanja i odmrzavanja, bispecifični molekuli iz kombinacija 3-6 i 9-12 (Tabela 15), kao i bispecifici divljeg tipa i bispecifični molekuli dobijeni kada se upotrebljavaju konstrukti 1 i 2 (kombinacija E356K:D399K/K392D’:K409D’ (par preokrenutog naelektrisanja)) izloženi su ciklusima deset uzastopnih zamrzavanja-odmrzavanja stavljanjem uzoraka na -80°C najmanje 15 minuta dok se potpuno ne zamrznu. Posle toga, uzorci su odmrznuti na sobnoj temperaturi. Kada su potpuno odmrznuti, ciklus zamrzavanja-odmrzavanja je ponovljen. Posle 10 ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja, istaložena antitela su uklonjena centrifugiranjem (18,000 rpm; 4°C, 20 min), posle čega je ukupna koncentracija IgG rastvorljivih antitela određena Oktetom upotrebom protein A biosenzora (1/10 razblaženje u PBS). Test stabilnosti zamrzavanjaodmrzavanja ponovljen je tri puta. Rezultati su prikazani na slici 21. Uočeno je da kontrolno CH3 projektovano bispecifično antitelo preokrenutog naelektrisanja činilo se ima blago smanjenu stabilnost u poređenju sa bispecifikom divljeg tipa. Nasuprot tome, činilo se da bispecifični molekuli iz kombinacija 3, 4 i 9 imaju blago poboljšanu stabilnost u poređenju sa bispecifkom divljeg tipa. Sve u svemu, može se zaključiti da strogi uslovi ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja ne uzrokuju velike probleme stabilnosti CH3 projektovanim varijantama.

Stabilnost seruma in vitro

[0126] Da bi se ispitala stabilnost CH3-projektovanih IgG u serumu držanom na 37°C, bispecifični molekuli iz kombinacija 3-6 i 9-12 (Tabela 15), kao i bispecifici divljeg tipa i bispecifični molekuli preokrenutog naelektrisanja inkubirani su na 37°C u 10% humanom serumu. Kontrolni uzorci su držani u humanom serumu na 4°C. Posle 1, 2 ili 5 dana, istaložena antitela su uklonjena centrifugiranjem. Posle toga, uzorci su titrirani u fibrinogenspecifičnom ELISA, da se odrede relativne količine funkcionalnog IgG. Prečišćeno kontrolno antitelo koje je sveže ubačeno u humani serum je upotrebljeno kao referenca.

[0127] Podaci ELISA za fibrinogen pokazuju da su svi uzorci bili prilično stabilni u 10% humanom serumu na 37°C tokom 5 dana. Na nižim koncentracijama IgG bispecifični molekuli iz kombinacija 4 i 5 činilo se da su malo manje stabilni, posebno pri T=1 i T=2, ali razlika je samo minimalna na kraju ovog eksperimenta (videti Sliku 22).

Primer 20: Dalji testovi stabilnosti

[0128] Dalja serija analitičkih postupaka je upotrebljena za procenu stabilnosti varijanti IgG-a. Bispecifični molekuli iz kombinacija 3-6 i 9-12 (Tabela 15), kao i bispecifici divljeg tipa (AA, AB, BB), pojedinačna roditeljska antitela (AA i BB) i bispecifični molekuli dobijeni kada se upotrebljavaju konstrukti 1 i 2 (kombinacija E356K:D399K / K392D':K409D' (par preokrenutog naelektrisanja)) upotrebljeni su kao uzorci u ovim testovima stabilnosti. Svi IgG su razblaženi do 0,2 mg/ml i primenjeno je nekoliko stresnih stanja (2 dana na 50°C, 2 nedelje na 40°C, 5x zamrzavanje-odmrzavanje), sa ciljem da se bude u mogućnosti da se napravi razlika između različitih uzoraka. Treba napomenuti da su ovi visoki nivoi stresa rezultovali uslovima u kojima je jedno od roditeljskih antitela (BB roditeljsko, koje nosi dva 1122 Fab-a), kao što je upotrebljeno u svim bispecificima postalo nestabilno. Na 2 dana na 50°C, agregacija ovog proteina je detektovana UV apsorbancom. Ovo je sugerisalo da ovo stresno stanje ne može da napravi razliku između nestabilnosti Fab-a i CH3 u bispecifiku i podatke koji su rezultat inkubacije na 50°C treba upotrebljavati oprezno.

[0129] Rezultati su sumirani u Tabeli 16. Analitički postupci koji su upotrebljeni uključuju:

- Fluorescentnu mikroskopiju sa Nil crvenim („Nil crvene čestice“ u Tabeli 16); da se uoči količina čestica > 0,5 μm nakon dodavanja Nil crvene boje.

- UV spektrometriju na 350 nm („UV 350 nm“); promena u apsorpciji na talasnim dužinama > 320 nm daje informacije o stanju agregacije proteina.

- 90° rasipanje svetlosti na 400 nm („LS400 nm“); osetljiva tehnika da se uoče promene u agregaciji proteina, npr. razlika između monomera i dimera IgG.

- Intrinzičnu fluorescenciju; maksimum talasne dužine fluorescencije i intenzitet aromatičnih ostataka u proteinu menja se posle promena u okruženju (npr. odvijanje)

- 1,8-ANS fluorescentnu spektroskopiju; 1,8-ANS se veže preko elektrostatičkih interakcija sa katjonskim grupama stvaranjem jonskog para i promene u strukturi proteina i/ili konformaciji se mogu detektovati

UV-VIS spektroskopija

[0130] UV-Vis spektri apsorbance su mereni na 25°C dvostrukim snopom, dva monohromatora Kari 300 Bio spektrofotometra od Varian-a u različitim kvarcnim kivetama (kao što su crne Helma (Hellma) kivete male zapremine sa dužinom puta od 1,0 cm i providne Helma kivete od 0,2 cm x 1,0 cm). Spektri su praćeni između 220 i 450 nm korišćenjem dužine puta od 1,0 cm. Apsorbanca oko 280 nm daje informacije o koncentraciji proteina. Region između 320 nm i 450 nm može dati informacije o stanju agregacije uzoraka.

90° rasipanje svetlosti

[0131] Spektralni postupak rasipanja svetlosti od 90 ° razvijen je za proučavanje agregacije proteina i izvršen je kao što je opisano u Capelle, 2005; Demeule, 2007a. Spektri rasipanja svetlosti od 90° praćeni su na 25°C upotrebom FluoroMaks spektrofluorimetra (Spex, Instruments S.A., Inc. U.K.) provođenjem sinhronog skeniranja (λem=λek) između 400 nm i 750 nm sa vremenom integracije od 0,01 s. Različita podešavanja proreza testirana su kako bi se pronašli optimalni uslovi. Posle optimizacije, ista podešavanja proreza su upotrebljena za sva merenja.

Fluorescentna emisija u stabilnom stanju

[0132] Fluorescentna emisija ostataka triptofana, tirozina i fenilalanina daje informacije o lokalnom okruženju ovih fluorofora. Mere se promene ili razlike u hidrofobnosti i/ili rigidnosti. Tipično, više hidrofobno i rigidno okruženje dovodi do povećanja intenziteta fluorescencije i plavog pomaka emisionog maksimuma. Intrinzična fluorescentna spektroskopija može pružiti informacije o trenutnom stanju proteina i prati promene fizičkih i hemijskih svojstava. Više informacija o fluorescenciji tirozina i triptofana može se naći u knjizi Lakovica [Lakowicz, 2006].

[0133] Fluorescentna emisija i spektri ekscitacije su zabeleženi na 25°C u različitim kvarcnim kivetama. Uzorci su bili ekscitovani na različitim talasnim dužinama. Optimizovana su vremena integracije i podešavanja proreza. Posle optimizacije za sve uzorke primenjena su ista vremena integracije i podešavanja proreza.

Fluorescentna mikroskopija sa Nil crvenim bojenjem

[0134] Postupak bojenja Nil crvenom je razvijen da vizualizuje agregate proteina i izveden je kako je opisano u Demeule et al., 2007b.

[0135] Mikroskopska posmatranja su izvedena na Lajka (Leica) DM RXE mikroskopu (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany) opremljenim živinom lampom. Slike su napravljene Soni (Sony) NEX-5 kamerom i njenim operativnim programom (firmware). Objektivi su bili 10x, 20x i 40x. Za mikroskopska ispitivanja upotrebljene su pločice sa fiksnim rastojanjem od 0,1 mm između pločice i pokrovnog stakalca. Veličina 4x4 rešetki je 1 mm x 1 mm i odgovara 0,1 μl.

1,8-ANS fluorescentna spektroskopija

[0136] 1-anilinonaftalen-8-sulfonska kiselina (1,8-ANS) je nenaelektrisana mala hidrofobna fluorescentna proba (Mw 299,34 Da) koja se upotrebljava za proučavanje površina membrane i proteina.

[0137] 1,8-ANS je u suštini ne fluorescentna u vodi i postaje značajno fluorescentna kada je vezana za membrane (kvantni prinosi ~0,25) ili proteine (kvantni prinosi ~0,7). Ovo svojstvo 1,8-ANS čini je osetljivim indikatorom savijanja proteina, konformacionih promena i drugih procesa koji modifikuju izlaganje probe vodi. Reference za 1,8-ANS mogu se pronaći na internet stranici Molekularnih Proba (Molecular Probes), www.probes.com.

[0138] Spektar fluorescentne emisije 1,8-ANS-a je zabeležen upotrebom FluoroMaks spektrometra. Direktno poređenje 1,8-ANS fluorescencije između IgG-a neće biti izvedeno. Svaki IgG može imati različit broj mesta vezivanja za 1,8-ANS i stoga se ne mogu porediti. U principu, što je niža 1,8-ANS fluorescencija, manje je 1,8-ANS molekula vezano za antitelo. Promene u intenzitetu 1,8-ANS fluorescencije i talasnoj dužini emisije zbog stresa će biti procenjene.

Tabela 16: Pregled različitih rezultata prinudne degradacije na različitim uzorcima IgG nakon razblaživanja do 0,2 mg/ml. Boja ćelija ukazuje na varijacije između T=0 i posle stresa: tamno siva=velika promena, svetlo siva=mala promena i bez boje=nema promene (=stabilno). * „kombi. #“ odnosi se na kombinaciju mutacija navedenih u Tabeli 15; ** vrlo male čestice fluorescentnom mikroskopijom, relevantnost ovih čestica nepoznata; 2d4°C= 2 dana na 4°C; 2d50°C= 2 dana na 50°C; 2w4°C= 2 nedelje na 4°C; 2w40°C= 2 nedelje na 40°C; T0 = početak eksperimenta; 5FT=5 ciklusa zamrzavanja odmrzavanja

[0139] Uzeti zajedno, ovi podaci ukazuju da su različiti IgG uzorci izuzetno stabilni. Ozbiljni stresni uslovi (npr. 2 dana na 50°C) su bili potrebni za generisanje merljivih razlika između testiranih uzoraka. Pod ovim uslovima izgleda da uzorci kombinacija # 9 i # 10 agregiraju više od drugih uzoraka.

[0140] Najdiskriminantniji faktori stabilnosti između proteina su ciklusi zamrzavanjadmrzavanja i povećana temperatura. Uzimajući u obzir veoma strog faktor stresa inkubacije na 50°C, varijante T366K/L351E, Y349E (kombi.#4) i T366K,L351K/L351D,Y349E (kombi.#11) su dva najstabilnija proteina unutar panela, odmah zatim slede T366K,L351K/L351D,Y349D (kombi.#10) i T366K,L351K/L351D,L368E (kombi.#12).

Primer 21: Nativna MS na eksperimentima odnosa; odnosi transfekcije od 1:5 do 5:1

[0141] Da bi postali bolje upoznati sa ponašanjem CH3 mutiranih IgG-a u iskrivljenim transfekcionim smešama, posebno o kombinaciji T366K:L351K/L351D':L368E (od sada pod nazivom KK/DE ili DEKK), sproveden je složeniji eksperiment odnosa.

[0142] Prethodno upotrebljeni VH regioni antitela sa poznatom sposobnošću sparivanja sa zajedničkim lakim lancem IGKV1-39 upotrebljeni su za rekloniranje u konstrukte 1, 2, 68 i 69, što rezultuje vektorima I-V iz Tabele 17. Vektori I-V, koji svi sadrže sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju zajednički humani laki lanac kao i Ig teški lanac sa različitim CH3 regionom i različite antigenske specifičnosti, zatim su transfektovani u ćelije sa različitim odnosima transfekcije kako je naznačeno u Tabeli 18. Rezultati su prikazani na slici 23.

Tabela 17:

Tabela 18:

[0143] Slike 23A i B pokazuju da za DEKK kombinaciju mutacija, kada je prisutan višak A ili C (A ili C su na „DE strani“ i B je na „KK strani“), AB ili BC se formira, ali je višak A ili C prisutan kao smeša oba homodimera i polu tela u svim slučajevima. Međutim, kada je prisutan višak B (B je na „KK strani“ i A ili C su na „DE strani“), postoji jasna razlika. AB ili BC se ipak formira ali višak B je suštinski odsutan jer se formiraju homodimer i samo polu tela. Procenti su ponovo izmereni visinom pika. Imati na umu: pikovi detektovani u rasponu od 2% ili niže su ispod praga onoga što nMS tehnologija kako je primenjena može precizno da meri. Merenja od <2% se stoga smatraju da su unutar nivoa šuma analize i stoga se ignorišu. Zapanjujuće je da višak B rezultuje visokim procentima samo polu tela B. Posebno kod odnosa 1:3 i 1:5 A:B, uočeni su visoki procenti polu tela B (Sl. 23A i 23B) u odsustvu homodimera BB, što ukazuje da CH3 mutacije KK-strane defavorizuju homodimerizaciju. Odsustvo homodimera nudi ključnu prednost, jer ova „KK strana“ DEKK kombinacije može biti izabrana da inkorporira specifičnost koja možda ima štetne efekte kada su prisutni kao homodimeri (na primer poznato je da cMET ili CD3 antitela imaju nepoželjne štetne sporedne efekte kada su prisutni kao bivalentni homodimeri u terapeutskim kompozicijama).

[0144] Uočeni nalazi za različite odnose DE:KK su u suprotnosti sa kontrolnim CH3 mutacijama preokrenutog naelektrisanja u vektorima IV i V. Slika 23C pokazuje da za E356K:D399K/K392D':K409D' kombinaciju mutacija kada je prisutan višak A (A je na „K392D:K409D strani“), višak A je prisutan kao smeša oba homodimera i polu tela u svim slučajevima, ali i kada je prisutan višak B (B je na E356K:D399K strani), višak B je prisutan kao smeša oba homodimera i polu tela u svim slučajevima. Čak i pri višim odnosima 1:3 i 1:5 nisu uočena polutela B iako su prisutni homodimeri, što ukazuje da E356K:D399K strana ne defavorizuje homodimerizaciju tako mnogo kao KK-strana DEKK kombinacije.

[0145] Uzeto zajedno, DEKK kombinacija mutacija nudi jasnu korist nad CH3 mutacijama preokrenutog naelektrisanja, u tome što jedan od lanaca heterodimera ne formira homodimere.

Primer 22: vrste smeša koje upotrebljavaju DEKK kombinaciju

[0146] Kao što je pokazano da DEKK kombinacija mutacija pokreće formiranje bispecifičnih IgG molekula („AB“) visoke čistoće, dalje smo istražili izvodljivost kontrolisane proizvodnje kompleksnijih smeša antitela iz jedne ćelije, kao što su „AB i AA“ ili „AB i AC“ smeše. Prethodno upotrebljeni model Fabovi su inkorporirani u vektore koji sadrže ili „DE konstrukt“ ili „KK konstrukt“ i različite kombinacije ovih vektora su ko-eksprimirane da bi se stvorile smeše, kako bi se pokazala svestranost tehnologije. Model Fabovi MF1337 (tetanus toksoid), MF1122 (fibrinogen) i MF1025 (tiroglobulin) su izabrani na osnovu njihovog ukupnog stabilnog ponašanja, dobrih nivoa ekspresije i razlike u masi između IgG-a koji sadrže ove Fabove (videti Tabelu 19)

Tabela 19:

Tabela 20: Raspored transfekcije:

[0147] SDS-PAGE analiza pokazala je da se većina uzoraka sastojala od pretežno potpunih IgG i u nekim slučajevima polu tela su bila prisutna u malim procentima. Štaviše, mnogi od uzoraka su pokazali dve trake od otprilike 150 kDa na ne-redukujućim gelovima, odražavajući prisustvo dve različite IgG vrste u uzorku. Takođe na redukujućim gelovima, trake dva teška lanca su bile vidljive u nekim uzorcima (podaci nisu prikazani).

[0148] Na svim uzorcima je izvedena nativna MS, a procenti opaženih vrsta su izračunati na osnovu visine pika (% opaženih vrsta u Tabeli 20). Rezultati su prikazani na Slici 24. U svih osam uzoraka gde su ko-eksprimirana tri teška lanca, opažena su dva glavna pika koja odgovaraju očekivanim vrstama. U dva od ovih uzoraka (transfekcije 2 i 4), i u transfekciji 11, mala količina kontaminirajućeg DE-DE homodimera je opaženo. U većini uzoraka u veoma malim količinama otkrivena su polu tela (manje od 2%), koja nisu problematična jer se mogu lako odvojiti od frakcije IgG pune dužine kao što je prethodno diskutovano. Posle nMS otkriveno je da je opažena masa IgG u uzorku 11 odgovarala drugačijim vrstama nego što se očekivalo, i zaključeno je da je to zbog greške u transfekciji, tj. u uzorku 11 očigledno je da je 1025-DE bio ko-transfekovan sa 1337-KK umesto 1122-KK.

[0149] IgG uzorci su dalje testirani u sendvič ELISA da se potvrdi funkcionalno prisustvo poželjnih specifičnosti. Oblaganje ELISA ploča obavljeno je fibrinogenom ili tiroglobulinom i detekcija je izvedena fluorescein-obeleženim tiroglobulinom ili - tetanus toksoidom. Detekcioni antigeni su obeleženi fluoresceinom (Pierce NHS-fluorescin Antibody Labeling kit, cat. # 53029) u skladu sa uputstvima proizvođača. Fluorescein-obeleženi antigeni mogu se posle toga detektovati FITC-konjugovanim anti-fluorescein antitelom (Roche diagnostics, cat. # 11426346910). Rezultati bispecifične ELISA (vrednosti OD450) su sumirani u Tabeli 21. Zasivljene ćelije označavaju očekivane vrste za svaku transfekciju. Uopšteno, rezultati su u skladu sa očekivanim ishodom sa izuzecima gledanja kao što je označeno kurzivom ili podebljano. U transfekcijama 1-3, pretpostavljeni „negativni“ bunarčić za vrste BC (tr. # 1 i 2) ili AC (tr. # 3) pokazao je značajan pozadinski signal. Poznato je iz prethodnih studija da bispecifične ELISA-e mogu patiti od visokih pozadinskih nivoa. Ovi pozadinski nivoi mogu takođe biti uzrokovani potencijalnim prisustvom polu-tela u uzorku. Treba napomenuti da su rezultati bispecifične ELISA zaista potvrdili da je došlo do greške u transfekciji #11, jer je vrsta AC (podebljana vrednost) otkrivena umesto BC.

Tabela 21: OD450 vrednosti iz bispecifične ELISA-e

Primer 23: poboljšane smeše dva bispecifična antitela koja prepoznaju 4 različita epitopa (AB i CD) od jedne ćelije

[0150] U primeru 12 se postavljena je hipoteza da se očekuje da smeše koje rezultuju iz transfekcija ZA ili ZB postanu problematične kada se prenesu na proizvodnju u većim razmerama, jer je prijavljeno da su varijante izbočina-u-udubljenje nestabilne i ne može se isključiti da će CH3 domeni koji sadrže „izbočinu“ ili „udubljenje“ dimerizovati sa CH3 domenima projektovanog naelektrisanja. Kao što je pokazano u gornjim primerima otkriveno je da novi mutanati naelektrisanog para preferencijalno pokreću heterodimerizaciju praktično bez formiranja homodimera, polipeptidni lanci koji sadrže CH3 domen koji sadrže ove nove mutante naelktrisanog para mogu biti eksprimirani u ćelijama zajedno sa prethodno poznatim polipeptidnim lanacima koji sadrže CH3 domen projektovanog naelektrisanja ili potencijalno sa SEED telima, i verovatno će rezultovati preferencijalnim formiranjem samo dva bispecifična molekula.

[0151] Iz gornjih primera bilo je jasno da je DEKK kombinacija mutacija odlična za proizvodnju jednog bispecifika (AB) ili dva bispecifika (AB plus AC) od strane klonalnih ćelija gde se dimerizacija teških lanaca pokreće CH3 domenima. Međutim, upotreba samo jednog vektorskog seta komplementarnih CH3 mutacija ograničava broj mogućnosti različitih smeša koje se mogu proizvesti. Bilo bi moguće proizvesti više složenih smeša IgG i/ili bispecifika, kao što su „AB i CD“ ili „AB i CC“ smeše ako bi mogao da se upotrebi drugi „ortogonalni“ vektorski set u kombinaciji sa DEKK. Kada se kombinuju dva vektorska seta, važan uslov je da teški lanci koji se eksprimiraju iz dva različita seta CH3 projektovanih vektora ne mogu da prave „ukrštene“ dimere, što je da teški lanci proizvedeni jednim od vektorskih setova dimerizuju u potpun IgG sa teškim lancima koji su eksprimirani drugim vektorskim setom.

[0152] Da bi se testiralo takvo potencijalno formiranje „ukrštenih“ dimera, izvršena je in silico analiza upotrebom HADDOCK-a da se dobiju dalji uvidi da li bi se desilo moguće sparivanje između CH3 domena divljeg tipa i CH3 domena koji sadrže DE- ili KK-mutacije. Slično tome, potencijalno sparivanje između CH3 domena divljeg tipa i CH3 domena koji sadrže mutacije E356K, D399K ili K392D,K409D je analizirano, kao i potencijalno sparivanje između CH3 domena divljeg tipa i CH3 domena koji sadrže izbočina-u-udubljenje mutacije i bilo koje kombinacije gore pomenutih. Kombinacije CH3-mutanata koje su analizirane u HADDOCK-u navedene su u Tabeli 22 i dobijeni HADDOCK rezultati su sumirani na Slici 25.

Tabela 22: CH3 varijante analizirane u HADDOCK-u, s jednoslovnim kodovima dodeljenim svakoj CH3-varijanti koju nosi teški lanac. *Lanci divljeg tipa označeni su kao „C“ i „D“ zbog pitanja doslednosti; **Varijante preokrenutog naelektrisanja označene su kao „A i B“ kada su kombinovane sa izbočina-u-udubljenje varijantama, i označene su kao „C i D“ kada su kombinovane sa DE/KK varijantama.

[0153] Slika 25 pokazuje da, na osnovu ovih HADDOCK predviđanja, kombinovanje CH3 kombinacije DEKK sa CH3 kombinacijama preokrnutog naelektrisanja najverovatnije će biti uspešno u formiranju poželjne kombinacije dva bispecifika (AB i CD) bez kontaminacije sporednim proizvodima (posebno AC, AD, BC, BD) kada se ko-transfektuju u jednoj ćeliji. Kao što se može videti sa slike 25, ove nepoželjne bispecifične vrste AC, AD, BC, i BD imaju relativno visoke HADDOCK rezultate, dok poželjne AB i CD vrste imaju najniže HADDOCK rezultate. Naravno, kada će ili CH3 kombinacije DEKK ili preokrenuto naelektrisanje biti stavljene u konstrukt koji nosi istu specifičnost (npr. „C“ na DE-strani, „C“ na KK-strani, „A“ na E356K, D399K-strani i „B“ na E356K,D399K-strani, ili „A“ na DE-strani, „B“ na KK-strani, „C“ na E356K,D399K-strani i „C“ na E356K,D399K-strani) ovo će rezultovati proizvodnjom pretežno CC i AB nakon ko-ekspresije u ćeliji.

[0154] Nasuprot tome, kada se pogledaju predviđanja za ko-ekspresiju DEKK-a sa divljim tipom, može se videti da su HADDOCK rezultati za AC i AD niži od HADDOCK rezultata za CD, što ukazuje da su AC i AD veoma mogući kontaminanti kada se pokuša da se proizvede smeša AB i CD ko-ekspresijom vektora koji kodiraju za CH3 kombinacije DEKK zajedno sa vektorima koji kodiraju divlji tip CH3. Na kraju, predviđanja za ko-ekspresiju ili DEKK ili varijanti preokrenutog naelektrisanja zajedno sa varijantama izbočina-u-udubljenje rezulturaju u nepoželjnim bispecifičnim varijantama sa relativno niskim HADDOCK rezultatima, tj. velika je verovatnoća da će ove nepoželjne vrste biti proizvedene nakon koekspresije.

[0155] Tako je zaključeno da je kombinovanje CH3 kombinacija DEKK sa CH3 kombinacijama preokrenutog naelektrisanja (E356K,D399K/K392'D,K409D') idealno pogodno za dobijanje u suštini čistih „AB i CD“ i/ili „AB i CC“ smeša antitela.

[0156] Sledeće, smeše 2 bispecifika koji prepoznaju 4 cilja/epitopa (AB i CD) i smeše jednog bispecifičnog i 1 monospecifičnog antitela koje prepoznaju 3 cilja/epitopa (AB i CC) su stvorene stavljanjem gore navedenog u praksu. Ove smeše su stvorene upotrebom 4 različita VH-a koji su svi sposobni za sparivanje sa zajedničkim lakim lancem IGVK1-39, ali pojedinačne VH/VL kombinacije sve imaju različite specifičnosti. Da bi se omogućila nativna MS analiza, razlika masa između (očekivanih) vrsta mora biti dovoljna, tj. > 190 Da. Izabrana su četiri pojedinačna VH-a i njihove mase su bile takve da se očekivane vrste nakon kotransfekcije mogu identifikovati i razdvojiti pomoću nMS. Štaviše, razlike u masi između 4 odabrana VH-a su takođe dovoljno velike da se identifikuje većina mogućih kontaminanata u smešama, pored dve poželjne vrste. Izabrani VH-i su navedeni u Tabeli 23.

Tabela 23:

[0157] Četiri različita VH-a su klonirana u vektore koji sadrže „DE“ ili „KK“ konstrukte ili konstrukte peokrenutog naelektrisanja, i nekoliko ko-transfekcija je izvedeno kao što je naznačeno u Tabeli 24. NB: kao uvek, svi vektori su takođe sadržali nukleinsku kiselinu koja kodira zajednički laki lanac IGKV1-39. Kao što je prethodno naznačeno, kada se kombinuju dva vektorska seta, važan uslov je da teški lanci koji se eksprimiraju iz dva različita seta CH3 projektovanih vektora ne mogu da prave „ukrštene“ dimere, što je da teški lanci proizvedeni jednim od vektorskih setova dimerizuju u potpun IgG sa teškim lancima koji su eksprimirani drugim vektorskim setom. Da bi se testiralo takvo potencijalno formiranje „ukrštenih“ dimera između teških lanaca koji sadrže mutacije preokrnutog naelektrisanja i teških lanaca koji sadrže DE ili KK mutacije, kontrolne transfekcije su izvršene.

Tabela 24:

[0158] Tabeli 25 pruža dalji pregled masa očekivanih vrsta, i mogućih kontaminanata, transfekcija # 9-11 iz Tabele 24.

Tabela 25: Za svaku od transfekcija # 9-11, vrste su sortirane po masi, razlika u masi je računata sa masom iznad. Sive ćelije: očekivane (i poželjne) vrste; kurzivi: razlika u masi suviše mala da se razdvoji u nMS analizi. *Vrste: jedno slovo predstavlja polu-tela; kod sa dva slova intaktan IgG.

[0159] Svi prečišćeni proteinski uzorci dobijeni iz transfekcija # 1-11 analizirani su SDS-PAGE, i uključena su tri kontrolna uzorka (Slika 26). Pored toga, nMS analiza je izvedena na proteinskim uzorcima iz transfekcija # 9-11 za identifikaciju svih vrsta u uzorcima. Kao što se može videti sa Slike 26, transfekcije # 3 i # 4 rezultovale su očekivanom pogrešnom poredivošću između „KK“ konstrukata i bilo „E356K:D399K“ ili „K392D:K409D“ i količina polu tela u proteinskim uzorcima iz ovih transfekcija prelazila je količinu potpunih IgG molekula. Transfekcije # 7 i # 8 rezultovale su proteinskim uzorcima gde su oba, polu tela i potpuni IgG, prisutni u približno jednakim količinama. Međutim, iz SDS-PAGE ne može se zaključiti da li potpuni IgG predstavlja DE/DE dimer, DE/E356K:D399K dimer ili DE/K392D:K409D dimer. Značajno je da praktično nijedno polu telo nije opaženo u uzorcima iz transfekcija # 9-11.

[0160] Na Slici 27, prikazana je nMS analiza transfekcija # 9 i # 11. Procenti očekivanih vrsta i kontaminirajućih vrsta su izračunati po visini pika. Pokazano je da su u transfekciji # 9 očekivane vrste „AB i CD“ zastupljene sa 97% u smeši (30% AB i 67% CD), dok je samo tako malo od oko 3% kontaminirajućeg BD prisutno (Slika 27A). U transfekciji # 11, očekivane vrste „AB i CC“ zastupljene su sa 94% u smeši (33% AB i 61% CC), dok je samo tako malo od oko 6% kontaminirajućih BC (4,1%) i AC (1,8%) prisutno (Slika 27B). Ovi podaci pokazuju da je zaista moguće proizvesti više složenih smeša IgG-a i/ili bispecifika, kao što su „AB i CD“ ili „AB i CC“ smeše kada se koristi drugi „ortogonalni“ vektorski set u kombinaciji sa DEKK. Kombinacija konstrukata preokrenutog naelektrisanja zajedno sa DEKK konstruktima rezultuje u samo veoma ograničenom formiranju „ukrštenih“ dimera. Podešavanjem odnosa transfekcije očekuje se da se niski procenti ovih kontaminirajućih sporednih proizvoda mogu još više smanjiti.

Primer 24: farmakokinetičke studije jedne doze na miševima

[0161] Za proučavanje farmakokinetičkog (pK) ponašanja bispecifičnih antitela koja nose DEKK kombinaciju mutacija u svojim CH3 regionima, u ovoj studiji su određeni i upoređeni pK parametri za tri različite serije IgG.

[0162] Tri IgG serije su uključivale 1) anti-tetanus toksoid roditeljsko antitelo divljeg tipa 1337:1337 (dva MF1337 Faba na Fc okosnici divljeg tipa); 2) anti-tetanus toksoid roditeljsko antitelo divljeg tipa 1516:1516 (dva MF1516 Faba na Fc okosnici divljeg tipa); 3) CH3 projektovano bispecifično anti-tetanus toksoid antitelo 1516:1337 koje nosi DEKK kombinaciju mutacija u svom Fc regionu (MF1516 Fab na DE-strani, MF1337 Fab na KK-strani).

[0163] Roditeljska antitela 1337:1337 i 1516:1516 su izabrana kao specifičnosti koje treba da budu uključene u DEKK-bispecifični proizvod, jer je bilo poznato na osnovu prethodnih studija da serumski odgovor pre doziranja prema ovim antitelima nije bio prisutan u nekoliko sojeva miševa. NB: prisustvo serumskog odgovora pre doziranja bi, naravno, poništilo studiju. Pored toga, postoji dovoljna razlika u masi između roditeljskih antitela da omogući identifikaciju 1337:1337 (wt Fc), 1516:1337 (DEKK Fc) i 1516:1516 (wt Fc) vrsta pomoću nMS. Pripremljene su tri IgG serije kao što je prethodno opisano, ali DNK upotrebljena za transfekciju je napravljena upotrebom bez-endo maksiprep kompleta (endo-free maxiprep kit) da se osigura da količina endotoksina bude što je moguće niža. Serije su zatim testirane na koncentraciju proteina, nivoe agregata, nivoe endotoksina i procenat bispecifičnog proizvoda. Pokazano je da su kriterijumi prihvatljivosti za naknadnu upotrebu IgG serija u pK studiji zadovoljena, tj. IgG koncentracija nakon gel filtracije bila je >0,3 mg/ml, nivoi agregata bili su <5%, nivoi endotoksina bili su <3 EU/mg proteina i DEKK serija je sadržala > 90% bispecifičnih IgG. Nativna masena spektrometrija gel filtriranih uzoraka pokazala je da su očekivane vrste prisutne u visokim procentima. U uzorku 1516:1337 detektovana je mala količina DE:DE homodimera, koji se procenjuje na oko 2% (Slika 28). Zaključeno je da su 3 IgG serije kvalifikovane za upotrebu u pK studiji.

[0164] Za poređenje pK parametara između tri serije, 3 grupe ženki C57BL/6J miševa (Harlan, Holandija) su dozirani sa 1 mg/kg humanog IgG (5 ml/kg rastvora imunoglobulina/kg telesne mase). U vreme doziranja, životinje su bile starosti između 7-8 nedelja i imale su telesnu masu od oko 18-20 grama. Uzeti su uzorci krvi pre doziranja i 15, 60 minuta, i 2, 4, 8, 24, 48, 96, 168, 268 i 336 h posle doziranja. Pripremljeni su uzorci seruma i čuvani na < -20 °C do analize. Svaka grupa se sastojala od 3 podgrupe od 4 miša, tj.

12 miševa/grupi. Iz svakog miša je uzorkovano 6 vremenskih tačaka. Dobrobit životinja održavana je u skladu sa opštim principima koji regulišu upotrebu životinja u eksperimentima Evropske zajednice (European Communities) (Direktiva 86/609/EEC) i holandskim zakonodavstvom (Ukaz o eksperimentima na životinjama, 1997 (The Experiments on Animals Act, 1997)). Ova studija je takođe izvedena u skladu sa Standardima humane brige i upotrebe laboratorijskih životinja, kako je izdala Kancelarija za dobrobit laboratorijskih životinja Američkog nacionalnog instituta za zdravlje (U.S. National Institutes of Health) pod identifikacionim brojem 45859-01 (datum isteka: 30. april 2015).

[0165] Miševi grupe 1 primili su monospecifično IgG 1516:1516 antitelo pune dužine (trouglovi); Miševi grupe 2 primili su monospecifično IgG 1337:1337 antitelo pune dužine (kvadrati); Miševi grupe 3 primili su bispecifično IgG 1516:1337 antitelo pune dužine (dijamanti), sa DEKK projektovanim CH3 regionima (1516 na DE-strani i 1337 na-KK strani).

[0166] ELISA test je primenjen za kvantitativnu analizu monoklonalnih humanih antitela u mišijem serumu upotrebom kvantitativnog humanog IgG ELISA (ZeptoMetrix, NY USA; ELISA kit br. 0801182). Ukratko, ELISA test je zasnovan na principu da se humano monoklonalno antitelo vezuje za anti-humani IgG kojim je obložena ELISA ploča sa 96 bunarčića. Vezano antitelo je posle toga vizualizovano upotrebom poliklonalnog antihumanog IgG antitela konjugovanog sa peroksidazom rena (HRP). Optička gustina (OD) svakog bunarčića je direktno proporcionalna količini antitela u uzorku seruma. Rezultati su prikazani na Slici 29, i primećeno je da su serumski nivoi oba, bispecifičnog IgG antitela pune dužine koji nosi DEKK kombinaciju mutacija i njegovih roditeljskih monospecifičnih antitela zapanjujuće slični. Zaključeno je da CH3 mutacije koje su prisutne u DEKK-bispecifičnom antitelu ne menjaju stabilnost ni polu život, i DEKK varijanta se ponaša kao IgG divljeg tipa.

Reference

[0167]

Deisenhofer J., Biochemistry 1981(20)2361-2370;

Miller S., J. Mol. Biol.1990(216)965-973;

Padlan, Advances in Protein Chemistry 1996 (49) 57-133

Ellerson JR., et al., J. Immunol 1976 (116) 510-517;

Lee and Richards J. Mol. Biol.1971(55)379.

Gunasekaran et al J.Biol.Chem.2010(285)19637-19646

De Vries Nature Protocols 2010(5)883

Kabat et al, (1991)

Mammalian Cell Biotechnology : a Practical Approach (M. Butler, ed., IRL Press, 1991

Merchant Nature biotechnology 1998(16)677

Ridgeway Protein Engineering 1996(9)617-621.

Davis JH. Et al., Protein Engineering, Design & Selection 2010(23)195-202

Papadea and Check. Crit Rev Clin Lab Sci.1989;27(1):27-58.

Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973)

Ionescu et al., J. Pharm. Sci.2008 (97)1414)

Current protocols in Protein Science 1995, coligan JE et al., Wingfield PT, ISBN 0-471-1184-8, Bendig 1988.

Capelle, M.A.H., Brugger, P., Arvinte, T. Vaccine 23 (2005), 1686-1694.

Demeule, B., Lawrence, M.J., Drake, A.F., Gurny, R., Arvinte, T. Biochim. Biophys. Acta 1774 (2007a), 146-153.

Demeule, B., Gurny, R., Arvinte, T., Int. J. Pharm 329 (2007b), 37-45.

Lakowicz, J.R., Principles of fluorescence spectroscopy; Second Edition Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, Boston, Dordrecht, London, Moscow, (2006) ISBN 0-306-46093-9.

Claims

Patentni zahtevi

1. Postupak za proizvodnju najmanje dva različita antitela od jedne ćelije domaćina, naznačen time što svaki od navedena dva antitela sadrži dva CH3 domena koja su sposobna da formiraju interfejs, pri čemu pomenuti postupak sadrži obezbeđivanje u pomenutoj ćeliji

a. prvog molekula nukleinske kiseline koji kodira prvi polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen humanog IgG koji sadrži lizin (K) ostatak na aminokiselinskom položaju 366 prema EU sistemu numeracije,

b. drugog molekula nukleinske kiseline koji kodira drugi polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen humanog IgG, koji sadrži ostatak asparaginske kiseline (D) na aminokiselinskom položaju 351 prema EU sistemu numeracije,

c. trećeg molekula nukleinske kiseline koji kodira treći polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen i

d. četvrtog molekula nukleinske kiseline koji kodira četvrti polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen,

pri čemu navedeni postupak dalje sadrži korak kultivacije navedene ćelije domaćina i omogućavanja ekspresije navedena najmanje četiri molekula nukleinske kiseline i sakupljanja navedena najmanje dva različita antitela iz kulture.

2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, koji dalje sadrži obezbeđivanje pomenute ćelije domaćina sa molekulom nukleinske kiseline koji kodira zajednički laki lanac.

3. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačen time što pomenuti prvi polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen dalje sadrži ostatak lizina (K) na aminokiselinskom položaju 351 u skladu sa EU sistemom numeracije.

4. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili 2 ili 3, naznačen time što pomenuti drugi polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen dalje sadrži ostatak glutaminske kiseline (E) ili ostatak asparaginske kiseline (D) na aminokiselinskom položaju 349 u skladu sa EU sistemom numeracije, i/ili ostatak glutaminske kiseline (E) na aminokiselinskom položaju 368 u skladu sa EU sistemom numeracije.

5. Postupak prema patentnom zahtevu 4, naznačen time što pomenuti drugi polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen dalje sadrži ostatak glutaminske kiseline (E) na aminokiselinskom položaju 368 u skladu sa EU sistemom numeracije.

6. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, naznačen time što navedeni treći polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen sadrži lizinski (K) ostatak na aminokiselinskom položaju 356 prema EU sistemu numeracije i lizinski (K) ostatak na aminokiselinskom položaju 399 prema EU sistemu numeracije, i navedeni četvrti polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen sadrži ostatak asparaginske kiseline (D) na aminokiselinskom položaju 392 prema EU sistemu numeracije i ostatak asparaginske kiseline (D) na aminokiselinskom položaju 409 prema EU sistemu numeracije.

7. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, naznačen time što svaki od polipeptidnih lanaca koji sadrže CH3 domen dalje sadrži varijabilni region koji prepoznaje ciljni epitop.

8. Postupak prema patentnom zahtevu 7, naznačen time što svaki od 4 varijabilna regiona od 4 polipeptida lanca koji sadrže CH3 domen prepoznaje različite ciljne epitope.

9. Postupak prema patentnom zahtevu 7, naznačen time što varijabilni regioni prvog i drugog polipeptidnog lanca koji sadrže CH3 domen prepoznaju različite ciljne epitope, pri čemu varijabilni regioni trećeg i četvrtog polipeptidnog lanca koji sadrže CH3 domen prepoznaju iste ciljne epitope.

10. Postupak prema patentnom zahtevu 9, naznačen time što je ciljni epitop koga prepoznaju varijabilni regioni trećeg i četvrtog polipeptidnog lanca koji sadrži CH3 domen isti kao ciljni epitop koga prepoznaje varijabilni region prvog ili drugog polipeptidnog lanca koji sadrži CH3 domen.

11. Postupak prema patentnom zahtevu 9, naznačen time što je ciljni epitop koga prepoznaju varijabilni regioni trećeg i četvrtog polipeptidnog lanca koji sadrži CH3 domen različit od ciljnog epitopa koga prepoznaje varijabilni region prvog ili drugog polipeptidnog lanca koji sadrži CH3 domen.

12. Postupak prema patentnom zahtevu 7, naznačen time što varijabilni regioni prvog i drugog polipeptidnog lanca koji sadrže CH3 domen prepoznaju isti ciljni epitop, dok varijabilni regioni trećeg i četrvtog polipeptidnog lanca koji sadrže CH3 domen prepoznaju drugi ciljni epitop koji se razlikuje od ciljnog epitopa koga prepoznaju navedeni prvi i drugi varijabilni region.

13. Smeša najmanje dva različita antitela koja se može dobiti pomoću postupaka prema bilo kom od patentnih zahteva 1-12.

14. Rekombinantna ćelija domaćin koja sadrži sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju najmanje dva različita antitela, naznačena time što svako od navedena dva antitela sadrži dva CH3 domena koji su sposobni da formiraju interfejs, pri čemu navedene sekvence nukleinskih kiselina kodiraju najmanje prvi, drugi, treći i četvrti polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen, pri čemu navedeni prvi polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen sadrži CH3 domen humanog IgG koji sadrži lizin (K) ostatak na aminokiselinskom položaju 366 prema EU sistemu numeracije i pri čemu navedeni drugi polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen sadrži CH3 domen humanog IgG koji sadrži ostatak asparaginske kiseline (D) na aminokiselinskom položaju 351 prema EU sistemu numeracije.

15. Farmaceutska kompozicija koja sadrži najmanje dva različita antitela prema patentnom zahtevu 13 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

16. Postupak za pripremu ćelije domaćina za proizvodnju najmanje dva različita antitela, pri čemu postupak sadrži korak uvođenja u navedenu ćeliju domaćina sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju najmanje prvi, drugi, treći i četvrti polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen, pri čemu navedeni prvi polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen sadrži CH3 domen humanog IgG koji sadrži lizinski (K) ostatak na aminokiselinskom položaju 366 prema EU sistemu numeracije i pri čemu navedeni drugi polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen sadrži CH3 domen humanog IgG koji sadrži ostatak asparaginske kiseline (D) na aminokiselinskom položaju 351 prema EU sistemu numeracije, pri čemu navedene sekvence nukleinske kiseline su uvedene uzastopno ili istovremeno.

17. Rekombinantne ćelije domaćini prema patentnom zahtevu 14, ili rekombinantne ćelije domaćini dobijene pomoću postupka prema patentnom zahtevu 16, koje proizvode najmanje dva različita antitela.