BE477991A - - Google Patents

Description

   <Desc/Clms Page number 1> 
 



  Perfectionnements à la production   d'un   antibiotique. 



   L'invention concerne la production, l'extraction et la purification d'un nouvel antibiotique de bonne puissance, spé- cialement contre les organismes infectieux négatifs de Gram, qui convient à des usages thérapeutiques.      



   La plupart des antibiotiques connus jusqu'à présent sont des produits de métabolisme de moisissures, telles que le Penicillium   notatum.   Le nouvel antibiotique, toutefois, est le produit du méta- bolisme d'une variété de bactérie. 



   La variété de bactérie qui, suivant l'invention, est utilisée à la production d'un antibiotique, est le Bacillus aero- sporus Greer décrit dans le "Journal of infectious Diseases, volu-      

 <Desc/Clms Page number 2> 

 me   42;-,   page 508,   1928",   ou le Bacillus polymyxa (Prazmowski) Migula décrit dans le "Manual. of Determinative Bacteriology" de   BERGEY,   5ème. édition, 1939, pages   701   à 704. Ce sont proba- blement deux dénominations du même bacille, mais si les cultures sont différentes, on peut utiliser l'une ou l'autre. 



   La culture de bactéries utilisée suivant l'invention peut être définie également en se rapportant à son apparence et à ses caractéristiques biologiques, qui sont les suivantes :   L'organisme   est un bacille, ayant des spores centraux; il est mobile et produit des acides et gaz avec le glucose, lactose, saccharose, mannite, maltose, xylose, arabinose, sali- cine, raffinose, lévulose et   inuline,   maispas avec le sorbitol ou   l'inosite;   il est négatif   vis-à-vis   de l'indol et du rouge de méthyle et donne une réaction de   VOGES-PROSKAUER   positive. 



  Il produit un acide et un caillot avec le latex de tournesol; le tournesol est réduit, le petit lait se sépare et le caillot est digéré. Les nitrates sont réduits, la gélatine subit une liquéfaction, le sérum coagulé est liquéfié.   Il   existe au moins deux variétés de colonies, l'une d'apparence blanchâtre et l'au- tre brune ou grise. Les colonies de deux des variétés ont un aspect doux et mucilagineux. 



   Le bacille en question est largement répandu dans la nature. côté de son existence dans l'air, il a été trouvé dans l'eau, le sol, le lait, les matières fécales et les légumes en putréfaction. 



   Suivant l'invention, on choisit des cultures du bacille produisant pendant le métabolisme de bonnes quantités de l'antibiotique désiré. Ceci peut être réalisé par des es- sais biologiques de cultures dérivées de colonies séparées de l'organisme, obtenues par cultures sur plateau. 



   Le bacille se dévelope bien dans les milieux,de cul- 

 <Desc/Clms Page number 3> 

 ture usuels. Les meilleurs résultats ont été obtenus dans un milieu aqueux contenant 10% en volume de bouillon de nutrition additionné de 0,002% de sulfate de manganèse,   3%   de glucose et 0,6% de phosphate diammonique hydrogénée; ayant un pH d'environ      7,4. Le'bacille étant aérobie, sa culture (comme dans le cas d'autres bacilles aérobies) peut s'effectuer soit dans des cou- ches statiques peu profondes ou dans des récipients plus pro- fonds avec aérage artificiel,: 
Pour préparer l'inoculum, l'incubation de la colo- nie choisie à 37 C pendant 18 à 24 heures constitue un procédé      convenable.

   Environ'5 millilitres de l'inoculum peuvent alors      être ajoutés à 100 millilitres du milieu nutritif déjà décrit dans un flacon plat, et le tout est soumis à l'incubation à 22-28 C pendant 3 à 8 jours ou pendant 20-24 heures dans les cas où on applique l'aérage artificiel. Des échantillons sont ana- lysés périodiquement pour leur teneur en antibiotique et la cul- ture traitée est recueillie lorsque la teneur en antibiotique a atteint sensiblement un maximum. 



   . Du fait que l'antibiotique est absorbé par les'matières filtrantes, le fluide de métabolisme doit être, séparé de la bacté- i rie par centrifugation. 0,4% de chloroforme peuvent être ajoutés      comme préservatif. 



   L'organisme recueilli dans la coupe de la machine cen- trifuge peut être remis en suspension dans une solution saline      stérile, avec addition de   1%   de toluène, et incubationdu mélange à 37 C pendant 48 heures.. Le liquide surnageant contenant des pro- duits d'autolyse   d   la bactérie., est séparé par centrifugation et ajouté au liquide de métabolisme séparé précédemment, ou est utilisé de la même manière. 



   Le liquide de métabolisme préparé comme il est décrit 

 <Desc/Clms Page number 4> 

 plus haut, est alors traité comme suit, conformément à l'inven- tion, pour en extraire l'antibiotique. 



   En premier lieu, suivant le procédé préféré, le liquide est rendu acide à un pH d'environ 2,0-2,5.On utilise de   préfé-   rence de l'acide chlorhydrique ou sulfurique. L'acide phosphori- que peut aussi être employé comme acidifiant, mais l'acide ni- trique et d'autres acides oxydants doivent être   évités.   



   Le liquide acidifié est alors traité par un charbon de bois activé approprié, pour absorber la plus grande partie des matières colorantes et autres impuretés présentes, mais pas l'antibiotique. Environ 0,5% de charbon de bois par rapport au poids de la solution, représente une quantité convenable. On reconnaît par un simple essai si un charbon de bois convient ou ne convient pas, c'est-à-dire s'il adsorbe les matières coloran- tes et les impuretés, mais non l'antibiotique, dans des conditions acides. Les charbons de bois activés dénommés Farnell n  14 et Farnell L.S. conviennent pour être employés de cette façon. 



   Le charbon de bois est alors enlevé par filtration et rejeté. 



   Le filtrat, contenant l'antibiotique, est alors neutra- lisé (pH 6,0 à 8,0) par addition d'alcali, tel que de la soude caustique. Il est ensuite traité à nouveau par un charbon de bois activé approprié. Cette fois (dans des conditions neutres), l'antibiotique est adsorbé. 



   Le charbon de bois est séparé par filtration et l'anti- biotique en est extrait par lavage au moyen d'acétone aqueux d'une concentration d'environ 40% en poids, maintenu à un pH d'environ 2,5 par de l'acide sulfurique. 



   On ajoute alors de l'acétone à l'extrait jusqu'à ce que la concentration en acétone soit d'environ 75%. Cette solu- tion est alors refroidie à environ 4 C pendant environ 16 heures. 

 <Desc/Clms Page number 5> 

 



  La matière   solide -,contenant   l'antibiotique, est séparée par' filtration. Elle est alors traitée;, par de l'eau à environ   30 C.   



  Le résidu insoluble est filtré et rejeté. 



   Le filtrat est porté au pH de 7 par addition d'alcali. 



  Une nouvelle quantité de matière inactive gélatineuse se dépose et est séparée par filtration. La solution restante est alors congelée et   séchéµ   sous vide à l'état congelé, pour produire le sulfate brut de   l'antibiotique.   



   Plusieurs variantes du procédé d'extraction préféré décrit plus haut sont possibles.      



   Ainsi, le charbon de bois sur lequel l'antibiotique a été adsorbé peut être lavé au moyen d'acide chlorhydrique (pH 2,0-2,5) et/ou d'eau pure avant d'être traité par l'acétone à 40%. 



   Ou bien, au'lieu de traiter le liquide de métabolisme par du charbon de bois dans des conditions acides, le charbon de bois peut être ajouté dans des   conditions'neutres.     L'anti-   biotique et une partie des impuretés sont alors adsorbés ensem- ble sur,le   charbon!'de   bois, qui est ensuite traité par de 1-lacé- tone à 40% à un pH de 2,5 environ,:'l'extrait étant ensuite traité comme il est dit plus haut. 



   Une autre variante du procédé décrit en premier lieu consiste à mettre'le charbon de bois sur lequel l'antibiotique a été adsorbé,   en(suspension   dans de l'éthanol neutre, puis à      séparer par filtration le charbon de bois et le laver avec une nouvelle quantité   d'éthanol.   L'antibiotique peut ensuite être   extrait   du:charbon de bois par du méthanol sec contenant environ   3,65   grammes d'acide chlorhydrique gazeux dissous par 'litre.,Le charbon de bois est filtré et le filtrat est immédiatement dilué avec quatre volumes d'éther sec. Le chlorhydrate brut de l'anti- biotique désiré se précipite et est enlevé par filtration.

   Il 

 <Desc/Clms Page number 6> 

 peut être   redissous   dans du méthanol,   reprécipité   par de   l'éther',   filtré, lavé avec une plus grande quantité d'éther et séché sous vide. 



   Une autrevariante du procédé décrit plus haut en pre- mier lieu consiste à séparer l'antibiotique de l'extrait dans l'acétone à   40%   en réglant cet extrait à un pH de 7 puis en i évaporant l'acétone sous pression réduite. La solution restante de l'antibiotique dans l'eau est remuée avec du charbon de bois activé et filtrée. Le filtrat est rejeté.L'antibiotique est extrait du charbon de bois par de l'acétone aqueux à 40% con- tenant environ 2% en poids d'acide sulfurique. L'extrait est neutralisé par du carbonate de calcium,, refroidi à environ 4 C et le sulfate de calcium précipité est séparé par filtration. 



  Le filtrat est congelé et séché dans le vide sous cet état, pour produire le sulfate de l'antibiotique. 



   Ou bien, après évaporation de l'acétone, on peut   ajou-   ter de l'acide picrique pour précipiter l'antibiotique sous forme de son picrate. 



   S'il est nécessaire ou avantageux dans certain cas d'effectuer une purification plus poussée du sulfatechlorhydrate ou picrate de l'antibiotique produit par l'un quelconque des pro- cédés d'extraction décrits plus haut, elle peut avoir lieu par transformation de l'antibiotique en son hélianthate. Ceci peut être réalisé par dissolution du sel dans du méthanol aqueux et addition d'une solution saturée de   néthyl   orange. L'hélianthate se sépare après repos à 4 C. pendant 12 heures. 



   Si la quantité de méthyl orange ajoutée est telle qu'en- viron   80%   de l'activité antibiotique se retrouve dans le préci- pité, celui-ci contient l'antibiotique à l'état pur, certaines des impuretés restant dans les liqueurs mères, dans ces conditions. 



  Le précipité peut être lavé successivement avec de l'eau et du méthanol et être ensuite traité par de l'acide dans du méthanol 

 <Desc/Clms Page number 7> 

 pour transformer 1àntibiotique en son chlorhydrate soluble ou en un autre sel acide désiré pouvant être séparé sous forme solide, par exemple par précipitation par de l'acétone. 



   Ou bien le sulfate brut de l'antibiotique peut être transformé,en chlorhydrate par traitement du premier par du chlorure de calcium, filtration du sulfate de calcium qui se dépose en même temps que certaines impuretés. 



   Le'nouvel antibiotique est une base forte. Son chlor- hydrate est extrêmement soluble dans l'eau et moins facile à ma- nipuler que son sulfate, qui est moins soluble. Son hélianthate est encore moins soluble. La base est un corps solide amorphe blanchâtre. Elle est stable pour de courtes périodes dans une solution aqueuse d'un pH de 3 à 8. Elle est très instable dans des 'solutions alcalines. Elle ne peut pas être extraite de la solution aqueuse par le chloroforme. On la dissout le plus   commo-   dément dans de l'eau ou du méthanol. 



   Des expériences in vivo ont montré que -l'antibiotique ' possède une activité chémothérapeutique, et donne un degré utile de protection contre les organismes pathogéniques suivants : Haemophilus pertussis,   Eaemophilus   influenzae, Eberthella typhi, Escherichia coli   compris   les variétés haemolithiques asso- ciées à la maladie  , de   diarrhée blanche chez les veaux) 'et Brucella   bronchiseptica.   Il a été.'trouvé avoir in vitro une acti- vité antibactérielle contre tous les organismes mentionnés ci- dessus, et aussi contre toutes les variétés de Salmonella, Pseudomonas aeruginosa, Shigella dysenteriae, Shigella para-      dysenteriae et Shigella sonnei. 



   Il paraît être bactéricide et non pas seulement bacté- riostatique vis-à-vis des organismes sensibles à son activité.

Claims (1)

1. REVENDICATIONS. EMI8.1 ---------------.-.----------- Ô 1.- Procédé de préparation d'un antibiotique, caracté- risé en ce qu'il comprend la préparation d'une culture de la va- riété de bactéries connue sous les noms de Bacillus aerosporus EMI8.2 Greer ou de Bacillus po1ymyxa (prazmowsld) Migula, la séparation des cellules de bactéries du produit de métabolisme ainsi obtenu, le traitement du liquide de métabolisme par un charbon de bois activé approprié dans des conditions neutres (pH 6,0 à 8,0) pour adsorber l'antibiotique désiré par le charbon de bois à par- tir du liquide de métabolisme, et l'extraction de l'antibiotique du charbon de bois en traitant celui-ci pa,r un solvant de l'anti- biotique.

   2.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le liquide de métabolisme, avant son traitement par le charbon activé dans des conditions neutres, est d'abord traité par un charbon de bois activé approprié dans des conditions aci- des (pH 2,0 à 2,5), pour adsorber et éliminer certaines impuretés.

   3. - Procédé suivant l'une ou l'autre dès revendications précédentes caractérisé en ce que l'antibiotique est extrait du charbon de bois sur lequel il est adsorbé, par lavage de celui- ci par de l'acétone aqueux acidifié par l'acide sulfurique.

   4.- Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que l'antibiotique ést précipité de sa solution dans l'acétone aqueux par addition de nouvelles quantités d'acétone jusqu'à ce que la concentration de l'acétone dans le mélange acétone-eau soit d'environ 75% en poids, puis congélation du mélange.

   5. - Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que l'antibiotique précipité est purifié par dissolution dans l'eau cha.ude et filtration. <Desc/Clms Page number 9>

   6.- Procêtlë suivant la revendication 5, caractérisé en ce que la solution de l'antibiotique est neutralisée par un alcali, pour précipiter d'autres impuretés de la solution, puis est fil- trée, congelée et séchée sous vide à l'état congelé.

   7. - Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'antibiotique adsorbé sur le charbon de bois activé, est lavé par de l'acide chlorhydrique dilué et/ou de l'eau.

   8.- Procédé suivant l'une quelconque des revendica- tions 1 à 6, caractérisé en ce que l'antibiotique, tant qu'il est adsorbé sur le charbon activé, est lavé par de l'éthanol neutre et est ensuite extrait du charbon de bois par du méthanol sec contenant'de l'acide chlorhydrique gazeux dissous, la solution' étant ensuite mélangée à de l'éther pour précipiter le chlorhy- drate de l'antibiotique.

   9.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'antibiotique est transformé en son chlorhydrate puis est purifié en le dissolvant dans du méthanol et le reprécipitant par de'l'éther.

   10.- Procédé suivant l'une quelconque ;des revendica- tions précédentes 1 à 8, caractérisé en ce que l'antibiotique est purifié par précipitation par de l'acide picrique.

   11.-. Procédé suivant l'une, quelconque des revendica- tions précédentes 1 à 8, caractérisé en ce que l'antibiotique est purifié par précipitation fractionnée au moyen de méthyl orange.

   12.- Procédé suivant la revendication 11, caractérisé en ce que environ 80% de l'activité antibiotique est retenue dans le précipité.

   13. - Procédé suivant la revendication 3;. caractérisé <Desc/Clms Page number 10> en ce que l'extrait est neutralisé, l'acétone est évaporé sous pression réduite et la solution restante est traitée par du charbon de bois activé, pour adsorber l'antibiotique.

   14.- Procédé suivant la revendication 13, caractérisé en ce que l'antibiotique est extrait du charbon activé par de l'acétone aqueux contenant de l'acide sulfurique, 1-'extrait est neutralisé par du carbonate de calcium et le sulfate de calcium précipité est séparé par filtration.

   15.- Procédé de préparation d'un antibiotique,compre- nant la préparation d'une culture du bacille défini précédemment en se référant à son aspect et ses caractéristiques biologiques, l'élimination des cellules bactérielles du produit de métabolisme ainsi obtenu, le traitement du liquide de métabolisme par un charbon de bois activé approprié dans des conditions de neutra- lité (pH 6,0 à 8,0) pour adsorber l'antibiotique désiré sur le charbon de bois à partir du liquide de métabolisme, et l'extrac- tion de l'antibiotique du charbon de bois en traitant celui-ci par un solvant de l'antibiotique.

   16.- Procédé suivant la revendication 15, caractérisé en ce que l'antibiotique ainsi produit est purifié davantage par les procédés spécifiés dans l'une quelconque des revendications 1 à 14.

   17.- Procédé suivant l'une quelconque des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce que l'on utilise des cul- tures du bacille qui pendant leur méta.bolisme produisent de bonnes quantités de l'antibiotique désiré, ces cultures étant sélectionnées par des essais biologiques de cultures provenant de colonies séparées de l'organisme obtenu par culture sur pla- teau.

   18.- Procédé suivant l'une quelconque des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce que le bacille est cultivé <Desc/Clms Page number 11> dans un milieu aqueux contenant environ 10% en volume de bouillon nutritif, additionné de petites quantités de glucose et de phos- phate diammonique hydrogénée et d'une trace de sel de manganèse.

   19.- Procédé suivant l'une quelconque des revendica- tions précédentes, caractérisé en -ce 'que le bacille est cultivé sur un milieu dispose= en couches statiques peu profondes.

   ' 20.- Procédé suivant l'une quelconque des revendica' tiens préc édentes 1 à 18, caractérisé en ce que'le bacille est cultivé sur.; milieu contenu dans un récipient profondet dans lequel on applique un aérage artificiel.

   21. - Procédé suivant l'une quelconque des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce que le bacille est cultivé pendant 3 à 8 jours à une température de 22-28 C, sans aérage artificiel.

   22. - Procédé suivant l'une quelconque des revendica- tions précédentes 1 à 20, caractérisé en ce que le bacille est cultivé pendant 20 à 24 heures à 22-28 C, avec-aérage artificiel.

   23. - Procédé suivant l'une quelconque des revendica- tions précédentes caractérisé en ce que les cellules,bactérielles, après leur séparation du liquide de'métabolisme, sont soumises à l'autolyse, et le produit ainsi obtenu est ajouté au liquide de métabolisme ou est traité de façon semblable à celle spécifiée pour le traitement du liquide de métabolisme.

   24.- Procédé suivant la revendication 23, caractérisé en ce que l'autolyse s'effectue en remettant,en suspension les cel- lules bactérielles dans une solution saline stérile et soumettant le mélange' à l'incubation à environ 37 C pendant environ 48 heu- res.