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La présente invention se rapporte à des perfectionnements à la préparation de sels d'héparine et se propose de fournir un procédé d'éli- mination des impuretés colorées qu'ils contiennent.
On suppose que l'héparine est un mélange d'esters polysulfuriques de la mucoïtine; elle constitue un agent anti-coagulant très précieux, très utilisé en clinique. L'héparine libre est de nature acide et est générale- ment isolée sous forme sous forme de sel de métal alcalin, par exemple de sel de sodium. L'héparine est généralement fournie en médecine sous for- me de solution du sel de sodium, qui est de couleur jaunâtre ou brune. On a éprouvé depuis longtemps le besoin d'éliminer cette coloration et l'on a effectué des recherches pour établir un procédé de traitement des sels d'héparine qui permit d'obtenir un produit donnant une solution incolore.
La demanderesse a découvert que l'on peut éliminer rapidement et efficacement les impuretés colorées des sels d'héparine sans perte sensible d'activité par le procédé ci-après. L'héparine peut être isolée des tissus pulmonaires des animaux par les procédés d'extraction et de purification. bien connus. Ces procédés donnent un produit final sous forme d'une poudre blanc sale ou beige.
Le procédé selon l'invention consiste à dissoudre dans l'eau le produit coloré (dont l'activité est normalement de l'ordre de
100 u./mg.) de manière à obtenir une solution contenant environ 5000 u./cc. et à traiter la solution ainsi obtenue à une température élevée, de pré- férence environ 80 C, et à un pH de préférence compris entre 8,0 et 8,5 au moyen d'une solution d'un 1 de l'acide permanganique. Le sel d'acide permanga- nique utilisé est déterminé en partie par la nature du cation que l'on dé- sire voir figurer dans le sel d'héparine finalement obtenu. On prépare nor- malement l'héparine sous forme de son sel de sodium, de sorte que c'est normalement le permanganate de sodium auquel on fera appel dans le procé- dé ci-dessus.
Bien entendu, l'invention n'est pas limitée à l'usage du sel de sodium de l'acide permanganique.
La quantité de permanganate nécessaire pour effectuer la décolora- tion varie avec le lot particulier de sel d'héparine préparé à décolorer.
On peut déterminer avec précision la quantité à utiliseren traitant desparties ali- quotes de chaque lot de sel d'héparine au moyen de quantités croissantes de solution de permanganate jusqu'à détermination de la quantité de per- manganate juste suffisante pour effectuer la décoloration dans les condi- tions ci-dessus décrites. On a trouvé que, d'une manière générale, la quan- tité à utiliser dans le cas du permanganate de sodium est d'environ une molécule-gramme pour décolorer 100 millions d'unités de sel d'héparine.
La durée pendant laquelle on doit laisser la réaction se poursui- vre varie avec la nature du lot particulier de sel d'héparine soumis au traitement, mais on a trouvé que dans les conditions exposées ici, la dé- coloration de la solution de sel d'héparine est terminée en 15 à 30 minu- tes après l'addition de la solution permanganique. La perte d'activité d' héparine éprouvée au cours de ce temps est faible ou nulle.
La gamme de pH dans laquelle on effectue la réaction est critique.
Si le pH est nettement inférieur à 8,0 la décoloration du sel d'héparine ne se fait que difficilement ou ne se fait pas du tout et si le pH est net- tement supérieur à 8,5, la décoloration est accompagnée d'une perte pronon- cée d'héparine par suite de dégradationo On a trouvé qu'il était préféra- ble d'effectuer la réaction dans des conditions telles que le pH initial du mélange réactionnel soit compris entre 8,0 et 8,5.
La température à laquelle la réaction est effectuée est égalementim- portante.On à constaté que si la réaction se fait à la température ambiante, le bioxyde de manganèse formé se dépose sous forme de très fines particules
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extrêmement difficiles à séparer par filtration. En fait le bioxyde de man- ganèse peut être déposé sous forme colloïdale et peut être si difficile à éliminer qu'il pollue le sel d'héparine isolé.
Si, toutefois,la réaction est effectuée à une température élevée, le bioxyde de manganèse se dépose sous forme granulaire et est aisément enlevé du produit. On a trouvé que la réaction est effectuée le plus com- modément à une température d'environ 80 C, mais il est bien entendu que la présente invention n'est pas limitée à l'usage de cette température ré- actionnelle particulière.
Quand la décoloration de la solution de sel d'héparine a été ef- fectuée de la manière décrite ci-dessus,le bioxyde de manganèse mis en liberté est isolé par filtration et le sel d'héparine solide est recueilli au sein du filtrat par les procédés bien connus. C'est ainsi par exemple que le filtrat aqueux peut être versé dans un excès d'alcool, ce qui pro- voque la précipitation du sel d'héparine sous forme d'un solide blanc que l'on peut recueillir et sécher.
Ainsi, l' invention a pour objet un procédé d'élimination des impuretés colorées d'un sel d'héparine y remarquable notamment en ce qu'il comporte la mise en réaction d'une solution aqueuse d'un sel d'héparine à un pH com- pris entre 8,0 et 8,5 à une température élevée, de préférence environ 800 C., avec une solution aqueuse d'un sel d'acide permanganique, dont le cation est de préférence identique au cation du sel d'héparine que l'on doit fi- nalement isoler, en quantité telle que définie ci-dessus.
La décoloration de l'héparine de la manière décrite ci-dessus ef- fectue en même temps une élimination partielle des substances pyrogènes.
Pour en assurer l'élimination complète, il est nécessaire de soumettre la matière à un autre traitement qui peut être effectué par les procédés con- nus, tels que le traitement sur charbon de bois activé ou la filtration sur couche de cellulose. On peut également effectuer l'élimi&ation des subs- tances pyrogènes par le procédé décrit dans la demande de brevet déposée =ce jour sous le N 421.488 par la demanderesse pour "Procédé d'élimination des substances pyrogènes d'une solution d'un sel d'héparine".
L'exemple suivant, qui n'est pas limitatif, illustre l'invention.
EXEMPLE
On dissout 300 g. d'héparine (à l'état de sel de sodium) d'une ac- tivité de 100 u./mg. dans 4 litres d'eau distillée et on filtre la solution sur une couche de .kieselguhr, qu'on lave ensuite à plusieurs reprises au moyen de faibles portions (100 ce,) d'eau distillée. On règle le volume du mélange du filtrat et des liqueurs de lavage à 6 litres par addition d'eau distillée et on chauffe rapidement la solution à 80 C. On règle le pH de la solution chaude à 8,0 - 8,5 par addition d'une solution 5 N d'hydroxy- de de sodium et on ajoute en agitant énergiquement 100 cc. d'une solution à 40 % en poids/volume de permanganate de sodium. On laisse la solution réactionnelle reposer pendant trente minutes en maintenant la température à 80 C.
On refroidit le produit à environ 40 C, et on isole le bioxyde de manganèse qui se sépare par filtration sur lit de kieselguhr. On met en suspension la couche de kieselguhr dans 1 litre d'eau distillée et on chauf- fe à 80 C., le pH étant réglé à 8,0 - 8,5 si nécessaire. On refroidit la suspension à 40 C et on filtre, le lit filtrant étant lavé au moyen de deux portions de 250 cc. chacune d'eau distillée. On mélange le filtrat avec- celui provenant de la masse réactionnelle principale et on ajuste la solution à pH 6,5. On ajoute à la solution suffisamment de chlorure de so- dium pour produire une concentration de 1% dans la solution finale. On cla-
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rifie la solution ainsi obtenue par filtration et on verse le filtrat en a- gitant dans quatre fois son volume d'alcool à 95 %.
On isole le solide qui se sépare par filtration et on le sèche sous vide à 35 C. On obtient ain- si de l'héparine (sous forme de sel sodique) à l'état de poudre blanche d'une activité d'environ 100 u./mg.
Bien entendu l'invention n'est pas limttée au mode de mise en oeu- vre décrit qui n'a été donné qu'à titre d'exemple.