WO2008044409A1

WO2008044409A1 - Procédé de fabrication d'un l-amino acide

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Publication number: WO2008044409A1
Application number: PCT/JP2007/067440
Authority: WO
Inventors: Satoshi Okutani; Shinya Fujiki; Shintaro Iwatani
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2006-10-10
Filing date: 2007-09-06
Publication date: 2008-04-17
Anticipated expiration: 2009-04-10
Also published as: US20090239268A1; EP2080808B1; DK2080808T3; PL2080808T3; JP2010017082A; BRPI0717826B1; BRPI0717826A2; US8859243B2; EP2080808A1; EP2080808A4; ES2800999T3; CN101558163B; CN101558163A

Description

明細書

L一アミノ酸の製造法

技術分野

[0001] 本発明は、発酵工業に関し、微生物を利用した発酵法により L アミノ酸、特に疎水性アミノ酸、並びに Lースレオニン及び L グルタミン酸を効率よく製造する方法に関する。疎水性 L アミノ酸は、医療を目的とする栄養混合物の成分として利用されている。さらに、動物用飼料添加物、製薬業及び化学工業における試薬としてさまざまに利用されている。また、 L フエ二ルァラニンは、甘味料の原料としても用いられる。また、 L スレオニンは飼料用として、 L グルタミン酸は、調味料原料等として広く用いられている。

背景技術

[0002] L アミノ酸は、 L アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌又は腸内細菌科に属するアミノ酸生産菌を用いて発酵法により工業生産されて!/、る。これらのアミノ酸生産菌としては、生産性を向上させるために、自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異株、あるいは遺伝子組換えにより L アミノ酸生合成酵素が増強された組換え体等が用いられている。

[0003] 例えば、疎水性アミノ酸の L—トリプトファン発酵においては、アントラニル酸合成酵素活性、ホスホダリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性、トリプトファンシンターゼ活性が増強された細菌（WO94/08031号参照）、及びトリプトファンオペロンが増幅された細菌が挙げられる（特開昭 57-71397号、特開昭 62-244382号、米国特許第 4,371,614)。

[0004] また、 L グルタミン酸発酵においては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（gdh) 、イソクェン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（icdA)、アコニット酸ヒドラターゼ遺伝子（acnA, acnB)、及びクェン酸シンターゼ遺伝子（gltA)を増強することによって、 L—ダルタミン酸の生産能を増加させる技術が挙げられる（特開昭 63— 214189号公報)。

[0005] また、 L スレオニン発酵においては、ァスバルトキナーゼ III遺伝子（lysC)、ァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（asd)、 thrオペロンにコードされるァスバルトキナーゼ I遺伝子（thrA)、ホモセリンキナーゼ遺伝子（thrB)、スレオニンシンターゼ遺伝子 (thrC)を強化した微生物（特開 2001-346578号)等が挙げられる。

[0006] 上述のような微生物の育種や製造法の改良により、 L アミノ酸の生産能はかなり高まっているが、今後の需要の一層の増大に応えるためには、さらに安価かつ効率的な疎水性 L アミノ酸の製造法の開発が求められている。

[0007] 一方、培養液中に蓄積する L アミノ酸を晶析せしめながら発酵を行う方法が知られている（特開昭 62-288号、欧州特許公報第 1078989号)。この方法は、培養液中に蓄積する L アミノ酸を析出させることにより、培養液中の L アミノ酸の濃度を一定に維持することを目的にしている。

[0008] また、 L グルタミン酸については、 L グルタミン酸を析出させながら蓄積させることができる微生物を用いて L グルタミン酸を製造する方法が開示されている（米国特許第 6905819号）。

[0009] また、これまでに疎水性 L アミノ酸の晶析法としては、水溶性セルロース誘導体を用いて L アミノ酸を精製する方法（特公平 5-76463)が知られていた。しかし、 Lーァミノ酸を析出させながら発酵を行う方法において、水溶性セルロース誘導体等のポリマーを培地中に添加して、 L アミノ酸の生産能を高めながら培地中に L アミノ酸を析出させる方法は知られていなかった。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0010] 本発明は、 L アミノ酸の発酵生産における生産性の向上、又は L アミノ酸結晶中の純度の向上を目的とする。

課題を解決するための手段

[0011] 本発明者は鋭意研究の結果、発酵培地中に、水溶性セルロース誘導体、ポリビニル化合物、水溶性澱粉誘導体、アルギン酸塩、及びポリアクリル酸塩からなる群より選ばれるポリマーを添加することによって、 L アミノ酸の生産性が向上すること、及び培地中に析出する L アミノ酸の結晶中の不純物を低減させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。

[0012] すなわち本発明は、以下のとおりである。 ( 1 ) L アミノ酸生産能を有する微生物を液体培地で培養し、該培地に L アミノ酸を析出させながら蓄積させる、発酵法による L アミノ酸の製造法において、前記培地力水溶性セルロース誘導体、水溶性ポリビュル化合物、極性有機溶媒溶解性ポリビュル化合物、水溶性澱粉誘導体、アルギン酸塩、及びポリアクリル酸塩からなる群より選ばれるポリマーを含むことを特徴とする方法。

(2)前記ポリマーが、カノレポキシメチノレセノレロース、メチノレセノレロース、カノレポキシメスフタレート、ポリビニノレピロリドン、ポリビニノレアノレコーノレ、ポリビニノレァセターノレジェチルァミノアセテート、アルギン酸ナトリウム、及びポリアクリル酸ナトリウムからなる群より選ばれる前記方法。

(3)前記微生物が、腸内細菌科に属する細菌またはコリネ型細菌である前記方法。

(4)前記腸内細菌科に属する微生物力 S、ェシエリヒア属またはパントエア属に属する細菌である前記方法。

(5)前記 L アミノ酸力 L ロイシン、 L イソロイシン、 L バリン、 L トリプトファン、 L フエ二ルァラニン、 Lーチロシン、 Lースレオニン及び L グルタミン酸からなる群より選ばれる前記方法。

(6)前記ポリマーがメチルセルロースであり、液体培地がメチルセルロースを lg/L 以上含むことを特徴とする前記方法。

(7)前記 L アミノ酸が L フエ二ルァラニンである、前記方法。

(8)前記方法により L—フエ二ルァラニンを製造し、得られた L—フエ二ルァラニンと、ァスパラギン酸又はその誘導体から、 a—L ァスパルチル— L フエ二ルァラニンの低級アルキルエステルを合成する、 a—L ァスバルチルー L フエ二ルァラニンの低級アルキルエステルの製造方法。

(9)さらに、 L フエ二ルァラニンを L フエ二ルァラニンの低級アルキルエステルにエステル化し、この L—フエ二ルァラニンの低級アルキルエステルを前記ァスパラギン酸の誘導体として Ν ァシルー Lーァスパラギン酸無水物と縮合させ、この反応混合物から Ν ァシルー a—L ァスバルチルー L フエ二ルァラニンの低級アルキルェステルを分離し、 Ν ァシルー a—L ァスパルチル— L フエ二ルァラニンの低級アルキルエステルを水素化して a—L ァスバルチルー L フエ二ルァラニンの低級アルキルエステルを生成させることを含む、前記方法。

発明を実施するための最良の形態

[0013] 本発明の製造法は、 L アミノ酸生産能を有する微生物を液体培地で培養し、該培地に L アミノ酸を析出させながら生成蓄積させることを含む、発酵法による Lーァミノ酸の製造法において、培地が水溶性セルロース誘導体、水溶性ポリビュル化合物、極性有機溶媒溶解性ポリビュル化合物、水溶性澱粉誘導体、アルギン酸塩、及びポリアクリル酸塩からなる群より選ばれるポリマーを含むことを特徴とする方法であ

[0014] 本発明において、「L アミノ酸」は、微生物を用いた発酵法において培地中に析出しながら蓄積するものであれば特に制限されない。具体的には、疎水性アミノ酸及び酸性アミノ酸が挙げられる。疎水性アミノ酸としては、分岐鎖 L アミノ酸である、 L —バリン、 L ロイシン、 L イソロイシン、芳香族 L アミノ酸である L トリプトファン、 L—フエ二ルァラニン、 Lーチロシンが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては Lーグルタミン酸が挙げられる。また、前記 L アミノ酸には、 L スレオニンも含まれる。

[0015] 本発明において、水溶性セルロース誘導体としては、カルボキシメチルセルロース、メチノレセノレロース、カノレポキシメチノレセノレロースナ卜リクム、ヒド '口キシプロピノレセノレ π ース、ヒドロキシプロピルセルロースフタレート等力 S、水溶性ポリビュル化合物又は極性有機溶媒溶解性ポリビュル化合物としては、ポリビュルピロリドン、ポリビュルアルコール、ポリビュルァセタールジェチルァミノアセテート等力 S、水溶性澱粉誘導体としては、ヒドロキシプロピルスターチ、ゼラチン等が、アルギン酸塩としては、アルギン酸ナトリウムなどのアルギン酸アルカリ金属塩等力またはポリアクリル酸塩としては、ポリアクリル酸ナトリウムなどが挙げられる。

[0016] これらのポリマーは、単独で培地に添加されてもよぐ 2種又はそれ以上の任意の組合わせで添加されてもよ!/ヽ。

[0017] 培地中に添加するポリマーの濃度は、目的の L アミノ酸の生成及び析出が阻害されない濃度であれば特に制限されない。好適なポリマーの濃度は、使用する微生物、目的 L アミノ酸、及び用いるポリマーの種類に応じて、適宜設定することができる。例えば、ポリマーを種々の濃度で培地に添加し、 L アミノ酸の収率又は生産速度、及び析出量を測定することによって、好適な濃度を決定することができる。ポリマーの濃度として具体的には、例えば、好ましくは 10mg/L以上、より好ましくは lg/L以上、特に好ましくは 1.7g/L以上が挙げられる。濃度の上限は、目的の L—アミノ酸の生成及び析出が阻害されなレ、濃度であれば!/、ずれでもよ!/、が、例えば 2g/Lが挙げられる。

[0018] 培地中のポリマーの量は、ポリマーの種類に応じた方法によって測定することができる。例えば、メチルセルロース等は、メトキシル基定量法によって測定できる。メトキシル基定量法は、試料にヨウ化水素酸を加えて加熱し、生じるヨウ化メチルを臭素で酸化し，生じたヨウ素酸をチォ硫酸ナトリウム溶液で滴定してメトキシル基を定量する方法であ^) (^- ： http://www.tokyo-eiken.go.jp/additives/kijun-l.html)。

[0019] 本発明において、ポリマーを培地に添加する時期は、目的の L アミノ酸が析出しながら蓄積する限りいずれでもよぐ培養当初からポリマーが培地中に添加されていてもよく、培養途中に添加してもよい。また後述する流加培養によってポリマーを培地に添加してもよい。

[0020] 本発明で用いられる培地は、栄養源として炭素源、窒素源とポリマーを含んでいればいずれでもよい。また、本発明の方法は、回分培養（batch culture)、流加培養（Fe d— batch culture)、連続培養法（continuous culture)のいずれも用いることができる。

[0021] ここで本発明において、上記流加培養とは、培養中の容器に培地を連続的又は間欠的に流加し、培養終了時までその培地を容器から抜き取らない培養方法をいう。また、連続培養とは、培養中の容器に培地を連続的又は間欠的に流加するとともに、容器から培地 (通常、流加する培地と当量)を抜き取る方法をいう。また、「初発培地」とは、流加培養又は連続培養において流加培地を流加させる前の回分培養（batch 培養）に用いる培地のことを意味し、「流加培地」とは、流加培養又は連続培養を行う際に発酵槽に供給する培地のことを意味する。流加培地は、微生物の生育に必要な成分の全てを含んでいてもよいが、一部のみを含むものであってもよい。また、本発明において「発酵培地」とは、発酵槽中の培地を意味し、この発酵培地から疎水性 L アミノ酸が回収される。また、本発明において、「発酵槽」とは、疎水性 L アミノ酸生産を行う器を意味し、その形状は問わず、発酵タンクを用いてもジャーフアーメンタ一を用いてもよい。また、その容量は疎水性 L アミノ酸を生成 ·回収できる容量であれば!/、ずれでもよい。

[0022] 尚、前記のとおり、ポリマーは、培養初期に添加しても、培養途中に添加してもよい

1S 例えば、本発明の方法が、 L アミノ酸生産能を持つ微生物を増殖させる段階（増殖期）と、 L アミノ酸を産生させる段階 (L アミノ酸生産期）を含む場合、少なくとも L アミノ酸生産期にお!/、て一定濃度含んで!/、ること力 S好ましレ、。

本発明における「増殖期」とは、培養開始から 3時間、好ましくは 6時間、特に好ましくは、 10時間以内の、炭素源が主に菌体生育に使用されている時期、すなわち微生物が対数的に増殖している時期を意味し、本発明における「L—アミノ酸生産期」とは、培養開始から 3時間以降、好ましくは 6時間以降、特に好ましくは 10時間以降炭素源が主に L アミノ酸生産に用いられている時期を意味する。

[0023] 本発明に用いられる培地に含まれる炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラタトース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用でき、特にグルコース、スクロースが好ましい。その他、酢酸、クェン酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して用いること力 Sできる。また、炭素源となる原料としては、ケインモラセス、ビートモラセス、ノ、ィテストモラセス、シトラスモラセスを用いてもよいし、セノレロース、デンプン、コーン、シリアル、タピオ力等の天然原料の加水分解物を用いてもよい。また培養液中に溶存した二酸化炭素も炭素源として使用出来る。これらの炭素源が初発培地にも流加培地にも用いることができる。培地中にこれらの炭素源を 1種のみ含んでいてもよいし、 2種以上含んでいてもよい。また、初発培地、流加培地とも、同じ炭素源を用いてもよいし、流加培地の炭素源を初発培地と変更してもよい。例えば、初発培地の炭素源をグルコースとし、流加培地の炭素源をスクロースとする場合である。

[0024] 本発明の培地中に含まれる窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニゥム、炭酸アンモニゥム、塩化アンモニゥム、リン酸アンモニゥム、酢酸アンモニゥム、ゥレア等のアンモニゥム塩または硝酸塩等が使用することができ、 pH調整に用いられるアンモニァガス、アンモニア水も窒素源として利用できる。また、ペプトン、酵母エキス、肉ェキス、麦芽エキス、コーンスティープリカ一、大豆加水分解物等も利用出来る。培地中にこれらの窒素源を 1種のみ含んでいてもよいし、 2種以上含んでいてもよい。これらの窒素源は、初発培地にも流加培地にも用いることができる。また、初発培地、流加培地とも、同じ窒素源を用いてもよいし、流加培地の窒素源を初発培地と変更してもよい。

[0025] また本発明の培地には、炭素源、窒素源の他にリン酸源を含んでいることが好ましい。リン酸源としては、リン酸 2水素カリウム、リン酸水素 2カリウム、ピロリン酸などのリン酸ポリマー等が利用出来る。

[0026] また本発明の培地には、炭素源、窒素源の他に、増殖促進因子（増殖促進効果を持つ栄養素）を含んでいてもよい。増殖促進因子とは、微量金属類、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用できる。特に芳香族アミノ酸、分岐鎖アミノ酸の場合、生合成系が共通しているので、微生物が後述のように、目的アミノ酸以外の生合成が弱化されている場合がある。このような場合、生合成系が弱化されたアミノ酸を培地中に添加することが好ましい。例えば目的アミノ酸が L トリプトファンの場合、 L フエニルァラニン及び/またはチロシン、目的アミノ酸が L—フエ二ルァラニンの場合、 L—トリプトファン及び/または Lーチロシンを添加することが望ましい（WO2003048374号パンフレット）。

[0027] 微量金属類としては、鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等が挙げられ、ビタミンとしては、ビタミン Bl、ビタミン B2、ビタミン B6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミン B12、ピリドキシン等が挙げられる。これらの増殖促進因子は初発培地に含まれていてもよいし、流加培地に含まれていてもよい。

[0028] また本発明の培地には、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましレ、。特に本発明に用いることができる L アミノ酸生産菌は、後述のように L アミノ酸生合成経路が強化されており、 L—アミノ酸分解能が弱化されているものが多いので、 L—リジン、 L—ホモセリン、 L—イソロイシン、 L メチォニンから選ばれる 1種又は 2種以上を添加することが望ましい。 [0029] 初発培地と流加培地は、培地組成が同じであってもよぐ異なっていてもよい。また、初発培地と流加培地の両方がポリマーを含む場合は、ポリマー濃度が同じであつてもよく、異なっていてもよい。さらには、流加培地の流加が多段階で行われる場合、各々の流加培地の組成は同じであってもよぐ異なっていてもよい。

[0030] 培養は、発酵温度 20〜45°C、特に好ましくは 30〜42°Cで通気培養を行うことが好ましい。ここで酸素濃度は、 5〜50%に、望ましくは 10%程度に調節して行う。また、 pHを 5〜9に制御し、通気培養を行う。培養中に pHが下がる場合には、例えば、炭酸カルシウムを加える力、、アンモニアガス、アンモニア水等のアルカリで中和する。尚、目的アミノ酸が酸性アミノ酸、例えば L—グルタミン酸の場合には、 pHは 3〜9、好ましくは 3〜5で行うことが望ましい。このような条件下で、好ましくは 10時間〜 120時間程度培養することにより、培養液中に著量の L アミノ酸が蓄積される。蓄積される L アミノ酸の濃度は野生株より高ぐ培地中から採取 ·回収できる濃度であればいずれでもよいが、 50g/L以上、望ましくは 75g/L以上、さらに望ましくは 100g/L以上である。

尚、 L—アミノ酸は培地中に溶解していても、析出していてもよいが、少なくとも一部は析出して!/、ることが好まし!/、。

[0031] 培養終了後の培養液から L アミノ酸を採取する方法は、公知の回収方法に従つて行えばよい。例えば、培地中に析出した L アミノ酸は、遠心分離又は濾過等により回収すること力できる。また、培地中に析出した L—アミノ酸は、培地中に溶解している L アミノ酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。

[0032] 本発明においては、 L アミノ酸蓄積を一定以上に保っために、微生物の培養を種培養と本培養とに分けて行ってもよぐ種培養をフラスコ等を用いたしんとう培養、又は回分培養で行い、本培養を流加培養、回分培養又は連続培養で行ってもよぐ種培養、本培養ともに回分培養で行ってもよい。

[0033] これらの培養法の場合、予定した L アミノ酸濃度に到達したときに、 L アミノ酸を一部引き抜いて、新たに培地を添加して繰り返し培養を行ってもよい。新たに添加する培地とは、炭素源及び増殖促進効果を持つ栄養素 (増殖促進因子）を含む培地が好ましい。炭素源としては、グルコース、スクロース、フルクトース、増殖促進因子としては、窒素源、リン酸、アミノ酸等が好ましい。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニゥム、炭酸アンモニゥム、塩化アンモニゥム、リン酸アンモニゥム、酢酸アンモニゥム、ゥレア等のアンモニゥム塩または硝酸塩等が使用することができる。またリン酸源としては、リン酸 2水素カリウム、リン酸水素 2カリウムが使用でき、アミノ酸としては、栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。

[0034] 本発明において、流加培養あるいは、連続培養を行う際には、一時的に糖や栄養源の供給が停止するように間欠的に流加培地を流加してもよい。また、流加を行う時間の最大で 30%以下、望ましくは 20%以下、特に望ましくは 10%以下で流加培地の供給を停止することが好ましい。流加培養液を間欠的に流加させる場合には、流加培地を一定時間添加し、 2回目以降の添加はある添加期に先行する添加停止期において発酵培地中の炭素源が枯渴するときの pH上昇または溶存酸素濃度の上昇がコンピューターで検出されるときに開始するように制御を行い、培養槽内の基質濃度を常に自動的に低レベルに維持してもよい（米国特許 5,912, 113号明細書)。

[0035] 炭素源としては、グルコース、スクロース、フルクトース、増殖促進因子としては、窒素源、リン酸、アミノ酸等が好ましい。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニゥム、炭酸アンモニゥム、塩化アンモニゥム、リン酸アンモニゥム、酢酸アンモニゥム、ウレァ等のアンモニゥム塩または硝酸塩等が使用することができる。またリン酸源としては、リン酸 2水素カリウム、リン酸水素 2カリウムが使用でき、アミノ酸としては、栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。また、流加培地は 1種でもよぐ 2種以上の培地を混合してもよい。 2種以上の流加培地を用いる場合、それらの培地は混合して 1つのフィード缶により流加させてもよいし、複数のフィード缶で流加させてもょレ、。

[0036] また、流加培養を行う際に、糖の量が、流加培養液あるいは発酵培地全体の炭素源量として、 30g/Lを超えない程度で流加させることが好ましぐ 20g/L以下、 10g/L以下で制御することが好ましい。特に、微生物の対数増終了時以降に、糖濃度が前記濃度範囲となるように制御することが好ましい。炭素源の流加速度は、米国特許 5,91 2， 113号明細書記載の方法を用いて制御することが出来る。また、糖とリン酸が菌体生育の制限因子となる濃度で糖とリン酸を流加することが好ましぐ流加培養液に含まれるリン酸の量としては、 P/C ratioで 2以下、好ましくは 1.5以下、さらに好ましくは 1 以下である（米国特許 5,763,230号明細書参照）。

[0037] 本発明で連続培養法を用いる場合には、引き抜きは流加と同時に行ってもよいし、一部引き抜いたあとで流加を行ってもよい。また培養液を L アミノ酸と細胞を含んだまま引き抜いて、細胞だけ発酵槽に戻す菌体を再利用する連続培養法でもよい (フランス特許 2669935号明細書参照）。連続的あるいは間欠的に栄養源を流加する方法は流加培養と同様の方法が用いられる。

[0038] ここで、培養液を間欠的に引き抜く場合には、予定した L アミノ酸濃度に到達したときに、 L アミノ酸を一部引き抜いて、新たに培地を流加して培養を行う。また、添加する培地の量は、最終的に引き抜く前の培養液量と同量になるように培養することが好ましい。ここで同量とは、引き抜く前の培養液量と 93〜； 107%の程度の量を意味する。

[0039] 培養液を連続的に引き抜く場合には、栄養培地を流加させると同時に、あるいは流カロさせたあとに開始することが望ましぐ例えば開始時間としては最大で流加を始めた 5時間後、望ましくは 3時間後、さらに望ましくは最大で 1時間後である。また引き抜く培養液量としては、流加させる量と同量で引き抜くことが好ましい。

[0040] 菌体を再利用する連続培養法とは、予定したアミノ酸濃度に達したときに、発酵培地を間欠的にあるいは連続して引き抜き、 L アミノ酸のみを取り出し、菌体を含むろ過残留物を発酵槽中に再循環させる方法であり、例えばフランス特許 2669935号明細書を参照にして実施することができる。

[0041] 本発明の方法によって製造されたフエ二ルァラニンは、例えば、 α—L ァスパルチルー L フエ二ルァラニンの低級アルキルエステル（「アスパルテーム」とも呼ばれる）の製造に使用することができる。すなわち、本発明の方法は、 L フエ二ルァラ二ンを原料として用いる a—L ァスバルチルー L フエ二ルァラニンの低級アルキルエステルの製造法を含む。同方法は、上記の本発明の方法によって製造された L フエ二ルァラニン、及びァスパラギン酸又はその誘導体から a—L ァスバルチルー L フエ二ルァラニンの低級アルキルエステルを合成する工程を含む。低級アルキルエステルとしては、メチルエステル、ェチルエステル及びプロピルエステル等が挙げられる。

[0042] 本発明の方法においては、 L—フエ二ルァラニン、及びァスパラギン酸又はその誘導体から a—L ァスバルチルー L フエ二ルァラニンの低級アルキルエステルを合成する方法は、 a—L ァスバルチルー L フエ二ルァラニンの低級アルキルエステルの合成に L フエ二ルァラニン又はその誘導体が用いられる限り特に制限されない。具体的には、例えば、 a—L ァスバルチルー L フエ二ルァラニンの低級アルキルエステルは、以下の方法により製造することができる（米国特許第 3,786,039号)。 L フエ二ルァラニンを L フエ二ルァラニンの低級アルキルエステルにエステル化する。この L—フエ二ルァラニンアルキルエステルを、 β カルボキシル基が保護され a カルボキシル基がエステル化されて活性化された Lーァスパラギン酸の誘導体と反応させる。前記誘導体としては、 N—ホルミル N—カルボベンゾキシ又は N— p メトキシカルボベンゾキシ L ァスパラギン酸無水物のような N ァシル Lーァスパラギン酸無水物が挙げられる。この縮合反応により、 N ァシルー a - L —ァスパルチル— L フエ二ルァラニンと、 N ァシルー β—L ァスパルチル— L フエ二ルァラニンの混合物が得られる。この縮合反応を、 37°Cにおける酸解離定数が 10_⁴以下の有機酸の存在下で行うと、 β一体に対する α—体の割合が上昇する（特開昭 51-113841)。続いて、 Ν アシノレー a—L ァスパノレチノレー L フエニノレアラニンを混合物から分離し、水素化して α Lーァスバルチルー L フエ二ルァラニンを得る。

[0043] 本発明に用いる微生物は、 L アミノ酸生産能を有し、液体培地で培養したときに培地に L—アミノ酸を析出させながら蓄積させることができる微生物である。

[0044] 各アミノ酸の 20°Cでの溶解度は、表 1の通りであり、 L—トリプトファン発酵の場合 10.

6g/L以上、 L フエ二ルァラニン発酵の場合 27.4g/L以上、 L チロシン発酵の場合 0.38g/L L—イソロイシン発酵の場合 41.2g/L以上、 L イシン発酵の場合 23.8g/L 以上、 L—パリン発酵の場合 57.5g/L以上、 L グルタミン酸発酵の場合、 7.2g/L L- スレオニン発酵の場合、 90.0g/L以上の L—アミノ酸を蓄積できる菌株が望ましい。

[0045] [表 1] 表 1

L—アミノ酸溶解度（20°C) g/L 溶解度（40°C) g/L

L—トリブトファン 10. 6 14

L—フエ二ルァラニン 27. 4 38

Lーチロシン 0. 38 0. 75

L一イソロイシン 41. 2 44

L一口イシン 23. 8 26

L一バリン 57. 5 65

L—グルタミン酸 7. 2 15

L一スレ才ニン 90. 0 122

[0046] L グルタミン酸を含む水溶液の pHを低下させると、 L グルタミン酸は γ カルボキシル基の pKa (4. 25)付近で溶解度は著しく減少し、等電点（pH3. 2)で溶解度は最も低くなる。培地組成によっても異なる力通常には、 L グルタミン酸は約 30 °C (こおレヽて (ま、 pH3. 2で (ま 10〜20g /し、 pH4. 0で (ま 30〜40g /し、 pH4. 7で (ま 50〜60g/L溶解する。

[0047] 本発明の微生物又はそれを育種するための親株としては、ェシエリヒア属細菌、パントエア属細菌を代表とする腸内細菌科に属する微生物や、コリネ型細菌等を用いること力 Sできる。また、メタノールから L アミノ酸を生産できる、メチロフイラス属細菌、メチロバチルス属細菌などのメタノール資化性細菌を用いてもよい。その他の腸内細菌科に属する微生物としては、ェンテロパクター（Enterobacter)属、、クレブシエラ（K lebsiella)属、セラチア（Serratia)属、エノレビユア（Erwinia)属、サノレモネラ（Salmonella )属、モルガネラ（Morganella)属などの γ プロテオバクテリアに属する腸内細菌が挙げられ、またその他の微生物としては、アリサイクロバチルス（Alicyclobacillus)属細菌、バチルス（Bacillus)属細菌、サッカロマイセス属ゃキャンディダ属等に属する酵母などが挙げられる。

[0048] ェシエリヒア属細菌としては、ナイトハルトらの著書（Neidhardt，F.C.et.aL， Escherichi a coli and Salmonella Ί yphimunum, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, table 1)に挙げられるもの、例えばェシエリヒア'コリ等が利用できる。ェシエリヒア'コリの野生株としては、例えば K12株又はその誘導体、ェシエリヒア'コリ MG1 655株（ATCC Νο·47076)、及び W3110株（ATCC Νο·27325)等が挙げられる。これらを入手するには、例えばアメリカン 'タイプ ·カルチャー 'コレクション (ATCC)より分譲を受けることができる（住所 ATCC, Address: P.O. Box 1549， Manassas, VA 20108， 1, United States of America )。

[0049] また、ェンテロパクター属細菌としては、ェンテロパクター ·アグロメランス (Enterobac ter agglomerans)、ェンァロノくグター'ノエロゲネス (Enterobacter aerogenes)等、ハントエア属細菌としてはパントエア.アナナティス（Pantoea ananatis)が挙げられる。尚、近年、ェンテロパクター.アグロメランスは、 16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア .アグロメランス (Pantoea agglomerans)又はパントエア ·アナナティス（Panto ea ananatis)、パントエア 'スチューアルティ（Pantoea stewartii)等に再分類されているものがある。本発明においては、腸内細菌科に分類されるものであれば、ェンテロバクター属又はパントエア属のいずれに属するものであってもよい。パントエア'ァナナティスを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、パントエア ·アナナティス AJ 13355株（FERM BP— 6614)、 AJ13356株（FERM BP— 6615)、 AJ13601 株（FERM BP— 7207)及びそれらの誘導体を用いることができる。これらの株は、分離された当時はェンテロバクタ一'アグロメランスと同定され、ェンテロバクタ一'ァグロメランスとして寄託された力 S、上記のとおり、 16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア ·アナナティスに再分類されている。

[0050] メチロフイラス属細菌として具体的には、メチロフィラス'メチロトロファスが挙げられ、代表的な株としては AS 朱（NCMB10515)等が挙げられる。メチロフィラス'メチロトロファス AS 朱はナショナル 'コレクション'ォブ 'インダストウリアル'アンド 'マリン'バクテリア (National Collections of Industrial and Marine Bacteria、住所 NCIMB Lts., Torr y Research Station 135， Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom)力も人手可能である。

[0051] メチロバチラス属細菌として具体的には、メチロバチラス.グリコゲネス（Methylobacil lus glycogenes)、メチロバチラス 'フラゲラタム (Methylobacillu flagellatum)等が挙げられる。メチロバチラス 'グリコゲネスとしては、 T- 1 朱（NCIMB 11375)、 ATCC 21276 株、 ATCC 21371株、 ATR80株 (Appl. Microbiol. Biotechnol., (1994)、 42巻， p67- 72 に記載)、 A513株（Appl. Microbiol. Biotechnol., (1994)、 42巻， p67_72に記載）等が挙げられる。メチロバチラス 'グリコゲネス NCIMB 11375株は、ナショナル 'コレクション •ォブ ·インダストウリアル ·アンド ·マリン ·バクテリア（National Collections of Industrial and Marine Bacteria^住所 Nし iMB Lts., orry Research station 1^5, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG， United Kingdom)から入手可能である。また、メチロバチラス'フラゲラタムとしては、 KT株 (Arch. Microbiol. , (1988)， 149巻、 p441_446に記載)等が挙げられる。

[0052] コリネ型細菌としては、バージーズ 'マニュアル'ォブ 'デターミネイティブ'バクテリオロシー (Bergey s Manual of Determinative Bacteriologyリ —8}¾599頁（1974) ίこ疋義れている一群の微生物であり、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞子形成能を有しない桿菌に分類される微生物が利用できる。なお、コリネ型細菌は、従来ブレビバタテリゥム属に分類されていたが現在はコリネバタテリゥム属細菌として統合された細菌（Int .J. Syst. Bacteriol., 41， 255 (1991))、及びコリネバタテリゥム属と非常に近縁なブレビバタテリゥム属細菌及びミクロバテリゥム属細菌を含む。

[0053] このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。

コリネバタテリゥム.ァセトァシドフィラム

コリネバタテリゥム.ァセトグルタミカム

コリネバタテリゥム 'アル力ノリティカム

コリネバタテリゥム .カルナェ

コリネバタテリゥム.グルタミカム

コリネバタテリゥム.リリウム

コリネバクテリウム.メラセコーラ

コリネバタテリゥム.サーモアミノゲネス（コリネバクテリゥム.エフイシエンス）コリネバタテリゥム.ノヽーキユリス

ブレビバタテリゥム.ディバリカタム

ブレビバタテリゥム.フラバム

ブレビバタテリゥム.インマリオフィラム

ブレビバタテリゥム.ラタトフアーメンタム

ブレビバタテリゥム.ロゼゥムブレビバタテリゥム.サッカロリティカム

ブレビバタテリゥム.チォゲ二タリス

コリネバタテリゥム 'アンモニアゲネス

ブレビバクテリウム.アル/くム

ブレビパクテリゥム 'セリヌム

ミクロバタテリゥム .アンモニアフィラム

具体的には、下記のような菌株を例示することができる。

コリネバクテリゥム'ァセトァシドフィラム ATCC 13870

コリネバクテリウム'ァセトグルタミカム ATCC 15806 コリネバタテリゥム'カルナェ ATCC15991

コリネバタテリゥム 'グルタミカム ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060 コリネバタテリゥム.リリウム ATCC15990

コリネバタテリゥム.メラセコーラ ATCC17965

コリネバタテリゥム 'エツフイシエンス AJ 12340(FERM BP-1539)

コリネバタテリゥム.ノヽーキユリス ATCC13868

ブレビバタテリゥム.ディバリカタム ATCC14020

ブレビパクテリゥム.フラバム ATCC13826, ATCC14067, AJ12418(FERM BP-2205) ブレビバタテリゥム.インマリオフィラム ATCC 14068

ブレビパクテリゥム.ラタトフアーメンタム ATCC13869 (コリネバクテリゥム'グルタミカム ATCC 13869)

ブレビバタテリゥム 'ロゼゥム ATCC13825

ブレビバタテリゥム 'サッカロリティカム ATCC14066

ブレビバタテリゥム.チォゲ二タリス ATCC19240

コリネバクテリゥム 'アンモニアゲネス ATCC6871、 ATCC6872

ブレビバタテリゥム 'アルバム ATCC15111

ブレビバクテリウム'セリヌム ATCC15112

ミクロバタテリゥム 'アンモニアフィラム ATCC 15354 [0055] これらを入手するには、例えばアメリカン 'タイプ ·カルチヤ一 ·コレクションより分譲を受けること力 Sできる（住所 P.O. Box 1549, Manassas, VA 2010812301 Parklawn Dri ve， Rockville, Maryland 20852， United States of America)。すなわち、菌株毎に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることができる。各菌株に対応する登録番号はアメリカン'タイプ'カルチャー 'コレクションのカタ口グに記載されている（http：〃 www.atcc.org/参照）。また、 AJ12340株は、 1987年 10月 2 7日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 (現独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター） ( 305-5466 日本国茨城県つくば巿東 1 丁目 1番地 1 中央第 6)に FERM BP-1539の受託番号でブダペスト条約に基づいて寄託されている。また、 AJ12418株は、 1989年 1月 5日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に FERM BP-2205の受託番号でブダペスト条約に基づいて寄託されている。

[0056] 以下、上述したような親株に L アミノ酸生産能を付与する方法について述べる。

[0057] L アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、 L アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はェシエリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、 1986年 5月 30日初版発行、第 77〜； 100頁参照）。ここで、 L アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよぐ 2種又は 3種以上であってもよい。また、発現が増強される L アミノ酸生合成系酵素も、単独であつても、 2種又は 3種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。

[0058] L アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、 L アミノ酸のアナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわち X線や紫外線の照射、または N メチル Ν' ニトロ N ニトロソグァ二ジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつ L アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることカできる。以下、具体的にアミノ酸生産能を付与する方法とアミノ酸生産菌について例示する

〇

[0059] L—トリプトファン、 L—フエ二ルァラニン、 Lーチロシンは共に芳香族アミノ酸で生合成系が共通しており、芳香族アミノ酸の生合成系酵素をコードする遺伝子としては、デォキシァラビノーヘプッロン酸リン酸シンターゼ (aroG)、コリスミン酸ムターゼープレフェン酸デヒドラターゼ（pheA)、 3—デヒドロキネートシンターゼ（aroB)、シキミ酸デヒドロゲナーゼ（_ar0E)、シキミ酸キナーゼ（aroL)、 5—ェノール酸ピルビンシキミ酸 3— リン酸シンターゼ（aroA)、コリスミ酸シンターゼ (aroC)が挙げられる（欧州出願公開 76 3127号明細書）。また、これらの遺伝子はチロシンリプレッサー（tyrR)によって制御されることが知られており、 tyrR遺伝子を欠損させることによって、芳香族アミノ酸の生合成系酵素活性を上昇してもよい（欧州特許 763127号明細書参照）。尚、酵素名の後のカツコ内は、遺伝子名である（以下の記載においても同様)。

また、それぞれのアミノ酸生産能を強化する場合、目的とする芳香族アミノ酸以外の生合成系を弱化させてもよい。例えば、目的アミノ酸が L トリブトファンの場合、 L フエ二ルァラニン生合成系、 Lーチロシン生合成系を弱化させてもよい（US4, 371,6 14)。

[0060] また、 3—デォキシ D ァラビノヘプッロン酸 7 リン酸シンターゼ（aroF、 aroG )は、芳香族アミノ酸によるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を受けないように改変してもよい。例えば、 aroFの場合、 N末端より 147番目の L ァスパラギン酸または 181番目の L セリンが他のアミノ酸残基に、 aroGの場合、 N末端より 146番目の L ァスパラギン酸、 147番目の L メチォニン、 150番目の L プロリンもしくは 202番目の L ァラニンの 1アミノ酸残基、または 157番目の L メチォニン及び 219番目の Lーァラニンの 2アミノ酸残基を他のアミノ酸に置換した変異型 aroF、 aroG遺伝子を宿主に導入することによって、芳香族生産アミノ酸生産菌を得ることができる（EP0488424)。また、コリスミン酸ムターゼープレフェン酸デヒドラターゼも、芳香族アミノ酸によるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を受けないように改変してもよい。

[0061] また、分岐鎖アミノ酸の合成に関与する遺伝子として、 ilvGMEDAオペロンが挙げられる力 S、同オペロンは、 Lーバリン及び/又は L イソロイシン及び/又は L ロイシンによるオペロンの発現調節（ァテ二ユエーシヨン）を受けるので、ァテニユエーションに必要な領域が除去又は変異された ilvGMEDAオペロンを微生物に保持させることによって、これらの L アミノ酸の生産性を向上させることができる。

[0062] 芳香族アミノ酸、分岐鎖アミノ酸はそれぞれ生合成系が共通しており、目的とする L

アミノ酸以外の芳香族アミノ酸、分岐鎖アミノ酸に固有の生合成系を弱化した株を用いることが好ましい。例えば、目的アミノ酸力 SL トリブトファンの場合、 L フエ二ノレァラニン、 Lーチロシン固有の生合成系を弱化すること、目的アミノ酸が L—フエ二ノレァラニンの場合、 L トリブトファン、 L チロシン固有の生合成系を弱化すること、目的アミノ酸が Lーバリンの場合、 L一口イシン、 L—イソロイシン固有の生合成系を弱化すること、目的アミノ酸が L イソロイシンの場合、 L バリン、 L ロイシン固有の生合成系を弱化すること、目的アミノ酸が L ロイシンの場合、 L バリン、 L イソロイシン固有の生合成系を弱化することによって、目的 L アミノ酸を効率よく生産する菌株を得ること力 Sできる。生合成系を弱化することは、その生合成系の酵素をコードする遺伝子に変異を導入すること、また弱化したい生合成系により合成される L アミノ酸を要求する株を、同 L アミノ酸を含有する合成培地を用いて取得することにより達成できる。

以下に、 L アミノ酸生産能を付与する方法及び本発明で使用することのできる L アミノ酸生産能が付与された微生物を例示する。

[0063] L トリプトファン生産菌

L—トリブトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、変異 trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニル -tRNAシンテターゼが欠損した Ε· coli JP4735/ pMU3028 (DSM10122)及び JP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第 5,756,345号)、トリプトフアナーゼが欠損した Ε· coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及び AGX6(p GX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第 4,371,614号)、フォスフォェノールピルビン酸生産能が増大した E. coli AGX17/pGX50,pAC G4-pps (WO9708333,米国特許第 6,319,696号)などのェシエリヒア属に属する株が挙げられる力 S、これらに限定されない。 yedA遺伝子または yddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したェシエリヒア属に属する L—トリブトファン生産菌も使用できる (米国特許出願公開 2003/01 48473 A1及び 2003/0157667 Al)。

[0064] L トリブトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アントラニレートシンターゼ (trpE)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ (serA)、及び、トリプトフアンシンターゼ (trpAB)から選ばれる酵素の活性の一種以上が増大した株も挙げられる。アントラニレートシンターゼ及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共に L トリプトファン及び Lーセリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持する E. coli SV164、及び、フィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異 serA遺伝子を含むプラスミド pGH5を E. coli SV164に導入することにより得られた SV164 (pGH5)が挙げられる。

前記 E. coli SV164 (trpE8)は、リプトフアンによるフィードバック阻害が解除されたァントラニレートシンターゼをコードする変異型 trpE遺伝子を、 trpE欠失株である Ε· coli B862 (DSM7196)に導入することによって得られた株である（WO94/08031、特表平 7-507693号）。 E. coli SV164 (pGH5)は、この SV164株に、セリンによるフィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型 serA5 遺伝子を含むプラスミド pGH5 (WO94/08031)を導入することによって得られた株である。 Ε· coli SV164 (pGH5)は、 L トリプトファンだけでなぐ L セリンも生産する（米国特許第 7,045,320号)。

上記 E. coli KB862は、 AJ13828と命名され、 2000年 12月 21日に工業技術院生命ェ学工業技術研究所 (現独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ一、 τ 305-8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)にブダペスト条約に基づいて国際寄託され、受託番号 FERM BP-7405が付与されている。

[0065] また、 L トリブトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例として、 3 フォスフォセリンフォスファターゼ（serB)活性を増大した株（US4，371,614)、フォスフォエノ一ルビルビン酸カルボキシキナーゼ（pckA)を増大した株 (WO2004/090125)、マレートシンターゼ.イソシトレートリアーゼ.イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ/フォスファターゼオペロン（aceオペロン）が構成的に発現する力、、又は同オペロンの発現が強化された株 (WO2005/103275)が挙げられる。

[0066] L トリブトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、阻害解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株 (特開昭 57-71397号，特開昭 62-244382号，米国特許第 4,371,614号)も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン (trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることにより L トリブトファン生産能を付与してもよい。トリプトフアンシンターゼは、それぞれ trpA及び trpB遺伝子によりコードされる α及び βサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼォペロンの発現を増大させることにより L トリプトファン生産能を改良してもよい (WO2005/103275)

〇

[0067] コリネ型細菌としてはサルファグァ二ジンに耐性株であるコリネバタテリゥム ·グルタミクム AJ12118 (FERM BP-478 特許 01681002号）、トリプトファンオペロンが導入されたコリネ型細菌（特開 S63240794号公報）、コリネ型細菌由来のシキミ酸キナーゼをコドする遺伝子を導入したコリネ型細菌（特開 01994749号公報）を用いることができ

[0068] L—フエ二ルァラニン生産菌

L フエ二ルァラニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、 E. coli AJ12479(FERM BP- 4796)(EP 1484410A) (実施例 2参照）、 E.coli AJ12739 (tyrA::Tn 10， tyrR) (V PM B_8197)、変異型 pheA34遺伝子を保持する E.coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、 E. coli MWEC101- b (KR8903681)、 E.coli NRR L B- 12141， NRRL B- 12145， NRRL B-12146及び NRRL B- 12147 (米国特許第 4,407 ，952号)などのェシエリヒア属に属する株が挙げられる力 S、これらに限定されない。また、親株として、 E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP_3566)、 E. coli K-12 [ W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP- 12659)、 E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm ] (FERM BP- 12662)及び AJ 12604と命名された Ε· coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-ar oG4， pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる (EP 488424 Bl)。さらに、 yedA遺伝子または yddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したェシエリヒア属に属する L—フエ二ルァラニン生産菌も使用できる (米国特許出願公開 2003/0148473 A1及び 2003/0157667 Al)。

[0069] コリネ型細菌のフエ二ルァラニン生産菌としては、ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼまたはピルビン酸キナーゼ活性が低下した Cornebacterium glutamicum B PS-13株 (FERM BP-1777, 77 (FERM BP-2062)及び K78 (FERM BP-2063) (欧州特許公開公報 331145号 JP 02303495)、チロシン要求性株（JP 05049489)等を使用すること力 Sでさる。

[0070] また、フエ二ルァラニン生産菌としては、副生物を細胞内に取り込むように改変すること、例えば、 L トリプトファンの取り込み遺伝子 tnaB，mtrや、 Lーチロシンの取り込み遺伝子である tyrPの発現量を向上させることによつても、効率よく L—フエ二ルァラニンを生産する菌株を取得することができる（EP1484410)。

[0071] Lーチロシン生産菌

チロシン生産菌としては、チロシンによる阻害を受けない脱感作型のプレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子 (tyrA)を有するェシエリヒア属細菌（欧州特許出願公開 1616940 号公報）が挙げられる。

[0072] Lーバリン生産菌

Lーバリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、 ilvGMEDAオペ口ンを過剰発現するように改変された株 (米国特許第 5,998， 178号)が挙げられるが、これらに限定されない。 ilvGMEDAオペロンのァテニユエーシヨンに必要な領域を除去し、生産される Lーバリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロンの ilvA遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。

[0073] 本発明の Lーバリン生産菌を誘導するための親株の例としては、アミノアシル t-RNA シンテターゼに変異を有する変異株 (米国特許第 5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロイシン tRNAシンテターゼをコードする ileS遺伝子に変異を有する Ε· coli VL19 70が使用できる。 E. coli VL1970は、 1988年 6月 24日、ルシアン 'ナショナル'コレクシヨン ·ォブ'インダストリアル 'マイクロオルガ二ズムズ (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545， Russia)に、受託番号 VKPM B-4411で寄託されている。さらに、生育にリポ酸を要求する、及び/または、 H⁺-ATP_aSeを欠失している変異株 (WO96/06926)を親株として用いることができる。

[0074] コリネ型細菌の L パリン生産菌としては、例えば、 Lーバリン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように改変した菌株を挙げることができる。 Lーバリン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、 ilvBNCオペロンによりコードされる酵素、すなわち ilvBNによりコードされるァセトヒドロキシ酸シンターゼゃ MCによりコードされるイソメロリダクターゼ (国際公開パンフレット WO00-/50624号)が挙げられる。尚、 ilvBNCオペロンは、 Lーバリン及び/又は L イソロイシン及び/又は L ロイシンによるオペロンの発現調節を受けるので、生成する L パリンによる発現抑制を解除するためにァテニユエーシヨンを解除することが望まし!/、。

[0075] Lーバリン生産能を有するコリネ型細菌としては、 L バリン産生を減少させる物質代謝経路に関与する、少なくとも 1種の酵素の活性を低下あるいは欠損させることにより行ってもよい。例えば、 L一口イシン合成に関与するスレオニンデヒドラターゼゃ D -パントセナート合成に関与する酵素の活性を低下させることが考えられる（国際公開パンフレット WO0050624号）。

[0076] L パリン生産能を付与する別の方法として、アミノ酸アナログなどへの耐性を付与する方法も挙げられる。

例えば、 L イソロイシンおよび L メチォユン要求性，ならびに D リボ—ス，プリンリボヌクレオシドまたはピリミジンリボヌクレオシドに耐性を有し，かつ Lーバリン生産能を有する変異株（FERM P-1841、 FERM P_29、特公昭 53-025034)や、ポリケトイド類に耐性を有する変異株 (FERM P-1763、 FERM P_1764、特公平 06-065314)、更には酢酸を唯一の炭素源とする培地で Lーバリン耐性を示し、且つグルコースを唯一の炭素源とする培地でピルビン酸アナログ (-フルォロピルビン酸等)に感受性を有する変異株（FERM BP-3006、 FERM BP_3007、特許 3006929号）が挙げられる。

[0077] L イソロイシン生産菌

L—イソロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、 6—ジメチノレアミノブリンに耐性を有する変異株 (特開平 5-304969号)、チアイソロイシン、イソ口イシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらに DL ェチォニン及び/またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株 (特開平 5-1 30882号).が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、スレオニンデァミナーゼ、ァセトヒドロキシ酸シンターゼなどの L イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる (特開平 2-45 8号， FR 0356739,及び米国特許第 5,998， 178号)。

[0078] コリネ型細菌の L イソロイシン生産菌としては、分岐鎖アミノ酸排出タンパク質をコードする brnE遺伝子を増幅したコリネ型細菌（特開 2001-169788)、 L リジン生産菌とのプロトプラスト融合により L イソロイシン生産能を付与したコリネ型細菌（特開昭 6 2-74293)、ホモセリンデヒドロゲナーゼを強化したコリネ型細菌（特開昭 62-91193)、スレオニンハイドロキサメート耐性株（特開昭 62-195293)、 aーケトマロン耐性株（特開昭 61-15695)、メチルリジン耐性株（特開昭 61-15696)が挙げられる。

[0079] L一口イシン生産菌

L一口イシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性の E . coil株（例えば、 57株（VKPM B-7386,米国特許第 6, 124, 121号》または /3— 2—チェニルァラニン、 3—ヒドロキシロイシン、 4ーァザロイシン、 5,5,5-トリフルォロロイシンなどのロイシンアナログ耐性の E. coli株 (特公昭 62-34397号及び特開平 8-70879号)、 WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られた E. coli株、 E. coli H-9068 ( 特開平 8-70879号)などのェシエリヒア属に属する株が挙げられる力これらに限定されなレ、。

[0080] 本発明の細菌は、 L一口イシン生合成に関与する遺伝子の 1種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、好ましくはし一ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコ一ドする変異 leuA遺伝子 (米国特許第 6,403,342号)に代表される、 leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、本発明の細菌は、細菌の細胞から L アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の 1種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、 b2682遺伝子及び b2683遺伝子 (ygaZH 遺伝子）（EP 1239041 A が挙げられる。

[0081] コリネ型細菌の L一口イシン生産菌としては、 2—チアゾールァラニンかつ /3—ハイドロキシロイシン耐性株（特開平 8— 266295)、ノリンアナログ耐性株（特開昭 63— 2 48392)、ノリン要求性株（特公昭 38— 4395)、 S—（2 アミノエチル） L システイン (AEC)耐性株（特公昭 51— 37347)、フエ二ルァラニン、ノリン、イソロイシン要求性株（特公昭 54— 36233)が挙げられる。

[0082] L グルタミン酸生産菌

L グルタミン酸生産菌として好適な菌株は、例えば、 L グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように改変する方法を挙げることができる。 L グルタミン酸生合成に関与する酵素としては、力、かる遺伝子の例としては、グルタメートデヒドロゲナーゼ（gdhA)、グルタミンシンテターゼ (glnA)、グルタメ一トシンテターゼ (gltAB)、イソシトレートデヒドロゲナーゼ (icdA)、アコ二テートヒドラターゼ (ac nA, acnB)、シトレートシンターゼ (gltA)、フォスフォェノールピルべートカルボシラーゼ (ppc)、ピルべ一トデヒドロゲナーゼ (aceEF, lpdA)、ピルべートキナーゼ (pykA, pykF)、フォスフォェノールピルべートシンターゼ (ppsA)、エノラーゼ (eno)、フォスフォグリセ口ムターゼ (pgmA, pgml)、フォスフォグリセレートキナーゼ (pgk)、グリセルアルデヒド- 3_ フォスフェートデヒドロゲナーゼ (gapA)、トリオースフォスフェートイソメラーゼ (tpiA)、フノレクトースビスフォスフェートアルドラーゼ (fbp)、フォスフォフルクトキナーゼ（pfkA, pfk B)、グルコースフォスフェートイソメラーゼ (pgi)などが挙げられるがこれらに限定されない。

[0083] シトレートシンテターゼ遺伝子、フォスフォェノールピルべ一トカルボキシラーゼ遺伝子、イソクェン酸デヒドロゲナーゼ、ピルべ一トデヒドロゲナーゼ及び/またはダルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改変された株の例としては、 EP1078989A、 EP955368A及び EP952221A、 EP1033407Aに開示されたものが挙げられる。

[0084] L グルタミン酸生産能を付与するための改変は、 L グルタミン酸の生合成経路力分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損させることにより行ってもよい。 L—グルタミン酸の生合成経路から分岐して L ダルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、イソクェン酸リアーゼ、 aーケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、ァセトヒドロキシ酸シンターゼ、ァセト乳酸シンターゼ、ギ酸ァセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、 1 ピロリン 5—カルボキシレートデヒドロゲナーゼなどが挙げられる

〇

[0085] 例えば、 α—ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させるには該酵素の Elo サブユニットをコードする _sucA (odhA)遺伝子を用いて改変すればよい。 aーケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下した株として、例えば、以下の株が挙げられる。ブレビバタテリゥム'ラタトフアーメンタム A S株（国際公開 95/34672号パンフレット）ブレビバタテリゥム.ラタトフアーメンタム AJ12821(FERM BP-4172；フランス特許公報 9401748号明細書参照）

ブレビバタテリゥム 'フラバム AJ 12822 (FERM BP-4173；フランス特許公報 9401748 号明細書参照）

コリネバタテリゥム.グルタミカム AJ12823(FERM BP-4174 ;フランス特許公報 940174 8号明細書参照）

パントエア.アナナティス AJ13601 (FERM BP-7207)

クレブシエラ.プランティコーラ AJ 13410株（FERM BP-6617)

パントエア.アナナティス AJ13355 (FERM BP-6614)

ここで、パントエア'アナナティス AJ13356は、 a KGDH-Elサブユニット遺伝子 (sue A)の破壊により α -ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損している。この株は、単離された時には、ェンテロバクタ一'アグロメランスと同定され、ェンテロバクタ一'ァグロメランス AJ 13356として寄託された。し力、し、 16S rRNAの塩基配列などに基づき、パントエア ·アナナティスに再分類された。 AJ13356は、上記寄託機関にェンテロバタター .ァグロメランスとして寄託されている力本明細書では、パントエア.アナナティスとして記載する。

[0086] さらにコリネ型細菌に L グルタミン酸生産能を付与する方法として、 yggB遺伝子 (N Cgl 1221 ; NP_600492. Reports small-conductance. [gi: 19552490] ; WO2006/070944) を増幅する方法、コード領域内に変異を導入した変異型 yggB遺伝子を導入する方法を用いることも可能である。

[0087] L グルタミン酸生産能を付与または増強する別の方法として、有機酸アナログや呼吸阻害剤などへの耐性を付与する方法や細胞壁合成阻害剤に対する感受性を付与する方法も挙げられる。例えば、モノフルォロ酢酸耐性を付与する方法（特開昭 50 -113209)、アデニン耐性またはチミン耐性を付与する方法（特開昭 57-065198)、ウレァーゼを弱化させる方法（特開昭 52-038088)、マロン酸耐性を付与する方法（特開昭 52-038088)、ベンゾピロンまたはナフトキノン類への耐性を付与する方法（特開昭 56-1889)、 HOQNO耐性を付与する方法（特開昭 56-140895)、 α _ケトマロン酸耐性を付与する方法（特開昭 57-2689)、グァニジン耐性を付与する方法（特開昭 56-3598 1)、ペニシリンに対する感受性を付与する方法（特開平 4-88994)などが挙げられる。このような耐性菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。

ブレビバタテリゥム 'フラバム AJ3949 (FERM ΒΡ-2632：特開昭 50-113209参照）コリネバタテリゥム.グルタミカム AJ11628 (FERM Ρ-5736；特開昭 57-065198参照）ブレビバタテリゥム.フラバム AJ11355(FERM P-5007；特開昭 56-1889号公報参照）コリネバタテリゥム.ダルタミカム AJ11368(FERM P-5020；特開昭 56-1889号公報参照）ブレビバタテリゥム.フラバム AJ11217(FERM P-4318；特開昭 57-2689号公報参照）コリネバタテリゥム.ダルタミカム AJ11218(FERM P-4319；特開昭 57-2689号公報参照）ブレビバクテリウム'フラバム AJ11564(FERM P-5472；特開昭 56-140895公報参照）ブレビバタテリゥム.フラバム AJ11439(FERM P-5136；特開昭 56-35981号公報参照）コリネバタテリゥム .ダルタミカム H7684(FERM BP-3004；特開平 04-88994号公報参照 )

ブレビバクテリウム'ラタトフアーメンタム AJ11426 (FERM P-5123；特開平 56-048890号公報参照）

コリネバタテリゥム.グルタミカム AJ11440 (FERM P-5137；特開平 56-048890号公報参照）

ブレビバクテリウム'ラタトフアーメンタム AJ11796 (FERM P-6402；特開平 58-158192号公報参照）

本発明に用いられる Lースレオニン生産菌として好まし!/、ものとしては、 Lースレオニン生合成系酵素を強化した腸内細菌科に属する細菌が挙げられる。 Lースレオニン生合成系酵素をコードする遺伝子としては、ァスノルトキナーゼ III遺伝子（lysC)、ァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（asd)、 thrオペロンにコードされるァスバルトキナーゼ I遺伝子（thrA)、ホモセリンキナーゼ遺伝子（thrB)、スレオニンシンターゼ遺伝子 (thrC)が挙げられる。これらの遺伝子は 2種類以上導入してもよい。 Lースレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制された腸内細菌科に属する細菌に導入してもよい。スレオニン分解が抑制されたェシエリヒア属細菌としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性が欠損した TDH6株（特開 2001-346578 号)等が挙げられる。

[0089] Lースレオニン生合成系酵素は、最終産物の Lースレオニンによって酵素活性が抑制される。従って、 Lースレオニン生産菌を構築するためには、 Lースレオニンによるフィードバック阻害を受けないように L—スレオニン生合成系遺伝子を改変することが望ましい。また、上記 thrA、 thrB, thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成している、スレオニンオペロンは、ァテニユエ一ター構造を形成しており、スレオニンオペ口ンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンにより阻害を受け、また、ァテニユエーシヨンにより発現が抑制される。このァテニユエーシヨンの解除又は低減は、ァテニユエーシヨン領域のリーダー配列あるいは、ァテニユエ一ターを除去することにより達成出来る（Lynn, S. P. , Burton, W. S.， Donohue, T. J. , Gould, R. Μ·， Gumport, R. I. ， and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194: 59-69 (1987);国際公開第 02/26993号パンフレット；国際公開第 2005/049808号パンフレット参照）。

[0090] スレオニンオペロンの上流には、固有のプロモーターが存在するが、非固有（non-n ative)のプロモーターに置換してもよいし（WO98/04715号パンフレット参照）、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファージのリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるようなスレオニンオペロンを構築してもよい（欧州特許第 0593792号明細書参照）。また、 L—スレオニンによるフィ一ドバック阻害を受けないようにェシエリヒァ属細菌を改変するために、 α —アミノー /3—ヒドロキシ吉草酸 (AHV)に耐性な菌株を選抜することによつても得られる。

[0091] このように Lースレオニンによるフィードバック阻害を受けないように改変されたスレォニンオペロンは、宿主内でコピー数が上昇しているか、あるいは強力なプロモータ一に連結し、発現量が増大していることが好ましい。コピー数の上昇は、プラスミドによる増幅の他、トランスポゾン、 Mu—ファージ等でゲノム上にスレオニンオペロンを転移させることによつても達成出来る。

[0092] また、ァスパルトキナ一ゼ III遺伝子（lysC)は、 L リジンによるフィ一ドバック阻害を受けなレ、ように改変した遺伝子を用いることが望ましレ、。このようなフィドバック阻害を受けないように改変した lysC遺伝子は、米国特許 5,932,453号明細書に記載の方法により取得できる。

[0093] Lースレオニン生合成系酵素以外にも、解糖系、 TCA回路、呼吸鎖に関する遺伝子や遺伝子の発現を制御する遺伝子、糖の取り込み遺伝子を強化することも好適である。これらの Lースレオニン生産に効果がある遺伝子としては、トランスヒドロナーゼ遺伝子（pntAB) (欧州特許 733712号明細書）、ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（p印 C) (国際公開 95/06114号パンフレット）、ホスホェノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps) (欧州特許 877090号明細書)、コリネ型細菌あるいはバチルス属細菌のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（国際公開 99/18228号パンフレット、欧州出願公開 1092776号明細書）が挙げられる。

[0094] また、 Lースレオニンに耐性を付与する遺伝子、及び/又は L—ホモセリンに耐性を付与する遺伝子の発現を強化することや、宿主に Lースレオニン耐性、及び/又は L—ホモセリン耐性を付与することも好適である。耐性を付与する遺伝子としては、 rhtA遺伝子 (Res. Microbiol. 154: 123— 135 (2003))、 rhtB遺伝子（欧州特許出願公開第 0994190号明細書）、 rhtC遺伝子（欧州特許出願公開第 1013765号明細書）、 yfiK 、 yeaS遺伝子（欧州特許出願公開第 1016710号明細書）が挙げられる。また宿主に L ースレオニン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第 0994190号明細書や、国際公開第 90/04636号パンフレット記載の方法を参照出来る。

[0095] Lースレオニン生産菌として、ェシエリヒア'コリ VKPM 8-3996株（米国特許第5，175，

107号明細書参照）を例示することが出来る。この VKPM B-3996株は、 1987年 11月 19日にロシアン ·ナショナル ·コレクション ·ォブ ·インダストリアル ·マイクロオーガニズム (Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNU Genetika ) (住所： Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd. 1)に登録番号 VKPM B-3996 のもとに寄託されている。また、この VKPM B-3996株は、ストレプトマイシン耐性マーカーを有する広域ベクタープラスミド pAYC3² (Chistorerdov， A. Υ·， and Tsygankov, Y. D. Plasmid, 16， 161-167 (1986)を参照のこと）にスレオニン生合成系遺伝子（スレォニンオペロン： thrABC)を揷入して得られたプラスミド pVIC40 (国際公開第 90/0463 6号パンフレット）を保持している。この pVIC40においては、スレオニンオペロン中の th rAがコードするァスバルトキナーゼ I ホモセリンデヒドロゲナーゼ Iの、 Lースレオニンによるフィードバック阻害が解除されて!/、る。

[0096] また、ェシエリヒア'コリ VKPM B-5318株 (欧州特許第 0593792号明細書参照)も好適な L スレオニン生産菌として例示することができる。 V PM B-5318株は、 1990年 5 月 3日にロシアン ·ナショナル ·コレクション ·ォブ ·インダストリアル ·マイクロオーガニズム (Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNU Genetika )に登録番号 VKPM B-5318のもとに寄託されている。またこの VKPM B-5318株は、イソロイシン非要求性菌株であり、ラムダファージの温度感受性 C1リプレッサー、 PR プロモーターおよび Croタンパク質の N末端部分の下流に、本来持つ転写調節領域であるァテニユエ一ター領域を欠失したスレオニンオペロンすなわちスレオニン生合成関与遺伝子が位置し、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファージのリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるように構築された組換えプラスミド DN Aを保持している。

[0097] また、本発明に用いる L アミノ酸生産菌は、固有の生合成系酵素をコードする遺伝子以外に、糖の取り込み、糖代謝 (解糖系）、エネルギー代謝に関与する遺伝子が増幅されていてもよい。

[0098] 糖代謝に関与する遺伝子としては、解糖系酵素をコードする遺伝子や糖の取り込み遺伝子が挙げられ、グルコース 6 リン酸イソメラーゼ遺伝子 (pgi ;国際公開第 01/ 02542号パンフレット）、ホスホェノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps; 欧州出願公開 877090号明細書）、ホスホダルコムターゼ遺伝子（pgm ;国際公開 03/04598号パンフレット）、フルクトースニリン酸アルドラーゼ遺伝子（ftp;国際公開 03/04664号パンフレット）、ピルビン酸キナーゼ遺伝子（pykF;国際公開 03/008609号パンフレット）、トランスアルドラーゼ遺伝子（talB;国際公開 03/008611号パンフレット）、フマラーゼ遺伝子（fom;国際公開 01/02545号パンフレット）、ホスホェノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps;欧州出願公開 877090号パンフレット）、 non-PTSシュクロース取り込み遺伝子遺伝子（csc;欧州出願公開 149911号パンフレット）、シュクロース資化性遺伝子（ scrABオペロン；国際公開第 90/04636号パンフレット）が挙げられる。

[0099] エネルギー代謝に関与する遺伝子としては、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子 (pntAB;

米国特許 5,830,716号明細書）、チトクロム bo型ォキシダーゼ（cytochrome bo type o xidase)遺伝子 (cyoB欧州特許出願公開 1070376号明細書)が挙げられる。

実施例

[0100] 以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されない。

[0101] 〔参考例 1〕L トリブトファン生産菌の構築

< 1 - 1 > serA遺伝子の導入

プラスミド pGH5 (国際公開第 9408031号パンフレット）上のホスホダリセレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（serA)の、トランスポゾン Mudを用いたゲノム上への揷入を試みた。

MudII1734を含有するプラスミド pCE1134 (特開平 2-109985号公報）を BamHIで切断して lacオペロン含有 DNA断片を除去し、平滑末端後 Smalリンカーを揷入した。このプラスミドを Smalで再切断し自己閉環して得られたプラスミドを pMul 134と命名した。 E. coli由来の serA遺伝子を含有するプラスミド pGH5から Scal、 Sail切断にて serA含有 DN A断片を切り出し、平滑末端後、上記の pMul 134の Smalサイトに揷入することによって、 pGH5由来の serA遺伝子が揷入された Mud (MudserAと命名）を搭載したプラスミド p MudserAを構築した。

[0102] 脱感作型アントラニル酸合成酵素を保持する L トリブトファン生産菌 SV164株（国際公開第 9408031号パンフレット）を受容菌として、 pMudserAを用いて定法に従い力ナマイシン耐性付与を指標にして MudserAをゲノム上に転移させた菌株 L 朱を取得した。 L 朱は、サザンハイブリダィゼーシヨン実験の結果、 MudserAの揷入位置は一箇所のみと推定された。また、 PCRによる MudserA含有ゲノム DNA断片のクローニングとその塩基配列決定にて、 Ε· coli K-12ゲノム（GenBank Accession No. U00096) 上の Νο·240，950の位置に揷入されていると同定された。

[0103] < l 2〉trpオペロンの導入次に、 trpオペロンのトランスポゾンを用いたゲノム上への揷入によるコピー数の追加を試みた。 trpオペロン遺伝子はプラスミド pGXlOOより切り出した。 pGXlOOは、 pBR 313に、脱感作型 trpE遺伝子を有する E. coli MTR#2株（米国特許第 4,371,614号明細書）由来の DNA断片を揷入したものであり、 XhoI、 Smal切断によって約 7.6 kbの trp オペロン含有 DNA断片を切り出すことができる。 pGXlOO力、ら XhoI、 Smal切断にて trp オペロン含有 DNA断片を切り出し、平滑末端後、上記の pCEl 134の Smalサイトに揷入した。同様の trpオペロン含有 DNA断片は、 E. coli MTR#2株ゲノム DNAより、配列表に記載した配列番号 1及び 2のプライマーを用いて直接 PCR法によってクローニングすることも可能である。以上のようにして、 MTR#2株由来の trpオペロン遺伝子が揷入された Mud (MudtrpG' lacと命名）を搭載するプラスミド pMudtrpG'lacが構築された

〇

[0104] MudtrpG' lacのゲノム上への揷入によるコピー数の追加に先立ち、揷入株の選択マーカーとしてラタトース資化能相補を用いる目的で、宿主株へのラタトース資化能欠損の性質付与を実施した。 L 朱に、 Lースレオニン生産菌 VKPM B-3996由来の ilv G遺伝子を PI形質導入することによって (米国特許第 5,175,107号明細書) L パリン耐性を導入した（国際公開 WO2005/103228号パンフレット参照）。定法に従い、 P1形質導入実験を実施し、 M9最小培地（4 g/L glucose, 12.8 g/L Na HPO · 7Η 0、 3 g/ L KH PO、 0.5 g/L NaCl、 1 g/L NH Cl、 5 mM MgSO、 0.1 mM CaCl、 1 mg/L thia

2 4 4 4 2 mine、 20 mg/1し _Phe、 20 mg/Lし _Tyr、 20 mg/Lし一 Met、 3 mg/L pyridoxine^ 20 mg /L L-Val、 20 mg/L tetracycline)に塗布し、出現したコロニーを Val耐性株として取得し、 LlValRと名づけた。

[0105] ME858 朱（HfrH(valS— uxuAB):lacZ98::TnlO relAl thi_l、国立遺伝学研究所に寄託）より TnlO由来のテトラサイクリン耐性を指標として、 lacZ98::TnlOを定法に従い L lValRに P1形質導入した。得られた株は、予想通りラタトース資化能は欠損していた。次いで、ラタトース資化能は欠損している力 TnlO自体は除去された株を取得するため、形質導入株からテトラサイクリン感受性株 14-1-lac-tetsを、レプリカ処理によって取得した。 14-1-lac-tets株は、ラタトース資化能は欠損したままであった。サザンハイブリダィゼーシヨン実験にて同株の TnlOの状況を確認したところ、 tet遺伝子にハイブリするバンドは検出されなかった力 S、 TnlOの IS10領域にハイブリするバンドは検出されたので、本株では lacZ遺伝子上に IS10が残存して!/、ると考えられた。

[0106] 14-1-lac-tets株を受容菌として、 pMudtrpG' lacを用いて定法に従!/、ラタトース資化能相補を指標にして MudtrpG' lacをゲノム上に転移させた菌株 N0.202株を取得した。得られたトランスポゾン揷入株から揷入トランスポゾンあるいはトランスポゾン上の遺伝子が脱落しやすい場合には、栄養培地上で植え継ぎ、カナマイシン耐性、ラタトース資化能等を安定に保持する菌株を選択すればよい。 No.202株は、サザンハイプリダイゼーシヨン実験の結果、 MudtrpG' lacの揷入位置は一箇所のみと推定された。また、 PCRによる MudtrpG' lac含有ゲノム DNA断片のクローニングとその塩基配列決定にて、 Ε· coliK_12ゲノム（GenBank Accession No. U00096)上の Νο·530，249の位置に揷入されていると同定された。

[0107] 次にシュクロース資化性に関与する遺伝子 scrK, scrY, scrA, scrB, scrRを PI形質導入により、 Νο·202に導入し、本菌株を No.202 scrとした（国際公開パンフレット W09 0/04636号参照）。

< 1 3〉 iclR破壊用プラスミド構築

[0108] 添付説明書にしたがって Pyrobest DNA Polymerase (宝酒造）を用いた PCR法により iclR断片を増幅した。 PCR反応には、 RNA/DNA maxi Kit (キアゲン）を用いて抽出した W3110ゲノムを铸型とし、プライマーには配列表に示した配列番号 3、配列番号 4 のオリゴヌクレオチドを用いた。 PCR後の増幅 DNA断片は、 Wizard PCR Preps (プロメガ）を用いて精製した。精製した DNA断片を制限酵素 EcoRI、 Hindlll (宝酒造）にて切断したのち、フエノールクロ口ホルム処理、エタノール沈殿を行い精製した。この切断断片と、同酵素にて切断し精製した pUC18 (宝酒造）とを、 DNA ligation Kit Ver.2 (宝酒造)を用いて結合した。この結合反応液にて JM109コンビテント細胞（宝酒造)を形質転換し、アンピシリン (Amp) (明治製菓）を SO g/mL含む LB寒天プレート（LB+Am pプレート）にまき、 37°Cでコロニーを選択した。コロニーを SO ^u g/mLの Ampを含む L B培地で 37°Cにて試験管培養し、自動プラスミド抽出機 Pト 50 (クラボウ）を用いてブラスミド抽出を行った。

[0109] 得られたプラスミド pUCiclRを制限酵素 Eco065I (宝酒造）にて切断した後、 BKL kit (宝酒造)を用いて末端平滑化及び結合を行った。結合反応液にて JM109を形質転換し、上記のようにコロニーの選択、プラスミド抽出を行った。得られたプラスミドを Eco RI、 Hindlllで切断後精製し、同酵素で切断後精製した温度感受性プラスミド pTS l (p MAN03 KJ. Bacteriol. 162， 1196-1202 (1985)、図 1参照）と pBR322 (宝酒造）のそれぞれの Pstl-Hindlll断片を繋ぎ換えたもの）と結合した。結合反応液にて JM109を形質転換し、 LB+Ampプレートにて 30°Cでコロニーを選択した。コロニーを 50 β g/mL の Ampを含む LB培地で 30°Cにて試験管培養し、上記のようにプラスミドを抽出した。

EcoRI、 Hindlllで切断して目的長断片が得られるプラスミドを、 iclR破壊用プラスミド pT S A iclRとした。

[0110] < 1 4〉 11¾皮壊株の取得

pTS Δ iclRで No.202scrを形質転換し、 LB+Ampプレート上 30°Cでコロニーを選択した。 30°Cで液体培養を一晩おこなった後 10— 3希釈して LB+Ampプレートにまき、 42 °Cでコロニーを選択した。 30°Cで LB+Ampプレートに塗り広げた後、 1/8プレート分の菌体を LB培地 2 mLに懸濁し、 42°Cで 4-5時間振とう培養した。 10— ⁵希釈した菌体を L Bプレートにまき、得られたコロニーのうち数百コロニーを LBプレートと LB + Ampプレートに植菌し生育を確認することで、 Amp感受性'耐性を確認した。 Amp感受性株にっレ、て配列番号 3及び 4のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてコロニー PCRを行い、増幅断片が Eco065Iにより切断されな!/、ものを iclR欠損株（Νο·202 Δ iclR)として取得した。

[0111] 〔実施例 1〕L トリブトファンの製造

トリプトファン生産菌 No.202 A iclRのグリセロールストックを、 LB-ァガロースプレート培地（トリプトン 1%、酵母抽出液 0.5%、塩化ナトリウム 1%、ァガロース 1.5%)に 1エーゼ植菌し、 30°Cで 24時間、静地培養した。この培養菌体を 500ml坂口フラスコに入れた 5 0mlの LB培地（トリプトン 1%、酵母抽出液 0.5%、塩化ナトリウム 1%)に 1エーゼ（約 10 1) 接種し、 30°Cで 7〜8時間、振盪下（115回転/分)で前培養した。

[0112] 前述の前培養液 lmlを、表 2に示した組成を有する 300mlの種培地に接種した。全容 1Lの小型発酵槽を用いて、 30°Cで約 14時間、 800回転/分で、滅菌フィルターにより滅菌した圧縮空気を lwm通気しながら培養した。また、培養中温度は 30°Cに保持し、 pHはアンモニアガスで 6· 5に保持した。

[表 2] 表 2 ：種培地組成

グルコース 10g/L

KH₂P0₄ 1 g/L

(NH₄) ₂ SO ₄ 2. 5g/L

MgS0₄ - 7H₂0 0. 5g/L

FeS0₄ - 7H₂0 10mg/し

MnS0₄ - 4H₂0 10mg/し

大豆加水分解物 0. 4g/L

L一メチォニン 50mg/L

L一フエ二ルァラニン 125mg/L

Lーチロシン 125mg/L ビタミン B1 5mg/L

ピリドキシン 30mg/し

GD-113 0. 05m I /L

[0114] 表 3に示した組成を有する 300mlの主培養培地に、 1.95 g/L濃度のメチルセルロース（MC:和光純薬工業株式会社「メチルセルロース 100cP」）を添加した培地と、 MC を添加しない培地を準備し、それぞれに種培養液 30mlを接種した。全容 1Lの小型発酵槽を用いて、 31°C、 800回転/分の撹拌下で、滅菌フィルタ一により滅菌した圧縮空気を lwm通気しながら主培養を実施した。また、培養期間中温度は 31°Cに保持し、 pHはアンモニアガスで 6.7に保持した。培養中、 700g/Lのグルコース溶液を適宜流加することによって、小型発酵槽内の糖濃度を 5〜20g/Lに調節した。

[0115] [表 3] 表 3 ：主培地組成

成分

グルコース 15g/L

KH₂P0₄ 1g/L

(NH₄) ₂ SO ₄ 1g/L

大豆加水分解物 0.75g/L

NaCI 0.5g/L

MgS0₄-7H₂0 0.3g/L

CaCI₂-2H₂0 14.7mg/L

FeS0₄-7H₂0 10mg/し

MnS0₄-4H₂0 7.5mg/L

L—メチォニン 0.3g/L

L一フエ二ルァラニン 1g/L

Lーチロシン 1g/L

ビタミン B1 5mg/L

ピリドキシン 36.5mg/L

NH₄CI 3.13g/L

K0H 1g/L

GD-113 0.05m I /L

[0116] 主培養 49.5時間後に、培地中の L—トリブトファン濃度を測定した。対糖収率及び生産速度を表 4に示す。表 4は、メチルセルロース無添加を 1とした比率で表している。その結果、メチルセルロース無添加であったものに比べ、メチルセルロースを添カロすると、対糖収率及び生産速度のいずれも向上することが判明した。

[0117] [表 4] 主培養発酵成績

[0118] 培養終了後の発酵液中の不純物を HPLCを用いて分析した結果、メチルセルロース無添加を 1としたとき、メチルセルロース添加条件では 0.637となり、トリプトファン以外の主な不純物総量の低減が確認された。

[0119] 〔実施例²〕 L フエ二ルァラニンの製造

フエ二ルァラニン生産菌 AJ12741(FERM BP-4796)のグリセロールストックを、 LB-ァガロースプレート培地（トリプトン 1%、酵母抽出液 0.5%、塩化ナトリウム 1%、ァガロース 1. 5%)に 1エーゼ植菌し、 37°Cで 24時間、静地培養した。この培養菌体を 500mlの LB培地（トリプトン 1%、酵母抽出液 0.5%、塩化ナトリウム 1%)に 1エーゼ（約 lOul)接種し、 37 °Cで 7時間、振盪下（115回転/分）で前培養した。 AJ1274 朱は、 tyrR、 tyrA遺伝子を欠失したェシエリヒア'コリ K-12の W3110株に、フィードバック阻害が解除された 3— デォキシ D ァラビノヘプッロン酸 7—リン酸シンターゼ、フィードバック阻害が解除されたコリスミン酸ムターゼープレフェン酸デヒドラターゼ、およびシキミ酸キナーゼのそれぞれをコードする遺伝子を含むプラスミド pMGALlを導入した株 (W3110(tyr R、 tyrA)/pMGALl)である（特許第 3225597号公報）。同株は、平成 4年 6月 11日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 (現独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、 T 305-8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6)に FERM P-13000の受託番号で寄託され、平成 6年 9月 14日に、この原寄託からブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管され、 FERM BP-4796として寄託されている。

[0120] 前述の前培養液 lmlを表 5に示した組成を有する 300mlの種培地に接種した。全容

1Lの小型培養槽を用いて、 37°Cで約 14時間、 800回転/分で滅菌フィルタ一により滅菌した圧縮空気を lwm通気しながら培養した。また、培養中温度は 37°Cに保持し、 pHはアンモニアガスで 6.5に保持した。 [0121] [表 5] 表 5 ：種培地組成グルコース 20g/L

KH₂P0₄ 1 g/L

(NH₄) ₂ SO ₄ 8g/L

MgS0₄ - 7H₂0 1 g/L

FeS0₄ - 7H₂0 10mg/L

nS0₄ - 4H₂0 10mg/L

大豆加水分解物 0. 3g/L

Lーチロシン 300mg/L

[0122] 表 6に示した組成を有する 300mlの主培養培地に、 0.5 g/L濃度のメチルセルロース

(MC:和光純薬工業株式会社「メチルセルロース 100cP」）を添加した培地と、 MCを添加しない培地を準備し、それぞれに種培養液 30mlを接種した。全容 1Lの小型発酵槽を用いて、 37°C、 800回転/分の撹拌下で、滅菌フィルタ一により滅菌した圧縮空気を lwm通気しながら主培養を実施した。また、培養期間中温度は 37°Cに保持し、 p Hはアンモニアガスで 7.0に保持した。培養中、 700g/Lのグルコース溶液を適宜流加することによって、小型発酵槽内の糖濃度を 0〜10g/Lに調節した。培養 21時間目に、発酵槽に L—フエ二ルァラニンを 7g添加した。

[0123] [表 6]

表 6 ：主培地組成グルコース 20g/L

KH₂P0₄ 1g/L

(NH₄) ₂ SO ₄ 5g/L

大豆加水分解物 0.5g/L

MgS0₄-7H₂0 1g/L

FeS0₄-7H₂0 10mg/し

MnS0₄-4H₂0 10mg/し

Lーチロシン 1g/L

KOH 0.8g/L

GD-113 0.05m I /L

[0124] 主培養 46時間後に、培地中の L フユ二ルァラニン濃度を測定した。対糖収率及び生産速度を表 7に示す。表 7は、メチルセルロース無添加を 1とした比率で表している。その結果、メチルセルロース無添加であったものに比べ、メチルセルロースを添加すると、対糖収率及び生産速度のレ、ずれも向上することが判明した。

[0125] [表 7] 表 7 主培養発酵成績

産業上の利用可能性

[0126] 本発明によれば、 L アミノ酸生産能を有する微生物を用いた発酵法による Lーァミノ酸の生産法において、 L アミノ酸の生産性を向上させること、及び/又は、培地中に析出する L アミノ酸の結晶中の不純物を低減させることが可能となる。 L アミノ酸の生産性には、対糖収率の向上、及び/又は生産速度の向上が含まれる。

Claims

請求の範囲

[1] L アミノ酸生産能を有する微生物を液体培地で培養し、該培地に L アミノ酸を析出させながら蓄積させる、発酵法による L—アミノ酸の製造法において、前記培地力水溶性セルロース誘導体、水溶性ポリビュル化合物、極性有機溶媒溶解性ポリビュル化合物、水溶性澱粉誘導体、アルギン酸塩、及びポリアクリル酸塩からなる群より選ばれるポリマーを含むことを特徴とする方法。

[2] 前記ポリマーが、カノレポキシメチノレセノレロース、メチノレセノレロース、カノレボキシメチフタレート、ポリビュルピロリドン、ポリビュルアルコール、ポリビュルァセタールジェチノレァミノアセテート、アルギン酸ナトリウム、及びポリアクリル酸ナトリウムからなる群より選ばれる請求項 1に記載の方法。

[3] 前記微生物が、腸内細菌科に属する細菌またはコリネ型細菌である請求項 1または 2に記載の方法。

[4] 前記腸内細菌科に属する微生物が、ェシエリヒア属またはパントエア属に属する細菌である請求項 3に記載の方法。

[5] 前記 L アミノ酸力 L ロイシン、 L イソロイシン、 L バリン、 L トリプトファン、

L フエ二ルァラニン、 Lーチロシン、 Lースレオニン及び L グルタミン酸からなる群より選ばれる請求項;!〜 4のいずれか一項に記載の方法。

[6] 前記ポリマーがメチルセルロースであり、液体培地力 Sメチルセルロースを lg/L以上含むことを特徴とする請求項;!〜 5のいずれか一項に記載の方法。

[7] 前記 L—アミノ酸が L—フエ二ルァラニンである、請求項 5に記載の方法。

[8] 請求項 7に記載の方法により L—フエ二ルァラニンを製造し、得られた L—フエニルァラニンと、ァスパラギン酸又はその誘導体から、 a—L ァスパルチル一 L フエ二ルァラニンの低級アルキルエステルを合成する、 α Lーァスバルチルー L フエ二ルァラニンの低級アルキルエステルの製造方法。

[9] さらに、 L フエ二ルァラニンを L フエ二ルァラニンの低級アルキルエステルにェステル化し、この L—フエ二ルァラニンの低級アルキルエステルを前記ァスパラギン酸の誘導体として Ν ァシルー Lーァスパラギン酸無水物と縮合させ、この反応混合物から N—ァシルー a—L—ァスパルチル— L—フエ二ルァラニンの低級アルキルエステルを分離し、 N—ァシルー a—L—ァスパルチル— L—フエ二ルァラニンの低級ァルキルエステルを水素化して a—L—ァスバルチルー L—フエ二ルァラニンの低級ァルキルエステルを生成させることを含む、請求項 8に記載の方法。