SE448060B - Forfarande for inkapsling av ett kernmaterial inom ett selektivt permeabelt membran samt kapsel - Google Patents

Description

25 30 35 448 usa 2 som bevarar biologiska materials ömtåliga funktionsför- fäl måga, finns emellertid inget förslag på att levande väv- nad kan bli inkapslad. tg*- Inkapslade levande celler, organeller eller vävnader har många potentiella användningar. Exempelvis kan det inom ett selektivt permeabelt membran inkapslade levande materialet bevaras i en permanent steril omgivning och _kan skyddas mot direkt kontakt med stora, potentiellt de- struktiva molekylarter, medan fri passage av lågmolekylära vävnadsnutrientia och metaboliska produkter tillåtes.

Sålunda kunde utvecklingen av sådan inkapslingsteknik leda till system för alstring av användbara hormoner såsom insulin. I sådana system skulle den däggdjursvävnad, som är ansvarig för alstringen av materialet, inkapslas på ett sådant sätt att fri passage av nutrientia och meta* boliska produkter genom membranet tillåtes, medan passage av bakterier förhindras. Om membranpermeabiliteten kunde regleras, är det möjligt att detta angrepp på problemet även kunde leda till artificiella organ som skulle kunna implanteras i en däggdjurskropp, t ex en diabetiker, utan avstötning och med reglerad hormonfrigöring, t ex insulin-_ frigöring, styrd av glukoskoncentration.

Olika försök har gjorts att framställa artificiella organ lämpliga för implantation i däggdjurskroppar genom tillhandahållande av en mekanisk, selektivt permeabel spärr, t ex en Millipore-diffusionskammare eller en kapillärrör- kammare, kring vävnad som exciderats från en donator.

Sådana artificiella organ erfordrar normalt kirurgisk implantation. Därtill isolerar däggdjurskropparnas skydds- mekanismer implantatet, typiskt genom tilltäppning av porer genom överväxning av fibroblaster.

Sammanfattning av uppfinningen Föreliggande uppfinning erbjuder ett sätt att inkapsla 43,1 kärnmateríal, såsom levande vävnad, individuella celler eller biologiskt aktiva material, i ett semipermeabelt 11)- membran. Grundprincipen innebär suspendering av den vävnad som ska inkapslas i ett fysiologiskt kompatibelt medium, vd 10 015 20 25 30 35 448 060 3 'vilket innehåller en vattenlöslig substans som kan göras olöslig i vatten, dvs gelas, för att tillhandhålla en 7 temporär, skyddande omgivning för vävnaden. Mediet formas därefter till små droppar, som innehåller vävnaden och gelas, exempelvis genom att betingelserna för temperatur, pH eller jonisk omgivning förändras. De sålunda bildade "temporära kapslarna" underkastas sedan en behandling, vilken kan vara en känd behandling, som resulterar i fram- ,stä1lningen av membraner med en reglerad permeabilitet (inbegripet impermeabilitet) kring de formbevarande tempo- rära kapslarna. _ Uppfinningen avser sålunda ett förfarande för inkaps- .ling av ett kärnmaterial inom ett selektivt permeabelt membran utan att kärnmaterialet påtagligt skadas, vilket förfarande innefattar A. att kärnmatcrialet sättes till en lösning av en vatten- löslig substans, som kan gelas till bildning av en samman- hängande, formbevarande massa; I B. att lösningen formas till droppar; C. att dropparna gelas till bildning av fristående, form- bevarande.massor;'och D. att ett selektivt permeabelt membran bildas omkring de formbevarande massorna genom tvärbindning eller poly- 'addition av ytskikten hos de formbevarande massorna.

Uppfinningen avser vidare en kapsel som omfattar ett selektivt permeabelt membran, som avgränsar ett inre kapsel- utrymme, vilket innehåller en eller flera livsdugliga, friska, levande celler, som har förmåga att undergå meta- bolism, varvid membranet omfattar en polysackarid med ett flertal anjoniska grupper, som är saltbundna till en poly- mer, som har ett flertal katjoniska grupper.

De temporära kapslarna kan tillverkas från vilken som helst icke toxisk, vattenlöslig substans, som kan gelas till bildning av en formbevarande massa genom förändring av betingelserna i mediet i vilket den är placerad, och omfattar även ett flertal grupper som lätt joniseras till bildning av anjoniska eller katjoniska grupper. Närvaron 10 15 pm 25 w' 35 448 Û60i 4 av sådana grupper i polymeren möjliggör att kapselns yt- skikt kan tvärbindas för att ge ett "permanent" membran, när de exponeras för polymerer som innehåller multipla funktionaliteter med den motsatta laddningen.

Det för närvarande föredragna materialet för bild- ning av de temporära kapslarna är polysackaridgummin, antingen naturliga eller syntetiska, av den typ som kan a) gelas för att bilda en formbevarande massa genom att de utsätts för en förändring av betingelserna, såsom en pH-ändring, eller genom att de utsätts för multivalenta _katjoner såsom Ca++; och b) permanent "tvärbindas" eller härdas av polymerer, som innehåller reaktiva grupper, såsom amin- eller imin-grupper, vilka kan reagera med sura poly- fsackaridbeståndsdelar. Det för närvarande föredragna gummit är alkalimetallalginat. Andra vattenlösliga gummin som kan användas inbegriper guargummi, gummi arabicum, karragen, pektin, dragantgummi, xantangummi eller sura fraktioner därav. När man inkapslar termiskt svårarbetade material kan gelatin eller agar användas i stället för gummi.

Den föredragna metoden att bilda de små dropparna är att tvinga gummi-nutrientia-vävnadssuspensionen genom ett vibrerande kapillärrör, som är placerat inom centrum av den virvel, som skapats genom snabb omröring av en lösning av en multivalent katjon. Droppar som utkastas från kapillärens-spets kommer omedelbart i kontakt med lösningen och gelar som sfäroidiska, formade kroppar. _ Den föredragna metoden att bilda ett permanent selek- tivt permeabelt membran kring de temporära kapslarna är att "tvärbinda"_ytskikt hos ett gelat gummi av den typ som har fria syragrupper med polymerer som innehåller syrareaktiva grupper, såsom amin- eller imingrupper. Detta göres typiskt i en utspädd lösning av den utvalda poly- merenl Allmänt gäller att ju lägre polymerens vikt är desto större är penetrationen in i den temporära kapselns yta och ju större penetreringen är, desto mindre permeabelt är det resulterande membranet. Permanenta tvärbindningar alstras som en konsekvens av saltbildning mellan tvärbind- W, p 10 -15 020 '25 30 35 448 060 5 ningspolvmerens syrareaktiva grupper och polysackaridgummits syragrupper. Inom vissa gränser kan semipermeabilitet reg- leras genom inställning av tvärbindningspolymerens molekyl- vikt, dess koncentration och reaktionstiden. Tvärbindnings- polymerer som har använts med framgång inbegriper poly- etylenimin och polylysin. Molekylvikten kan variera, be- .roende på den erfordrade graden av permeabilitet, mellan ca 3 000 ooh 100 000 eller mera. Goda resultat har er- 7 hållits med användning av polymerer som har en medelmole- kylvikt_i storleksordningen 35 000. _ Kapslarna kan anordnas att ha ett utvalt in vivo användbart liv genom skarpsinnigt val av tvärbindnings~ polymeren. Proteiner eller polypeptidbryggbildare, t ex polylysin, angrips lätt in vivo, vilket leder till rela- tivt snabb förstörelse av membranet. Bryggbildare som inte lätt digereras i däggdjurskroppar, t ex polyetylenimin, leder till membraner som-varar längre. Genom att utvälja tvärbindningspolymeren eller genom tvärbindning samtidigt eller i följd med två eller flera sådana material, är det möjligt att förvälja den tidsperiod som den implanterade vävnaden förblir skyddad. 7 Med vissa material, som använts för bildning av de -temporära kapslarna, är det valfritt möjligt att förbättra massöverföring inom kapseln efter bildningen av det per- manenta membranet genom återinställning av de betingelser under vilka materialet är i vätskeform, t ex avlägsnande av den multivalenta katjonen. Detta kan göras genom jon- byte, t ex nedsäkning i fosfatbuffrád fysiologisk salt- lösning eller citratbuffert. I vissa situationer, såsom när det är önskvärt att bevara den inkapslade vävnaden eller när den temporära, gelade kapseln är permeabel, kan det-vara lämpligt att lämna det.inkapslade gummit i det tvärbundna, gelade tillståndet; _En alternativ metod för mombranbildninq inbegriper gen gränsytpolykondensation eller polyaddition lika det förfarande som beskrivits i US patentansökan serie nr 606,l66. Detta angreppssätt innebär framställning av en 10 15 izo 25 30 35 i44s 060' 6 suspension av temporära kapslar i en vattenhaltig lösning av den vattenlösliga reaktionskomponenten av ett par kom- plementära monomerer, som kan bilda en polymer. Därefter suspenderas den vattenhaltiga fasen i en hydrofob vätska, i vilken den komplementära reaktionskomponenten är löslig.

När den andra reaktionskomponenten sättes till tvåfassys- _ temet sker polymerisationen vid gränsytan. Permeabiliteten kan regleras genom reglering av tillsatsen av det hydrofoba lösningsmedlet och koncentrationen av reaktionskomponen- terna. Ett ytterligare annat sätt att bilda ett selektivt permeabelt membran är att inbegripa en mängd av protein i den temporära kapseln, som därefter kan tvärbindas i ytskikten genom exponering för en lösning av ett tvärbind- ningsmedel såsom glutaraldehyd. _ _ V Det föregående förfarandet har använts för inkapsling av livsdugliga Langerhans' cellöar, vilka, i ett medium l som innehåller nutrientia och andra material som är nöd- vändiga för att upprätthålla livsduglighet och understödja in vitro metabolism hos vävnaden, avsöndrar insulin i närvaro av glukos. Inkapslad vävnad har bibehållits i ett livsdugligt tillstånd under 3 månader. Även leverceller har inkapslats och har visats vara i ett fysiologiskt aktivt tillstànd.

Föreliggande uppfinning erbjuder även en vävnadsim- plantationsmetod, som inte erfodrar kirurgiskt ingrepp och som övervinner många av immunavstötningsproblemen.

I enlighet med uppfinningen injiceras kapslarna in i ett lämpligt ställe i en däggdjurskropp och fungerar normalt tills vävnaden dör eller tills naturliga kroppsprocesser lyckas isolera kapslarna så,att substanser, som krävs för att vävnaden_skall leva, ej längre finns tillgängliga.

Vid detta skede kan färsk vävnad med lätthet tillhanda- hållas genom en annan injektion, eftersom kirurgiskt in- grepp inte erfordras för implantationen. Däggdjurskroppen kan följaktligen tillföras vävnadens specialiserade funk- tion så länge som önskas. 10 is 20 25 .30 35 448 060 7 I en föredragen utföringsform av uppfinningen inkaps- las däggdjurs Langerhans' cellöar eller cellöpreparat, som innehåller utvalda mängder av alfa-, beta- och/eller deltaceller från cellöar, i polylysin- och polyetylenimin- tvärbundna alginatmembraner. Dessa kan periodiskt inji- ceras, t ex in i en diabetisk däggdjurskropps peritoneal- håla och fungera som en artificiell pankreas.

I I Följaktligen är ett primärt föremål för uppfinningen att åstadkomma en metod för inkapsling av levande celler,_ organeller eller vävnad i ett membran, som är permeabeltg för nutrientia och andra substanser, som krävs för upprätt- hållande och metabolism samt för metaboliska produkter, men impermeabelt för bakterier och för substanser med en molekylvikt över en utvald nivå, för att på så sätt ute- I sluta agens, som är ansvariga för immunologisk avstötning av den främmande vävnaden. Andra föremål för uppfinningen inbegriper ombesörjande av inkapslad levande vävnad, som är användbar för alstring av hormoner, såsom insulin, och för utförande av komplexa kemiska förändringar, som är karakteristiska för in vivo vävnaden, för tillhandahållande av ett insulinalstrande system, för tillhandahållande av ett kroppsvätskeavgiftningssystem och för tillhandahållande av inkapslat aktivt kol. I I Tillämpningar av uppfinningen är att erbjuda en metod för implantation av levande vävnad i däggdjurskroppar och en icke kirurgisk vävnadsimplantationsteknik. Ytterligare _en annan tillämpning av uppfinningen är att erbjuda en metod för inkapsling av levande vävnad, vilken medger tillverkning av kapslar med ett högt förhållande ytarea till volym och membraner med en förutbestämd in vivo uppe- hållstid, En annan tillämpning uppfinningen är att till- handahålla en artificiell pankreas.

Dessa och andra tillämpningar av och särdrag hos upp- finningen framgår ur den följande beskrivningen av vissa föredragna utföringsformer och ur ritningen.

Kort beskrivning av ritningen Ritningen visar schematiskt en föredragen metod för 10 l5 20 25 30' 35 n! 443 oeu '8 .inkapsling av levande vävnad, lämplig för användning i _\ sättet enligt uppfinningen, och mikrokapselprodukten.

Beskrivning av föredragen utföringsform , Vävnaden, organellen eller cellen som skall inkapslas prepareras i enlighet med tidigare välkända tekniker i finfördelad form och suspenderas i ett vattenhaltigt medium, som är lämpligt för upprätthållande och för stödjande av de pågående metaboliska processerna hos den ifrågavarande särskilda vävnaden. För detta ändamål lämpliga medier är kommersiellt tillgängliga. Genomsnittsdiametern hos mate- rialet som skall inkapslas kan vidsträckt variera mellan mindre än l pm till flera mm. Däggdjurs hangerhans' cellöar har typiskt 140 - 200 pm diameter. Naturligtvis kan indi- viduella celler, såsom pankreas beta-celler, alfa-celler, delta-celler eller olika förhållanden därav, hela Langer- hans' cellöar, individuella hepatocyter, organeller eller' andra vävnadsenheter inkapslas efter behov. Även mikroorga- nismer kan inkapslas, såväl som icke-levande material som biologiska material.

Fortgående livsduglighet hos sådant levande material beror bl a på tillgängligheten av erfordrade nutrientia,' syreöverföring, frånvaro av toxiska substanser i mediet och mediets pH. Hittills har det inte varit möjligt att upprätthålla sådant levande material i en fysiologiskt kompatibel omgivning medan samtidig inkapsling utförts.

Problemet har varit att de för membranframställning erford- rade betingelserna har varit letala eller skadliga för vävnaden, och ingen membranbildningsmetod har varit väntad där vävnaden_kan överleva i ett friskt tillstånd. Man har nu upptäckt att vissa vattenlösliga substanser, som är fysiologiskt kompatibla med levande vävnad och kan göras vattenolösliga för att bilda en formbevarande, samman- g.. hängande massa, kan användas för bildning av en "temporär kapsel" eller ett skyddat spärrskikt kring vävnadspartiklar.

Ett sådant material sättes, typiskt vid låg koncentration, 7 ¿ till vävnadskulturmediet. Lösningen formas sedan till drop- par, som innehåller vävnaden tillsammans med dess uppe~l 10 15 20 25 Vw 35 448 060 9 hållesmedium och göres sedan omedelbart vattenolöslig och gelas, åtminstone i ett ytskikt. Därefter ges den formbe~ varande temporära kapseln ett permanent selektivt permeabelt membran. Om materialet som används för bildning av den temporära kapseln tillåter, kan kapselinnanmätet återföras till vätska efter bildningen av det permanenta membranet.

Detta göres genom återupprättande av de betingelser i mediet, 7 vid vilka materialet är lösligt.

Det för bildning av de temporära kapslarna använda "materialet kan vara vilket som helst icke-toxiskt, vatten- "lösligt material som, vid förändring av den omgivande tem~ _ peraturen, pH eller jonomgivningen eller ekoncentrationen, 'kan överföras till en formbevarande massa. Företrädesvis innehåller materialet även ett flertal lätt joniserade grupper, t ex karboxyl- eller aminogrupper, vilka kan rea? . gera genom saltbildning med polymerer som innehåller ett flertal grupper som joniserar till bildning av grupper med motsatt laddning. Såsom nedan kommer att förklaras 7 möjliggör denna typ av material avsättning av ett perma- nent membran med en utvald porositet och en utvald in vivo 'livslängd på den temporära kapselns ytskikt. _ _De för närvarande föredragna materialen för bildning av de temporära kapslarna är vattenlösliga, naturliga eller syntetiska polysackaridgummin. Många sådana material är kommersiellt tillgängliga. Typiskt extraheras de från grön- - saker och användes ofta som tillsatsmedel till olika livs- ~medel. Natriumalginat är det för närvarande föredragna vattenlösliga gummit. Andra användbara gummin inbegriper guargummi, gummi arabicum, karragen, pektin, dragantgummi, xantangummi eller deras sura fraktioner.

Dessa material omfattar glykosidbundna sackaridkedjor.

' Många innehåller fria syragrupper, vilka ofta är närvarande i alkalimetalljonform, t ex natriumform. Om alkalimetall- jonen ersättes med en multivalent jon, såsom kalcium eller strontium, "tvärbindes" de vätskeformiga, vattenlösliga polysackaridmolekylerna till bildning av en vattenolöslig, formbevarande gel, vilken kan resolubiliseras genom avlägs- 10 15 20 30 350 .448 060 10 ning av jonerna med jonbyte eller via ett sekvesterings- medel. Ehuru väsentligen varje multivalent jon, som kan bilda ett salt, är användbart, är det föredraget att an- m vända fysiologiskt kompatibla joner, t ex kalcium. Detta tenderar att bevara vävnaden i levande tillstånd. Andra multivalenta katjoner kan användas för mindre ömtàliga material. _ I _Andra gummin kan omkastas mellan det vattenlösliga och gelade, vattenolösliga tillståndet helt enkelt genom förändring av pH-värdet i det medium i vilket de är lösta.

En typisk vävnad-vävnadsmedium-gummilösningskomposi- tion omfattar lika volymer av vävnad i dess medium och en 1 --2 % lösning av gummit i fysiologisk saltlösning.

När natriumalginat användes, har en 1,0 - 1,5 % lösning med framgång använts.

När man inkapslar material, som kan motstå föränd- ringar av temperatur, kan gelatin eller agar användas för bildning av de temporära kapslarna. Dessa kan gelas genom injektion in i en lågtemperaturomgivning. Andra vatten- lösliga substanser, såsom hydroxietylmetakrylat, kan även användas._ 0 *A I ' I nästa steg av inkapslingsförfarandet formas gummi- lösningen, som innehåller vävnaden, till droppar med en önskad storlek. Därefter gelas dropparna omedelbart för att bilda formbevarande sfäriska eller sfäroida massor.

Apparat för utförande av dessa senare steg visas vid steg BC på ritningen. En bägare 10, som_innehâller en vatten- lösning av multivalent katjon, t ex 1,5 % CaCl2-lösning, är utrustad med en magnetomrörarstav ll och omrörare 12.

Omrörningsmekanismen sättes i rörelse för att ge en virvel 14 med ihåligt centrum 16. Ett kapillärrör 18 med en utvald innerdiameter placeras inom virvelns ihåliga region 16 och utrustas med en vibrator 20. Suspensionen, som inne- håller vävnad och det solubiliserade gummit, matas genom kapillären. Ytspänningseffekten, som skulle inducera bild- ningen av relativt stora droppar, minimeras medelst vibratorn 9 så att droPP\rna, visade vid 22, med en storlek som är *1 o' '15 20 »25 30 35, 448 060 ll jämförbar med kapillärens innerdiameter, skakas loss från kapillärspetsen. Dessa kommer omedelbart i kontakt med lösningen, där de absorberar kalciumjoner. Detta resul- terar i "tvärbindning" av gelen och i bildningen av en formbevarande, högviskositetsskyddande temporär kapsel, som innehåller den suspenderade vävnaden och dess medium.

Kapslarna samlas i lösningen som en separat fas och sepa- 'reras'genom aspiration.

I en alternativ utföringsform av förfarandet inbe- gripes en liten mängd polymer av den typ som användes för "permanent tvärbindning av gummit i lösningen tillsammans _med de multivalenta jonerna (eller annan lösning, som har förmåga att gela det särskilda gummit som användes). Detta resulterar i bildningen av permanenta tvärbindningar.

Kapslar av denna typ har vissa fördelar om målet är att bevaragvävnaden.

I nästa steg av förfarandet avsättes ett selektivt permeabelt membran kring ytan av de temporära kapslarna.

Det finns en mångfald metoder tillgängliga för utförande av detta steg, av vilka vissa är förut kända. Exempelvis kan gränsytpolymerisationstekniker utnyttjas. Vid gräns- ytpolymerisation bringas ett par av minst difunktionella- inbördes reaktiva monomerer, eller en monomer och en re- lativt lågmolekylär polymer, av vilka den ena är löslig i polära lösningsmedel, såsom vatten och den andra är 'löslig i hydrofoba lösningsmedel, såsom hexan, att reagera vid gränsytan av en emulsion av typen vatten-i-olja. I enlighet med förfarandet, som beskrivits i ovan angivna ö US patentansökan ser nr 606,l66, suspenderas eller upplöses materialet, som skall inkapslas i vatten, tillsammans med reaktionens vattenlösliga komponent, den vattenhaltiga fasen emulgeras i ett hydrofobt lösningsmedel och den kom- plementära monomeren sättes till systemets kontinuerliga fas så att polymerisation uppträder kring de vattenhaltiga dropparna. Genom att reglera typen av lösningsmedel i den _kontinuerliga fasen och koncentrationen av den där ingående reaktionskomponenten är det möjligt att utöva reglering 10 l5 20 25 30 35 448 nens 12 av porstorlek och att framställa selektivt permeabla mikro- kapslar.' _ _ Denna teknik kan användas i enlighet med föreliggande uppfinning om den vattenlösliga reaktionskomponenten löses i en vattenhaltig lösning och lösningen användes för sus- lpendering av de temporära kapslarna. Denna vätskesuspension emulgeras sedan i exempelvis hexan eller i en hexan-kloro- formblandningl Därpå tillsättes den komplementära monomeren, företrädesvis i ökande mängder, för att inducera gränsyt- polymerisation vid ytan av de vattenhaltiga dropparna.

Beroende på den gelade massan av polysackarid, som omger den suspenderade vävnaden, och särskilt om lämpligt buff- rade polyfunktionella aminogruppinnehållande polymerer, såsom vissa proteiner, användes som den vattenlösliga reak- tionskomponenten, är förfarandet sådant att vävnaden över- lever inkapslingen i ett friskt tillstånd. Substanser som är användbara vid bildning av membranerna med de polyfunk- tionella aminerna inbegriper disyror, disyrahalogenider och multifunktionella sulfonylhalogenider. Förutom poly- aminerna kan diaminer, polyoler och dioler användas. Mole- kyler som innehåller ett flertal amingrupper kan även tvär- bindas med glutaraldehyd till bildning av ett membran.

En annan användbar membranbildningsmetod är gränsytpoly- merisation, som utnyttjar polyadditíonsreaktioner. I detta fall bringas exempelvis multifunktionella aminer absor- berade i ytskikten hos de temporära kapslarna att reagera med epiklorhydrin, epoxiderade polyestrar eller diisocyanat.

Den föredragna metoden att bilda membranet, visad som steg D på ritningen, är att permanent tvärbinda drop- parnas ytskikt genom att utsätta dem för en vattenhaltig lösning av en polymer, som innehåller grupper reaktiva med funktionaliteter i gelmolekylerna. Vissa långkedjiga kvaternära ammoniumsalter kan användas för detta ändamål under vissa omständigheter. När sura gummin användes kan polymerer, som innehåller syraroaktiva grupper, såsom polyetylenimin och polylysin, användas. I denna situation tvärbindes polysackariderna genom interaktion mellan karbo- w m W) 448 060 13 xylgrupperna och amingrupperna. Permeabiliteten kan med '_fördel regleras geom val av den använda tvärbindningspoly- 0 merens molekylvikt. Exempelvis penetrerar en lösning av polymer med en låg molekylvikt, under en given tidsperiod, längre in i de temporära kapslarna än vad en polymer med gen hög molekylvikt gör. Tvärbindningspolymerens grad av penetration står i korrelation till den resulterande per- meabilitetenl I allmänhet gäller att ju högre molekyl- f _vikten är och ju mindre penetrationen är desto större är io 15 20 kzs 30 gas porstorleken. Allmänt taget kan polymerer med molekylvikter inom området 3,000 till loo ooo aalton eller större användas, «beroende på reaktionens varaktighet, polymerlösningens koncentration och graden av önskad permeabilitet. I en framgångsrik sats av reaktionsbetingelser, med användning av polylysin_med medelmolekylvikt av ca 35 000 dalton, innebar reaktion i 2 min, under omröring, av en fysiolo- gisk saltlösning som innehöll o,ol67 % polylysin. optimala reaktionsbetingelser lämpliga för reglering av permeabilitet i ett givet system kan lätt beszämmas empiriskt utan arbete av uppfinningstyp.

Valet av tvärbindningsmed1»t-eller -medlen bestämmer 'även kapslarnas in vivo uppehål stid. I det ovan beskrivna systemet omfattar det permanenta kapselmembranet poly- sackarid (en lättdigererbar substans) tvärbunden med en- dera av eller både en polypeptid eller ett protein, t ex polylysin, eller en syntetisk substans, t ex polyetylen- imin. Polymerer varierar med hänsyn till hastigheten, vid vilken de kan dispergeras in viflo. Vissa digereras utan svårighet, t ex protein; andra redbrytes långsamt och ytterligare andra kvarstår i oärdlighet. Förfarandet enligt uppfinningen räknar med tvärbincning med en eller flera polymerer för att alstra kapslar med en utvald upplösnings- hastighet in vivo, som allmänt sträcker sig mellan några få timmar eller dygn till väsentlig beständighet. Exemplet som följer beskriver hur man framställer kapslar som förblir intakta minst ca 2 mån inom peritonealhålan hos råttor.

Uppfinningen är emellertid inte begränsad till dessa sär- 10 44ßao60r 14 skilda kapselmembraner och ej heller till kapslar med denna grad av in vivo liv. I själva verket beror mikrokapslarnas optimala in vivo livslängd på deras avsedda användning och deras implantationsställe. Fackmännen på området kommer att kunna empiriskt framställa mikrokapslar med en utvald in vivo livslängd utan arbete av uppfinningstyp, på grundval av denna beskrivning- Vid detta skede av inkapslingen kan kapslar uppsamlas, vilka omfattar ett permanent selektivt permeabelt membran omkring en gelad lösning av gummi, vävnadskompatibelt ._ kulturmedium och vävnadspartiklar. Om avsikten är att en- 15 20 25 30 35 dast bevara vävnaden i en skyddande omgivning behöver inga ytterligare steg utföras. Om emellertid massöverföring skall främjas inom kapslarna och genom membranerna, före- drages det att återföra gelen till vätska till dess vatten- lösliga form. Detta kan göras genom återupprättande av betingelserna under vilka gummit är en vätska, t ex ändring av mediets pH eller avlägsnande av kalciumet eller andra multifunktionella katjoner, som använts. I gelerna, vilka är olösliga i närvaro av de multivalenta katjonerna, kan mediet i kapseln resolubiliseras helt enkelt genom ned-H sänkning av kapslarna i fosfatbuffrad fysiologisk salt- lösning, vilken innehåller alkalimetalljoner och vätejoner.

Monovalenta_joner utbytes mot kalciumet eller andra multi- funktionella joner inom gummit när, såsom visas vid steg E på ritningen, kapslarna nedsänkes i lösningen under om- röring. Andra salter, t ex natriumcitrat, kan användas för samma ändamål. _ K Slutligen beroende på typen av den använda tekniken för bildning av selektivt permeabelt membran, kan det vara önskvärt att behandla kapslarna för att binda fria amino- grupper av den typ, som annars skulle ge kapslarna en tendens att klumpa sig. Detta kan göras exempelvis genom nedsänk- ning av kapslarna i en lösning av natriumalginat.

Uppfinningen medger injektion av inkapslad, finfördelad vävnad, multicellulära fraktioner därav, eller individuella celler, in i ett lämpligt ställe inom en däggdjurskropp NI 10 15 20 25 30 35 448 060 15 för ändamålet att tillföra kroppen, åtminstone temporärt, vävnadens specialiserade fysiologiska funktion. Förfarings- sättet har de dubbla fördelarna avseende undanröjande av behovet för kirurgisk implantation (ehuru kapslarna kan implanteras kirurgiskt om så önskas) och avseende framgångs- rik handläggning av problemen med immunavstötning och naturlig fysisk isolering. Företrädesvis består kapsel- membranerna av substanser, som digereras efter det att vävnaden utdött. Såsom ovan angivits kan detta åstadkommas genom utnyttjande av en bryggbildare, som motstår in vivo nedbrytning så att ett givet användbart in vivo liv uppnås.

Från_det föregående är det uppenbart att inkapslings- förfarandet enligt uppfinningen och därav följande implanta- tionsteknik kan-utövas med användning av en mångfald reagens och inkapslade material och kan varieras avsevärt utan 7 att uppfinningens skyddsomfång och idé frängås. Följande exempel bör följaktligen i alla avseenden betraktas som belysande och inte som begränsande. 1 ' Exempel 1 7Langerhans' cellöar erhölls från råttpankreas och sattes till en fullständig Vävnadskultur (CMRL-1969 Connaugt Laboratories, Toronto, Canada) vid en koncentra- tion av ca 103 cellöar per ml. Vävnadskulturen innehöll Kalla nutrientia, som krävdes för fortsatt livsduglighet hos cellöarna samt aminosyrorna som utnyttjas av beta- cellerna för_alstring av insulin. Fyra tiondelar av en milliliter av cellösuspensionen sattes sedan till en halv Vmilliliter av l,2 % natriumalginat (Sigma Chemical Company) fi fysiologisk saltlösning.

Därefter placerades 80 ml av en 1,5 % kalciumklorid- lösning i en 150 ml bägare på en omrörare och omrördes vid en hastighet, som inducerade bildningen av en virvel med ett konformigt tomrum i dess centrum. En glaskapillär 'med en gradvis avtagande diameter, som slutade vid en spets med en innerdiameter av ca 300 um, utrustades sedan med en vibrator (60 perioder per sekund). Kapillärspetsen pla- cerades sedan inom virvelns centrum, vibratorn påkopplades 10 15 20 125 30 35 *med 10 ml av en 0,12 % 448 060 -16 och natriumalginat-kulturmedium-vävnadssuspensionen tvingades därigenom medelst en infusionspump. Droppar i storleks- ordningen 300 - 400 um diameter utslungades från kapillä- rens spets och kom omedelbart in i kalciumlösningen.

Efter 10 min frånkopplades omröraren och den överliggande lösningen avlägsnades genom aspiration. De gelade kaps- larna överfördes sedan till en bägare, som innehöll 15 ml F av en lösning, vilken omfattade en del av en 2 % 2-(cyklo- hexylamino)etansulfonsyralösning i 0,6 % NaCl pH =_8,2) utspädd med 20 delar l % CaCl2. Efter 3 min av CaCl2.

Kapslarna överfördes sedan till en 32 ml lösning,_¿ 3 (isotonisk, nedsänkning tvättades kapslarna 2 ggr i l % som omfattande l/80 av l % 35 000 AMU) i fysiologisk saltlösning. Efter 3 min dekan- terades polylysinlösningen. Kapslarna tvättades sedan med polylysin,(medelmolekylvikt l % CaCl2 och suspenderades sedan under 3 min i en lösning av polyetylenimin (molekylvikt 40 000 - 60 000), som fram- ställts genom spädning av en 3,3 % polyetyleniminförråds- lösning i morfolinopropansulfonsyrabuffert (0,2 M, pH = 6) med tillräckligt l'%'CaCl2 för att ge en slutlig polymer- koncentration av 0,12 %. De resulterande kapslarna, med permanenta selektiva membraner, tvättades sedan 2 ggr med 1 % CaCl2, 2 ggr med fysiologisk saltlösning och blandades alginsyralösning.

Kapslarna motstod klumpning och många sågs innehålla Langerhans' cellöar. Gel i det inre av kapslarna återfördes till vätska genom nedsänkning av kapslarna i en blandning *av~fysio1ogisk saltlösning och citratbuffert (pH = 7,4) i 5 min. Slutligen suspenderades kapslarna i CMLR-69 medium.

V Under mikroskop hade dessa kapslar ett utseende, som visas på ritningen. De omfattade ett mycket tunt membran 24, vilket omslöt en cellö 26, inom vilken individuella celler 28 kan ses. Molekyler med en molekylvikt upp till ca 100 000 kan passera membranet 24. Detta tillåter syre, aminosyror, nutrientia och plasmakomponenter som användes i kulturmediet (t ex fetala kalvplasmakomponenter) att nå cellöarna och medger avsöndring av insulin. 10 zol _25 30 35 '500 ~ 700 mg/dl behandlades var och en med ca l0 15, 448 060 17 Exempel 2 -Efter upprepade tvättningar i fysiologisk saltlösning suspenderades mikrokapslarna som framställts i enlighet .med Exempel 1, och som innehöll ca 15 cellöar, i 3 ml CMRL~l969. När kapslarna var 8 dygn gamla, avsöndrade de i närvaro av 600 mg/dl glukos, vid en körning, 67 enheter/ml insulin på 1,5 h. I en andra körning alstrades 68 enheter/ml _insulin på samma tid. En vecka gamla kapslar, i samma 'medium, men i närvaro av 100 mg/dl glukos, avsöndrade i en_första körning 25 enheter/ml insulin på l,2 h, och avsöndringen i andra körningen 10 enheter/ml. __ >_ u Exempel 3 Diabetiska råttor med blodglukosnivåer i området 3 cellöar inkapslade såsom.angivits i Exempel l odh suspenderade i fysiologisk saltlösning. Kapslarna infördes genom injek- tion in i peritonealhålan, med användning en nr 19 nål som var ansluten till en spruta. Blodsockerniváer analyserades dagligen och befanns enhetligt vara under 300 mg/dl. De efter 2 mån avlivade djuren visade inga tecken på toxisk 'reaktion kring implantationsstället. De, efter 2 mån in vivo liv, från de avlivade djuren avlägsnade kapslarna Exempel 4 Inkapsling av hepatocyter 'var intakta och uppvisade inga tecken på nedbrytning.

Förfarandet enligt Exempel 1 upprepades med undan- "tag för att 0,5 ml av en levercellsuspension i Hank's lösning användes i stället för 0,4 ml cellösuspensionen.

Den pågående livsdugligheten hos levervävnaden hade visats genom förguteslutningstekniken (uteslutning av trypanblått).

Det är känt att levervävnad, in vitro, kan intaga toxiner från sin omgivning; Toxiner med en tillräckligt låg mole- kylvikt för att passera genom de semipermeabla membranerna intages och förstörs därför av vävnaden. Väsentligen alla toxiner, som behandlas av levern, är material med låg molekylvikt. Toxinerna kan emellertid vara protein-komplex- bundna. Kapselpermeabiliteten kan varieras efter behov. 10 15 20 p44s 060 18 _ Exempel 5 7Förfarandet enligt Exempel 1 upprepades med undantag 1-1 , för att partikelformigt aktivt kol suspenderades direkt 01- i natriumalginatlösningen, att l/2 ml av vävnadssuspension uteslöts och att polylysin med en medelmolekylvikt av 35 000 användes som en bryggbildare. Så länge som kolpartik- larna är mindre än den för alstring av dropparna använda kapillärens minsta innerdiameter erhålles kol med stor ytarea omgivet av ett selektivt permeabelt membran. Dessa hindrar effektivt flykt av kolbitar eller damm och kan icke desto mindre användas för att absorbera material med medelstora molekylvikter (upp till ca 2 000 dalton) från f1uidum.som passerar kring kapslarna.

Förfarandets användbarhet har visats med andra levande celler, inbegripet röda blodkroppar, med användning av serum som ett mediumj spermaceller, med användning av semen som mediet och hagerijäst. Fackmännen på området inser att en mångfald andra material kan inkapslas än de som specifikt visats här, och att permeabilitet kan regleras efter behov för utvalda tillämpningar av förfarandet.

Följaktligen är andra utföringsformer inom patentkravens skyddsomfäng. 19,9,

Claims (1)

1. l0 l5 20 25 30 448 060 19 PATENTKRAV 1. Eörfarande för inkapsling av ett kärnmaterial inom ett selektivt permeabelt membran utan att kärnmaterialet påtagligt skadas, k ä n n.e t e c k n a t därav, A, att kärnmaterialet sättes till en lösning av en vatten- flöslig substans, som kan gelas till bildning av en samman- hängande, formbevarande massa; *BJ att lösningen formas till droppar; 'C. att dropparna gelas till bildning av fristående, formbevarande massor; och iD. att ett selektivt permeabelt membran bildas omkring de formbevarande massorna genom tvärbindning eller poly- addition av ytskikten hos de formbevarande massorna. I 2. Förfarande enligt kravet l, k ä n n e t e c k - n a t därav, att den vattenlösliga substansen omfattar en polysackarid, som innefattar ett flertal anjoniska grupper. _ 3. Förfarande enligt kravet 2, k ä n n e t e c k - in a t därav, att steg C utföres genom att dropparna -utsättes för en vattenlöslig multivalent jonlösning. 4. Förfarande enligt kravet 2, k ä n n e t e c k - in a t därav, att steg D utföres genom exponering av de formbevarande massorna för en polymer, som innehåller ett flertal grupper, som joniserar till bildning av grupper med motsatt laddning mot de i polysackariden ingående grupperna, samt fria aminogrupper, till bildning av tvärbindningar mellan aminogrupperna och de anjoniska grupperna. _ É, Förfarande enligt kravet_2, k ä n n e t e c k - n a t därav, att de anjoniska grupperna är karboxyl- grupper. "V '7 7 6; Förfarande enligt kravet l, k ä n n e t e c k - n a t därav, att de formbevarande massorna återföres till vätskeform eften steget D. 10 '15 20 25, 30 35 .44spo60 20 7. Förfarande enligt kravet 1, k ä n n e t e c k - n a t därav, att kärnmaterialet omfattar en levande cell eller vävnad. 8. Förfarande enligt kravet l, k ä n n e t e c k - n a t- därav, att kärnmaterialet är ett hormon, ett enzym, en antikropp eller annat biologiskt aktivt material. _ 9; Förfarande enligt kravet 7, k'ä n n e t e c k - n a t därav, att den vattenlösliga substansen är en polysackarid, som innehåller ett flertal karboxylgrupper, och att steget D utföres genom exponering av de form- bevarande massorna för en polymer, som omfattar ett flertal fria aminogrupperfl 10. Förfarande enligt kravet 9, k ä nzn e t e o k - n a t därav, att steget C utföres genom exponering av dropparna för en kalciumjonlösning. ll. Förfarande enligt kravet 9, k äzn n e t e c k - n a t därav, att de formbevarande massorna återföres till vätskeform efter steget D. 7 12. Förfarande enligt kravet 9, k ä n n e t e c k - n a t därav, att polysackariden är ett alkalimetall- alginat. 7 ' 13. Förfarande enligt kravet 9, k ä n n e t e c k - n a t därav, att polymeren är en polylysin. Z 14. Kapsel, k ä'n n e t'eVc_k n a d därav, att ”den omfattar ett selektivt permeabelt membran, som av- gränsar ett inre kapselutrymme, vilket innehåller en eller flera livsdugliga, friska, levande celler, som har förmåga att undergå metabolism, varvid membranet omfattar en polysackarid med ett flertal anjoniska grupper, som är saltbundna till en polymer, som har ett flertal katjoniska grupper. l5. Kapsel enligt kravet 14, k ä n n e t e c k - n a d' därav, att membranet omfattar en karboxylerad Vpolysackarid, som saltbundits till en aminerad polymer, l6. Kapsel enligt kravet l5, k ä n n e t e c k - n a d därav, att den karboxylerade polysackariden om- fattar alginat och att den aminerade polymeren omfattar en polypeptid med fria aminogrupper. n 10 15_ 448 060 , 21 7* 17. Kapsel enligt kravet 15, k ä n n e t e c k - n a d därav, att den aminerade polymeren omfattar poly- lysin. _ 18. Kapsel enligt kravet 14, k ä n n e t e c k - n a d därav, att den dessutom omfattar ett medium för den eller de nämnda cellerna, som finns inom det inre kapselutrymmet. lK"'l9. Kapsel enligt kravet 14, k ä n n_e t e c k - n a d därav, att den är suspenderad inom ett medium för den eller de nämnda cellerna. 20. Kapsel enligt kravet 14, k ä n n e t e c k - _n7a d därav, att den innehåller en eller flera Langerhans- cellöar. Q 21. Kapsel enligt kravet 14, k ä n n e t e c k - n a d därav, att den innehåller en eller flera leverf celler. _ K _ 22. Kapsel enligt kravet 14, k ä nfn e t e c k - n a dl därav, att den innehåller en eller flera dägg- djursce11er§