BE532575A

BE532575A -

Info

Publication number: BE532575A
Authority: BE

Description

La présente invention a pour objet un procédé d'extraction et de purification composé d'un ensemble de modes opératoires aboutissant à l'obtention d'une hormone pancréatique agissant sur les centres respiratoi- res, cette hormone pancréatique étant totalement exempte d'insuline et de vagotonine, cette dernière étant une hormone pancréatique agissant sur le parasympathique.

Le procédé conforme à la présente invention consiste essentiel- lement en trois opérations de préparation.

Dans le premier mode opératoire, on procède à l'extraction de l'hormone active sur les centres respiratoires, contenue dans le pancréas de boeuf. En même temps que cette hormone se trouvent extraites l'insuline et la vagotonine.

Dans le deuxième mode-opératoire, on-élimine de l'extrait brut, obtenu précédemment, toute la vagotonine et en même temps une partie de l' insuline.

Le troisième mode opératoire consiste à éliminer totalement les dernières traces d'insuline et certaines impuretés, en particulier une sub- stance hyperglycémiante.

Pour illustrer l'invention, on donne ci-après un exemple non limitatif du procédé d'extraction et de purification de l'hormone pancréatique.

Le premier mode opératoire, consistant à obtenir un extrait brut, peut être réalisé suivant trois méthodes.

Dans la première méthode, on fait macérer pendant vingt-quatre heures des pancréas de boeuf prélevés dès l'abattage de l'animal et finement hachés dans un liquide extractif composé d'alcool éthylique à 95 et d'acide chlorhydrique de densité égale à 1,18 à raison de onze ou'douze cm3 d'acide par litre d'alcool. On emploie 1,5 litre de liquide par kg. de pancréas, ce qui donne à la macération un titre alcoolique voisin de 50 et un pH compris entre 3 et 4. -
Après essorage et pressage de la macération, les jus alcooliques acides reçoivent une solution d'acétate de soude à 50%, en quantité suffisante pour obtenir un début de floculation. Il faut environ un à quatre cm3 d'acétate de soude par litre et le pH doit se situer aux environs de 5. Après quelques heures de repos, on filtre sur toile.

Les liquides limpides sont ensuite concentrés au 1/15 de leur volume initial par distillation dans le vide sans dépasser la température de 20 C.

Le liquide concentré, refroidi à 0 C reçoit 1/10 de son volume de chloroforme refroidi à 0 C et après agitation on laisse une nuit au repos, à basse température. On recueille par siphonnage la couche surnageante. On ajoute le pH de ce liquide à 2,5 et on sature de chlorure de sodium. Le précipité recueilli par centrifugation est déshydraté à l'alcool et séché dans le vide.

Un deuxième mode d'extraction consiste à traiter le pancréas de boeuf congelé à -30 C, dès l'abattage de l'animal, dans-des appareils à séchage à froid par le vide. Les pancréas-desséchés sont pulvérisés, dégraissés par épuisement au trichloréthylène. La poudre de pancréas est stabilisée à l'acétone. Elle est mise ensuite à macérer pendant douze à dix-huit heures dans cinq fois son poids d'eau refroidie à 2 G. Le pH de la solution est amené à 5. Le liquide après essorage de la macération est ajusté- à un pH 4.

On laisse au repos une ou deux heures et on centrifuge le précipité formé.

Le liquide recueilli par centrifugation reçoit une solution d'acétate de soude à 50% en quantité suffisante pour obtenir un début de floculation, qu' on laisse se poursuivre pendant quelques heures. Le pH est aux environs de 5. Lorsque le précipité commence à se déposer, on filtre sur toile. Le liquide est amené à un pH égal à 2,5 par l'acide chlorhydrique et saturé de

EMI2.1
chlorure de ..)d-'¯'..JI!o Le précipite qui se forme est centrifugée déshydrate à l'alcool absolu et sèche dans le vide.
EMI2.2

Un troisième procède consiste à recueillir, au cours de la préparation 1"5i-nz-.uline E, partir de pancréas de boeuf, les eaux-mères qui pro- viennent- de la réparation de l'insuline à son point isoélectrique dans les liquides dextraction du pancréas. Le pH de ces eaux-mères est ajusté à 2,5 et on le sature par le chlorure de sodium. Le précipité recueilli est séché à 1=alcool et dans le vide..

La substance pancréatique obtenue par l'un de ces modes d'extraction est alors soumise aux opérations de purification qui éliminent to-
EMI2.3
talement-la vagotoni==e et l'insuline qu'on peut mettre en évidence dans 1' extrait par les tests approprias.

Les -cests bzclog.ci:xes que l'on utilise pour le contrôle de l'é- puration progressive de l'hormone recherchée, permettent de déterminer l'augmentation d'activité respiratoire de l'extrait et la disparition totale d'
EMI2.4
activité sur le parasympathique; en même temps l'slectrophorse permet de voir si l'insuline disparaît progressivement au cours de la purification.
EMI2.5
On élimine de même les autres impuretés protéidiques.

L'activité respiratoire se mesure au moyen du test décrit cidessous qui se pratique sur des cobayes non anesthésiés et non soumis à con-
EMI2.6
tenticn. 0n E"¯1= inhaler un mélange d'air et de Ga2 contenant des doses progres5i.i?ne--; croissantes de C02a La dose de C02 qui provoque une augmentation de l ç ampli :::1:.::'-:::l thoracique, phénomène enregistrable graphiquement, est celle pour laquelle est atteint le seuil d7ex---i+-ab4Llî+v3 des centres respira- toires.

Apres injection aux cobayes de l'extrait pancréatique purifié
EMI2.7
contenant 1?1;crmc;e re:;;pi:1.:aoire, l'augmentation de l'ampliation thoracique apparaît pour des doses moindres de CO2 dans le mélange inhalé, mettant en évidence un accroissement de l'excitabilité chimique des centres respiratoi- res.
EMI2.8

Au C0ï.r;:' de la purification de l'extrait pancréatique, on peut suivre l'er.:::-ichis$êmei1-: de ¯.e dernier en hormone respiratoire, car il faut des poids dG plaiz. en pl').2 fubles d'extrait pour augmenter l'excitabilité des centres -:éspL##.tc.5,-ei. On peut ainsi titrer avec une très grande préci- -*ii# 1"aeiJm ,7es extrait.? pancréatiques sur l'excitabilité chimique des oestres respiratoires L"3.c.tivi't sur le parasympathique est mise en évidence par le test rlu réflexe ac;ï.--cardïw: 4e chez le lapin non anesthésié.

L'être expérimentale et statistique ayant montré qu'il suffisait de 5 gamma par kg. de lapin, en injection sous-cu--tan3e. de vagotonine hautement purifiée, pour obtenir un accroissement important et durable de 1"effet cardio-modérateur ':(n:3G:.tif à la compression des globes oculaires, il est ainsi, par cette m2ï:.hoc1e, de vérifier qu'une quantité donnée d'extrait pancréatique contient moins de 5 gamma d'hormone vagotonisante.

On a constaté rue dans certaines conditions :'le concentration et de pH, le'3 .5e1::. de métaux lourds précipitent la vago'tc1ir-e des solutions r1' exti-aits pSLcr iati;ue6 Dans ce procédé, on a choisi comme sel de chlorure de zinc. 1.l'C fait agir sur ine solution assez diluée d'extrait pancréatique brat 1?cù il p:'2ciplte la vagotonine. La quantité de chlorure de zinc a employer pour 21iIIllner totalement la vagotonine peut varier avec les extraits bruts à purifier- On détermine donc, pour un lot important d'extrait pancréatique brut, les quantité différentes de chlorure de zinc à partir d'échantil- long prélevés sur le l@t d'extrait pancréatique brut.

Le deuxième mode opératoire du procédé consiste donc à détermi- ner d'abord les quantités de sels nécessaires, puis ensuite on procède à la purification du lot total. Pour ce faire, on prélève un échantillon cor- respondant à 50 kg. de pancréas, on lui fait subir les opérations de puri- 5 fication décrites ci-après en employant, par exemple, un cm3 de solution à
20% de chlorure de zinc.

On pratique alors le test du réflexe oculo-cardiaque.

Si, par injection au lapin du produit obtenu, à raison de 50 mg. par kg. d'animal, on observe encore une augmentation de la réflectivité pa- o rasympathique, on en déduit que toute la vagotonite n'a pas été éliminée.

On recommence donc la purification sur d'autres échantillons de même poids en augmentant la quantité de solution de chlorure de zinc à 20% de 2 ou 3 dixièmes de centimètre cube jusqu'à obtension d'un produit purifié totalement inactif sur le parasympathique.

5 Cette recherche par essais successifs de la quantité de chloru- re de zinc minimum nécessaire à l'élimination totale de la vagotonine est indispensable car on risque, en utilisant d'emblée une forte quantité de chlorure de zinc, qui évidemment précipiterait toute la vagotonine, d'entraî- ner, avec cette dernière, une partie ou même la totalité de l'hormone respiO ratoire qu'on veut isoler.

On donne ci-après un exemple numérique permettant de purifier un lot d'extrait brut correspondant à plusieurs tonnes de pancréas. Il est entendu que les quantités de sels de aine employées dans cette purification ne sont valables que pour le lot d'extrait pancréatique considéré.

300 g. d'extrait'brut sont dissous dans 900 cm3 d'eau. Le pH de la solution est amené, soit par de la soude, soit par de l'acide chlorhydri- que ( qui sont les seuls agents alcalins ou acides employés au cours de la purification) aux environs de 6. La solution est mise en dialyse pendant une nuit à la température de 15 C environ, l'expérience ayant montré que les ) dialyses à basse température ne permettent pas l'élimination de certaines substances à action anti-respiratoire ou toxique.

La solution privée de sels est filtrée,le volume est complété à
4 litres par de'l'eau distillée et le pH est ajusté à 5. On ajoute 9 cm3 de solution de chlorure de zinc à 20%. On laisse reposer 1/2 heure à 15 C, l' ; opération s'étant avérée inefficace à basse température. On remonte le pH vers la neutralité jusqu'à apparition d'un précipité. On laisse reposer pen- dant deux heures à 15 C. Le précipité formé, qui contient la vagotonine sous forme de complexe vagotonine-zinc, est séparé par centrifugation.

La solution est amenée-à un pH égal à 2,6 et reçoit du chlorure 0 de sodium à saturation en agitant pour faciliter la dissolution du sel. Le précipité qui se forme est centrifugé après deux heures de repos à très basse température, inférieure à 0 C.

Les culots de centrifugation sont dissous dans 300 cm3 d'eau; la solution est amenée à un pH voisin de 6 et soumise à une dialyse pendant ; une nuit à 15 C environ.

Le liquide privé de sels est amené progressivement à un pH égal à 2,6 en observant s'il y a formation de trouble ou de floculat à un pH compris entre 5-et 4,7, cas dans lequel il faut éliminer les insolubles formés.

Lorsque le pH est ramené à 2,6 la solution refroidie à 0 C reçoit 1/2 volume ) de solution de chlorure de lithium à 50% refroidie à 0 C. On laisse reposer au froid pendant deux heures. Le précipité formé est recueilli par centrifu- gation, dissous ensuite dans le minimum d'alcool à 70 ; la solution alcooli- que est amenée à un pH égal à 6 environ et versée dans 10 volumes d'alcool absolu refroidi à 0 C. le précipité recueilli par centrifugation est séché dans le vide .

L'extrait purifié obtenu, qui est de l'ordre de 30 à 35 go pour 350 kg. de pancréas traités, ne doit plus contenir de vagotonine, mais il peut encore contenir de l'insuline décelable par électrophorèse et une substance hyperglycémiante.. Son activité sur les centres respiratoires, qui est déterminée par le test au. CO2 star le cobaye, est de l'ordre de 10 unités respiratoires par milligramme d'extrait.

On procède ensuite au troisième mode opératoire consistant à éliminer les dernières traces d'insuline en même temps que les autres impuretés présentes en faible quantité.

On dissout 1-'extrait purifié dans 10 fois son poids d'eau. On ajuste le pH de la solution à 5. On élimine par centrifugation tout trouble ou floculat se formant apres quelques heures de repos au froid. Le pH de la solution, qui est égal à 5, est maintenu puis on dilue progressivement par de l'eau jusqu'à formation d'un trouble ou floculat que l'on sépare par cen- trifugation. Si par dilution jusqu'au triple de son volume initial,il ne se produit rien, on ajuste le pH de la solution à 4,7. On élimine le trouble ou le floculat qui se ferme avec le repos au froid; ce trouble ou floculat est constitué par la substance hyperglycémiante.

La solution privée de tous les insolubles, compris entre un pH égal à 5 et un pH égal à 4,7 est mise en dialyse pendant cinq heures à 15 C. kprès dialyse et nouvelle vérification d'absence d'insoluble à ur- pH égal à 4,7 et un pH égal à 5 (insoluble qu'on élimine par centrifugation dans le cas oû il se produit)la solution ajustée à un pH égal à 4,7 re- çoit 15% de son volume dalcool absolu. Le précipité formé est séparé par centrifugation. Le liquide limpide est versé dans un mélange de 5 volumes d'alcool absolu et 3 volumes d'éther, refroidi à 0 C. Le précipité recueilli par centrifugaticn est séché dans le vide.

Ce précipité sec est redissous dans 10 fois son poids d'eau. On élimine tout insoluble se formant dans la zone de pH comprise entre 4,7 et 5,5. On dilue au double du volume et on élimine encore tout insoluble entre un pH de 4,7 et 5,5.

Le liquide refroidi à 0 C reçoit la moitié de son volume d'une solution de chlorure de lithium à 50% refroidie à 0 C, après avoir ajusté le pH à 2,7.

Le précipité est centrifugé après deux heures de repos au froid.

Il est dissous dans le minimum d'alcool à 70 refroidi à 0 C. La solution est amenée à un pH égal à 6 et est versée dans 10 volumes d'alcool absolu refroidi à 0 C. Le précipité centrifugé est séché dans le vide
On redissout ce précipité dans 10 fois son poids d'eau. Le pH de la solution est amené aux environs de 6. On met en dialyse pendant trois ou quatre heures. La solution privée'de sels est versée dans 10 volumes d'alcool absolu refroidi à 0 C. Le précipité centrifugé est trituré dans une nouvelle quantité d'alcool absolu refroidi, recentrifugé et séché dans le vide.

Par pulvérisation on obtient une poudre blanche à raison de 5 centigrammes par kg. de pancréas traité.

Les tests d'activité et de pureté pratiqués sur cet extrait purifié révèlent la présence d'une activité respiratoire de l'ordre de 10 unités au moins par 0 mg. 5 de produit, l'absence totale de vagotonine, d'insuline ainsi que de substance hyperglycémiante.

Diverses autres modifications peuvent d'ailleurs être apportées aux modes opératoires du procédé d'extraction et de purification de l'hormone pancréatique agissant sur les centres respiratoires, sans sortir du cadre de l'invention.

Claims

R E S U M E.

Procédé d'extraction et de purification d'une hormone pancréa- tique agissant sur les centres respiratoires, remarquable notamment par les caractéristiques suivantes, considérées séparément ou en combinaison: a) Le procédé consiste en trois modes opératoires ; dans le premier mode opératoire, on procède à l'extraction de l'hormone active sur les centres respiratoires contenu dans les pancréas de boeuf; comme en même temps l'insuline et la vagotonine se trouvent extraites avec l'hormone recherchée, le second mode opératoire est destiné à éliminer de l'extrait brut contenant l'hormone recherchée toute la vagotonine et en même temps la plus grande partie de l'insuline;

le troisième mode opératoire est celui qui permet d'éliminer totalement les dernières traces d'insuline et certaines impuretés constituées en particulier par une substance hyperglycémiante. b) Le premier mode opératoire consiste en l'extraction de l'hormone à partir de pancréas de boeuf frais par un liquide composé d'alcool éthyique et d'acide chlorhydrique, les jus obtenus étant ensuite traités à l'acétate de soude, au chloroforme, au chlorure de sodium et finalement recueillis par centrifugation puis séchés à-l'alcool sous vide. c) L'extrait brut est obtenu à partir d'une poudre de pancréas stabilisée à l'acétone dissoute dans l'eau, essorée puis traitée à l'acétate de soude.

à l'acide chlorhydrique, au chlorure de sodium, le précipité formé étant centrifugé, déshydraté à l'alcool absolu et séché sous vide. d) l'extrait brut est obtenu à partir de la préparation d'insuline en recueillant les eaux-mères qui proviennent de la séparation de l'in suline à son point isoélectrique; ces eaux-mères étant traitées au chlorure de sodium pour obtenir un précipité séché à l'alcool et sous vide.

@) L'élimination de la vagotonine est obtenue en traitant l'extrait brut par des sels de métaux lourds. f) Le sel de chlorure de zinc est utilisé comme sel de métal lourd. g) L'insuline est séparée de l'extrait semi-purifié par traitement à l'alcool, par dialyse et par centrifugation.