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La présente invention se rapporte aux antibiotiques et'plus spé- cialement à un nouvel antibiotique qui sera appelé streptogramine, ainsi qu'à son procédé de préparation.
Spectre bactérien.
Il a été constaté que la nouvelle substance antibiotique agit efficacement contre un grand nombre de types différents de bactéries.Parmi les bactéries qui ne se reproduisent pas en présence du nouvel antibiotique, on peut citer: Hemophilus pertussis, Bacillus subtilis, Streptococcus pyogenes et, en particulier, Staphylococcus àureus qui est devenu résistant à la pénicilline et d'autres produits pharmaceutiques disponibles.Ce dernier microorganisme a
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été récemment impliqué dans un grand nombre d'infections ssrieuses et sou- vent .fatales pour des êtres humains .Il est intéressant de noter qu'une race de Staphylococcus aureus qui a été rendue résistante à plus de cent Fois
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la dose inhibitrice originale de pênidiIlJuMB, par transferts en série,
est encore pleinement sensible au nouvel antibiotique appelé streptogramine.
Le tableau I donne une liste plus étendue de microorganismes qui sont sensibles au nouvel agent antibiotique.
TABLEAU I
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Activité bactériostatique "in vitrait en microgrammes par ml de milieu de culture.
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<tb> Staph, <SEP> aureus <SEP> '0,03 <SEP> - <SEP> 0,08
<tb>
<tb> Strep. <SEP> pyogenes <SEP> 0,02 <SEP> - <SEP> 0,03
<tb> Strep. <SEP> agalactiae <SEP> 0,04
<tb>
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Strep. feaalis 0,94 - 1,12 D. pneumonia 0,16 - 0,31 C. diphtheria 0,005 - 0,02
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<tb> S. <SEP> typhosa <SEP> 1,25 <SEP> - <SEP> >10 <SEP>
<tb>
<tb> S.paratyphi <SEP> >10
<tb>
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S. Schottmalleri >10 Shig,sonn'ei 7, 5 - 10 E.coli 30 P.mnltocida 1,8 - 3,8
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<tb> K.pneumoniae <SEP> >10
<tb>
<tb> Ps. <SEP> aeruginosa <SEP> >30
<tb>
<tb> P.vulgaris <SEP> >30
<tb>
<tb> Br. <SEP> abortus <SEP> 15
<tb>
<tb> H. <SEP> pertussis <SEP> 0,06
<tb>
Propriétés physiques et chimiques.
La nouvelle substance antibiotique est un composé neutre/Des con- centres purifiés de l'antibiotique sont peu solubles dans l'eau (approxi- mativement 0,1 mg/ml).Elle est facilement soluble dans le méthanol, l'éthanol, l'acétone et l'acétate d'éthyle. Elle est insoluble dans la ligroïne.Jus- qu'à présent, les essais effectués ppùr obtenir une préparation cristalline de streptogramine n'ont pas eu de succès.Divers solvants saturés avec l'an- tibiotique ont provoqué, sous 1(effet du refroidissement,le dépôt de peti-
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tes sphérules solides.Occasionnellement ces sphétftles se sont agglomérées pour former des pseudo-cristaux (aiguilles)
qui ne donnaient pas lieu à l'extinction entre des prismes de Nichol croisés.La préparation la plus puissante qui a été obtenue contient les éléments carbone, hydrogène,
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azote, oxygène et soufre (ce dernier en tant que trace à'impureté).Lé.ana- lyse chimique de cette préparation était en moyenne : carbone62,25%; hydro-
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gène 6,62%; azote 8;42; oxygène 22,35%;
et traces de soufre.La formule empirique calculée sur la base de ces données correspond approximativement à 26g3N37
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La streptogramine possède un spectre particulier d'absorption des rayons infrarouges, tel que le montre le dessin annexé.Le diagramme montre en abscisses la longueur d'onde L en microns, et en ordonnées le pourcen- tage de transmission % T.Ces spectre a été obtenu au moyen du spectrophoto- mètre infrarouge Perkin - Elmer, modèle 21, à enregistrement automatique avec prisme de NaC1.Le spectre a été enregistré automatiquement de 2,0 à 15 microns.L'échantillon a été gâché avec de l'huile minérale épaisse et étalé uniformément entre deux plaques de sel,
sans employer un élément d'espacement.Un témoin d'huile minérale seule a été employé comme référence.
Les sommets que le spectre de l'échantillon présente à 3,4; 6,8; 7,2 microns, sont dus en partie à l'huile minérale.Les bandes suivantes peuvent être distinguées : 3,05; 3,43; 3,54 ; 5,80; 6,02; 6,17; 6,23; 6,35 ; 6,46 ; 6,58 ; 6,94; 7,03; 7,32; 7,46; 7,64; 7,72; 7,96; 8,09; 8,20; 8,44; 8,61; 8,94; 9,45 ; 9,65; 9,78; 10,15; 10,26; 10,60; 10,80; 10,98; 11,29; 11,50; 11,78; 12,28; 12,68; 13,00; 13,23 ; 13,40; et 14,35.
Il est intéressant de noter que la préparation la plus puissante présente un spectre d'absorption identique à celui d'un concentré ayant une puissance de 10%, indiquant donc que les ippuretés inactives ont une structure intimement relationnée et donnant une explication possible pour la difficulté d'obtenir l'antibiotique sous forme cristalline.Une autre raison de supposer qu'il existe une tintime relation de structure entre l'antibiotique et l'impureté inactive qu'il contient est la difficulté que l'on rencontre pour les séparer l'un de l'autre par la distribution de sol- vant en contre-courant.
Lorsqu'on soumet ces mélanges à l'analyse de solu- bilité selon la règle des phases on constate aussi la présence d'un com- posant seulement, ce qui indique que les deux'matières sont isomorphes .Le point de fusion de préparations de streptogramine (apprQimativement 155 C) est, dans certaines limites, indépendant de la puissance ou efficacité, comme c'est également le cas pour la rotation spécifique (Ó=- 134 , D = ligne de sodium).
Une réaction négative à la ninhydrine (ce amino-azote) est obtenue aussi bien avant qu'après l'hydrolyse.La présence d'azote de noyau est in- diquée par un essai positif de coloration avec de laddiméthylaminobenzal- dêhyde en solution dans de l'acide phosphorique.
Une réaction positive de coloration obtenue avec de l'acide diazo-sulfanilique et un essai positif de coloration avec du chlorure fer- rique indiquent la présence d'un ou plusieurs groupes phénoliques.
Caractéristiques du microorganisme.
L'organisme qui produit la nouvelle substance chimique selon la présente invention a été isolé d'un échantillon de sol de l'état du Texas.
Cet organisme, tel qu'on le trouve naturellement dans le sol, et des es- pèces mutantes spontanées de cet organisme, appartiennent au genre couram- ment appelé Streptomyces.Il est typiquement aérobie avec croissance limitée lorsqu'il est submergé.Il se forme un véritable mycélium.Lorsqu'on utilise de la gélose ou agar-agar au caséinate de sodium, inoculé avec l'organisme,on a constaté, après une période d'incubation appropriée, de la croissance et de la sporulation abondante à la surface.L'examen microscopique a révélé des mycélla végétatifs ramifiés, d'un diamètre d'environ 1 micron.Il se formait des hyphes aériens de 1 à 1,3 microns de diamètre ,
qui portaient des coni- dies sphériques en chaînas se terminant en spirales serrées.Ces conidies aveent un diamètre d'environ 1,2 microns.
Du lait de tournesol donnait une excellente croissance sous la forme d'un collier brun foncé à noir, à la surface du milieu de culture.Il se produisait une peptonisation à réaction alcaline marquée (pH 6,4 chan- geant en 8,2).
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Il se produisait une croissance modérée à excellente dans du bouillon de nitrate, avec des colonies de surface, blanches et sporulées, et un peu de sédiment dans le fond du tube. Le nitrate était réduit faible- ment en nitrite après 14 jours à 37 C.
Dans du bouillon de tryptone il se produisait un développement modéré sous la forme d'une pellicule partielle, blanche à grise. Il se for- mait un pigment jaune soluble.L'essai à l'indol était négatif.
Dans du bouillon synthétique (de Czapek) il se formait une pelli- cule complète de petites colonies abondamment recouvertes d'hyphes aériens blancs à gtis.Le liquide a été pigmenté brun rougêâtre.
Dans le cas de culture sous-superficielle sur gélatine solide, celle-ci se liquéfiait en 7 jours à 37 C, bien que la croissance fut pauvre, sous la forme d'un peu de colonies brunes de surface et un- sédiment de fond clairsemé.
La croissance était excellente sur des tampons de pommes de terre, les surfaces du tampon étant couvertes de minuscules colonies saillantes qui étaient à leur tour couvertes d'hyphes aériens blancs poudreux qui viraient ensuite au gris. Les tampons de pommes de terre devenaient noirs.
La croissante sur de la gélose d'amidon était abondante sous la forme de colonies à surface rugueuse, de couleur havane, légèrement sail- lantes, à bords irréguliers,les colonies présentant des stries allant du bord au centre.Les surfaces étaient couvertes d'hyphes aériens gris à bordure blanche.L'envers de la colonie allait du brun au noir.L'amidon était hydrolysé.
Sur la gélose de Bennett, la croissance était excellente et les colonies ressemblaiént à celles qui se développaient sur la gélose d'amidon. il ne se formait pas de pigment soluble.
La croissance sur de la gélose ou agar-agar nutritif (peptone de viande) était modérée et les colonies ressemblaient à celles de la gélose d'amidon.
La croissance sur de la gélose de glucose-peptone était modérée et produisait des colonies havane à bord irrégulier qui s'enfonçaient dans la gélose.Elles étaient couvertes de hyphes aériens blancs.L'envers des colonies allait du brun au noir.On a constaté un certain fendillement des colonies développées à 37 0.Il n'y avait pas de pigment soluble.
Sur la gélose de glucose-asparagine la croissance était pauvre, formant des colonies à bord irrégulier, de forme comparable à une toile d'araignée, de couleur chamois, avec des hyphes aériens blancs clairs- més à 30 C.
Sur la gélose synthétique (de Czapek) on constatait un dévelop- pement modéré de colonies de couleur chamois selblables à une toile d'araig- née, similaires à celles qui se développent sur la glucose-asparagine.On n'a observé ni sporulation, ni formation de pigment soluble.
La gélose de caséinate de sodium produisait un excellent dévelop- pement de colonies inodores,à bord irrégulier, qui étaient couvertes de mycélia aériens gris à 30 C.A 37 C, il se formait des colonies superfi- cielles planes à bord plumeux, sporulées au centre et avec bord non sppru- lé.L'envers de la colonie présentait un centre brun et un bord incolore.Il ne se formait pas de pigment soluble.
Sur la gélose de tyrosine la croissance était faible sous la fo'rme de minuscules colonies brunes en forme de dôme, sans hyphes aériens visi- bles.L'envers des colonies était brun clair.Il ne se formait pas de pigment
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soluble.
Sur la gélose de malate de calcium, la croissance était modérée sous la forme de colonies défoncées à bord plumeux, avec un centre en for- me de dôme qui s'élevait au-dessus de la gélose et était couvert d'hyphes aériens de couleur blanc-jaunâtre.Il ne se formait pas de pigment soluble.
Dans l'ensemble la croissance et la sporulation étaient meilleures à 37 qu'à 30 C, mais le résultat était satisfaisant à quelques degrés en plus ou en moins.
Il y a lieu de croire que par les susdites caractéristiques 1' organisme en question et ses diverses formes se différencient de n'impor- te laquelle des espèces décrites dans le "Manual of Determinative Bacterio- logy", sixième édition, pages 929-967, de Bèrgey.
En conséquence, le nom Streptomyces graminofaciens a été choisi pour désigner le nouvel organisme décrit dans la présente spécification.
Developpement ou croissance du microorganisme.
L'pntibiotique est produit par le processus de fermentation usuel comprenant l'agitation de l'aération pour poursuivre la culture'aérobie.
On peut utiliser un milieu conventionnel de fermentation et celui-ci doit contenir les ingrédients usuels, tels qu'un hydrate de carbone, une source d'azote, des sels minéraux, tels que des phosphatés;et des éléments en tant que traces.La streptogramine peut être produite notamment dans le milieu de culture du type suivant :
Cérélose 0,8%; N-Z-Amine B (tryptone) 0,28%; peptone de soya de Sheffield 0,05%; Basaminebact 0,1%; acide glutamique 0,1%; NaCl; 0,083%; K2HPO4, 0,24%; KH2PO4,0,2%; MnC12, 0,0002%.La cérélose peut être rempla- cee 2 par d'autres hydrates de carbone, tels que la dextrine ou l'amidon.
Basaminebact est mis dans le commerce par Anheuser-Busch Inc.
Au début du développement de S. graminofaciens par fermentation, le pH du milieu de culture doit être réglé à une valeur comprise entre 6,7 et 7,0.
La description des exemples typiques suivants fera comprendre comment la streptogramine peut être produite et récupérée.
Exemple 1.
On prépare un milieu stérilisé de culture ayant la composition suivante:
Cérélose 0,8%
NZ Amine B 0,28%
K2HPO4 0,24%
KH2PO4 0,2%
Basaminbact 0,2% (Glutamate Monosodique 0,1%
NaCl 0,083%
Peptone de soya de uSheffield 0,05%
MnC12 0,0002% pH 6,7 - 6,8
Une prise de quelques milligrammes de sol stérile qui a été ino- culé au préalable avec du S. graminofa$iens est ajoutée à un flacon de 250 ml contenant le milieu de culture.On laisse se poursuivre la croissance pendant 4 jours à 25 C, pendant que le flacon est agité. On en prélève 10 cm3
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que l'on ajoute à un flacon de 2 litres du milieu de culture.On poursuit l'agitation pendant 3 jours à 25 C.
Le développement est alors poursuivi dans une bouteille à agita- tion contenant 12 litres du milieu de culture dont le pH est réglé à,6,7.
On y ajoute 360 cm3 d'inoculum provenant du flacon de 2 litres.Comme pro- duit anti-mousse on ajoute celui connu sous l' appellation DC200, tel que fabriqué par Dow Corning Corporation.L'agitation est effectuée au moyen d' un agitateuir tournant à 1750 tours'/minute.Pour l'aération on introduit, par minute, une quantité d'air stérile correspondant à 1/4 du volume.La température a été maintenue à 25 C et l'agitation poursuivie pendant 24 heures.
Douze litres de ce produit de fermentation ont été ajoutés à un réservoir contenant 600 litres du milieu de culture ayant un pH de 6,7.
Comme agent anti-mousse on a ajouté du DC200.L'agitation était effectuée par un agitateur tournant à 120 tours/minute,L'aération a été réalisée en introduisant,par minute, une quantité d'air stérile correspondant appro- ximativement à 1/4 du volume.La température a été maintenue à 25 C et l'agitation a été poursuivie pendant 48 heures.
Le développement a ensuite été poursuivi dans des réservoirs plus grands en ajoutant 48 litres du-produit de fermentation à 2400 litres de milieu de culture.Les conditions de croissance ont été maintenues comme pour la masse de 600 litres.Après 24 heures le milieu de fermentation accu- sait à l'essai 91,2 unités/ml et après 48 heures 177 unités/ml.Cela repré- sente 17,7 microgrammes par ml, en se basant sur l'efficacité de la prépa- ration de streptogramine la plus pure qui a été isolée.
Isolation de la Streptogramine.
Exemple II
Le mycélium a été enlevé par filtration et le filtrat a été extrait avec 1/3 de son volume d'acétate d'éthyle, dans un extracteur à contre-courant.e solvant contenant de l'antibiotique a été lavé avec
1/5 de son volume de tampon de phosphate à pH 9,0, puis avec 1/5 de son volume de tampon d'acétate à pH 3,5, et ensuite avec 1/5 de son volume d' eau.Ces lavages , bien qu'ils ne soient pas essentiels, éliminent les impuretés qui,sinon, contamineraient le produit final.Le solvant lavé a été réduit en volume à environ 4 litres par distillation sous vide et a été traité avec un volume triple de ligroine, en précipitant la matière active qui, après filtration et séchage dans le vide, avait une pureté d'environ 50% et pesait 200 g.
Pour poursuivre la purification , une solution à 10% dans le méthanol, de la substance brute décrite ci-dessus, a été traitée avec neuf fois son volume d'un tampon de phosphate à 1% avec un pH de 7,0.La masse ainsi obtenue a été conservée à 5 C pendant 18-24 heures et filtrée.L'anti- biotique restait dans le filtrat et était ainsi séparé d'une quantité im- portante de contaminant inactif coloré.Le filtrat a été réduit à 1/10 de son volume par distillation dans le vide L'antibiotique se séparait alors de la solution à l'état purifié et a été récupéré par filtration, lavé à l'eau et séché.au-dessus du vide, en donnant 90 grammes de streptogramine pure.
Propriétés physiologiques.
La streptogramine possède une toxicité intrapéritonéale, pour les souris, d'environ 450 mg/kg (DL 0 = dose léthale, suffisante pour tuer 50% des souris).Des souris infectées par voie intrapéritonéale avec 1000 doses @ léthales minimum d'organismes pathogènes ont été protégées par l'adminis- tration de streptogramine, à raison d'une petite fraction de la dose toxique.
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La streptogramine a été administrée sur une période de quatre jours par des voies diverses et la quantité minimum en microgrammes par dose Il été . déterminée pour donner 50% de cas de survie.Les résultats sont indiqués dans le tableau suivant.
TABLEAU II
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<tb> Agent <SEP> d'infection <SEP> Voie <SEP> d' <SEP> Dose <SEP> DP50 <SEP> en
<tb>
<tb> administration <SEP> microgrâmmes <SEP> par
<tb>
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¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ dose.
Staph-c. aureus in-brapêritpnêaiâ' 1 a9
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<tb> " <SEP> " <SEP> intramusculaire <SEP> 3525
<tb> " <SEP> " <SEP> buccale <SEP> 1509
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> intraveineuse <SEP> 492
<tb>
EMI6.5
" " snus-cutanée 543 Strep.Iyogenes intrapéritdnéale 1,2
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<tb> " <SEP> " <SEP> intramusculaire <SEP> 111
<tb> " <SEP> " <SEP> buccale <SEP> 664
<tb>
<tb>
<tb> " <SEP> intraveineuse <SEP> 142
<tb>
Il est significatif qu'une seule dose de streptogramine est approximativement aussi efficace que sept doses de la même grandeur,et que la drogue agit par administration intrapéritonéale, intraveineuse, intra- musculaire et buccale.Dans des essais sur des blessures de la peau de.
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lapins, infectées avec Staphilococcus aureus, le traitement.avec de la streptogramine a permis de réduire le temps de guérison par rapport à des cas similaires non traités.
L'administration de Streptogramine purifiée par toutes les voies (intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire, souscutanée et buccale) a été très bien tolérée dans tous les cas et ne donnait lieu à aucune mani-
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feoetatïon de nécrose, décoloration, ni autre accident.
La préparation la plus puissante' qui a été isolée jusqu'à présent possédait un point de fusion d'environ 155 C et une rotation spécifique
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foej 250 .= -134 .
REVENDICATIONS..
1- Procédé pour la production de streptogramine, dans lequel on ajoute du reptomyces graminofaoiens à un milieu de culture contenant des sources assimilables d'hydrate de carbone,azote et sels inorganiques; et on poursuit le développement dans des conditions aérobies jusqu'à ce qu'il se produise de la streptogramine susceptible d'être récupérée.
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2 - Procédé pour la production de streptogramine dans lequel on ajoute du Streptomyces graminofaciens à un milieu de culture contenant des sources assimilables d'hydrate de carbone,azote et sels inorganiques, et on poursuit le développement dans des conditions aérobies et à une température'' de le,ordre de 25 C.
3 - Procédé pour la production de Streptogramine, dans lequel; on ajoute du Streptomyces graminofaciens à un milieu de culture contenant des sources assimilables d'hydrate de carbone, azote et sels inorganiques, et on poursuit le développement dans des conditions aérobies et à nne température de l'ordre de 25 C pendant au moins 4 jours.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.