SU470964A3 - Способ получени антибиотика - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к области получени  антибиотиков.

Предложенный способ получени  антибиотика (А-201А), ранее в патентной литературе не описанный, заключаетс  в том, что культуру Streptomyces capreolus NRRL 3817 выращивают в аэробных услови х на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли при 30-50°С и рН 6,2-7,2 в течение 72-120 ч. Фильтрат культуральной жидкости экстрагируют хлороформом при рН 8,5, экстракт упаривают досуха. Остаток обрабатывают метанолом, метанольный экстракт упаривают досуха, остаток раствор ют в хлороформе , хлороформный раствор вливают в петролейный эфир, осадок раствор ют в хлороформе , пропускают раствор через колонку адсорбента, например силикагел , элюируют целевой продукт ацетоном с последующим выделением известными приемами.

Предложенный щтамм Streptomyces capreolus NRRL выделен из образца почвы, собранной в Венесуэле, имеет гладкие споры овальной или почти цилиндрической формы, расположенные в виде длинных извилистых переплетенных цепей, в количестве приблизительно 10-50 спор на одну цепь.

Предложенный щтамм имеет следующие особенности на различных питательных средах . Цвета определ ют по Maerza и Paul,

М. R., Dictionary of Color, Me Gravv-Hill. Ne vlork (1950).

A r a p с томатной п a с т о il и овс ной к а щ е и. Хорощий рост с недостаточным воздущным мицелием (белый), субстратный мицелий имеет цвет серовато-желтоватокоричневый 13 В 5. Растворимый пигмент отсутствует.

Агар Чапека. Хороший рост с недостаточным воздущным мицелием. Субстратный мицелий бледно-желтый 10 В 2.

Агар с дрожжевым экстрактом. Обильный рост при отсутствии воздущного мицели  пли спор. Субстратный мицелий интенсивно желтовато- рко-розовый 2F9. Растворимый пигмент отсутствует.

Агар Bennett. Обильный рост при отсутствии воздушного мицели . Субстратный мицелий умеренно красный ЗП10. Растворимый пнгмепт отсутствует.

Питательный агар. Довольно хорощий рост при отсутствии воздущного мицели  или спор.

Агар Эмерсона. Хороший рост при отсутствии воздущного мицели . Субстратный мицелий темный серо-желтый 13 КЗ. Растворимый пигмент отсутствует.

Агар с глюкозой и аспарагпном. Хорощий рост при отсутствии мицели . Субстратный мицелий интенсивно желтовато- рко-розовый . Растворимый пигмент отсутствует .

Агар с ,1 а л а т о м кальци  (кальциевой солью  блочной кислоты). Рост на этой среде был настолько скудный, что не было сделано никаких наблюдений цвета.

Л г а р с т и р о 3 и п о м. Довольно хороший рост со скудным воздушныгу мицелием и бледно-желтыми снорами 1 С 1. Субстратный мицелий бледно-желто-зеленый. Растворимый пигмент отсутствует.

Среда «М е ж д у ц а р о д в ы и п р о е к г IS Р medium № 2. Обильный рост нри отсутствии воздушного мицели  или сцор. Субстратиый мицелий сероватый и красновато-оранжевый 11 А 8. Растворимый пигмент отсутствует.

Среда «М еждународны и цроект I S Р medium ЛЬ 3. Довольно хороший рост с довольно хорошим воздушным мицелием и спорами. Цвет серовато-желтоватый,  рко-розовый 4 А 9. Растворимый нигмент отсутствует .

Среда «М еждународный цроект I S Р medium К 4. Скудный рост со ску;и-1ым юздушиым мицелием ц спорами. С.убстратный мицелий бледно-желто-зеленый 10В I. Растворимый пигмент отсутствует.

Среда «М еждународный цроект I S Р medium № 5. Рост этой среды был настолько ничтожен, что не было отмечено про вление цвета.

Желатин - не разжижает. Восстанавливает нитраты. На агаре с железом и пентоннодрожжевым экстрактом и на м сном отваре с триптоном и дрожжевым экстрактом меланинового пигмента не образует.

Полученный цредложенным способом антибнотик А-201у представл ет собой белое криi таллическое соединение, плав шеес  нри 170-172°С, при выкристаллизовывании из ;: цетопа. Оно очень хорошо раствор етс  в спиртах, растворимо в ацетоне, хлороформе н этилацетате, церастворимо в воде, углеводородах и цростом эфцре.

Электрометрическое титрование А-201А в 67%-ном дцметилформамиде показало нервоначальное значение рН 7,8 н не обнаружило титрующихс  груцц в цределах рН от 3,5 до 13,5.

Микроанализом получен следуюш;ий примерный элементарный состав А-201А, %: С 55,20; Н 6,72; N 10,45; О 28,05, молекул рный вес на основе масс-спектрального исследовани  составл ет около 693.

Инфракрасный спектр А-201А, как кристаллического соединени  в хлороформно.м растворе цоказан на чертеже. Раснознаваемые полосы в инфракрасном снектре потощени  в цределах 2,0-15,0 мкм: 2,96 (широка ); 3,45; 3,53; 5,89; 6,06; 6,26; 6,33; 6,40; 6,67; 6,92; 7,06; 7,15; 7,28; 7,46; 7,60; 7,76; 7,92; 8,10; 8,30; 8,60; 8,87; 9,06; 9,14; 9,32; 9,54; 9,65; 10,12; 10,23; 10,59; 11,01; 11,30; 11,60 и 12,00.

Сцектр цоглош,ени  в ультрафиолетовых лучах А-201А в 95%-цом этаноле: водный раствор показывает максимум поглощени  примерно при 208 мкм, с коэффициентом экстинк ции EicM 535 и максимум ноглощени  примерно цри 275 мкм с коэффициентом экстинкции EICM 490.

Антибиотик А-201А обладает invivo активg ностыо в отношении заражени  цыил т Муcoplasma gallisopticum.

При введении через рот (иерорально) дозами 100 мг/кг смесь антибиотиков А-201А эффективна при воздействии на молодых крыс, зараженных Entanoeba uistolutica.

Антибиотик А-201А цри подкожной инъекции мыщам обладает invivo антимикробной активностью против инфекционных организмов .

Аитибиотик А-201А  вл етс  также эффективным .средство:. дл  торможени  роста микроорганизмов , которые содействуют развитию периодонтального заболевани .

Пример 1. Штамм Streptomyces саргеод lus NRRL 3817 выращивают 6 дней цри 30°С на питательном косом агаре следующего состава , г:

Глюкоза.5

Дрожжевой экстракт10

Агар20

Дистиллированна  вода до 1 л

Суспензией, смытой с кос ков, засевают 100 мл среды следующего состава, г:

Декстроза15

Мука соевых бобов15

Твердый водный экстракт зерен пшеницы или кукурузы5 СаСОз 2 0 NaCl 5 Вода водопроводна  до до 1 л

Инкубацию цровод т 48 ч при 30°С при непрерывном встр хивании на вращающемс 

5 устройстве, работающем со скоростью 250 об/мин.

Порции по 100 мл среды того же состава, что и вышеуказанный, помещают в Эрленмейеровские колбы емкостью 500 мл, подвергают

0 стерилизации при 120°С в течение 30 мин и засевают полученной культурой.

Культивирование провод т при встр хивании в течение 72 ч цри 30°С на вращающемс  встр хивающем устройстве, совершающем

5 250 об/мин. рН цривитой среды цриблизи-, тельно 7,7. рН постенеппо возрастает на прот жении периода времени брожени  и при сн тии урожа  составл ет около 7,5. Антибиотик экстрагируют из культуральной жид0 кости общеизвестными приемами.

Пример 2. Спорами Streptomyces саргеоlus NRRL 3817 засевают питательный косой

агар следующего состава, г:

5 10 Глюкоза Дрожжевой экстракт

Агар20

Дистиллированна  вода до 1 л Привитой косой агар выдерживают в термостате при 30°С в течение 5 дней.

0,5 мл смытой с кос ка суспензией засевают 50 мл стерильной среды следующего состава , г:

Декстроза15

Бактопентон10

Глицерин10

Амбер, ALB10

Патока5

Надрисол10 Дистиллированна  вода до 1 л

Амбер (Amber) ALB - торговое название дл  продукта молочного альбумина лаборатории Amber, Juncan, Висконзин 55039.

Надрисол (Nadrisol) - торговое название высушенного растворимого продукта винокуренного производства фирмы National Distillers Products Company, Нью-Йорк.

Инкубацию провод т 72 ч при 72°С при посто нном перемешивании на Браш,аюшемс  встр хиваюшем устройстве, совершающем 250 об/мин.

Порцию в 20 мл полученной таким образом культуральной жидкости добавл ют к 400 мл среды того же состава, что и приведенна  выше . Выращивание ведут в течение 48 ч при 30°С при посто нном перемешивании на вращающемс  встр хивающем устройстве, совершающем 250 об/мин.

К ферментационному резервуару добавл ют после стерилизации при 120°С 42 л среды из сем н вышеуказанного состава с добавлением 0,2 г противовспенивающего средства на 1 л среды. В среду из сем н добавл ют около 400 мл полученной культуральной жидкости и культивируют около 24 ч при 30°С при перемешивании мешалкой, вращающейс  со скоростью 135 об/мин, и аэрации с расходом 18,4 . Спуст  примерно 24 ч ферментации около 8,0 л культуры используют дл  прививки 946,25 л стерильной продукционной среды, содержащей, %:

Противовспенивающий агент0,02

Декстроза5,00

Крупа соевых бобов1,50

Патока (черна  мелиса)0,30

Карбонат кальци 0,25

Дистиллировап1 а  вода до100,0

Ферментацию провод т в течение 48 ч при 30°С при скорости перемешивани  около 250 об/мин и аэрации с расходом 396,4 . За этот отрезок времени добавл ют стерильный раствор из 472 кг декстрозы в 42 л воды. Ферментацию продолжают и последуюшие 48 ч.

900 л культуральной жидкости, полученной, как указано выше, фильтруют с использованием 27 кг коммерческого вспомогательного

фильтра (ПиПо Super-cei). Фильтрат довод т до рН 8,5 с помощью 5 н. раствора гидроокиси натри . Щелочной фильтрат дважды экстрагируют, использу  0,5 объема хлороформа . Хлороформные выт жки собирают и выпаривают досуха под вакуумом. Образующийс  остаток раствор ют в 2 л метанола, а нерастворимые частички отфильтровывают и отбрасывают за ненадобностью. Фильтрат метанола выпаривают досуха под вакуумом. Образующийс  остаток раствор ют в 470 мл хлороформа и добавл ют к 10 л петролейного эфира. При этой операции образовываетс  осадок. Осадок отфильтровывают, затем сушат под вакуумом с выходом 82,6 г сырьевой смеси антибиотика.

В 500 мл хлороформа раствор ют 3 г сырьевой смеси антибиотика, полученной по вышеприведенному способу. Хроматографическую

колонку размерами 7X60 см набивают кремнегелем (Grace, 62, Davison Chemical Со), измельченным со смесью хлороформа и ацетона (1 : 1), а затем растворитель удал ют. Хлороформный раствор сырьевой смеси антибиотика ввод т в верхнюю часть колонки и пропускают через слой кремнегел .

После выхода 500 мл хлороформа из колонки слой силикагел  промывают 10 л смеси хлороформа и ацетона (1 : 1). Сточную и промывочную жидкость отбрасывают за ненадобностью .

После этого через колонку пропускают ацетон и элюат (экстракт из адсорбента), испытывают на активность антибиотика. Фракции,

имеющие активность антибиотиков, собирают и выпаривают досуха под вакуумом. К полученному таким образом остатку добавл ют 500 мл ацетона. Раствор нагревают, а затем дают ему 10-12 ч посто ть при -20°С дл 

обеспечени  протекани  кристаллизации антибиотика А-201А. Кристаллы отфильтровывают и высушивают под вакуумом, выход при этом составл ет 13,3 г антибиотика А-201А с т. пл. 170-172°С.

Провод  элюирование антибиотика А-201А, смесь ацетона и метанола (9:1) пропускают через колонку и удал ют фракци ми, которые испытывались на активность антибиотика.

Предмет изобретени 

Способ получени  антибиотика, отличающийс  тем, что культуру Streptoniyces capreolus NRRL 3817 выращивают в аэробных услови х на среде, содержащей источники углерода , азота и минеральные соли при 30- 50°С и рП 6,2-7,2 в течение 72-120 ч, фильтрат культуральной жидкости экстрагируют хлороформом, метапольный экстракт упаривают досуха, остаток раствор ют в хлороформе,

хлороформный раствор вливают в петролейный эфир, осадок раствор ют в хлороформе, пропускают раствор через колонку адсорбента , например силикагел , элюируют целевой продукт ацетоном с последующим выделением известными приемами. 000 50002500 2000 Ш 10(f Частота, 1 WO то то то looogsomsso soo iso 8 Э 10 11 Поглощение, fiKii