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PERFECTIONNEMENTS A LA PRODUCTION DE SUBSTANCES ANTIBIOTIQUES.
La présente invention est relative à un procédé de préparation des substances antibiotiques et plus particulièrement d'une substance antibiotique nouvelle et efficace produite par culture dans des conditions artificielles d'un microorganisme identifié plus complètement plus loin, de l'espèce des Streptomyces, c'est-à-dire d'un des organismes classés sous le nom d'actimo- mycetes.
On peut également décrire cet organisme comme une souche de Strepto- myces du type des Streptomyces fradiae, cette dernière ayant été isolée du sol en 1915 par Waksman (un des inventeurs) et Curtis, puis désignée sous le nom d'Actinomyces Fradii, mais plus récemment enregistrée dans le manuel de Bergey sous le nom de Streptomyces fradia La souche d'organismes de cette nature ou du moins une souche qui ressemble de très près à celle dénommée ci- dessus et qu'on emploie suivant l'invention est déposée à l'Université Rut- ger, Département microbiologique, Département des cultures types, collection des cultures types, et est également citée dans le collection Américaine de cultures type sous le n officiel 35350 On peut donc ainsi l'identifier de façon pratique et précise sous le nom de Streptomyces n 3535.
'Parmi-les antibiotiques utilisés largement actuellement la strep- tomycine réussit particulièrement comme agent chimiothérapeutique pour un grand nombre de buts, en raison de son activité aussi bien contre les bactéries .négatives au Gram que contre les bactéries positives au Gram, y compris-les myco-bactéries, et on l'a utilisée avec efficacité pour le traitement et le contrôle de certaines formes de tuberculose humaine.Il existe cependant cer- taines souches bactériennes qui sont plus ou moins résistantes à la 'streptomy- cine, la manifestation la plus importante de cette résistance étant son dé- veloppement dans certains cas après administration prolongée de la drogue.
Il en résulte qu'une ou plusieurs souches résistantes peuvent se développer ou , croître parmi les organismes infectieux dans un tel cas, lequel correspond en général à une situation pour laquelle la série initiale de traitements n'a été que partiellement efficace. On comprend par conséquent qu'un antibiotique particulièrement utile serait celui possédant les propriétés essentielles sui-
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vantes : a) haute activité contre les bactéries négatives au Gram et les my- cro-bactéries, b) activité vis-à-vis des souches de bactéries résistantes à la streptomycine, particulièrement des bactéries acido-résistantes, c) basse toxicité vis-à-vis des animaux.
On a découvert, suivant la présente invention que l'on peut uti- liser l'organisme identifié précédemment (Streptomyces n 3535) pour produire une substance antibactérienne nettement nouvelle et exceptionnellement utile, qui présente une composition organique et diffère aux points de vue à la fois chimique et antibiotique des autres susbtances de sa classe générale, telles que la streptomycine, la streptothricine, la griséine, et l'actinomycine.
La nouvelle composition antibiotique nommée néomycine et identi- fiée de façon convenable dans le présent texte se distingue de façon caracté ristique en ce qu'elle possède dans une mesure assez large les propriétés dé- sirables énumérées ci-dessus, et qui indiquent son extraordinaire utilité.
On donnera plus bas une liste plus complète des propriétés antibactériennes mais on peut noter dès maintenant que cette substance a non seulement montré de l'activité contre un certain nombre de souches de bactéries résistantes à la streptomycine (y compris les myco-bactéries), mais est également moins fa- vorable au développement des cultures résistantes dans des circonstances où celles-ci, en présence d'un autre antibiotique tel que la streptomycine se- rait probable. C'est-à-dire parmi un certain nombre de type d'organismes qui comprennent des souches résistant respectivement aux autres antibiotiques, on n'a noté aucune différence notable de leur sensibilité à la néomycine.
Ce nouvel antibiotique, la néomycine, est produit en laissant se développer l'organisme dit streptomyces n 3535 dans un milieu nutritif con- venable à l'état immobile ou aérobie submergé (c'est-à-dire agité) approprié, et en isolant et purifiant ensuite la substance, par exemple par un procédé du genre décrit plus loin comprenant divers stades d'adsorption, de récupéra- tion par élution, de séparation des impuretés et de précipitation. On consta- te que la néomycine ainsi préparée est un composé basique (c'est-à-dire solu- ble dans les solutions acides), très actif en réaction alcaline.
C'est-à-dire que son activité antimicrobienne tend à être limitée en condition acide mais semble s'élever quand on atteint la neutralité, et est définitivement favori- sée dans un milieu alcalin, caractéristique avantageuse si l'on songe à la réaction généralement alcaline du sang. La substance isolée, c'est-à-dire la néomycine, est facilement soluble dans l'eau, dans les solutions acides diluées (par exemple HCl dilué), dans le méthanol aqueux et dans des mélanges acide- alcool à basse normalité acide, tels que les solutions éthanol-acide chlorhy- drique ou méthanol-acide formique utilisées jusqu'ici pour l'élution de la streptomycine à partir des adsorbants. Elle est relativement insoluble dans divers solvants organiques tel: quel-'éther, le chloroforme et l'acétone.
On a trouvé que la néomycine est thermostable, particulièrement en milieu neutre ou légèrement acide ou alcalin, et peut être ainsi chauffée à 100 G pendant plusieurs minutes sans destruction de son activité. Elle est également remarquablement stable en solution quand on la stocke pendant de longues périodes de temps, telles qu'un moins ou plus. On a maintenant ces solutions à la fois à la température ambiante et en les réfrigérant pendant au moins 3 mois sans diminution d'activité. Une telle stabilité permet une distinction précise des substances telles que la pénicilline et l'auréomyci- ne dont les solutions s'altèrent au bout d'un certain nombre de jours, l'auré- omycine étant connue pour son aptitude à s'altérer sérieusement (même en étant réfrigérée) en peu de jours.
A l'état sec, c'est-à-dire cristallisée ou fine- ment divisée d'une autre façon, on peut maintenir la néomycine inaltérée pen- dant de très longues périodes, pratiquement indéfiniment. Elle n'est pas inac- tivée dans le sang ou en présence de sérum ou d'autres matières organiques.
Bien qu'on n'ait pas encore déterminé la structure chimique préci- se de la néomycine, sa nouvelle composition semble pleinement démontrée par sa série unique de propriétés comprenant celles citées ci-dessus et dans la suite du présent mémoire et particulièrement son spectre antibiotique. On es- time que ces propriétés sont très significatives, bien que la substance n'ait
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pas encore été produite à l'état complètement pur, et n'ait pas encore été ain- si susceptible d'une analyse détaillée. Il apparaît cependant que la néomyci- ne ne donne pas la réaction au maltol comme la streptomycine, qu'elle ne donne pas non plus la réaction de Sakaguchi pour les guanidines mono-substituées, ce qui indique ainsi l'absence d'un groupement guanidine, qui est une caracté- ristique distinctive des diverses formes de streptomycine.
Comme on l'a indiqué, le spectre antibiotique de la néomycine est une caractéristique spécifique et intrinsèquement unique, au point de vue de l'identification par rapport aux autres substances antibiotiques. En effet, on reconnaît généralement qu'un tel spectre par exemple d'activité ou d'inac- tivité bactériostatique ou analogue vis-à-vis d'un certain nombre de diffé- rents organismes, constitue un moyen particulièrement efficace pour caracté- riser et identifier les matières de cette classe.
On veut dire par là que chaque substance antibiotique a un spectre nettement déterminable et défini qui la distingue de façon unique des autres matières antibiotiques, sans au- cune nécessité de comparaison numérique parmi ces substances, en ce qui con- cerne leur activité absolue vis-à-vis de l'un ou l'autre d'un grand nombre d'organismes particuliers contre lesquels on peut les employer. Ainsi, le spectre d'un antibiotique donné consiste en fait en points d'activité (ou d'inactivité) relativement forte ou faible, présentée respectivement vis-à-vis de différents organismes particuliers, et mesurée seulement l'une par rapport à l'autre.
Un tel spectre peut être schématisé ou mis en tableau, et la confi- guration ou forme de la combinaison résultante de sommets et de creux, four- nit une identification positive de la substance, par suite de sa nature aussi bien chimique qu'antibiotique.
Un spectre typique de la néomycine pour autant que le revèlent les tests, pratiqués actuellement est représenté en détail plus loin, mais on peut en noter ici certaines caractéristiques. D'une façon générale, en ce qui con- cerne les déterminations effectuées jusqu'ici, la néomycine a un spectre indi- quant une activité à l'égard des mêmes bactéries importantes (y compris les myco-bactéries), que celles à l'égard desquelles la streptomycine est effica- ce et une inactivité vis-à-vis des moisissures, également de la même façon que la streptomycine est relativement inefficace vis-à-vis de tels organis- mes.
En conséquence, on distingue par son spectre antibiotique la néomycine des autres matières (telles que la streptothricine, l'actinomycine, la griséi- ne, la pénicilline, la clavacine) par la plupart des mêmes caractéristiques générales qui distinguent la streptomycine de ces matières. Le spectre de la néomycine comprend également des "points" d'activité, relatifs à un certain nombre d'organismes insensibles à la streptomycine. Ces régions du spectre qui permettent une distinction correspondante par rapport à cette dernière matière sont représentées par les souches résistant à la streptomycine de E.coli et de M. tuberculosis, et par l'organisme dit de Bodenheimer.
L'organisme employé pour produire la néomycine a été isolé du sol ; comme indiqué ci-dessus, c'est un actinomycetes, qui est au moins très voisin du Streptomyces Fradiae, et est désigné sous le nom de Streptomyces n 3535. Il donne une culture jaunâtre à brunâtre sur milieux synthétiques et organiques, mais pas de pigments solubles. Il appartient par conséquent au groupe non chromogénique. Il produit facilement un mycelium aérien parti- culièrement sur un milieu synthétique, le mycelium étant pigmenté de¯blanc jusqu'à rose pâle, rose coquillage ou rose. On peut définir la couleur du mycelium comme roux-vineux clair, selon la nomenclature de Ridgway pour l'i- dentification des couleurs. Des observations indiquent également que les hyphes sporulants sont généralement droits et ne forment de spirales que sur certains milieux.
Comme on l'a indiqué précédemment, on produit la nouvelle sub- stance antibiotique par culture de l'organisme en question dans des conditions très artificielles, par exemple en inoculant un milieu convenable avec des spores de l'organisme ou par culture submergée. A la lumière du travail ex- périmental effectué sur ce procédé, il apparaît que des variations considéra- bles sont possibles dans la composition de ce milieu, de préférence en ce qui concerne la présence de constituants organiques et minéraux convenables, à la
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fois pour favoriser la croissance de l'organisme et stimuler la production de l'antibiotique.
Il apparaît ainsi que les meilleurs résultats sont ob- tenus quand la culture croit dans un milieu contenant une source convenable d'azote, un hydrate de carbone et des éléments minéraux, tels que ceux cons- titués par le chlorure de sodium et d'autres matières décrites plus loin.
Une énumération plus précise des types de constituants que l'on peut avanta- geusement incorporer au milieu de culture comprend :
I. Une peptone ou digeste de protéine, les peptones ordinaires ou les digestes de protéine, tels que les digestes de caséine, semblent satis- faisants, mais on a obtenu des résultats supérieurs avec des matières telles que la peptone du soja. On peut avantaguesment inclure un constituant de ce type par exemple dans la proportion de 10 à 20 grammes par litre de milieu.
Ce constituant semble avoir une importance toute particulière pour la produc- tion de l'antibiotique.
II. Extrait de viande ou type similaire, de matière, tel que l'ex- trait de levure en quantité, par exemple de 3 à 5 grammes par litre. Bien qu'on croît que cet ingrédient ait relativement peu d'importance et qu'on puis- se en effet s'en passer dans certains cas, il semble qu'il contribue notable- ment au résultat désiré. On peut définir ce constituant comme une matière nu- tritive du type extractive.
III. Un hydrate de carbone, de préférence représenté par du gluco- se ou un sucre similaire, tel que le maltose. On peut utiliser le glucose ou les corps analogues en quantité par exemple de 5 à 10 grammes par litre, et ces corps semblent être d'une aide primordiale pour une bonne croissance de l'organisme, bien qu'au sens direct ou strict, leur présence ne constitue pas une condition essentielle et critique pour la production de la néomycine.
IV. Certains éléments minéraux, spécialement quand on constate que ceux-ci sont absents de l'eau utilisée pour préparer le milieu ou les cultures.
Un élément qui semble particulièrement important est le zinc sous forme d'un sel de zinc tel que le sulfate de zinc, en quantité relativement faible, par exemple 10 mg par litre environ. Il apparaît également que le chlorure de so- dium est un constituant extrêmement désirable dans la proportion d'environ 5 grammes par litre.
V. De l'eau généralement sous forme d'eau du robinet ordinaire.
Bien que l'on puisse utiliser de l'eau distillée, par exemple en y ajoutant un sel de zinc, comme indiqué précédemment, l'eau du robinet, qui contient naturellement une trace de zinc combiné convient tout-à-fait et évite toute nécessité d'addition de constituants minéraux autres qu'un sel, tel que le chlo- rure de sodium.
Quand on utilise un milieu de l'espèce décrite ci-avant et conte- nant les cinq (5) ingrédients cités, on ajuste le pH de préférence à environ 7 ou 7,2 à l'aide de NaOH. Bien qu'il soit possible de commencer avec un mi- lieu acide par exemple ayant un pH de 6, l'expérience indique que la produc- tion de l'antibiotique est alors sensiblement retardée et pratiquement il peut en résulter une augmentation de l'acidité, ce qui entraîne une lyse de l'or- ganisme. En fait, il apparaît que le glucose ou les corps analogues tendent à produire ou à favoriser une augmentation de l'acidité et à retarder par con- séquent la production de néomycine. On a surmonté cet effet du glucose en employant la peptone en quantité relativement importante, c'est-à-dire voisi- ne de la limite supérieure de l'ordre des proportions indiquées précédemment.
On peut également réaliser une diminution des effets défavorables du glucose sur la production de l'antibiotique, au moins en partie, en diminuant la quantité de glucose (de préférence en augmentant la proportion de peptone, comme on vient de l'expliquer) ou en rajoutant spécialement un agent neutra- lisant, tel que le carbonate de calcium. P our ce dernier but, le carbonate de calcium a l'avantage supplémentaire d'être neutralisant de lui-même. Bien que l'on puisse utiliser d'autres substances, telles que le carbonate de so- dium, il devient alors nécessaire d'opérer quotidiennement ou à d'autres in- tervalles réguliers des additions de cet agent, dans le but de maintenir des conditions favorisant la production de l'antibiotique.
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En utilisant des milieux du type précédemment décrit ou d'un type équivalent, on peut produire la néomycine en culture soit immobile soit agitée.
Dans le cas des cultures immobiles, on obtient un rendement satisfaisant en antibiotique à condition que l'incubation ait lieu à la température ambiante, par exemple de l'ordre de 22 à 28 G pendant une période de 7 à 12 jours. Pour les cultures immobiles le milieu doit être très peu profond ; alors les spores de l'organisme tendent à couler, c'est-à-dire à devenir submergées et ainsi à être inefficaces pour la production de l'antibiotique. Il semble que cet organisme soit caractérisé par un poids ou une densité supérieure à celle des organismes tels que le Streptomyces Griseus, avec lesquels on rencontre moins de difficultés lors de l'incubation de cultures immobiles.
On peut ob- tenir des résultats préférables en épaississant quelque peu le milieu, par exemple, en y incorporant 1/4 à 1/2 % de gélose pour produire une consistance semi-solide ou semi-liquide. Avec une telle modification du milieu, l'organis- me semble avoir un support convenable, de telle sorte que la culture croît en surface sous Iorme d'une pellicule en recevant la quantité d'air nécessaire pour l'élaboration de la substance antibiotique.
On a obtenu une incubation beaucoup plus rapide avec un rendement satisfaisant en néomycine avec des cultures agitées, c'est-à-dire dans des mi- lieux de culture relativement profonds, que l'on soumet à une agitation con- venable pour obtenir une aération efficace. Ainsi, on a trouvé qu'il suffit de 3 à 5 jours à une température d'environ 25 C pour une production utile, la gamme de températures préférées étant de 22 à 28 C Il semble que pour des résultats optimum, le degré d'agitationou plus exactement le degré d'aération doit être contrôlé avec soin.
L'expérience indique qu'avec le mode d'agita- tion rigoureux employé ordinairement pour la,production de streptomycine dans des cultures de S. griseus, les cultures de Streptomyces n 3535 peuvent ne donner qu'un rendement en néomycine qui est loin d'être élevé. On obtient alors facilement une amélioration du rendement, en fait jusqu'à une valeur optimum, en réduisant la vitesse d'agitation ou bien en incorporant une peti- te quantité de gélose (1/4 à 1 %), pour réduire la diffusion de l'air. La gélose épaissit le milieu, mais de préférence pas au delà d'un état semi-li- quide. Il est naturellement extrêmement important qu'une quantité considéra- ble d'air traverse le milieu par exemple pendant l'opération d'agitation.
Bien qu'il soit impossible de définir quantitativement la quantité d'air ou d'aération nécessaire, le contrôle de la quantité désirable dans la pratique actuelle est très facile (ne nécessitant au plus que quelques essais simples), compte tenu de l'exposé précédent des facteurs nécessaires. Bien que les du- rées d'incubation établies précédemment soient celles trouvées optimum jus- qu'ici dans la mise en pratique expérimentale de l'invention, on comprend qu'on puisse ou doive utiliser d'autres durées dans des cas spéciaux. Par exemple l'expérience de la production des antibiotiques indique généralement que l'on peut réduire notablement la période d'incubation en utilisant un inoculum relativement grand.
Bien que l'on puisse adopter différents procédés pour séparer la matière antibiotique du bouillon de culture et pour la purifier ultérieurement, on peut donner une idée préliminaire de certaines opérations trouvées parti- - culièrement convenables. D'une façon générale le procédé comporte les stades- d'adsorption et d'élution, comprenant des stades de purification supplémentai- res et s'étendant, si on le désire, à la séparation chromatographique. A ti- tre d'exemple général du procédé, le milieu de culture, après la période d'incubation désirée, peut être filtré, et le filtrat traité avec une adsor- bant convenable, tel que le charbon de bois activé ou un autre charbon activé qui adsorbe la néomycine.
Après la séparation de l'adsorbat, c'est-à-dire du charbon, on peut traiter le milieu de culture avec de l'éthanol rendu acide à 2% avec HC1 pour soumettre l'antibiotique à une élution ou par un autre mé- lange acide-alcool, tel qu'un mélange méthanol-acide formique dans le même but.
Les stades ultérieurs de purification peuvent comprendre une autre adsorption et élution de l'antibiotique suivies finalement d'une précipitation par un li- quide organique, tel que l'acétone et par un lavage et un séchage final du précipité à une température modérée appropriée.
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On peut également réaliser la première adsorption de la néomycine avec un adsorbant du type zéolite c'est-à-dire un échangeur de cations. Dans ce cas, (de même que quand on utilise le charbon pour adsorber la néomycine), on peut envisager un traitement préliminaire du milieu de culture après fil- tration, en l'acidifiant fortement et en introduisant du charbon activé pour adsorber les impuretés, étant entendu que la néomycine n'est pas adsorbée dans des conditions fortement acides. Lorsqu'on emploie des adsorbants du type zéolite (ou de façon analogue quand l'adsorbant du type charbon est employé après la purification préliminaire), le pH du filtrat résultant de la séparation de l'adsorbant et des impuretés doit d'abord être amené sensible- ment à la neutralité.
L'antibiotique est alors adsorbé par traitement avec l'adsorbant en question et celui-ci, c'est-à-dire un adsorbat contenant la néo- mycine, est filtré et soumis à une élution pour la séparation de l'antibioti- que. Dans le cas d'un adsorbant du type zéolite on peut réaliser une telle élution avec une solution de chlorure d'ammonium. Le liquide résultant dans lequel est dissous l'antibiotique peut ensuite être soumis à des opérations d'adsorption et d'élution successives ou terminant avec un procédé approprié pour la précipitation, la séparation physique et le séchage de la matière active désirée,c'est-à-dire la néomycine.
Cn a trouvé que la néomycine, 'par exemple produite par des pro- cédés de cette nature, possède un spectre antibiotique remarquablement éten- du, présentant une activité extrêmement utile contre les bactéries à la fois négatives et positives au Gram et présentant une activité importante contre les myco-bactéries des types à la fois sensibles et résistants à la streptomy- cine. De plus, dans les tests qui ont montré des résultats contraires avec la streptomycine il se produit un développement moindre de la résistance à la néomycine parmi les organismes éprouvés, de tels résultats tendant à indiquer le nombre limité de souches de ces organismes qui peuvent être spécifiquement résistants à la néomycine, ce qui les distingue de la streptomycine par exem- ple.
Le tableau suivant représente un spectre antibiotique de la. néomy- cine comparé à ceux de la streptomycine et de la streptothricine. Les déter- minations pour la néomycine étant faites par le procédé "à la bande de gélose" (c'est-à-dire un procédé de dilution d'une plaque de gélose) avec la matière antibiotique isolée, préparée selon le procédé de l'exemple particulier expo- sé plus bas. Les valeurs spécifiques de l'activité dans ce tableau doivent naturellement être comprises en tenant compte du fait que les déterminations peuvent être améliorées ou affectées d'une autre manière par une purification supplémentaire de l'antibiotique, et en particulier que les différentes sou- ches des différents organismes éprouvés peuvent entraîner certaines différen- ces dans la force d'activité.
On croît cependant que la nature ou configura- tion de l'ensemble du spectre n'est pas spécifiquement affectée par de telles variations; pour identifier l'antibiotique par la forme de son spectre, il est entendu de même que l'on ne doit pas attacher une signification particu- liére à une comparaison des activites absolues de la néomycine d'une part et de la streptomycine ou de la streptothricine d'autre part, c'est-à-dire à un organisme donné contre lequel la néomycine et l'un des autres ou les deux sont sensiblement actifs. La principale importance du spectre est de mettre en évidence pour chaque substance la relation d'ensemble entre les activités et inactivités diverses.
On peut noter cependant que, selon la présente ex- périence, la néomycine est une substance à haute activité ou potentiel, ce qui permet une économie sur la quantité nécessaire et facilite son adminis- tratiJn, quand on l'utilise pour le traitement de diverses affections.
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TABLEAU 1 Spectre antibiotique de la néomycine brute comparé à ceux de la streptomycine brute et de la streptothricine brute.
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(exprimé <SEP> en <SEP> unités <SEP> de <SEP> dilution <SEP> par <SEP> gramme <SEP> de <SEP> préparation <SEP> brute <SEP> nécessaire <SEP> pour
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<tb> arrêter <SEP> la <SEP> croissance <SEP> des <SEP> organismes <SEP> éprouvés).
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Organisme <SEP> Néomycine <SEP> Streptomycine <SEP> Streptothricine
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<tb> X <SEP> 1000 <SEP> X <SEP> 1000 <SEP> X <SEP> 1000'
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<tb> 1. <SEP> Bacillus <SEP> subtilis- <SEP> 150-750 <SEP> 125 <SEP> 125
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<tb> 2. <SEP> Bacillus <SEP> mycoides <SEP> 20-150 <SEP> 20 <SEP> 0,8
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<tb> 3. <SEP> Bacillus <SEP> cereus <SEP> 20-60 <SEP> 30 <SEP> < <SEP> 0,8 <SEP>
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<tb> 4. <SEP> Sta[hydrocus <SEP> aureus <SEP> 100-250 <SEP> 15 <SEP> 50
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<tb> 5. <SEP> Sarcina <SEP> lutea <SEP> 10 <SEP> 100 <SEP> 37,5
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<tb> 6. <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> SS <SEP> 25 <SEP> 25 <SEP> 25'
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<tb> 7. <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> RS <SEP> 20 <SEP> 0 <SEP> Active
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<tb> 8.
<SEP> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 2,5 <SEP> 1 <SEP> <0,8
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<tb> 9. <SEP> Proteus <SEP> vulaaris <SEP> 25 <SEP> 10 <SEP> 12,5
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<tb> 10. <SEP> organisme <SEP> de-Bodenheimer <SEP> 15 <SEP> 0 <SEP> Active
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<tb> 11. <SEP> Serratia <SEP> marcescens <SEP> 20 <SEP> 25 <SEP> 1,2
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<tb> 12. <SEP> Mvcobactérium
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<tb> tuberculosis <SEP> hominis
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<tb> 607 <SEP> (SS) <SEP> 80-250 <SEP> Active <SEP> Active
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<tb> 13. <SEP> Mycobacterium
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<tb> tuberculosis <SEP> hominis
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<tb> 607 <SEP> (RS) <SEP> 50-150 <SEP> Inactive <SEP> Active
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<tb> 14. <SEP> Mvcobacterium <SEP> avium <SEP> 50-150 <SEP> Active <SEP> Active
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EMI7.2
15.
Mycobacterium'ràna.e 150 Active Active
EMI7.3
<tb> 16. <SEP> Mycobacterium <SEP> phlei <SEP> 300 <SEP> 100 <SEP> 12,5
<tb> 17. <SEP> Trichophyton
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metalyro-phytes <..0,3' 0,3 Active
EMI7.5
<tb> 18. <SEP> Cryptococcus <SEP> albicans <SEP> < <SEP> 0,3 <SEP> <0,3 <SEP> Active
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<tb> 19: <SEP> Penicillium <SEP> notatum <SEP> < <SEP> 0,3 <SEP> 0,3 <SEP> Active
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Dans le tableau ci-dessus et en d'autres endroits de la présente description, le symbole SS désigne une souche sensible à la streptomycine et le symbole RS désigne une souche résistante à la streptomycine.
Il est enten- du que la référence a des unités de dilution (qui sont les nombres portés dans le tableau multipliés par mille dans chaque cas) exprime le nombre de fois qu'une unité d'activité de l'antibiotique donné peut être diluée et empêche encore la croissance de l'organisme éprouvé. Une unité d'activité est la quantité de matière qu: empêche la croissance d'un organisme standard choi- si dans des conditions standard dans un cm3 de milieu. Ainsi dans le tableau, les valeurs élevées représentent une forte activité, tandis que les valeurs les plus basses représentent une inactivité relative. Pour plus de commodité et de brièveté, on peut identifier les différents organismes du tableau par les nombres qui leur sont arbitrairement assignés dans la colonne de gauche.
Comme on le voit, la néomycine est très active contre tous les organismes numérotés de 1 à 16-inclusivement dans le tableau, c'est-à-dire contre les n 1 à 6 inclusivement, 8,9, 11, 12 et 14 à 16 inclusivement, contre lesquels la streptomycine est également efficace et contre les orga- nismes 2,3, 8 et 11 pour lesquels la streptolycine présente une activité
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relativement faible ou nulle. D'autre part, tandis que la streptothricine est active contre divers champignons, par exemple les organismes 17,18 et 19 du tableau, la néomycine est relativement inactive.
On peut noter en passant que, tandis que les valeurs numériques du tableau représentent des déterminations faites sur une base garantissant une comparaison numérique, certaines activi- tés, par exemple celles de la streptomycine et de la streptothricine, ont été déterminées par des tests de différents degrés de la substance ou dans d'au- tres conditions et pour ces autres tests on a simplement donné les résultats par des caractéristiques telles que "active" ou "inactive". On estime que les caractéristiques d'activité et d'inactivité ainsi reportées sont largement suffisantes pour les comparaisons et l'aspect spectral auquel le tableau est destiné.
Une caractéristique particulière importante du spectre de la néo- mycine, qui la distingue de la streptomycine, est son activité par rapport aux organismes 7,10 et 13, c'est-à-dire le fait qu'elle présente le même ca- ractère d'activité à l'égard de ces organismes qu'à l'égard de beaucoup d'au- tres organismes du tableau par opposition avec l'inactivité relative de la néo- mycine à l'égard des organismes 17, 18 et 19. L'organisme de Bodenheimer, n 10 du tableau, a été utilisé pour l'essai des substances antibiotiques pour déterminer spécifiquement la streptothricine en présence de streptomycine, celle-ci présentant une activité relativement nulle vis-à-vis de cet organis- me.
La sensibilité des organismes 7 et 13 vis-à-vis de la néomycine est d'une utilité toute spéciale, c'est-à-dire constitue pour la néomycine la pôssibili- té de contrôler ces souches de bactéries résistantes à la streptomycine. Com- me on sait Que les organismes 12 et 13 sont parmi ceux responsables de la tu berculose chez les êtres humains, on voit clairement que la néomycine a un champ d'efficacité contre des souches résistantes que n'atteint pas la strep- tomycine.
L'antagonisme de la néomycine vis-à-vis des souches d'organisme contre lesquels la streptomycine est inefficace a été démontré dans d'autres tests en plus de ceux portés dans le tableau 1. Ainsi, par exemple, quand on raye des plaques contenant différentes concentrations de néomycine, avec des souches sensibles à la streptomycine, résistantes à la streptomycine, et dépendant de la.streptomycine, de E. Coli, les deux premières sont trouvées aussi sensibles à la néomycine tandis que la troisième né présente aucun dé- veloppement.
En recommençant le même test avec la streptomycine seule, la première souche d'organisme présente une sensibilité à l'effet antibiotique, le second organisme étant sensiblement non affecté et le troisième subissant la croissance pour laquelle elon la précédente découverte) la présence de streptomycine'est nécessaire. Ces tests expriment clairement les différences de nature biologique et chimique entre le néomycine et la streptomycine.
Si on met à incuber pendant des périodes de temps relativement lon- gues des cultures sur bouillon ou sur gélose' de diverses bactéries contenant suffisamment de néomycine pour arrêter la croissance, il ne se produit pas de développement supplémentaire des bactéries. Ainsi, on a encore démontré la stabilité de l'antibiotique par contraste avec d'autres substances, telles que l'auréomycine.
Pour mettre en évidence de façon supplémentaire 1¯'action de la néo- mycine sur les myco-bactéries, on fait des déterminations de la sensibilité de diverses souches de ces organismes sensibles à la streptomycine et résistants à la streptomycine, en utilisant les procédés turbidimétriques dans le milieu Dubos Tween. Le tableau suivant résume les résultats de ces tests avec un cer- tain nombre d'organismes ou de souches d'organismes de ce type, comprenant la culture pathogène humaine de M. tuberculosis H37 Rv.
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TABLEAU8 II.
Effet de la néomycine sur la croissance des différentes souches de M, tubercu- losis en milieu de Dubos,
EMI9.1
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<tb> Incubation <SEP> à <SEP> 37 C <SEP> pendant <SEP> 14 <SEP> jours.
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Organisme <SEP> essayé <SEP> .Arrêt <SEP> de <SEP> la <SEP> croissance <SEP> en <SEP> unité/cm3
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<tb> M <SEP> tuberculosis <SEP> H37 <SEP> Rv <SEP> (SS) <SEP> 0,2
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<tb> M. <SEP> tuberculosis <SEP> H37 <SEP> RvR <SEP> (RS) <SEP> 0,2
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<tb> M <SEP> tuberculosis <SEP> H37 <SEP> Rv <SEP> (SS) <SEP> 0,5-1,0
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<tb> M <SEP> tuberculosis <SEP> H37 <SEP> RVR <SEP> (RS) <SEP> 1,0
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<SEP> tuberculosis <SEP> 607R <SEP> (RS) <SEP> 0,25
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On a trouvé que la néomycine est active contre tous les types ci- tés d'organismes, et comme on le voit, sur ce tableau, dans chaque cas les souches résistantes à la streptomycine et sensibles à la streptomycine sont également sensibles à la néomycine.
Le fait que la néomycine ne semble pas favoriser le développement rapide des cultures résistantes, c'est-à-dire des souches d'organismes parti- culièrement résistantes à la néomycine est indiqué par des tests sûrs. Dans une telle série de tests, on met en suspension dans l'eau une culture de E. coli dans la gélose vieille de vingt heures et on l'étale dans une gélose nu- tritive contenant des quantités arjées de néomycine.
Après neuf jours d'in- cubation à 28 C seulement une colonie d'une levure, mais aucune de bactéries, développe 22 milliards de cellules sur une plaque contenant 25 unités par cm3 de néomycine et également seulement deux colonies de levure et aucune de bac- téries sur une plaque portant 5 unités par cm3 de néomycine, aucune colonie n'étant remarquée sur une troisième plaque portant 10 unités au cm3. Ainsi, il est évident qu'il ne s'est développé aucune culture résistante dans aucun cas. On a trouvé par la suite cependant que quelques colonies se développent en présence de 2à 4 unités de néomycine, mais beaucoup moins (c'est-à-dire 1/10 à 1/100) qu'en présence de concentrations analogues de streptomycine.
Quand on prélève des fragments de gélose de ces plaques et qu'on les inocule dans des plaques de gélose stérilisées, seulement certains des fragments provenant des plaques de gélose stérilisées ayant contenu 5 unités au cm3 de néomycine présentent une croissance. Les fragments provenant des plaques ayant contenu 10 unités au cm3 et 25 unités au cm3 de néomycine ne donnent aucune croissance. Ces tests, ainsi que d'autres, indiquent que le néomyci- ne est un puissant bactéricide aussi bien qu'un bactériostatique.
Une autre propriété extrêmement importante de la néomycine est qu'elle semble être relativement non toxique ou avoir une toxicité extrême- ment faible. Des tests sur des animaux et d'autres essais analogues in vivo (par exemple sur des embryons d'oeuf) ont non seulement confirmé la relative- ment forte activité de la néomycine contre diverses bactéries, mais encore indiqué que la toxicité de l'antibiotique, s'il en a une, envers les animaux est extrêmement limitée.
L'activité in vivo contre les bactéries a été montrée à l'égard à la fois des organismes positifs et négatifs au Gram et à l'égard à la fois des organismes sensibles à la streptomycine et des organismes résis- tants à la streptomycine, des souches sensibles à la streptomycine étant à titre d'exemple le Staphylococcus aureus, le Klebsiellapneumoniae et le Shi- gella pullorum et des souches résistantes à la streptomycine étant à titre d'exemples le Salmonella schottmulleri et la Staphylococcus aureus. Les tests révèlent une capacité efficace de la néomycine pour contrôler chacun
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de ces organismes.
En ce qui concerne la toxicité, les tests sur des animaux, par exemple des souris, indiquent qu'il ne se produit aucun effet toxique ou nuisible même quand le traitement est augmenté de 20 à 80 fois la dose effica- ce. D'après ce qui précède, on comprend que le milieu de culture utilisé pour la production de l'antibiotique peut varier considérablement selon les condi- tions, les substances nutritives disponibles et des causes analogues. A ti- tre simplement d'exemple pratique on donne ci-dessous deux exemples de milieu trouvés satisfaisants pour la culture du -ages n 3535 et par suite pour la production de néomycine.
Milieu de culture - Exemple 1 ----------------- - ---------
20 grammes de peptone de soja
5 grammes d'extrait de viande
5 à 10 grammes de glucose
5 grammes de chlorure de sodium
1 litre d'eau du robinet (comme décrit plus haut).
Milieu de culture - Exemple 2.
----------------- -
10 grammes de peptone de soja
5 grammes d'extrait de viande
10 grammes de glucose
10 grammes de carbonate de calcium (en poudre fine)
5 grammes de chlorure de sodium
1 litre d'eau du robinet (comme décrit plus haut)
Comme on l'a expliqué précédemment, le milieu de l'exemple 2, qui a une teneur relativement basse en peptone et une teneur relativement élevée en glucose, contient également une certaine quantité de carbonate de calcium pour éviter des effets possibles et indésirables de l'acidité accrue pendant l'incubation. Chacun des milieux ci-dessus permet d'obtenir des résultats très satisfaisants, par exemple un milieu agité avec un contrôle convenable de l'aération, de la manière qui a également été expliquée.
Dans chaque cas on ajuste le pH approximativement à 7 avant l'inoculation par des spores ou la culture submergée de l'organisme S n 3535.
A titre d'exemple supplémentaire et plus particulier d'une série d'opérations permettant de séparer et de purifier partiellement la néomycine, on donne le procédé suivant : Après filtration préliminaire pour éliminer les solides en suspension, le milieu de culture ou bouillon est acidifié avec de l'acide chlorhydrique concentré pour réduire son pH à une valeur comprise en- tre 2,0 et 2,5. On ajoute du charbon de bois activé, plus spécialement l'es- pèce désignée sous la marque Darco G-60, à raison de 5 grammes par litre, et on agite le mélange pendant environ 30 minutes.
Puis on agite dans*le mélan- ge une substance pour aider la filtration, par exemple une matière telle qu'une terre à diatomées, plus spécialement une substance aidant à la filtration con- nue sous le nom de Hyflo Super-Cel, en quantité de 5 grammes par litre, puis on filtre le mélange à travers un tampon de la même substance, à savoir Hyflo Super-Cel, en quantité analogue. Comme on n'a pas trouvé que la néomycine soit adsorbée en milieu à réaction fortement acide, le résultat de ce traite- ment au charbon de bois et de la filtration subséquente, est une élimination préliminaire de certaines impuretés, étant bien entendu qu'un procédé plus rapide peut dans certains cas éviter ce traitement préliminaire.
Le filtrat de ce traitement constitue ainsi un filtrat préliminai- re purifié de bouillon de culture et contient le néomycine désirée. On ajus- te alors le pH de cette solution à 7, 1 0,2 avec une solution à 40% d'hy- droxyde de sodium. On introduit alors une matière adsorbante plus précisément du type zéolite (silico luminate de sodium), une substance convenable étant le produit connu sous le nom de Decalso. La quantité de cet adsorbant peut varier, des résultats efficaces ayant été obtenus quand on l'introduit dans une proportion de 1 gramme pour 7.000 unités d'activité de néomycine dans la solution. On agite alors le mélange pendant environ 30 minutes et on sépare
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par filtration l'adsorbat, c'est-à-dire l'adsorbant contenant la néomycine.
On le lave à l'eau et on le laisse sécher à l'air jusqu'au lendemain.
On place alors l'adsorbat de Decalso séché dans une colonne ayant un diamètre intérieur de 30 mm et muni d'un bouchon en laine de verre. On fait passer à travers l'adsorbat (c'est-à-dire la substance zéolite contenant la néomycine adsorbée), une solution aqueuse à 10 % de chlorure d'ammonium. et on recueille des fractions successives pour les essayer. Ainsi la-'néomycine est effectivement séparée par élutionde l'adsorbant. On peut réaliser les es- sais des diverses fractions, soit par la méthode des bandes en utilisant le E Coli soit par le procédé de la tasse de gélose, en utilisant alors de fa- gon appropriée, 1eB subtilis. On' combine les fractions ayant les plus hau- tes puissances pour former une seule masse de solution et on ajuste le pH du mélange à 7,0.
On ajoute une quantité supplémentaire de charbon de bois ac- tivé, par exemple du Darco G-60, à raison de 10 grammes par 100 cm3 et on agi- te le mélange pendant 30 minutes. On sépare par filtration l'adsorbat, c'est- à-dire le charbon de bois contenant la néomycine, on le lave avec de l'eau et on le sèche à l'air. On sépare l'antibiotique de cet adsorbat pai élution en agitant l'adsorbat pendant trente minutes avec du méthanol contenant 50 % d'a- cide chlorhydrique 0,05 N, en utilisant 5 cm3 du mélange acide-alcool dilué par gramme de charbon de bois. On sépare par filtration le charbon de bois soumis à l'élution et on le soumet à une seconde élution de la même manière.
On combine es éluats, le pH de la combinaison étant alors ajusté à 6,0-7,0 par de l'hydroxyde de sodium aqueux. On concentre alors cette solution con- tenant la néomycine dans le vide à un volume d'environ 3 cm3.
On recueille le petit résidu de liquide précédent contenant l'an- tibiotique en ajoutant du méthanol, le mélange résultant étant alors centri- fugé pour séparer la matière insoluble,- c'est-à-dire les autres impuretés.
On concentre encore à environ 5 cm3 dans le vide la solution, c'est-à-dire la solution d'éthanol surnageant de la centrifugation. On lave encore se second concentrat dans un tube à centrifugation avec du méthanol en quantité telle que le volume total de solution ainsi produite soit de 10 à 15 cm3. On sépa- re encore le résidu insoluble par centrifugation. On traite alors la solu- tion contenant la néomycine, c'est-à-dire le liquide surnageant à la fin de la dernière opération de centrifugation avec 8 à 10 volumes d'acétone pour précipiter la néomycine.
On laisse alors la suspension résultante reposer pendant quelques heures à 5 C puis on la centrifuge encore une fois., La ma- tière solide séparée constituant cette fois la néomycine est finalement lavée avec de l'acétone et séchée dans le vide pour fournir un produit sec assez fi- nement divisé, constituant une masse isolée et séparée bien qu'encore brute, de la nouvelle substance antibiotique, à savoir, la néomycine. Comme on l'a indiqué précédemment d'autres stades de purification peuvent suivre, conduisant à un produit à haute pureté correspondant à la qualité de certains autres an- tibiotiques actuellement disponibles sur le marché. Cependant, on a trouvé que le produit résultant du procédé décrit précédemment possède les propriétés nouvelles et désirables exposées ici, d'ordres antibiotique et autres.
L'examen du nouveau produit préparé.par le procédé décrit précé- demment tend à indiquer que c'est en fait un-complexe comprenant plusieurs composés ou formes presque identiques de néomycine, qui semblent ne se dis- tinguer que par de très petits détails. Ainsi'on a effectué des tests analy- tiques d'un type dans lequel les substances composantes sont séparées selon leurs solubilités respectives relatives dans' deux milieux (par exemple un sol- vant organique et l'eau). Par exemple par des tests consistant à observer la distribution du chlorhydrate du produit (le complexe de néomycine) après des transferts successifs de fractions des milieux en utilisant un procédé tel que celui décrit par Craie et al. dans J. Biol. Chem. Vol. 168, p. 665, 1947 (et également en partie décrit par Craig dans J.'Biol. Chem., Vol. 155, p.
519, 1944) et avec un système au tampon de borate à un pH de 7,3 ''comme il est décrit par E.A. Swart dans J. of the Amer. Chem. Society, août 1949). On a trouvé trois fractions (I, II et III) ayant différents coefficients de dis- tribution dans l'opération de séparation en question, et représentant respec- tivement 55, 20 et 11 % de l'activité antibiotique totale dans le produit ini- tial ainsi essayé.
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Toutes les propriétés du produit ou complexe complet qui viennent d'être décrites semblent également caractériser chaque fraction. Contre une souche isolée quelque peu résistante à la néomycine d'un organisme identifié comme étant le mycobactérium 607 (RN), la fraction III montre une activité su- périeure à celle des deux autres, mais les spectres antibiotiques des trois fractions et du complexe semblent qualitativement être les mêmes au point que le complexe et ses fractions semblent tous identifiables comme des formes ou des aspects particuliers de la néomycine considérée comme un nouveau composé fondamental.
Comme le complexe, les fractions ont une stabilité exceptionnel- le dans diverses conditions et diverses températures, sont de nature basique, forment des sels tels que chlorhydrates et picrates, et sont susceptibles d'une bonne adsorption sur les échangeurs cationiques.
Il est bien entendu qu'on peut utiliser d'autres procédés de pro- duction de la néomycine et pour son isolement et sa purification, par exemple en fonction des différentes circonstances indiquées précédemment, ainsi qu'en fonction de la nature de la substance et de ses caractéristiques de solubilité et de son comportement vis-à-vis des réactifs utilisés dans des procédés de ce type général. Il est par conséquent bien entendu que l'invention n'est-pas limitée aux stades et aux compositions particulières décrits ici, mais peut être réalisée de toute autre façon.
R E V E N D I C A T IONS.
1. - Procédé de préparation d'une substance antibiotique dite néo- mycine, caractérisé en ce qu'il consiste à laisser se développer une culture d'un microorganisme produisant la néomycine dans un milieu de culture artifi- ciel favorable à cette croissance et à la production de la dite substance an- tibiotique, puis à séparer du milieu de culture la néomycine obtenue.